ホーム > 特許ランキング > ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
▶ ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーンの特許一覧
特許7495435治療用干渉粒子による免疫不全ウイルス感染を処置するための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-27
(45)【発行日】2024-06-04
(54)【発明の名称】治療用干渉粒子による免疫不全ウイルス感染を処置するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20240528BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20240528BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240528BHJP
C07K 14/155 20060101ALI20240528BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240528BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240528BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20240528BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z
C12N15/49 ZNA
C12N7/01
C07K14/155
A61K35/76
A61K45/00
A61P31/18
【請求項の数】
56
(21)【出願番号】P 2021574334
(86)(22)【出願日】2020-06-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-18
(86)【国際出願番号】 US2020037488
(87)【国際公開番号】W WO2020252305
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2022-02-09
(31)【優先権主張番号】62/861,723
(32)【優先日】2019-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517352418
【氏名又は名称】ザ ジェイ． デビッド グラッドストーン インスティテューツ、 ア テスタメンタリー トラスト エスタブリッシュド アンダー ザ ウィル オブ ジェイ． デビッド グラッドストーン
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ワインバーガー、レオール エス．
(72)【発明者】
【氏名】タナー、エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】チョン、スン－ヨン
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００１５７５９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１１２２２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】PLOS Genetics，2016年，Vol.12, No.5, e1005986，pp.1-14
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
干渉し、条件付きで複製し、条件付きで伝達する、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物であって、前記構築物は、ａ）長い末端反復、Ｇａｇリーダ配列、Ψパッケージングシグナル、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）、Ａ３、及びＡ７を含むシス作用エレメント；及び
ｂ）ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更であって、前記１つ以上の変更により、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、それにより前記構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更、
を含み、
前記１つ以上の変更は、逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子をトランケートするＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列における欠失を含む、構築物。
【請求項2】
前記シス作用エレメントが、Ｄ４、Ａ４、及びＡ５をさらに含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項3】
前記長い末端反復が、長い３’末端反復又は長い５’末端反復である、請求項１又は２に記載の構築物。
【請求項4】
ＲｅｖおよびＶｐｕのそれぞれを非機能的にする１つ以上の変更をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項5】
前記構築物によってコードされるゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、前記野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡよりも速い速度で産生され、それにより、前記野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡに対して前記構築物によってコードされる前記ｇＲＮＡの比率が、前記細胞内で１よりも大きくなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項6】
前記構築物が前記野生型ＨＩＶよりも高い伝達頻度を有する、請求項５に記載の構築物。
【請求項7】
前記構築物が基本再生産数（Ｒ０）＞１を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項8】
前記構築物が、遺伝子産物をコードするいかなる異種ヌクレオチド配列も含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項9】
前記構築物が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶよりも高い効率でパッケージ化される、請求項１～８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項10】
前記シス作用エレメントが、ＨＩＶタンパク質コード配列内に包埋された少なくとも１つのシスエレメントを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項11】
ＨＩＶスプライスドナー部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項12】
Ｄ２及びＤ３スプライスドナー部位が欠失している、請求項１０に記載の構築物。
【請求項13】
ＨＩＶスプライスアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項14】
Ａ１及びＡ２スプライスアクセプター部位が欠失している、請求項１３に記載の構築物。
【請求項15】
前記ＨＩＶヌクレオチド配列における前記１つ以上の変更が、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項16】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５に記載の構築物。
【請求項17】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、５８３０～６０４４、５８７２～５８８０、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の構築物。
【請求項18】
前記構築物が、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項１６又は１７に記載の構築物。
【請求項19】
ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、およびＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項20】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５７３７、３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、５８５０～６３４１、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１９に記載の構築物。
【請求項21】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の構築物。
【請求項22】
前記構築物が、配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項２０又は２１に記載の構築物。
【請求項23】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５６３０、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項24】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、５８５０～６０４４、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の構築物。
【請求項25】
前記構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項２４に記載の構築物。
【請求項26】
配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置５８５０～６３４１に対応するヌクレオチドの欠失をさらに含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項27】
前記構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の構築物。
【請求項28】
前記構築物が、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、請求項２６又は２７に記載の構築物。
【請求項29】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項30】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項31】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項32】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項33】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項34】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項35】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項36】
前記構築物が、ＨＩＶ Ｇａｇをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項37】
請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項38】
請求項３７に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＨＩＶに感染した個体を処置するためにその治療有効量が前記個体に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項39】
請求項３７に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減するためにその有効量が前記個体に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項40】
請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物及びウイルスエンベロープタンパク質を含む粒子。
【請求項41】
前記エンベロープタンパク質がｇｐ１２０を含む、請求項４０に記載の粒子。
【請求項42】
前記エンベロープタンパク質が非ＨＩＶタンパク質である、請求項４０に記載の粒子。
【請求項43】
請求項４０～４２のいずれか一項に記載の粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項44】
請求項３７又は４３に記載の医薬組成物を含む容器を含む、ＨＩＶによる感染症を処置するためのキット。
【請求項45】
前記容器がシリンジである、請求項４４に記載のキット。
【請求項46】
請求項４３に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＨＩＶに感染した個体を処置するためにその治療有効量が前記個体に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項47】
請求項４３に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減するためにその有効量が前記個体に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項48】
請求項３８、３９、４６および４７のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤とともに前記個体に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項49】
前記個体が、ＨＩＶ感染と診断されているか、又は一般集団よりもＨＩＶに感染するリスクが高いと考えられている、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項50】
前記医薬組成物は、ＨＩＶに感染した細胞のゲノムに組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する有効量の薬剤とともに前記個体に投与されるものである、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項51】
請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物を含む、単離された体液。
【請求項52】
前記体液が血液又は血漿である、請求項５１に記載の単離された体液。
【請求項53】
干渉し、条件付きで複製する、変異体ＨＩＶ構築物を生成する方法であって、前記方法は、ａ）請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物を第１の非ヒト動物個体に導入することと；
ｂ）請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物が前記第１の非ヒト動物個体から伝達された第２の非ヒト動物個体から生物学的試料を入手することであって、前記第２の非ヒト動物個体に存在する前記構築物は、請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物の変異体である前記入手することと；
ｃ）前記第２の非ヒト動物個体から前記変異体構築物をクローニングすることと、
を含む、方法。
【請求項54】
請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物を含む、単離された細胞。
【請求項55】
粒子を生成する方法であって、請求項１～３６のいずれか一項に記載の構築物でＨＩＶに感染した細胞をトランスフェクトし、前記構築物を前記粒子にパッケージングするのに好適な条件下で前記細胞をインキュベートすることを含み、前記方法はインビトロで実施される、方法。
【請求項56】
請求項４０～４３のいずれか一項に記載の粒子を含む、単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療用干渉粒子による免疫不全ウイルス感染を処置するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗レトロウイルス剤の変革的な成功にもかかわらず、３７００万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳと共に生活している。現在の介入には高度な患者の関与が必要であるが、多くの感染者、特に資源に乏しい環境にいる感染者は、一貫したケアにアクセスすることができない。２００３年に、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）らは、患者の負担を低減するための戦略を提案した。ウイルスの存在下で増幅し、ＨＩＶ感染連鎖に入り、高リスク個体に遭遇する可能性を高める、伝染性抗ウイルス剤である（ワインバーガー、２００３年および２０１１年）。治療用干渉粒子（ＴＩＰ）と呼ばれるこの概念は、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、野生型ウイルスからの複製及び／又はパッケージングタンパク質を乗っ取り、それによりウイルスの増殖に干渉する、複製欠陥ウイルスゲノムからインスピレーションを得ている（図１Ａ）。ＤＩＰは、元は１９７０年代にウイルス対策として提案されたが（ファン（Ｈｕａｎｇ）及びバルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ））、治療期間が限られているため、目標に届かなかった。ＲＮＡウイルスの場合、ＤＩＰの複製及び感染には、野生型ウイルスによる持続的な重複感染が必要であり、そうでない場合、ＤＩＰ ＲＮＡは分解によって急速に排除される。一方、ＴＩＰは、高い伝達率（すなわち、Ｒ０＞１）と宿主細胞ゲノムへの組み込みの組み合わせにより、持続性について明確に改変されている（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）、メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）、イゴール（Ｉｇｏｒ））。シミュレーションによると、これらの持続性基準を満たし、患者におけるウイルス量を１ログ低減するＴＩＰの単回投与により、患者のＡＩＤＳ進行の可能性及び感染伝播のリスクが大幅に低減され得ることが示唆される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は、干渉し（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）、条件付きで複製する（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物；構築物を構成する感染性粒子；及び構築物又は粒子を含む組成物を提供する。構築物、粒子、及び組成物は、個体におけるＨＩＶウイルス量を減少させる方法において有用であり、その方法もまた提供される。
【0004】
一態様では、干渉し、条件付きで複製し、条件付きで伝達する（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ）、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物が提供され、構築物は、ａ）長い末端反復、Ｇａｇリーダ配列、Ψパッケージングシグナル、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）、Ａ３、及びＡ７を含むシス作用エレメント；及びｂ）ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を含み、ここで、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＨＩＶ）を要する。
【0005】
特定の実施形態では、シス作用エレメントは、Ｄ４、Ａ４、及びＡ５をさらに含む。
特定の実施形態では、長い末端反復は、長い３’末端反復又は長い５’末端反復である。
特定の実施形態では、長い末端反復は、長い３’末端反復又は長い５’末端反復である。
【0006】
特定の実施形態では、構築物は、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、及びＥｎｖのそれぞれを非機能的にする１つ以上の変更をさらに含む。
特定の実施形態では、構築物によってコードされるゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡよりも速い速度で産生され、その結果、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡに対する構築物によってコードされるｇＲＮＡの比率は、細胞内で約１よりも大きくなる。
特定の実施形態では、構築物によってコードされるゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡよりも速い速度で産生され、その結果、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡに対する構築物によってコードされるｇＲＮＡの比率は、細胞内で約１よりも大きくなる。
【0007】
特定の実施形態では、構築物は、野生型ＨＩＶよりも高い伝達頻度を有する。
特定の実施形態では、構築物は、基本再生産数（ｂａｓｉｃ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ）（Ｒ０）＞１を有する。
特定の実施形態では、構築物は、基本再生産数（ｂａｓｉｃ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ）（Ｒ０）＞１を有する。
【0008】
特定の実施形態では、構築物は、遺伝子産物をコードするいかなる異種ヌクレオチド配列も含まない。
特定の実施形態では、構築物は、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶよりも高い効率でパッケージ化される。
特定の実施形態では、構築物は、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶよりも高い効率でパッケージ化される。
【0009】
特定の実施形態では、シス作用エレメントは、ＨＩＶタンパク質コード配列内に包埋された少なくとも１つのシスエレメントを含む。
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶスプライスドナー又はアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む。例えば、１つ以上のＤ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位を欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位は全て欠失している。
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶスプライスドナー又はアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む。例えば、１つ以上のＤ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位を欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位は全て欠失している。
【0010】
特定の実施形態では、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更は、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異を含む。
【0011】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５７３７、３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、５８３０～６０４４、５８７２～５８８０、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含む。
【0012】
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異をさらに含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、５８５０～６３４１、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0013】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５６３０及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、５８５０～６０４４、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0014】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置５８５０～６３４１に対応するヌクレオチドの欠失をさらに含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。
【0015】
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列における欠失、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の欠失、若しくはＨＩＶ Ｇａｇをコードするヌクレオチド配列の欠失、又はそれらの組み合わせを含む。
【0016】
別の態様では、本明細書に記載の構築物を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、別のＨＩＶ抗ウイルス治療剤をさらに含む。
【0017】
別の態様では、ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体を処置する方法が提供され、方法は、本明細書に記載の構築物を含む治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む。
【0018】
別の態様では、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法が提供され、方法は、本明細書に記載の構築物を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む。
【0019】
別の態様では、粒子が提供され、粒子は、本明細書に記載の構築物及びウイルスエンベロープタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、エンベロープタンパク質は、ｇｐ１２０を含む。他の実施形態では、エンベロープタンパク質は非ＨＩＶタンパク質である。
【0020】
別の態様では、本明細書に記載の構築物を含む粒子及びウイルスエンベロープタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、別のＨＩＶ抗ウイルス治療剤をさらに含む。
【0021】
別の態様では、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を処置するためのキットが提供され、キットは、本明細書に記載の構築物を含む医薬組成物を含む容器（例えば、シリンジ）を含む。
【0022】
別の態様では、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を処置するためのキットが提供され、キットは、本明細書に記載の構築物とウイルスエンベロープタンパク質とを含む粒子を含む医薬組成物を含む容器（例えば、シリンジ）を含む。
【0023】
別の態様では、ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体を処置する方法が提供され、方法は、本明細書に記載の粒子を含む治療有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む。
【0024】
別の態様では、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法が提供され、方法は、本明細書に記載の粒子を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む。
【0025】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＨＩＶ感染と診断されているか、又は一般集団よりもＨＩＶに感染するリスクが高いと考えられる個体を処置するために使用される。そのような個体は、ＨＩＶに感染した細胞のゲノムに組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する有効量の薬剤でさらに処置されてもよい。
【0026】
別の態様では、本明細書に記載の構築物を含む単離された体液が提供され、例えば、血液又は血漿を含むがこれらに限定されない。
別の態様において、干渉し、条件付きで複製する、変異体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を生成する方法が提供され、方法は、ａ）本明細書に記載の構築物を第１の個体に導入すること；ｂ）構築物が第１の個体から伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、第１の個体に導入された構築物の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である入手すること；及びｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすることを含む。
別の態様において、干渉し、条件付きで複製する、変異体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を生成する方法が提供され、方法は、ａ）本明細書に記載の構築物を第１の個体に導入すること；ｂ）構築物が第１の個体から伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、第１の個体に導入された構築物の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である入手すること；及びｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすることを含む。
【0027】
別の態様では、本明細書に記載の構築物を含む単離された細胞が提供される。
別の態様では、粒子を生成する方法が提供され、方法は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した細胞を本明細書に記載の構築物でトランスフェクトし、構築物を粒子にパッケージングするのに好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。
別の態様では、粒子を生成する方法が提供され、方法は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した細胞を本明細書に記載の構築物でトランスフェクトし、構築物を粒子にパッケージングするのに好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】ＨＩＶ治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の概念を示す。（図１Ａ）（弱い）ＬＴＲプロモータによって駆動される９つの遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ）をコードするＨＩＶゲノムの模式図。ゲノム（左のＤＮＡ）に組み込まれた後、ＴａｔはＬＴＲ（矢印）をトランス活性化してＨＩＶ ＲＮＡを生成し、最終的にウイルスカプシドを形成するパッケージングタンパク質を生成し、ＨＩＶ ＲＮＡは、ＨＩＶパッケージングシグナル（Ψ）がウイルスゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に存在する場合にパッケージ化される。
【図1B】ＨＩＶ治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の概念を示す。（図１Ｂ）ＨＩＶ ＴＩＰは、パッケージングに必要なΨ、ＬＴＲ、及びその他のウイルスシスエレメントを輸送するように再改変された、簡素化されたバージョンのＨＩＶゲノムである。したがって、ＴＩＰ ＲＮＡは、ＨＩＶタンパク質（例えば、Ｔａｔ）も発現する細胞によってのみ作製できる。ＴＩＰは、二重感染細胞でＨＩＶよりも実質的に多くのｇＲＮＡコピーを産生するように改変されている（予備データを参照）。ＨＩＶ ｇＲＮＡよりもＴＩＰ ｇＲＮＡの方が不釣り合いに多く、ＨＩＶのパッケージング材料は、ＨＩＶではなくＴＩＰを封入することで主に浪費されている。したがって、ＴＩＰはＨＩＶ放出数を低下させ、感染細胞をＨＩＶ産生から主にＴＩＰ産生に変換し、それにより、ＨＩＶセットポイントウイルス量を低下させる（図２を参照）。
【図2A】ＴＩＰが患者のＨＩＶウイルス量を低下させ、サハラ以南アフリカでの従来の介入よりも優れていると予測されていることを示す。（図２Ａ）患者のウイルス量の数学的モデルにより、細胞内パッケージングリソースについてＨＩＶを化学量論的に打ち負かす、ＴＩＰが干渉し、条件付きで動員して、臨床的進行及び伝達に強い相関関係でＨＩＶセットポイントウイルス量を低下させることが予測される。
【図2B】ＴＩＰが患者のＨＩＶウイルス量を低下させ、サハラ以南アフリカでの従来の介入よりも優れていると予測されていることを示す。（図２Ｂ）ＵＮＡＩＤＳ産婦人科クリニックのデータセットに基づいた、マラウイにおけるＨＩＶ／ＡＩＤＳに対するＴＩＰ介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の予測される影響。ＴＩＰ介入は以下と比較される：（ｉ）全個体の楽観的な８０％接種率に展開される、ＲＶ１４４「タイ（Ｔｈａｉ）」ワクチン試験から報告された保護レベルに基づく３０％予防ワクチン（ワクチン１）の導入；（ｉｉ）楽観的な９５％接種率による潜在的な５０％の予防ワクチン（ワクチン２）、及び（ｉｉｉ）全感染の７５％が、伝達を阻止する効果９９．９％で処置される、楽観的な抗レトロウイルス剤の「試験及び処置」キャンペーン。ＨＩＶウイルス量を０．５～１．５ログのみ低減するＴＩＰは、高リスク群の固有のターゲティングにより、有病率を大幅に低減し得る。ＨＩＶセットポイントを１ログ低減するＴＩＰは、約５％のＨＩＶ／ＡＩＤＳ有病率をもたらし、１．５ログの低減は１％未満の有病率を達成する。重要なことに、これらのモデルはＨＩＶ耐性の進化を考慮していないため、ワクチン及び抗ウイルスの予測は楽観的である（ｏｐｔｉｍｉｓｔｉｃ）（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。
【図4】ＴＩＰスクリーニングのためのランダム化されたバーコード（ｂａｒｃｏｄｅｄ）欠失ライブラリを構築するための一般的な方法を示す。分子クローンからバーコードＴＩＰ候補ライブラリを構築する方法の模式的サイクル：インビトロレトロトランスポゾンのサイクル［１］、ランダムに挿入されたレトロトランスポゾンのエキソヌクレアーゼ媒介切除［２］、欠失を作製するための酵素的チューバック（ｃｈｅｗｂａｃｋ）（Δ）［３］、及び再ライゲーション中のバーコード［４］。（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）著、２０１７年）
【図5B】ライブラリの欠失がＨＩＶのゲノムに及ぶことを示す。（図５ｂ）選択されたシス（ＲＲＥ、ＬＴＲ）及びトランスエレメント（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）で注釈が付けられた基礎ｐＮＬ４－３マップ。１２０，０００変異体ライブラリの１５％のサブセットが示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でｐＮＬ４－３プラスミドを維持するために必要なｏｒｉ／β－ｌａｃに欠失がないことに留意されたい（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）著、２０１７年）。
【図6A】ランダム欠失ライブラリからのＨＩＶにおけるシス作用エレメント（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の同定を示す。（図６Ａ）高ＭＯＩ継代スキーム。ＨＩＶ欠失変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）（薄い灰色のビリオン）の多様なライブラリは、ＮＬ４３ ＨＩＶ（濃い灰色のビリオン）の存在下、許容Ｔ細胞株（ＭＴ－４）で継代される。必要な全てのシス作用エレメントを保持している欠失変異体のみが、ＨＩＶによって次世代の標的細胞に動員される。
【図6B】ランダム欠失ライブラリからのＨＩＶにおけるシス作用エレメントの同定を示す。（図６Ｂ）ＭＴ－４（２５ｋ変異体）で１２継代した後、生存変異体の遺伝子型は、ＨＩＶゲノムにマッピングされたバーコードタグ及び欠失遺伝子型のディープシーケンシングによって評価される（図６Ｃに示される）。欠失深度が低い領域は、欠失に耐性のないシス作用エレメント（５’ＬＴＲ、５’ｇａｇ、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ、３’ＬＴＲ）の存在を示し、欠失深度が高い領域は、欠失に耐性があり（トランス作用エレメント）、欠失してＴＩＰを生成できる。
【図6C】ランダム欠失ライブラリからのＨＩＶにおけるシス作用エレメントの同定を示す。（図６Ｂ）ＭＴ－４（２５ｋ変異体）で１２継代した後、生存変異体の遺伝子型は、ＨＩＶゲノムにマッピングされたバーコードタグ及び欠失遺伝子型のディープシーケンシングによって評価される（図６Ｃに示される）。欠失深度が低い領域は、欠失に耐性のないシス作用エレメント（５’ＬＴＲ、５’ｇａｇ、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ、３’ＬＴＲ）の存在を示し、欠失深度が高い領域は、欠失に耐性があり（トランス作用エレメント）、欠失してＴＩＰを生成できる。
【図7】ＨＩＶスプライシングが転写後であることを示す。潜伏期逆転（ＴＮＦ）とそれに続くアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）による転写停止後の、ＨＩＶ非スプライシング、単一スプライシング、及び多重スプライシング転写物（ＵＳ、ＳＳ、ＭＳ）の単一分子ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら著、２０１８年）。
【図8B】Ｆ１ｃＰＰＴ組換え体がＨＩＶに干渉することを示す。（図８Ｂ）Ｆ１（ＴＩＰ＋細胞）又はシャム（ナイーブ細胞）で形質導入され、次いでＨＩＶ－ＢＦＰに感染した、ＭＴ－４細胞の２色フローサイトメトリー。１ラウンド目及び２ラウンド目の感染（２及び４ｄｐｉ）のデータが示される。２ラウンド目の感染時に明らかなＨＩＶへのＦ１干渉（４ｄｐｉでＢＦＰの低減）。
【図8C】Ｆ１ｃＰＰＴ組換え体がＨＩＶに干渉することを示す。（図８Ｃ）２ｄｐｉのナイーブ又はＦ１＋細胞からナイーブＭＴ－４細胞へのウイルス上清移入後のＨＩＶ力価（増殖）。プロトタイプＴＩＰは、ＨＩＶ力価（％ＢＦＰ＋細胞及び細胞変性効果によって定量化される）を大幅に低減する。
【図8D】Ｆ１ｃＰＰＴ組換え体がＨＩＶに干渉することを示す。（図８Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲ：上清のＨＩＶ ｇＲＮＡはＦ１によって低減され、ＨＩＶはＦ１ ｇＲＮＡを動員する。これは、ＨＩＶ ｇＲＮＡを約６０：４０で打ち負かし、パッケージ化する。初代細胞及びヒト化マウスのデータにつき図＊＊－＊＊を参照されたい。
【図9】Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶ感染によって動員され、自己動員しないことを示す。ＭＴ－４共培養アッセイのフローサイトメトリー分析：ＨＩＶ感染の存在下又は非存在下で、Ｆ１ｃＰＰＴＧＦＰ形質導入細胞又は対照ＧＦＰ＋細胞と共培養したナイーブｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞。
【図10A】Ｆ１ｃＰＰＴがＲ０＞１を示し、ＨＩＶのＲ０を低減することを示す。（図１０Ａ）約１０％のＦ１ｃＰＰＴＣＥＭ細胞（ＧＦＰ＋）及び８８％のｍＣｈｅｒｒｙ＋標的ＣＥＭを播種し、低ＭＯＩでＨＩＶ－ＢＦＰに感染させたスピナーフラスコでのＨＩＶ及びＴＩＰの伝播率。％ＢＦＰ＋及びＧＦＰ＋／ｍＣｈｅｒｒｙ＋二重陽性細胞をフローサイトメトリーで監視した。細胞が２００万細胞／ｍＬに達したときに細胞を１：４に希釈した。
【図10B】Ｆ１ｃＰＰＴがＲ０＞１を示し、ＨＩＶのＲ０を低減することを示す。（図１０Ｂ）単一ラウンドの伝播からの計算されたＨＩＶ及びＦ１ｃＰＰＴＴＩＰのＲ０。上、ｍＣｈｅｒｒｙ標識細胞へのＨＩＶ及びＴＩＰの伝播。下、Ｒ０値の表。
【図11】Ｆ１ｃＰＰＴが長期培養におけるＨＩＶ伝播に安定的に干渉することを示す。ＣＥＭ細胞（黒）でのＨＩＶ又は５０％Ｆ１ｃＰＰＴ形質導入ＣＥＭ細胞（緑）でのＨＩＶのリアクター培養物のフローサイトメトリー分析。２５～３５日目の推定上の共進化性「ブリップ（ｂｌｉｐ）」に注意されたい。
【図13B】Ｆ１欠失がＧａｇのプロテアーゼ切断を破壊することを示す。（図１３Ｂ）ウイルス上清中のｐ２４のＦＬＡＱアッセイ（左）及びｐ２４に正規化されたＨＩＶ又はＦ１ｃＰＰＴｇＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを用いたＲＴ－ｑＰＣＲ（右）。
【図13C】Ｆ１欠失がＧａｇのプロテアーゼ切断を破壊することを示す。（図１３Ｃ）抗ｐ２４抗体によってアッセイされた、示された比率のＨＩＶ又はＦ１でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット。
【図14A】Ｆ１のトランケート型ＧａｇＰｏｌタンパク質がビリオン粒子中にパッケージングされていることを示す。（図１４Ａ）野生型ＨＩＶ及びＦ１ ｇａｇ－ｐｏｌコード領域の模式図であり、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質サイズが示されている。Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質は、ｇａｇ配列内のフレームシフトシグナルによって作製される。
【図14B】Ｆ１のトランケート型ＧａｇＰｏｌタンパク質がビリオン粒子中にパッケージングされていることを示す。（図１４Ｂ）精製されたビリオン粒子のウエスタンブロット分析。２９３Ｔ細胞に、野生型プロテアーゼ又はプロテアーゼ不活性化変異（Ｄ２５Ａ）をコードする完全長ＨＩＶ又はＦ１構築物をトランスフェクトして、ビリオンで検出される未切断のＧａｇ及びＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質を検出した。トランスフェクションの２日後、上清を精製し、ショ糖勾配で濃縮し、ビリオンタンパク質を抗ｇａｇ（ｐ２４）抗体を使用したリコール（ＬＩＣＯＲ）（商標）ウエスタンブロットで分析した。
【図16】ＨＩＶビリオン中のタンパク質のＬＣ ＭＳ／ＭＳ質量分析検出を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で産生されたビリオンは、ろ過した培養上清を２０％スクロース層で超遠心分離することにより精製した。得られたペレットをトリプシンで消化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ＨＩＶタンパク質は太字で示される。
【図17B】ＲＮＡパッケージングのＳＶＡイメージングを示す。（図１７Ｂ）細胞内のＨＩＶＢＳＬ及びＨＩＶＭＳＬの代表的なＳＶＡ ＴＩＲＦイメージング（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２０１６年）。矢印は、ホモ二倍体のＨＩＶＢＳＬ又はＨＩＶＭＳＬビリオン（２色）及びヘテロ二倍体のＨＩＶＢＳＬ－ＨＩＶＭＳＬビリオン（３色、中央の矢印）を示す。
【図18A】Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶ－２系統の実験室株（ＳＩＶｍａｃ２３９）に干渉することを示す。（図１８Ａ）ＣＥＭｘ１７４細胞のＳＩＶｍａｃ２３９感染がＦ１ｃＰＰＴＴＩＰを実質的にトランス活性化することを示すフローサイトメトリーヒストグラム。形質導入された非感染ＣＥＭｘ１７４細胞では、ＧＦＰ活性は中程度（緑色）であるが、ＳＩＶ感染はＦ１ｃＰＰＴを実質的にトランス活性化する（ピンク、２ｄｐｉからのデータ）。
【図18B】Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶ－２系統の実験室株（ＳＩＶｍａｃ２３９）に干渉することを示す。（図１８Ｂ）ＣＥＭｘ１７４（左）又はＦ１ ＴＩＰｃＰＰＴ形質導入ＣＥＭｘ１７４細胞（右）のいずれかからのウイルス上清（２ｄｐｉから）で処置されたＣＥＭｘ１７４細胞に対するウイルス細胞変性効果によって測定されるＳＩＶ増殖。Ｆ１ ＴＩＰは、１ラウンドの感染でＳＩＶの増殖を大幅に低減する（エラーバーは、生物学的重複実験からのＳＴＤＥＶを示す）。
【図19B】Ｆ１ ＴＩＰがｈｕ－ＰＢＬマウスモデルにおいてＨＩＶを阻害し、ＣＤ４細胞を保護することを示す。（図１９Ｂ）感染後１週間（左）及び２週間（右）での、ＨＩＶ感染を有する及び有しない、ＴＩＰ処置マウス及び対照マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞濃度。Ｆ１ｓｐｌｉｃｅ＊ＴＩＰは、Ｆ１ ｐ５１コード領域の初期に二重終止コドンを含む。箱ひげプロット、各条件につきｎ＝８。星印は、グループ内（すなわち、＋／－感染）又は非ＴＩＰマウスとＴＩＰマウスの間で計算されたｐ値を示す。＊ｐ≦０．０３、＊＊ｐ≦０．００３、マンホイットニー検定。
【図19C】Ｆ１ ＴＩＰがｈｕ－ＰＢＬマウスモデルにおいてＨＩＶを阻害し、ＣＤ４細胞を保護することを示す。（図１９Ｃ）ｄｄＰＣＲによって測定された感染後１週間の感染マウスから収集されたマウス血清中のウイルス量。点＝マウス個体；線＝平均。検出閾値を下回る値の試料は、ｘ軸上にグラフ化される。＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とそれに続くテューキの多重比較検定。
【図19D】Ｆ１ ＴＩＰがｈｕ－ＰＢＬマウスモデルにおいてＨＩＶを阻害し、ＣＤ４細胞を保護することを示す。（図１９Ｄ）マウス血清中の完全長ＨＩＶ及びＴＩＰゲノムの頻度。ＷＴ及びＴＩＰゲノムは、感染後１週間のｄｄＰＣＲによって定量化された。各バーは、ＨＩＶに感染した１匹のマウスを表す。
【図20】ｈｕ－ＮＳＧマウスが約１００日間にわたり安定したＨＩＶセットポイントを示すことを示す。ＡＲＴ前（０～４週）、ＡＲＴ中（４～１０週、影付き領域）、及びＡＲＴ後（１０～１４週）のｈｕ－ＨＳＰＣ－ＮＳＧマウスにおける血漿ウイルスＲＮＡ（コピー／ｍｌ）動態。マウス１匹あたり５０～１００ｌの血液しか採取されなかったため、アッセイ感度は約７５０～８００ＲＮＡコピー／ｍｌ（点線）である。黒丸は未処置マウスのｖＲＮＡレベルを示し、白丸はＡＲＴ処置動物のレベルを示す。（サティーサン（Ｓａｔｈｅｅｓａｎ）ら著、２０１８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第９２巻、第７号、ｐｉｉ：ｅ０２１１８－１７）。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
「免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、及びサル免疫不全ウイルスを含む。本明細書で使用される「ヒト免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、並びに多様なＨＩＶサブタイプ及び疑似種のうちのいずれをも指す。
「免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、及びサル免疫不全ウイルスを含む。本明細書で使用される「ヒト免疫不全ウイルス」という用語は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス－２（ＨＩＶ－２）、並びに多様なＨＩＶサブタイプ及び疑似種のうちのいずれをも指す。
【0030】
本明細書で言及される場合、「シュードタイプエンベロープ」は、レトロウイルスコアビリオンと共に自然発生するもの以外のエンベロープタンパク質であり、レトロウイルスコアビリオンをカプセル化する（表現型的に混合されたウイルスを生じる）。
【0031】
「ウイルス」とは、タンパク質及び核酸からなり、宿主細胞の遺伝子機構を使用してウイルス核酸で特定されたウイルス産物を産生する、感染性物質である。「核酸」は、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状であり、任意選択により、ＤＮＡ又はＲＮＡポリマーに組み込むことができる合成、非天然、又は修飾ヌクレオチドを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、ゲノム又はｃＤＮＡ配列から構成される。
【0032】
「ウイルスの野生型株」は、本明細書に記載されるような人工の変異を含まない株であり、すなわち、野生型ウイルスは、自然から（例えば、ウイルスに感染したヒトから）単離することができる任意のウイルスである。野生型ウイルスは実験室で培養することができるが、それでも、他のウイルスの非存在下でも、自然から単離されたもののような子孫ゲノム又はビリオンを生成することができる。
【0033】
本明細書で使用されるとき、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、所望の薬理的及び／又は生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防する点で予防的であってもよく、且つ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因し得る有害作用に対する部分的若しくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物における、特にヒトにおける、疾患のいずれの処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）をも包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、それを有すると未だに診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を止めること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。
【0034】
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、ネズミ科動物（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ科動物、ネコ科動物、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【0035】
「治療有効量」又は「効果的量」は、疾患を処置するために哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の対象に投与されるとき、その疾患に対するそのような処置を達成するのに十分である、薬剤（例えば、本明細書に記載の構築物、粒子など）の量を指す。「治療有効量」は、化合物又は細胞、疾患及びその重症度、並びに処置されるべき対象の年齢、体重などに応じて変動し得る。
【0036】
「共投与」及び「と組み合わせて」という用語は、同時に、並行に、又は具体的な時限のない範囲での順次のいずれかでの、２つ以上の治療剤の投与を含む。一実施形態では、薬剤は、細胞中若しくは対象の体内に同時に存在するか、又はそれらの生物学的若しくは治療的効果を同時に発揮する。一実施形態では、治療剤は、同じ組成物又は単位剤形中にある。他の実施形態では、治療剤は、別個の組成物又は単位剤形中にある。特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与の前に（例えば、分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、それと併用で、又はその後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）、投与することができる。
【0037】
本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」は、哺乳動物（例えばヒト）などの対象への投与に好適な組成物を包含することが意図される。一般的に、「薬学的組成物」は、滅菌されており、対象内で望ましくない反応を引き出す可能性のある汚染物質がない（例えば、薬学的組成物中の化合物は、薬学的グレードである）。薬学的組成物は、それを必要とする対象又は患者への、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などを含むいくつかの異なる投与経路を介した投与のために、設計することができる。
【0038】
本発明がさらに説明される前に、本発明が、説明される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら、異なり得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、限定するものとしては意図されないこともまた理解されたい。
【0039】
値の範囲が提供される場合、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り下限の単位の小数第１位までの、その範囲の上限と下限の間の、且つその指定範囲における任意の他の指定された又は介在する値である各介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、指定範囲における任意の具体的な除外限度を条件として、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、それもまた本発明内に包含される。指定範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限度の一方又は両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【0040】
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての学術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び物質と同様又は同等のいずれの方法及び物質もまた、本発明の実践又は試験で使用することができるが、好ましい方法及び物質がここでは記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される関連となる方法及び／又は物質を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0041】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「干渉粒子（ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」への言及は、複数のそのような粒子を含み、「シス作用エレメント（ｔｈｅ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、１つ以上のシス作用エレメント及び当業者に公知のその均等物への言及を含み、その他も同様である。特許請求の範囲は、いずれの任意選択による要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的専門用語の使用、又は「否定的」限定の使用のための、先行的基礎としての機能を果たすことが意図される。
【0042】
明確さのために別個の実施形態の文脈において記載される、本発明の特定の特色はまた、単一の実施形態と組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈において記載される、本発明の種々の特色もまた、別個に又は任意の好適な部分的組み合わせで提供され得る。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかも全ての組み合わせが個別に明示的に開示されたかのごとく、本明細書に開示される。さらに、種々の実施形態及びその要素の全ての部分的組み合わせもまた、あたかもありとあらゆるそのような部分的組み合わせが本明細書に個々に且つ明示的に開示されたかのごとく、本発明によって具体的に包含され、本明細書に開示される。
【0043】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためのみに提供される。本明細書のいかなる部分も、本発明が、先願発明に基づいて、そのような刊行物に先行する権利を有さないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行物の日付と異なる場合があり、それらはそれぞれ確認される必要があり得る。
【0044】
本開示は、干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物；構築物を構成する感染性粒子；及び構築物又は粒子を含む組成物を提供する。構築物、粒子、及び組成物は、個体におけるＨＩＶウイルス量を減少させる方法において有用であり、その方法もまた提供される。
【0045】
干渉構築物
本開示は、干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を提供する。簡単にするために、干渉し、条件付きで複製するＨＩＶ構築物は、「干渉構築物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」又は「ＴＩＰ」と呼ばれる。対象干渉構築物は条件付きで複製され、例えば、対象干渉構築物は、哺乳動物宿主に存在する場合、野生型ＨＩＶの非存在下で、それ自体のコピーを含む感染性粒子を形成することはできない。対象干渉構築物は、パッケージングに必要な適切なポリペプチドが提供される場合、実験室においてインビトロで（例えば、インビトロ細胞培養で）、感染性粒子にパッケージ化することができる。感染性粒子は、干渉構築物を宿主細胞、例えば、インビボ宿主細胞に送達することができる。インビボ宿主細胞（哺乳動物対象の宿主細胞）内に入ると、干渉構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は細胞質に留まることができる。干渉構築物は、野生型ＨＩＶの存在下でのみインビボ宿主細胞で複製することができる。干渉構築物を含むインビボ宿主細胞が野生型ＨＩＶに感染すると、干渉構築物は野生型ＨＩＶよりも実質的により効率的に複製し（例えば、転写及びパッケージングされ）、それにより野生型ＨＩＶを打ち負かす。その結果、ＨＩＶウイルス量は個体において大幅に低減される。
本開示は、干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を提供する。簡単にするために、干渉し、条件付きで複製するＨＩＶ構築物は、「干渉構築物（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」又は「ＴＩＰ」と呼ばれる。対象干渉構築物は条件付きで複製され、例えば、対象干渉構築物は、哺乳動物宿主に存在する場合、野生型ＨＩＶの非存在下で、それ自体のコピーを含む感染性粒子を形成することはできない。対象干渉構築物は、パッケージングに必要な適切なポリペプチドが提供される場合、実験室においてインビトロで（例えば、インビトロ細胞培養で）、感染性粒子にパッケージ化することができる。感染性粒子は、干渉構築物を宿主細胞、例えば、インビボ宿主細胞に送達することができる。インビボ宿主細胞（哺乳動物対象の宿主細胞）内に入ると、干渉構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、又は細胞質に留まることができる。干渉構築物は、野生型ＨＩＶの存在下でのみインビボ宿主細胞で複製することができる。干渉構築物を含むインビボ宿主細胞が野生型ＨＩＶに感染すると、干渉構築物は野生型ＨＩＶよりも実質的により効率的に複製し（例えば、転写及びパッケージングされ）、それにより野生型ＨＩＶを打ち負かす。その結果、ＨＩＶウイルス量は個体において大幅に低減される。
【0046】
本開示の干渉構築物は、ＲＮＡ構築物、又はＤＮＡ構築物（例えば、ＲＮＡのＤＮＡコピー）であり得る。
本開示の干渉構築物は、異種ヌクレオチド配列、例えば、ＨＩＶに由来しない配列を含まない。本開示の干渉構築物は、遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含まない。遺伝子産物には、ポリペプチド及びＲＮＡが含まれる。「異種」とは、天然の野生型ＨＩＶには通常は存在しないヌクレオチド配列を指す。
本開示の干渉構築物は、異種ヌクレオチド配列、例えば、ＨＩＶに由来しない配列を含まない。本開示の干渉構築物は、遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列を含まない。遺伝子産物には、ポリペプチド及びＲＮＡが含まれる。「異種」とは、天然の野生型ＨＩＶには通常は存在しないヌクレオチド配列を指す。
【0047】
対象干渉構築物は、ＨＩＶシス作用エレメントを含み、変更が１つ以上のコードＨＩＶトランス作用性ポリペプチドを非機能的にするようなＨＩＶヌクレオチド配列の変更を含む。「非機能的」とは、コードされたポリペプチドのトランケーション又は内部欠失のために、又はポリペプチド全体が欠如しているために、ＨＩＶトランス活性化ポリペプチドがその通常の機能を実行しないことを意味する。ＨＩＶヌクレオチド配列の「変更」には、１つ以上のヌクレオチドの欠失及び／又は１つ以上のヌクレオチドの置換が含まれる。
【0048】
場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、対象干渉構築物を含まない同じ型の宿主細胞における野生型ＨＩＶの複製速度よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍を超えて速い速度で複製する。
【0049】
場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、野生型ＨＩＶに感染しているが対象干渉構築物を含まない宿主細胞における野生型ＨＩＶ転写物の量と比較して、細胞内の野生型ＨＩＶ転写物の量を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％低減する。
【0050】
場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、宿主細胞の細胞質における野生型ＨＩＶコードＲＮＡに対する干渉構築物コードＲＮＡの比（重量比、例えば、μｇ：μｇ）が１より大きくなるように、干渉構築物コードＲＮＡの産生をもたらす。場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、宿主細胞の細胞質における野生型ＨＩＶコードＲＮＡに対する干渉構築物コードＲＮＡの比（重量比、例えば、μｇ：μｇ）が、少なくとも約１．５：１～少なくとも約１０２：１となるように、又は１０２：１より大きくなるように、例えば、約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１となるように、又は１００：１より大きくなるように、干渉構築物コードＲＮＡの産生をもたらす。
【0051】
場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、宿主細胞の細胞質における野生型ＨＩＶコードＲＮＡに対する干渉構築物コードＲＮＡの比（例えば、モル比）が１より大きくなるように、干渉構築物コードＲＮＡの産生をもたらす。場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、宿主細胞の細胞質における野生型ＨＩＶコードＲＮＡに対する干渉構築物コードＲＮＡの比（例えば、モル比）が、少なくとも約１．５：１～少なくとも約１０２：１となるように、又は１０２：１より大きくなるように、例えば、約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１となるように、又は１００：１より大きくなるように、干渉構築物コードＲＮＡの産生をもたらす。
【0052】
宿主細胞の細胞質における野生型ＨＩＶコード化ＲＮＡに対する干渉構築物コード化ＲＮＡの比を測定するために、任意の都合の良い方法を使用することができる。好適な方法は、例えば、干渉構築物でコードされたＲＮＡ及び野生型ＨＩＶでコードされたＲＮＡの両方のｑＲＴ－ＰＣＲを介して転写物数を直接測定すること；干渉構築物でコードされたＲＮＡ及び野生型ＨＩＶでコードされたＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを測定すること（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などを介して）；干渉構築物でコードされたＲＮＡ及び野生型ＨＩＶでコードされたＲＮＡに関連する検出可能な標識のレベルを測定すること（例えば、ＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡから翻訳されるタンパク質に融合される蛍光タンパク質の蛍光）を含み得る。このような測定は、例えば、共トランスフェクション後に、任意の都合の良い細胞型を使用して実行することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、干渉構築物コードＲＮＡは、パッケージ化されている。いくつかの実施形態では、干渉構築物コードＲＮＡは、パッケージ化されていない。場合によっては、干渉構築物コードＲＮＡは、パッケージ化されたＲＮＡ及びパッケージ化されていないＲＮＡの両方を含む。場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、野生型ｇＲＮＡ ＨＩＶゲノムと二量体化する。場合によっては、野生型ＨＩＶに感染している宿主細胞（例えば、個体の宿主細胞）に存在する場合、対象干渉構築物は、野生型ｇＲＮＡ ＨＩＶゲノムと二量体化し、野生型ＨＩＶの二量体化を阻害する。
【0054】
野生型ＨＩＶ及び対象干渉構築物は両方、宿主細胞によって（例えば、個体の宿主細胞において）感染性粒子にパッケージ化することができる。場合によっては、宿主細胞が対象干渉構築物及び野生型ＨＩＶの両方を含む場合、宿主細胞によって産生された干渉構築物含有粒子：野生型ＨＩＶ含有粒子の比は、１より大きい。場合によっては、宿主細胞が対象干渉構築物及び野生型ＨＩＶの両方を含む場合、宿主細胞によって産生された干渉構築物含有粒子：野生型ＨＩＶ含有粒子の比は、少なくとも約１．５：１～少なくとも約１０２：１であるか、又は１０２：１より大きく、例えば、約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１であるか、又は１００：１より大きい。
【0055】
野生型ＨＩＶゲノムは、およそ９７００ヌクレオチド長であり、例えば、約９７００ヌクレオチド～約９８００ヌクレオチド長である。対照的に、対象干渉構築物は、約１０００ヌクレオチド（ｎｔ）～約９７００ｎｔ、例えば、約１０００ｎｔ～約２０００ｎｔ、約２０００ｎｔ～約３０００ｎｔ、約３０００ｎｔ～約４０００ｎｔ、約４０００ｎｔ～約５０００ｎｔ、約５０００ｎｔ～約６０００ｎｔ、約６０００ｎｔ～約７０００ｎｔ、約７０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約８０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、又は約９０００ｎｔ～約９７００ｎｔなどの、ＨＩＶゲノム全長の一部であるゲノムを有する。場合によっては、対象干渉構築物は、約２５００ヌクレオチド（ｎｔ）～約９５００ｎｔ、例えば、約２５００ｎｔ～約３５００ｎｔ、約３０００ｎｔ～約４０００ｎｔ、約３５００ｎｔ～約４５００ｎｔ、約４０００ｎｔ～約５０００ｎｔ、約４５００ｎｔ～約５５００ｎｔ、約５０００ｎｔ～約６０００ｎｔ、約５５００ｎｔ～約６５００ｎｔ、約６０００ｎｔ～約７０００ｎｔ、約６５００ｎｔ～約７５００ｎｔ、約７０００ｎｔ～約８０００ｎｔ、約７５００ｎｔ～約８５００ｎｔ、約８０００ｎｔ～約９０００ｎｔ、又は約８５００ｎｔ～約９５００ｎｔの長さを有する。
【0056】
対象干渉構築物は、１より大きい基本再生産数（ｂａｓｉｃ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ）（Ｒ０）（「基本再生産数（ｂａｓｉｃ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ）」とも呼ばれる）を示し得る。Ｒ０は、感染期間中に１つのケースが平均して生成するケースの数である。Ｒ０が１の場合、感染は集団に伝播する可能性がある。したがって、対象干渉構築物は、集団内のある個体から別の個体に伝播する能力を有する。場合によっては、対象干渉構築物（又は対象干渉粒子）は、約２～約５、約５～約７、約７～約１０、約１０～約１５、又は１５超のＲ０を有する。
【0057】
シス作用エレメント
本開示の干渉構築物は、レンチウイルスシス作用エレメントを含む。シス作用エレメントは、例えば、レンチウイルスΨ（ｐｓｉ）パッケージングシグナル；レンチウイルスｒｅｖ応答エレメント（ｒｒｅ）；レンチウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）；及びＨＩＶタンパク質コード配列内に包埋されたシスエレメントを含む。ＨＩＶ－１シス作用エレメントのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。例えば、次のＷｅｂサイトを参照されたい：ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ。
本開示の干渉構築物は、レンチウイルスシス作用エレメントを含む。シス作用エレメントは、例えば、レンチウイルスΨ（ｐｓｉ）パッケージングシグナル；レンチウイルスｒｅｖ応答エレメント（ｒｒｅ）；レンチウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）；及びＨＩＶタンパク質コード配列内に包埋されたシスエレメントを含む。ＨＩＶ－１シス作用エレメントのヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。例えば、次のＷｅｂサイトを参照されたい：ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ。
【0058】
レンチウイルスΨパッケージングシグナル配列は当技術分野で公知である。例えば、レバー（Ｌｅｖｅｒ）ら著、１９８９年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、ｐ．４０８５；及びマクブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）ら著、１９９８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）第７１巻、ｐ．４５４４を参照されたい。Ψパッケージングシグナルの長さは約８０ｎｔから約１５０ｎｔであり、４つのステムループ（ＳＬ）構造：ＳＬ１－ＳＬ４を含む。レンチウイルスΨ（ｐｓｉ）パッケージングシグナル配列は、任意の既知の野生型Ψパッケージングシグナル配列と、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。
【0059】
ＨＩＶ－１ ＳＬ－１（当技術分野ではＨＩＶ－１＿ＤＩＳとしても知られる）は、以下の配列を有し得る：
５’－ＧＧＡＣＵＣＧＧＣＵＵＧＣＵＧＡＡＧＹＧＣＲＣＷＣＲＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＲＧ－３’（配列番号６）。
５’－ＧＧＡＣＵＣＧＧＣＵＵＧＣＵＧＡＡＧＹＧＣＲＣＷＣＲＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＲＧ－３’（配列番号６）。
【0060】
ＨＩＶ－１ ＳＬ２（当技術分野ではＨＩＶ－１＿ＳＤとしても知られる）は、以下の配列を有し得る：
５’－ＲＧＣＧＡＣＵＧＧＵＧＡＧＵＡＣＧＣＨ－３’（配列番号７）。
５’－ＲＧＣＧＡＣＵＧＧＵＧＡＧＵＡＣＧＣＨ－３’（配列番号７）。
【0061】
ＨＩＶ－１ ＳＬ３は、以下の配列を有し得る：
５’－ＵＧＡＣＵＡＧＣＧＧＡＧＧＣＵＡＧＡＡＧＧＡＧ－３’（配列番号８）。
ＨＩＶ－１ ＳＬ４は、以下の配列を有し得る：
５’－ＵＧＧＧＵＧＣＧＡＧＡＧＣＧＵＣＡＲＵＡ－３’（配列番号９）。
５’－ＵＧＡＣＵＡＧＣＧＧＡＧＧＣＵＡＧＡＡＧＧＡＧ－３’（配列番号８）。
ＨＩＶ－１ ＳＬ４は、以下の配列を有し得る：
５’－ＵＧＧＧＵＧＣＧＡＧＡＧＣＧＵＣＡＲＵＡ－３’（配列番号９）。
【0062】
上記の配列では、ＹはＣ又はＴであり；ＷはＡ又はＴであり；ＲはＡ又はＧであり；ＨはＡ、Ｃ、又はＴである。
レンチウイルスのｒｅｖ応答エレメント（ｒｒｅ）は、ＨＩＶ－１ゲノムの約ｎｔ７７０９～８０６３内にあり、長さは約２４０ｎｔ～約３５５ｎｔである。例えば、カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら著、１９９１年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６５巻、ｐ．１０５３；カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら著、１９９１年、セル（Ｃｅｌｌ）、第５８巻、ｐ．４２３～４２６；及びマリム（Ｍａｌｉｍ）ら著、１９８９年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第６２１２号、ｐ．２５４～７を参照されたい。好適なレンチウイルスｒｒｅは、任意の既知の野生型ＨＩＶ－１ ｒｒｅ配列と、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
レンチウイルスのｒｅｖ応答エレメント（ｒｒｅ）は、ＨＩＶ－１ゲノムの約ｎｔ７７０９～８０６３内にあり、長さは約２４０ｎｔ～約３５５ｎｔである。例えば、カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら著、１９９１年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６５巻、ｐ．１０５３；カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら著、１９９１年、セル（Ｃｅｌｌ）、第５８巻、ｐ．４２３～４２６；及びマリム（Ｍａｌｉｍ）ら著、１９８９年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第６２１２号、ｐ．２５４～７を参照されたい。好適なレンチウイルスｒｒｅは、任意の既知の野生型ＨＩＶ－１ ｒｒｅ配列と、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【0063】
ＨＩＶ－１ＬＴＲ配列は当技術分野で公知である。好適なレンチウイルス５’－ＬＴＲ又は３’－ＬＴＲは、任意の既知の野生型ＨＩＶ－１ ５’ＬＴＲ又は３’ＬＴＲ配列と、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物は、長い末端反復、Ｇａｇリーダ配列、Ψパッケージングシグナル、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）、及びＡ３、及びＡ７を含むシス作用エレメントを含む。いくつかの実施形態では、シス作用エレメントは、Ｄ４、Ａ４、及びＡ５をさらに含む。いくつかの実施形態では、構築物は、長い３’末端反復、長い５’末端反復、又はそれらの組み合わせを含む。
【0065】
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶスプライスドナー又はアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む。例えば、１つ以上のＤ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位を欠失させてもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ２及びＤ３スプライスドナー部位並びにＡ１及びＡ２スプライスアクセプター部位は欠失している。
【0066】
特定の実施形態では、構築物は、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、及びＥｎｖのそれぞれを非機能的にする１つ以上の変更をさらに含む。
二量体化開始シグナル
レンチウイルスは二倍体であり、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は対でビリオンにパッケージ化され、ｇＲＮＡを二量体化させることでＲＮＡの２つのコピーのカプシド形成が達成される。このｇＲＮＡ対形成は、ＨＩＶ－１ゲノムのステムループ１（ＳＬ１）内に位置し、コンセンサス配列ＧＣＧＣＧＣを有する、二量体化開始シグナル（ＤＩＳ）と呼ばれる６ヌクレオチドのパリンドロームで開始される。
二量体化開始シグナル
レンチウイルスは二倍体であり、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は対でビリオンにパッケージ化され、ｇＲＮＡを二量体化させることでＲＮＡの２つのコピーのカプシド形成が達成される。このｇＲＮＡ対形成は、ＨＩＶ－１ゲノムのステムループ１（ＳＬ１）内に位置し、コンセンサス配列ＧＣＧＣＧＣを有する、二量体化開始シグナル（ＤＩＳ）と呼ばれる６ヌクレオチドのパリンドロームで開始される。
【0067】
本開示の干渉構築物は、例えば、コンセンサス配列ＧＣＧＣＧＣを有する野生型ＤＩＳを含み得る。他の場合において、本開示の干渉構築物は、単一ヌクレオチド変異を有するＤＩＳを含む（例えば、ＧＣＧＣＧＣ→ＧＣＧＡＧＣ）。ＧＣＧＡＧＣ ＤＩＳにより、ＨＩＶ－１のホモ二量体化が低減される。
【0068】
トランス作用エレメント
本開示の干渉構築物は、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更を含み、ここで、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する。野生型ＨＩＶ－１ゲノムは、３つのクラスのＲＮＡ：スプライシングされていないＲＮＡ；不完全にスプライシングされたＲＮＡ；完全にスプライシングされたＲＮＡを生じる。
本開示の干渉構築物は、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更を含み、ここで、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する。野生型ＨＩＶ－１ゲノムは、３つのクラスのＲＮＡ：スプライシングされていないＲＮＡ；不完全にスプライシングされたＲＮＡ；完全にスプライシングされたＲＮＡを生じる。
【0069】
スプライシングされていないＲＮＡ：スプライシングされていない９ｋｂの一次転写物は、Ｇａｇ及びＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体タンパク質を生成するために発現させるか、ゲノムＲＮＡとして機能するようにビリオンにパッケージ化することができる。不完全にスプライシングされたＲＮＡ。これらのｍＲＮＡは、ＨＩＶ ＲＮＡゲノムの５’末端に最も近いスプライスドナー部位を、ウイルスの中央領域にあるスプライスアクセプターのいずれかと組み合わせて使用する。これらのＲＮＡは、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、及びＴａｔの単一エクソン型を発現する可能性がある。これらのヘテロｍＲＮＡは４～５ｋｂの長さで、ＨＩＶの第２のイントロンを保持する。
【0070】
完全にスプライシングされたＲＮＡ。これらのｍＲＮＡは、ＨＩＶの両方のイントロンをスプライシングし、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、及び２エクソン型のＴａｔを発現する可能性を有する。これらのヘテロｍＲＮＡは、Ｒｅｖタンパク質の発現を要しない。
【0071】
場合によっては、ＨＩＶヌクレオチド配列の変更は、スプライスドナー及び／又はスプライスアクセプターの１つ以上のヌクレオチドの欠失である。例えば、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６４巻、ｐ．２５１９を参照されたい。例えば、場合によっては、変更は、主要な５’スプライスドナーの１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換である。ＨＩＶの５’主要スプライスドナーのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）及びレバー（Ｌｅｖｅｒ）著、１９９２年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ．４１４４を参照されたい。
【0072】
本開示の干渉構築物は、いくつかの実施形態では、ＨＩＶの１つ以上のスプライスドナー及び／又はスプライスアクセプター配列における１つ以上のヌクレオチドの欠失を含み得、その結果、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、及びＶｐｕの１つ以上が産生されない。本開示の干渉構築物は、いくつかの実施形態では、ＨＩＶの１つ以上のスプライスドナー及び／又はスプライスアクセプター配列における１つ以上のヌクレオチドの変異を含み得、その結果、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、及びＶｐｕの１つ以上が産生されない。場合によっては、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、及びＶｐｕのいずれも産生されない。場合によっては、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、及びＴａｔが産生されない。場合によっては、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのいずれも産生されない。場合によっては、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、及びＶｐｕのいずれも産生されない。
【0073】
場合によっては、本開示の干渉構築物は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４から選択されるＨＩＶスプライスドナーにおける１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。場合によっては、本開示の干渉構築物は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、及びＡ７から選択されるＨＩＶスプライスアクセプターにおける１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。例えば、ＨＩＶゲノムにおけるエクソンの位置に対するＨＩＶスプライスドナーＤ１～Ｄ４及びスプライスアクセプターＡ１～Ａ７の組織化について、マンダル（Ｍａｎｄａｌ）ら著（２０１０年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第８４巻、ｐ．１２７９０）の図１を参照されたい。
【0074】
場合によっては、本開示の干渉構築物は、ＨＩＶ主要スプライスドナーにおける１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含み、ここで、主要なスプライスドナー（Ｄ１）を囲む例示的な野生型配列には、
【0075】
【化1】
【0076】
が含まれ、；
ここで、大文字で太字の「Ｇ」は主要なスプライスドナーである。例えば、ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）及びレバー（Ｌｅｖｅｒ）著、１９９２年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ．４１４４の図８を参照されたい。主要なスプライスドナーは、ｇａｇイニシエータＡＴＧの５’のおよそ５０ヌクレオチド（例えば、４５ヌクレオチド～５５ヌクレオチド）である。
ここで、大文字で太字の「Ｇ」は主要なスプライスドナーである。例えば、ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）及びレバー（Ｌｅｖｅｒ）著、１９９２年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６６巻、ｐ．４１４４の図８を参照されたい。主要なスプライスドナーは、ｇａｇイニシエータＡＴＧの５’のおよそ５０ヌクレオチド（例えば、４５ヌクレオチド～５５ヌクレオチド）である。
【0077】
場合によっては、本開示の干渉構築物は、ＨＩＶスプライスドナーＤ２における１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。ＨＩＶスプライスドナーＤ２を囲む例示的なヌクレオチド配列は、５’－ＡＡＧＧＵＧＡＡＧＧＧ－３’（配列番号１５）である。場合によっては、本開示の干渉構築物は、ＨＩＶスプライスドナーＤ３における１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。ＨＩＶスプライスドナーＤ３を囲む例示的なヌクレオチド配列は、５’－ＡＡＧＧＵＡＧＧＵＣＡ－３’（配列番号１６）である。場合によっては、本開示の干渉構築物は、ＨＩＶスプライスドナーＤ４における１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。ＨＩＶスプライスドナーＤ４を囲む例示的なヌクレオチド配列は、５’－ＣＵＡＧＡＣＵＡＧＡＧ－３’（配列番号１７）である。例えば、マンダル（Ｍａｎｄａｌ）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第８４巻、ｐ．１２７９０を参照されたい。ＨＩＶスプライスドナーＤ４を囲む別の例示的なヌクレオチド配列は、５’－ＧＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧ－３’（配列番号１８）である。例えば、カムラー（Ｋａｍｍｌｅｒ）ら著、２００６年、レトロウイルス学（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．）、第３巻、ｐ．８９を参照されたい。
【0078】
場合によっては、本開示の干渉構築物は、ＨＩＶスプライスアクセプター配列における１つ以上のヌクレオチドの欠失又は置換を含む。ＨＩＶスプライスアクセプター配列を囲むヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら著、１９９０年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６４巻、ｐ．２５１９の図７を参照されたい。
【0079】
例えば、配列：
【0080】
【化2】
【0081】
において、大文字で太字の「ＡＧ」は、５’－３’からスプライスアクセプター４Ａ、４Ｂ、５、７Ａ、７Ｂ、及び７を示す。ｒｅｖイニシエータＡＴＧには下線が引かれている。
【0082】
ＨＩＶスプライスアクセプターＡ７を囲む例示的なヌクレオチド配列が、カムラー（Ｋａｍｍｌｅｒ）ら著、２００６年、レトロウイルス学（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．）、第３巻、ｐ．８９の図２Ａに示されている。ＨＩＶスプライスアクセプターＡ５を囲む例示的なヌクレオチド配列が、カムラー（Ｋａｍｍｌｅｒ）ら著、２００６年、レトロウイルス学（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．）、第３巻、ｐ．８９の図４Ａに示されている。ＨＩＶスプライスアクセプターＡ１～Ａ７を囲む例示的なヌクレオチド配列が、カムラー（Ｋａｍｍｌｅｒ）ら著、２００６年、レトロウイルス学（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．）、第３巻、ｐ．８９の図５Ａに示されている。
【0083】
例示的な干渉構築物
干渉構築物の非限定的な例は、図１Ｄ、２Ａ、及び４Ａに模式的に示される。例示的な干渉構築物は、「Ｆ１ｐｏｌ」（配列番号２）、「Ｆ１ｐｏｌスプライス」（配列番号３）；「Ｆ１ｖｐｒ」（配列番号４）；及び「Ｆ１ｖｐｒスプライス」（配列番号５）と呼ばれる。例示的な干渉構築物は、図７Ａ－７Ｅに示される。
干渉構築物の非限定的な例は、図１Ｄ、２Ａ、及び４Ａに模式的に示される。例示的な干渉構築物は、「Ｆ１ｐｏｌ」（配列番号２）、「Ｆ１ｐｏｌスプライス」（配列番号３）；「Ｆ１ｖｐｒ」（配列番号４）；及び「Ｆ１ｖｐｒスプライス」（配列番号５）と呼ばれる。例示的な干渉構築物は、図７Ａ－７Ｅに示される。
【0084】
特定の実施形態では、干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物は、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更を含み、ここで、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する。
【0085】
特定の実施形態では、ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更は、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異を含む。
【0086】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、５８３０～６０４４、５８７２～５８８０、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。
【0087】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含む。
【0088】
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異をさらに含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、５８５０～６３４１、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含む。
【0089】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５６３０及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、５８５０～６０４４、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含む。
【0090】
特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置５８５０～６３４１に対応するヌクレオチドの欠失をさらに含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、構築物は、配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性などの、これらの範囲内の任意のパーセント同一性を含む）を示すヌクレオチド配列を含む。
【0091】
前述の付番は、ＨＩＶ－１ ｐＮＬ４－３株の参照ゲノム配列（配列番号１）に関連しているが、他のＨＩＶ株及び任意のタイプ、サブタイプ（ＨＩＶ－１グループ：Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ及びＨＩＶ－２）、又はクレード（ＨＩＶ－１ Ｍ：Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ、及びＫ；ＨＩＶ－２：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ及びＧ）の分離株もまた、本発明に包含されることが意図されていることを理解されたい。
【0092】
特定の実施形態では、構築物は、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列における欠失、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の欠失、ＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の欠失、若しくはＨＩＶ Ｇａｇをコードするヌクレオチド配列の欠失、又はそれらの組み合わせを含む。
【0093】
干渉粒子
本開示は、干渉構築物を含む粒子をさらに含む。このような粒子は、本明細書において「干渉粒子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」と呼ばれる。干渉粒子は、宿主細胞に感染及び侵入することができる。
本開示は、干渉構築物を含む粒子をさらに含む。このような粒子は、本明細書において「干渉粒子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」と呼ばれる。干渉粒子は、宿主細胞に感染及び侵入することができる。
【0094】
本開示の干渉粒子は、場合によっては、ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１２０及びｇｐ４１）を含むであろう。他の場合には、本開示の干渉粒子は、非ＨＩＶエンベロープタンパク質を含み、すなわち、干渉構築物はシュードタイプ化される。
【0095】
本開示の干渉粒子は、場合によっては、ＨＩＶエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１２０及びｇｐ４１）を含み、その結果、パッケージ化された干渉粒子は、野生型ＨＩＶで使用されるのと同じ受容体（ＣＣＲ５）を介して細胞に感染する。ＣＣＲ５は、主にＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞及びミクログリアに発現される。したがって、いくつかの実施形態では、対象干渉粒子は、主にＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びミクログリアに感染する。
【0096】
シュードタイプ化干渉構築物
上記のように、場合によっては、対象干渉構築物がシュードタイプ化される。例えば、場合によっては、対象干渉構築物がＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化される。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レトロウイルスは、広範な宿主範囲（汎親和性）を示し、狭宿主性及び広宿主性のレトロウイルスによる感染に耐性のある細胞に効率的に感染することができる。（イー（Ｙｅｅ）ら著、２００４年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、ｐ．９５６４～９５６８））。ＶＳＶ－Ｇの任意の好適な血清型（例えば、インディアナ、ニュージャージー、チャンディプラ、パイリー）及び株（例えば、ＶＳＶインディアナ、サンファン）を使用できる。安定的なＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レトロウイルスパッケージング細胞株は、大規模なウイルス調製物（例えば、１０～５０リットルの上清）の生成を可能にし、１ｍｌあたり１０７～１０１１レトロウイルス粒子の範囲のレトロウイルスストックを生成する。
上記のように、場合によっては、対象干渉構築物がシュードタイプ化される。例えば、場合によっては、対象干渉構築物がＶＳＶ－Ｇでシュードタイプ化される。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レトロウイルスは、広範な宿主範囲（汎親和性）を示し、狭宿主性及び広宿主性のレトロウイルスによる感染に耐性のある細胞に効率的に感染することができる。（イー（Ｙｅｅ）ら著、２００４年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻、ｐ．９５６４～９５６８））。ＶＳＶ－Ｇの任意の好適な血清型（例えば、インディアナ、ニュージャージー、チャンディプラ、パイリー）及び株（例えば、ＶＳＶインディアナ、サンファン）を使用できる。安定的なＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レトロウイルスパッケージング細胞株は、大規模なウイルス調製物（例えば、１０～５０リットルの上清）の生成を可能にし、１ｍｌあたり１０７～１０１１レトロウイルス粒子の範囲のレトロウイルスストックを生成する。
【0097】
いくつかの実施形態では、本開示の干渉構築物は、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化される。例えば、米国特許第８，１８７，８７２号明細書を参照されたい。
【0098】
細胞株
任意の好適な細胞株を使用して、対象干渉構築物をパッケージングして、干渉構築物を含む感染性粒子（「干渉粒子」）を生成するために使用するパッケージング細胞を調製することができる。一般的に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用できる好適なヒト細胞株には、例えば、２９３細胞が含まれる（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら著、１９７７年、ジャーナル・オブ・ジェネラルバイロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、第３６巻、ｐ．５９～７２、ｔｓａ ２０１細胞（ハインツェル（Ｈｅｉｎｚｅｌ）ら著、１９８８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６２巻、ｐ．３７３８）、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）））。本発明における使用のための他の好適なパッケージング細胞株には、Ｐｓｉ－２細胞（マン（Ｍａｎｎ）ら著、１９８３年、セル（Ｃｅｌｌ）、第３３巻、ｐ．１５３～１５９；ＦＬＹ（コゼット（Ｃｏｓｓｅｔｔ）ら著、１９９３年、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）、第１９３巻、ｐ．３８５～３９５；ＢＯＳＣ ２３細胞（ペア（Ｐｅａｒ）ら著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９０巻、ｐ．８３９２～８３９６；ＰＡ３１７細胞（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、１９８６年、分子細胞生物学（Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．２８９５～２９０２；Ｋａｔ細胞株（フィナー（Ｆｉｎｅｒ）ら著、１９９４年、血液（Ｂｌｏｏｄ）、第８３巻、ｐ．４３～５０；ＧＰ＋Ｅ細胞及びＧＰ＋ＥＭ１２細胞（マーコビッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ）ら著、１９８８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６２巻、ｐ．１１２０～１１２４、及びＰｓｉ Ｃｒｉｐ及びＰｓｉ Ｃｒｅ細胞（米国特許第５，４４９，６１４号明細書；ダノス・Ｏ（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．）及びマリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら著、１９８８年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第８５巻、ｐ．６４６０～６４６４）などの、他のヒト細胞株由来（例えば、胚性細胞株由来）のパッケージング細胞株及びマウス細胞株由来のパッケージング細胞株が含まれる。パッケージング細胞株は、汎親和性、広宿主性、又は狭宿主性の宿主範囲を有するレトロウイルス粒子を産生することができる。例示的なパッケージング細胞株は、分裂細胞及び非分裂細胞に感染することができるレンチウイルス粒子（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２及びＳＩＶ）などのレトロウイルス粒子を産生する。
任意の好適な細胞株を使用して、対象干渉構築物をパッケージングして、干渉構築物を含む感染性粒子（「干渉粒子」）を生成するために使用するパッケージング細胞を調製することができる。一般的に、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用できる好適なヒト細胞株には、例えば、２９３細胞が含まれる（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら著、１９７７年、ジャーナル・オブ・ジェネラルバイロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、第３６巻、ｐ．５９～７２、ｔｓａ ２０１細胞（ハインツェル（Ｈｅｉｎｚｅｌ）ら著、１９８８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６２巻、ｐ．３７３８）、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）））。本発明における使用のための他の好適なパッケージング細胞株には、Ｐｓｉ－２細胞（マン（Ｍａｎｎ）ら著、１９８３年、セル（Ｃｅｌｌ）、第３３巻、ｐ．１５３～１５９；ＦＬＹ（コゼット（Ｃｏｓｓｅｔｔ）ら著、１９９３年、バイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）、第１９３巻、ｐ．３８５～３９５；ＢＯＳＣ ２３細胞（ペア（Ｐｅａｒ）ら著、１９９３年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９０巻、ｐ．８３９２～８３９６；ＰＡ３１７細胞（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、１９８６年、分子細胞生物学（Ｍｏｌｅｃ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第６巻、ｐ．２８９５～２９０２；Ｋａｔ細胞株（フィナー（Ｆｉｎｅｒ）ら著、１９９４年、血液（Ｂｌｏｏｄ）、第８３巻、ｐ．４３～５０；ＧＰ＋Ｅ細胞及びＧＰ＋ＥＭ１２細胞（マーコビッツ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ）ら著、１９８８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６２巻、ｐ．１１２０～１１２４、及びＰｓｉ Ｃｒｉｐ及びＰｓｉ Ｃｒｅ細胞（米国特許第５，４４９，６１４号明細書；ダノス・Ｏ（Ｄａｎｏｓ，Ｏ．）及びマリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら著、１９８８年、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第８５巻、ｐ．６４６０～６４６４）などの、他のヒト細胞株由来（例えば、胚性細胞株由来）のパッケージング細胞株及びマウス細胞株由来のパッケージング細胞株が含まれる。パッケージング細胞株は、汎親和性、広宿主性、又は狭宿主性の宿主範囲を有するレトロウイルス粒子を産生することができる。例示的なパッケージング細胞株は、分裂細胞及び非分裂細胞に感染することができるレンチウイルス粒子（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２及びＳＩＶ）などのレトロウイルス粒子を産生する。
【0099】
組成物
本開示は、対象干渉構築物又は対象干渉粒子を含む、医薬組成物及び生物学的組成物を含む、組成物を提供する。簡単にするために、対象干渉構築物及び対象干渉粒子は、以下、集合的に「活性剤」と呼ばれる。
本開示は、対象干渉構築物又は対象干渉粒子を含む、医薬組成物及び生物学的組成物を含む、組成物を提供する。簡単にするために、対象干渉構築物及び対象干渉粒子は、以下、集合的に「活性剤」と呼ばれる。
【0100】
本開示は、対象干渉構築物又は対象干渉粒子を含む組成物を提供する。対象干渉構築物組成物又は対象干渉粒子組成物は、対象干渉構築物又は対象干渉粒子に加えて、塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０などの非イオン性洗剤；ヌクレアーゼ阻害剤；グリセロール；などの１つ以上を含み得る。
【0101】
医薬組成物
活性剤は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される。多種多様な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で既知であり、本明細書で詳述される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．ジェンナーロ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、２０００年、「レミントン：薬局の科学とプラクティス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２０版、リッピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）著、医薬剤形及び薬剤送達システム（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９９年、Ｈ．Ｃ．アンセル（Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ）ら著、第７版、リッピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）著、及び医薬賦形剤ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）、２０００年、Ａ．Ｈ．キッブ（Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ）ら編、第３版、アメリカ薬学協会（Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．）を含む、様々な刊行物に十分に記載されている。製剤の次の説明に関して、「活性剤」は、上述される活性剤、及び任意選択により１つ以上のさらなる治療剤を含む。
活性剤は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される。多種多様な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で既知であり、本明細書で詳述される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．ジェンナーロ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、２０００年、「レミントン：薬局の科学とプラクティス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２０版、リッピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）著、医薬剤形及び薬剤送達システム（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９９年、Ｈ．Ｃ．アンセル（Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ）ら著、第７版、リッピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）著、及び医薬賦形剤ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）、２０００年、Ａ．Ｈ．キッブ（Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ）ら編、第３版、アメリカ薬学協会（Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．）を含む、様々な刊行物に十分に記載されている。製剤の次の説明に関して、「活性剤」は、上述される活性剤、及び任意選択により１つ以上のさらなる治療剤を含む。
【0102】
対象方法において、活性剤は、宿主に、所望の程度の免疫不全ウイルス転写の低減をもたらすことが可能な、任意の好都合な手段を使用して投与され得る。したがって、活性剤は、治療的投与のために多様な製剤中に組み込むことができる。例えば、活性剤は、適切な、薬学的に許容される担体又は希釈剤との組み合わせによって、薬学的組成物へと製剤化することができ、また錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入剤、及びエアロゾルなどの固体、半固体、液体、又は気体形態で、調製物へと製剤化されてもよい。例示的な実施形態では、活性剤は、ゲルとして、溶液として、又は膣内投与に好適な何らかの他の形態で製剤化される。さらに例示的な実施形態では、活性剤は、ゲルとして、溶液として、又は直腸（例えば、直腸内）投与に好適な何らかの他の形態で製剤化される。
【0103】
薬学的剤形において、活性剤は、その薬学的に許容される塩の形態で投与され得るか、又はそれはまた、単独で、若しくは適切な会合で、並びに他の薬学的に活性化合物と組み合わせて使用されてもよい。次の方法及び賦形剤は、例示的なものにすぎず、決して限定的ではない。
【0104】
いくつかの実施形態では、活性は、水性緩衝液中で製剤化される。好適な水性緩衝液には、約５ｍＭ～約１００ｍＭまでの様々な強度の、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、水性緩衝液は、等張性溶液を提供する試薬を含む。そのような試薬は、塩化ナトリウム、及び糖、例えば、マンニトール、デキストロース、スクロースなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、水性緩衝液は、ポリソルベート２０又は８０などの非イオン性界面活性剤をさらに含む。任意選択により、製剤は、防腐剤をさらに含んでもよい。好適な防腐剤には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなどが含まれるが、これらに限定されない。多くの場合、製剤は、約４℃で保管される。製剤はまた、凍結乾燥されてもよく、その場合それらは、一般的に、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトールなどの凍結保護物質を含む。凍結乾燥製剤は、長期間にわたって、周囲温度であってさえ、保管することができる。
【0105】
経口調製物について、活性剤は、単独で、又は錠剤、粉末、顆粒、若しくはカプセルを作製するための適切な添加剤と、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、若しくはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤と；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、若しくはゼラチンなどの結合剤と；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と；並びに所望される場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤及び香味剤と組み合わせて、使用することができる。
【0106】
活性剤は、注射のために、それらを、植物油若しくは他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸若しくはプロピレングリコールのエステルなどの水性又は非水性溶媒中に溶解、懸濁、又は乳化させることによって、並びに所望される場合、可溶化剤、張性薬剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、及び防腐剤などの従来の添加剤と共に、調製物へと製剤化することができる。
【0107】
活性剤は、吸入を介して投与されるべきエアロゾル製剤で利用することができる。活性剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤へと製剤化することができる。
【0108】
さらに、活性剤は、乳化基剤又は水溶性基剤などの多様な基剤と混合することによって、坐剤へと作製することができる。活性剤は、坐剤を介して直腸投与することができる。坐剤は、体温で融解するが、室温では固体化される、ココアバター、カルボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含む可能性がある。
【0109】
シロップ、エリキシル、及び懸濁液などの、経口又は直腸投与のための単位剤形が提供されてもよく、各投与量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤、又は坐剤は、１つ以上の活性剤を含有する既定量の組成物を含有する。同様に、注射又は静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、又は別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中に、活性剤を含んでもよい。
【0110】
シロップ、エリキシル、ゲル、及び懸濁液などの、膣内又は直腸内投与のための単位剤形が提供されてもよく、ここで各投与量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤、単位ゲル体積、又は坐剤は、１つ以上の活性剤を含有する既定量の組成物を含有する。
【0111】
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位用量として好適な、物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルとの関連で、所望の効果をもたらすのに十分な量に算出された既定量の活性剤を含有する。所与の活性剤のための明細は、一部には、用いられる特定の化合物及び達成されるべき効果、及び宿主における各化合物に関連する薬力学に依存するであろう。他の投与様式もまた、対象発明と共に使用されるであろう。例えば、活性剤は、坐剤、並びに場合によっては、エアロゾル及び鼻腔内組成物に製剤化することができる。坐剤について、ビヒクル組成物は、ポリアルキレングリコール、又はトリグリセリドなどの、伝統的な結合剤及び担体を含むであろう。そのような坐剤は、約０．５％～約１０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％～約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成されてもよい。
【0112】
活性剤は、注射物質として投与することができる。典型的には、注射用組成物は、液体溶液又は懸濁液として調製されるが、注射前の液体ビヒクル中の溶液、又はその中の懸濁液に好適な固体形態がまた調製されてもよい。調製物はまた、乳化されてもよく、又はリポソームビヒクル中にカプセル封入された活性成分であってもよい。
【0113】
活性剤は、いくつかの実施形態では、膣送達のために製剤化されるであろう。膣内投与のための対象製剤は、膣内生体付着性錠剤、膣内生体付着性微粒子、膣内クリーム、膣内ローション、膣内泡状物質、膣内軟膏、膣内ペースト、膣内溶液、又は膣内ゲルとして製剤化される活性剤を含む。
【0114】
活性剤は、いくつかの実施形態では、直腸送達のために製剤化されるであろう。直腸内投与のための対象製剤は、直腸内生体付着性錠剤、直腸内生体付着性微粒子、直腸内クリーム、直腸内ローション、直腸内泡状物質、直腸内軟膏、直腸内ペースト、直腸内溶液、又は直腸内ゲルとして製剤化される活性剤を含む。活性剤を含む対象製剤は、賦形剤（例えば、スクロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、又は炭酸カルシウム）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアガム、ポリ（エチレングリコール）、スクロース、又はデンプン）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、又はクエン酸カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、又はラウリル硫酸ナトリウム）、香味剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、又はオレンジ粉末）、防腐剤（例えば、安息香酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、又はプロピルパラベン）、安定剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、又は酢酸）、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はステアリン酸アルミニウム）、分散剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、希釈剤（例えば、水）、及びベースワックス（例えば、ココアバター、白色ワセリン、又はポリエチレングリコール）のうちの１つ以上を含む。
【0115】
活性剤を含む錠剤は、好適な薄膜形成剤、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はエチルセルロースでコーティングされてもよく、それに対する好適な賦形剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ジエチルフタレート、又はグリセロール三酢酸塩などの軟化剤；スクロース、ソルビトール、キシリトール、グルコース、又はラクトースなどの充填剤；水酸化チタンなどの着色剤などが、任意選択により添加されてもよい。
【0116】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。さらに、所望される場合、ビヒクルは、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤などの少量の補助材料を含有してもよい。そのような剤形を調製する実際の方法は、既知であるか、又は当業者に明らかとなろう。例えば、レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン、第１７版、１９８５年を参照されたい。投与されるべき組成物又は製剤は、いずれにせよ、処置されている対象における所望の状態を達成するのに十分な薬剤の量を含有するであろう。薬学的に許容される賦形剤などのビヒクル、アジュバント、担体又は希釈剤は、公衆にとって容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤薬剤などの薬学的に許容される補助材料は、公衆にとって容易に入手可能である。
【0117】
生物学的組成物
本開示は、ａ）対象干渉構築物又は対象干渉粒子；及びｂ）体液、を含む生物学的組成物を提供する。好適な体液には、例えば、血液又は血液画分が含まれる。血液画分には、例えば、血清及び血漿が含まれる。場合によっては、体液は個体から分離されている。場合によっては、体液は、１つ以上の処理ステップ、例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶなどの病原体の除去に供されている。
本開示は、ａ）対象干渉構築物又は対象干渉粒子；及びｂ）体液、を含む生物学的組成物を提供する。好適な体液には、例えば、血液又は血液画分が含まれる。血液画分には、例えば、血清及び血漿が含まれる。場合によっては、体液は個体から分離されている。場合によっては、体液は、１つ以上の処理ステップ、例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶなどの病原体の除去に供されている。
【0118】
処置及び予防方法
本開示は、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法を提供する。この方法は、一般的に、有効量の対象干渉構築物、対象干渉構築物を含む医薬製剤、対象干渉粒子、又は対象干渉粒子を含む医薬製剤を個体に投与することを含む。
本開示は、個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法を提供する。この方法は、一般的に、有効量の対象干渉構築物、対象干渉構築物を含む医薬製剤、対象干渉粒子、又は対象干渉粒子を含む医薬製剤を個体に投与することを含む。
【0119】
場合によっては、対象方法は、有効量の対象干渉粒子、又は対象干渉粒子を含む製剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。場合によっては、対象干渉粒子の有効量は、個体に、１回以上の用量で、単剤療法又は組み合わせ療法において投与されるとき、個体における免疫不全ウイルス量を、干渉粒子での処置の不在下での個体における免疫不全ウイルス量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は８０％を超えて低減するのに有効である量である。
【0120】
場合によっては、対象方法は、有効量の対象干渉粒子を、それを必要とする個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象干渉粒子の「有効量」は、個体に、１回以上の用量で、単剤療法又は組み合わせ療法において投与されるとき、個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、干渉粒子での処置の不在下での個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は１０倍を超えて増加させるのに有効である量である。
【0121】
多様な方法のいずれかを使用して、処置法が有効であるかどうかを決定することができる。例えば、本発明の方法が、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ウイルス量を低減すること、及び／又は免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を処置することにおいて有効であるかどうかを決定する方法は、ウイルス量を、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）ポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えば、生物学的試料中の免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の量を測定することによって測定すること；免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）によってコードされるポリペプチド、例えば、ｐ２４、ｇｐ１２０、逆転写酵素を、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的アッセイを使用して検出及び／又は測定すること、及び個体におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を測定することを含むが、これらに限定されない、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症の兆候についての任意の既知の試験である。
【0122】
製剤、投与量、及び投与経路
宿主に導入する前に、干渉構築物又は干渉粒子は、治療的及び予防的処置方法における使用のための様々な組成物に製剤化することができる。特に、干渉構築物又は干渉粒子は、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物を作製することができ、ヒト用又は動物用のいずれかに適切であるように製剤化することができる。簡単にするために、対象干渉構築物及び対象干渉粒子は、以下、集合的に「活性剤」又は「有効成分」と呼ばれる。
宿主に導入する前に、干渉構築物又は干渉粒子は、治療的及び予防的処置方法における使用のための様々な組成物に製剤化することができる。特に、干渉構築物又は干渉粒子は、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物を作製することができ、ヒト用又は動物用のいずれかに適切であるように製剤化することができる。簡単にするために、対象干渉構築物及び対象干渉粒子は、以下、集合的に「活性剤」又は「有効成分」と呼ばれる。
【0123】
したがって、対象処置方法における使用のための組成物は、例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせて、対象干渉構築物又は対象干渉粒子を含み得る。好適な投与方法と同様に、薬学的に許容される担体は当業者に周知である。担体の選択は、部分的には、特定のベクターによって、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されるであろう。当業者はまた、組成物を投与する様々な経路が利用可能であり、投与に複数の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも迅速且つより効果的な反応を提供できることを理解するであろう。したがって、対象干渉構築物組成物又は対象干渉粒子組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。
【0124】
対象干渉構築物又は対象干渉粒子の組成物は、単独で、又は他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、非経口投与に好適な製剤を作製することができる。このような製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を目的のレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性滅菌注射液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含み得る。製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数回用量の密封容器で提供でき、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保管でき、使用直前に注射用の滅菌液体担体（例えば、水）の添加のみを要する。注射可能な溶液及び懸濁液は、本明細書に記載されるように、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【0125】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、又はフルーツジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の対象干渉構築物又は対象干渉粒子などの液体溶液；それぞれが所定量の活性剤（対象干渉構築物又は対象干渉粒子）を固体又は顆粒として含むカプセル、小袋又は錠剤；水性液体中の溶液又は懸濁液；及び水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョンであり得る。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、香味剤、及び薬理学的に適合性のある担体のうちの１つ以上を含み得る。
【0126】
吸入による投与に好適なエアロゾル製剤も作製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に入れることができる。
【0127】
同様に、経口投与に好適な製剤は、フレーバの有効成分、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントを含み得るロゼンジ形態；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアなどの不活性ベース中に有効成分（対象干渉構築物又は対象干渉粒子）を含むトローチ；及び好適な液体担体中に活性剤を含むマウスウォッシュ；並びに活性剤に加えて、当技術分野で公知の担体を含むクリーム、エマルジョン、ゲルなどを含み得る。
【0128】
局所適用に好適な製剤は、クリーム、軟膏、又はローションの形態であり得る。
直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバター又はサリチル酸塩を含む、好適な基剤を有する坐剤として提示することができる。膣内投与に好適な製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適切であることが知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム（ｆｏａｍ）、又はスプレー製剤として提示することができる。同様に、有効成分は、コンドームのコーティングとして潤滑剤と組み合わせることができる。
直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバター又はサリチル酸塩を含む、好適な基剤を有する坐剤として提示することができる。膣内投与に好適な製剤は、有効成分に加えて、当技術分野で適切であることが知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム（ｆｏａｍ）、又はスプレー製剤として提示することができる。同様に、有効成分は、コンドームのコーティングとして潤滑剤と組み合わせることができる。
【0129】
本発明の文脈において動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたって感染した個体に治療的応答をもたらすのに十分でなければならない。用量は、処置に利用される特定の干渉構築物又は干渉粒子の効力、病状の重症度、並びに感染個体の体重及び年齢によって決定される。用量のサイズは、使用される特定の干渉構築物又は干渉粒子の使用に伴い得る有害な副作用の存在によっても決定される。可能な限り、有害な副作用を最小限に抑えることが常に望ましい。
【0130】
投与量は、錠剤、カプセル、液体製剤の単位体積などの単位剤形であり得る。本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投与量として好適な、物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルとの関連で、所望の効果をもたらすのに十分な量に算出された既定量の干渉構築物又は干渉粒子を、単独で又は他の抗ウイルス剤と組み合わせて含有する。本開示の単位剤形の仕様は、使用される特定の構築物又は粒子、及び達成される効果、並びに宿主中の各構築物又は粒子に関連する薬力学に依存する。投与される用量は、「抗ウイルス有効量」又は個々の患者において「有効レベル」を達成するために必要な量であり得る。
【0131】
一般的に、投与された構築物又は粒子の組織濃度を１日あたり約５０ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ体重にするのに十分な対象干渉構築物又は対象干渉粒子の量を投与することができ、例えば、１日あたり約１００ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。特定の用途、例えば、局所、眼又は膣用途では、複数の１日用量を投与することができる。さらに、投与回数は、送達の手段及び投与される特定の干渉構築物又は干渉粒子に応じて変化するであろう。
【0132】
組み合わせ療法
いくつかの実施形態では、対象干渉構築物又は干渉粒子（又はそれを含む組成物）は、１つ以上の追加の治療剤との組み合わせ療法で投与される。好適なさらなる治療剤には、免疫不全ウイルスの１つ以上の機能を阻害する薬剤、免疫不全ウイルス感染症の症状を治療する又は寛解させる薬剤、免疫不全ウイルス感染症に続発して生じ得る感染症を治療する薬剤などが含まれる。
いくつかの実施形態では、対象干渉構築物又は干渉粒子（又はそれを含む組成物）は、１つ以上の追加の治療剤との組み合わせ療法で投与される。好適なさらなる治療剤には、免疫不全ウイルスの１つ以上の機能を阻害する薬剤、免疫不全ウイルス感染症の症状を治療する又は寛解させる薬剤、免疫不全ウイルス感染症に続発して生じ得る感染症を治療する薬剤などが含まれる。
【0133】
治療剤には、例えば、ベータ－ラクタム抗生物質、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、グラミシジン、バシトラシン、スルホンアミド、ニトロフラゾン、ナリジクス酸、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、インドメタシン、スリンダク、アシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）、抗受容体抗体（例えば、ライノウイルスに対する）、ネビラピン、シドホビル（ビスタイド（Ｖｉｓｔｉｄｅ）（商標））、ホスホノギ酸三ナトリウム（ホスカルネット（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（商標））、ファムシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、核酸／複製阻害剤、インターフェロン、ジドブジン（ＡＺＴ、レトロビル（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）（商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン、ｄｄＩ、ヴァイデックス（Ｖｉｄｅｘ）（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ、ゼリット（Ｚｅｒｉｔ）（商標））、ザルシタビン（ジデオキシシトシン、ｄｄＣ、ハイビッド（Ｈｉｖｉｄ）（商標））、ネビラピン（ビラミューン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）（商標））、ラミブジン（エピビル（Ｅｐｉｖｉｒ）（商標）、３ＴＣ）、プロテアーゼ阻害剤、サクイナビル（インビラーゼ（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）（商標）、フォートベイス（Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ）（商標））、リトナビル（ノービア（Ｎｏｒｖｉｒ）（商標））、ネルフィナビル（ビラセプト（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）（商標））、エファビレンツ（サスティバ（Ｓｕｓｔｉｖａ）（商標））、アバカビル（ザイアジェン（Ｚｉａｇｅｎ）（商標））、アンプレナビル（アゲネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）（商標））インジナビル（クリキシバン（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）（商標））、ガンシクロビル、ＡｚＤＵ、デラビルジン（レスクリプター（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）（商標））、カレトラ（Ｋａｌｅｔｒａ）、トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、リファンピン、クラシロマイシン（ｃｌａｔｈｉｒｏｍｙｃｉｎ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド阻害剤、アドリアマイシン、フルオロウラシル、メトトレキセート、アスパラギナーゼ、及びそれらの組み合わせが含まれる。抗ＨＩＶ薬剤は、１つ以上のＨＩＶタンパク質の機能を特異的に標的とする、前述の一覧のものである。
【0134】
いくつかの実施形態では、対象活性剤は、２つ以上の抗ＨＩＶ薬剤との組み合わせ療法で投与される。例えば、対象活性剤は、１、２、又は３つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、コンビビル（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）、エピビル（Ｅｐｉｖｉｒ）、ハイビッド（Ｈｉｖｉｄ）、レトロビル（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、ヴァイデックス（Ｖｉｄｅｘ）、ゼリット（Ｚｅｒｉｔ）、ザイアジェン（Ｚｉａｇｅｎ）など）との組み合わせ療法で投与することができる。対象活性剤は、１つ又は２つの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、レスクリプター（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、サスティバ（Ｓｕｓｔｉｖａ）、ビラミューン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）など）との組み合わせ療法で投与することができる。対象活性剤は、１つ又は２つのプロテアーゼ阻害剤（例えば、アゲネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、クリキシバン（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、フォートベイス（Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ）、インビラーゼ（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、カレトラ（Ｋａｌｅｔｒａ）、ノービア（Ｎｏｒｖｉｒ）、ビラセプト（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）など）との組み合わせ療法で投与することができる。対象活性剤は、プロテアーゼ阻害剤及びヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との組み合わせ療法で投与することができる。対象活性剤は、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との組み合わせ療法で投与することができる。対象活性剤は、プロテアーゼ阻害剤及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤との組み合わせ療法で投与することができる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のうちの１つ以上との対象活性剤の他の組み合わせが企図される。
【0135】
いくつかの実施形態では、対象処置方法は、ａ）対象活性剤；並びにｂ）ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する薬剤を投与することを含む。
【0136】
いくつかの実施形態では、対象処置方法は、ａ）対象活性剤；並びにｂ）ＨＩＶ阻害剤（ここで好適なＨＩＶ阻害剤には、１つ以上のヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、ケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）阻害剤、及びヒドロキシ尿素が含まれるが、これらに限定されない）を投与することを含む。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤には、アバカビル（ＡＢＣ、ザイアジェン（ＺＩＡＧＥＮ）（商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ヴァイデックス（ＶＩＤＥＸ）（商標））、ラミブジン（３ＴＣ、エピビル（ＥＰＩＶＩＲ）（商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ、ゼリット（ＺＥＲＩＴ）（商標）、ゼリット ＸＲ（ＺＥＲＩＴ ＸＲ）（商標））、ザルシタビン（ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、ハイビッド（ＨＩＶＩＤ）（商標））、ジドブジン（ＺＤＶ、かつてはアジドチミジン（ＡＺＴ）として知られた、レトロビル（ＲＥＴＲＯＶＩＲ）（商標））、アバカビル、ジドブジン、及びラミブジン（トリジビル（ＴＲＩＺＩＶＩＲ）（商標））、ジドブジン及びラミブジン（コンビビル（ＣＯＭＢＩＶＩＲ）（商標））、及びエムトリシタビン（エムトリバ（ＥＭＴＲＩＶＡ）（商標））が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤は、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩（ビリアード（ＶＩＲＥＡＤ）（商標））を含む。ＨＩＶのための非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤には、ネビラピン（ビラミューン（ＶＩＲＡＭＵＮＥ）（商標））、メシル酸デラビルジン（レスクリプター（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ）（商標））、及びエファビレンツ（サスティバ（ＳＵＳＴＩＶＡ）（商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0137】
ＨＩＶ感染症を治療するためのプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）には、アンプレナビル（アゲネラーゼ（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ）（商標））、メシル酸サキナビル（フォートベイス（ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ）（商標）、インビラーゼ（ＩＮＶＩＲＡＳＥ）（商標））、リトナビル（ノービア（ＮＯＲＶＩＲ）（商標））、硫酸インジナビル（クリキシバン（ＣＲＩＸＩＶＡＮ）（商標））、メシル酸ネルフマビル（ｎｅｌｆｍａｖｉｒ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（ビラセプト（ＶＩＲＡＣＥＰＴ）（商標））、ロピナビル及びリトナビル（カレトラ（ＫＡＬＥＴＲＡ）（商標））、アタザナビル（レヤタズ（ＲＥＹＡＴＡＺ）（商標））、並びにホスアンプレナビル（レキシバ（ＬＥＸＩＶＡ）（商標））が含まれる。融合阻害剤は、ウイルスと細胞との間の融合が生じるのを予防し、したがって、ＨＩＶ感染症及び分裂増殖を予防する。融合阻害剤には、エンフビルチド（フゼオン（ＦＵＺＥＯＮ）（商標））、ラレザリ（Ｌａｌｅｚａｒｉ）ら著、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．）、第３４８巻、ｐ．２１７５～２１８５、２００３年、及びマラビロク（シーエルセントリ（ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ）（商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））が含まれるが、これらに限定されない。
【0138】
インテグラーゼ阻害剤は、インテグラーゼの作用を遮断して、ＨＩＶ－１遺伝物質が宿主ＤＮＡ中に組み込まれるのを予防し、それによってウイルス複製を停止する。インテグラーゼ阻害剤には、ラルテグラビル（アイセントレス（ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ）（商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ））、及びエルビテグラビル（ＧＳ ９１３７、ギリアド・サイエンシズ（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））が含まれるが、これらに限定されない。
【0139】
成熟阻害剤には、例えば、ベビリマット（３β－（３－カルボキシ－３－メチル－ブタノイルオキシ）ｌｕｐ－２０（２９）－エン－２８－オイック酸）、及びビベコン（Ｖｉｖｅｃｏｎ）（ＭＰＣ９０５５）が含まれる。
【0140】
いくつかの実施形態では、対象処置方法は、ａ）対象活性剤；並びにｂ）（１）アンプレナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、リトナビル、ネルフィナビル、サクイナビル、チプラナビル、ブレカナビル、ダルナビル、ＴＭＣ－１２６、ＴＭＣ－１１４、モゼナビル（ＤＭＰ－４５０）、ＪＥ－２１４７（ＡＧ１７７６）、Ｌ－７５６４２３、ＲＯ０３３４６４９、ＫＮＩ－２７２、ＤＰＣ－６８１、ＤＰＣ－６８４、ＧＷ６４０３８５Ｘ、ＤＧ１７、ＰＰＬ－１００、ＤＧ３５、及びＡＧ １８５９から選択されるＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、（２）カプラビリン、エミビリン（ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ）、デラビリジン（ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）、エファビレンツ、ネビラピン、（＋）カラノリドＡ、エトラビリン、ＧＷ５６３４、ＤＰＣ－０８３、ＤＰＣ－９６１、ＤＰＣ－９６３、ＭＩＶ－１５０、及びＴＭＣ－１２０、ＴＭＣ－２７８（リルピビリン（ｒｉｌｐｉｖｉｒｅｎｅ））、エファビレンツ、ＢＩＬＲ ３５５ ＢＳ、ＶＲＸ ８４０７７３、ＵＫ－４５３０６１、及びＲＤＥＡ８０６から選択される逆転写酵素のＨＩＶ非ヌクレオシド阻害剤、（３）ジドブジン、エムトリシタビン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミブジン、アバカビル、アムドキソビル、エルブシタビン（ｅｌｖｕｃｉｔａｂｉｎｅ）、アロブジン、ＭＩＶ－２１０、ラシビル、Ｄ－ｄ４ＦＣ、エムトリシタビン、ホスファジド（ｐｈｏｓｐｈａｚｉｄｅ）、フォジブジンチドキシル（ｆｏｚｉｖｕｄｉｎｅ ｔｉｄｏｘｉｌ）、アプリシチビン（ａｐｒｉｃｉｔｉｂｉｎｅ）（ＡＶＸ７５４）、アムドキソビル、ＫＰ－１４６１、及びフォサルブジンチドキシル（ｆｏｓａｌｖｕｄｉｎｅ ｔｉｄｏｘｉｌ）（かつてはＨＤＰ ９９．０００３）から選択される逆転写酵素のＨＩＶヌクレオシド阻害剤、（４）テノホビル及びアデホビルから選択される逆転写酵素のＨＩＶヌクレオチド阻害剤、（５）クルクミン、クルクミンの誘導体、チコリ酸、チコリ酸の誘導体、３，５－ジカフェオイルキナ酸、３，５－ジカフェオイルキナ酸の誘導体、アウリントリカルボン酸、アウリントリカルボン酸の誘導体、コーヒー酸フェネチルエステル、コーヒー酸フェネチルエステルの誘導体、チルホスチン、チルホスチンの誘導体、ケルセチン、ケルセチンの誘導体、Ｓ－１３６０、ジンテビル（ｚｉｎｔｅｖｉｒ）（ＡＲ－１７７）、Ｌ－８７０８１２、及びＬ－８７０８１０、ＭＫ－０５１８（ラルテグラビル）、ＢＭＳ－５３８１５８、ＧＳＫ３６４７３５Ｃ、ＢＭＳ－７０７０３５、ＭＫ－２０４８、及びＢＡ ０１１から選択されるＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、（６）エンフビルチド、スフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＦＢ００６Ｍ、及びＴＲＩ－１１４４から選択されるｇｐ４１阻害剤、（７）ＡＭＤ－０７０などのＣＸＣＲ４阻害剤、（８）ＳＰ０１Ａなどの侵入阻害剤、（９）ＢＭＳ－４８８０４３及び／又はブロックエイド（ＢｌｏｃｋＡｉｄｅ）／ＣＲなどのｇｐ１２０阻害剤、（１０）イムニチン（ｉｍｍｕｎｉｔｉｎ）などのＧ６ＰＤ及びＮＡＤＨ－オキシダーゼ阻害剤、（１１）アプラビロク、ビクリビロク、マラビロク、ＰＲＯ－１４０、ＩＮＣＢ１５０５０、ＰＦ－２３２７９８（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））、及びＣＣＲ５ ｍＡｂ００４からなる群から選択されるＣＣＲ５阻害剤、（１２）ＢＡＳ－１００、ＳＰＩ－４５２、ＲＥＰ ９、ＳＰ－０１Ａ、ＴＮＸ－３５５、ＤＥＳ６、ＯＤＮ－９３、ＯＤＮ－１１２、ＶＧＶ－１、ＰＡ－４５７（ベビリマット）、アンプリゲン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）、ＨＲＧ２１４、シトリン（Ｃｙｔｏｌｉｎ）、ＶＧＸ－４１０、ＫＤ－２４７、ＡＭＺ ００２６、ＣＹＴ ９９００７Ａ－２２１ ＨＩＶ、ＤＥＢＩＯ－０２５、ＢＡＹ ５０－４７９８、ＭＤＸＯ１０（イピリムマブ）、ＰＢＳ１１９、ＡＬＧ ８８９、及びＰＡ－１０５００４０（ＰＡ－０４０）から選択される、ＨＩＶを治療するための別の薬物、（１３）上記のいずれの組み合わせ又は混合物の１つ以上を投与することを含む。
【0141】
さらなる例として、いくつかの実施形態では、対象処置法は、次のものを投与することを伴う：ａ）対象活性剤、並びにｂ）次のうちの１つ以上：ｉ）アンプレナビル（アゲネラーゼ（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ）、（３Ｓ）－オキソラン－３－イル Ｎ－［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－［Ｎ－（２－メチルプロピル）（４－アミノベンゼン）スルホンアミド］－１－フェニルブタン－２－イル］カルバメート）を、６００ｍｇ若しくは１２００ｍｇの量で１日２回、ｉｉ）チプラナビル（アプティバス、Ｎ－｛３－［（１Ｒ）－１－［（２Ｒ）－６－ヒドロキシ－４－オキソ－２－（２－フェニルエチル）－２－プロピル－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン－５－イル］プロピル］フェニル｝－５－（トリフルオロメチル）ピリジン－２－スルホンアミド）を、５００ｍｇの量で１日２回、ｉｉｉ）インジナビル（ｉｄｉｎａｖｉｒ）（クリキシバン（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、（２Ｓ）－１－［（２Ｓ，４Ｒ）－４－ベンジル－２－ヒドロキシ－４－｛［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヒドロキシ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデン－１－イル］カルバモイル｝ブチル］－Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－（ピリジン－３－イルメチル）ピペラジン－２－カルボキサミド）を、８００ｍｇの量で１日３回、ｉｖ）サクイナビル（インビラーゼ（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）、２Ｓ）－Ｎ－［（２Ｓ，３Ｒ）－４－［（３Ｓ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルカルバモイル）－デカヒドロイソキノリン－２－イル］－３－ヒドロキシ－１－フェニルブタン－２－イル］－２－（キノリン－２－イルホルムアミド）ブタンジアミド）を、１，０００ｍｇの量で１日２回、ｖ）ロピナビル及びリトナビル（カレタ（Ｋａｌｅｔａ）（ここでロピナビルは、２Ｓ）－Ｎ－［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）－５－［２－（２，６－ジメチルフェノキシ）アセトアミド］－４－ヒドロキシ－１，６－ジフェニルヘキサン－２－イル］－３－メチル－２－（２－オキソ－１，３－ジアジナン－１－イル）ブタンアミドであり、リトナビルは、１，３－チアゾール－５－イルメチル Ｎ－［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）－３－ヒドロキシ－５－［（２Ｓ）－３－メチル－２－｛［メチル（｛［２－（プロパン－２－イル）－１，３－チアゾール－４－イル］メチル｝）カルバモイル］アミノ｝ブタミド］－１，６－ジフェニルヘキサン－２－イル］カルバメートである）を、１３３ｍｇの量で１日２回、ｖｉ）ホスアンプレナビル（レキシバ（Ｌｅｘｉｖａ）、｛［（２Ｒ，３Ｓ）－１－［Ｎ－（２－メチルプロピル）（４－アミノベンゼン）スルホンアミド］－３－（｛［（３Ｓ）－オキソラン－３－イルオキシ］カルボニル｝アミノ）－４－フェニルブタン－２－イル］オキシ｝ホスホン酸）を、７００ｍｇ若しくは１４００ｍｇの量で１日２回）、ｖｉｉ）リトナビル（ノービア（Ｎｏｒｖｉｒ））を、６００ｍｇの量で１日２回、ｖｉｉｉ）ネルフィナビル（ビラセプト（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、（３Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル－２－［（２Ｒ，３Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－［（３－ヒドロキシ－２－メチルフェニル）ホルムアミド］－４－（フェニルスルファニル）ブチル］－デカヒドロイソキノリン－３－カルボキサミド）を、７５０ｍｇの量で１日３回、若しくは１２５０ｍｇの量で１日２回、ｉｘ）フュージオン（Ｆｕｚｅｏｎ）（アセチル－ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱ ＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ－アミド、配列番号２０）を、９０ｍｇの量で１日２回、ｘ）コンビビル（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ）を、１５０ｍｇラミブジン（３ＴＣ、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン）及び３００ｍｇジドブジン（ＡＺＴ、アジドチミジン）の量で１日２回、ｘｉ）エムトリシタビン（エムトリバ（Ｅｍｔｒｉｖａ）、４－アミノ－５－フルオロ－１－［（２Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－オキサチオラン－５－イル］－１，２－ジヒドロピリミジン－２－オン）を、２００ｍｇの量で１日１回、ｘｉｉ）エプジコムを、６００ｍｇアバカビル（ＡＢＶ、｛（１Ｓ，４Ｒ）－４－［２－アミノ－６－（シクロプロピルアミノ）－９Ｈ－プリン－９－イル］シクロペンタ－２－エン－１－イル｝メタノール）及び３００ｍｇ ３ＴＣの量で１日１回、ｘｉｉｉ）ジドブジン（レトロビル（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）、ＡＺＴ若しくはアジドチミジン）を、２００ｍｇの量で１日３回、ｘｉｖ）トリジビル（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）を、１５０ｍｇ ３ＴＣ及び３００ｍｇ ＡＢＶ及び３００ｍｇ ＡＺＴの量で１日２回、ｘｖ）ツルバダ（Ｔｒｕｖａｄａ）を、２００ｍｇエムトリシタビン及び３００ｍｇテノホビル（（｛［（２Ｒ）－１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）プロパン－２－イル］オキシ｝メチル）ホスホン酸）の量で１日１回、ｘｖｉ）ジダノシン（ヴァイデックス（Ｖｉｄｅｘ）、２’，３’－ジデオキシイノシン）を、４００ｍｇの量で１日１回、ｘｖｉｉ）テノホビル（ビリアード（Ｖｉｒｅａｄ））を、３００ｍｇの量で１日１回、ｘｖｉｉｉ）アバカビル（ザイアジェン（Ｚｉａｇｅｎ））を、３００ｍｇの量で１日２回、ｘｉｘ）アタザナビル（レイアタッツ、メチル Ｎ－［（１Ｓ）－１－｛［（２Ｓ，３Ｓ）－３－ヒドロキシ－４－［（２Ｓ）－２－［（メトキシカルボニル）アミノ］－３，３－ジメチル－Ｎ’－｛［４－（ピリジン－２－イル）フェニル］メチル｝ブタンヒドラジド］－１－フェニルブタン－２－イル］カルバモイル｝－２，２－ジメチルプロピル］カルバメート）を、３００ｍｇの量で１日１回、若しくは４００ｍｇの量で１日１回、ｘｘ）ラミブジン（エピビル（Ｅｐｉｖｉｒ））を、１５０ｍｇの量で１日２回、ｘｘｉ）スタブジン（ゼリット（Ｚｅｒｉｔ）、２’－３’－ジデヒドロ－２’－３’－ジデオキシチミジン）を、４０ｍｇの量で１日２回、ｘｘｉｉ）デラビルジン（レスクリプター（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、Ｎ－［２－（｛４－［３－（プロパン－２－イルアミノ）ピリジン－２－イル］ピペラジン－１－イル｝カルボニル）－１Ｈ－インドール－５－イル］メタンスルホンアミド）を、４００ｍｇの量で１日３回、ｘｘｉｉｉ）エファビレンツ（サスティバ（Ｓｕｓｔｉｖａ）、（４Ｓ）－６－クロロ－４－（２－シクロプロピルエチニル）－４－（トリフルオロメチル）－２，４－ジヒドロ－１Ｈ－３，１－ベンゾオキサジン－２－オン）を、６００ｍｇの量で１日１回）、ｘｘｉｖ）ネビラピン（ビラミューン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）、１１－シクロプロピル－４－メチル－５，１１－ジヒドロ－６Ｈ－ジピリド［３，２－ｂ：２’，３’－ｅ］［１，４］ジアゼピン－６－オン）を、２００ｍｇの量で１日２回）、ｘｘｖ）ベビリマット、並びにｘｘｖｉ）ビベコン（Ｖｉｖｅｃｏｎ）。
【0142】
キット、容器、デバイス、送達システム
例えば、経口、膣、直腸、経皮、又は注射用用量（例えば、筋肉内、静脈内、又は皮下注射のため）中の活性剤の単位用量を有するキットが提供される。そのようなキット中には、単位用量を含有する容器に加えて、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を処置する際の、薬物の使用及び付随する便益を説明する、情報提供のためのパッケージ挿入物が存在するであろう。好適な活性剤（対象干渉構築物又は対象干渉粒子）及び単位用量は、本明細書に上述されるものである。多くの実施形態では、対象キットは、対象方法を実践するための指示書又はそれを得るための手段をさらに含み（例えば、ユーザを、指示書を提供するウェブページに導くウェブサイトＵＲＬ）、これらの指示書は、典型的に基材上に印刷され、その基材は、次のうちの１つ以上であってもよい：パッケージ挿入物、パッケージ材料、製剤容器など。
例えば、経口、膣、直腸、経皮、又は注射用用量（例えば、筋肉内、静脈内、又は皮下注射のため）中の活性剤の単位用量を有するキットが提供される。そのようなキット中には、単位用量を含有する容器に加えて、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染症を処置する際の、薬物の使用及び付随する便益を説明する、情報提供のためのパッケージ挿入物が存在するであろう。好適な活性剤（対象干渉構築物又は対象干渉粒子）及び単位用量は、本明細書に上述されるものである。多くの実施形態では、対象キットは、対象方法を実践するための指示書又はそれを得るための手段をさらに含み（例えば、ユーザを、指示書を提供するウェブページに導くウェブサイトＵＲＬ）、これらの指示書は、典型的に基材上に印刷され、その基材は、次のうちの１つ以上であってもよい：パッケージ挿入物、パッケージ材料、製剤容器など。
【0143】
いくつかの実施形態では、対象キットは、患者の服薬遵守を増加させる１つ以上の構成要素又は特色、例えば、活性剤を適切な時間又は間隔で摂取することを念頭に置く際に患者を補助するための、構成要素又はシステムを含む。そのような構成要素には、活性剤を適切な時間又は間隔で摂取することを念頭に置く際に患者を補助するための、カレンダー管理システムが含まれるが、これらに限定されない。
【0144】
本発明は、活性剤を含む送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、活性剤を含む製剤の皮下、静脈内、又は筋肉内注射を提供する送達システムである。他の実施形態では、送達システムは、膣又は直腸送達システムである。
【0145】
いくつかの実施形態では、活性剤は、経口投与のためにパッケージ化される。本発明は、活性剤の毎日の投与量単位を含むパッケージ単位を提供する。例えば、パッケージ単位は、いくつかの実施形態では、従来のブリスターパック又は錠剤、丸薬などを含む任意の他の形態である。ブリスターパックは、ボール紙、板紙、ホイル、又はプラスチック裏板により密封されたブリスターパック中に適切な数の単位剤形を含有し、好適な被覆内に密閉されるであろう。各ブリスター容器は、例えば、１日目から開始して、付番されるか、又はラベル付けされてもよい。
【0146】
いくつかの実施形態では、対象の送達システムは、注射デバイスを含む。例示的な、非限定的薬物送達デバイスは、ペン型注射器などの注射デバイス及び針／シリンジデバイスを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の対象活性剤を含む製剤で事前充填された、注射送達デバイスを提供する。例えば、対象送達デバイスは、対象活性剤の単回用量で事前充填された注射デバイスを含む。対象注射デバイスは、再使用可能又は使い捨てであり得る。ペン型注射器は、当技術分野で周知である。本方法における使用に適合させられ得る、例示的なデバイスは、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からの多様なペン型注射器、例えば、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ ＩＩ、ＢＤ（商標）オートインジェクター（Ａｕｔｏ－Ｉｎｊｅｃｔｏｒ）のうちのいずれか；イノジェクト（Ｉｎｎｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．）からのペン型注射器；米国特許第５，７２８，０７４号明細書、同第６，０９６，０１０号明細書、同第６，１４６，３６１号明細書、同第６，２４８，０９５号明細書、同第６，２７７，０９９号明細書、及び同第６，２２１，０５３号明細書などに考察される薬品送達ペン型デバイスのいずれでもある。薬剤送達ペンは、使い捨てであってもよく、又は再利用可能で詰め替え可能であってもよい。
【0147】
本発明は、個体の膣又は直腸への、活性剤の膣又は直腸送達のための送達システムを提供する。送達システムは、膣又は直腸中への挿入のためのデバイスを含む。いくつかの実施形態では、送達システムは、製剤の膣又は直腸中への送達のためのアプリケータと、活性剤を含む製剤を含有する容器とを含む。これらの実施形態では、容器（例えば、管）は、製剤をアプリケータ中に送達するために適合させられる。他の実施形態では、送達システムは、膣又は直腸中に挿入されるデバイスを含み、そのデバイスは、活性剤を含む。例えば、デバイスは、活性剤を含む製剤でコーティングされるか、それにより浸漬されるか、又はそれを含有する。
【0148】
いくつかの実施形態では、膣又は直腸送達システムは、対象製剤を含むタンポン又はタンポン様デバイスである。薬物送達タンポンは、当技術分野で既知であり、いずれのそのようなタンポンも対象薬物送達システムと併せて使用することができる。薬物送達タンポンは、例えば、米国特許第６，０８６，９０９号明細書に記載される。タンポン又はタンポン様デバイスが使用される場合、活性剤がデバイス中に組み込まれ得る、多数の方法が存在する。例えば、活性剤は、デバイスの先端におけるゲル様生体付着性リザーバ中に組み込むことができる。代替的に、活性剤は、タンポンの先端に位置付けられた粉末物質の形態であり得る。活性剤はまた、例えば、活性剤を薬学的に許容される担体中に溶解させ、薬物溶液をタンポン繊維中に吸収させることによって、タンポンの先端の繊維中に吸収させることもできる。活性剤はまた、タンポンの先端に適用されるコーティング物質中に溶解させることもできる。代替的に、活性剤は、タンポンの先端に関連して配置された挿入可能な坐剤中に組み込むことができる。
【0149】
他の実施形態では、薬物送達デバイスは、膣又は直腸リングである。膣又は直腸リングは、通常、送達されるべき活性剤を含有するエラストマーの別の層によってコーティングされた、不活性エラストマーリングからなる。リングは、ユーザによって、簡便に挿入し、所望の一定期間（例えば、最大７日間）にわたって定置に残し、次いで除去することができる。リングは、任意選択により、活性剤を何ら含有しない第３の外部速度制御エラストマー層を含む可能性がある。任意選択により、第３のリングは、二重放出リングのための第２の活性剤を含有する可能性がある。活性剤は、送達されるべき薬物のためのリザーバとして作用するように、シリコーンエラストマーリング全体にわたってポリエチレングリコール中に組み込むことができる。
【0150】
他の実施形態では、対象の膣又は直腸送達システムは、膣又は直腸スポンジである。活性剤は、文献に記載される円筒状の薬物不含ポリウレタンスポンジ上にコーティングされるシリコーンマトリックス中に組み込まれる。ペッサリー、錠剤、及び坐剤は、本開示の文脈において使用され得る薬物送達システムの他の例である。これらのシステムは、文献に広範に記載されている。
【0151】
生体付着性微粒子は、本開示の文脈において使用するのに好適な、依然として別の薬物送達システムを構成する。このシステムは、多くの坐剤製剤のように膣又は直腸から滲出しない、多相液体又は半固体調製物である。材料は、膣又は直腸の壁に付着し、薬物を一定期間にわたって放出する。これらのシステムのうちの多くは、鼻用の使用のために設計されたが、膣又は直腸でも同様に使用することができる（例えば、米国特許第４，７５６，９０７号明細書）。システムは、活性剤を有するミクロスフェア、及び薬物の取り込みを強化するための界面活性剤を含んでもよい。微粒子は、１０～１００μｍの直径を有し、デンプン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、又はデキストランから調製することができる。
【0152】
別のシステムは、アプリケータとの使用のために適合させられる、対象製剤を含む容器（例えば、管）である。活性剤は、アプリケータを使用して膣又は直腸に適用され得るクリーム、ローション、泡状物質、ペースト、軟膏、及びゲル中に組み込まれる。クリーム、ローション、泡状物質、ペースト、軟膏、及びゲル中の医薬品を調製するためのプロセスは、文献全体を通じて見出すことができる。好適なシステムの例は、ジャーゲンズ（ＪＥＲＧＥＮＳ）（商標）（アンドリュー・ジャーゲンズ（Ａｎｄｒｅｗ Ｊｅｒｇｅｎｓ Ｃｏ．）、オハイオ州シンシナティ）の商標の下に販売される製品などの、グリセロール、セラミド、鉱物油、ワセリン、パラベン、香料、及び水を含有する標準的な無香料ローション製剤である。本発明の組成物における使用に好適な非毒性の薬学的に許容されるシステムは、薬学的製剤の技術分野の専門家に明らかとなり、例は、レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１９版、Ａ．Ｒ．ジェンナーロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編、１９９５年に記載される。好適な担体の選定は、所望される特定の膣又は直腸剤形の厳密な性質、例えば、活性成分が、クリーム、ローション、泡状物質、軟膏、ペースト、溶液、又はゲルへと製剤化されるべきであるかどうか、並びに活性成分の素性に依存するであろう。他の好適な送達デバイスは、米国特許第６，４７６，０７９号明細書に記載されるものである。
【0153】
処置に好適な対象
本開示の方法は、免疫不全ウイルス感染症を有する、例えば、免疫不全ウイルス感染症を有すると診断された、個体を処置するのに好適である。本開示の方法はまた、ＨＩＶ感染と診断されていない個体（例えば、ＨＩＶにつき試験され、ＨＩＶにつき陰性となった個体；及び試験されていない個体）、及び一般集団よりもＨＩＶ感染のリスクが高いと考えられている個体（例えば、「リスクのある」個体）における使用に好適である。
本開示の方法は、免疫不全ウイルス感染症を有する、例えば、免疫不全ウイルス感染症を有すると診断された、個体を処置するのに好適である。本開示の方法はまた、ＨＩＶ感染と診断されていない個体（例えば、ＨＩＶにつき試験され、ＨＩＶにつき陰性となった個体；及び試験されていない個体）、及び一般集団よりもＨＩＶ感染のリスクが高いと考えられている個体（例えば、「リスクのある」個体）における使用に好適である。
【0154】
本開示の方法は、ＨＩＶ感染症を有する（例えば、ＨＩＶ感染症を有すると診断された）個体、及び一般集団よりもＨＩＶ感染症に接触するリスクが高いとみなされる個体を処置するのに好適である。そのような個体には、健康で無傷の免疫システムを有するが、ＨＩＶに感染するようになるリスクがある個体（「リスクのある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。リスクがある個体には、一般集団よりも、ＨＩＶに感染するようになる可能性がより高い個体が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶに感染するようになるリスクがある個体には、ＨＩＶに感染した個体との性行為に起因して、ＨＩＶ感染症に対するリスクがある個体が含まれるが、これらに限定されない。処置に好適な個体には、ＨＩＶ－１及び／若しくはＨＩＶ－２及び／若しくはＨＩＶ－３、又はそれらの任意の変異体に感染した、又はそれらに感染するようになるリスクがある個体が含まれる。
【0155】
変異体を生成する方法
本開示は、干渉し、条件付きで複製する、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ＨＩＶ構築物を生成する方法を提供する。方法は、一般的に、ａ）上記の干渉構築物を第１の個体に導入すること；ｂ）干渉構築物が第１の個体から（直接的に又は１以上の干渉個体を介して）伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、第１の個体に導入された干渉構築物の変異体である入手すること；及びｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすることを含む。
本開示は、干渉し、条件付きで複製する、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ＨＩＶ構築物を生成する方法を提供する。方法は、一般的に、ａ）上記の干渉構築物を第１の個体に導入すること；ｂ）干渉構築物が第１の個体から（直接的に又は１以上の干渉個体を介して）伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、第１の個体に導入された干渉構築物の変異体である入手すること；及びｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすることを含む。
【0156】
本開示の例示的な非限定的側面
上記の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、又は１つ以上の他の態様又は実施形態と組み合わせて、有益であり得る。前述の説明を制限することなく、１～７８の番号が付けられた開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に付番けされた態様はそれぞれ、使用され得、又は先行又は後続の個別に付番された態様のいずれかと組み合わせられ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせにつきサポートを提供することを目的としており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
上記の本主題の実施形態を含む態様は、単独で、又は１つ以上の他の態様又は実施形態と組み合わせて、有益であり得る。前述の説明を制限することなく、１～７８の番号が付けられた開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に付番けされた態様はそれぞれ、使用され得、又は先行又は後続の個別に付番された態様のいずれかと組み合わせられ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせにつきサポートを提供することを目的としており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
【0157】
態様１．干渉し、条件付きで複製する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物であって、同構築物は、
ａ）長い末端反復、Ｇａｇリーダ配列、Ψパッケージングシグナル、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）、Ａ３、及びＡ７を含むシス作用エレメント；及び
ｂ）ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更であって、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する、変更、
を含む、構築物。
ａ）長い末端反復、Ｇａｇリーダ配列、Ψパッケージングシグナル、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、ポリプリントラクト（ＰＰＴ）、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）、Ａ３、及びＡ７を含むシス作用エレメント；及び
ｂ）ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更であって、１つ以上の変更により、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＶｉｆのそれぞれが機能しなくなり、その結果、構築物はそれ自体ではウイルスの複製及び産生ができなくなるが、ヘルパーウイルスとして機能するために複製能を有するＨＩＶを要する、変更、
を含む、構築物。
【0158】
態様２．シス作用エレメントが、Ｄ４、Ａ４、及びＡ５をさらに含む、態様１に記載の構築物。
態様３．長い末端反復が、長い３’末端反復又は長い５’末端反復である、態様１又はｂ）に記載の構築物。
態様３．長い末端反復が、長い３’末端反復又は長い５’末端反復である、態様１又はｂ）に記載の構築物。
【0159】
態様４．Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、及びＥｎｖのそれぞれを非機能的にする１つ以上の変更をさらに含む、態様１～３のいずれか１つに記載の構築物。
態様５．構築物によってコードされるゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡよりも速い速度で産生され、その結果、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡに対する構築物によってコードされるｇＲＮＡの比率は、細胞内で約１よりも大きくなる、態様１～４のいずれか１つに記載の構築物。
態様５．構築物によってコードされるゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡよりも速い速度で産生され、その結果、野生型ＨＩＶ ｇＲＮＡに対する構築物によってコードされるｇＲＮＡの比率は、細胞内で約１よりも大きくなる、態様１～４のいずれか１つに記載の構築物。
【0160】
態様６．構築物が野生型ＨＩＶよりも高い伝達頻度を有する、態様５に記載の構築物。
態様７．構築物が基本再生産数（Ｒ０）＞１を有する、態様１～５のいずれか１つに記載の構築物。
態様７．構築物が基本再生産数（Ｒ０）＞１を有する、態様１～５のいずれか１つに記載の構築物。
【0161】
態様８．構築物が、遺伝子産物をコードするいかなる異種ヌクレオチド配列も含まない、態様１～７のいずれか１つに記載の構築物。
態様９．構築物が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶよりも高い効率でパッケージ化される、態様１～８のいずれか１つに記載の構築物。
態様９．構築物が、野生型ＨＩＶに感染した宿主細胞に存在する場合、野生型ＨＩＶよりも高い効率でパッケージ化される、態様１～８のいずれか１つに記載の構築物。
【0162】
態様１０．シス作用エレメントが、ＨＩＶタンパク質コード配列内に包埋された少なくとも１つのシスエレメントを含む、態様１～９のいずれか１つに記載の構築物。
態様１１．構築物が、ＨＩＶスプライスドナー部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、態様１～１０のいずれか１つに記載の構築物。
態様１１．構築物が、ＨＩＶスプライスドナー部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、態様１～１０のいずれか１つに記載の構築物。
【0163】
態様１２．Ｄ２及びＤ３スプライスドナー部位が欠失している、態様１１の構築物。
態様１３．構築物が、ＨＩＶスプライスアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、態様１～１２のいずれか１つに記載の構築物。
態様１３．構築物が、ＨＩＶスプライスアクセプター部位における欠失又は変異を含む１つ以上の変更をさらに含む、態様１～１２のいずれか１つに記載の構築物。
【0164】
態様１４．Ａ１及びＡ２スプライスアクセプター部位が欠失している、態様１３の構築物。
態様１５．ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更が、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異を含む、態様１～１４のいずれか１つに記載の構築物。
態様１５．ＨＩＶヌクレオチド配列における１つ以上の変更が、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異を含む、態様１～１４のいずれか１つに記載の構築物。
【0165】
態様１６．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、態様１５に記載の構築物。
【0166】
態様１７．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、５８３０～６０４４、５８７２～５８８０、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、態様１６に記載の構築物。
【0167】
態様１８．構築物が、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、態様１６又は１７に記載の構築物。
【0168】
態様１９．ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異、及びＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のヌクレオチドの欠失又は変異をさらに含む、態様１５～１８のいずれか１つに記載の構築物。
【0169】
態様２０．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～４７８０、４９０４～５７３７、５８５０～６３４１、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、態様１９に記載の構築物。
【0170】
態様２１．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、４７８１～４９０３、５７３８～５８４９、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、及び９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、態様２０に記載の構築物。
【0171】
態様２２．構築物が、配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、態様２０又は２１に記載の構築物。
【0172】
態様２３．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置３１５９～５６３０、及び８７８６～９０４８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、態様１～１５のいずれかに記載の構築物。
【0173】
態様２４．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、５８５０～６０４４、５９６９～６０４４、６０４５～６０６０、６０６１～６３０６、６２２１～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、態様２３に記載の構築物。
【0174】
態様２５．構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、態様２３又は２４に記載の構築物。
【0175】
態様２６．配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置５８５０～６３４１に対応するヌクレオチドの欠失をさらに含む、態様２３～２５のいずれかに記載の構築物。
態様２７．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、態様２６に記載の構築物。
態様２７．構築物が、配列番号１の参照ＨＩＶ配列に対して付番された位置１～６３４、６３５～７８９、６８６～８２３、７９０～２２９２、２０８５～３１５８、５６３１～５８４９、４７７８～４８９８、６３４２～８７８５、７７５９～７９９２、８３６９～８４１４、８３６９～８６４３、９０４９～９７０９に対応するヌクレオチドを含む、態様２６に記載の構築物。
【0176】
態様２８．構築物が、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる、態様２６又は２７に記載の構築物。
【0177】
態様２９．構築物が、ＨＩＶ Ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列における欠失を含む、態様１～２８のいずれか１つに記載の構築物。
態様３０．構築物が、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～２９のいずれか１つに記載の構築物。
態様３０．構築物が、ＨＩＶ Ｖｉｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～２９のいずれか１つに記載の構築物。
【0178】
態様３１．構築物が、ＨＩＶ Ｖｐｒをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３０のいずれか１つに記載の構築物。
態様３２．構築物が、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３１のいずれか１つに記載の構築物。
態様３２．構築物が、ＨＩＶ Ｔａｔをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３１のいずれか１つに記載の構築物。
【0179】
態様３３．構築物が、ＨＩＶ Ｒｅｖをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３２のいずれか１つに記載の構築物。
態様３４．構築物が、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３３のいずれか１つに記載の構築物。
態様３４．構築物が、ＨＩＶ Ｖｐｕをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３３のいずれか１つに記載の構築物。
【0180】
態様３５．構築物が、ＨＩＶ Ｅｎｖをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３４のいずれか１つに記載の構築物。
態様３６．構築物が、ＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３５のいずれか１つに記載の構築物。
態様３６．構築物が、ＨＩＶ Ｎｅｆをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３５のいずれか１つに記載の構築物。
【0181】
態様３７．構築物が、ＨＩＶ Ｇａｇをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む、態様１～３６のいずれか１つに記載の構築物。
態様３８．態様１～３７のいずれか１つの構築物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
態様３８．態様１～３７のいずれか１つの構築物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【0182】
態様３９．ヒト免疫不全ウイルスによる感染を処置する方法であって、治療有効量の態様３８に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
態様４０．個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法であって、有効量の態様３８の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
態様４０．個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法であって、有効量の態様３８の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
【0183】
態様４１．態様１～３７のいずれか１つの構築物及びウイルスエンベロープタンパク質を含む粒子。
態様４２．エンベロープタンパク質がｇｐ１２０を含む、態様４１に記載の粒子。
態様４２．エンベロープタンパク質がｇｐ１２０を含む、態様４１に記載の粒子。
【0184】
態様４３．エンベロープタンパク質が非ＨＩＶタンパク質である、態様４１に記載の粒子。
態様４４．態様４１～４４のいずれか１つの粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
態様４４．態様４１～４４のいずれか１つの粒子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【0185】
態様４５．態様３８又は４４の医薬組成物を含む容器を含む、ヒト免疫不全ウイルスによる感染症を処置するためのキット。
態様４６．容器がシリンジである、態様４５に記載のキット。
態様４６．容器がシリンジである、態様４５に記載のキット。
【0186】
態様４７．ヒト免疫不全ウイルスによる感染を処置する方法であって、治療有効量の態様４４に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
態様４８．個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法であって、有効量の態様４４の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
態様４８．個体におけるヒト免疫不全ウイルスのウイルス量を低減する方法であって、有効量の態様４４の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
【0187】
態様４９．ウイルス複製、ウイルスプロテアーゼ活性、ウイルス逆転写酵素活性、細胞中へのウイルス侵入、ウイルスインテグラーゼ活性、ウイルスＲｅｖ活性、ウイルスＴａｔ活性、ウイルスＮｅｆ活性、ウイルスＶｐｒ活性、ウイルスＶｐｕ活性、ウイルスＰｏｌ活性、及びウイルスＶｉｆ活性から選択される免疫不全ウイルス機能を阻害する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む、態様３９、４０、４７、及び４８のいずれか１つに記載の方法。
【0188】
態様５０．個体が、ＨＩＶ感染と診断されているか、又は一般集団よりもＨＩＶに感染するリスクが高いと考えられる、態様４９に記載の方法。
態様５１．ＨＩＶに感染した細胞のゲノムに組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む、態様５０に記載の方法。
態様５１．ＨＩＶに感染した細胞のゲノムに組み込まれた潜伏ＨＩＶを再活性化する有効量の薬剤を個体に投与することをさらに含む、態様５０に記載の方法。
【0189】
態様５２．態様１～３７のいずれか１つの構築物を含む、単離された体液。
態様５３．体液が血液又は血漿である、態様５２に記載の単離された体液。
態様５４．干渉し、条件付きで複製する、変異体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を生成する方法であって、
ａ）態様１～３７のいずれか１つの構築物を第１の個体に導入すること；
ｂ）態様１～３７のいずれか１つの構築物が第１の個体から伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、態様１～３７のいずれか１つの構築物の変異体である入手すること；及び
ｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすること
を含む、方法。
態様５３．体液が血液又は血漿である、態様５２に記載の単離された体液。
態様５４．干渉し、条件付きで複製する、変異体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）構築物を生成する方法であって、
ａ）態様１～３７のいずれか１つの構築物を第１の個体に導入すること；
ｂ）態様１～３７のいずれか１つの構築物が第１の個体から伝達された第２の個体から生物学的試料を入手することであって、第２の個体に存在する構築物は、態様１～３７のいずれか１つの構築物の変異体である入手すること；及び
ｃ）第２の個体から変異体構築物をクローニングすること
を含む、方法。
【0190】
態様５５．態様１～３７のいずれか１つの構築物を含む、単離された細胞。
態様５６．粒子を生成する方法であって、態様１～３７のいずれかの構築物でヒト免疫不全ウイルスに感染した細胞をトランスフェクトし、構築物を粒子にパッケージングするのに好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む、方法。
態様５６．粒子を生成する方法であって、態様１～３７のいずれかの構築物でヒト免疫不全ウイルスに感染した細胞をトランスフェクトし、構築物を粒子にパッケージングするのに好適な条件下で細胞をインキュベートすることを含む、方法。
【0191】
態様５７．態様４１～４４のいずれか１つの粒子を含む、単離された細胞。
【実施例】
【0192】
次の例は、当業者に本発明の作製及び使用方法の開示及び説明を提供するために提示されるものであり、本発明者らが何を本発明として見なすかについての範囲を限定するようには意図されず、且つそれらが、下記の実験が全ての又は唯一の行われた実験であることを表すことも意図されない。使用された数（例えば、量、温度など）に関する正確性を確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験的誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途指示しない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準的な略号が使用され得、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒（ｓｅｃｏｎｄ）；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間（ｈｏｕｒ）；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）などである。
【0193】
実施例１：ＨＩＶの伝染性抗ウイルス療法：第１の治療用干渉粒子の発見及び検証
序論
現在の抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は薬剤ベースであり、生涯にわたる投与（これは患者の行動／アドヒアランスに依存する）が必要であり、治療の中断は、潜伏リザーバからのウイルスのリバウンド、臨床的進行、及びウイルスの変異回避の脅威につながる（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）ら著、２０１４年）。
序論
現在の抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）は薬剤ベースであり、生涯にわたる投与（これは患者の行動／アドヒアランスに依存する）が必要であり、治療の中断は、潜伏リザーバからのウイルスのリバウンド、臨床的進行、及びウイルスの変異回避の脅威につながる（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）ら著、２０１４年）。
【0194】
本発明者らは、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）という歴史的概念（ヘンレ（Ｈｅｎｌｅ）及びヘンレ（Ｈｅｎｌｅ）著、１９４３年；ファン（Ｈｕａｎｇ）及びバルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）著、１９７０年）が、耐性に対する高い遺伝的障壁を備えた単回投与療法として機能する治療用干渉粒子（ＴＩＰ）へと合理的に改変され得る（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）という考えを前進させた。ＤＩＰと同様に、ＴＩＰはサブゲノム欠失変異体であるが、ＴＩＰは基本再生産数（Ｒ０）＞１になるように改変されている（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年）。
【0195】
ＨＩＶ－１（以下「ＨＩＶ」）の場合、ＴＩＰは分子寄生虫として作用して、ＨＩＶから重要な複製機構を奪い、ＨＩＶと共に条件付きで複製してＨＩＶ放出数を低減すると予測された（図１）。分子スケールでは、ＴＩＰは自己複製に必要な構造遺伝子及びエンベロープ遺伝子（すなわち、トランス作用エレメント）を欠いているが、パッケージング及びカプシド形成のための遺伝的シグナル（すなわち、シス作用エレメント）を保持していると予測された。したがって、ＴＩＰは、ＨＩＶトランスエレメント（例えば、カプシド、エンベロープ）を利用し、ＨＩＶをヘルパーウイルスとして使用して、感染した細胞から動員し得る。ただし、ＴＩＰのエビデンスは存在しなかった。
【0196】
疫学モデルからは、ＴＩＰがうまく改変できれば、既存及び提案されている介入より大幅に優れたものであり得ると予測された（図２）。具体的には、ＴＩＰはインビボでのＨＩＶセットポイントウイルス量を大幅に低減し（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）、より遅い臨床的進行及びより低いＨＩＶ伝達をもたらし（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）、患者（ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年）及び高リスク集団（ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年）におけるＨＩＶの進化及び変異の回避を最小限に抑え得る。ＴＩＰは、ＨＩＶセットポイントウイルス量を低減することでこれらの利点を実現する。これは、依然として、他の指標（例えば、ＣＤ４＋細胞数）にも関わらず、臨床的進行（メラース（Ｍｅｌｌｏｒｓ）ら著、１９９６年）及びウイルス伝達（フレーザ（Ｆｒａｓｅｒ）ら著、２００７年）の強力な予測因子である。
【0197】
ＨＩＶのインビボダイナミクスの数学的モデルは十分に確立されており（ノワック（Ｎｏｗａｋ）及びメイ（Ｍａｙ）著、２０００年）、ＴＩＰの科学的前提を築いている。モデルは、生産的にＨＩＶに感染している細胞はわずか約１％であるにもかかわらず、これらの細胞の大部分がＨＩＶ－ＴＩＰに共感染することを示した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）。その理由は、ＨＩＶ感染細胞の急速な代謝回転である。感染細胞は約１日で死滅し（ペレルソン（Ｐｅｒｅｌｓｏｎ）ら著、１９９７年）、その結果、慢性セットポイント感染中に毎日１％の細胞の新しいサブセットが感染する。これらのインビボダイナミクスの結果として、モデルは、組み込みＴＩＰプロウイルスを保有するＣＤ４＋Ｔ細胞が３０～５０日以内にＨＩＶによって重感染し、トランス活性化されることを示した［急性感染中に細胞のより大きな画分がＨＩＶに感染している場合はより迅速（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）］。ちなみに、これは、ＨＩＶ組換えが迅速である理由についての従来の説明（組換えには、２つの別個のプロウイルスに重感染した細胞から産生されるヘテロ二倍体ビリオンが必要である）と類似しているが、複数のＨＩＶプロウイルスを有する細胞はまれである（ヨセフソン（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ）ら著、２０１１年）。
【0198】
ＴＩＰは、ＡＲＴ中断時のウイルスのリバウンドを制限する「サルベージ療法」を構成し得る。
ＨＩＶ－１ ＴＩＰ（及びＤＩＰ）は、Ｔａｔを欠くレンチウイルスベクターであり、潜在を制御する関連する正のフィードバック回路である。本発明者ら、及び他の研究者らは、そのようなベクターがプロウイルス潜伏期に入り、Ｔａｔがトランスで提供されるまで休眠状態を維持することを示した（ラズーキー（Ｒａｚｏｏｋｙ）ら著、２０１５年；ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００５年）。したがって、ＡＲＴの中断又は失敗中に、ＨＩＶが潜伏期を逆転させるか、形質導入された細胞に感染すると、潜在型のＤＩＰ／ＴＩＰが再活性化され得る。したがって、ＴＩＰは、ＡＲＴ中断中のＨＩＶウイルス量を低減するために、ＡＲＴを補完するサルベージ療法として機能し得る（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。実際に、分析療法の中断（ＡＴＩ）は、クリニックでＴＩＰを試験し、最終的には実装するためのアプローチである可能性がある（例えば、現在進行中の２４週間のＡＴＩ臨床試験ＮＣＴ０３６１７１９８）。
ＨＩＶ－１ ＴＩＰ（及びＤＩＰ）は、Ｔａｔを欠くレンチウイルスベクターであり、潜在を制御する関連する正のフィードバック回路である。本発明者ら、及び他の研究者らは、そのようなベクターがプロウイルス潜伏期に入り、Ｔａｔがトランスで提供されるまで休眠状態を維持することを示した（ラズーキー（Ｒａｚｏｏｋｙ）ら著、２０１５年；ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００５年）。したがって、ＡＲＴの中断又は失敗中に、ＨＩＶが潜伏期を逆転させるか、形質導入された細胞に感染すると、潜在型のＤＩＰ／ＴＩＰが再活性化され得る。したがって、ＴＩＰは、ＡＲＴ中断中のＨＩＶウイルス量を低減するために、ＡＲＴを補完するサルベージ療法として機能し得る（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。実際に、分析療法の中断（ＡＴＩ）は、クリニックでＴＩＰを試験し、最終的には実装するためのアプローチである可能性がある（例えば、現在進行中の２４週間のＡＴＩ臨床試験ＮＣＴ０３６１７１９８）。
【0199】
ＴＩＰは、変異性逃避に対して高い遺伝的障壁を有する
ＨＩＶ－１インビボダイナミクスの数学的モデルは、ＤＩＰ及びＴＩＰは、同じ逆転写酵素機構を使用して変異し、放出数が大きく、野生型ウイルスとの寄生関係を維持するために進化的に選択されているため、従来の治療法よりも本質的にＨＩＶ変異性逃避に対する脆弱性が低くなることを示唆している。（ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年）。予備モデルは、圧倒的に、最も可能性の高い変異がＴＩＰの機能喪失イベント（すなわち、ＴＩＰが野生型ＨＩＶに対する治療効果を失うこと）であることを示す。驚くべきことに、本発明者らのモデルでは、ＨＩＶが現在のＡＲＴから逃避する２倍の速さでＴＩＰの機能喪失が起こったとしても、ＴＩＰは潜在的なワクチンの１０倍を超えてＡＩＤＳ集団の有病率を安定して低減する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。
ＨＩＶ－１インビボダイナミクスの数学的モデルは、ＤＩＰ及びＴＩＰは、同じ逆転写酵素機構を使用して変異し、放出数が大きく、野生型ウイルスとの寄生関係を維持するために進化的に選択されているため、従来の治療法よりも本質的にＨＩＶ変異性逃避に対する脆弱性が低くなることを示唆している。（ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年）。予備モデルは、圧倒的に、最も可能性の高い変異がＴＩＰの機能喪失イベント（すなわち、ＴＩＰが野生型ＨＩＶに対する治療効果を失うこと）であることを示す。驚くべきことに、本発明者らのモデルでは、ＨＩＶが現在のＡＲＴから逃避する２倍の速さでＴＩＰの機能喪失が起こったとしても、ＴＩＰは潜在的なワクチンの１０倍を超えてＡＩＤＳ集団の有病率を安定して低減する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。
【0200】
別の懸念は、ＴＩＰが組換えによって病原体の産生を「アップレギュレート」し、細胞からの自身の産生をアップレギュレートするエレメントを得る可能性があることである。本発明者らは、この懸念の進化的淘汰の側面を詳細に調査した（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年）。驚くべきことに、これらのモデルでは、ＴＩＰを介したＨＩＶのアップレギュレーションにより、患者のＴＩＰウイルス量が増加し、これは実際にさらに低いＨＩＶウイルス量及びＨＩＶ集団の有病率を生じた。したがって、ＴＩＰは複数のスケールで競合する選択圧に供され、これらの療法の潜在的な進化的破綻を制限する。
【0201】
疫学的予測：ＴＩＰは、行動的障害を回避し、高リスク群を標的化し得る。
疫学者は、感染症を効率的に制御するために、高リスクの「コアグループ」及びウイルスの「スーパースプレッダー」を標的にすることの計り知れない可能性を長く認識してきた。しかし、これらの高リスク集団を特定し到達することは非常に困難であることが多く、問題は、主要な集団における不健康な行動（例えば、注射薬物使用者、ＩＤＵ）、及び高リスク個体が未知のままでいるように動機付ける社会的スティグマ又は犯罪障壁（例えば、ＩＤＵ、商業的セックスワーカ及びその客、男性と性交する男性、婚外の性的パートナを有する人）によってさらに悪化する。高リスク集団の特定に伴うコスト及び労力の結果、大きな潜在的利益があるにもかかわらず、実際には疾病管理対策の対象となることはしばしば実現不可能であるということを意味している。ＴＩＰは、病原体と同じメカニズムとリスク因子を介してこれらの主要な感染集団に到達するために伝播する疾患の根底にある伝達パターンを利用することによって、この障害を克服する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）ら著、２０１４年）。すなわち、ＴＩＰは、高リスク個体を特定し到達するためのコスト及び課題を発生させることなく、標的化制御の利益をもたらすと予測される。現在の予防及び処置のアプローチは、不十分なアドヒアランス及び行動の脱抑制という課題に直面している。そこでは、疾患制御が成功すると、疾患による個人的なリスクの感覚が低減し、リスク行動の増加を生じ得る。脱抑制は依然としてＨＩＶの予防及び制御の懸念事項であり（デューカーズ（Ｄｕｋｅｒｓ）ら著、２００１年）、治療が成功すると実際にＨＩＶの発生率が高まるという逆の結果を生じ得る（ブロワー（Ｂｌｏｗｅｒ）ら著、２０００年）。ＡＲＴ又は潜在的ワクチンとは異なり、単回投与療法はこれらの問題を効果的に回避し得、ＴＩＰの公衆衛生上の利点は脱抑制に対してユニークに強力である（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。
疫学者は、感染症を効率的に制御するために、高リスクの「コアグループ」及びウイルスの「スーパースプレッダー」を標的にすることの計り知れない可能性を長く認識してきた。しかし、これらの高リスク集団を特定し到達することは非常に困難であることが多く、問題は、主要な集団における不健康な行動（例えば、注射薬物使用者、ＩＤＵ）、及び高リスク個体が未知のままでいるように動機付ける社会的スティグマ又は犯罪障壁（例えば、ＩＤＵ、商業的セックスワーカ及びその客、男性と性交する男性、婚外の性的パートナを有する人）によってさらに悪化する。高リスク集団の特定に伴うコスト及び労力の結果、大きな潜在的利益があるにもかかわらず、実際には疾病管理対策の対象となることはしばしば実現不可能であるということを意味している。ＴＩＰは、病原体と同じメカニズムとリスク因子を介してこれらの主要な感染集団に到達するために伝播する疾患の根底にある伝達パターンを利用することによって、この障害を克服する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）ら著、２０１４年）。すなわち、ＴＩＰは、高リスク個体を特定し到達するためのコスト及び課題を発生させることなく、標的化制御の利益をもたらすと予測される。現在の予防及び処置のアプローチは、不十分なアドヒアランス及び行動の脱抑制という課題に直面している。そこでは、疾患制御が成功すると、疾患による個人的なリスクの感覚が低減し、リスク行動の増加を生じ得る。脱抑制は依然としてＨＩＶの予防及び制御の懸念事項であり（デューカーズ（Ｄｕｋｅｒｓ）ら著、２００１年）、治療が成功すると実際にＨＩＶの発生率が高まるという逆の結果を生じ得る（ブロワー（Ｂｌｏｗｅｒ）ら著、２０００年）。ＡＲＴ又は潜在的ワクチンとは異なり、単回投与療法はこれらの問題を効果的に回避し得、ＴＩＰの公衆衛生上の利点は脱抑制に対してユニークに強力である（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年）。
【0202】
遺伝子毒性：レンチウイルスベクター治療の成功（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）により、遺伝子毒性の懸念が低減された
発癌性形質転換につながる挿入型変異誘発の初期の報告により、レトロウイルスの組み込みについては理解できる懸念が残っている（パイク・オバーゼット（Ｐｉｋｅ－Ｏｖｅｒｚｅｔ）ら著、２００７年）。しかし、その試験とは異なり、ＴＩＰは造血幹細胞（又は任意の前駆細胞）の形質導入に依存せず、最終的に分化したＴ細胞及び場合によってはマクロファージの形質導入にのみ依存する。血球への遺伝子療法は、ＣＡＲ Ｔ療法及び他のアプローチによって証明されるように、現在、成功した治療戦略である。これは、発癌性形質転換に対するＴリンパ球の耐性が原因である可能性がある。Ｔ細胞性白血病は、ＨＩＶに感染した集団でも非常にまれであり、Ｂ細胞性白血病（ＨＩＶ患者でより一般的）は、これらの細胞へのＨＩＶの組み込みによるものではない。
発癌性形質転換につながる挿入型変異誘発の初期の報告により、レトロウイルスの組み込みについては理解できる懸念が残っている（パイク・オバーゼット（Ｐｉｋｅ－Ｏｖｅｒｚｅｔ）ら著、２００７年）。しかし、その試験とは異なり、ＴＩＰは造血幹細胞（又は任意の前駆細胞）の形質導入に依存せず、最終的に分化したＴ細胞及び場合によってはマクロファージの形質導入にのみ依存する。血球への遺伝子療法は、ＣＡＲ Ｔ療法及び他のアプローチによって証明されるように、現在、成功した治療戦略である。これは、発癌性形質転換に対するＴリンパ球の耐性が原因である可能性がある。Ｔ細胞性白血病は、ＨＩＶに感染した集団でも非常にまれであり、Ｂ細胞性白血病（ＨＩＶ患者でより一般的）は、これらの細胞へのＨＩＶの組み込みによるものではない。
【0203】
それに関わらず、現代のレンチウイルス療法は強力な安全性の記録を有し、挿入を介した遺伝子毒性の欠如を一貫して示している（アイウチ（Ａｉｕｔｉ）ら著、２０１３年；ビッフィ（Ｂｉｆｆｉ）ら著、２０１３年；ハセイン・ベイ・アビナ（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ）ら著、２０１５年；リバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら著、２００６年；マレク（Ｍａｌｅｃｈ）及びオックス（Ｏｃｈｓ）著、２０１５年；シェラー（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ）ら著、２０１２年）。特に、Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）のレトロウイルスベクターは、現在、１０年の長きにわたる安全性及び有効性のプロファイル（シェラー（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ）ら著、２０１２年）、並びに鎌状赤血球症（リベイル（Ｒｉｂｅｉｌ）ら著、２０１７年）及びＳＣＩＤ－Ｘ１乳児（マムカルツ（Ｍａｍｃａｒｚ）ら著、２０１９年）における最近の成功を有する。したがって、レンチウイルスベクター（例えば、ＤＩＰ及びＴＩＰ）の挿入遺伝子毒性及び発癌は最小限のようである。
【0204】
組換え：レンチウイルスベクターは、細胞培養、マウス、又はヒトにおいて野生型ＨＩＶとの組換えを示さない。
疑似二倍体であるレンチウイルスは、逆転写中に組換えることができる２つのゲノムＲＮＡ鎖を有する。レンチウイルスの組換えには、配列に有意な相同性が必要であるようであり、１つの完全長９．７ｋｂ ＨＩＶ ｇＲＮＡ及び３～７ｋｂの有意に短縮されたｇＲＮＡなどの高度にヘテロ接合性のｇＲＮＡ鎖間の組換えは、プロウイルス組み込み前の遮断のためにウイルス子孫を産生できない（アン（Ａｎ）ら著、１９９９年）。この分子所見は、マウスモデル（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら著、２００４年）及びヒト臨床試験（リバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら著、２００６年）のデータと一致しており、どちらも野生型ＨＩＶと、より短いレンチウイルスベクターとの間の組換えを検出しなかった。本発明者らの予備データ（下記）も、推定ＴＩＰ、Ｆ１、及びＨＩＶ間の組換えを示していない。
疑似二倍体であるレンチウイルスは、逆転写中に組換えることができる２つのゲノムＲＮＡ鎖を有する。レンチウイルスの組換えには、配列に有意な相同性が必要であるようであり、１つの完全長９．７ｋｂ ＨＩＶ ｇＲＮＡ及び３～７ｋｂの有意に短縮されたｇＲＮＡなどの高度にヘテロ接合性のｇＲＮＡ鎖間の組換えは、プロウイルス組み込み前の遮断のためにウイルス子孫を産生できない（アン（Ａｎ）ら著、１９９９年）。この分子所見は、マウスモデル（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら著、２００４年）及びヒト臨床試験（リバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら著、２００６年）のデータと一致しており、どちらも野生型ＨＩＶと、より短いレンチウイルスベクターとの間の組換えを検出しなかった。本発明者らの予備データ（下記）も、推定ＴＩＰ、Ｆ１、及びＨＩＶ間の組換えを示していない。
【0205】
Ｆ１ ＤＩＰの発見
ＴＩＰは、耐性に対する高い遺伝的障壁を備えた単回投与療法として機能する可能性を有する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年；ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）。ＴＩＰ療法の潜在的な利点を考慮して、本発明者らは、ＨＩＶ ＴＩＰの候補を特定することに着手した。理想的には、本発明者らは、既存のＤＩＰを上記の基準を満たすように変更したかったが（すなわち、高伝達及びウイルス増殖の１ログ低減）、文献に記載されているＨＩＶ「ＤＩＰ」は伝達しない。
ＴＩＰは、耐性に対する高い遺伝的障壁を備えた単回投与療法として機能する可能性を有する（メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年；ラスト（Ｒａｓｔ）ら著、２０１６年；ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年；ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）。ＴＩＰ療法の潜在的な利点を考慮して、本発明者らは、ＨＩＶ ＴＩＰの候補を特定することに着手した。理想的には、本発明者らは、既存のＤＩＰを上記の基準を満たすように変更したかったが（すなわち、高伝達及びウイルス増殖の１ログ低減）、文献に記載されているＨＩＶ「ＤＩＰ」は伝達しない。
【0206】
ＤＩＰが検出可能なレベルに達するまでに約５０日かかり得るＨＩＶのモデルに基づき（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）、ＣＥＭ Ｔ細胞でＨＩＶを長期間培養するための連続リアクターシステムを構築した（図３）。リアクターは感染細胞数にフォン・マグナス（ｖｏｎ Ｍａｇｎｕｓ）様の振動を発生させ（図３）、生存細胞で約２．５ｋｂの欠失（フラスコ１のＦ１と呼ぶ）を検出した。特に、Ｆ１の欠失は繰り返し発生し（すなわち、その後の５回の実験で）、以前にシーケンシングされた患者試料には出現しておらず（ブルーナー（Ｂｒｕｎｅｒ）ら著、２０１６年；コーン（Ｃｏｈｎ）ら著、２０１５年；ホー（Ｈｏ）ら著、２０１３年；ポラック（Ｐｏｌｌａｃｋ）ら著、２０１７年）、以下に説明するスクリーニング（図４～６）は、可能な説明を提供する。
【0207】
ＨＩＶ Ｆ１ ＤＩＰのＴＩＰへの改変
予備データは、Ｆ１ ＤＩＰがＨＩＶに干渉する一方で、トランスでＨＩＶによって効率的に動員されなかったことを示した（すなわち、そのＲ０＜１）。したがって、ＴＩＰの基準を満たすために、Ｆ１のさらなる改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）が必要であった。Ｆ１をＴＩＰへと改変するために、２つのアプローチ：（ｉ）ランダム欠失ライブラリのスクリーニング、及び（ｉｉ）スプライシングアブレーション、を利用した。
予備データは、Ｆ１ ＤＩＰがＨＩＶに干渉する一方で、トランスでＨＩＶによって効率的に動員されなかったことを示した（すなわち、そのＲ０＜１）。したがって、ＴＩＰの基準を満たすために、Ｆ１のさらなる改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）が必要であった。Ｆ１をＴＩＰへと改変するために、２つのアプローチ：（ｉ）ランダム欠失ライブラリのスクリーニング、及び（ｉｉ）スプライシングアブレーション、を利用した。
【0208】
ｉ）ランダムライブラリスクリーニング。効率的な動員に必要なＨＩＶの領域を体系的に同定するために、本発明者らは、ランダム化された欠失スクリーニング（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）著、２０１７年）を利用して、ＨＩＶ ＮＬ４－３のランダム欠失ライブラリを作製及びインデックス付けした（図４）。簡単に説明すると、トランスポゾンを介したランダム挿入にプラスミドＤＮＡを供し、続いてトランスポゾンを切除し、露出した末端を、エキソヌクレアーゼを介して消化して、それぞれ可変サイズのランダムな遺伝子位置を中心とする欠失を作製した。次に、プラスミドを２０ヌクレオチドのランダムＤＮＡバーコードを含むカセットと共に再ライゲーションして、欠失を「インデックス付け（ｉｎｄｅｘ）」する。インデックス付けは、欠失領域を（ゲノム配列とバーコードの接合部によって）簡単に特定し、ディープシーケンシングによって追跡／定量化できるため、重要である。
【0209】
ランダム化されたバーコードライブラリは、約１２０，０００の変異体をもたらした（図５に示す完全ライブラリの１５％サブセット）。ｐＮＬ４－３プラスミドの欠失は、プラスミドの複製起点／ベータラクタマーゼを除いてプラスミド全体で発生する。これは、これらの領域の欠失が細菌で強く選択されていることを考慮すると予想される（これらの領域は実験用の天然対照）。平均欠失サイズは１．４ｋｂであったが、最大６ｋｂの範囲であった（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）著、２０１７年）。
【0210】
ライブラリのスクリーニングは、ヘルパーウイルスとして作用する複製能を有するＨＩＶの存在下、インビトロで高ＭＯＩ（ＭＯＩ＝５）継代を繰り返すことによって実施された（すなわち、ＲＮＡウイルスの古典的なＤＩＰ分離アプローチ）。以前のアプローチと同様に、ＭＯＩ＝５を使用して、トランスで補完される可能性を有する欠陥変異体が、複製能を有するＨＩＶによる重感染時に増幅する機会を有することを確認した（複製能を有するウイルスも選択されるが、その後フィルターで除外される）。バーコードは、１２継代後のディープシーケンシングによって分析された（図６Ａ）。簡単に説明すると、バーコード欠失ライブラリは、２９３Ｔ細胞のウイルス様レンチウイルス粒子にパッケージ化され、Ｔ細胞株（ＭＴ－４）の形質導入に使用された。その後、細胞から細胞への移入及び無細胞移入の両方によって、ＭＴ－４細胞を高ＭＯＩ（ＭＯＩ＞５）で１２回継代した。ウイルスＲＮＡは定期的な時点で上清から分離され、バーコードカセットのイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングを介してディープシーケンシングされ、各継代後の欠失深度ランドスケープの計算を可能にした。バーコード欠失が各塩基にまたがる頻度は、ＤＮＡディープシーケンシング資料の「読み取り深度」に類似した「欠失深度」によって与えられる。９～１２継代の間で、欠失ランドスケープは安定し、単一塩基分解能で、欠失に耐性のないＨＩＶゲノム領域（シス作用エレメント）及び欠失に耐性のある領域（トランス作用エレメント）のマップを生成できるようになった（図６Ｂ）（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びノットン（Ｎｏｔｔｏｎ）著、２０１７年）。ランドスケープは、公知のシス作用エレメント（例えば、ＲＲＥ、Ψ、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）を再現し、ｃＰＰＴ／ＣＴＳは、ｐｏｌからｖｐｒにわたるＦ１欠失内に直接的に位置するため、最も顕著である（図３）。ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントは核輸送を補助することが知られているため（ダーダルホン（Ｄａｒｄａｌｈｏｎ）ら著、２００１年）、本発明者らは、それをＦ１削除に再挿入して、Ｆ１ｃＰＰＴを生成した。本発明者らは、これはＴＩＰを構成し得ると仮定した。
【0211】
ｉｉ）ＨＩＶスプライシングのアブレーション。次に、Ｆ１ ｇＲＮＡ産生を強化するために、ＨＩＶの調節回路の最近のマッピング（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら著、２０１８年ａ）を構築し、ＨＩＶスプライシングが偏性的に転写後であることを示した（図７）。本発明者らは、Ｆ１ｃＰＰＴのスプライスアクセプター部位を変異させて、Ｆ１ ｇＲＮＡスプライシングを制限し、ｇＲＮＡのみを生成した。以下で言及される全てのＦ１ｃＰＰＴベクターは、変異したスプライスアクセプター部位をコードする。本発明者らは、スプライシングされたＨＩＶｇ ＲＮＡと比較して、Ｆ１ｃＰＰＴｇＲＮＡの細胞内存在量を増やすことにより、Ｆ１ｃＰＰＴがより効率的にパッケージングされると仮定した。
【0212】
Ｆ１ｃＰＰＴ組換え体。Ｆ１ｃＰＰＴ組換え体（図８Ａ）はＨＩＶによってトランス補完され（図８Ｂ）、驚くべきことに、ＨＩＶ感染力価の１ログ低減を誘発した（図８Ｃ）。細胞質及び上清ｇＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析により、Ｆ１ｃＰＰＴが、ＨＩＶより多くのｇＲＮＡをビリオン粒子にパッケージ化したことが示された（図８Ｄ）。
【0213】
Ｆ１ｃＰＰＴは、ＨＩＶが新しい細胞に動員すること要する。動員効率を定量化するために、本発明者らは、共培養アッセイを開発した。ｍＣｈｅｒｒｙレポータを安定的に発現するナイーブＣＥＭ標的細胞は、Ｆ１ｃＰＰＴ（ＧＦＰレポータを輸送）で前形質転換された細胞と共培養した。共培養の２日後、ＨＩＶ感染の存在下でのみ、二重陽性（ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＦＰ＋）細胞の大きい画分が観察された（図９）。
【0214】
Ｆ１ｃＰＰＴは、Ｒ０＞１（ＴＩＰの基準を満たす）を示す。Ｆ１ｃＰＰＴのＲ０を決定するために、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞へのＦ１ｃＰＰＴの伝播を（ＧＦＰによって）定量化した。簡単に説明すると、Ｆ１ｃＰＰＴで形質導入された細胞は、ＨＩＶ－ＢＦＰに感染し、ナイーブｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞で１０：９０に希釈された。これが行われたのは、Ｒ０の正式な定義が、大多数の細胞が感染しやすい場合（すなわち、初期感染）にのみ当てはまるためである。並行して、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞によるＦ１ｃＰＰＴの伝播速度（ＧＦＰによる）の動態も測定した。両方のアプローチは、Ｆ１ｃＰＰＴにつきＲ０＞１の測定値を与え、ＨＩＶのＲ０がＦ１ｃＰＰＴの存在下で低減することを示した（図１０）。
【0215】
Ｆ１ｃＰＰＴは、長期培養においてＨＩＶに効率的に干渉し、共進化の可能性のある兆候を示す。Ｆ１ｃＰＰＴが複数ラウンドの伝播感染でＨＩＶを阻害できるかを判断するために、ＣＥＭ Ｔ細胞リアクターアプローチ（図３）を使用した。リアクターに、Ｆ１ｃＰＰＴで予め形質導入した細胞の画分を播種した。Ｆ１ｃＰＰＴ細胞を１：１で播種すると、リアクターを介して伝播するＨＩＶの実質的な阻害があり（図１１）、Ｆ１ｃＰＰＴは細胞の５０％超に動員された。５％及び１０％のＦ１ｃＰＰＴでリアクターに播種すると、ＨＩＶへの干渉も示されたが、理論（ルージン（Ｒｏｕｚｉｎｅ）及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）著、２０１３年；ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年）によると、このような播種画分で完全阻害が見られるまでに５０～１００日かかると予測される。驚くべきことに、２５日目ごろ、Ｆ１ｃＰＰＴリアクターは、ＨＩＶ感染細胞の有意な増加を示し、１０日後に低下した。これらのタイプの動的な「ブリップ（ｂｌｉｐｓ）」は、バクテリオファージと大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の間の共進化的軍拡競争の標準的な特徴である（レンスキー（Ｌｅｎｓｋｉ）及びレビン（Ｌｅｖｉｎ）著、１９８５年）。
【0216】
Ｆ１は、作用の複数のメカニズムによって干渉する。Ｆ１がＨＩＶにどのように干渉するか、またそれ自体のｇＲＮＡのカプシド形成を強化するために、本発明者らは、一連の生化学的及び変異的研究を開始した。
【0217】
Ｆ１トランケーションタンパク質が必要であり、完全なＲＴ欠失は表現型を再現しない。Ｆ１欠失は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子をトランケートしたため（図１２Ａ）、本発明者らはまずＦ１を有する及び有しないウイルス上清中のＲＴ活性を分析した。予想通り、ＲＴ活性はＦ１上清で有意に低減された（図１２Ｂ）。しかし、ＲＴがＦ１から完全に欠失した場合（Ｆ１ΔＲＴ；Ｆ１欠失の拡大）、部分的なＨＩＶ干渉のみが生じた（図１２Ｃ）。これらのデータは、ＲＴが干渉表現型を完全に説明しておらず、Ｆ１がドミナントネガティブタンパク質として部分的に作用しているようであることを示す。
【0218】
Ｆ１はＧａｇプロセシングに干渉する。特定の非ヌクレオシドＲＴ阻害剤（例えば、エファビレンツ）はＧａｇ－Ｐｏｌポリタンパク質プロセシングを誤調節するため（フィゲイレード（Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ）ら著、２００６年）、本発明者らは、Ｆ１もＧａｇ－Ｐｏｌプロセシングを妨害するか試験した（図１３）。Ｆ１培養物が上清中に同様のレベルのｐ２４カプシドタンパク質を産生し、同様のｇＲＮＡ：ｐ２４比を示すにもかかわらず（図１３Ｂ）、ウエスタンブロット分析は、Ｇａｇタンパク質分解切断における重度の欠陥を示し（図１３Ｃ）、これは、Ｇａｇプロセシングの欠陥が強力なドミナントネガティブであることと一致する（リー（Ｈｏ）ら著、２００９年）。全体的なＧａｇポリタンパク質翻訳の顕著な増加は、Ｆ１の存在下でも観察され（図１３Ｃ）、リボソーム分画によってさらに調査される。
【0219】
Ｆ１トランケーションタンパク質は、ビリオン中にパッケージングされている。次に、トランケート型Ｆ１タンパク質がビリオン粒子にパッケージ化されているかどうかを試験するためのアッセイを開発した。ビリオン粒子のウエスタンブロット分析は、トランケート型タンパク質がビリオン粒子に存在することを示した（図１４）。
【0220】
Ｆ１及びＨＩＶビリオン粒子の電子顕微鏡検査
「ハイブリッド」ＨＩＶ－Ｆ１ｃＰＰＴビリオン粒子は、変異体Ｆ１タンパク質及びＲＮＡゲノムの取り込みがビリオンの超構造に影響を与えるかを決定し、ビリオン形態形成のどの段階が変更されるかを定義するために、サンキスト（Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ）研究所（ユタ大学）での電子顕微鏡検査によって特徴付けられる。
「ハイブリッド」ＨＩＶ－Ｆ１ｃＰＰＴビリオン粒子は、変異体Ｆ１タンパク質及びＲＮＡゲノムの取り込みがビリオンの超構造に影響を与えるかを決定し、ビリオン形態形成のどの段階が変更されるかを定義するために、サンキスト（Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ）研究所（ユタ大学）での電子顕微鏡検査によって特徴付けられる。
【0221】
通常のＨＩＶビリオンの形態形成中に、ウイルスのＧａｇポリタンパク質は原形質膜で集合し、膜中にエンベロープ化され、細胞から出芽し、Ｇａｇプロセシング後に成熟した円錐形のウイルスカプシドを集合させる（サンキスト（Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ）及びクラウスリッチ（Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ）著、２０１２年）。したがって、成熟した感染性ＨＩＶ粒子は、薄切片ビリオンの電子顕微鏡写真で見ることができる中央の円錐形のカプシドを含む（図１５Ａ）。この成熟した感染状態に到達できないビリオンは、生合成の異なる段階で止まる可能性があり、サンキスト（Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ）研究所は以前に、異なる必須の宿主因子との異常な相互作用のために、（ｉ）エンベロープ化中に失敗した（図１５Ｂ）（メルセン（Ｍｅｒｃｅｎｎｅ）ら著、２０１５年）、（ｉｉ）出芽（図１５Ｃ）（ガラス（Ｇａｒｒｕｓ）ら著、２００１年）、及び（ｉｉｉ）成熟（図１５Ｄ）（ハイアット（Ｈｉａｔｔ）ら著、２０１９年）ＨＩＶビリオンを特徴づけた。
【0222】
Ｆ１ｃＰＰＴの存在下で産生された薄切片ＨＩＶビリオンの形態は、カプシド可視化を最適化するように設計された染色プロトコルを使用して調べられる（フラド（Ｊｕｒａｄｏ）ら著、２０１３年）。対照として、野生型ＨＩＶ粒子及び純Ｆ１ｃＰＰＴウイルス様粒子（ＶＬＰ）を並行して調べ、全てのビリオン表現型を定量的にスコアリングする（ハイアット（Ｈｉａｔｔ）ら著、２０１９年；メルセン（Ｍｅｒｃｅｎｎｅ）ら著、２０１５年）。薄切片化したＦ１ｃＰＰＴＤＩＰ／ＨＩＶハイブリッド粒子で形態学的欠陥が観察された場合、これらのビリオンは、投影画像及び電子クライオトモグラフィー（ＥＣＴ）の両方で、クライオＥＭによって高解像度且つその天然状態で画像化される。後者のアプローチでは、アセンブリの３Ｄ空間特性及び成熟異常を視覚化できる。本発明者らは、以前にＥＣＴ再構成を実施して成熟（ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）ら著、２００５年）及び未成熟（ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら著、２００７年）のＨＩＶ粒子（ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）を使用）を特徴付け、エンベロープ化タンパク質ナノ粒子を設計した（ボッテラー（Ｖｏｔｔｅｌｅｒ）ら著、２０１６年）（本発明者ら）。ＨＩＶビリオンを再構築するためのアプローチは急速に進歩しており（ハーゲン（Ｈａｇｅｎ）ら著、２０１６年；マッテイ（Ｍａｔｔｅｉ）ら著、２０１６年；シュール（Ｓｃｈｕｒ）ら著、２０１６年）、本発明者らは、現在、Ｋ２検出器及びエネルギーフィルターを備えたタイタン・クリオス（Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（商標））顕微鏡を使用して、可能な限り最高の解像度の再構成を行うことができる。シリアルＥＭ（ＳｅｒｉａｌＥＭ）（マストロナーデ（Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ）著、２００５年）は、低線量モードを使用した傾斜系列取得の自動化に使用され、断層像はＩＭＯＤソフトウェアパッケージ（クレマー（Ｋｒｅｍｅｒ）ら著、１９９６年）を使用して生成及び処理され、セグメンテーション及びレンダリングはアミラ（Ａｍｉｒａ（商標））（ＦＥＩ）で実施される。まとめると、これらの実験は、Ｆ１トランケーションタンパク質と野生型ＨＩＶ Ｇａｇの共集合が粒子の形態を変化させ、異常が発生する段階を定義し、可能な限り最高の解像度でそれらの構造を視覚化するかを示す。
【0223】
ＨＩＶ及びＦ１ビリオンプロテオームの質量分析
Ｆ１ｃＰＰＴがビリオンのタンパク質組成又はポリプロテインのプロセシングを変更することによって干渉するかを評価するために、質量分析ベースのプロテオミクスアプローチを使用して、ビリオンのタンパク質組成及びプロセシング状態をネバン・クローガン（Ｎｅｖａｎ Ｋｒｏｇａｎ）博士（グラッドストーン／カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ））と共に測定する。
Ｆ１ｃＰＰＴがビリオンのタンパク質組成又はポリプロテインのプロセシングを変更することによって干渉するかを評価するために、質量分析ベースのプロテオミクスアプローチを使用して、ビリオンのタンパク質組成及びプロセシング状態をネバン・クローガン（Ｎｅｖａｎ Ｋｒｏｇａｎ）博士（グラッドストーン／カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ））と共に測定する。
【0224】
クローガン（Ｋｒｏｇａｎ）研究室（カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ））は、ＨＩＶタンパク質間相互作用ネットワークを決定するための質量分析プロテオミクスアプローチを開発し（チョウ（Ｃｈｏｕ）ら著、２０１３年；イェーガー（Ｊａｇｅｒ）ら著、２０１１年ａ；イェーガー（Ｊａｇｅｒ）ら著、２０１１年ｂ）、最近、ビリオンのタンパク質組成をアッセイするためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳ質量分析を適用した（図１６）。分析により、ビリオンにパッケージされた予想されるウイルス成分（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｐｒ、及びＮｅｆ）及び宿主成分（例えば、ＡＬＩＸ、シクロフィリンＡ、クラスリン）が特定された。ＨＩＶ Ｇａｇペプチドは、大半の切断部位にわたるペプチドを含め、一次配列の８５％超を占めていた。
【0225】
本発明者らは、Ｆ１ｃＰＰＴの存在下及び非存在下で産生されたＨＩＶビリオンのタンパク質組成及びタンパク質処理状態の違いを定量化するために同様のアプローチを適用している。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、純Ｆ１ｃＰＰＴをパッケージ化するために使用されるか、又はＨＩＶ及びＦ１ｃＰＰＴハイブリッドを共パッケージ化するために使用される（空のプラスミドは、精製手順によって濃縮された非ビリオンタンパク質を差し引くために使用される）。全ての実験は生物学的に３回実施される。精製されたビリオン又はＶＬＰは、ＦＬＡＱアッセイを使用してｐ２４で正規化され、トリプシンで消化され、オービトラップ・フュージョンＭＳ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標） ＭＳ）システムでＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析される。本発明者らの以前の研究と同様に、ペプチド配列は生の質量スペクトル、マックスクアント（ＭａｘＱｕａｎｔ）によって抽出された強度、及びＭＳスタッツ（ＭＳｓｔａｔｓ）パッケージを使用して実施された統計分析と照合され、Ｆ１ｃＰＰＴの存在下と非存在下で産生されたビリオンが差次的に豊富なタンパク質及び切断部位にまたがるペプチドが同定される。
【0226】
Ｆ１ ＲＮＡパッケージングのシングルビリオンイメージング
ビリオンへのＲＮＡパッケージングにおけるＦ１ｃＰＰＴの効果は、ＳＶＡのパイオニアであるウェイ・シャウ・フー（Ｗｅｉ－Ｓｈａｕ Ｈｕ）博士（ＮＣＩ／ＮＩＨ）と共にイメージングベースの単一ビリオン分析（ＳＶＡ）によって測定される（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２００９年）。ＳＶＡイメージングアプローチ（図１７）は、ＨＩＶビリオン粒子の９０％超が２つのウイルスＲＮＡをパッケージ化することを示した（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２００９年）。最近では、本発明者らは、ＳＶＡを、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を使用した生細胞イメージングに拡張して、（ｉ）ＨＩＶ ＲＮＡは細胞質ではなく原形質膜で二量体化すること、（ｉｉ）ＲＮＡ二量体の安定化にはＧａｇタンパク質が必要であること、（ｉｉｉ）二量体化はウイルス集合の初期段階で発生すること、及び（ｉｖ）二量体化は２つのＲＮＡではなく２つのＲＮＡ－Ｇａｇ複合体の相互作用によって媒介されることを示した（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２０１６年）。
ビリオンへのＲＮＡパッケージングにおけるＦ１ｃＰＰＴの効果は、ＳＶＡのパイオニアであるウェイ・シャウ・フー（Ｗｅｉ－Ｓｈａｕ Ｈｕ）博士（ＮＣＩ／ＮＩＨ）と共にイメージングベースの単一ビリオン分析（ＳＶＡ）によって測定される（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２００９年）。ＳＶＡイメージングアプローチ（図１７）は、ＨＩＶビリオン粒子の９０％超が２つのウイルスＲＮＡをパッケージ化することを示した（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２００９年）。最近では、本発明者らは、ＳＶＡを、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を使用した生細胞イメージングに拡張して、（ｉ）ＨＩＶ ＲＮＡは細胞質ではなく原形質膜で二量体化すること、（ｉｉ）ＲＮＡ二量体の安定化にはＧａｇタンパク質が必要であること、（ｉｉｉ）二量体化はウイルス集合の初期段階で発生すること、及び（ｉｖ）二量体化は２つのＲＮＡではなく２つのＲＮＡ－Ｇａｇ複合体の相互作用によって媒介されることを示した（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２０１６年）。
【0227】
ＳＶＡイメージングは、Ｆ１又はＦ１ｃＰＰＴの存在下及び非存在下でＦ１ｃＰＰＴＲＮＡパッケージングをＨＩＶ ＲＮＡパッケージングと比較するために使用される。記載されているように（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２００９年）、ＳＶＡは２つの蛍光タンパク質標識を使用する（図１７Ａ）。ＨＩＶ（ＮＬ４３）及びＦ１／Ｆ１ｃＰＰＴは、Ｂｇｌステムループ（ＢＳＬ）又はＭＳ２ステムループ（ＭＳＬ）のセットをコードするために再クローン化される。ＢＳＬ及びＭＳＬは、それぞれＲＮＡ結合コートタンパク質Ｂｇｌ及びＭＳ２によって認識され、その同族のステムループに結合すると、コートタンパク質の点状病巣への局在化が触媒される。Ｂｇｌ及びＭＳ２コートタンパク質をＹＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙに融合させると、ＹＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ点をフォローすることでＲＮＡを視覚的に追跡できる。これにより、（ｉ）２つのＨＩＶ ＲＮＡを含むビリオン（同倍数体）、（ｉｉ）２つのＦ１ｃＰＰＴＲＮＡを含むビリオン（同倍数体Ｆ１）、及び（ｉｉｉ）１つのＨＩＶ及びＦ１ｃＰＰＴＲＮＡを含むビリオン（ヘテロ二倍体）の画分の定量化が可能になる。
【0228】
さらに、説明されているように、セルリアン蛍光タンパク質（ＣｅＦＰ）へのＧａｇ融合（タグ付きとタグなしの両方のＧａｇを使用して、ウイルス粒子の正常な形態を確保する）により、ＨＩＶ及びＦ１ｃＰＰＴＲＮＡがＧａｇでどのように局在するかの細胞内動態のＴＩＲＦ顕微鏡による時空間分析が可能になる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、２０１６年）。Ｆ１ｃＰＰＴＲＮＡの翻訳効率は、フー（Ｈｕ）実験室が最近ＨＩＶに適合させたポリソーム画分によってもアッセイされる。このようにして、本発明者らは、Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶ ＲＮＡとのパッケージングについて単純に化学量論的に競合しているか、又はＧａｇ及びカプシドに対する１人あたりのＲＮＡ親和性が強化されているかを決定する。
【0229】
広範囲のＨＩＶ患者分離株及び細胞にわたるＦ１干渉を定量化する
形質転換細胞株及びＨＩＶ実験室株は便利なツールであるが、インビボでの感染の生物学的複雑性を反映していない。したがって、初代のヒト及び患者の細胞の使用が標準となっている。ここでは、患者の細胞及びウイルス分離株におけるＦ１ｃＰＰＴの有効性の調査に焦点を当てる。
形質転換細胞株及びＨＩＶ実験室株は便利なツールであるが、インビボでの感染の生物学的複雑性を反映していない。したがって、初代のヒト及び患者の細胞の使用が標準となっている。ここでは、患者の細胞及びウイルス分離株におけるＦ１ｃＰＰＴの有効性の調査に焦点を当てる。
【0230】
ドナー由来のαＣＤ３／２８活性化初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞における本発明者らの以前のＨＩＶ研究（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら著、２０１８年ａ；ラズーキー（Ｒａｚｏｏｋｙ）ら著、２０１５年）に基づいて、本発明者らは、Ｆ１ｃＰＰＴＴＩＰがインビボでヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶに干渉し得ることを確認した（図１９のマウスデータの初期実験）。さらに、本発明者らは、Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶ－２由来のＳＩＶｍａｃ２３９分子クローンによってトランス活性化され、ＣＥＭｘ１７４細胞においてＳＩＶに有意に干渉することを見出した（図１８）。ＨＩＶ－２とＨＩＶ－１の間の配列相違を考慮すると、ＨＩＶ－２に干渉するＦ１の能力は、ＨＩＶ－１サブタイプの広い範囲に干渉し得ると議論される。
【0231】
多様なＨＩＶ患者ウイルス分離株に対するＦ１ｃＰＰＴの効果。患者の細胞は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）のＳＣＯＰＥコホート（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００１８７５１２）から取得される。本発明者らが以前に説明したように、患者のＣＤ４＋Ｔ細胞は、大量（２２０ｍＬ）の採血から分離される（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら著、２０１３年）。患者間のばらつきを説明するために、Ｆ１ｃＰＰＴは≧１０人の患者試料で試験される。細胞はＰＭＡ／イオノマイシン活性化され、Ｆ１ｃＰＰＴ又はシャムベクターで形質導入され、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬データベース（カタログ番号１８０１３０）から得られた国際的分離株（サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及び循環組換え体を含む）のパネルからの１０の主要な患者ウイルス分離株に感染させた。健常ドナーからの細胞を使用することもできるが、感染した患者からの細胞での試験は、Ｆ１ｃＰＰＴ機能を阻害し得る慢性的に感染したＡＲＴ処置を受けた患者の細胞における潜在的な生理学的差異を説明する。全ての分離株について、患者細胞からのＨＩＶ増殖は、プローブベースのｑＰＣＲを使用した限界希釈増殖アッセイによって定量化される（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら著、２０１８年ａ）。Ｆ１ｃＰＰＴビリオンもｐ２４を輸送する（ｃａｒｒｙ）ため、ｐ２４を測定する標準ＱＶＯＡをわずかに変更する。
【0232】
患者細胞からのウイルス増殖に対するＦ１ｃＰＰＴの効果。記載されているように（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら著、２０１３年）、患者細胞からのＨＩＶ増殖は、Ｆ１ｃＰＰＴ形質導入の存在下／非存在下で直接定量化される。さらに、未処置の患者（ウイルス量＞１０３コピー／ｍＬ）からの過去の凍結保存された細胞ストックは、Ｆ１ｃＰＰＴ形質導入され、ＰＭＡ／イオノマイシン活性化され、上記のように増殖が定量化される。ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）及びディークス（Ｄｅｅｋｓ）研究室は、潜伏期逆転及びウイルス増殖の定量化において豊富な経験を有する（ダール（Ｄａｒ）ら著、２０１４年；エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら著、２０１３年）。患者間のばらつきを説明するために、≧１０人の患者試料が試験される。
【0233】
ヒト化マウスモデルにおける経時的なＦ１干渉及び共進化の定量化
Ｆ１ｃＰＰＴ干渉の長期持続時間、共進化のダイナミクス（ｃｏ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ）、及び潜在的な遺伝子毒性は、ジョン・バーネット（Ｊｏｈｎ Ｂｕｒｎｅｔｔ）（シティ・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ））及びポーラ・キャノン（Ｐａｕｌａ Ｃａｎｎｏｎ）（南カリフォルニア大学）と共にｈｕ－ＨＳＰＣ ＮＳＧマウスモデルでアッセイされる。複数の組織断片を共移植するために複雑な外科的処置を必要とする骨髄肝胸腺（ＢＬＴ）マウス（デントン（Ｄｅｎｔｏｎ）ら著、２０１２年）と比較して、ｈｕ－ＨＳＰＣ ＮＳＧマウスはそのような外科手術を必要とせず、実験ごとにより多くの数の動物を研究することができる（ＦＤＡ承認の重要な考慮事項）。
Ｆ１ｃＰＰＴ干渉の長期持続時間、共進化のダイナミクス（ｃｏ－ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ）、及び潜在的な遺伝子毒性は、ジョン・バーネット（Ｊｏｈｎ Ｂｕｒｎｅｔｔ）（シティ・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ））及びポーラ・キャノン（Ｐａｕｌａ Ｃａｎｎｏｎ）（南カリフォルニア大学）と共にｈｕ－ＨＳＰＣ ＮＳＧマウスモデルでアッセイされる。複数の組織断片を共移植するために複雑な外科的処置を必要とする骨髄肝胸腺（ＢＬＴ）マウス（デントン（Ｄｅｎｔｏｎ）ら著、２０１２年）と比較して、ｈｕ－ＨＳＰＣ ＮＳＧマウスはそのような外科手術を必要とせず、実験ごとにより多くの数の動物を研究することができる（ＦＤＡ承認の重要な考慮事項）。
【0234】
ジム・ライリー（Ｊｉｍ Ｒｉｌｅｙ）博士（ペンシルベニア大学）と共に、本発明者らは、最近、ＨＩＶ ｈｕ－ＰＢＬマウスモデルで予備実験を完了した（図１９ａ）。Ｆ１ｃＰＰＴ及びより広範なスプライシングアブレーションを備えたバージョン（Ｆ１ｓｐｌｉｃｅ）はいずれも、１．５～２ログでＨＩＶを阻害し、１ログ超でＣＤ４＋Ｔ細胞を保護した（図１９ｂ～ｄ）。同様の結果が第２の反復実験で観察された（図示せず）。しかし、ｈｕ－ＰＢＬは短期モデルであり、マウスは約５～６週間で、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）で死亡する。バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ）及びキャノン（Ｃａｎｎｏｎ）研究室は、ＨＩＶチャレンジヒト化ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスでＨＩＶ治療戦略を試験するためのインビボモデルシステムを確立した（アッキナ（Ａｋｋｉｎａ）ら著、２０１６年；ホルト（Ｈｏｌｔ）ら著、２０１０年；サティーサン（Ｓａｔｈｅｅｓａｎ）ら著、２０１８年）。重要なことに、ｈｕ－ＮＳＧマウスは、ＨＩＶ潜伏期を再現し、ＧＶＨＤなしで約４０週間ウイルス血症を維持し、比較的安定的なセットポイントのウイルス血症を確立することができ（図２０）、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ）博士及びワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）博士には、共同研究の経歴を有する（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００５年）。
【0235】
ｈｕ－ＨＳＰＣ ＮＳＧマウスの研究：長期のＦ１干渉を試験するために、記載されているようにｈｕ－ＮＳＧマウスを調製する（石川（Ｉｓｈｉｋａｗａ）ら、２００５年）。オス及びメスのマウスは、細胞生着における性別の偏りを説明するために、全ての実験群及び対照群で均等に分配される。生着後１２～１４週間で、ヒト化マウスをＩＰ注射による１００～２００ｎｇのｐ２４のＨＩＶ－１ＢａＬでチャレンジする。感染後３～４週間で、動物にｇｐ１２０ ｅｎｖシュードタイプ化Ｆ１ｃＰＰＴ又はシャムベクターを１０８ＩＵの尾静脈注射によりインビボで形質導入する。初期の形質導入効率は、ＧＦＰ発現についてＦＡＣＳによってアッセイされ、最近のｄｄＰＣＲアッセイであるインタクトプロウイルス検出アッセイ、ＩＰＤＡ（ブルーナー（Ｂｒｕｎｅｒ）ら著、２０１９年）は、インタクトなＦ１ｃＰＰＴ及びＨＩＶプロウイルスを有する細胞を定量化するように適合されている。
【0236】
ＨＩＶウイルス血症、細胞数、及びサイトカインプロファイル（ＥＬＩＳｐｏｔ／ＦｌｕｏｒＳｐｏｔによる）は、Ｆ１ｃＰＰＴ及びシャム形質導入マウスの末梢血（眼窩後出血によって収集）から毎週アッセイされる。４０週目に、マウスを剖検して脾臓、肝臓、骨髄、腸、及び脳を回収し、ｄｄＰＣＲによるＨＩＶ及びＦ１ｃＰＰＴｇＤＮＡの分析を行う。本発明者らは、これらの組織で持続的なＨＩＶ感染を観察した（サティーサン（Ｓａｔｈｅｅｓａｎ）ら著、２０１８年）。
【0237】
シーケンシングによる共進化分析：マウスの血液／組織から収集された完全長ｇＤＮＡは、配列共進化の可能性のあるシグネチャにつき、パックビオ（ＰａｃＢｉｏ（登録商標））ＲＳＩＩ単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングシステム（シティ・オブ・ホープ・シーケンシングコア（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ））で分析される（例えば、Ｆ１及びＨＩＶ ＧａｇのｄＮ／ｄＳ分析）。この分析は、ＨＩＶ配列サブセットがＦ１ｃＰＰＴ処置された動物でより急速に進化しているかどうか、及びＦ１ｃＰＰＴがその親シーケンスから分岐しているか、又はどのように分岐しているかを決定する。パックビオ（ＰａｃＢｉｏ）テクノロジーは、ＮＧＳのディープマスパラレルシーケンシングとロングシーケンシングリード（＞１０ｋｂ）を組み合わせ、最大４０の異なる完全長ＨＩＶ－１ゲノムの混合物を同時にシーケンシングできる（ジラーニア（Ｄｉｌｅｒｎｉａ）ら著、２０１５年）。グラッドストン・ゲノミクス・コア（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ）は、パックビオ（ＰａｃＢｉｏ）データ（トマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら著、２０１４年）の分析に豊富な経験を有し、本発明者らの取り組みを支援する。
【0238】
分析的治療中断（ＡＴＩ）：潜在的なヒト臨床試験（ＮＣＴ０３６１７１９８）の構造を模倣するために、ＡＲＴを受けているｈｕ－ＮＳＧマウスでＡＴＩ研究が実施される。本発明者らは、ＨＩＶ感染マウスへのＡＲＴの経口送達のプロトコルを確立し、ＡＲＴ中の潜伏を示した（図２０）：血清中の検出不能なＨＩＶ ＲＮＡ及びＡＲＴ中断後２～４週間の強力且つ迅速なウイルスリバウンド（サティーサン（Ｓａｔｈｅｅｓａｎ）ら著、２０１８年）。ＨＩＶチャレンジの４週間後、マウスにＦ１ｃＰＰＴを注入し、８週間後にウイルス血症が検出されなくなるまでＡＲＴを投与する。ＡＲＴは４～６週間後に中断され、ＨＩＶ ｖＲＮＡは４０週まで定量化されて、Ｆ１ｃＰＰＴがＨＩＶリバウンドを遅延又は制御するかを判断する。４０週目に、組織分析のためにマウスを剖検する。
【0239】
【表1-1】
【0240】
【表1-2】
【0241】
【表2-1】
【0242】
【表2-2】
【0243】
【表3-1】
【0244】
【表3-2】
【0245】
【表4-1】
【0246】
【表4-2】
【0247】
実施例２：材料及び方法
細胞株。全ての細胞は、５％ＣＯ２で、３７℃で増殖させた。ＭＴ－４（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム、１２０）及びＣＥＭ ＣＤ４＋（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム、１１７）細胞は、１０％ＦＢＳ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ３５０１１ＣＶ）及び１％Ｐｅｎ ／Ｓｔｒｅｐ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ３０００２ＣＩ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ１００４０ＣＶ）中で維持された。２９３Ｔ（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ＣＲＬ－３２１６）は、ＲＰＭＩと同様に補充したＤＭＥＭ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ１００１３ＣＶ）中で維持された。
細胞株。全ての細胞は、５％ＣＯ２で、３７℃で増殖させた。ＭＴ－４（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム、１２０）及びＣＥＭ ＣＤ４＋（ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム、１１７）細胞は、１０％ＦＢＳ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ３５０１１ＣＶ）及び１％Ｐｅｎ ／Ｓｔｒｅｐ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ３０００２ＣＩ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ１００４０ＣＶ）中で維持された。２９３Ｔ（アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ＣＲＬ－３２１６）は、ＲＰＭＩと同様に補充したＤＭＥＭ（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＴ１００１３ＣＶ）中で維持された。
【0248】
シミュレーション
バイロスタット（ｖｉｒｏｓｔａｔ）感染及び分析。バイロスタットが構築されたら、細胞を８０～１２０ｍＬの容量中、約０．５～１００万細胞／ｍＬで添加し、安定した細胞濃度及び生存率を確保するために、培養物の細胞密度及び生存率を１～２週間監視した。培養が安定したら、細胞は、複製能を有するＨＩＶ（ＧＦＰ又はＢＦＰのいずれかを発現）に低ＭＯＩ（実験に応じて約０．０１～０．１）で感染させた。感染後の示された日に、フラスコの全内容物（すなわち、細胞及び上清）の３ｍＬをフラスコから取り出して分析した。細胞濃度及び生存率は、バイオラド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標））ＴＣ２０自動セルカウンター（カタログ＃１４５０１０２）を使用して決定し、細胞は１％ホルムアルデヒド（トーシミス・リサーチ社（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００８Ａ）中で固定し、蛍光をＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩフローサイトメータで測定し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））で分析した。バイロスタット上清は、細胞を１，０００ｇで３分間ペレット化し、上清を除去してチューブを洗浄し、－８０℃で凍結することにより回収した。下流の分析のために、解凍時に上清をろ過した。元のバイロスタットにつき、ウイルス力価は以下に示すようにＴＣＩＤ５０によって決定された。ＴＩＰ細胞で開始されたバイロスタットの場合、完全長のＨＩＶ構築物にＢＦＰタグが含まれているため、ＢＦＰ＋細胞の頻度がウイルス量のプロキシとして使用された。
バイロスタット（ｖｉｒｏｓｔａｔ）感染及び分析。バイロスタットが構築されたら、細胞を８０～１２０ｍＬの容量中、約０．５～１００万細胞／ｍＬで添加し、安定した細胞濃度及び生存率を確保するために、培養物の細胞密度及び生存率を１～２週間監視した。培養が安定したら、細胞は、複製能を有するＨＩＶ（ＧＦＰ又はＢＦＰのいずれかを発現）に低ＭＯＩ（実験に応じて約０．０１～０．１）で感染させた。感染後の示された日に、フラスコの全内容物（すなわち、細胞及び上清）の３ｍＬをフラスコから取り出して分析した。細胞濃度及び生存率は、バイオラド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標））ＴＣ２０自動セルカウンター（カタログ＃１４５０１０２）を使用して決定し、細胞は１％ホルムアルデヒド（トーシミス・リサーチ社（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００８Ａ）中で固定し、蛍光をＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩフローサイトメータで測定し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））で分析した。バイロスタット上清は、細胞を１，０００ｇで３分間ペレット化し、上清を除去してチューブを洗浄し、－８０℃で凍結することにより回収した。下流の分析のために、解凍時に上清をろ過した。元のバイロスタットにつき、ウイルス力価は以下に示すようにＴＣＩＤ５０によって決定された。ＴＩＰ細胞で開始されたバイロスタットの場合、完全長のＨＩＶ構築物にＢＦＰタグが含まれているため、ＢＦＰ＋細胞の頻度がウイルス量のプロキシとして使用された。
【0249】
プロウイルスＤＮＡのＰＣＲ及びサンガーシーケンシング。ヌクレオスピン組織（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標））キット（７４００５２．５０）を製造元のプロトコルに従って使用して、約１００万個のバイロスタット細胞から全ゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲは、フュージョン・ハイフィデリティー・ＰＣＲマスターミックス（Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（ＮＥＢ、Ｍ０５３１Ｓ）を使用し、次の条件を使用して、プライマーＰｏｌフォワード及びＶｐｕリバース（プライマー表を参照）で実施した：初期変性：９８℃で３０秒間；３０回のサイクル：９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４分間；最終伸長：７２℃で１０分間、４℃で保持。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分析し、シーケンシングのために切り出した。ＰＣＲ産物は、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標））ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））、２８１１５）を使用してゲル抽出され、Ｐｏｌフォワード及びＶｐｕリバースプライマーを使用したシーケンシング確認のためにエリムバイオファーム（Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ）に送られた（プライマー表を参照）。
【0250】
プラスミド：全てのＦ１構築物及びその他の欠失変異体の変異を表１～４に示す。クローニングは、都合の良いように様々なＰＣＲクローニング技術によって行われた。必要に応じて、制限クローニングを使用してプラスミド配列を交換した。配列は、エリムバイオファーム（Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ）でのサンガーシーケンシングによって確認された。
【0251】
ウイルスストック、レンチウイルス、又は共トランスフェクション競合実験のためのトランスフェクション。完全長のＨＩＶストックの場合、２９３Ｔ細胞にプラスミドｐＮＬＥＮＧ１－ＩＲＥＳ－Ｎｅｆ（レビー（Ｌｅｖｙ）ら著、２００５）又はその誘導体（表１～４を参照）をトランスフェクトした。ＴＩＰ構築物又はレンチウイルスベクターをパッケージ化するために、トランスファープラスミド、パッケージングプラスミドｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１（ズフェリー（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ）ら著、１９９７年）及びシュードタイピングプラスミドｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ（アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ）、＃８４５４）は、１：２：１の比で混合された一次細胞形質導入のために調製されたＴＩＰ構築物を除き、それぞれ４：１０：５の質量比で混合した。共トランスフェクションの競合は、示されたモル比でプラスミドを混合し、過剰なｐＵＣ１９で全ての反応にわたって質量を等しくすることによって実施された。トランスフェクションミックスを作製するために、プラスミドを未補充のＤＭＥＭ（すなわち、血清又は抗生物質が添加されていない）で１０ｎｇ／ｍＬ全ＤＮＡの濃度に希釈し、ＰＥＩを３０μｇ／ｍＬの濃度で、トランスフェクションウェル又はディッシュの総用量の約１０％の容量（例えば、２ｍＬの培地を有する６ウェルプレートでは２００μｌ）で添加した。トランスフェクションミックスを激しくボルテックスし、室温で１０分間インキュベートし、細胞に添加して一晩インキュベートした。翌日、トランスフェクション上清を新鮮な完全ＤＭＥＭに交換し、トランスフェクションの約４８時間後に上清を回収した。遠心分離により細胞破片を除去し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過した。濃縮ウイルスは、６％イオジキサノール勾配（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄ１５５６－２５０ｍＬ）を介して２０，０００ｒｐｍで１．５～２時間の超遠心分離（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））オプティマ（Ｏｐｔｉｍａ（商標））ＸＥ－９０、ロータＳＷ３２Ｔｉ）によって調製した。
【0252】
ウイルス及びレンチウイルス力価。蛍光タグ付きの完全長ＨＩＶ及びレンチウイルスは、ＭＴ－４で段階希釈して力価を測定し、ＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩ又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ＶＹＢフローサイトメータで、２ｄｐｉでフローサイトメトリーによって分析した。ＬＴＲからの発現が弱いレンチウイルスストック（すなわち、Ｔａｔを含まない構築物）は、ＭＴ－４を形質導入し、形質導入後２日又は３日で完全長ＨＩＶに重感染し（トランスでＴａｔを提供するため）、２ｄｐｉでレンチウイルス発現が陽性であった感染細胞の割合として測定した。全ての蛍光データは、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））で分析された。元のバイロスタット力価は、長期感染の過程で変異によってＧＦＰタグが失われた場合に備え、ＴＣＩＤ５０によって決定された。
【0253】
上清ｐ２４濃度。ｐ２４の上清濃度は、ＦＬＡＱ法（ヘイデン（Ｈａｙｄｅｎ）ら著、２００３年及びゲスナー（Ｇｅｓｎｅｒ）ら著、２０１４年）によって決定された。これは、本質的には、フローサイトメトリーによる定量を可能にするために、ＰＥ結合抗体を使用してビーズに対して実施されるサンドイッチＥＬＩＳＡである。簡単に説明すると、段階希釈した上清試料を、ＫＣ５７－ＰＥ ｐ２４抗体（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標））、６６０４６６７）及びヒト抗ｐ２４ Ｇａｇ ＨＩＶ－１ ＩＩＩＢポリクローナル抗体（イムノＤＣ（ＩｍｍｕｎｏＤＣ ＬＬＣ）、２５０３）に事前に架橋したポリスチレンビーズと共にインキュベートした。洗浄及び固定後、ビーズ蛍光をＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩのフローサイトメトリーで分析し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））の標準曲線を使用して蛍光強度を濃度に変換した。
【0254】
形質導入効率の計算。レンチウイルスストック形質導入の効率は、ｐ２４（すなわち、カプシドタンパク質）の１ｎｇあたりの形質導入単位（「力価」）として測定された。力価及びｐ２４濃度は上記のように決定された。
【0255】
単一組み込みポリクローナルＤＩＰ／ＴＩＰ細胞株の構築。ポリクローナル細胞株は、低ＭＯＩでレンチウイルスをＣＥＭに形質導入し（単一組み込みを確実にするため）、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩセルソータを使用してＧＦＰ又はＢＦＰ発現細胞（使用する構築物に応じて）をバッチ選別することによって作製された。選別する前に、形質導入された集団を５μＭのダルナビルで３～５日間処理し、複製能を有する組換え体を排除した。注記：Ｔａｔが存在しないため、大半の構築物でＧＦＰ又はＢＦＰの発現は非常に低かったが、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩではかすかに発現が検出された。
【0256】
細胞株の感染、分析及び上清の回収。ＴＩＰ構築物（又は対照）で形質導入された細胞株（ＣＥＭ又はＭＴ－４）に、５０万細胞／ｍＬの密度で蛍光標識ＨＩＶを重感染させた。感染の頻度は、細胞を１％ホルムアルデヒド（トーシミス・リサーチ社（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００８Ａ）で固定し、ＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩでフローサイトメトリーによって蛍光細胞を測定し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））で分析することによって監視された。単一サイクルの感染分析では、細胞をペレット化し、．４５μＭフィルター（マイレックス（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標））、ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）で上清をろ過することにより、上清を３ｄｐｉで収集した。
【0257】
ＣＤ４受容体の染色及び分析。細胞は、ブリリアントバイオレット６５０コンジュゲート抗ヒトＣＤ４抗体（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、３１７４３６）又はアイソタイプ対照（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、４００３５１）で、０．１ｍＬの容量で５０万個の細胞に１μｌの抗体を使用して染色した。細胞を抗体と共に３０分間光線から保護してインキュベートし、１ｍＬのフローバッファー（２％ＦＢＳ、ＤＰＢＳ中の２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、０．２５ｍＬの固定液（フローバッファー中の１％ホルムアルデヒド）に再懸濁した。ＣＤ４染色は、ＢＤ ＬＳＲ（商標）ＩＩでのフローサイトメトリーによって評価され、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ（商標））で分析された。
【0258】
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルスＲＮＡの分析。ウイルスゲノムＲＮＡは、キアａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、５２９０４）を製造元のプロトコルに従って使用して、ろ過した上清から抽出し、ＭＳ２ ＲＮＡ溶液の１：１，０００希釈液（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０１６５９４８００１）２μｌも、正規化対照としてスパイクインした。抽出されたウイルスＲＮＡは、常用ＤＮａｓｅ処理プロトコルに従って、ターボＤＮＡフリーキット（ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標） ｋｉｔ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＭ１９０７）でＤＮａｓｅ処理された。全細胞ＲＮＡは、オンカラムＤＮＡ消化（ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ Ｉ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、７９２５４）を含む製造元のプロトコルに従って、キアゲンＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、７４１０４）を使用して抽出した。ＲＮＡは、製造元のプロトコル（ｇＤＮＡワイプアウトステップを含む）に従ったＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）逆転写キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、２０５３１１）、又はランダムプライマーにつき２５℃のインキュベーションの推奨を含むメーカの標準プロトコルに従ったＭ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢ、Ｍ０２５３Ｌ）及びマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ、Ｍ０３１４Ｓ）のいずれかを使用して逆転写した。ただし、試料は７０℃で変性され、酵素は８０℃で５分間不活化された。全てのｃＤＮＡ合成には、非ＲＴ酵素コントロールが含まれ、反応はランダムヘキサマーでプライミングされた。ｑＰＣＲは、高速ＳＹＢＲグリーン（Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）マスターミックス（サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、４３８５６１２）を使用し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））７５００高速リアルタイムＰＣＲシステムで１０μｌの反応容量及び２００ｎＭの最終プライマー濃度を使用して製造元のプロトコルに従って実行された。全体、完全長、及びＴＩＰ ｇＲＮＡ、並びにＭＳ２対照ＲＮＡのプライマーは、プライマー表に見出すことができる。完全長ＲＮＡの割合は、全体及び完全長のＣｔ値を倍率変化に変換し（完全長のみの試料に正規化）、ＷＴ倍率変化を総倍率変化で割ることによって決定された。ＴＩＰ ＲＮＡは、試料中の残存ｇＲＮＡであると想定された。
【0259】
ＨＩＶ－１－ヒト化マウスチャレンジ（レズリー（Ｌｅｓｌｉｅ）ら著、ＰＬｏＳ病原体（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ）、２０１６年から適合）。ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、２ｘ１０７の未修飾の初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞、又は未修飾且つＴＩＰ形質導入された初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の５０／５０混合物（すなわち、約１ｘ１０７の非形質導入細胞、及び約１ｘ１０７のＴＩＰ細胞）を生着させ、各動物からの５０μＬの血液を使用したトゥルーカウント（ＴｒｕＣｏｕｎｔ）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））分析により、３週間後にＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞の生着を監視した。次に、実験群あたり５匹の対照（非感染）動物及び８匹の試験（感染）動物の群へ、生着に基づいて、マウスを正規化した。マウスを＿＿ＩＵ ＢａＬ完全長ＨＩＶに感染させ、３週間にわたって７日ごとに採血し、ＣＤ４＋Ｔ細胞数をトゥルーカウント（ＴｒｕＣｏｕｎｔ）で分析した。トゥルーカウント（ＴｒｕＣｏｕｎｔ）分析は、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒトＣＤ４５抗体（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））及びＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ４抗体（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を使用して実施した。利用可能な場合、ウイルス量分析のためにおよそ５０μｌの血清が保存された。動物はペンシルベニア大学で飼育された。
【0260】
マウス血清ＲＮＡ抽出。血清からのＲＮＡ抽出につき、製造元のプロトコルに従って、ＢＤ ＴＲＩ試薬（モレキュラーリサーチセンター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＴＢ １２６）を使用して、マウス血清からＲＮＡを抽出した。プロトコルを開始する前に、１５０μｌのＤＰＢＳを約５０μｌの血清試料に添加して、容量を約２００μｌにした。ＲＮＡの最終再懸濁は、ヌクレアーゼを含まない水５０μｌ中で実施した。
【0261】
マウスＲＮＡ試料のｄｄＰＣＲ及び分析。デジタルドロップレットＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ（商標）ＰＣＲ）は、バイオラド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ＱＸ１００液滴発生器（１８６３００２）及びリーダ（１８６３００３）を使用して、製造元のプロトコルに従って実施された。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、バイオラドプローブ用ワンステップＲＴ－ｄｄＰＣＲアドバンストキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｄｄＰＣＲ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）、１８６４０２１）を使用して、以下の反応条件で製造元のプロトコルに従って実施した：９００ｎＭプライマー、２５０ｎＭ Ｔａｑｍａｎ標的プローブ、及び１Ｘ濃度の血清抽出ＲＮＡ。サーモサイクリング条件では、初期変性は６５℃で５分間、アニーリング及び伸長は５６℃で１分５秒間行った。データはクアンタソフト（ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ（商標））ソフトウェアで取得及び分析した。ｄｄＰＣＲプライマー及びプローブのリストについては、プライマー表を参照されたい。全ての反応は技術的に重複して実施され、検出限界未満の試料（陰性対照によって決定される）はＴＩＰ含有量について分析されなかった。
【0262】
統計分析。力価又はｑＰＣＲの比較では、独立Ｔ検定を使用してｐ値を取得した。経時的なＴＩＰバイロスタット感染のトラジェクトリーについて、対応ｔ検定を使用した。マウス実験におけるＣＤ４＋Ｔ細胞濃度については、マンホイットニー検定を使用してグループ内及びグループ間比較を行い、一元配置分散分析及び多重比較のためのテューキ検定によってウイルス量を分析した。
【0263】
バイオグラフィー：
ゲスナー・Ｍ（Ｇｅｓｎｅｒ Ｍ）、マイチ・Ｍ（Ｍａｉｔｉ Ｍ）、グラント・Ｒ（Ｇｒａｎｔ Ｒ）、及びカブロイス・Ｍ（Ｃａｖｒｏｉｓ Ｍ）著、ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇの高速定量化のための蛍光結合抗原定量化（ＦＬＡＱ）アッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＦＬＡＱ）ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ）、バイオプロトコル（Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、２０１４年、第４巻、第２４号、ｅ１３６６。
ゲスナー・Ｍ（Ｇｅｓｎｅｒ Ｍ）、マイチ・Ｍ（Ｍａｉｔｉ Ｍ）、グラント・Ｒ（Ｇｒａｎｔ Ｒ）、及びカブロイス・Ｍ（Ｃａｖｒｏｉｓ Ｍ）著、ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇの高速定量化のための蛍光結合抗原定量化（ＦＬＡＱ）アッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＦＬＡＱ）ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｆａｓｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｐ２４ Ｇａｇ）、バイオプロトコル（Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ）、２０１４年、第４巻、第２４号、ｅ１３６６。
【0264】
ヘイデン・ＭＳ（Ｈａｙｄｅｎ ＭＳ）、パラシオス・ＥＨ（Ｐａｌａｃｉｏｓ ＥＨ）、及びグラント・ＲＭ（Ｇｒａｎｔ ＲＭ）著、蛍光結合抗原定量化アッセイを使用したＨＩＶ－１ ｐ２４及びＳＩＶ ｐ２７のリアルタイム定量化（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｐ２４ ａｎｄ ＳＩＶ ｐ２７ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）、エイズ（ＡＩＤＳ）、２００３年、第１７巻、第４号、ｐ．６２９～６３１。
【0265】
レズリー・ＧＪ（Ｌｅｓｌｉｅ ＧＪ）、ワン・Ｊ（Ｗａｎｇ Ｊ）、リチャードソン・ＭＷ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＭＷ）ら著、ＣＸＣＲ４アミノ末端にコンジュゲートしたｇｐ４１ヘプタッドリピート－２ドメインからのペプチドによるＨＩＶ－１の強力且つ広範な阻害（Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｂｒｏａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｂｙ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｐ４１ ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ－２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＣＸＣＲ４ ａｍｉｎｏ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、ＰＬｏＳ病原体（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）、２０１６年、第１２巻、第１１号、ｅ１００５９８３。
【0266】
レビー・ＤＮ（Ｌｅｖｙ ＤＮ）、アルドロバンディ・ＧＭ（Ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ ＧＭ）、クッチ・Ｏ（Ｋｕｔｓｃｈ Ｏ）、及びショー・ＧＭ（Ｓｈａｗ ＧＭ）著、その天然の標的細胞におけるＨＩＶ－１組換えのダイナミクス（Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｔｓ ｎａｔｕｒａｌ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、２００４年、第１０１巻、第１２号、ｐ．４２０４～９。
【0267】
ズファリー・Ｒ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ）、ナギー・Ｄ（Ｎａｇｙ Ｄ）、マンデル・ＲＪ（Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ）、ナルディーニ・Ｌ（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ）、及びトロノ・Ｄ（Ｔｒｏｎｏ Ｄ）著、多重減衰レンチウイルスベクターは、インビボでの効率的な遺伝子送達を実現する（Ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９７年、第１５巻、第９号、ｐ．８７１～５。
【0268】
米国特許第７，５７２，９０６号明細書。
メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年、ＰＬｏＳ計算生物学（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．）、第７巻、ｅ１００２０１５。
メッツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら著、２０１１年、ＰＬｏＳ計算生物学（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．）、第７巻、ｅ１００２０１５。
【0269】
ダル（Ｄｕｌｌ）ら著、１９９８年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）第７２巻、ｐ．８４６３～７１。
ファン（Ｈｕａｎｇ）及びバルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）著、１９７０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２６巻、ｐ．３２５～７。
ファン（Ｈｕａｎｇ）及びバルティモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）著、１９７０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２６巻、ｐ．３２５～７。
【0270】
リバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら著、２００６年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０３巻、ｐ．１７３７２～７。
ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第７７巻、ｐ．１００２８～３６。
ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら著、２００３年、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第７７巻、ｐ．１００２８～３６。
【0271】
本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載されたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われてもよく、均等物が置換されてもよいことが当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップを本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合させるために、多くの修正が行われてもよい。全てのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図20】
【配列表】