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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-27
(45)【発行日】2024-06-04
(54)【発明の名称】コラーゲン受容体産生促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20240528BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20240528BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20240528BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20240528BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240528BHJP
A61K 8/60 20060101ALI20240528BHJP
A61K 8/368 20060101ALI20240528BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240528BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A61K31/7028
A61K31/7048
A61K31/192
A61P43/00 105
A61K8/60
A61K8/368
A61Q19/00
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020071273
(22)【出願日】2020-04-10
(65)【公開番号】P2021166494
(43)【公開日】2021-10-21
【審査請求日】2022-11-07
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】蔀 泰幸
(72)【発明者】
【氏名】高橋 香織
(72)【発明者】
【氏名】今井 理恵
【審査官】中島 芳人
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－１９９４４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１２５２６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０２１－１６６４７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】月見草エキス EVENING PRIMROSE EXTRACT，月見草エキス EVENING PRIMROSE EXTRACT，オリザ油化株式会社，2014年，https://www.oryza.co.jp/pdf/japanese/%E6%9C%88%E8%A6%8B%E8%8D%89%E3%82%A8%E3%82%AD%E3%82%B97.1.pdf
【文献】藍谷教夫 他，月見草エキスの血糖値上昇抑制作用とその関与成分，日本食品科学工学会誌，2003年，Vol. 50, No. 4，pp 180-187
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ
Ａ６１Ｋ ８／
Ａ６１Ｑ １９／
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペンタガロイルグルコースとイソクエルシトリンを有効成分として含有するコラーゲン受容体産生促進用組成物。
【請求項2】
組成物中のペンタガロイルグルコース１質量部に対し、イソクエルシトリンが１～１００質量部である請求項１に記載のコラーゲン受容体産生促進用組成物。
【請求項3】
コラーゲン受容体が、ＤＤＲ２、Ｅｎｄｏ１８０から選択される１又は２である請求項１又は２に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コラーゲン受容体産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外マトリックスは、細胞の周囲を隙間なく充填して生体組織に機械的強度や柔軟性・可塑性を与え、周囲の細胞が接着する際の足場を提供し、細胞が秩序正しく集合して組織・器官を形成するために必要な外部環境を提示している。さらに細胞外マトリックスは、細胞へ積極的にシグナルを伝達することにより、発生、分化、免疫応答、血液凝固、創傷治癒などの多様な生体プロセスを制御していることが知られている。細胞外マトリックスを構成する成分の代表的な分子はコラーゲンである。コラーゲンは、体内の総タンパク質量のおよそ３０％を占める。また、コラーゲンは強靭な線維（膠原線維）を形成し、組織に線維方向への張力に抵抗する機械的強度を与える。
【0003】
生体内にはコラーゲンと相互作用する様々な分子が存在する。また、コラーゲンはフィブロネクチンやラミニンなどの多数の細胞外マトリックスを構成する分子と結合して高次構造を形成し、細胞が接着するための足場を提供する。さらに、コラーゲンは内皮細胞の直下に存在することから，血管壁の損傷時におけるセンサーとしての役割を果たしている。生体の細胞表面には、コラーゲンと結合するレセプターが発現している。
コラーゲンは、このレセプターを介して、細胞間の情報伝達や、細胞間の結合に関与している。細胞の表面に発現しているコラーゲン受容体として代表的なものは、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ(インテグリン)、Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＤＲ、ディスコイディン・ドメイン・レセプター）、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＶ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、Ｅｎｄｏ１８０が代表的レセプターとして知られている。
コラーゲンは、このレセプターを介して、細胞間の情報伝達や、細胞間の結合に関与している。細胞の表面に発現しているコラーゲン受容体として代表的なものは、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ(インテグリン)、Ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＤＲ、ディスコイディン・ドメイン・レセプター）、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＶ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、Ｅｎｄｏ１８０が代表的レセプターとして知られている。
【0004】
インテグリンは最も古くから研究されている受容体で、これまでに４つのコラーゲン結合性（α１β１、α２β１、α１０β１、α１１β１）が報告されており、インテグリンβ１サブユニット（ＩＴＧＢ１）は共通の構成分子である（非特許文献１～３）。その働きは細胞－細胞、細胞－細胞外マトリックスを繋ぐ接着分子であり、細胞増殖や組織の形成・修復に関わっている。
ＤＤＲは、ＤＤＲ１とＤＤＲ２のアイソフォームが存在し、それぞれ上皮系細胞と間葉系細胞に主に発現している。ＤＤＲはネイティブな構造を保持したコラーゲン分子によって活性化される受容体型チロシンキナーゼであり、細胞接着や遊走に関与している（非特許文献１～４）。皮膚線維芽細胞に発現しているＤＤＲ２は、細胞外マトリックスのリモデリングを介した発生や分化、創傷治癒に重要な膜タンパク質で、ノックアウトマウスでは、骨の形成が未熟となる小人症を示し、皮膚の創傷治癒が抑制されることが報告されている（非特許文献５）。
Ｅｎｄｏ１８０は、断片化したコラーゲンや変性したコラーゲンを認識して、それらを細胞内へ取り込むことで、貪食作用によるコラーゲンのリモデリングを制御する膜タンパク質である（非特許文献６）。いずれの受容体も線維芽細胞の膜上に存在し、コラーゲンを介した細胞内外の情報を伝達する役割を担っている。
これらの細胞表面のコラーゲン受容体の発現が増加することによって、細胞間の結合が強化され、細胞相互の情報交換が活性化されて創傷の回復や修復が促進される。
ＤＤＲは、ＤＤＲ１とＤＤＲ２のアイソフォームが存在し、それぞれ上皮系細胞と間葉系細胞に主に発現している。ＤＤＲはネイティブな構造を保持したコラーゲン分子によって活性化される受容体型チロシンキナーゼであり、細胞接着や遊走に関与している（非特許文献１～４）。皮膚線維芽細胞に発現しているＤＤＲ２は、細胞外マトリックスのリモデリングを介した発生や分化、創傷治癒に重要な膜タンパク質で、ノックアウトマウスでは、骨の形成が未熟となる小人症を示し、皮膚の創傷治癒が抑制されることが報告されている（非特許文献５）。
Ｅｎｄｏ１８０は、断片化したコラーゲンや変性したコラーゲンを認識して、それらを細胞内へ取り込むことで、貪食作用によるコラーゲンのリモデリングを制御する膜タンパク質である（非特許文献６）。いずれの受容体も線維芽細胞の膜上に存在し、コラーゲンを介した細胞内外の情報を伝達する役割を担っている。
これらの細胞表面のコラーゲン受容体の発現が増加することによって、細胞間の結合が強化され、細胞相互の情報交換が活性化されて創傷の回復や修復が促進される。
【0005】
これまでも、コラーゲン受容体産生促進剤について様々な提案がなされている。
特許文献１には、コラーゲン受容体であるＤＤＲ２の産生を促進する物質として、メマツヨイグサエキスや果物トケイソウエキスが有用であることが記載されている。
特許文献２には、ペラルゴニジンを有効成分とするインテグリンの産生促進剤が記載されている。また特許文献３には、ナガレイシ、ミツガシワ、ヒメウコギ、ミツバアケビ、キクラゲ、ピーポーレン等の抽出物を有効成分とするインテグリン発現促進物が記載されている。特許文献４には、リンゴ抽出物を有効成分とするインテグリン産生促進剤、特許文献５にはシカク豆抽出物を有効成分とするインテグリン産生促進剤が記載されている。
特許文献１には、コラーゲン受容体であるＤＤＲ２の産生を促進する物質として、メマツヨイグサエキスや果物トケイソウエキスが有用であることが記載されている。
特許文献２には、ペラルゴニジンを有効成分とするインテグリンの産生促進剤が記載されている。また特許文献３には、ナガレイシ、ミツガシワ、ヒメウコギ、ミツバアケビ、キクラゲ、ピーポーレン等の抽出物を有効成分とするインテグリン発現促進物が記載されている。特許文献４には、リンゴ抽出物を有効成分とするインテグリン産生促進剤、特許文献５にはシカク豆抽出物を有効成分とするインテグリン産生促進剤が記載されている。
【0006】
特許文献６には、コラーゲン受容体であるＥｎｄｏ１８０の産生を促進するハス胚芽抽出物、月桃葉抽出物、ラクトバシラスプランタラムが記載されている。また特許文献７には、ロスマリン酸、カフェ酸、メリッサ抽出物が、特許文献８には、タイソウ、藤茶、ゲンチアナ、プルーン、スターフルーツ、ローヤルゼリー、緑茶、ワイルドタイム、スギナ、サンショウ、キンモクセイ、キンギンカ、セイヨウノコギリソウからなる群から選択される植物抽出物が、Ｅｎｄｏ１８０の産生を促進することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１９－１９９４４１号公報
【文献】特開２０１１－０２０９５１号公報
【文献】特開２０１６－０６５０１９号公報
【文献】特開２０１１－２１９４５４号公報
【文献】特開２０１０－０２４２１１号公報
【文献】特開２０１９－１８２７５３号公報
【文献】特開２０１９－１０８３９８号公報
【文献】特開２０１９－０５５９２４号公報
【文献】特開２００８－１３１８８８号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】B. Leitinger, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 27, 265～290（2011）
【文献】J. Heino et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 41, 341～348,（2009）
【文献】YC. Yeh et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol., 303, C1207～C1217（2012）
【文献】B. Leitinger, Int. Rev. Cell Mol. Biol., 310, 39～87,（2014）
【文献】JP. Labrador, EMBO Rep., 2, 446～452,（2001）
【文献】MC Melander et al., Int. J. Oncol., 47, 1177～1188,（2015）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者は、カテキンの一種であるペンタガロイルグルコース、フラボノール化合物の配糖体であるイソクエルシトリン、及び没食子酸の３成分を含有する組成物は、コラーゲン受容体産生を相乗的に促進することを見出し、本発明をなした。すなわち、本発明は、新たなコラーゲン受容体産生促進用の組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、以下の構成からなる。
（１）ペンタガロイルグルコースと、イソクエルシトリン、没食子酸から選択される１以上を有効成分として含有するコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（２）組成物中のペンタガロイルグルコース１質量部に対し、イソクエルシトリンが１～１００質量部である（１）に記載のコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（３）組成物中のペンタガロイルグルコース１質量部に対し、没食子酸が０．１～１０質量部である（１）に記載のコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（４）コラーゲン受容体が、ＤＤＲ２、Ｅｎｄｏ１８０から選択される１又は２である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（１）ペンタガロイルグルコースと、イソクエルシトリン、没食子酸から選択される１以上を有効成分として含有するコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（２）組成物中のペンタガロイルグルコース１質量部に対し、イソクエルシトリンが１～１００質量部である（１）に記載のコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（３）組成物中のペンタガロイルグルコース１質量部に対し、没食子酸が０．１～１０質量部である（１）に記載のコラーゲン受容体産生促進用組成物。
（４）コラーゲン受容体が、ＤＤＲ２、Ｅｎｄｏ１８０から選択される１又は２である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、ペンタガロイルグルコース、イソクエルシトリン、没食子酸を有効成分として含有するコラーゲン受容体産生促進用の組成物が提供される。本発明の組成物は、細胞の表面に発現している代表的なコラーゲン受容体であるＤＤＲ２、Ｅｎｄｏ１８０の産生を促進する作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ペンタガロイルグルコース、イソクエルシトリン、没食子酸から選択される１以上を含有する組成物が各成分の相乗作用により、コラーゲン受容体タンパク質であるＥｎｄｏ１８０の産生を促進することを示すグラフである。
【図2】ペンタガロイルグルコース、没食子酸、イソクエルシトリンから選択される１以上を含む組成物が、コラーゲン受容体タンパク質であるＤＤＲ２の産生を促進することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明について具体的に説明する。
本発明でいう「コラーゲン受容体」とは、コラーゲンと特異的に結合する部位を有する細胞外タンパク質をいう。本願明細書においては、コラーゲン受容体をコラーゲンレセプターと称する場合がある。このコラーゲン特異的結合部位を有するタンパク質は、コラーゲンと選択的に結合することができる。コラーゲン結合タンパク質としては、フィブロネクチン、インテグリン、ラミニン、ＤＤＲ、Ｅｎｄｏ１８０、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＶ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅを代表的なものとして例示できる。
本発明でいう「コラーゲン受容体」とは、コラーゲンと特異的に結合する部位を有する細胞外タンパク質をいう。本願明細書においては、コラーゲン受容体をコラーゲンレセプターと称する場合がある。このコラーゲン特異的結合部位を有するタンパク質は、コラーゲンと選択的に結合することができる。コラーゲン結合タンパク質としては、フィブロネクチン、インテグリン、ラミニン、ＤＤＲ、Ｅｎｄｏ１８０、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＶ、ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅを代表的なものとして例示できる。
【0014】
本発明において、ペンタガロイルグルコースは、１，２，３，４，６－ペンタ－Ｏ－ガロイル－β－Ｄ－グルコースを意味し、以下の構造を有する。
【0015】
【化1】
【0016】
本願明細書において、ペンタガロイルグルコースは、ＰＧＧと略して表記する場合がある。
【0017】
ペンタガロイルグルコースは、五倍子、没食子、芍薬、大黄、楊梅皮、桂皮、ウラジロガシ皮、コケモモ葉、菱実、地楡、メマツヨイ草および牡丹皮等の植物や生薬から得ることができる。これらからの抽出に当たっては、１種のみを用いても良いし、２種以上を用いても良い。五倍子、没食子、芍薬および大黄がより好ましく、五倍子および没食子が一層好ましく、五倍子が最も好ましい。
【0018】
抽出は、抽出溶媒として水、メタノールもしくはエタノール等のアルコール、またはアセトン等の親水性有機溶媒、およびこれらの混合物を使用して行うことができる。これらのうち、水及び／又はアルコールを用いることが好ましく、更に、上記アルコールとしてエタノールを用いることがより好ましい。特に、含水エタノールを用いることが好ましい。抽出後、抽出溶媒を除去し、抽出物を固形物として得ることができる。
【0019】
この抽出物には、数種のガロタンニンが含まれているが、適宜メタノリシス、再結晶、再抽出、および／または液体クロマトグラフィー等を用いて分離・精製することにより、ペンタガロイルグルコースを得ることができる。また抽出物をそのまま本発明に用いることもできる。
【0020】
「イソクエルシトリン」とは、ケルセチンにグルコース残基が結合している下記化学式２であらわされる配糖体である。
【0021】
【化2】
【0022】
本明細書においてイソクエルシトリンをＩＱＣと略記して表示することがある。
イソクエルシトリンの製造方法は、特に限定されない。例えば、特公昭54－32073号公報に記載されているように、イソクエルシトリンと澱粉質などのグルコース供与体を含有する溶液に対して糖転移酵素を作用させることにより、イソクエルシトリンにグルコース供与体からグルコース残基を等モル以上転移させ、次いで、アミラーゼを作用させてα-グルコシルイソクエルシトリンを生成させればよい。この方法によって製造したα-グルコシルイソクエルシトリンは、酵素処理イソクエルシトリン（enzyme-modified isoquercitrin: ＥＭＩＱ）と呼ばれる。さらに、多孔性合成吸着剤に接触させて、その吸着性の違いを利用することにより、α-グルコシルイソクエルシトリンのみを精製することも可能である。
イソクエルシトリンの製造方法は、特に限定されない。例えば、特公昭54－32073号公報に記載されているように、イソクエルシトリンと澱粉質などのグルコース供与体を含有する溶液に対して糖転移酵素を作用させることにより、イソクエルシトリンにグルコース供与体からグルコース残基を等モル以上転移させ、次いで、アミラーゼを作用させてα-グルコシルイソクエルシトリンを生成させればよい。この方法によって製造したα-グルコシルイソクエルシトリンは、酵素処理イソクエルシトリン（enzyme-modified isoquercitrin: ＥＭＩＱ）と呼ばれる。さらに、多孔性合成吸着剤に接触させて、その吸着性の違いを利用することにより、α-グルコシルイソクエルシトリンのみを精製することも可能である。
【0023】
没食子酸は３，４，５－トリヒドロキシ安息香酸（3,4,5-Trihydroxybenzoic Acid）ともいい、下記化学式３であらわされる化合物である。抗酸化作用を有することが知られている。
【0024】
【化3】
【0025】
本願明細書においては、没食子酸をＧＡと略記して表すことがある。
没食子酸の製造方法としては、化学合成による方法、天然物からの抽出による方法の他、酵素や発酵による方法が挙げられる。例えば、ガレート型カテキンにタンナーゼ処理を施し、その加水分解反応生成物として没食子酸を得る方法が知られている。また、ガレート型カテキンは茶や茶抽出物に多く含まれることが知られている。いずれの方法によって得たものであっても本発明に使用可能である。あるいは、市販品を利用してもよい。
没食子酸の製造方法としては、化学合成による方法、天然物からの抽出による方法の他、酵素や発酵による方法が挙げられる。例えば、ガレート型カテキンにタンナーゼ処理を施し、その加水分解反応生成物として没食子酸を得る方法が知られている。また、ガレート型カテキンは茶や茶抽出物に多く含まれることが知られている。いずれの方法によって得たものであっても本発明に使用可能である。あるいは、市販品を利用してもよい。
【0026】
本発明でいう「組成物」とは、ペンタガロイルグルコースと、イソクエルシトリン、没食子酸のいずれかを含有し、コラーゲン受容体の産生を促進するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、化粧品、健康食品、動物用飼料を包含する。
本発明の組成物は、有効成分としてペンタガロイルグルコース１質量部に対して、イソクエルシトリン１～１００質量部を含有させるか、没食子酸０．１～１０質量部を含有させることが好ましい。
本発明の組成物は、コラーゲン受容体産生促進剤として各種医薬品、化粧品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができる。具体的には、液剤、クリーム剤、ローション剤等の外用剤としての形態、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。また本発明の作用効果を阻害しない範囲で、賦形剤や生理活性成分等を含有させることができる。
本発明の組成物は、有効成分としてペンタガロイルグルコース１質量部に対して、イソクエルシトリン１～１００質量部を含有させるか、没食子酸０．１～１０質量部を含有させることが好ましい。
本発明の組成物は、コラーゲン受容体産生促進剤として各種医薬品、化粧品、食品、健康食品、動物飼料等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができる。具体的には、液剤、クリーム剤、ローション剤等の外用剤としての形態、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。また本発明の作用効果を阻害しない範囲で、賦形剤や生理活性成分等を含有させることができる。
【0027】
本発明に係るコラーゲン受容体産生促進用組成物中の有効成分であるペンタガロイルグルコースと、イソクエルシトリン又は没食子酸を含有する組成物中の、それぞれの成分の配合量は、特に制限されず、１成分以上が含有されていればよい。３成分あるいは２成分が含有されることで相乗的な効果を発揮する。また、目的、対象とする疾病により、必要とする有効成分の主体が異なるので、一概に規定できるものではないが、ペンタガロイルグルコース１質量部に対して、イソクエルシトリン１～１００質量部、又は没食子酸０．１～１０質量部を含有することで、本発明組成物によるコラーゲン受容体の産生促進作用を効果的に発揮させることができる。
【実施例】
【0028】
試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜試験方法＞
１．細胞の培養
試験用細胞として、正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、Ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｋｉｎ、Ｃａｔ．＃ ＣＣ－２５０９；Ｌｏｔ Ｎｏ．００００４９０８２５；ＬＯＮＺＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）ＳＡ（ニチレイ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２存在下のインキュベーターで培養した。
＜試験方法＞
１．細胞の培養
試験用細胞として、正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、Ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｋｉｎ、Ｃａｔ．＃ ＣＣ－２５０９；Ｌｏｔ Ｎｏ．００００４９０８２５；ＬＯＮＺＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）ＳＡ（ニチレイ）及び１％（ｖ／ｖ）Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２存在下のインキュベーターで培養した。
【0029】
２．イソクエルシトリン（以下「ＩＱＣ」）、ペンタガロイルグルコース（以下「ＰＧＧ」）、没食子酸（以下「ＧＡ」）の試験溶液の調製
ＩＱＣ（イソクエルシトリン、富士フイルム和光純薬）、ＰＧＧ（ペンタガロイルグルコース、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＡ（没食子酸、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。各試薬は、ＤＭＥＭ培地（血清なし）を用いて以下の評価試験方法に記載の試験濃度に希釈して、本試験に使用した。
ＩＱＣ（イソクエルシトリン、富士フイルム和光純薬）、ＰＧＧ（ペンタガロイルグルコース、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＡ（没食子酸、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。各試薬は、ＤＭＥＭ培地（血清なし）を用いて以下の評価試験方法に記載の試験濃度に希釈して、本試験に使用した。
【0030】
３．コラーゲン受容体産生促進活性の評価試験方法
（１）コラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０の産生促進効果試験
１）試験方法
ＮＨＤＦ細胞を１２－ｗｅｌｌ プレートに８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、培地を用いて調製し、ＩＱＣ、ＰＧＧ、ＧＡの最終濃度が表１に記載の濃度になるように希釈して培養を継続した。なお表１における「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルフォキシドの略である。
（１）コラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０の産生促進効果試験
１）試験方法
ＮＨＤＦ細胞を１２－ｗｅｌｌ プレートに８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して、２４時間培養した。培養後、培地を除去して、培地を用いて調製し、ＩＱＣ、ＰＧＧ、ＧＡの最終濃度が表１に記載の濃度になるように希釈して培養を継続した。なお表１における「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルフォキシドの略である。
【0031】
【表1】
【0032】
各コラーゲン受容体産生促進効果を確認するために、培養液中の最終濃度は次の表２になるように添加した。
【0033】
培地交換後４８時間培養し、その後、培地を除去して、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄した。細胞は１００μｌ Ｌａｅｍｍｌｉ ｂｕｆｆｅｒ（０．０９ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３％ ＳＤＳ、１０．３％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に溶解し、エッペンドルフチューブに回収して、超音波破砕（１０秒処理、５秒氷上静置を３回）にかけて細胞を溶解させた。
次いで、４℃で１５，０００×ｇの条件で５分間遠心分離した。上清を４×ＳＤＳ－ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５℃で３分間熱処理した。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、約１５分間ブロッキングした。次に、ＰＶＤＦ膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋで１，０００倍希釈した一次抗体、Ａｎｔｉ－ＤＤＲ２（ＡＦ２５３８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｎｔｉ－Ｅｎｄｏ１８０（ａｂ７０１３２、ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β１（ＭＡＢ１９６５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＡｎｔｉ－βＡｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浸し、４℃で一晩反応させた。
その後ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて４回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体、Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ，Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，８１－１６２０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（７０７４Ｓ， ＣＳＴ）又は Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ（ＨＲＰ， Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇ２１０４０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
反応終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、次いでＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、化学発光検出装置（ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉ、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）でシグナルを検出した。検出されたＥｎｄｏ１８０に相当するバンドのシグナル強度を解析（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）し、βＡｃｔｉｎのバンドシグナル強度で標準化して、ＤＭＳＯのみが含有されているコントロール溶液（ネガティブコントロール）に対する相対値を算出しコラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０の増加量を評価した。
次いで、４℃で１５，０００×ｇの条件で５分間遠心分離した。上清を４×ＳＤＳ－ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混合し、９５℃で３分間熱処理した。次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけてタンパク質を分離した。ゲル内のタンパク質は電気的にＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、約１５分間ブロッキングした。次に、ＰＶＤＦ膜をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋで１，０００倍希釈した一次抗体、Ａｎｔｉ－ＤＤＲ２（ＡＦ２５３８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｎｔｉ－Ｅｎｄｏ１８０（ａｂ７０１３２、ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β１（ＭＡＢ１９６５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、またはＡｎｔｉ－βＡｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に浸し、４℃で一晩反応させた。
その後ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて４回洗浄後、１０，０００倍希釈した二次抗体、Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ，Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，８１－１６２０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（７０７４Ｓ， ＣＳＴ）又は Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ（ＨＲＰ， Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ，Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇ２１０４０，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に浸し、室温で１時間反応させた。
反応終了後にＰＢＳＴで４回洗浄し、次いでＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、化学発光検出装置（ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉ、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）でシグナルを検出した。検出されたＥｎｄｏ１８０に相当するバンドのシグナル強度を解析（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）し、βＡｃｔｉｎのバンドシグナル強度で標準化して、ＤＭＳＯのみが含有されているコントロール溶液（ネガティブコントロール）に対する相対値を算出しコラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０の増加量を評価した。
【0034】
２）結果
ＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡによるコラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０タンパク質の産生促進効果の測定結果を表２及び図１に示す。
ＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡによるコラーゲン受容体Ｅｎｄｏ１８０タンパク質の産生促進効果の測定結果を表２及び図１に示す。
【0035】
【表2】
【0036】
図１、表２に示す通り、ＰＧＧとＧＡ又はＩＱＣを併用すると相乗的にＥｎｄｏ１８０の産生が促進された。ＰＧＧのコラーゲン受容体産生促作用は、ＧＡ及び／又はＩＱＣによって相乗的に促進されることが確認できた。
【0037】
（２）コラーゲン受容体ＤＤＲ２の産生促進効果試験
１）試験方法
Ｅｎｄｏ１８０の産生促進試験と同様に試験を行った。なおＤＤＲ２に相当するバンドのシグナル強度の解析（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を行い、βＡｃｔｉｎのバンドシグナル強度で標準化して、ＤＭＳＯのみを含有するコントロール（ネガティブコントロールＤＭＳＯ（０．０５％）に対する相対値を算出しコラーゲン受容体ＤＤＲ２の増加量を評価した。
なお試験に用いたＩＱＣ、ＰＧＧ、ＧＡの最終濃度は、表３に記載の通りとした。
１）試験方法
Ｅｎｄｏ１８０の産生促進試験と同様に試験を行った。なおＤＤＲ２に相当するバンドのシグナル強度の解析（Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を行い、βＡｃｔｉｎのバンドシグナル強度で標準化して、ＤＭＳＯのみを含有するコントロール（ネガティブコントロールＤＭＳＯ（０．０５％）に対する相対値を算出しコラーゲン受容体ＤＤＲ２の増加量を評価した。
なお試験に用いたＩＱＣ、ＰＧＧ、ＧＡの最終濃度は、表３に記載の通りとした。
【0038】
【表3】
【0039】
２）結果
ＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡによるコラーゲン受容体ＤＤＲ２の産生促進効果の測定結果を表４及び図２に示す。
ＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡによるコラーゲン受容体ＤＤＲ２の産生促進効果の測定結果を表４及び図２に示す。
【0040】
【表4】
【0041】
ＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡは、強いＤＤＲ２産生促進作用を有している。その作用は、相互に併用すると、単独で用いた同濃度の効果の２倍以上のＤＤＲ２の産生促進効果を発揮することが判明した。
【0042】
以上の産生促進効果試験の結果からＰＧＧ、ＩＱＣ、ＧＡはコラーゲン受容体の産生を促進し、その活性は、併用によって増強されることが判明した。
【図1】
【図2】
