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特許7494199Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原のイムノアッセイ及びそのためのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-24
(45)【発行日】2024-06-03
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原のイムノアッセイ及びそのためのキット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/576 20060101AFI20240527BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20240527BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240527BHJP
【ＦＩ】
G01N33/576 B
C07K16/08 ZNA
C12P21/08
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021549030
(86)(22)【出願日】2020-09-25
(86)【国際出願番号】 JP2020036213
(87)【国際公開番号】W WO2021060450
(87)【国際公開日】2021-04-01
【審査請求日】2023-08-07
(31)【優先権主張番号】P 2019176474
(32)【優先日】2019-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】306008724
【氏名又は名称】富士レビオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001656
【氏名又は名称】弁理士法人谷川国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大植 千春
(72)【発明者】
【氏名】八木 慎太郎
(72)【発明者】
【氏名】青柳 克己
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第０２／０１４８７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００５／１１１６２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００３－５１５３２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１０７２７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】田中靖人ほか，B型肝炎ウイルスコア関連抗原（HBcrAg）測定法の基礎的・臨床的検討，モダンメディア，2008年，54(12)，347-352
【文献】Tran Nhu Duong et al.，Comparison of Genotypes C and D of the Hepatitis B Virus in Japan:A Clinical and molecular Biological Study，Journal of Medical Virology，2004年，72，551-557
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５７６
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイする方法であって、イムノアッセイに用いる抗体として、少なくとも１種のＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の31～48番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いる、方法。
【請求項2】
イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記イムノアッセイが、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原と特異的に結合する第１の抗体及び第２の抗体を含むサンドイッチ法であって、前記第１の抗体が固相に結合した捕捉用抗体であり、前記第２の抗体が標識物質と結合した検出用抗体であり、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合する前記モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２の抗体を含む溶液が水溶性高分子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
被検試料を界面活性剤、酸性化剤及びアルカリ性物質から成る群より選ばれる少なくとも１種を含む前処理液で前処理する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記前処理液が、還元剤をさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項7】
イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＤのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＥ又はＦのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイするためのキットであって、イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と結合反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の31～48番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、キット。
【請求項10】
イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原（以下、「ＨＢｃｒＡｇ」と呼ぶことがある）のイムノアッセイ及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」と呼ぶことがある）は、直径約４２ｎｍの球状のＤＮＡウイルスであり、Ｄａｎｅ粒子とも呼ばれる。ウイルスの外側は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなるエンベロープで構成され、内側はＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）からなるコア粒子と不完全環状二本鎖ＤＮＡからなる遺伝子で構成される。ＨＢＶは、肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二本鎖ＤＮＡは、完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。ｃｃｃＤＮＡからは４種のｍＲＮＡが転写され、それらよりＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇまたはｐ２２ｃｒ抗原（以下、「ｐ２２ｃｒＡｇ」と呼ぶことがある）、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（以下、「ＨＢｅＡｇ」と呼ぶことがある）及び逆転写酵素が翻訳される。ｍＲＮＡの一部はｐｒｏｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡとしてＨＢｃＡｇから形成されるコア粒子に取り込まれ、そこで逆転写酵素の働きによりＤＮＡが合成される。ＤＮＡを含むコア粒子がＨＢｓＡｇより形成されるエンベロープに包まれて、Ｄａｎｅ粒子となり、血中に放出される。Ｄａｎｅ粒子の血中放出以外に、ＨＢｓＡｇ、中空粒子、及びＨＢｅＡｇが放出される。ここでいう中空粒子は、ＤＮＡが存在しない粒子であって、エンベロープ中にｐ２２ｃｒＡｇが取り込まれることで形成される。ＨＢｃｒＡｇは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びｐ２２ｃｒＡｇの総称であり、これらは、共通してＨＢＶ ＤＮＡのＣ遺伝子領域にコードされている。
【0003】
血液等の被検試料中のＨＢｃｒＡｇの検出は、Ｂ型肝炎ウイルスの検査方法の１つとして実用化されている（特許文献１）。
【0004】
血液等の被検試料中のＨＢｃｒＡｇを測定するにあたり、試料中に元から存在する、ＨＢｃｒＡｇを認識する抗体の影響による低値化を低減するため、被検試料を前処理することも知られている（特許文献２）。前処理方法としては、被検試料をドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」ということがある）のような界面活性剤又は酸で処理し、さらに加熱する方法が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】ＷＯ２００２／０１４８７１Ａ
【文献】ＷＯ２００５／１１１６２０Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１に記載されているモノクローナル抗体を用いた、日本で実用化されている公知の方法では、日本人に多いＢ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」と呼ぶことがある）ジェノタイプであるジェノタイプＣと特異的に結合するモノクローナル抗体が用いられている。しかしながら、この方法では、欧州やインドに多い、ＨＢＶジェノタイプＤ（以下、「ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ」と呼ぶことがある）の検出感度が低いという問題がある。
【0007】
したがって、本発明の目的は、公知の方法よりもＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄの検出感度が高い新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本願発明者らは、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を抗体として用いることにより、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄの検出感度を向上させることが可能ではないかと考えた。しかしながら、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体はこれまでに作出されていない。本願発明者らは、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄのコア抗原を遺伝子工学的手法により作出し、これをマウスに免疫して作出したハイブリドーマにより、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を創製することに成功し、このモノクローナル抗体を、被検試料中のＨＢｃｒＡｇのイムノアッセイのための抗体の一部として用いることにより、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄの検出感度が向上することを実験的に確認して本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１） Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイする方法であって、イムノアッセイに用いる抗体として、少なくとも１種のＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いる、方法。
（２） イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる（１）に記載の方法。
（３） 前記イムノアッセイが、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原と特異的に結合する第１の抗体及び第２の抗体を含むサンドイッチ法であって、
前記第１の抗体が固相に結合した捕捉用抗体であり、前記第２の抗体が標識物質と結合した検出用抗体であり、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合する前記モノクローナル抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記第２の抗体を含む溶液が水溶性高分子を含む、（３）に記載の方法。
（５） 被検試料を界面活性剤、酸性化剤及びアルカリ性物質から成る群より選ばれる少なくとも１種を含む前処理液で前処理する（１）～（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６） 前記前処理液が、還元剤をさらに含む（５）に記載の方法。
（７） イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＤのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８） イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＥ又はＦのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（９） Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイするためのキットであって、イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と結合反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、キット。
（１０） イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる（９）記載のキット。
（１） Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイする方法であって、イムノアッセイに用いる抗体として、少なくとも１種のＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いる、方法。
（２） イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる（１）に記載の方法。
（３） 前記イムノアッセイが、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原と特異的に結合する第１の抗体及び第２の抗体を含むサンドイッチ法であって、
前記第１の抗体が固相に結合した捕捉用抗体であり、前記第２の抗体が標識物質と結合した検出用抗体であり、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体の少なくとも一方がＢ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と特異的に結合する前記モノクローナル抗体である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記第２の抗体を含む溶液が水溶性高分子を含む、（３）に記載の方法。
（５） 被検試料を界面活性剤、酸性化剤及びアルカリ性物質から成る群より選ばれる少なくとも１種を含む前処理液で前処理する（１）～（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６） 前記前処理液が、還元剤をさらに含む（５）に記載の方法。
（７） イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＤのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８） イムノアッセイするＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原が、ジェノタイプＥ又はＦのＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原である（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（９） Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原をイムノアッセイするためのキットであって、イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＤのコア関連抗原と結合反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、キット。
（１０） イムノアッセイに用いる抗体として、Ｂ型肝炎ウイルスジェノタイプＣのコア関連抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をさらに用いる（９）記載のキット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇを高感度で検出できる新規なイムノアッセイが初めて提供された。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びｐ２２ｃｒＡｇのアミノ酸配列構造の関係概略図である。
【図2】本発明の方法の実施例において測定した、２つの試験例における各種検体についての測定結果の相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の方法に用いるＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体は、下記実施例に詳述する方法により作出することが可能である。すなわち、下記実施例では、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄの感染患者の血液からＤＮＡを回収し、ＨＢｃｒＡｇをコードする領域をＰＣＲにより増幅し、大腸菌に導入して遺伝子工学的にＨＢｃｒＡｇを生産し、これをマウスに免疫して常法によりハイブリドーマを作出し、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これからＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を回収することによりＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。下記実施例では、この方法によりＨＢ１２４及びＨＢ１３５と命名した２種類のハイブリドーマが得られたので、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体は再現性をもって作出可能であることが確認された。また、下記実施例で得られたＨＢ１２４及びＨＢ１３５が産生するモノクローナル抗体は、いずれも、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列に含まれる領域をエピトープとするものである。なお、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列から成るペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体であれば、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列に含まれる領域をエピトープとするモノクローナル抗体であると判断できる。また、本明細書及び特許請求の範囲において、「特異的に結合する」とは抗原抗体反応するという意味である。
【0013】
本発明のイムノアッセイにおいては、用いる抗体は、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体のみでもよいが、他のジェノタイプのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体をも用いることが好ましい。これにより、ジェノタイプＤのみならず、ジェノタイプＤ以外のジェノタイプのＨＢｃｒＡｇについても高感度で検出が可能となる。例えば、日本において実用化されている方法では、日本人に多いジェノタイプＣと特異的に結合するモノクローナル抗体が用いられているが、本発明では、ジェノタイプＣと特異的に結合するモノクローナル抗体に加えて、ジェノタイプＤと特異的に結合するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。そのようにすれば、日本人に多いジェノタイプＣも、欧州人やインド人に多いジェノタイプＤも高感度に検出することができる。
【0014】
ＨＢＶ ｇｅｎ．ＣのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を配列番号１に、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＣのＨＢｅＡｇのアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、配列番号２の１～１０番目のアミノ酸は、図１のＨＢｅＡｇのアミノ酸配列の－１０～－１番目に、１１～１５９番目のアミノ酸は、１～１４９番目に相当する。ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列のうち、アミノ酸Ｎｏ．１－１４９を配列番号３に示す。ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びｐ２２ｃｒＡｇのアミノ酸配列構造の関係概略図を図１に示す。また、実施例で創製されたハイブリドーマＨＢ１２４及びＨＢ１３５が産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープを含む領域を配列番号４に示す。ジェノタイプＣとジェノタイプＤでは、このエピトープ中のＮ末端から数えて１０番目のアミノ酸（以下、「１０ａａ」と記載。他も同様）が、ジェノタイプＣではＧｌｕであるが、ジェノタイプＤではＡｓｐであり、これ以外は両者で同じである。
【0015】
なお、上記のとおり、配列番号３は、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃＡｇのアミノ酸配列のうち、アミノ酸Ｎｏ．１－１４９であるが、配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列は、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＭｉｎｏｒ配列であり、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｅ及びＨＢＶ ｇｅｎ．ＦのＭａｊｏｒ配列でもある。したがって、本発明のモノクローナル抗体のエピトープを含む領域である配列番号３の３１～４８番アミノ酸配列は、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｅ及びＨＢＶ ｇｅｎ．ＦのＭａｊｏｒ配列中の配列でもある。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｅ及びＨＢＶ ｇｅｎ．Ｆにも特異的に結合する。このことは、下記実施例においても実験的に確認されている。このため、本発明の方法によれば、欧州やインドにおけるＨＢＶ感染者に多いジェノタイプＤ、ならびに欧州や南米におけるＨＢＶ感染者に多いジェノタイプＥおよびジェノタイプＦも高感度に検出することができる。
【0016】
本発明のイムノアッセイにおいては、上記した各モノクローナル抗体自体を用いることもできるし、各モノクローナル抗体に代えて、又は各モノクローナル抗体と共に、それらの抗原結合性断片を用いてもよい。抗体の抗原結合性断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
【0017】
ＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体として、少なくとも上記した、ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ、Ｅ及びＦのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる点以外は、本発明のイムノアッセイは、周知のイムノアッセイと同様にして行うことができる。すなわち、このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、例えば、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。これらのイムノアッセイ自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。
【0018】
直接競合法は、測定すべき標的抗原（本発明ではＨＢｃｒＡｇ）に対する抗体を固相に固定化し（固相化）、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理（血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理）後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料と、一定量の標識した抗原とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量（標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ）を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ２０１５０１６６６７８Ａに記載されている。
【0019】
間接競合法では、標的抗原（本発明ではＨＢｃｒＡｇ）を固相化する。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したＵＳ２０１５０１６６６７８Ａに記載されている。
【0020】
サンドイッチ法は、抗標的抗原抗体を固相化し、ブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料を反応させ、洗浄後、標的抗原に対する標識した二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。サンドイッチ法において、固相化した抗体を「捕捉用抗体」、標識した抗体を「検出用抗体」とも称する。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。サンドイッチ法自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ２０１５０３０９０１６Ａ１に記載されている。
【0021】
上記した各種イムノアッセイのうち、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類したイムノアッセイである。化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、ＡＭＰＰＤ）を用いた、イムノアッセイである。酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等）を用いるイムノアッセイである。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、１，２－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）や３，３'，５，５'－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）等、アルカリフォスファターゼの場合には、ｐ－ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）等、β－ガラクトシダーゼの場合には、ＭＧ：４－メチルウンベリフェリルガラクトシド、ＮＧ：ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、標識として蛍光物質または蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質または蛍光タンパク質としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いるイムノアッセイ自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ８０３９２２３ＢやＵＳ２０１５０３０９０１６Ａ１に記載されている。
【0022】
免疫比濁法（ＴＩＡ）は、測定すべき標的抗原（本発明ではＨＢｃｒＡｇ）と、該抗原に対する抗体との結合により生成された抗原抗体複合物により濁度が増大する現象を利用したイムノアッセイである。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、ＵＳ ２０１４０１８６２３８ Ａ１に記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、ＵＳ ７，８２０，３９８ Ｂに記載されている。
【0023】
イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体（マトリックスやストリップとも呼ばれる）上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばＵＳ ６２１０８９８ Ｂに記載されている。
【0024】
上記した各種イムノアッセイのうち、検出感度及び自動化の容易性の観点から、サンドイッチ法、特に、固相として磁性粒子を用い、標識として酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ））を用いるイムノアッセイである化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）が好ましい。
【0025】
ＨＢｃＡｇは、分子間Ｓ－Ｓ結合を有し、ＨＢｅＡｇは分子内Ｓ－Ｓ結合を有しており、これらのＳ－Ｓ結合により所定の立体構造を維持している。これらの抗原を高感度にイムノアッセイするためには、これらのＳ－Ｓ結合を切断して抗原を直線化し、抗原と自己抗体とを解離させることが望まれるため、ＨＢｃｒＡｇの検出のために、被検試料（検体）を前処理することが好ましい。以下、この前処理及び前処理後のイムノアッセイにおける反応工程と検出工程について説明する。
【0026】
１．前処理工程
本発明の方法は、生体試料と抗体とを反応させる免疫反応により生体試料中に存在するＨＢｃｒＡｇを測定する方法であるが、免疫反応（反応工程）の前に、生体試料と界面活性剤、酸性化剤又はアルカリ性物質を含む前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことが好ましい。前処理液は、酸性化剤又はアルカリ性物質と、界面活性剤とを含んでもよい。前処理工程により、生体試料中に元々存在するＨＢｃｒＡｇに特異的に結合する抗体の影響による、ＨＢｃｒＡｇの低値化を低減することができる。また、ＨＢｃＡｇは、分子間Ｓ－Ｓ結合を有し、ＨＢｅＡｇは分子内Ｓ－Ｓ結合を有しており、これらのＳ－Ｓ結合により所定の立体構造を維持している。これらの抗原をイムノアッセイするためには、これらのＳ－Ｓ結合を切断して抗原を直線化（リニアエピトープ化）することが望まれる。したがって、前処理には、Ｓ－Ｓ結合を切断する還元剤が含まれることが好ましい。即ち、前処理液は、（１）界面活性剤、酸性化剤又はアルカリ性物質と、（２）還元剤を含むことが好ましい。
本発明の方法は、生体試料と抗体とを反応させる免疫反応により生体試料中に存在するＨＢｃｒＡｇを測定する方法であるが、免疫反応（反応工程）の前に、生体試料と界面活性剤、酸性化剤又はアルカリ性物質を含む前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことが好ましい。前処理液は、酸性化剤又はアルカリ性物質と、界面活性剤とを含んでもよい。前処理工程により、生体試料中に元々存在するＨＢｃｒＡｇに特異的に結合する抗体の影響による、ＨＢｃｒＡｇの低値化を低減することができる。また、ＨＢｃＡｇは、分子間Ｓ－Ｓ結合を有し、ＨＢｅＡｇは分子内Ｓ－Ｓ結合を有しており、これらのＳ－Ｓ結合により所定の立体構造を維持している。これらの抗原をイムノアッセイするためには、これらのＳ－Ｓ結合を切断して抗原を直線化（リニアエピトープ化）することが望まれる。したがって、前処理には、Ｓ－Ｓ結合を切断する還元剤が含まれることが好ましい。即ち、前処理液は、（１）界面活性剤、酸性化剤又はアルカリ性物質と、（２）還元剤を含むことが好ましい。
【0027】
前記前処理工程において混和する生体試料と前処理液の体積比は、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、ＨＢｃｒＡｇを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血液試料（血清、血漿、全血）、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、生体試料は、血液試料であり、より好ましくは血清または血漿である。
【0028】
前処理液は、界面活性剤、酸性化剤又はアルカリ性物質に加えて、さらに還元剤を含むことが好ましい。前処理液に含まれる還元剤の好ましい例としては、２－ジエチルアミノエタンチオール（ＤＥＡＥＴ）、トリス （２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、イミダゾール、システイン、システアミン、ジメチルアミノエタンチオール、ジエチルアミノエタンチオール、ジイソプロピルアミノエタンチオール、ジチオスレイトール等を挙げることができる。還元剤の濃度としては、生体試料との混和液の終濃度として０．５～１００ｍＭ、特に１．０～５０ｍＭ、さらに２．０～２０ｍＭとすることが好ましい。
【0029】
前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。
【0030】
前処理条件は、大別して、１．酸性化剤を主成分として含む前処理液を使用する系（酸性化前処理系）と、２．ＳＤＳ等の界面活性剤を主成分として含む前処理液を使用する系（界面活性剤前処理系）と、３．アルカリ性物質を主成分として含む前処理液を使用する系（アルカリ性前処理系）の３種類の系に分けられ、これらの何れかを選択可能である。以下、それぞれの前処理系について分けて記載する。
【0031】
１－１．酸性化前処理
酸性化前処理系において、前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０１Ｎ以上、特に０．０２Ｎ以上０．５Ｎ以下、さらに０．０５Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０１Ｎ以上とすることで、前処理の効果が十分に得ることが可能である。
酸性化前処理系において、前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０１Ｎ以上、特に０．０２Ｎ以上０．５Ｎ以下、さらに０．０５Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０１Ｎ以上とすることで、前処理の効果が十分に得ることが可能である。
【0032】
酸性化前処理においては、生体試料との混和時に沈澱が生じないよう、界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤の種類としては、陽イオン性、両イオン性、非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【0033】
陽イオン性界面活性剤としては、特に炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミンまたは第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１６ＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．０１％以上１％以下が好ましく、さらに、０．０１％～０．５％が好ましい。
【0034】
なお、本明細書中で記載される「％」の濃度は、特に記載のない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度表示である。
【0035】
非イオン界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００等）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）３５等）等を挙げることができる。
【0036】
両イオン性界面活性剤の例としては、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１２ＡＰＳ）、Ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１４ＡＰＳ）、Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１６ＡＰＳ）などが挙げられる。
【0037】
前処理工程は、生体試料と前処理液を単に混和し、混合液を室温又は加熱下で所定時間放置することにより行うことができる。必要に応じて、撹拌、振とうなどを行ってもよい。特に、混合液は、加熱することが好ましい。加熱温度は、例えば２５℃～４５℃であり、好ましくは３０℃～４０℃である。前処理時間は、１分以上、特に３分以上、さらに５分以上とすることが好ましい。前処理時間の上限は特に存在しないが、６０分以下でよい。
【0038】
１－２．界面活性剤前処理
界面活性剤前処理系において、前処理液に含まれる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び陽イオン界面活性剤から成る群より選ばれる少なくとも１種であってよい。特に、陰イオン性界面活性剤を主成分として含むことが好ましい。使用可能な非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤の例は、上記１－１に例示したものと同様である。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム （ＳＤＢＳ）、デオキシコール酸等を挙げることができる。ＳＤＳを使用する場合は、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、０．１～１２．５％、特に０．２５～１０％、さらに０．５～７．５％とすることが好ましい。ＳＤＳの濃度を０．１～１０％とすることで、抗原を検体中の抗体から十分に遊離させるとともに、ＳＤＳの析出等を生じにくい、という効果を奏する。
界面活性剤前処理系において、前処理液に含まれる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、及び陽イオン界面活性剤から成る群より選ばれる少なくとも１種であってよい。特に、陰イオン性界面活性剤を主成分として含むことが好ましい。使用可能な非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤の例は、上記１－１に例示したものと同様である。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム （ＳＤＢＳ）、デオキシコール酸等を挙げることができる。ＳＤＳを使用する場合は、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、０．１～１２．５％、特に０．２５～１０％、さらに０．５～７．５％とすることが好ましい。ＳＤＳの濃度を０．１～１０％とすることで、抗原を検体中の抗体から十分に遊離させるとともに、ＳＤＳの析出等を生じにくい、という効果を奏する。
【0039】
前処理液が陰イオン性界面活性剤を上記濃度で含有する場合、感度向上の観点から、さらに非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤から成る群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を含むことが好ましい。非イオン性界面活性剤の濃度は、前処理時の終濃度で０．０１％～５％が好ましく、さらに０．０５％～５％が好ましい。両イオン性界面活性剤の終濃度は、０．０１％～５％が好ましい。
【0040】
上記陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤または両イオン性界面活性剤の混合液に陽イオン界面活性剤を加えることもできる。陽イオン界面活性剤の濃度は、０．０１％～１％が好ましい。
【0041】
界面活性剤前処理においては、生体試料と前処理液を単に混和し、混合液を室温又は加熱下で放置または撹拌、振とうすることにより行うことができる。混合液は、加熱することが好ましい。加熱温度は、例えば３５℃～９５℃であり、好ましくは６０℃～８０℃である。前処理時間は、１分以上であればよく、上限は特に存在しないが、６０分以下でよい。
【0042】
１－３．アルカリ性前処理
アルカリ性前処理系において、前処理液に含まれるアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化物等を好適に使用できる。前処理液のアルカリ性物質の規定度は、前処理時の終濃度として、０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。アルカリ性物質の規定度を０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
アルカリ性前処理系において、前処理液に含まれるアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類金属水酸化物等を好適に使用できる。前処理液のアルカリ性物質の規定度は、前処理時の終濃度として、０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。アルカリ性物質の規定度を０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
【0043】
アルカリ性前処理においては、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤の種類としては、非イオン性、両イオン性、陰イオン性界面活性剤が挙げられる。これにより、後述するイムノアッセイの感度をさらに向上させることができる。使用可能な非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び陰イオン性界面活性剤の例は、上記１－１及び上記１－２に例示したものと同様である。
【0044】
前処理工程は、生体試料と前処理液を単に混和し、混合液を室温又は加熱下で所定時間放置することにより行うことができる。必要に応じて、撹拌、振とうなどを行ってもよい。特に、混合液は、加熱することが好ましい。加熱温度は、例えば２５℃～４５℃であり、好ましくは３０℃～４０℃である。前処理時間は、１分以上、特に３分以上、さらに５分以上とすることが好ましい。前処理時間の上限は特に存在しないが、６０分以下でよい。
【0045】
２．反応工程
本発明の方法の上記前処理工程で得られた生体試料混和液は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液中の抗原をＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる。生体試料混和液は、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる前に、緩衝液と混和してもよい。上記前処理工程において、酸性化剤又はアルカリ性物質を主成分として含む前処理液を使用する場合は、生体試料混和液は、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる前に、緩衝液と混和することが好ましい。なお、ＨＢｃｒＡｇのイムノアッセイ自体は、上記したとおり種々の方法が周知であり、ＨＢｃｒＡｇを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。
本発明の方法の上記前処理工程で得られた生体試料混和液は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液中の抗原をＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる。生体試料混和液は、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる前に、緩衝液と混和してもよい。上記前処理工程において、酸性化剤又はアルカリ性物質を主成分として含む前処理液を使用する場合は、生体試料混和液は、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体と反応させる前に、緩衝液と混和することが好ましい。なお、ＨＢｃｒＡｇのイムノアッセイ自体は、上記したとおり種々の方法が周知であり、ＨＢｃｒＡｇを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。
【0046】
前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられる。前処理液として界面活性剤を含有するものを使用した場合には、未反応の界面活性剤を吸収するために、例えば、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）デキストラン硫酸ナトリウム等の水溶性高分子を前処理後の混和液と混合した際の終濃度で０．０１～１０．０％、特に０．０５～５．０％程度含む緩衝液を使用することが好ましい。前処理工程の混和液と緩衝液との混合は、体積比で、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。
【0047】
本発明の方法で使用されるＨＢｃｒＡｇに対する抗体は、上記したとおりである。ＨＢｃｒＡｇに対する抗体は、固相化されていてもよい。本明細書において、固相化された抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。
【0048】
反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合する場合、混和後に固相化した抗体に接触させてもよく、緩衝液中に例えば粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。
【0049】
ＨＢｃｒＡｇに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム、ルテニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体としては、このような標識物質で標識化されていてもよい。
【0050】
このような標識物質で標識された抗体を含む溶液（以下、「標識体液」と呼ぶことがある）に水溶性高分子を含ませることにより、検出感度がさらに向上させることができるので好ましい。水溶性高分子としては、デキストラン、アミノデキストラン、フィコール（商品名）、デキストリン、アガロース、プルラン、各種セルロース（例えば、ヘミセルロースやリグリン等）、キチン、キトサン、β―ガラクトシダーゼ、サイログロブリン、ヘモシアニン、ポリリジン、ポリペプチド及びＤＮＡ、並びにこれらの修飾体（例えば、ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎやデキストラン硫酸ナトリウム等）を挙げることができる。これらのうち、多糖類であるフィコール（商品名）、デキストラン及びアミノデキストラン並びにこれらの修飾体が好ましい。水溶性高分子の重量平均分子量は、特に限定されないが、イムノアッセイの感度の観点及び水溶性であるという観点から、６千～４００万が好ましい。標識体液中の水溶性高分子の濃度は、特に限定されないが、検出感度の観点から、標識体液全体に対して通常、０．５％～１０％、好ましくは、１％～８％である。
【0051】
特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体と異なるエピトープを認識するＨＢｃｒＡｇに対する別の抗体（二次抗体）を含む。ＨＢｃｒＡｇに対するモノクローナル抗体により認識されるエピトープと、ＨＢｃｒＡｇに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。二次抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、再現性の観点からモノクローナル抗体が好ましい。
【0052】
３． 検出工程
一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
【0053】
本発明は、また、上記した本発明のイムノアッセイを実施するためのキットをも提供する。当該キットは、上記した、ＨＢＶ ｇｅｎ．ＤのＨＢｃｒＡｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。該モノクローナル抗体は、磁性粒子等に固相化されていてもよく、また、標識化されていてもよい。好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体は、磁性粒子等に固相化されている。好ましい実施形態では、本発明のキットは、採用されるイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明のキットは、ｉ）上記前処理液、ｉｉ）ＨＢｃｒＡｇに対するモノクローナル抗体、ｉｉｉ）緩衝液、並びに任意の構成成分として、ｉｖ）ＨＢｃｒＡｇに対する別の抗体、ｖ）標識物質、ｖｉ）希釈液、及び、必要に応じて、ｖｉｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉｉ）及びｉｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｖ）の構成成分は、ｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、ＨＢｃｒＡｇに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。
【0054】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0055】
実施例１ Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原（ＨＢｃｒＡｇ）ジェノタイプＤに反応するモノクローナル抗体の構築
（１－１）ＨＢＶコア関連抗原の発現および精製
（Ａ）ＨＢｃ抗原発現プラスミドの構築
ＨＢＶジェノタイプＤ（ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ）のコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。 ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ患者血清１００μＬをＤＮＡ抽出液１００μＬ 〔１Ｍ Ｔｒ ｉｓ－ ＨＣ１ （ｐＨ８．４）が １０μＬ， ２５０ｍＭ ＥＤＴＡが８μＬ，１０％ＳＤＳが４０μＬ， ５Ｍ ＮａＣｌが ８μＬ，２０ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが１０μＬ， ｔＲＮＡ（５μｇ／μＬ）が １μＬ，滅菌水が２３μＬ〕と混合させ、５４℃、３０分間保温した。２００μＬのフェノール ・ クロロホルム（１：１）溶液を加えて混合し、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、上清を取り出し１５０μＬのイソプロパノールと７μＬの５Ｍ ＮａＣｌを加えて－２０℃で１時間静置した。１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールでリンスし、１５，０００ｒｐｍ、４℃で再度５分間遠心分離した。沈殿物を自然乾燥させ、２０μＬの滅菌水に溶解させてＨＢＶ ＤＮＡ溶液とした。
（１－１）ＨＢＶコア関連抗原の発現および精製
（Ａ）ＨＢｃ抗原発現プラスミドの構築
ＨＢＶジェノタイプＤ（ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ）のコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。 ＨＢＶ ｇｅｎ．Ｄ患者血清１００μＬをＤＮＡ抽出液１００μＬ 〔１Ｍ Ｔｒ ｉｓ－ ＨＣ１ （ｐＨ８．４）が １０μＬ， ２５０ｍＭ ＥＤＴＡが８μＬ，１０％ＳＤＳが４０μＬ， ５Ｍ ＮａＣｌが ８μＬ，２０ｍｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが１０μＬ， ｔＲＮＡ（５μｇ／μＬ）が １μＬ，滅菌水が２３μＬ〕と混合させ、５４℃、３０分間保温した。２００μＬのフェノール ・ クロロホルム（１：１）溶液を加えて混合し、１５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、上清を取り出し１５０μＬのイソプロパノールと７μＬの５Ｍ ＮａＣｌを加えて－２０℃で１時間静置した。１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、沈殿物を７０％エタノールでリンスし、１５，０００ｒｐｍ、４℃で再度５分間遠心分離した。沈殿物を自然乾燥させ、２０μＬの滅菌水に溶解させてＨＢＶ ＤＮＡ溶液とした。
【0056】
このＨＢＶ ＤＮＡ溶液の５μＬを２つのプライマー（５'－ｇａａｔｔｃａｔｇｇａｃａｔｔｇａｃｃｃｇｔａｔａａａ－３'（配列番号５）、５'－ｇｇａｔｃｃｔａａｃａｔｔｇａｇａｔｔｃｃｃｇａｇａ－３'（配列番号６））を用いＰＣＲを行った。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ （ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ製）のキッ卜を用いＤＮＡ変性９５℃１分、アニーリング ５５℃１分、ＤＮＡ合成７２℃１分の条件で行い、得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）で精製した。このＰＣＲにより増幅された遺伝子断片は、ＨＢｃｒＡｇのコアの領域をコードするものである。この増幅されたＨＢｃ遺伝子断片０．５μｇを制限酵素反応液２０μＬ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、約５７０ｂｐのＥｏｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片を精製した。次に発現ベクターであるｐＡＴｒｐのＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素反応液２０μＬ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ- ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ジチオスレイトール，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μＬを加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ΒΑΡ）１μＬ（２５０単位／μＬ）を加えて３７℃で１時間保温した。
【0057】
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ ０．５μｇと上述のＨＢｃ ５７０ｂｐ断片を１０×リガーゼ用緩衝液 〔６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭ ＡＴＰ〕５μＬ、Τ４リガーゼ１μＬ（３５０単位／μＬ）に水を加えて５０μＬとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。発現プラスミドｐＡＴｒｐ－ＨＢｃを得るために、この連結反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
【0058】
形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Mandel,M.とHiga, A. , J. Mol. Biol., 53, 159-162(1970)〕により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，ｌ．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。
【0059】
１．５ｍＬの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションアルカリ法〔Manniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(1982)〕によりＤＮＡ抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡ １μＬを制限酵素反応液２０μＬ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＥｏｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行って、約５７０ｂｐのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴｒｐ－ＨＢｃ発現プラスミドを選別した。
【0060】
（Ｂ）ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｄ抗原をコードするポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドｐＡＴｒｐ－ＨＢｃをもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養した。この培養液１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍＬのＭ９－ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ２ＨＰ０４，０．５％ ＫＨ２Ｐ０４，０．５％ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＳ０４， ０．５％ カザミノ酸，０．２％ グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／Ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を集めた。
発現プラスミドｐＡＴｒｐ－ＨＢｃをもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養した。この培養液１ｍＬを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１００ｍＬのＭ９－ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ２ＨＰ０４，０．５％ ＫＨ２Ｐ０４，０．５％ ＮａＣｌ，０．１％ ＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＳ０４， ０．５％ カザミノ酸，０．２％ グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／Ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を集めた。
【0061】
菌体に２０ｍＬの緩衝液Ａ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），ｌｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭ ＮａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体 ２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ １０ｍＬ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に１２，０００ｒｐｍ、４℃，３０分間遠心分離を行い、ＨＢｃ粒子を含む可溶性画分を得た。回収した上清を２３，０００ｒｐｍ、４℃にて２時間遠心し（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８．１ローター）、沈殿を得た。沈殿は５％ショ糖を含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）， ５ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。５％ショ糖を含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液にて平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｃｈｅｍ）カラム（２．６ｃｍ×８５ｃｍ）にアプライし同緩衝液にて溶出させた。分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析し、ＨＢｃ抗原の分子量２２ｋＤａのバンドが検出された分画を集めた。集めた分画を限外濾過（排除分子量 ５０ｋＤａ）により濃縮した後、 ６０％ショ糖、５０％ショ糖、４０％ショ糖を含むＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液を重層させたステップ密度勾配上に濃縮液を重層させ、３９，０００ｒｐｍ、４℃にて５時間遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｙ６０Ｔｉローター）。遠心後底から順に分画し、分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。ＨＢｃ抗原は高密度分画と低密度分画の２層に分画され、それぞれを集め、ＨＢｃ抗原精製品として用いた。
【0062】
（１－２）ハイブリドーマの作製
前記方法により調製したポリベプチド（ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｄ ＨＢｃ）にＳＤＳを終濃度が１０％となるように加え１００℃で５分間変性処理した。この変性ＨＢｃ抗原を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）に終濃度が０．２～１．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、等量のフロイントアジュバントと混和し、４～６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０～２０μｇ腹腔内投与した。２～４週間ごとに計５回同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したＨＢｃ １０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
前記方法により調製したポリベプチド（ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｄ ＨＢｃ）にＳＤＳを終濃度が１０％となるように加え１００℃で５分間変性処理した。この変性ＨＢｃ抗原を、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）に終濃度が０．２～１．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、等量のフロイントアジュバントと混和し、４～６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０～２０μｇ腹腔内投与した。２～４週間ごとに計５回同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したＨＢｃ １０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
【0063】
最終免疫後３日目にこのマウスより脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／ＯＡｇ１４をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄後、該細胞と脾臓細胞を１：５の細胞数比で混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク社）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地１ｍＬをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ－１６４０培地１０ｍＬを加えて細胞融合させた。
【0064】
融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清およびヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、培養上清の一部をとり、あらかじめＳＤＳにより変性させたＨＢｃを固相化抗原に用いたＥＬＩＳＡ法により抗ＨＢｃ抗体を産生するウェルを スクリーニングし、変性ＨＢｃに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。さらに、ＳＤＳ存在下で同様のスクリーニングを行い、ＳＤＳ存在下でも変性ＨＢｃに対する反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選択した。
【0065】
得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローン化を行い、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。得られたハイブリドーマをＨＢ１２４、ＨＢ１３５と命名した。
【0066】
（１－３）モノクローナル抗体の作製および解析
（１－２）に記載の方法により得られたハイブリドーマを、あらかじめプリスタンを腹腔投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔に移植し、７～１４日後産生されたモノクローナル抗体を含む腹水を採取した。該モノクローナル抗体は、 プロティンＡセファロースカラムを用いたアフィ二ティークロマトグラフィ一によりＩｇＧフラクションを分離精製した。
（１－２）に記載の方法により得られたハイブリドーマを、あらかじめプリスタンを腹腔投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔に移植し、７～１４日後産生されたモノクローナル抗体を含む腹水を採取した。該モノクローナル抗体は、 プロティンＡセファロースカラムを用いたアフィ二ティークロマトグラフィ一によりＩｇＧフラクションを分離精製した。
【0067】
抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイビングキット（Ｚｙｍｅｄ社）により、それぞれのモノクローナル抗体の（サブ）クラスを同定した。その結果、ΗΒ１２４はＩｇＧ２ｂ、κ、ＨＢ１３５はＩｇＧ２ａ、κであった。
【0068】
配列番号１又は配列番号３に示すＨＢｃ抗原のアミノ酸配列のうちの２０アミノ酸配列を有する各種ペプチドを調製してマイクロタイタープレートに固相化し、得られたモノクローナル抗体について、各ペプチドに対する反応性を調べ、エピトープ解析を行った。
【0069】
結果を表１に示す。表１には、ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｃに対するモノクローナル抗体である、ＨＢ４４、ＨＢ５０、ＨＢ６１、ＨＢ９１、ＨＢ１１０のエピトープを示す。ＨＢ４４、ＨＢ５０、ＨＢ６１、ＨＢ９１、ＨＢ１１０の調製方法、エピトープ解析方法は、特許文献１に示される通りである。
【0070】
さらに、表１には、ＨＢ１２４、ＨＢ１３５のエピトープ解析結果を示す。ＨＢ１２４およびＨＢ１３５は、配列番号３の３１～４８番目から成るペプチドと特異的に結合した。したがって、ＨＢ１２４およびＨＢ１３５は、配列番号３の３１～４８番目のアミノ酸配列に含まれる領域をエピトープとして認識することが分かった。配列番号３の３１～４８番目のアミノ酸配列は、ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｄ、ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｅ及びＨＢｃ ｇｅｎ．Ｆに共通して見いだされる配列であり、ＨＢ１２４及びＨＢ１３５は、ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｄ、ＨＢｃ ｇｅｎ．Ｅ及びＨＢｃ ｇｅｎ．Ｆに特異的に結合する抗体であることが分かった。
【0071】
【表1】
【0072】
実施例２ ＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤのイムノアッセイによる測定
（１）抗ＨＢｃｒＡｇプレートの調製
ポリスチレン製９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に表２に示す各抗ＨＢｃｒＡｇ抗体を各濃度で含む抗体希釈液（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ９．６）を１００μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩インキュベーションを行った。マイクロウェルプレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ブロッキング液（１．０％ ＢＳＡ、３％スクロースを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル分注し、室温で２時間インキュベーションを行った。ブロッキング液を除去した後、プレートを真空乾燥させ、抗ＨＢｃｒＡｇ抗体プレートとした。
（１）抗ＨＢｃｒＡｇプレートの調製
ポリスチレン製９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に表２に示す各抗ＨＢｃｒＡｇ抗体を各濃度で含む抗体希釈液（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ９．６）を１００μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩インキュベーションを行った。マイクロウェルプレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ブロッキング液（１．０％ ＢＳＡ、３％スクロースを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル分注し、室温で２時間インキュベーションを行った。ブロッキング液を除去した後、プレートを真空乾燥させ、抗ＨＢｃｒＡｇ抗体プレートとした。
【0073】
【表2】
【0074】
（２）ＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤの測定
購入したＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤ陽性血清検体４４検体（ＰｒｏＭｅｄＤｘより入手）について、（１）で調製した２種のプレートを用いて、ＨＢｃｒＡｇの測定を行った。各検体１００μＬを、ＳＤＳ溶液（１５％ ＳＤＳ、２％ Ｔｗｅｅｎ６０（商品名））５０μＬと混合して７０℃で３０分間反応させた。
購入したＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤ陽性血清検体４４検体（ＰｒｏＭｅｄＤｘより入手）について、（１）で調製した２種のプレートを用いて、ＨＢｃｒＡｇの測定を行った。各検体１００μＬを、ＳＤＳ溶液（１５％ ＳＤＳ、２％ Ｔｗｅｅｎ６０（商品名））５０μＬと混合して７０℃で３０分間反応させた。
【0075】
各マイクロウェルプレートに１次反応バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ ＢＳＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ４０５、ｐＨ７．５）１００μＬを分注し、次いで上記反応済み検体を各５０μＬ添加した。室温で１２０分間振とうし、０．５％Ｔｗｅｅｎ（商品名）／ＰＢＳで５回洗浄した。次いで、表３に示すアルカリフォスファターゼ標識抗ＨＢｃｒＡｇモノクローナル抗体（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｃａｓｅｉｎ Ｎａ、１％ＢＳＡ、５．７ｍＭ ＭＥＧＡ１０、３．４ｍＭ ＮＬＳ、ｐＨ７．５）溶液を１００μＬ／ウェル分注し、室温で６０分間静置した。ここで使用したＨＢ９１及びＨＢ１１０は、常法に従ってアルカリフォスファターゼ標識したものである。プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎ（商品名）／ＰＢＳで５回洗浄した後、基質溶液（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標）＋ Ｅｍｅｒａｌｄ ＩＩ（登録商標））を１００μＬ／ウェル分注し、室温で２０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーで測光した。
【0076】
上記検体と同時に既知濃度の組み換えＨＢｃｒＡｇを含む標準液を測定し、標準曲線を作成し、各検体からの発光シグナルからＨＢｃｒＡｇ濃度を算出した。試験例１及び２の条件における各検体の測定値（Ｕ／ｍＬ）の相関を図２に示す。なお、図２の縦軸は試験例１、横軸は試験例２を示す。ＨＢｃｒＡｇのジェノタイプＤ陽性検体４４検体のうち、９検体において、実施例の条件下で測定値が有意に上昇した。抗ＨＢｃｒＡｇモノクローナル抗体ＨＢ１２４を使用することで、ジェノタイプＤの測定感度が向上することが示された。
【0077】
上記に加えて、ＨＢ１２４に代えてＨＢ１３５を使用した固相化プレートを使用して、同様の条件で各検体のＨＢｃｒＡｇの測定を行った。その結果、ＨＢｃｒＡｇの測定値は、ＨＢ１２４を使用した場合と非常に高い相関が得られ、ほぼ同等の結果となった（データ示さず）。
【0078】
【表3】
【0079】
実施例３ 検体前処理液（酸処理）への還元剤添加の影響
ＨＢｃｒＡｇ陽性の抗原濃度既知の購入検体２種（検体Ａ（ｐ２２ｃｒＡｇ優位検体）、検体Ｂ（ＨＢｅＡｇ優位検体））について、これらの１０５倍及び１０６倍希釈検体について、検体前処理及びＨＢｃｒＡｇ検出を行った。
ＨＢｃｒＡｇ陽性の抗原濃度既知の購入検体２種（検体Ａ（ｐ２２ｃｒＡｇ優位検体）、検体Ｂ（ＨＢｅＡｇ優位検体））について、これらの１０５倍及び１０６倍希釈検体について、検体前処理及びＨＢｃｒＡｇ検出を行った。
【0080】
検体３０μＬに表４に示す各種前処理液９０μＬを添加し、３７℃で６．５分間反応させた。中和液（０．７Ｍ Ｂｉｃｉｎｅ、１０％ ＮＬＳ、ｐＨ１０）３０μＬを加えて３７℃で２０秒間反応させた。
【0081】
常法に従って、ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を４：１：４：７となるように固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を使用した。抗体固相化磁性粒子を０．０６％含む粒子希釈液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、８％ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）５０μＬに上記処理済み検体を加えて３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗体ＨＢ９１のＦａｂ断片を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３％ ＢＳＡ、１３．６ｍＭ ＮＬＳ、５．５ｍＭ Ｃ１４ＡＰＳ、ｐＨ７．５）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、ＡＭＰＰＤ基質液を添加して、４６３ｎｍの発光を測定した。
【0082】
各条件下の測定結果を表４に示す。陰性検体においては前処理への還元剤の添加の有無による影響は見られなかったが、ＨＢｃｒＡｇ陽性検体においては、ｐ２２ｃｒＡｇが優位な検体とＨＢｅＡｇが優位な検体の両方においてシグナルの増加が見られた。特に、いずれの検体においても２．４６～２．７４ＬｏｇＵ／ｍＬ（表中では「ＬＵ／ｍＬ」）の極めて低濃度の抗原がより確実に検出可能であることが示された。
【0083】
【表4】
【0084】
実施例４ 検体前処理（ＳＤＳ処理）への還元剤添加の影響
実施例３と同じ血清を１００倍希釈した検体についてＨＢｃｒＡｇ検出を行った。 検体１００μＬに表５に示す各種前処理液２００μＬを添加し、８０℃で５分間反応させた。常法に従って、ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を４：１：４：７となるように固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を使用した。抗体固相化磁性粒子を０．０６％含む粒子希釈液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、８％ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）５０μＬに上記処理済み検体を５０μＬ加えて３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗体ＨＢ９１のＦａｂ断片を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、１１．４ｍＭ ＭＥＧＡ１０，５．１ｍＭ ＮＬＳ、２．９ｍＭ ＳＤＢＳ、ｐＨ７．５）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、ＡＭＰＰＤ基質液を添加して、４６３ｎｍの発光を測定した。
実施例３と同じ血清を１００倍希釈した検体についてＨＢｃｒＡｇ検出を行った。 検体１００μＬに表５に示す各種前処理液２００μＬを添加し、８０℃で５分間反応させた。常法に従って、ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を４：１：４：７となるように固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を使用した。抗体固相化磁性粒子を０．０６％含む粒子希釈液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、８％ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）５０μＬに上記処理済み検体を５０μＬ加えて３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗体ＨＢ９１のＦａｂ断片を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、１１．４ｍＭ ＭＥＧＡ１０，５．１ｍＭ ＮＬＳ、２．９ｍＭ ＳＤＢＳ、ｐＨ７．５）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、ＡＭＰＰＤ基質液を添加して、４６３ｎｍの発光を測定した。
【0085】
各条件下の測定結果を表５に示す。ＨＢｃｒＡｇ陽性検体において、ｐ２２ｃｒＡｇが優位な検体とＨＢｅＡｇが優位な検体の両方においてシグナルの増加が見られた。
【0086】
【表5】
【0087】
実施例５ 標識体液への水溶性高分子添加の影響
実施例３と同じ検体についてＨＢｃｒＡｇ検出を行った。検体３０μＬに前処理液（１６ｍＭ ＤＥＡＥＴを含む）９０μＬを添加し、３７℃で６．５分間反応させた。次いで、中和液３０μＬを加えて３７℃で２０秒間反応させた。
実施例３と同じ検体についてＨＢｃｒＡｇ検出を行った。検体３０μＬに前処理液（１６ｍＭ ＤＥＡＥＴを含む）９０μＬを添加し、３７℃で６．５分間反応させた。次いで、中和液３０μＬを加えて３７℃で２０秒間反応させた。
【0088】
実施例３と同様に調製した抗体固相化磁性粒子を０．０６％含む粒子希釈液５０μＬに上記処理済み検体を加えて３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗体ＨＢ９１のＦａｂ断片を１μｇ／ｍＬ含む表６に示す標識体液を各５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳで洗浄後、ＡＭＰＰＤ基質液を添加して、４６３ｎｍの発光を測定した。
【0089】
各条件下の測定結果を表６に示す。標識体液にフィコールを添加することによって、濃度依存的にシグナルが高くなった。陰性検体においてもシグナルが上がり、バックグラウンドが高くなる傾向があるが、陽性検体のシグナルの上昇がより顕著であった。これにより、２．４６～２．７４ＬＵ／ｍＬの低濃度抗原をさらに確実に検出できることが示された。
【0090】
【表6】
【0091】
実施例６ ＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤ, Ｅ, Ｆの測定
（１）抗ＨＢｃｒＡｇ粒子の調製
実施例３に記載した方法に従って、抗体ＨＢ４４、ＨＢ１３５、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を調製した。また、対照として抗体ＨＢ４４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を調製した。
（１）抗ＨＢｃｒＡｇ粒子の調製
実施例３に記載した方法に従って、抗体ＨＢ４４、ＨＢ１３５、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を調製した。また、対照として抗体ＨＢ４４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（富士レビオ社製）を調製した。
【0092】
（２）ＨＢｃｒＡｇジェノタイプＤ、Ｅ、Ｆ検体および組換えＨＢｅＡｇジェノタイプＤの測定
ＨＢＶジェノタイプＡ, Ｃ, Ｄ陽性検体はＰｒｏＭｅｄＤｘより入手した。ジェノタイプＥ, Ｆ陽性検体はＴＲＩＮＡより入手した。また、組換えＨＢｃｒＡｇとして、ＨＢｅＡｇジェノタイプＤの１～１４９アミノ酸配列からなる組換え抗原を１ｎｇ／ｍLで含む組換え抗原溶液を作製した。検体を実施例３の試験例５の条件にて処理し、処理済み検体を得た。組換え抗原溶液も同様に前処理して、処理済み抗原溶液を得た。
ＨＢＶジェノタイプＡ, Ｃ, Ｄ陽性検体はＰｒｏＭｅｄＤｘより入手した。ジェノタイプＥ, Ｆ陽性検体はＴＲＩＮＡより入手した。また、組換えＨＢｃｒＡｇとして、ＨＢｅＡｇジェノタイプＤの１～１４９アミノ酸配列からなる組換え抗原を１ｎｇ／ｍLで含む組換え抗原溶液を作製した。検体を実施例３の試験例５の条件にて処理し、処理済み検体を得た。組換え抗原溶液も同様に前処理して、処理済み抗原溶液を得た。
【0093】
実施例６（１）で調製したＨＢ４４、ＨＢ１３５、ＨＢ６１及びＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（試験例３２）、ＨＢ４４、ＨＢ６１及びＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（試験例３０）又は実施例３で調製した、ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１及びＨＢ１１４を固相化した磁性粒子（試験例３１）と上記処理済み検体又は抗原溶液を用いた以外は、実施例３に記載した方法でＨＢｃｒＡｇを測定した。さらに、検体の代わりに、既知濃度の組み換えＨＢｃｒＡｇを含む標準液を測定し、標準曲線を作成し、各検体からの発光量からＨＢｃｒＡｇ濃度（ｋＵ／ｍＬ）を算出した。
【0094】
結果を表７に示す。ＨＢ１２４とＨＢ１３５を固相化抗体として加えた試験例３１及び３２では、ＨＢＶジェノタイプＤの検体、及び組換え抗原に、同等の強さで反応することが確認された。
【0095】
また、ＨＢ１２４とＨＢ１３５を固相化抗体として加えた試験例３１及び３２では、これら固相化抗体を加えない試験例３０と比較して、ＨＢＶジェノタイプＥ及びジェノタイプＦ検体の測定値が平均で約４倍上昇した。
【0096】
モノクローナル抗体ＨＢ１２４、ＨＢ１３５を使用することで、ジェノタイプＥ、Ｆの測定感度が向上することが示された。
【0097】
【表7】
【0098】
実施例７ アルカリ性物質を含む前処理
組換えＨＢｃｒＡｇを０、５、２５０ＫＵ／ｍＬで含む抗原溶液に、モノクローナル抗体ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４、ＨＢ９１を各１０μｇ／ｍＬとなるように添加後、３７℃で６０分インキュベートし、競合抗体陽性モデル検体を作製した。モノクローナル抗体を添加していない抗原溶液を競合抗体陰性モデル検体とした。１．５ｍＬチューブに競合抗体陽性モデル検体と競合抗体陰性モデル検体４０μＬを分注した。０Ｍ～０．５Ｍに調製した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を７０μＬ添加後撹拌し、３７℃で６．５分間反応させた。ＮａＯＨと等モル濃度の塩酸、０．７Ｍ Ｕｒｅａ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む中和液７０μＬを加えて中和後速やかに撹拌し、処理済み検体を得た。
組換えＨＢｃｒＡｇを０、５、２５０ＫＵ／ｍＬで含む抗原溶液に、モノクローナル抗体ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４、ＨＢ９１を各１０μｇ／ｍＬとなるように添加後、３７℃で６０分インキュベートし、競合抗体陽性モデル検体を作製した。モノクローナル抗体を添加していない抗原溶液を競合抗体陰性モデル検体とした。１．５ｍＬチューブに競合抗体陽性モデル検体と競合抗体陰性モデル検体４０μＬを分注した。０Ｍ～０．５Ｍに調製した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を７０μＬ添加後撹拌し、３７℃で６．５分間反応させた。ＮａＯＨと等モル濃度の塩酸、０．７Ｍ Ｕｒｅａ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む中和液７０μＬを加えて中和後速やかに撹拌し、処理済み検体を得た。
【0099】
実施例３で調製した、ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１及びＨＢ１１４を固相化した磁性粒子を０．０６％含む粒子希釈液５０μＬに上記処理済み検体３０μＬを加え、３７℃で８分間反応させた。以降の反応は実施例３に記載の方法でＨＢｃｒＡｇを測定した。
【0100】
表８に示したように、前処理時０．１２７ Ｍ以上のＮａＯＨの存在で、競合抗体による影響を受けずにＨＢｃｒＡｇを測定できることを確認した。
【0101】
【表8】
【0102】
実施例８ 検体前処理液（アルカリ性処理）への界面活性剤の添加効果
アルカリ性物質を含む前処理液に組み合わせる界面活性剤として、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０）、両イオン性界面活性剤（ＣＨＡＰＳ、Ｃ１２ＡＰＳ、Ｃ１４ＡＰＳ、Ｃ１６ＡＰＳ）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ、ＳＤＢＳ、ＮＬＳ）について検討した。
アルカリ性物質を含む前処理液に組み合わせる界面活性剤として、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０）、両イオン性界面活性剤（ＣＨＡＰＳ、Ｃ１２ＡＰＳ、Ｃ１４ＡＰＳ、Ｃ１６ＡＰＳ）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ、ＳＤＢＳ、ＮＬＳ）について検討した。
【0103】
０．２Ｍ ＮａＯＨ（前処理時濃度０．１２７Ｍ）、各種界面活性剤を０．１６、０．８、４％（前処理時濃度０．１、０．５、２．５％）となるように混合して前処理液を調製した。
１．５ｍＬチューブに実施例７で調製した、競合抗体陽性モデル検体（組換えＨＢｃｒＡｇ濃度２５０ＫＵ／ｍＬ）と競合抗体陰性モデル検体（組換えＨＢｃｒＡｇ濃度２５０ＫＵ／ｍＬ）４０μＬと、ＮａＯＨ及び各種界面活性剤を混合した前処理液７０μＬとを混合し、撹拌後３７℃で６．５分間反応させた。０．２ＭのＨＣｌを含む中和液７０μＬを加えて中和後速やかに撹拌し、処理済み検体を得た。アルカリ処理をしない場合のＣｏｎｔｒｏｌとして、上記前処理液の代わりに０．２ＭのＮａＣｌ溶液を用いた。
上記処理済み検体中のＨＢｃｒＡｇの測定は、実施例７と同様に行った。
１．５ｍＬチューブに実施例７で調製した、競合抗体陽性モデル検体（組換えＨＢｃｒＡｇ濃度２５０ＫＵ／ｍＬ）と競合抗体陰性モデル検体（組換えＨＢｃｒＡｇ濃度２５０ＫＵ／ｍＬ）４０μＬと、ＮａＯＨ及び各種界面活性剤を混合した前処理液７０μＬとを混合し、撹拌後３７℃で６．５分間反応させた。０．２ＭのＨＣｌを含む中和液７０μＬを加えて中和後速やかに撹拌し、処理済み検体を得た。アルカリ処理をしない場合のＣｏｎｔｒｏｌとして、上記前処理液の代わりに０．２ＭのＮａＣｌ溶液を用いた。
上記処理済み検体中のＨＢｃｒＡｇの測定は、実施例７と同様に行った。
【0104】
前処理時０．１％以上の非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤が存在することにより、アルカリ処理による沈殿が生じることが軽減され、競合抗体による影響を受けることなく感度上昇が確認された(表９)。
陰イオン性界面活性剤は、非イオン性、両イオン性界面活性剤よりさらに感度の上昇が認められた。
陰イオン性界面活性剤は、非イオン性、両イオン性界面活性剤よりさらに感度の上昇が認められた。
【0105】
【表9】
【0106】
実施例９ 検体前処理液（アルカリ性処理）への界面活性剤及び還元剤の添加効果
ＨＢｃｒＡｇ陽性の抗原濃度既知の購入検体２種（検体Ａｘ１０４希釈、４．４６ＬｏｇＵ／ｍＬ（ｐ２２ｃｒＡｇ優位検体）、検体Ｂｘ１０４希釈、４．７４ＬｏｇＵ／ｍＬ（ＨＢｅＡｇ優位検体））にモノクローナル抗体ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４、ＨＢ９１を各１０μｇ／ｍＬとなるように添加後、３７℃で６０分インキュベートし、競合抗体陽性検体を作製した。モノクローナル抗体を添加していない検体を競合抗体陰性検体とした。
０．２Ｍ（前処理時０．１２７Ｍ）ＮａＯＨ、４．７１％（前処理時３％）ＳＤＳの前処理液に還元剤としてＤＥＡＥＴ又はＴＣＥＰを前処理時１、３、６、１０ｍＭとなるように添加し、前処理液を調製した。上記の競合抗体陽性検体及び競合抗体陰性検体４０μＬに、ＮａＯＨとＳＤＳと各濃度のＤＥＡＥＴ又はＴＣＥＰを混合した前処理液を７０μＬ添加し、撹拌後３７℃で６．５分間反応させた。０．２Ｍ ＨＣｌを含む中和液を７０μＬ加えて中和後速やかに撹拌した。コントロールとして、還元剤０ｍＭにて同様に処理した。
上記処理済み検体中のＨＢｃｒＡｇの測定は、実施例７と同様に行った。
還元剤を添加することにより、前処理による感度上昇が確認され、特に検体Ａ（ｐ２２ｃｒ優位検体）に対して効果が認められた（表１０）。
ＨＢｃｒＡｇ陽性の抗原濃度既知の購入検体２種（検体Ａｘ１０４希釈、４．４６ＬｏｇＵ／ｍＬ（ｐ２２ｃｒＡｇ優位検体）、検体Ｂｘ１０４希釈、４．７４ＬｏｇＵ／ｍＬ（ＨＢｅＡｇ優位検体））にモノクローナル抗体ＨＢ４４、ＨＢ１２４、ＨＢ６１、ＨＢ１１４、ＨＢ９１を各１０μｇ／ｍＬとなるように添加後、３７℃で６０分インキュベートし、競合抗体陽性検体を作製した。モノクローナル抗体を添加していない検体を競合抗体陰性検体とした。
０．２Ｍ（前処理時０．１２７Ｍ）ＮａＯＨ、４．７１％（前処理時３％）ＳＤＳの前処理液に還元剤としてＤＥＡＥＴ又はＴＣＥＰを前処理時１、３、６、１０ｍＭとなるように添加し、前処理液を調製した。上記の競合抗体陽性検体及び競合抗体陰性検体４０μＬに、ＮａＯＨとＳＤＳと各濃度のＤＥＡＥＴ又はＴＣＥＰを混合した前処理液を７０μＬ添加し、撹拌後３７℃で６．５分間反応させた。０．２Ｍ ＨＣｌを含む中和液を７０μＬ加えて中和後速やかに撹拌した。コントロールとして、還元剤０ｍＭにて同様に処理した。
上記処理済み検体中のＨＢｃｒＡｇの測定は、実施例７と同様に行った。
還元剤を添加することにより、前処理による感度上昇が確認され、特に検体Ａ（ｐ２２ｃｒ優位検体）に対して効果が認められた（表１０）。
【0107】
【表10】
【図1】
【図2】
【配列表】