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特許7494230無菌眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶懸濁液の調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-24
(45)【発行日】2024-06-03
(54)【発明の名称】無菌眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶懸濁液の調製方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/56 20060101AFI20240527BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240527BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20240527BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240527BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240527BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240527BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240527BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240527BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240527BHJP
【ＦＩ】
A61K31/56
A61K9/10
A61K47/04
A61K47/10
A61K47/38
A61K47/18
A61K47/02
A61K47/34
A61P27/02
【請求項の数】
8
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022015508
(22)【出願日】2022-02-03
(62)【分割の表示】P 2020124238の分割
【原出願日】2020-07-21
(65)【公開番号】P2022062172
(43)【公開日】2022-04-19
【審査請求日】2022-07-27
(31)【優先権主張番号】62/877,599
(32)【優先日】2019-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/942,551
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】514283353
【氏名又は名称】ニコックス アフサァルミィクス、 インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＩＣＯＸ ＯＰＨＴＨＡＬＭＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ジャン－ミシェル・ブコウスキー
(72)【発明者】
【氏名】アクシャイ・ナドカーニ
(72)【発明者】
【氏名】ホセ・エル・ボイヤー
(72)【発明者】
【氏名】ブリジット・デュケスロイ－チャクルン
(72)【発明者】
【氏名】トーマス・ナヴラティル
【審査官】榎本 佳予子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２０１４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２８８８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－１７７３６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３８８２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１８１９３５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリセリン（グリセロール）、ホウ酸、及び１００nmから１０００nmの平均粒子径を有するプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含む、局所眼用水性ナノ懸濁液の調製方法であって：ａ）プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、ホウ酸を含むが、グリセロールを含まない水性ビヒクルに懸濁して解凝集する工程、そしてそれから
ｂ）グリセロールを前記ビヒクルに添加する工程
を含み、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、該ナノ結晶のＸ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に対して実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、方法。
【請求項2】
最終の局所眼用水性ナノ懸濁液中のプロピオン酸フルチカゾンの濃度が０．００１重量％から１重量％である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
最終の局所眼用水性ナノ懸濁液中のプロピオン酸フルチカゾンの濃度が、０．５重量％、０．２５重量％、０．２重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％である、請求項１記載の方法。
【請求項4】
２重量％から２０重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を有する、注射用のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の水中懸濁液を、オートクレーブ処理することにより滅菌する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の水中懸濁液を、約１２２℃で約３０分間オートクレーブ処理する、請求項４記載の方法。
【請求項6】
工程ａ）において、懸濁及び解凝集が、６０００RPMで実施される、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
工程ａ）において、懸濁及び解凝集が少なくとも１０分間適用される、請求項６記載の方法。
【請求項8】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、以下の工程：１）下記：
０．４５重量％のプロピオン酸フルチカゾン多形１、
２３．２重量％のポリエチレングリコール４００（PEG 400）、
６８．８重量％のポリプロピレングリコール４００（PPG 400）、
７．６重量％のポリソルベート８０（Tween 80）
を含む第Ｉ相溶液を調製し；該第Ｉ相溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
２）下記：
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．４０重量％のメチルセルロース１５ｃｐ、
０．１重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
pHを３．４～３．８にするクエン酸塩緩衝液、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む第ＩＩ相溶液を調製し、該第ＩＩ相溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
３）該濾過された第Ｉ相及び第ＩＩ相溶液を、０～４℃の温度に冷却する工程；
４）超音波トランスデューサー（QSonica Q2000超音波トランスデューサー）を備えた反応器内で、該第Ｉ相溶液と第ＩＩ相溶液を混合して、ナノ結晶の第ＩＩＩ相懸濁液を得る工程であって：
－ 該第Ｉ相溶液及び第ＩＩ相溶液が、それぞれ６００mL／分（第Ｉ相溶液）及び２４００mL／分（第ＩＩ相溶液）の流速で、該反応器に連続的にポンプで送り込まれ；
－ 第Ｉ相と第ＩＩ相の容積比は１：４であり；
－ 該超音波処理は、出力６０％で混合中に適用され；
－ 第ＩＩＩ相懸濁液の平均温度は約１１℃である工程
５）工程４）の第ＩＩＩ相懸濁液を、超音波処理を行わずに、渦流を発生させるのに十分な速度で、室温で最低３０分間、低剪断で混合する工程；
６）該第ＩＩＩ相懸濁液を、４０℃で１６時間以上かけてアニールする工程；
７）下記：
０．２重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
０．２重量％のポリソルベート８０（Tween 80）、
０．００１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．０５重量％のリン酸二水素ナトリウム一水和物、
０．０２重量％のリン酸一水素ナトリウム二水和物、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含み、６．３±０．２のpHを有する緩衝溶液を調製し、該緩衝溶液を０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
８）工程６）の該第ＩＩＩ相懸濁液を、該濾過された緩衝溶液で希釈する工程であって、緩衝溶液と第ＩＩＩ相の体積比が１：１である工程；
９）該希釈した第ＩＩＩ相懸濁液を遠心分離して、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を回収し、回収したナノ結晶を洗浄する工程；
１０）採取したナノ結晶を注射用水で洗浄する工程
に従って調製する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、水性ビヒクル中にプロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶を含む、無菌局所眼用ナノ懸濁液を調製する方法に関する。該方法は、大規模生産のための調製に容易に適応可能であり、安定な粒度分布を有する無菌の均一な水性ナノ懸濁液をもたらす。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含む、無菌局所眼用水性ナノ懸濁液は、眼瞼（例えば、上眼瞼及び下眼瞼）、睫毛及び眼瞼縁への前記ナノ懸濁液（又はナノ結晶懸濁液）の局所投与を介しての、眼の炎症疾患又は眼の炎症性病態の処置に有用である。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含む、無菌局所眼用水性ナノ懸濁液は、眼瞼（例えば、上眼瞼及び下眼瞼）、睫毛及び眼瞼縁への前記ナノ懸濁液（又はナノ結晶懸濁液）の局所投与を介しての、眼の炎症疾患又は眼の炎症性病態の処置に有用である。
【背景技術】
【0002】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有するナノプレートである。このプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶は、ＷＯ２０１３／１６９６４７に開示された貧溶媒超音波結晶化法（anti-solvent sonocrystallization process）により、市販のプロピオン酸フルチカゾン多形１から調製される。
ＷＯ２０１３／１６９６４７は、プロピオン酸フルチカゾン（Ａ型）の多形形態のナノ結晶の調製、それらの精製及び前記ナノ結晶を含む水性懸濁液の調製を開示している。
要約すると、ＷＯ２０１３／１６９６４７（実施例１１及び図３８）によって開示された連続超音波処理フロースルースケールアップ法に従い、プロピオン酸フルチカゾンのナノ結晶を、超音波処理下での貧溶媒結晶化を用いて調製し、続いてナノ懸濁液の熱アニーリングを行う；生成したナノ結晶を連続フロー遠心分離により精製し、ナノ懸濁液のビヒクルを遠心分離し、このペレットを洗浄溶液中に再分散させ、分散液を再び遠心分離する。この洗浄手順を数回繰り返し、所望のレベルの精製を達成する。
次いで、ペレットを最終配合組成物中に分散させて、所望の用量強度で最終生成物を得る。しかし、ＷＯ２０１３／１６９６４７ではナノ懸濁液の無菌試験に関する如何なるデータも報告されていない。
ＷＯ２０１３／１６９６４７は、プロピオン酸フルチカゾン（Ａ型）の多形形態のナノ結晶の調製、それらの精製及び前記ナノ結晶を含む水性懸濁液の調製を開示している。
要約すると、ＷＯ２０１３／１６９６４７（実施例１１及び図３８）によって開示された連続超音波処理フロースルースケールアップ法に従い、プロピオン酸フルチカゾンのナノ結晶を、超音波処理下での貧溶媒結晶化を用いて調製し、続いてナノ懸濁液の熱アニーリングを行う；生成したナノ結晶を連続フロー遠心分離により精製し、ナノ懸濁液のビヒクルを遠心分離し、このペレットを洗浄溶液中に再分散させ、分散液を再び遠心分離する。この洗浄手順を数回繰り返し、所望のレベルの精製を達成する。
次いで、ペレットを最終配合組成物中に分散させて、所望の用量強度で最終生成物を得る。しかし、ＷＯ２０１３／１６９６４７ではナノ懸濁液の無菌試験に関する如何なるデータも報告されていない。
【0003】
この出願人は、ＷＯ ２０１３／１６９６４７により開示された連続超音波処理フロースルー法が、多量のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を調製することを可能にすることを見出したが、精製されたナノ結晶（ペレット）を最終水性ビヒクル（図３８参照）に分散させることは、眼内送達用の医薬製剤が適合していなければならない無菌性の要件を有する最終製品を製造することを可能にするものではないため、無菌眼用水性ナノ懸濁液の大規模の調製には適さない。
さらに、大量のナノ懸濁液の調製中に、精製されたナノ結晶を最終水性ビヒクルと混合する間に、このナノ結晶は解凝集することが困難な凝集体を形成する傾向があり、それ故に、均一なナノ懸濁液を得ることを困難にしている事が判った。さらに、いくつかの効果的な解凝集及び均一なナノ懸濁液が一時的に得られた場合でも、これらのナノ懸濁液は再凝集し不安定である傾向を示した。
さらに、大量のナノ懸濁液の調製中に、精製されたナノ結晶を最終水性ビヒクルと混合する間に、このナノ結晶は解凝集することが困難な凝集体を形成する傾向があり、それ故に、均一なナノ懸濁液を得ることを困難にしている事が判った。さらに、いくつかの効果的な解凝集及び均一なナノ懸濁液が一時的に得られた場合でも、これらのナノ懸濁液は再凝集し不安定である傾向を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
周知のごとく、ナノ粒子は表面エネルギーが高いために凝集しやすく、その結果、ナノ懸濁液の調製及び貯蔵の間に、凝集体が形成される。ナノ粒子の凝集は、懸濁液の製造の間の重要な局面であるだけでなく、凝集は、一貫性のない（inconsistent）投与量や患者のコンプライアンス違反など、さまざまな問題を引き起こす可能性がある。具体的には、眼瞼、睫毛及び眼瞼縁への適用を意図したナノ懸濁液については、凝集が、患者の忍容性及び潜在的な安全性に影響を及ぼす可能性がある。
【0005】
薬物ナノ懸濁液の適切な物理的安定性を保証するいくつかの戦略は、周知である。
例えば、安定剤が通常使用されるが、ある特定の薬物について、適切な安定剤の選択が困難な場合がある。
ＵＳ２０１８／０１１７０６４は、グルココルチコステロイド化合物のナノ粒子及び分散安定剤を含む水性懸濁液の調製を開示している。ＵＳ２０１８／０１１７０６４は、安定剤の主な機能は、ナノ懸濁液のオストヴァルト熟成（Ostwald ripening）及び凝集を防止するために、薬物粒子を十分に湿潤させ、また立体的（asteric）又はイオン性の障壁を提供することによって、物理的に安定な製剤を形成することであることを開示している。ナノ懸濁液に使用される安定剤の典型的な例は、セルロース、ポロキサマー、ポリソルベート、レシチン、ポリオレアート及びポビドンである。
例えば、安定剤が通常使用されるが、ある特定の薬物について、適切な安定剤の選択が困難な場合がある。
ＵＳ２０１８／０１１７０６４は、グルココルチコステロイド化合物のナノ粒子及び分散安定剤を含む水性懸濁液の調製を開示している。ＵＳ２０１８／０１１７０６４は、安定剤の主な機能は、ナノ懸濁液のオストヴァルト熟成（Ostwald ripening）及び凝集を防止するために、薬物粒子を十分に湿潤させ、また立体的（asteric）又はイオン性の障壁を提供することによって、物理的に安定な製剤を形成することであることを開示している。ナノ懸濁液に使用される安定剤の典型的な例は、セルロース、ポロキサマー、ポリソルベート、レシチン、ポリオレアート及びポビドンである。
【0006】
ＷＯ２０１０／１４１８３４は、アレルギー性結膜炎及び／又はアレルギー性鼻結膜炎を処置するためのプロピオン酸フルチカゾンの局所眼用製剤を開示している。ＷＯ２０１０／１４１８３４は、３０μm以下の粒子径を有する懸濁液を含む種々の製剤を開示している；ビヒクルの例は、リン酸緩衝液、プロピレングリコール、ヒプロメロース、ポリソルベート８０、エデト酸二ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムを含む（１４頁、７～１５行目）。
しかしながら、ＷＯ２０１０／１４１８３４には、如何なる眼用製剤の調製方法も、眼用製剤の安定性に関する如何なる実験結果も報告されていない。
しかしながら、ＷＯ２０１０／１４１８３４には、如何なる眼用製剤の調製方法も、眼用製剤の安定性に関する如何なる実験結果も報告されていない。
【0007】
ＷＯ２０１３／０２５６９６は、少なくとも１つの湿潤剤を含む水性ビヒクル中に懸濁された眼用薬物を含有する眼用製剤中における薬物凝集体の形成を防止するための、高圧均質化の使用を開示している。高圧均質化工程は特に、薬物粒子が局所適用に好適な粒子径を有する微粒子化された形態で既に存在する場合の、眼用製剤中における薬物凝集体の形成を防止するために使用され得る；実際に、ＷＯ２０１３／０２５６９６は、湿潤剤の水溶液中の予め微粒子化された薬物を含む懸濁液に高圧均質化が適用され得ること、及び高圧均質化が、粒子径の減少をもたらさず、代わりに既に微粒子化された薬物を安定化し、したがって薬物凝集体の形成を防止することを開示している。
【0008】
しかしながら、ＷＯ２０１３／０２５６９６の方法は、剤形のコストを増加させる高コスト機器の使用を暗示しており、加えて、高圧均質化の使用はナノ結晶の劣化を引き起こす可能性がある。
【0009】
超音波処理法は、懸濁液の均質性及び安定性を改善するために必要な、水系媒体中でのナノマテリアルの解凝集及び分散に一般的に使用される。その広範な使用にもかかわらず、本発明のナノ懸濁液の調製方法の設定中に試験された超音波処理は、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶を解凝集するのに有効ではなかった。
【0010】
したがって、水性ビヒクル中にプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含む眼用ナノ懸濁液（ナノ結晶懸濁液）を調製するための大規模な方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上述の課題を解決するために実施された研究の結果、驚くべきことに、プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶を、グリセリン（グリセロール）及びホウ酸を含む水性ビヒクルと共に、高剪断、高速の条件下で混合すると、ナノ結晶が安定化することがわかった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、グリセリンとホウ酸はナノ結晶の安定化剤として挙動する複合体を形成し；ホウ酸／グリセロール複合体は、ナノ懸濁液の調製中にナノ結晶凝集体の形成を妨げ、また貯蔵中にナノ懸濁液を安定化すると考えられる。また研究の結果から、あらかじめ形成されたホウ酸／グリセロール複合体を含む最終ビヒクルにプロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶を加えると、残存（residual）凝集が生じ、この残存凝集は、プロピオン酸フルチカゾンのナノ結晶を、ホウ酸を含むがグリセロールを含まないビヒクルに懸濁して解凝集させた後に、グリセロールを加える本発明の方法に従ってナノ懸濁液を調製した場合には観察されないことも示された。プロピオン酸フルチカゾンのナノ結晶を、あらかじめ形成されたホウ酸／グリセロール複合体を含む最終ビヒクル中に直接懸濁して解凝集させると、安定化効果が失われ、ナノ結晶の解凝集を達成し、貯蔵中にこれを維持することは、より困難である。
【0012】
ホウ酸とポリヒドロキシル化合物との複合体（ホウ酸－ポリオール複合体）は周知であり、抗菌活性を高めるために、眼用組成物中にホウ酸－ポリオール複合体を用いることは一般的に公知である。
ＷＯ９３／２１９０３は、コンタクトレンズ消毒液中の補助的消毒剤としての、マンニトール、グリセロール及びプロピレングリコール等のホウ酸－ポリオール複合体を開示している。
ＷＯ２０１０／１４８１９０は、多用量の眼用組成物の保存性を改善するために、２つの異なるポリオールを含むホウ酸－ポリオール複合体を開示している。
ＷＯ９３／２１９０３は、コンタクトレンズ消毒液中の補助的消毒剤としての、マンニトール、グリセロール及びプロピレングリコール等のホウ酸－ポリオール複合体を開示している。
ＷＯ２０１０／１４８１９０は、多用量の眼用組成物の保存性を改善するために、２つの異なるポリオールを含むホウ酸－ポリオール複合体を開示している。
【0013】
本発明は、商業生産のための大規模な調製に容易に適応し、均質で再現性のある粒度分布を有する安定なナノ懸濁液をもたらす、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含有する無菌局所眼用水性懸濁液を調製するための方法に関する。
【0014】
本発明について、「プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶」は、１００nmから１０００nmの平均粒子径、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、更には約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含むＸ線粉末回折パターンを有するプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を指し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、そのナノプレートの厚さを規定する表面に対して実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のＸＲＰＤパターンである。
【図2】４０℃でのＴ＝１週間の粒度分布グラフである；あらかじめ形成した１重量％のホウ酸／０．２５重量％のグリセロール複合体を含むビヒクル中における、０．２５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶（比較例）。
【図3】４０℃でのＴ＝１週間の粒度分布グラフである；あらかじめ形成した１重量％ ホウ酸／１重量％ グリセロール複合体を含むビヒクル中における、０．２５重量％ プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶（比較例）。
【図4】初めに４０℃で分析した後、５℃で２０時間保冷貯蔵した、４０℃でのＴ＝１週間の粒度分布グラフである；０．２５重量％のグリセロールを含むビヒクル中の、０．２５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶（比較例）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含み、１００nmから１０００nmの平均粒子径及び０．００１重量％から１重量％のプロピオン酸フルチカゾン濃度を有する、無菌局所眼用水性ナノ懸濁液の調製方法であって：
ａ）下記：
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とする量の水
を含む水性ビヒクル１を調製する工程；
ｂ）１００nmから１０００nmの平均粒子径を有するプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型のある量を、水性ビヒクル１のある量と混合して、２重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含むスラリーを得る工程；
ｃ）工程ｂ）のスラリーに、高剪断、高速の混合を少なくとも１０分間適用する工程；
ｄ）下記：
１．８重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル２を調製する工程；
ｅ）工程ｃ）のスラリーに、水性ビヒクル２のアリコートを加えて、約１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を得る工程；
ｆ）工程ｅ）のスラリーに、高剪断、高速の混合を、目標とする平均粒子径を得るまで適用する工程；
ｇ）工程ｆ）のナノ懸濁液を、オートクレーブ処理（autoclaving）によって滅菌する工程；
ｈ）下記：
０．９重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調製するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル３を調製し、該水性ビヒクル３を濾過により滅菌する工程；
ｉ）工程ｇ）の滅菌したナノ懸濁液に、無菌水性ビヒクル３のアリコートを無菌的に加えて、目標濃度のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を含む無菌局所眼用水性ナノ懸濁液を調製する工程
を含み、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、該ナノ結晶のＸ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に対して実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、方法に関する。
ａ）下記：
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とする量の水
を含む水性ビヒクル１を調製する工程；
ｂ）１００nmから１０００nmの平均粒子径を有するプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型のある量を、水性ビヒクル１のある量と混合して、２重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含むスラリーを得る工程；
ｃ）工程ｂ）のスラリーに、高剪断、高速の混合を少なくとも１０分間適用する工程；
ｄ）下記：
１．８重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル２を調製する工程；
ｅ）工程ｃ）のスラリーに、水性ビヒクル２のアリコートを加えて、約１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を得る工程；
ｆ）工程ｅ）のスラリーに、高剪断、高速の混合を、目標とする平均粒子径を得るまで適用する工程；
ｇ）工程ｆ）のナノ懸濁液を、オートクレーブ処理（autoclaving）によって滅菌する工程；
ｈ）下記：
０．９重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調製するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル３を調製し、該水性ビヒクル３を濾過により滅菌する工程；
ｉ）工程ｇ）の滅菌したナノ懸濁液に、無菌水性ビヒクル３のアリコートを無菌的に加えて、目標濃度のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を含む無菌局所眼用水性ナノ懸濁液を調製する工程
を含み、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、該ナノ結晶のＸ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に対して実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、方法に関する。
【0017】
工程ｃ）において、グリセリンを含まない、プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶及び水性ビヒクル１を含有するスラリーの高剪断、高速の混合は、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶の均一な分布を保証し、最終ナノ懸濁液の均質性を向上させるために行われる。
好ましくは、工程ｃ）及び工程ｆ）において、高剪断、高速の混合は、６０００RPMで実施される。
好ましくは、工程ｆ）の高剪断、高速の混合が少なくとも１０分間適用される。
好ましくは、工程ｇ）の、１重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含有する工程ｆ）のナノ懸濁液の滅菌は、約１２２℃で約４０分間、ガラス瓶中で前記ナノ懸濁液をオートクレーブ処理することによって実施される。
好ましくは、水性ビヒクル１及び２は各々、工程ｂ）及び工程ｅ）で使用する前に、０．２μmフィルターを通して濾過される。
場合により、グリセリン１．８重量％を含む水性ビヒクル２は、０．２μmフィルターを通して濾過したビヒクル１のアリコートに、ある量のグリセリンの量を加えて、グリセリンの最終濃度１．８重量％を得ることによって調製し得る。
好ましくは、本発明の方法に従って調製される最終の無菌局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．００１重量％から０．５重量％であり；より好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％であり；最も好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．２０重量％又は０．１０重量％又は０．０５重量％である。
好ましくは、工程ｃ）及び工程ｆ）において、高剪断、高速の混合は、６０００RPMで実施される。
好ましくは、工程ｆ）の高剪断、高速の混合が少なくとも１０分間適用される。
好ましくは、工程ｇ）の、１重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含有する工程ｆ）のナノ懸濁液の滅菌は、約１２２℃で約４０分間、ガラス瓶中で前記ナノ懸濁液をオートクレーブ処理することによって実施される。
好ましくは、水性ビヒクル１及び２は各々、工程ｂ）及び工程ｅ）で使用する前に、０．２μmフィルターを通して濾過される。
場合により、グリセリン１．８重量％を含む水性ビヒクル２は、０．２μmフィルターを通して濾過したビヒクル１のアリコートに、ある量のグリセリンの量を加えて、グリセリンの最終濃度１．８重量％を得ることによって調製し得る。
好ましくは、本発明の方法に従って調製される最終の無菌局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．００１重量％から０．５重量％であり；より好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％であり；最も好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．２０重量％又は０．１０重量％又は０．０５重量％である。
【0018】
あるいは、本発明の方法は、滅菌したプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶及び滅菌したビヒクル１～３を利用する完全無菌製造条件下で実施されてもよく、それに応じて、本発明の別の実施態様は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含み、１００nmから１０００nmの平均粒子径及び０．００１重量％から１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を有する、無菌局所眼用水性ナノ懸濁液の調製方法であって：
ａ－１）１００nmから１０００nmの平均粒子径を有するプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を滅菌する工程；
ｂ－１）下記：
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル１を調製し、該水性ビヒクル１を濾過により滅菌する工程；
ｃ－１）滅菌したプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型のある量を、滅菌した水性ビヒクル１のある量と無菌的に混合して、２重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含有するスラリーを得る工程；
ｄ－１）工程ｃ－１）のスラリーに、高剪断、高速の混合を少なくとも１０分間適用する工程；
ｅ－１）下記：
１．８重量のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル２を調製し、該水性ビヒクル２を濾過により滅菌する工程；
ｆ－１）工程ｄ－１）のスラリーに、滅菌した水性ビヒクル２のアリコートを無菌的に加えて、約１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を得る工程；
ｇ－１）工程ｆ－１）のスラリーに、高剪断、高速の混合を、目標とする平均粒子径を得るまで適用する工程；
ｈ－１）下記：
０．９重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸／１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とする量の水
を含有する水性ビヒクル３を調製し、該水性ビヒクル３を濾過により滅菌する工程；
ｉ－１）工程ｇ－１）のナノ懸濁液に、滅菌した水性ビヒクル３のアリコートを無菌的に加えて、最終濃度のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を含有する無菌局所眼用水性ナノ懸濁液を調製する工程
を含み、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、方法に関する。
ａ－１）１００nmから１０００nmの平均粒子径を有するプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を滅菌する工程；
ｂ－１）下記：
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル１を調製し、該水性ビヒクル１を濾過により滅菌する工程；
ｃ－１）滅菌したプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型のある量を、滅菌した水性ビヒクル１のある量と無菌的に混合して、２重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンを含有するスラリーを得る工程；
ｄ－１）工程ｃ－１）のスラリーに、高剪断、高速の混合を少なくとも１０分間適用する工程；
ｅ－１）下記：
１．８重量のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む水性ビヒクル２を調製し、該水性ビヒクル２を濾過により滅菌する工程；
ｆ－１）工程ｄ－１）のスラリーに、滅菌した水性ビヒクル２のアリコートを無菌的に加えて、約１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を得る工程；
ｇ－１）工程ｆ－１）のスラリーに、高剪断、高速の混合を、目標とする平均粒子径を得るまで適用する工程；
ｈ－１）下記：
０．９重量％のグリセリン、
０．５重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
１．０重量％のホウ酸、
０．１重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．２重量％のポリソルベート８０、
pHを７．３～７．５に調整するための１Ｎ塩酸／１Ｎ水酸化ナトリウム、並びに
全体を１００重量％とする量の水
を含有する水性ビヒクル３を調製し、該水性ビヒクル３を濾過により滅菌する工程；
ｉ－１）工程ｇ－１）のナノ懸濁液に、滅菌した水性ビヒクル３のアリコートを無菌的に加えて、最終濃度のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を含有する無菌局所眼用水性ナノ懸濁液を調製する工程
を含み、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、方法に関する。
【0019】
好ましくは、工程ａ～１）に使用するプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶は、２％から２０重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度を有する、注射用水中のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の懸濁液をオートクレーブ処理することにより滅菌され；好ましくは、水中のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の懸濁液は、約１２２℃で約３０分間オートクレーブ処理される。
好ましくは、工程ｄ－１）及び工程ｇ－１）において、高剪断、高速の混合は、６０００RPMで実施される。
好ましくは、工程ｇ－１）の高剪断、高速の混合は、少なくとも１０分間適用される。
好ましくは、本発明の方法に従って調製された無菌局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．００１％から０．５重量％であり、より好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％であり、最も好ましくは、０．２０重量％又は０．１０重量％又は０．０５％である。
好ましくは、工程ｄ－１）及び工程ｇ－１）において、高剪断、高速の混合は、６０００RPMで実施される。
好ましくは、工程ｇ－１）の高剪断、高速の混合は、少なくとも１０分間適用される。
好ましくは、本発明の方法に従って調製された無菌局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．００１％から０．５重量％であり、より好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％であり、最も好ましくは、０．２０重量％又は０．１０重量％又は０．０５％である。
【0020】
好ましくは、本発明の方法で使用されるプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶は、以下に報告される一般的な方法に従って調製され、その方法は、次の工程：
１）下記：
０．４５重量％のプロピオン酸フルチカゾン多形１、
２３．２重量％のポリエチレングリコール４００（PEG 400）、
６８．８重量％のポリプロピレングリコール４００（PPG 400）、及び
７．６重量％のポリソルベート８０（Tween 80）
を含む第Ｉ相溶液を調製し；該第Ｉ相溶液を０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
２）下記：
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．４０重量％のメチルセルロース１５ｃｐ、
０．１重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
pHを３．４～３．８にするクエン酸塩緩衝液、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む第ＩＩ相溶液を調製し、該第ＩＩ相溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
３）該濾過された第Ｉ相及び第ＩＩ相溶液を、０～４℃の温度に冷却する工程；
４）超音波トランスデューサー（例えば、QSonica Q2000超音波トランスデューサー）を備えた反応器内で、該第一相溶液と第二相溶液を混合して、ナノ結晶の第ＩＩＩ相懸濁液を得る工程であって：
－ 該第Ｉ相溶液及び第ＩＩ相溶液が、それぞれ６００mL／分（第Ｉ相溶液）及び２４００mL／分（第ＩＩ相溶液）の流速で、該反応器に連続的にポンプで送り込まれて、第ＩＩＩ相懸濁液を得；
－ 第Ｉ相と第ＩＩ相の容積比は１：４であり；
－ 超音波処理は、出力６０％で混合中に適用され；
－ 第ＩＩＩ相懸濁液の平均温度は約１１℃である工程
５）工程４）の第ＩＩＩ相懸濁液を、超音波処理を行わずに、渦流を発生させるのに十分な速度で、室温で最低３０分間、低剪断で混合する工程；
６）該第ＩＩＩ相懸濁液を、４０℃で１６時間以上かけてアニールする工程；
７）下記：
０．２重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
０．２重量％のポリソルベート８０（Tween 80）、
０．００１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．０５重量％のリン酸二水素ナトリウム一水和物、
０．０２重量％のリン酸一水素ナトリウム二水和物並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含み、６．３±０．２のpHを有する緩衝溶液を調製し、該緩衝溶液を０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
８）工程６）の第ＩＩＩ相緩衝溶液を、該濾過された緩衝溶液で希釈する工程であって、該緩衝溶液と第ＩＩＩ相の体積比が１：１である工程；
９）該希釈した第ＩＩＩ相懸濁液を遠心分離して、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を回収し、回収したナノ結晶を洗浄する工程；
１０）採取したナノ結晶を注射用水で洗浄する工程
を含む。
１）下記：
０．４５重量％のプロピオン酸フルチカゾン多形１、
２３．２重量％のポリエチレングリコール４００（PEG 400）、
６８．８重量％のポリプロピレングリコール４００（PPG 400）、及び
７．６重量％のポリソルベート８０（Tween 80）
を含む第Ｉ相溶液を調製し；該第Ｉ相溶液を０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
２）下記：
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．４０重量％のメチルセルロース１５ｃｐ、
０．１重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
pHを３．４～３．８にするクエン酸塩緩衝液、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含む第ＩＩ相溶液を調製し、該第ＩＩ相溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
３）該濾過された第Ｉ相及び第ＩＩ相溶液を、０～４℃の温度に冷却する工程；
４）超音波トランスデューサー（例えば、QSonica Q2000超音波トランスデューサー）を備えた反応器内で、該第一相溶液と第二相溶液を混合して、ナノ結晶の第ＩＩＩ相懸濁液を得る工程であって：
－ 該第Ｉ相溶液及び第ＩＩ相溶液が、それぞれ６００mL／分（第Ｉ相溶液）及び２４００mL／分（第ＩＩ相溶液）の流速で、該反応器に連続的にポンプで送り込まれて、第ＩＩＩ相懸濁液を得；
－ 第Ｉ相と第ＩＩ相の容積比は１：４であり；
－ 超音波処理は、出力６０％で混合中に適用され；
－ 第ＩＩＩ相懸濁液の平均温度は約１１℃である工程
５）工程４）の第ＩＩＩ相懸濁液を、超音波処理を行わずに、渦流を発生させるのに十分な速度で、室温で最低３０分間、低剪断で混合する工程；
６）該第ＩＩＩ相懸濁液を、４０℃で１６時間以上かけてアニールする工程；
７）下記：
０．２重量％のポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート）、
０．２重量％のポリソルベート８０（Tween 80）、
０．００１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．０５重量％のリン酸二水素ナトリウム一水和物、
０．０２重量％のリン酸一水素ナトリウム二水和物並びに
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
を含み、６．３±０．２のpHを有する緩衝溶液を調製し、該緩衝溶液を０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを通して濾過する工程；
８）工程６）の第ＩＩＩ相緩衝溶液を、該濾過された緩衝溶液で希釈する工程であって、該緩衝溶液と第ＩＩＩ相の体積比が１：１である工程；
９）該希釈した第ＩＩＩ相懸濁液を遠心分離して、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶Ａ型を回収し、回収したナノ結晶を洗浄する工程；
１０）採取したナノ結晶を注射用水で洗浄する工程
を含む。
【0021】
本発明の方法を完全無菌製造条件下で実施する場合、工程１０）の洗浄したナノ結晶は、無菌局所眼用水性ナノ懸濁液の調製に使用する前に滅菌される；例えば、洗浄したナノ結晶は、２％から２０重量％のプロピオン酸フルチカゾン濃度で注射用水中に懸濁され、約１２２℃で３０分間オートクレーブ処理される。
【0022】
本発明の別の実施態様は、眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に局所的に投与可能であり：
（ａ）０．００１％から１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量％の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
（ａ）０．００１％から１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量％の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
【0023】
好ましくは、局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．００１％から０．５重量％であり、より好ましくは、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％である。最も好ましくは、局所眼用水性ナノ懸濁液において、プロピオン酸フルチカゾンの濃度は、０．１重量％、０．２０重量％又は０．０５重量％である。
【0024】
本発明の別の実施形態は、眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に局所的に投与可能であり：
（ａ）０．１重量％、又は０．５重量％、又は０．２５重量％、又は０．２０重量％又は０．０５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量％の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
（ａ）０．１重量％、又は０．５重量％、又は０．２５重量％、又は０．２０重量％又は０．０５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量％の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
【0025】
本発明の別の好適な実施態様は、眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に局所的に投与可能であり：
（ａ）０．１重量％、又は０．２０重量％又は０．０５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
（ａ）０．１重量％、又は０．２０重量％又は０．０５重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶；
（ｂ）０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ；
（ｃ）０．２重量％のポリソルベート８０；
（ｄ）０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物；
（ｅ）１．０重量％のホウ酸；
（ｆ）０．９重量％のグリセリン；
（ｇ）０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム；
（ｈ）０．０５５重量の塩化ナトリウム；
（ｉ）pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）；及び
（ｊ）全体を１００重量％とするのに十分な量の水；
からなる眼用水性ナノ懸濁液であって、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有する、眼用水性ナノ懸濁液に関する。
【0026】
本発明の方法に従って調製された無菌局所眼用水性ナノ懸濁液は、いくつかの利点、例えば、小さい粒子径及び長期間にわたる薬物放出の維持に起因する、眼瞼（例えば、上眼瞼及び下眼瞼）、睫毛又は眼瞼縁への投与時のより良好な忍容性を有しており、このことにより、投与される有効成分の量を減少させ、その結果、プロピオン酸フルチカゾンに対する全身曝露を減少させ、また眼の他の構造体に対するこの曝露をも減少させることができる。周知のように、コルチコステロイドは、眼圧（ＩＯＰ）の上昇、角膜厚の増加、散瞳、眼瞼下垂、白内障、緑内障、副腎抑制、骨ミネラル密度の低下等の副作用を有する；従って、全身又は眼全体の曝露が少ないこと（low systemic exposure an overall eye）は、特に、長期又は反復的なコルチコステロイド処置を必要とする治療用途についての、本発明の方法に従って調製された眼用水性ナノ懸濁液の重要な利点である。
【0027】
本発明の無菌局所眼用水性ナノ懸濁液は、プロピオン酸フルチカゾン有効成分の全身吸収に関連する望ましくない副作用を伴わずに、高い有効性及び局所忍容性を有する。
【0028】
別の実施態様では、本発明のナノ懸濁液は、眼瞼炎、後部眼瞼炎、マイボーム腺機能不全又はドライアイ疾患等の眼の炎症疾患又は眼の炎症病態に関連する症状及び／又は臨床徴候を、必要とする被験体の眼瞼、睫毛又は眼瞼縁への前記組成物の局所投与によって処置又は軽減するための方法において使用され得る。
眼瞼炎、後部眼瞼炎、マイボーム腺機能不全又はドライアイ疾患を処置するためのこのような方法は、有効量の本発明のナノ懸濁液を、被験体の眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に局所的に投与する工程を含む。
眼瞼炎、後部眼瞼炎、マイボーム腺機能不全又はドライアイ疾患を処置するためのこのような方法は、有効量の本発明のナノ懸濁液を、被験体の眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に局所的に投与する工程を含む。
【0029】
本発明の別の実施形態は、眼瞼炎、後部眼瞼炎、マイボーム腺機能不全又はドライアイ疾患に関連する症状及び／又は臨床徴候を処置及び／又は軽減する方法を提供し、該方法は、それを必要とする被験体に有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物は、
０．００１から１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶、
０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
０．２重量％のポリソルベート８０、
０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
１．０重量％のホウ酸、
０．９重量％のグリセリン、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調節剤としての１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
からなる眼用水性ナノ懸濁液であり、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型の該ナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有し、該眼用水性ナノ懸濁液は、上眼瞼縁及び／又は下眼瞼縁、マイボーム腺導管睫毛、又は眼瞼組織（anatomy）の任意の領域に局所的に投与される。好ましくは、本発明の方法において使用される眼用水性ナノ懸濁液は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含有し、より好ましくは、この眼用水性ナノ懸濁液中のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の濃度は、０．１重量％、０．２０重量％、０．２５重量％、０．５重量％、０．０５重量％又は０．０１％ 重量％であり、最も好ましくは、このプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の濃度は、０．１重量％、０．２０重量％、又は０．０５重量％である。
０．００１から１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶、
０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、
０．２重量％のポリソルベート８０、
０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、
１．０重量％のホウ酸、
０．９重量％のグリセリン、
０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、
０．０５５重量％の塩化ナトリウム、
pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調節剤としての１Ｎ塩酸及び／又は１Ｎ水酸化ナトリウム、及び
全体を１００重量％とするのに十分な量の水
からなる眼用水性ナノ懸濁液であり、
プロピオン酸フルチカゾンＡ型の該ナノ結晶は、１００nmから１０００nmの平均粒子径を有し、かつ、約７．８、１５．７、２０．８、２３．７、２４．５、及び３２．５°に２θのピークを含み、さらに約９．９、１３．０、１４．６、１６．０、１６．９、１８．１、及び３４．３°に２θのピークを含む、Ｘ線粉末回折パターンを有し、該ナノ結晶は、ナノプレートであって、該ナノプレートの厚さを規定する表面に実質的に垂直な［００１］結晶軸を有し、該眼用水性ナノ懸濁液は、上眼瞼縁及び／又は下眼瞼縁、マイボーム腺導管睫毛、又は眼瞼組織（anatomy）の任意の領域に局所的に投与される。好ましくは、本発明の方法において使用される眼用水性ナノ懸濁液は、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％又は０．００５重量％の濃度のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含有し、より好ましくは、この眼用水性ナノ懸濁液中のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の濃度は、０．１重量％、０．２０重量％、０．２５重量％、０．５重量％、０．０５重量％又は０．０１％ 重量％であり、最も好ましくは、このプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の濃度は、０．１重量％、０．２０重量％、又は０．０５重量％である。
【0030】
眼瞼炎及びマイボーム腺機能不全に関連する典型的な臨床徴候は、眼瞼の落屑（debris）、眼瞼縁の発赤、眼瞼の腫脹、マイボーム腺の閉塞、及び／又はマイボーム腺分泌の質的／量的変化を含む。
ドライアイ（乾燥性角結膜炎としても知られる）に関連する最も一般的な症状は、眼の乾燥、眼の不快感、眼の発赤、眼における刺すような、焼けるような又はひっかくような感覚、なみだ目、光に対する過敏さ、霧視、疼痛又は眼の疲労を含む。
本発明の方法は、好ましくは、被験体における非感染性、炎症性の眼瞼炎又はマイボーム腺機能不全を処置するための方法に関する。
ドライアイ（乾燥性角結膜炎としても知られる）に関連する最も一般的な症状は、眼の乾燥、眼の不快感、眼の発赤、眼における刺すような、焼けるような又はひっかくような感覚、なみだ目、光に対する過敏さ、霧視、疼痛又は眼の疲労を含む。
本発明の方法は、好ましくは、被験体における非感染性、炎症性の眼瞼炎又はマイボーム腺機能不全を処置するための方法に関する。
【0031】
別の実施態様では、被験体は、少なくとも１日に１回、本発明の局所眼用水性ナノ懸濁液を投与され、好ましくは、被験体は、１日に１回、医薬製剤を投与される。
別の実施態様では、被験体は、少なくとも２週間の間、２週間以上の間、少なくとも３週間の間、又は少なくとも４週間の間、本発明の局所眼用水性ナノ懸濁液を、少なくとも１日１回投与される。
本発明の別の実施態様は、（ａ）プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含有する、上に報告した局所投与可能な眼用水性ナノ懸濁液、及び（ｂ）該ナノ懸濁液を眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に適用するための綿棒又はスポンジを含むキットに関する。
別の実施態様では、被験体は、少なくとも２週間の間、２週間以上の間、少なくとも３週間の間、又は少なくとも４週間の間、本発明の局所眼用水性ナノ懸濁液を、少なくとも１日１回投与される。
本発明の別の実施態様は、（ａ）プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を含有する、上に報告した局所投与可能な眼用水性ナノ懸濁液、及び（ｂ）該ナノ懸濁液を眼瞼、睫毛又は眼瞼縁に適用するための綿棒又はスポンジを含むキットに関する。
【実施例】
【0032】
本明細書で使用される場合、組成物及び実施例における百分率（％）は、特に断りが無い限り、重量百分率（w/w）を意味する。本文及び実施例中の用語グリセリン及びグリセロールは、同義語として使用される。
【0033】
実施例１
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶の調製
第Ｉ相溶液の調製
２Ｌプロセス容器に、ポリソルベート８０（Tween 80） １０６．２６ｇ、ポリプロピレングリコール４００（PPG 400） ９６３．３４ｇ、ポリエチレングリコール４００（PEG 400） ３２４．１０ｇを室温で加え、全ての成分が溶解するまで一緒に撹拌し、次いでプロピオン酸フルチカゾン多形１ ６．３ｇをこの溶液に加え、透明な溶液が得られるまで撹拌した。得られた溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶の調製
第Ｉ相溶液の調製
２Ｌプロセス容器に、ポリソルベート８０（Tween 80） １０６．２６ｇ、ポリプロピレングリコール４００（PPG 400） ９６３．３４ｇ、ポリエチレングリコール４００（PEG 400） ３２４．１０ｇを室温で加え、全ての成分が溶解するまで一緒に撹拌し、次いでプロピオン酸フルチカゾン多形１ ６．３ｇをこの溶液に加え、透明な溶液が得られるまで撹拌した。得られた溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
【0034】
第ＩＩ相溶液の調製
８Ｌのプロセス容器に、精製水 約５２７６ｇ（初期量）を加え、渦流が生じるようにオーバーヘッドミキサーで撹拌した。
ポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート） ６．０１ｇ、塩化ベンザルコニウム（溶液１０％） ５．９８ｇ、メチルセルロース１５ｃｐ ２４．０２ｇを加え、メチルセルロースが完全に溶解するまで撹拌した。クエン酸緩衝液を加えてpHを３．５～４．０に調整し、水 ５８５．８ｇを加えた。第ＩＩ相溶液の最終pHは３．８３であった
次に、第ＩＩ相を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
８Ｌのプロセス容器に、精製水 約５２７６ｇ（初期量）を加え、渦流が生じるようにオーバーヘッドミキサーで撹拌した。
ポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート） ６．０１ｇ、塩化ベンザルコニウム（溶液１０％） ５．９８ｇ、メチルセルロース１５ｃｐ ２４．０２ｇを加え、メチルセルロースが完全に溶解するまで撹拌した。クエン酸緩衝液を加えてpHを３．５～４．０に調整し、水 ５８５．８ｇを加えた。第ＩＩ相溶液の最終pHは３．８３であった
次に、第ＩＩ相を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
【0035】
希釈緩衝溶液の調製
２０Ｌプロセス容器に、ポリソルベート８０（Tween 80） １２．０ｇを導入し、精製水 ５３７４ｇを加え、渦流が生じるようにオーバーヘッドミキサーで撹拌した。
リン酸二水素ナトリウム一水和物 ３．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム二塩基二水和物 １．１４ｇ、ポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート） １２．００ｇ、塩化ベンザルコニウム（溶液１０％） ０．６ｇを加え、完全に溶解するまで攪拌し、水 ５９７ｇを加えた。緩衝溶液の最終pHは６．４であった。この溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
２０Ｌプロセス容器に、ポリソルベート８０（Tween 80） １２．０ｇを導入し、精製水 ５３７４ｇを加え、渦流が生じるようにオーバーヘッドミキサーで撹拌した。
リン酸二水素ナトリウム一水和物 ３．２４ｇ、リン酸一水素ナトリウム二塩基二水和物 １．１４ｇ、ポリエチレングリコール４０ステアラート（ＰＥＧ－４０ステアラート） １２．００ｇ、塩化ベンザルコニウム（溶液１０％） ０．６ｇを加え、完全に溶解するまで攪拌し、水 ５９７ｇを加えた。緩衝溶液の最終pHは６．４であった。この溶液を、０．８／０．２μm ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターを用いて濾過し、使用するまで２～８℃で冷蔵保存した。
【0036】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶の調製
第ＩＩ相 ４８０ｇを反応器のチャンバーに入れた。第Ｉ相 ９４０ｇ及び第ＩＩ相 ３７８０ｇを、冷却器に接続されたジャケット付き容器中で、２～４℃の目標温度まで冷却した。
較正した蠕動ポンプを用いて、振幅が６０％に設定された超音波トランスデューサ（Q Sonica Q1375 W）を取り付けた反応器を通して、第Ｉ相及び第ＩＩ相をポンプで送り込んだ（第Ｉ相及び第ＩＩ相のポンプの流速は、それぞれ６００mL／分及び２４００mL／分であった）。
反応器からの流出物（第ＩＩＩ相：５２０１．７ｇ）を、室温で清浄な容器に採取した。第ＩＩＩ相の温度は約１１℃であった。
次に、第ＩＩＩ相を室温で約３０分間、収集容器内で撹拌して、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶の均一な懸濁液を得た（最終第ＩＩＩ相）。
第ＩＩ相 ４８０ｇを反応器のチャンバーに入れた。第Ｉ相 ９４０ｇ及び第ＩＩ相 ３７８０ｇを、冷却器に接続されたジャケット付き容器中で、２～４℃の目標温度まで冷却した。
較正した蠕動ポンプを用いて、振幅が６０％に設定された超音波トランスデューサ（Q Sonica Q1375 W）を取り付けた反応器を通して、第Ｉ相及び第ＩＩ相をポンプで送り込んだ（第Ｉ相及び第ＩＩ相のポンプの流速は、それぞれ６００mL／分及び２４００mL／分であった）。
反応器からの流出物（第ＩＩＩ相：５２０１．７ｇ）を、室温で清浄な容器に採取した。第ＩＩＩ相の温度は約１１℃であった。
次に、第ＩＩＩ相を室温で約３０分間、収集容器内で撹拌して、プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶の均一な懸濁液を得た（最終第ＩＩＩ相）。
【0037】
アニーリング方法
最終第ＩＩＩ相を密閉容器に移した。この容器をインキュベーターに入れ、４０℃で少なくとも１６時間保持した。
最終第ＩＩＩ相を密閉容器に移した。この容器をインキュベーターに入れ、４０℃で少なくとも１６時間保持した。
【0038】
ナノ結晶の精製及び単離
アニールした第ＩＩＩ相 ５１６７ｇをプロセス容器に移し、希釈緩衝溶液に対する第ＩＩＩ相の比が１：１となるように、等量の希釈緩衝溶液を加えた。得られた混合物を低せん断混合機で３０分間撹拌して、ナノ結晶の均質な懸濁液（希釈第ＩＩＩ相）を得た。
希釈第ＩＩＩ相を遠心分離するまで２～８℃で冷蔵保存した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、まず希釈第ＩＩＩ相の非連続式遠心分離により採取した。次いで、注射用水でこのナノ結晶を数回（４回の洗浄サイクル）洗浄した。
単離したナノ結晶の粒径を、レーザ散乱式粒度分布測定器（Horiba LA‐950）を用いて評価した。Ｄ５０は０．２１５３μm、Ｄ９０は０．６０７３μmであった。
ＸＲＰＤ及びリートベルト精密化（Rietveld refinement）により、ナノ結晶のキャラクタリゼーションを行った。図１（ＸＲＰＤ）に結果を示す。同図は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型の典型的なパターンを示しており、このものは、ＷＯ２０１３／１６９６４７において定義（リートベルト精密化から得られる極点図によって確認）されているように、強い選択配向を伴う晶癖及び表面に対して実質的に垂直なｃ軸を有している。
アニールした第ＩＩＩ相 ５１６７ｇをプロセス容器に移し、希釈緩衝溶液に対する第ＩＩＩ相の比が１：１となるように、等量の希釈緩衝溶液を加えた。得られた混合物を低せん断混合機で３０分間撹拌して、ナノ結晶の均質な懸濁液（希釈第ＩＩＩ相）を得た。
希釈第ＩＩＩ相を遠心分離するまで２～８℃で冷蔵保存した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、まず希釈第ＩＩＩ相の非連続式遠心分離により採取した。次いで、注射用水でこのナノ結晶を数回（４回の洗浄サイクル）洗浄した。
単離したナノ結晶の粒径を、レーザ散乱式粒度分布測定器（Horiba LA‐950）を用いて評価した。Ｄ５０は０．２１５３μm、Ｄ９０は０．６０７３μmであった。
ＸＲＰＤ及びリートベルト精密化（Rietveld refinement）により、ナノ結晶のキャラクタリゼーションを行った。図１（ＸＲＰＤ）に結果を示す。同図は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型の典型的なパターンを示しており、このものは、ＷＯ２０１３／１６９６４７において定義（リートベルト精密化から得られる極点図によって確認）されているように、強い選択配向を伴う晶癖及び表面に対して実質的に垂直なｃ軸を有している。
【0039】
実施例２
プロピオン酸フルチカゾンＡ型の無菌局所眼用水性ナノ懸濁液の調製
工程１）ビヒクル１（グリセリンを含まないビヒクル）の調製
２０Ｌのプロセス容器中で、注射用水 １７６００ｇを８０℃で加熱し、メチルセルロース４０００cｐ １００．０ｇをゆっくり加え、混合物を、メチルセルロースが溶解するまで撹拌した。
この溶液を４０℃で冷却し、ホウ酸 ２００．０ｇを加え、水酸化ナトリウム（１Ｎ）によってpHを７．４に調整した。
以下の賦形剤を、特定の以下の順序：エデト酸二ナトリウム二水和物 ２０．０ｇ、塩化ナトリウム １１．０ｇ、塩化ベンザルコニウム（５０％溶液） ４．０ｇ、ポリソルベート８０（Tween 80） ４０．０ｇで加えた；各賦形剤は、次の賦形剤を加える前に完全に溶解させ、この溶液の調製は、約４０℃から室温で行った。pHを試験し、場合により塩酸（１Ｎ）又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）で７．３～７．５に調整した；pH調整後、注射用水を加えて最終重量を１９８００ｇにした。得られた溶液を少なくとも１０分間混合して均一な溶液を得、これを２～８℃で保存した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型の無菌局所眼用水性ナノ懸濁液の調製
【表1】
工程１）ビヒクル１（グリセリンを含まないビヒクル）の調製
２０Ｌのプロセス容器中で、注射用水 １７６００ｇを８０℃で加熱し、メチルセルロース４０００cｐ １００．０ｇをゆっくり加え、混合物を、メチルセルロースが溶解するまで撹拌した。
この溶液を４０℃で冷却し、ホウ酸 ２００．０ｇを加え、水酸化ナトリウム（１Ｎ）によってpHを７．４に調整した。
以下の賦形剤を、特定の以下の順序：エデト酸二ナトリウム二水和物 ２０．０ｇ、塩化ナトリウム １１．０ｇ、塩化ベンザルコニウム（５０％溶液） ４．０ｇ、ポリソルベート８０（Tween 80） ４０．０ｇで加えた；各賦形剤は、次の賦形剤を加える前に完全に溶解させ、この溶液の調製は、約４０℃から室温で行った。pHを試験し、場合により塩酸（１Ｎ）又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）で７．３～７．５に調整した；pH調整後、注射用水を加えて最終重量を１９８００ｇにした。得られた溶液を少なくとも１０分間混合して均一な溶液を得、これを２～８℃で保存した。
【0040】
工程２）２％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーの調製
ビヒクル１ ４０００ｇを、攪拌棒を含む１０Ｌプロセス容器に、ＰＥＳ ０．２μmの濾材を通した濾過により導入し、更なる使用に備えた。
２Ｌビーカーに、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶 １５．０４ｇを、幾らかのビヒクル１と共に導入した。このスラリーを均質性のために混合し、プロピオン酸フルチカゾン含有量（３１．６mg／ｇ）を分析した後、２０mg／mL（２重量％スラリー）のプロピオン酸フルチカゾンの目標濃度に達するように、さらにビヒクル１で希釈した。
この濃縮したスラリーを、６０００±１０RPMで１０分間、高剪断、高速の混合に供し、Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均値：０．８５６μm
モード：０．３６３μm
中央値：０．４２０μm
Ｄ１０：０．２０３μm
Ｄ９０：２．１５４μm
ビヒクル１ ４０００ｇを、攪拌棒を含む１０Ｌプロセス容器に、ＰＥＳ ０．２μmの濾材を通した濾過により導入し、更なる使用に備えた。
２Ｌビーカーに、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶 １５．０４ｇを、幾らかのビヒクル１と共に導入した。このスラリーを均質性のために混合し、プロピオン酸フルチカゾン含有量（３１．６mg／ｇ）を分析した後、２０mg／mL（２重量％スラリー）のプロピオン酸フルチカゾンの目標濃度に達するように、さらにビヒクル１で希釈した。
この濃縮したスラリーを、６０００±１０RPMで１０分間、高剪断、高速の混合に供し、Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均値：０．８５６μm
モード：０．３６３μm
中央値：０．４２０μm
Ｄ１０：０．２０３μm
Ｄ９０：２．１５４μm
【0041】
工程３）ビヒクル２（１．８重量％のグリセリン含有ビヒクル）の調製
４Ｌビーカーに、濾過したビヒクル１ １６００ｇを導入し、グリセリン ３６ｇを溶解するまで撹拌しつつ加えた。
pHを試験して、水酸化ナトリウム（ＩＮ）により７．３～７．５に調整し、ビヒクル１をさらに加えて最終重量を２０００ｇに調整し、１．８重量％のグリセリン溶液とした。
４Ｌビーカーに、濾過したビヒクル１ １６００ｇを導入し、グリセリン ３６ｇを溶解するまで撹拌しつつ加えた。
pHを試験して、水酸化ナトリウム（ＩＮ）により７．３～７．５に調整し、ビヒクル１をさらに加えて最終重量を２０００ｇに調整し、１．８重量％のグリセリン溶液とした。
【0042】
工程４）１％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーの調製
工程２）で調製した２％の濃縮スラリーを、１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度になるように、ビヒクル２でさらに希釈することによって、１％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーを調製した。
１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶スラリーを、６０００±１０ RPMで１０分間、高剪断、高速の混合に供し、Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均：０．４２８μm
モード：０．１２３μm
中央値：０．１６２μm
Ｄ１０：０．０８２μm
Ｄ９０：０．６７８μm
工程２）で調製した２％の濃縮スラリーを、１重量％のプロピオン酸フルチカゾンの濃度になるように、ビヒクル２でさらに希釈することによって、１％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーを調製した。
１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶スラリーを、６０００±１０ RPMで１０分間、高剪断、高速の混合に供し、Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均：０．４２８μm
モード：０．１２３μm
中央値：０．１６２μm
Ｄ１０：０．０８２μm
Ｄ９０：０．６７８μm
【0043】
１％濃縮スラリーのアリコートを、撹拌棒を含む５００mLのガラス瓶に充填し、１２１．５℃で４０分間オートクレーブ処理することによって滅菌した。
【0044】
工程５）ビヒクル３（０．９重量％のグリセリン含有ビヒクル）の調製
２０Ｌ容器に、ビヒクル１ １１２００ｇを導入し、攪拌下でグリセリン １２６ｇを加え、次に水酸化ナトリウムでpHを７．３～７．５に調整し、さらにビヒクル１のアリコートを加えて最終重量を１４０００ｇに調整し、０．９重量％のグリセロール溶液とした。この溶液を、均一になるまで少なくとも１０分間混合し、滅菌濾過して別の受器に入れた。
２０Ｌ容器に、ビヒクル１ １１２００ｇを導入し、攪拌下でグリセリン １２６ｇを加え、次に水酸化ナトリウムでpHを７．３～７．５に調整し、さらにビヒクル１のアリコートを加えて最終重量を１４０００ｇに調整し、０．９重量％のグリセロール溶液とした。この溶液を、均一になるまで少なくとも１０分間混合し、滅菌濾過して別の受器に入れた。
【0045】
工程６）０．１重量％のプロピオン酸フルチカゾンナノ懸濁液の調製
ＩＳＯ ５環境において、工程４）の、オートクレーブ処理した無菌の１重量％のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶を含む瓶の内容物を、最終配合容器に無菌的に移してプールした。
この容器に移した１％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーの重量を記録した（１３６６．３ｇ）。
無菌ビヒクル３ １１７７４．２ｇを加えることによって、最終の０．１％無菌プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶懸濁液を得た。
最終の無菌ナノ懸濁液を、１５分以上攪拌プレート上で攪拌した。
Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均：０．８４６μm
モード：０．３６２μm
中央値：０．４２５μm
Ｄ１０：０．２０２μm
Ｄ９０：２．２１９μm
ＩＳＯ ５環境において、工程４）の、オートクレーブ処理した無菌の１重量％のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶を含む瓶の内容物を、最終配合容器に無菌的に移してプールした。
この容器に移した１％プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーの重量を記録した（１３６６．３ｇ）。
無菌ビヒクル３ １１７７４．２ｇを加えることによって、最終の０．１％無菌プロピオン酸フルチカゾンナノ結晶懸濁液を得た。
最終の無菌ナノ懸濁液を、１５分以上攪拌プレート上で攪拌した。
Horiba LA‐950S2 PSDアナライザを用いたレーザー回折により粒度分布を試験した。
結果は以下の通りであった：
平均：０．８４６μm
モード：０．３６２μm
中央値：０．４２５μm
Ｄ１０：０．２０２μm
Ｄ９０：２．２１９μm
【0046】
工程４）の解凝集した１％プロピオン酸フルチカゾンナノ懸濁液を、最終プロピオン酸フルチカゾン濃度が得られるように、工程６）で開示したようにして水性ビヒクル３のアリコートで希釈することによって、０．５重量％、０．２５重量％、０．２０重量％、０．１重量％、０．０５重量％、０．０３重量％、０．０１重量％及び０．００５重量％などの異なる濃度のプロピオン酸フルチカゾンＡ型を含有する、本発明に従ったナノ懸濁液を得た。
【0047】
実施例３
実施例２のナノ懸濁液の安定性の評価
実施例２で調製したナノ懸濁液組成物を、３つの異なる温度及び湿度条件（５℃、２５℃／４０％ RH；４０℃／２５％ RH）で保存することにより、ナノ懸濁液を保存安定性試験に供した。ナノ懸濁液の再懸濁性、プロピオン酸フルチカゾンの含有量、粒度分布及び塩化ベンザルコニウムの含有量を、１か月及び３か月時点で評価した。
表２及び３に報告された結果は、このナノ懸濁液が製造及び保存時に物理的及び化学的に安定であったことを示している。保存時のナノ懸濁液の物理的外観の変化は認められなかった。プロピオン酸フルチカゾンの化学的アッセイは、保存時の表示量の９０％～１１０％の範囲内に収まっていたため、ナノ懸濁液は化学的分解の徴候を示さなかった。関連物質及び不純物の総量は、保存時に、規格した範囲である４％以内で収まっていた。
実施例２のナノ懸濁液の安定性の評価
実施例２で調製したナノ懸濁液組成物を、３つの異なる温度及び湿度条件（５℃、２５℃／４０％ RH；４０℃／２５％ RH）で保存することにより、ナノ懸濁液を保存安定性試験に供した。ナノ懸濁液の再懸濁性、プロピオン酸フルチカゾンの含有量、粒度分布及び塩化ベンザルコニウムの含有量を、１か月及び３か月時点で評価した。
表２及び３に報告された結果は、このナノ懸濁液が製造及び保存時に物理的及び化学的に安定であったことを示している。保存時のナノ懸濁液の物理的外観の変化は認められなかった。プロピオン酸フルチカゾンの化学的アッセイは、保存時の表示量の９０％～１１０％の範囲内に収まっていたため、ナノ懸濁液は化学的分解の徴候を示さなかった。関連物質及び不純物の総量は、保存時に、規格した範囲である４％以内で収まっていた。
【表2】
【表3】
【0048】
実施例４（比較例）
この研究の結果は、ホウ酸を含むがグリセリンを含まないプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のナノ懸濁液が安定でなく、凝集することを示す。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、前の実施例２と全く同じ濃度のホウ酸及びメチルセルロースを含むが、グリセロールを含まないビヒクルに懸濁した。
試験したナノ懸濁液の組成を表４に報告する。
この研究の結果は、ホウ酸を含むがグリセリンを含まないプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のナノ懸濁液が安定でなく、凝集することを示す。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、前の実施例２と全く同じ濃度のホウ酸及びメチルセルロースを含むが、グリセロールを含まないビヒクルに懸濁した。
試験したナノ懸濁液の組成を表４に報告する。
【表4】
【0049】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶懸濁液の調製
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のある量を、０．５０重量％のメチルセルロース４０００cｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸；０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水（表４参照）からなるビヒクルのアリコートに懸濁し、プロピオン酸フルチカゾンの目標濃度を得た（表４参照）。一旦ナノ結晶を懸濁した後、高速、高剪断のSilverson混合装置を用いて解凝集するために、懸濁液を５００mLのガラスビーカーに注いだ。粒度分布の仕様に適合するまで懸濁液を６０００RPMで混合した。このナノ懸濁液の粒度分布及び粘度を測定した。
ナノ懸濁液を４０℃で安定に置き、２週間後の時点で粒度分布（ＰＤＳ）及び粘度を測定した。
表５ａ及び表５ｂに報告された結果は、わずか２週間という短期間で、平均粒子径及びＤ９０の増加があった事を示し、ナノ懸濁液中の凝集体の形成を反映している。逆に、実施例３で報告された安定性の結果は、本発明の方法に従って調製されたナノ懸濁液が、加速条件下で３カ月まで安定であったことを示す。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のある量を、０．５０重量％のメチルセルロース４０００cｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸；０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水（表４参照）からなるビヒクルのアリコートに懸濁し、プロピオン酸フルチカゾンの目標濃度を得た（表４参照）。一旦ナノ結晶を懸濁した後、高速、高剪断のSilverson混合装置を用いて解凝集するために、懸濁液を５００mLのガラスビーカーに注いだ。粒度分布の仕様に適合するまで懸濁液を６０００RPMで混合した。このナノ懸濁液の粒度分布及び粘度を測定した。
ナノ懸濁液を４０℃で安定に置き、２週間後の時点で粒度分布（ＰＤＳ）及び粘度を測定した。
表５ａ及び表５ｂに報告された結果は、わずか２週間という短期間で、平均粒子径及びＤ９０の増加があった事を示し、ナノ懸濁液中の凝集体の形成を反映している。逆に、実施例３で報告された安定性の結果は、本発明の方法に従って調製されたナノ懸濁液が、加速条件下で３カ月まで安定であったことを示す。
【表5a】
【表5b】
【0050】
実施例５（比較例）
この研究の結果により、予め形成したホウ酸／グリセロール複合体を含有するビヒクルにプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を加えることが残存凝集をもたらし、高速、高剪断の混合で解凝集させた２％のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーにグリセロールを加える本発明の方法に従ってナノ懸濁液を調製した場合には、これが観察されないことを確認した（実施例２－工程４参照）。
あらかじめ形成したホウ酸／グリセロール複合体（１．０重量％のホウ酸／０．２５重量％のグリセロール及び１．０重量％のホウ酸／１．０重量％のグリセロール）を含むビヒクル中に、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を懸濁して解凝集し、０．２５重量％のプロピオン酸フルチカゾンの最終濃度を得た。
試験した２つのナノ懸濁液のビヒクルの組成を表６に報告する。
この研究の結果により、予め形成したホウ酸／グリセロール複合体を含有するビヒクルにプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を加えることが残存凝集をもたらし、高速、高剪断の混合で解凝集させた２％のプロピオン酸フルチカゾンナノ結晶スラリーにグリセロールを加える本発明の方法に従ってナノ懸濁液を調製した場合には、これが観察されないことを確認した（実施例２－工程４参照）。
あらかじめ形成したホウ酸／グリセロール複合体（１．０重量％のホウ酸／０．２５重量％のグリセロール及び１．０重量％のホウ酸／１．０重量％のグリセロール）を含むビヒクル中に、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を懸濁して解凝集し、０．２５重量％のプロピオン酸フルチカゾンの最終濃度を得た。
試験した２つのナノ懸濁液のビヒクルの組成を表６に報告する。
【表6】
【0051】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶ナノ懸濁液の調製
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、予め形成したホウ酸／グリセロール複合体を含む表６に報告した２つのビヒクルに懸濁し、磁気攪拌板上で撹拌棒を用いて一晩攪拌した。一旦ナノ結晶を懸濁した後、高速、高剪断のSilverson混合装置を用いて解凝集するために、この懸濁液を５００mLのガラスビーカーに注いだ。この懸濁液を、粒度分布仕様に適合するまで６０００RPMで混合した。
この２つの製剤を４０℃で安定に置き、１週間後の時点で抜き取った試料について粒度分布を測定した。試料は安定チャンバーから抜き取った直後に分析した。その結果は、サンプル中の多くの凝集を示した（図２、３参照）。
試料を冷蔵すると、凝集は部分的に可逆的であったが、依然としてかなりの残存レベルの凝集があった（図４参照）。この熱可逆的凝集は、温度が上昇するとメチルセルロースの溶解度が低下することに関係していた。
メチルセルロース溶液は、３０～５０℃の範囲では、検出可能な粒子がなく、視覚的に透明であっても、温度が上昇すると、ポリマー鎖が緩く会合したクラスターを形成し、その大きさが大きくなることが知られている。これらのクラスターが、４０℃でのナノ結晶の凝集の一部に関与している可能性がある。
以上報告したように、本研究の結果は、グリセロールが、単離されたナノ結晶の凝集を防ぐ、ホウ酸との複合体を形成することによって、安定化剤として作用することを実証した。ナノ懸濁液を、あらかじめ形成したホウ酸／グリセロール複合体を含むビヒクル中にナノ結晶を懸濁して調製すると、複合体の安定化の効果は低下する。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶を、予め形成したホウ酸／グリセロール複合体を含む表６に報告した２つのビヒクルに懸濁し、磁気攪拌板上で撹拌棒を用いて一晩攪拌した。一旦ナノ結晶を懸濁した後、高速、高剪断のSilverson混合装置を用いて解凝集するために、この懸濁液を５００mLのガラスビーカーに注いだ。この懸濁液を、粒度分布仕様に適合するまで６０００RPMで混合した。
この２つの製剤を４０℃で安定に置き、１週間後の時点で抜き取った試料について粒度分布を測定した。試料は安定チャンバーから抜き取った直後に分析した。その結果は、サンプル中の多くの凝集を示した（図２、３参照）。
試料を冷蔵すると、凝集は部分的に可逆的であったが、依然としてかなりの残存レベルの凝集があった（図４参照）。この熱可逆的凝集は、温度が上昇するとメチルセルロースの溶解度が低下することに関係していた。
メチルセルロース溶液は、３０～５０℃の範囲では、検出可能な粒子がなく、視覚的に透明であっても、温度が上昇すると、ポリマー鎖が緩く会合したクラスターを形成し、その大きさが大きくなることが知られている。これらのクラスターが、４０℃でのナノ結晶の凝集の一部に関与している可能性がある。
以上報告したように、本研究の結果は、グリセロールが、単離されたナノ結晶の凝集を防ぐ、ホウ酸との複合体を形成することによって、安定化剤として作用することを実証した。ナノ懸濁液を、あらかじめ形成したホウ酸／グリセロール複合体を含むビヒクル中にナノ結晶を懸濁して調製すると、複合体の安定化の効果は低下する。
【0052】
実施例６
インビトロ溶出試験
本発明のナノ懸濁液のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の溶出速度を評価し、標準的なプロピオン酸フルチカゾン１型の微粒子化した材料（標準試料）の溶出速度と比較した。
本発明の２つのナノ懸濁液のプロピオン酸フルチカゾンＡ型及び微粒子化したプロピオン酸フルチカゾン１型のナノ結晶の溶出プロファイルを、溶出法を用いて実施した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の粒径は０．４３４μm（Ｄ５０－中央値）であり、プロピオン酸フルチカゾン１型の微粉化材料の粒子径は４．６４μm（Ｄ５０－中央値）である。
インビトロ溶出試験
本発明のナノ懸濁液のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の溶出速度を評価し、標準的なプロピオン酸フルチカゾン１型の微粒子化した材料（標準試料）の溶出速度と比較した。
本発明の２つのナノ懸濁液のプロピオン酸フルチカゾンＡ型及び微粒子化したプロピオン酸フルチカゾン１型のナノ結晶の溶出プロファイルを、溶出法を用いて実施した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の粒径は０．４３４μm（Ｄ５０－中央値）であり、プロピオン酸フルチカゾン１型の微粉化材料の粒子径は４．６４μm（Ｄ５０－中央値）である。
【0053】
本研究は透析膜とシンク（sink)条件を介したコンパートメント拡散分析を用いて実施した。シンク条件は、５％のＨＰβＣＤシクロデキストリンを含む３０mMのリン酸緩衝液（pH７．４）を含むレセプター液の使用を介して、又、飽和点以下を維持するため、２４時間毎に緩衝液を完全に置換することにより達成した。飽和点は、これらの実験条件下で５μg/gと推定され、緩衝液の置換に加えて実施した測定は、１．５μg/gの最高濃度を示した。本研究は３７℃の温度で実施した。溶出試験法の詳細を以下に示す：
２つの０．１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液を、製剤ビヒクル（界面活性剤を含むすべての製剤賦形剤を含むプラセボ溶液）で５倍希釈して、透析装置内部の最終濃度である０．０２重量％のプロピオン酸フルチカゾンを得た。
微粒子化したプロピオン酸フルチカゾン１型を、透析システムの受容コンパートメントで使用したものと同じリン酸緩衝液に懸濁した。
プロピオン酸フルチカゾン放出は、１～２RPMで行った（was carried）。
１mLの試料採取アリコートをあらかじめ決められた時間間隔（１、３、５、２０、２４、４８、７２時間）で抜き取り、等容量の溶出媒体で置換して、５０mL管中の一定の総容量３９mLを維持した。
これらのアリコートを直ちに遠心分離し、ＨＰＬＣにより測定を行った
２つの０．１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液を、製剤ビヒクル（界面活性剤を含むすべての製剤賦形剤を含むプラセボ溶液）で５倍希釈して、透析装置内部の最終濃度である０．０２重量％のプロピオン酸フルチカゾンを得た。
微粒子化したプロピオン酸フルチカゾン１型を、透析システムの受容コンパートメントで使用したものと同じリン酸緩衝液に懸濁した。
プロピオン酸フルチカゾン放出は、１～２RPMで行った（was carried）。
１mLの試料採取アリコートをあらかじめ決められた時間間隔（１、３、５、２０、２４、４８、７２時間）で抜き取り、等容量の溶出媒体で置換して、５０mL管中の一定の総容量３９mLを維持した。
これらのアリコートを直ちに遠心分離し、ＨＰＬＣにより測定を行った
【0054】
表７～９に報告された結果は、２つの試験試料及び参照試料が異なる粒径を有するにもかかわらず、プロピオン酸フルチカゾンＡ型のナノ結晶と、プロピオン酸フルチカゾン１型の微粒子化された材料の溶出プロファイルが類似していることを示している。より具体的には、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶の粒径（Ｄ５０＝０．４３４μm）は、微粉化したプロピオン酸フルチカゾン１型の粒径（Ｄ５０＝４．６４μm）よりも１０倍小さい。
化合物の溶解性はしばしば、本質的に粒子径に関連しており、粒子が小さくなるにつれて、体積に対する表面積の比が増加し、溶媒との相互作用が大きくなって、溶解性の増加をもたらすことから、本研究の結果は、本発明の眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のユニークな特性、すなわち、一方では、小さな粒径（ナノ粒子）が、眼用製剤の快適性及び忍容性を改善し、他方では、プロピオン酸フルチカゾン有効成分の緩徐な溶出速度が、ステロイドの全身吸収に関連する望ましくない副作用に相関している、プロピオン酸フルチカゾンの速く高い吸収を回避することを可能にすることを示すものである。
化合物の溶解性はしばしば、本質的に粒子径に関連しており、粒子が小さくなるにつれて、体積に対する表面積の比が増加し、溶媒との相互作用が大きくなって、溶解性の増加をもたらすことから、本研究の結果は、本発明の眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶のユニークな特性、すなわち、一方では、小さな粒径（ナノ粒子）が、眼用製剤の快適性及び忍容性を改善し、他方では、プロピオン酸フルチカゾン有効成分の緩徐な溶出速度が、ステロイドの全身吸収に関連する望ましくない副作用に相関している、プロピオン酸フルチカゾンの速く高い吸収を回避することを可能にすることを示すものである。
【表7】
【表8】
【表9】
【0055】
実施例７
ビーグル犬における、局所眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶懸濁液の１４日間の反復投与研究
本研究の目的は、ビーグル犬の両眼の上眼瞼及び下眼瞼の縁（辺縁）への直接的局所適用を介して投与した、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（下記表１０参照）の毒物動態を評価することであった。
ビーグル犬における、局所眼用水性プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶懸濁液の１４日間の反復投与研究
本研究の目的は、ビーグル犬の両眼の上眼瞼及び下眼瞼の縁（辺縁）への直接的局所適用を介して投与した、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（下記表１０参照）の毒物動態を評価することであった。
【表10】
【0056】
方法
研究開始時点で、雌雄共に生後約５～６ヵ月、体重５．７～８．８kgの、未体験の（naive）ビーグル犬５０匹（雄２５匹、雌２５匹）を、処置群（１～４群）及びビヒクル群に割り付けた。
雄及び雌のビーグル犬に、プロピオン酸フルチカゾンを、１．６、９．６、及び３２μg／日（両眼ＱＤ局所適用）、又は６４μg／日（両眼ＢＩＤ局所適用）で、眼瞼アプリケーターを介して、両眼の上下眼瞼に直接１日１回又は２回（投与間隔は最低６時間）、１４日間連続投与した。
毒物動態評価のための血液を、１日目及び１４日目の選択された時点で、全動物から採取した。
処置開始前、投与の第１週及び第２週、並びに回復の最終週に、眼科学的検査を実施した。修正されたドレイズスケール（Draize scale）に従って、眼を１日１回スコア化した。
プロピオン酸フルチカゾンナノ懸濁液の効果の可逆性を、１４日間の回復期間で評価した。
研究開始時点で、雌雄共に生後約５～６ヵ月、体重５．７～８．８kgの、未体験の（naive）ビーグル犬５０匹（雄２５匹、雌２５匹）を、処置群（１～４群）及びビヒクル群に割り付けた。
雄及び雌のビーグル犬に、プロピオン酸フルチカゾンを、１．６、９．６、及び３２μg／日（両眼ＱＤ局所適用）、又は６４μg／日（両眼ＢＩＤ局所適用）で、眼瞼アプリケーターを介して、両眼の上下眼瞼に直接１日１回又は２回（投与間隔は最低６時間）、１４日間連続投与した。
毒物動態評価のための血液を、１日目及び１４日目の選択された時点で、全動物から採取した。
処置開始前、投与の第１週及び第２週、並びに回復の最終週に、眼科学的検査を実施した。修正されたドレイズスケール（Draize scale）に従って、眼を１日１回スコア化した。
プロピオン酸フルチカゾンナノ懸濁液の効果の可逆性を、１４日間の回復期間で評価した。
【0057】
結果及び結論
群平均血漿中毒物動態パラメータは、以下の表１１に要約されている。
結果は、プロピオン酸フルチカゾンへの曝露量が、用量の増加に伴って用量依存的に増加したことを示す。雌雄の動物に明確な蓄積の証拠は認められなかった。また、曝露における性別に関連した識別可能な差は認められなかった。イヌでの１４日間の吸入投与毒性試験における、コルチコステロイド関連所見に関連する最低観測副作用量での全身曝露量（ＡＵＣ）は、イヌでの１４日間の局所眼毒性試験において、０．１％ ＱＤ及びＢＩＤの眼球用量で観察された全身曝露量の１４倍及び９倍であった（Advair-Diskuss-NDA-021077）。
局所毒性又は全身毒性の証拠はなかった。
群平均血漿中毒物動態パラメータは、以下の表１１に要約されている。
結果は、プロピオン酸フルチカゾンへの曝露量が、用量の増加に伴って用量依存的に増加したことを示す。雌雄の動物に明確な蓄積の証拠は認められなかった。また、曝露における性別に関連した識別可能な差は認められなかった。イヌでの１４日間の吸入投与毒性試験における、コルチコステロイド関連所見に関連する最低観測副作用量での全身曝露量（ＡＵＣ）は、イヌでの１４日間の局所眼毒性試験において、０．１％ ＱＤ及びＢＩＤの眼球用量で観察された全身曝露量の１４倍及び９倍であった（Advair-Diskuss-NDA-021077）。
局所毒性又は全身毒性の証拠はなかった。
【表11】
【0058】
実施例８
眼瞼炎の急性増悪の処置についての、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の有効性及び安全性の評価
この研究の目的は、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の水性眼用製剤の、眼瞼炎に罹患した被験体の徴候及び症状を軽減することにおいての有効性及び安全性を、プラセボに対して比較することであった。
眼瞼炎の急性増悪の処置についての、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の有効性及び安全性の評価
この研究の目的は、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の水性眼用製剤の、眼瞼炎に罹患した被験体の徴候及び症状を軽減することにおいての有効性及び安全性を、プラセボに対して比較することであった。
【0059】
試験製剤（以下FP-Form A-NS）
０．１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶（平均粒子径１００nmから１０００nm）、０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸、０．９重量％のグリセリン、０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、０．０５５重量％の塩化ナトリウム、pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水。
０．１重量％のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ結晶（平均粒子径１００nmから１０００nm）、０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸、０．９重量％のグリセリン、０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、０．０５５重量％の塩化ナトリウム、pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水。
【0060】
プラセボ製剤
０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸、０．９重量％のグリセリン、０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、０．０５５重量％の塩化ナトリウム、pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水。
０．５０重量％のメチルセルロース４０００ｃｐ、０．２重量％のポリソルベート８０、０．１０重量％のエデト酸二ナトリウム二水和物、１．０重量％のホウ酸、０．９重量％のグリセリン、０．０１重量％の塩化ベンザルコニウム、０．０５５重量％の塩化ナトリウム、pHを７．３～７．５とするのに十分な量の、調整剤としての塩酸（１Ｎ）及び／又は水酸化ナトリウム（１Ｎ）、及び全体を１００重量％とするのに十分な量の水。
【0061】
研究の設計
これは、眼瞼炎の徴候及び症状の処置についての、０．１％プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（１日１回）の安全性及び有効性を評価する、第ＩＩ相の、多施設共同で、無作為化された、二重盲検の、プラセボを対照とする研究であった。
この研究において対象となる集団は、スクリーニング来院時及びベースライン来院時に、両眼の眼瞼縁発赤、眼瞼落屑、眼瞼不快感の其々についてスコアが最小の「１」（４段階で）と定義され、急性眼瞼炎増悪を経験している、眼瞼炎の既往歴が記録されている成人男女であった。合計で１５の被験体が本研究に含まれた。被験体の年齢は５５歳と８０歳の間で、平均年齢は７０．８歳であった。
全米の３つの臨床施設で１５人の患者が無作為化された。両眼に１日１回夕方に、１０名の患者がFP-Form A-NS、５人の患者がプラセボを受けた。試験の訪問は以下の通りであった：スクリーニング（－７日目～－３日目）、ベースライン／１日目、４日目（±１日）、８日目（±１日）、１１日目（±１日）、１４日目（－Ｉ日目；処置最終日）、及び２８日目／終了（＋２日；追跡調査来院）。
試験用ナノ懸濁液（１眼あたり１６μgのプロピオン酸フルチカゾン）又はプラセボを、１日１回夕方に適用した。試験薬剤は被験体が自己投与した。
これは、眼瞼炎の徴候及び症状の処置についての、０．１％プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（１日１回）の安全性及び有効性を評価する、第ＩＩ相の、多施設共同で、無作為化された、二重盲検の、プラセボを対照とする研究であった。
この研究において対象となる集団は、スクリーニング来院時及びベースライン来院時に、両眼の眼瞼縁発赤、眼瞼落屑、眼瞼不快感の其々についてスコアが最小の「１」（４段階で）と定義され、急性眼瞼炎増悪を経験している、眼瞼炎の既往歴が記録されている成人男女であった。合計で１５の被験体が本研究に含まれた。被験体の年齢は５５歳と８０歳の間で、平均年齢は７０．８歳であった。
全米の３つの臨床施設で１５人の患者が無作為化された。両眼に１日１回夕方に、１０名の患者がFP-Form A-NS、５人の患者がプラセボを受けた。試験の訪問は以下の通りであった：スクリーニング（－７日目～－３日目）、ベースライン／１日目、４日目（±１日）、８日目（±１日）、１１日目（±１日）、１４日目（－Ｉ日目；処置最終日）、及び２８日目／終了（＋２日；追跡調査来院）。
試験用ナノ懸濁液（１眼あたり１６μgのプロピオン酸フルチカゾン）又はプラセボを、１日１回夕方に適用した。試験薬剤は被験体が自己投与した。
【0062】
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の有効性及び安全性の評価
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（FP-Form A-NS）の有効性及び安全性を、研究期間中の各投与後来院時にプラセボと比較した。この研究では、眼瞼炎の徴候及び症状に加えて、ドライアイ疾患に特徴的な徴候及び症状（眼瞼炎を罹患した被験体でも共通して観察される）を評価した。
プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液（FP-Form A-NS）の有効性及び安全性を、研究期間中の各投与後来院時にプラセボと比較した。この研究では、眼瞼炎の徴候及び症状に加えて、ドライアイ疾患に特徴的な徴候及び症状（眼瞼炎を罹患した被験体でも共通して観察される）を評価した。
【0063】
有効性
表１２及び１３に報告した研究の結果は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の処置は一貫して、眼瞼炎の被験体の徴候及び症状を改善し、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液で処置された被験体は、ベースラインからの、またプラセボで処置された被験体と比較しての、落屑、発赤及び不快感の複合スコアの低下を示すことを実証した。
表１２及び１３に示した結果は、１４日間の処置後に評価し、毎日の眼瞼の洗浄手順の前に実施した眼の研究（study eye）における、眼瞼炎の徴候及び症状に関連している。
以下のドライアイ症状は、被験体により視覚的アナログ尺度（Visual Analog Scales （ＶＡＳ））でも評価した：眼の乾燥、灼熱感‐刺痛、異物感、かゆみ、羞明、疼痛及び霧視。表１４に報告された複合ＶＡＳスコア（これらの症状の個々のスコアの平均）は、ドライアイ症状の軽減に、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の処置が、プラセボに対して有効であることを実証した。
表１２及び１３に報告した研究の結果は、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の処置は一貫して、眼瞼炎の被験体の徴候及び症状を改善し、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液で処置された被験体は、ベースラインからの、またプラセボで処置された被験体と比較しての、落屑、発赤及び不快感の複合スコアの低下を示すことを実証した。
表１２及び１３に示した結果は、１４日間の処置後に評価し、毎日の眼瞼の洗浄手順の前に実施した眼の研究（study eye）における、眼瞼炎の徴候及び症状に関連している。
以下のドライアイ症状は、被験体により視覚的アナログ尺度（Visual Analog Scales （ＶＡＳ））でも評価した：眼の乾燥、灼熱感‐刺痛、異物感、かゆみ、羞明、疼痛及び霧視。表１４に報告された複合ＶＡＳスコア（これらの症状の個々のスコアの平均）は、ドライアイ症状の軽減に、プロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液の処置が、プラセボに対して有効であることを実証した。
【0064】
安全性
本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液による処置は、非常に良好な忍容性を示し、全ての患者が処置を完了した。重篤な有害事象（ＳＡＥ）は無く、特に、処置中又は処置中止後２週間までに、被験体の眼圧に臨床的に意義のある変化は観察されなかった。
この研究の結果は、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液が、眼瞼炎及びドライアイの徴候及び症状の両方を軽減することができ、処置及び適用方法が安全な忍容性プロファイルを有することを実証する。
本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液による処置は、非常に良好な忍容性を示し、全ての患者が処置を完了した。重篤な有害事象（ＳＡＥ）は無く、特に、処置中又は処置中止後２週間までに、被験体の眼圧に臨床的に意義のある変化は観察されなかった。
この研究の結果は、本発明のプロピオン酸フルチカゾンＡ型ナノ懸濁液が、眼瞼炎及びドライアイの徴候及び症状の両方を軽減することができ、処置及び適用方法が安全な忍容性プロファイルを有することを実証する。
【表12】
【表13】
【表14】
【0065】
実施例９
実施例２のナノ懸濁液の安定性の評価
実施例２で調製したナノ懸濁液組成物を、ナノ懸濁液を３つの異なる温度及び湿度条件（５℃、２５℃／４０％RH；４０℃／２５％RH）で保存することによる保存安定性試験に供した。ナノ懸濁液の再懸濁性、プロピオン酸フルチカゾンの含有量、粒度分布及び塩化ベンザルコニウムの含有量を、１ヵ月及び３ヵ月の時点（実施例３及び表２及び３で報告した結果を参照）、４０℃で５ヵ月の時点（表１５）並びに５℃及び２５℃で１２ヵ月まで（表１６）評価した。
表１５及び１６に報告した結果は、ナノ懸濁液が貯蔵時に物理的及び化学的に安定であることを示す。保存時のナノ懸濁液の物理的外観の変化は認められなかった。プロピオン酸フルチカゾンの化学的アッセイは保存時の表示量の９０％～１１０％の範囲内に収まっていたため、ナノ懸濁液は化学的分解の徴候を示さなかった。関連物質及び不純物の総量は、保存時に、規格した範囲である４％以内で収まっていた。
粒度分布はHoriba LA‐950装置を用いて解析した。
実施例２のナノ懸濁液の安定性の評価
実施例２で調製したナノ懸濁液組成物を、ナノ懸濁液を３つの異なる温度及び湿度条件（５℃、２５℃／４０％RH；４０℃／２５％RH）で保存することによる保存安定性試験に供した。ナノ懸濁液の再懸濁性、プロピオン酸フルチカゾンの含有量、粒度分布及び塩化ベンザルコニウムの含有量を、１ヵ月及び３ヵ月の時点（実施例３及び表２及び３で報告した結果を参照）、４０℃で５ヵ月の時点（表１５）並びに５℃及び２５℃で１２ヵ月まで（表１６）評価した。
表１５及び１６に報告した結果は、ナノ懸濁液が貯蔵時に物理的及び化学的に安定であることを示す。保存時のナノ懸濁液の物理的外観の変化は認められなかった。プロピオン酸フルチカゾンの化学的アッセイは保存時の表示量の９０％～１１０％の範囲内に収まっていたため、ナノ懸濁液は化学的分解の徴候を示さなかった。関連物質及び不純物の総量は、保存時に、規格した範囲である４％以内で収まっていた。
粒度分布はHoriba LA‐950装置を用いて解析した。
【表15】
【表16】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
