特許 7495489 ＰＤ－１およびＴＧＦβを標的化する組換えタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-27

(45)【発行日】2024-06-04

(54)【発明の名称】ＰＤ－１およびＴＧＦβを標的化する組換えタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240528BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240528BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240528BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240528BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240528BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240528BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240528BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K16/28

C07K14/52

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K38/16

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022523480

(86)(22)【出願日】2020-10-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-21

(86)【国際出願番号】 CN2020122242

(87)【国際公開番号】W WO2021078123

(87)【国際公開日】2021-04-29

【審査請求日】2022-06-22

(31)【優先権主張番号】62/924,154

(32)【優先日】2019-10-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】522145605

【氏名又は名称】ナンチン リーズ バイオラブス カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(72)【発明者】

【氏名】シアオチアン カン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン シアオ

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／０１４２８５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０２０／００６５０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５２１３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２０－５１９２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０３７６３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５０６２１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１８４５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】ONCOIMMUNOLOGY，2018年，Vol.7, No.5, e1426519，p.1-14

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ／ＣＡＢＡ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ／ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）ＴＧＦβに結合する、ヒトＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、
ｂ）ＰＤ－１に結合する、重鎖と軽鎖とを含む抗体と、を含む、組換え融合タンパク質であって、前記重鎖が、配列番号４のアミノ酸配列、または、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含み、前記ヒトＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのＮ末端が、リンカーを介して、前記抗体の重鎖のＣ末端に連結され、重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲ２融合タンパク質を形成する、組換え融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。

【請求項3】

前記リンカーが、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の組換え融合タンパク質。

【請求項4】

前記重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲ２融合タンパク質が、配列番号１０、１１、１２または１３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列、または、それぞれ配列番号１０、１１、１２または１３と少なくとも９０％の同一性を有し、同時にそれぞれ対応する配列番号１０、１１、１２または１３の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。

【請求項5】

配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含む、軽鎖を含む、請求項４に記載の組換え融合タンパク質。

【請求項6】

１）配列番号１０のアミノ酸配列、または、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；
２）配列番号１１のアミノ酸配列、または、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；
３）配列番号１２のアミノ酸配列、または、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；または、
４）配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；
から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸を含むベクター。

【請求項9】

請求項７に記載の核酸または請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項10】

適切な条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、組換え融合タンパク質の製造方法。

【請求項11】

請求項１０に記載の方法によって製造される組換え融合タンパク質。

【請求項12】

前記組換え融合タンパク質が、
配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、
配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む、
請求項６に記載の組換え融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。

【請求項13】

前記組換え融合タンパク質が、
配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、
配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む、
ＴＧＦβおよび／またはＰＤ－Ｌ１を過剰発現する疾患を治療するための薬剤の製造における、請求項１～６若しくは１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質または請求項１２に記載の医薬組成物の使用。

【請求項14】

前記疾患が、結腸直腸（大腸）、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、頸部、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される癌／腫瘍である、請求項１３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ＰＤ－１およびＴＧＦβを標的化する組換え融合タンパク質、ならびにその調製および使用に関する。

【背景技術】

【0002】

世界保健機関（ＷＨＯ）によると、癌は世界で２番目に多い死因であり、２０１８年には約９６０万人が癌で死亡した。

【0003】

癌は実際には異常な細胞の成長と分裂を伴う疾患群である。癌細胞は非常に「スマート」であり、宿主の免疫監視を回避するためのいくつかのメカニズムを開発した。例えば、それらは高レベルの膜タンパク質ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を発現させ、これら２つはＴ細胞の表面でＰＤ－１に結合し、Ｔ細胞の枯渇を誘導する（Ｏｓｃａｒ Ａｒｒｉｅｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８（６０）：１０１９９４－１０２００５）。癌細胞はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞における活性化免疫受容体ＮＫＧ２Ｄの発現を減少させ、ＮＫＧ２ＤリガンドＭＩＣＡの発現を抑制することにより、細胞傷害性リンパ球およびＮＫ細胞による細胞死を阻止するために形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の発現、より一般的にはＴＧＦβ１を増加させる（Ｍａｓａｔｏ Ｍｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ８：ａ０２１８７３；Ｊｏａｎ Ｍａｓｓａｇｕｅ（２００８）Ｃｅｌｌ １３４（２）：２１５－２３０）；Ｐａｕｌ Ｓｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．１３：８。

【0004】

癌の早期診断と適切な治療に向けた取り組みが行われており、癌に関連する全体的な死亡率は低下している。癌治療の現在の選択肢には、手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、標的療法、免疫療法などがある。これらの中で、免疫療法は、免疫応答を増幅させることで免疫系が癌と戦うのを助ける治療法の一種である。免疫療法は、まだ手術、化学療法、放射線療法のように広く使用されていないが、近年ではかなりの成功を収めている。免疫療法では、抗体などの免疫抑制経路を標的化する医薬品が使用される。
ＰＤ－１

【0005】

ＣＤ２７９としても知られるＰＤ－１は、細胞表面受容体である。それは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドを有する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ＬＰＳおよびＧＭ－ＣＳＦ治療に反応してマクロファージおよび樹状細胞でアップレギュレートされ、ＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞でアップレギュレートされ、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡは、マウスの心臓、肺、胸腺、脾臓および腎臓で検出される（Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９２（７）：１０２７；Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６９（１０）：５５３８－５５４５）。ＰＤ－Ｌ１は腫瘍細胞にも発現している。ＰＤ－Ｌ２はより制限された発現プロファイルを持っている。

【0006】

ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２と結合すると、ＰＤ－１は免疫系をダウンレギュレートし、Ｔ細胞の炎症活性を抑制することにより自己寛容を促進する。免疫系に対するＰＤ－１の阻害効果は、自己免疫疾患を予防することができる。一方、癌細胞における局所的なＰＤ－Ｌ１発現の増加は、免疫系がこれらの細胞を殺すことを妨げる可能性がある。Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ＢＭＳ）やＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）などの数種類の抗ＰＤ－１抗体は、単独で、または他の抗腫瘍剤と組み合わせて、臨床癌治療に使用できることが証明されている。
ＴＧＦβ

【0007】

形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３の３つの哺乳類アイソフォームを持つ二機能性サイトカインである。ＴＧＦβは、他の因子と複合体を形成し、ＴＧＦβ受容体に結合して下流の基質および調節タンパク質を活性化するセリン／スレオニンキナーゼ複合体を形成する。ＴＧＦβシグナル伝達は、ほとんどの細胞型において強力な増殖阻害活性を主に伝達する。例えば、ＴＧＦβはＴリンパ球および胸腺細胞の増殖を阻害する。ＴＧＦβはまた、特定の条件下で一部の細胞の増殖を刺激する。例えば、ＴＧＦβはＩＬ－２と組み合わせて、Ｔｒｅｇ細胞の分化を誘導する。癌細胞は高レベルのＴＧＦβ１を発現させて免疫機能を抑制し、同時にコア経路成分の突然変異不活性化またはシグナル伝達経路の腫瘍抑制アームの喪失により、ＴＧＦβの腫瘍抑制作用を無効にする。

【0008】

ＴＧＦβ受容体であるＴＧＦβＲ１とＴＧＦβＲ２は、どちらもＴＧＦβ１に対して高い親和性を持っている。ＴＧＦβＲ２は、Ｃ末端プロテインキナーゼドメインとＮ末端エクトドメインとからなる膜貫通型タンパク質である。エクトドメインは、９つのβ鎖を含むコンパクトな折り畳みと、６つの鎖内ジスルフィド結合のネットワークによって安定化された単一のヘリックスとからなる。ＴＧＦβＲ２のＴ細胞特異的発現は、マウスに接種された黒色腫または胸腺腫の増殖（成長）を防ぐことができる。
複数の分子を標的化する治療

【0009】

単一の腫瘍関連抗原または単一の免疫抑制経路を標的化する医薬品は、治療効果が限られていることが時々見られる。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）は、癌細胞の増殖をある程度阻害することが証明されているが、癌細胞を排除することはできない。さらに、承認された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ）の全奏効率はわずか３３％である。

【0010】

そのため、臨床試験や臨床治療では、薬剤を通常、他の治療薬と組み合わせて投与し、その結果、癌細胞などの標的細胞を攻撃するいくつかの方法がある。あるいは、二重特異性または多重特異性抗体／タンパク質などの２つ以上の標的結合特異性を有する単一分子薬物を開発して、複数の分子を標的化する治療を可能にすることができる。例えば、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏは、非小細胞肺癌や胆道癌などの複数の固形癌の治療のために、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインに結合した抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む二重特異性融合タンパク質Ｍ７８２４を開発した。

【発明の概要】

【0011】

本開示は、１）ＴＧＦβに結合し得る、ＴＧＦβＲ２またはその断片、および２）ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を含む組換え融合タンパク質を開示する。組換え融合タンパク質は、腫瘍微小環境においてＴＧＦβを捕捉して免疫細胞の増殖と機能に対する阻害効果を低減し、また、腫瘍細胞に対するＰＤ－Ｌ１と免疫細胞に対するＰＤ－１の相互作用を遮断し、ＰＤ－１媒介性の阻害シグナルによる免疫細胞に対しるチェックを解除する。２つの免疫抑制経路を標的化することにより、本開示の組換え融合タンパク質は、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強する。

【0012】

本開示のＴＧＦβＲ２は、ヒトＴＧＦβＲ２であり得る。本開示のＴＧＦβＲ２断片は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の組換え融合タンパク質は、配列番号１に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２細胞外ドメインを含み、該ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインがＴＧＦβに結合する。

【0013】

本開示のＰＤ－１に結合する抗体は、ヒトまたはヒト化抗ＰＤ－１抗体であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＰＤ－１に結合する抗体は、配列番号２に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含み、必要に応じてヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ４重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を有し、前記抗体がＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する。一実施形態において、ＰＤ－１に結合する抗体は、配列番号４に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号５に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含み、前記抗体がＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する。抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂またはＦｖ断片であり得る。

【0014】

ＴＧＦβＲ２またはその断片は、リンカーを介して抗体またはその抗原結合断片に連結され得る。リンカーは、約５～３０アミノ酸残基のペプチドであり得る。一実施形態において、リンカーは、１０～３０アミノ酸残基のペプチドである。別の実施形態において、リンカーは、１０～２０アミノ酸残基のペプチドである。リンカーは、配列番号６、７、８または９に示されるアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0015】

本開示の組換え融合タンパク質は、重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端の抗ＰＤ－１抗体に連結されたＴＧＦβＲ２断片を含み得る。

【0016】

本開示の組換え融合タンパク質は、重鎖定常領域のＣ末端の抗ＰＤ－１抗体にリンカーを介して連結されたＴＧＦβＲ２細胞外ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４の重鎖および配列番号５の軽鎖可変領域を含む。リンカーは、配列番号６、７、８または９に示されるアミノ酸配列を含む。抗ＰＤ－１重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインは、配列番号１０、１１、１２または１３のアミノ酸配列を含む。

【0017】

本開示の組換え融合タンパク質は、ＴＧＦβおよびＰＤ－１の両方への結合能力を維持し、従来技術の二重特異性融合タンパク質Ｍ７８２４と比較して、優れたＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１遮断活性および他の薬理学的性質を示す。

【0018】

一実施形態において、本願は、
ａ）ヒトＴＧＦβＲ２断片と、
ｂ）重鎖および軽鎖を含む抗体と、を含み、
ヒトＴＧＦβＲ２断片が重鎖のＣ末端に連結されている、組換え融合タンパク質を提供する。

【0019】

一実施形態において、本願は、
ａ）ヒトＴＧＦβＲ２断片と、
ｂ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む（Ｆａｂ’）₂と、を含み、
ＴＧＦβＲ２断片が前記重鎖可変領域のＣ末端に連結されている、組換え融合タンパク質を提供する。

【0020】

一実施形態において、本願は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片およびヒトＴＧＦβＲ２断片を含み、前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２の重鎖可変領域および配列番号３の軽鎖可変領域の６ＣＤＲを含む、組換え融合タンパク質を提供する。

【0021】

一実施形態において、本願は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。

【0022】

一実施形態において、本願は、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸配列、または、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号２の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３のアミノ酸配列、または、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有し、同時に配列番号３の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、組換え融合タンパク質を提供する。

【0023】

一実施形態において、本願は、重鎖が、配列番号４のアミノ酸配列、または、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。

【0024】

一実施形態において、本願は、２つのペプチドを含み、第１のペプチドがヒト抗ＰＤ－１抗体の重鎖、リンカーおよびＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインを含み、第２のペプチドがヒト抗ＰＤ－１抗体の軽鎖を含む、組換え融合タンパク質を提供する。

【0025】

一実施形態において、本願は、以下から選択される組換え融合タンパク質を提供する：
１）配列番号１０のアミノ酸配列、または、配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；
２）配列番号１１のアミノ酸配列、または、配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；
３）配列番号１２のアミノ酸配列、または、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質；または、
４）配列番号１３のアミノ酸配列、または、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号４の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有し、同時に配列番号５の３ＣＤＲを有するアミノ酸配列と、を含む組換え融合タンパク質。

【0026】

さらなる実施形態において、本願は、２つのペプチドを含み、第１のペプチドが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、第２のペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。好ましくは、第１のペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、第２のペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸からなる。

【0027】

さらなる実施形態において、本願は、２つのペプチドを含み、第１のペプチドが配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、第２のペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。好ましくは、第１のペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、第２のペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸からなる。

【0028】

さらなる実施形態において、本願は、２つのペプチドを含み、第１のペプチドが配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、第２のペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。好ましくは、第１のペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、第２のペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸からなる。

【0029】

さらなる実施形態において、本願は、２つのペプチドを含み、第１のペプチドが配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、第２のペプチドが配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質を提供する。好ましくは、第１のペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、第２のペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸からなる。

【0030】

一態様において、本発明の組換え融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびに該核酸を含む発現ベクターおよび該発現ベクターを含む宿主細胞もまた提供される。

【0031】

別の態様において、発現ベクターを含む宿主細胞を用いて組換え融合タンパク質を調製する方法もまた提供され、この方法は、（ｉ）宿主細胞において組換え融合タンパク質を発現させるステップ、および（ｉｉ）宿主細胞から組換え融合タンパク質を分離（単離）するステップを含む。

【0032】

別の態様において、本発明は、本発明の組換え融合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含み得る。

【0033】

別の態様において、本発明は、ＴＧＦβおよび／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする患者または被験体に、本発明の組換え融合タンパク質または本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。

【0034】

別の態様において、本発明は、ＴＧＦβおよび／またはＰＤ－Ｌ１の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための医薬組成物の製造における組換え融合タンパク質の使用を提供する。

【0035】

一実施形態において、本発明の方法は、癌／腫瘍の成長を阻害するためのものである。癌または腫瘍は、結腸直腸（大腸）、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、頸部、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群より選択され得る。

【0036】

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかになるであろうが、限定的であると解釈されるべきではない。この出願を通じて引用されたすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】本開示の例示的な組換え融合タンパク質の構造の概略図である。

【0038】

【図2】融合タンパク質Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４（左）およびＴｒａｐ－１５（右）のヒトＰＤ－１への結合活性を示す図である。

【0039】

【図3】融合タンパク質Ｔｒａｐ－１３（左）、Ｔｒａｐ－１４、Ｔｒａｐ－１５（右）のヒトＴＧＦβ１への結合活性を示す図である。

【0040】

【図4】ＴＧＦβ－ＴＧＦβＲ相互作用に対するＴｒａｐ－１５の遮断活性を示す図である。

【0041】

【図5】ＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用に対するＴｒａｐ－１５の遮断活性を示す図である。

【0042】

【図6】Ｔｒａｐ－１５がヒトＰＢＭＣを刺激してＩＦＮγを放出できることを示す図である。

【0043】

【図7】Ｔｒａｐ－１５がＡＤＣＣ効果を誘導しないことを示す図である。

【0044】

【図8】Ｔｒａｐ－１５がＣＤＣ効果を誘導しないことを示す図である。

【0045】

【図9】Ｔｒａｐ－１５が腫瘍増殖（腫瘍成長）を有意に抑制できることを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

腫瘍成長（腫瘍増殖）の２つ以上の薬理を標的化する、主に３つの異なるアプローチがある。最も一般的には、２つ以上の異なる薬剤のカクテルが、患者に投与され得る。この選択肢は、可能な薬剤組み合わせと、異なる用量に関して最大の柔軟性を可能にするが、それは、（ａ）錠剤数の負担増大および個々の薬剤の異なる投与スケジュールに起因する、患者の治療に対する潜在的な遵守不良、（ｂ）薬剤と薬剤の相互作用のための可能な不適合性、および（ｃ）薬剤副作用のリスク増大に悩まされる。これらの問題は、特に癌などの慢性疾患の治療において、治療の有効性を低下させ、治療目的の達成を妨害し得る。

【0047】

第２のアプローチは、単回投与剤形中における薬剤の固定用量組み合わせの使用に依存する。このアプローチは、錠剤数の負担を低下させ、改善された患者コンプライアンスをもたらす。固定用量組み合わせの不都合は、主に、活性成分間の可能な用量比の選択が限られることであり、最小限の副作用で最大効力を得るために、個々の患者を適切に滴定することがより困難になる。さらに、組み合わせ中の構成成分の異なる薬物動態特性は、個々の標的において薬力学効果に複雑な時間的ミスマッチをもたらすかもしれず、その結果、全体的な効力が損なわれる。

【0048】

第３のアプローチは、単一化合物中で２つ以上の薬理を組み合わせる、多機能性薬剤の使用である。このような多機能性化合物の設計および検証は、より複雑であり、分子内の標的機能の最適な比率についてかなりの研究を要するが、一体化された薬物動態が、分子標的における調和のとれた薬力学活性をもたらすことができる。多機能性分子はまた、その他の薬剤との固定用量組み合わせに適していてもよく、それによって３つまたは４つにさえ至る薬理が単一丸薬中で組み合わされて、有効性をさらに高めることができる。

【0049】

本発明者らは、ＴＧＦβに結合するＴＧＦβＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩ断片と、ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合部分とを含む、新規な組換え多機能融合タンパク質を発明した。この組換え融合タンパク質は、腫瘍微小環境においてＴＧＦβを捕捉し、これにより免疫細胞の増殖と機能に対するＴＧＦβの阻害効果を低減し、さらにＰＤ－Ｌ１－ＰＤ－１相互作用を遮断して、ＰＤ－１媒介性の阻害シグナルによる免疫細胞に対するチェックを解除し、免疫細胞による癌細胞死滅を促進する。

【0050】

本明細書において使用されるように、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む」という用語と併せて使用される場合、「１」または「１個」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、また、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」の意味とも一致する。

【0051】

「含む」、「有している」、「有する」、「できる」、「含有する」という用語およびそれらの変形体は、本明細書で使用するとき、追加の作用または構造の可能性を妨げないオープンエンドの移行句、用語または単語であることが意図される。本開示はまた、明示的に規定されているかどうかにかかわらず、本明細書に示されている実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「から本質的になる」他の実施形態を考慮する。

【0052】

「約」または「略」という用語は、当業者により判定された特定の値が、値をどのように測定または判定するかによってある程度左右される、許容な可能な誤差範囲内にあること、すなわち、測定システムの限界を意味する。あるいは、「約」は、所定の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらに好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。

【0053】

用語「ＴＧＦβＲＩＩ」または「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」とは、野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号ＮＰ＿００１０２００１８のアミノ酸配列）を有するポリペプチド、または野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ配列（例えば、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３のアミノ酸配列）を有するポリペプチドを指す。ＴＧＦβＲＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％を保持し得る。「ＴＧＦβ結合能を有するＴＧＦβＲＩＩの断片」とは、ＴＧＦβ結合活性を保持する、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号ＮＰ＿００１０２００１８またはＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号ＮＰ＿００３２３３の任意の一部分を意味する。

【0054】

本明細書において、用語「抗体」は、全抗体及びそのいずれかの抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここで、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここで、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する領域にさらに細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）への免疫グロブリンの結合を媒介できる。

【0055】

抗体の「抗原結合部分」または抗体の「抗原結合断片」という用語は、本願を通して交換可能に使用され、それぞれ単に「抗体部分」または「抗体断片」と呼ばれることも可能である。抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメイ
ンから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法により、それらを単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーを用いて結合することができる。前記単一タンパク質鎖において、ＶＬ及びＶＨがペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）を形成する。このような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」との用語に含まれることが意図されている。これらの断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。

【0056】

用語「融合タンパク質」とは、本明細書で最も広い意味で使用され、１つ以上のペプチドを含む。「融合タンパク質」の例は免疫複合体であるが、これに限定されない。「免疫複合体」は、サイトカインを含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子に結合した抗体である。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体とＴＧＦβＲＩＩとを含む免疫複合体である。

【0057】

本開示の融合タンパク質に含まれる２つの主成分は、ＴＧＦβＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩ断片、およびその抗ＰＤ－１抗体または抗原結合部分である。当業者は、上記の２つの構成要素を選択するための多くの設計上の選択肢があることを認識するであろう。非ヒト動物由来のタンパク質またはペプチドの強い免疫原性がアレルギーおよび他の有害作用を引き起こす可能性があるため、好ましくは、ヒト由来の配列がヒトの癌治療に使用される。しかしながら、適切な場合にはヒト化された他の動物性タンパク質またはペプチドもまた、異なる適用目的に基づいて本発明において使用され得る。

【0058】

ＴＧＦβＲＩＩはヒトＴＧＦβＲＩＩであってもよく、融合タンパク質を比較的小さいサイズで構築するには、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインが好ましい。ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有していてもよい。

【0059】

本開示の融合タンパク質における抗ＰＤ－１抗体は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８７２８７に詳細に記載されており、重鎖定常領域を改変して、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）を排除する。

【0060】

本開示において、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインは、いくつかの実施形態において、部分的にＡＤＣＣおよびＣＤＣの排除を目的として、重鎖または重鎖定常領域のＣ末端に連結されている。他の実施形態において、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインは、重鎖または軽鎖（可変領域）のＮ末端、あるいは、軽鎖または軽鎖定常領域のＣ末端に連結され得る。ＡＤＣＣおよびＣＤＣを減少させるために抗体の重鎖定常領域を除去または改変してもよいが、重鎖定常領域を除去するとヒト体内の融合タンパク質の半減期を短縮し得る。

【0061】

必要に応じて、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインと抗ＰＤ－１抗体との間にリンカーを使用してもよい。リンカーは主にスペーサーとして機能する。リンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された５～３０個のアミノ酸から構成されてもよく、前記アミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のうちの１つ以上は、当業者が理解するようにグリコシル化され得る。一実施形態において、５～３０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびリジンから選択され得る。一実施形態において、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のないアミノ酸の大部分で構成される。例示的なリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙｓ、（Ｇｌｙ）₈）、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）、およびポリアラニンである。以下の実施例に示される１つの例示的な適切なリンカーは、－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）₃－などの（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）である。リンカーは非ペプチドリンカーでもあり得る。例えば、－ＮＨ－、－（ＣＨ₂）ｓ－Ｃ（Ｏ）－などのアルキルリンカーであって、ｓ＝２～２０のものを使用できる。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（例えば、Ｃ_1-4）、低級アシル、ハロゲン（例えば、ＣＩ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ₂、フェニルなどの非立体障害基によって置換され得る。

【0062】

また、本発明は、組換え融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および組換え二機能性融合タンパク質を発現させる発現ベクターを提供する。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、形質転換能を有する人工染色体（ＴＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、およびヒト人工染色体（ＨＡＥＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

本発明は、上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ得る。適切な宿主細胞には、大腸菌、酵母および他の真核生物が含まれる。好ましくは、大腸菌、酵母または哺乳動物細胞株（ＣＯＳまたはＣＨＯなど）が使用される。

【0064】

他の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、他の抗体及び薬物などの１つ以上の追加の薬学的有効成分を任意に含有してもよい。本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤又はワクチンとの併用療法で投与することができる。

【0065】

医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含み得る。使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤及び乳化剤、固体バインダー、分散及び懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択と使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0066】

医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、注射用の水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、注射時に一般的な他の材料で補充されることがある。例えば、ビヒクルまたは担体は、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水であり得る。他の例示的な医薬組成物は、トリスバッファーまたは酢酸バッファーを含み、これらは、ソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含み得る。本発明の一実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｓｕｐｒａ）と混合することにより、貯蔵用の組成物を調製することができる。さらに、治療用組成物を、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として配合することができる。

【0067】

好ましくは、前記医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄及び表皮投与（例えば、注射及び注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物は、酸の作用及びそれを不活性化する可能性のある他の自然条件から保護するために材料でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」という用語は、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。或いは、本発明の抗体は、局所、表皮及び粘膜投与経路などの非腸管外経路を介して、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下及び局所的に投与することができる。

【0068】

医薬組成物は、滅菌水溶液及び分散液の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、及び高薬物濃度に適した他の秩序構造に製剤化することができます。

【0069】

担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる有効成分の量は、治療される被験体及び特定の投与経路に応じて異なり、一般的に、治療効果を奏する組成物の量である。一般的には、有効成分と薬学的に許容される担体の合計１００％に対して、有効成分の量は、約０．０１％から約９９％、好ましくは約０．１％から約７０％、最も好ましくは約１％から約３０％である。

【0070】

投与計画は、最適な望ましい反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、治療状況の緊急性によって経時的に分割された用量で投与してもよいか、又は用量を比例的に減少及び増加させてもよい。投与の容易さ及び投与量の均一性の観点から、投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬品担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。あるいは、抗体を徐放性製剤として投与してもよく、この場合、投与頻度を減少させる必要がある。

【0071】

融合タンパク質の投与については、投与量は宿主体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１－１０ｍｇ／ｋｇであり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回及び３～６か月に１回の投与を伴う。本発明の融合タンパク質に関する好ましい投与量レジメンには、腹腔内投与による３ｍｇ／ｋｇ体重または６ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、抗体は、以下の投薬スケジュールのいずれかを用いて投与される： （ｉ）４週間に１回で６回後、３か月に１回、（ｉｉ）３週間に１回及び（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回後、１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間に１回のうちの１種により同時に与えられる、（ｖｉ）６ｍｇ／ｋｇ体重で１週間に１回投与。いくつの方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約１～１０００μｇ／ｍｌ、いくつの方法では約２５～３００μｇ／ｍｌとなるように調整される。

【0072】

本発明の融合タンパク質の「治療有効用量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患の症状のない期間の頻度と時間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する被験体の治療のために、「治療有効用量」は、治療されていない被験体と比較して腫瘍の成長を、好ましくは少なくとも約 ４０％、より好ましくは少なくとも約 ６０％、さらにより好ましくは少なくとも ８０％、よりさらに好ましくは少なくとも 約９９％阻害する。治療的化合物の治療的有効量は、被験体の腫瘍サイズを減少させるか、又は症状を改善することができる。被験体は、典型的にはヒト、他の哺乳動物であり得る。

【0073】

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ｃｏｌＬＡＧｅｎ、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0074】

治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４及び４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）点滴装置（米国特許第４，４４７，２３３及び４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６及び４，４７５，１９６号）などの医療機器により投与することができる。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0075】

特定の実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、生体内での適切な分布が確保されるように製剤化することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過することを確保するために、リポソームに製剤化することができ、特定の細胞及び器官への選択的輸送を促進する標的化部分をさらに含んでもよい。例えば、米国特許第４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、５，４１６，０１６及び５，３９９，３３１号。

【0076】

本発明の組換え融合タンパク質をコードする核酸分子、またはその誘導体を被験体に直接導入する、インビボ遺伝子治療もまた想定される。例えば、本発明の組換え融合タンパク質をコードする核酸配列を、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適切な送達ベクターを伴うまたは伴わない核酸構築物の局所注射を介して、標的細胞内に導入する。代替のウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターの物理的な転移は、所望の核酸構築物、または所望の核酸配列を含有する他の適切な送達ベクターの、局所的な注射；リポソーム媒介転移；直接注射（裸のＤＮＡ）；または微粒子銃（遺伝子銃）によってインビボで達成され得る。

【0077】

本開示の組成物は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて使用して、それらの治療効果を増強するか、または潜在的な副作用を減少させることができる。

【0078】

本発明の別の目的は、上記の組換え融合タンパク質およびそれを含む医薬組成物を調製する方法を提供することである。一実施形態において、この方法は、（１）タンパク質コード化ポリヌクレオチド分子を提供するステップと、（２）（１）のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを構築するステップと、（３）（２）の発現ベクターを用いて適切な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、該宿主細胞を培養してタンパク質を発現させるステップと、（４）タンパク質を精製するステップと、を含む。調製は、通常の熟練した職人による周知の技術を用いて行うことができる。

【0079】

本発明の別の目的は、有効量の前述の医薬組成物を、それを必要とする患者または被験体に投与することを含む、本発明の組換え融合タンパク質または本発明の医薬組成物を用いて癌を治療する方法を提供することである。一実施形態において、医薬組成物は、結腸直腸（大腸）、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、頸部、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群を含むがこれらに限定されない、ＴＧＦβおよび／またはＰＤ－Ｌ１過剰発現腫瘍または癌を治療するために使用される。

【0080】

次に、本発明を以下の非限定的な例でさらに説明する。
実施例

【0081】

以下の実施例では、本開示の４つの例示的な融合タンパク質、Ｔｒａｐ－１２、Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４およびＴｒａｐ－１５を調製し、試験した。リンカーを介して２つのＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインに融合した１つの抗ＰＤ－１抗体を含む、融合タンパク質の概略図を図１に示す。

【0082】

Ｔｒａｐ－１２は、配列番号１０の２つのポリペプチドおよび配列番号５の２つのポリペプチドによって形成された。Ｔｒａｐ－１３は、配列番号１１の２つのポリペプチドおよび配列番号５の２つのポリペプチドによって形成された。Ｔｒａｐ－１４は、配列番号１２の２つのポリペプチドおよび配列番号５の２つのポリペプチドを含有している。Ｔｒａｐ－１５は、配列番号１３の２つのポリペプチドおよび配列番号５の２つのポリペプチドを含有している。
実施例１．Ｔｒａｐ－１２、Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４およびＴｒａｐ－１５を発現させるベクターの構築

【0083】

重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインをコードするヌクレオチド酸（それぞれ配列番号１０、１１、１２および１３に示されるアミノ酸）および軽鎖（配列番号５に示されるアミノ酸）を、ＧＥＮＥＷＩＺにより合成し、それぞれ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。
実施例２．タンパク質の発現と精製

【0084】

実施例１で構築されたベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って用いて、ＣＨＯ－Ｓ細胞にコトランスフェクトした。培養上清を１２日目に採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例3．ＰＤ－１に結合した例示的な融合タンパク質

【0085】

融合タンパク質のヒトＰＤ－１への相対的結合能力を決定するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。

【0086】

ヒトＰＤ－１タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２１）を、４℃、２５ｎｇ／ウェルで一晩インキュベートすることにより、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）中の９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることにより遮断した。遮断後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。段階希釈した融合タンパク質（Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４およびＴｒａｐ－１５）、陽性コントロールとしての抗ＰＤ－１抗体（ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８７２８７に開示の抗体２１Ｆ１２－１Ｆ６であり、本明細書では抗ヒトＰＤ－１とも呼ばれ、それぞれ配列番号１４および５のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を有する）、および陰性コントロールとしての自社製の抗ＴＩＭ３抗体（本明細書ではヒトＩｇＧコントロールとも呼ばれ、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８２３１８に開示の抗体ＴＩＭ３－６．１２である）を、結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製し、固定化ＰＤ－１タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）²抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９７）とともに３７℃で１時間インキュベートした。再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４０２８）で１５分間発色させた後、１ＭＨ₂ＳＯ₄で停止させた。各プレートウェルには、各ステップで５０μＬの溶液を含有していた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定し、ヒトＰＤ－１に結合する融合タンパク質に対するＥＣ₅₀値および結合曲線を、図２に示した。

【0087】

データは、本開示の融合タンパク質がＰＤ－１結合能力を維持し、抗体２１Ｆ１２－１Ｆ６とほぼ同等のＥＣ₅₀値を有することを示した。
実施例４．ＴＧＦβ１に結合した例示的な融合タンパク質

【0088】

融合タンパク質のヒトＴＧＦβ１への相対的結合能力を決定するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。

【0089】

ヒトＴＧＦβ１タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＡ５９）を、４℃、１０ｎｇ／ウェルで一晩インキュベートすることにより、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）の９６ウェルプレートに固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることにより遮断した。遮断後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。段階希釈した融合タンパク質（Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４およびＴｒａｐ－１５）、陽性コントロールとしてのヒトＴＧＦβＲ２－ｈＦｃ（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＴＧ２－Ｈ５２５２）、および陰性コントロールとしての抗ＴＩＭ３抗体を結合バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で調製し、固定化ヒトＴＧＦβ１タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした。結合後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、結合バッファー中に１／２００００希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－０９８）とともに３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄し、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２８）で１５分間発色させた後、１ＭＨ₂ＳＯ₄で停止させた。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。ヒトＴＧＦβ１に結合する融合タンパク質に対するＥＣ₅₀値と結合曲線を、図３に示した。

【0090】

データは、ヒトＴＧＦβ１に結合した本開示の融合タンパク質がヒトＴＧＦβＲ２－ｈＦｃと類似のＥＣ₅₀値を有することを示唆した。
実施例５．ＰＤ－１およびＴＧＦβ１に対する例示的な融合タンパク質の結合親和性

【0091】

ヒトＰＤ－１、カニクイザルＰＤ－１、ヒトＴＧＦβ１およびラットＴＧＦβ１に対するＴｒａｐ－１５の動態結合活性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６を用いてバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ）により測定された。

【0092】

ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）をランニングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．０）に事前に浸し、ランニングバッファーに１００秒間浸してベースラインを確立した後、バイオセンサーに０．８ｎＭＴｒａｐ－１５をロードするまで、ランニングバッファー中の５μｇ／ｍＬのＴｒａｐ－１５を有するウェルに浸した。ベースラインバランスのために、バイオセンサーをランニングバッファーに１００秒間浸した。次に、バイオセンサーを、ランニングバッファーにて４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、および６．２５ｎＭで段階希釈したヒトＰＤ－１（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２１）またはカニクイザルＰＤ－１（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｃ５２２３）を有するウェルに２００秒間浸し、次いで、ランニングバッファーに６００秒間浸した。

【0093】

ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）をランニングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．０）に事前に浸し、ランニングバッファーに１００秒間浸してベースラインを確立した後、バイオセンサーに１．２ｎＭ Ｔｒａｐ－１５をロードするまで、ランニングバッファー中の２０μｇ／ｍＬのＴｒａｐ－１５を有するウェルに浸した。ベースラインバランスのために、バイオセンサーをランニングバッファーに１００秒間浸した。次に、バイオセンサーを、ランニングバッファーにて１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、および１．５６ｎＭで段階希釈したヒトＴＧＦβ１（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．１０８０４－ＨＮＡＣ）およびラットＴＧＦβ１（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．ＣＫ３３）を有するウェルに６０秒間浸し、次いで、ランニングバッファーに６００秒間浸した。

【0094】

結合曲線および解離曲線を、Ｏｃｔｅｔ評価ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。Ｋ_a、Ｋ_dおよびＫ_Dの値を決定し、以下の表１にまとめた。

【0095】

データは、Ｔｒａｐ－１５が４つのタンパク質に高い親和性で結合することを示した。

【表1】

実施例６．ＴＧＦβ－ＴＧＦβＲ相互作用を遮断した例示的な融合タンパク質

【0096】

ＴＧＦβタンパク質は細胞表面のＴＧＦβ受容体に結合し、シグナル伝達カスケードを開始して、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のリン酸化と活性化を引き起こし、ＳＭＡＤ４と複合体を形成する。次に、ＳＭＡＤ複合体は核に移行し、核内のＳＭＡＤ結合要素（ＳＢＥ）に結合して、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ応答性遺伝子の転写と発現を引き起こす。ＴＧＦβ－ＴＧＦβＲ相互作用の遮断に関する本開示の融合タンパク質の活性を、これに基づいて試験した。

【0097】

２９３Ｔ細胞をｐＧＬ４．４８［ｌｕｃ２Ｐ／ＳＢＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３６７Ａ）で、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０２７）を用いてトランスフェクトした後、限界希釈することにより、安定した細胞株２９３Ｔ／ＳＢＥ－ｌｕｃ２Ｐを調製した。得られた細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９１４１）および８５μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０６８７０１０）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１９９５０６５）で培養した。

【0098】

１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中の２９３Ｔ／ＳＢＥ－ｌｕｃ２Ｐ細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）、５００００細胞／ウェルにロードした。１０％ＦＢＳおよび１．２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１タンパク質（Ｓｉｎｏ、１０８０４－ＨＮＡＣ）を有するＤＭＥＭで、段階希釈したＴｒａｐ－１５およびコントロール抗体（Ｍ７８２４、ＵＳ２０１５／０２２５４８３Ａ１に記載、配列番号１５の重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲ断片および配列番号１６の軽鎖を有する）を、それぞれＲＴで約３０分間インキュベートし、その後、２９３Ｔ／ＳＢＥ－ｌｕｃ２Ｐ細胞を含有する９６ウェルプレートに６０μｌ／ウェルで添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで１６～１８時間インキュベートした。次に、６０μｌ／ウェルの上清を廃棄し、６０μｌ／ウェルのＯｎｅ－ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）をアッセイプレートに添加した。発光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｆ２００）を用いて発光を測定した。

【0099】

ＩＣ₅₀値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって適合した阻害剤の用量反応可変勾配（４つのパラメーター）で決定され、用量依存曲線を図４に示した。

【0100】

結果は、Ｔｒａｐ－１５の遮断活性がＭ７８２４とほぼ同等であることを示した。
実施例７．ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断した例示的な融合タンパク質

【0101】

ＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１エフェクター細胞を、ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１標的細胞と共培養すると、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用によりＴＣＲ－ＮＦＡＴ媒介発光はほとんど観察されない。ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用が遮断されると発光が見られる。したがって、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断に関する本開示の融合タンパク質の活性を、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１レポーター遺伝子アッセイで試験した。

【0102】

チャイニーズハムスター卵巣上皮ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－６１）を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で１０％ＦＢＳ含有Ｆ－１２Ｋ培地において維持した。ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする核酸分子（配列番号１７に示されるＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸）を含むベクターと、ＯＫＴ３－ｓｃＦｖをコードする核酸分子（配列番号１８に示されるアミノ酸配列）を含むベクターとを、ポリエチレンイミン（ＭＷ２５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号２３９６６－２）を用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞にコトランスフェクトし、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＯＫＴ３－ｓｃＦｖを安定的に発現するＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１細胞株クローンを、限界希釈により得た。

【0103】

エレクトロポレーションにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞株（中国科学院のセルバンク（上海、中国）、クローンＥ６－１）に、配列番号１９のヒトＰＤ－１およびｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ８４８Ａ）をコードする核酸分子を含むベクターをコトランスフェクトすることにより、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ－１細胞株を調製し、ヒトＰＤ－１およびＮＦＡＴを安定的に発現するクローンを、限界希釈により得た。

【0104】

１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２２４０００８９）で段階希釈したＴｒａｐ－１５およびＭ７８２４を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９１７）に６０μｌ／ウェルで播種した。次に、プレートに、１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地に、３００００個のＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＰＤ１細胞と２００００個のＣＨＯ－ＯＫＴ３－ＰＤ－Ｌ１細胞とを含有する６０μｌ／ウェルの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターで１６～１８時間インキュベートした。その後、６０μｌ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ^TM試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）をアッセイプレートに添加し、発光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｆ２００）を用いて発光を測定した。ＥＣ₅₀値を計算し、用量依存曲線を図５に示した。

【0105】

データは、Ｔｒａｐ－１５がＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用においてＭ７８２４よりも優れた遮断活性を持っていることを示唆した。
実施例８．Ｔｒａｐ－１５はヒトＴＧＦβ１に拮抗し、ＰＢＭＣ機能を再活性化した

【0106】

免疫抑制因子ＴＧＦβ１の存在下でＴｒａｐ－１５がヒトＰＢＭＣ機能を再活性化できるかどうかを決定するために、細胞ベースアッセイを行った。

【0107】

ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから採取した。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｎｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＳｅｐＭａｔｅ－５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３７９９）に対して、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬ機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）を４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートをＤＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄した。１×１０⁵／ウェルのＰＢＭＣをプレートに加えた。段階希釈したＴｒａｐ－１５、Ｍ７８２４、抗ＰＤ－１抗体（抗体２１Ｆ１２－１Ｆ６）およびＩｇＧコントロール（陰性コントロールＩｇＧ）（重鎖：配列番号２２；軽鎖：配列番号２３）を、ヒトＴＧＦβ１（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０８０４－ＨＮＡＣ）と別々に混合してプレートに加え、プレート中のＴＧＦβ１の最終濃度は５ｎｇ／ｍＬであった。３７℃で７２時間細胞培養した後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２８５Ｂ）を用いてＩＦＮγレベルをテストした。結果を図６に示した。

【0108】

結果は、Ｔｒａｐ－１５がＰＤ－１とＴＧＦβ１の両方を遮断し、ＰＢＭＣを再活性化し、用量依存的にＩＦＮγレベルを上昇させることができることを示した。驚いたことに、Ｍ７８２４はこのアッセイシステムでは何の効果も示さなかった。
実施例９．Ｔｒａｐ－１５は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導しなかった

【0109】

ＡＤＣＣ効果を消失させるためにＴｒａｐ－１５のＦｃ領域を変異させる。ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを行い、Ｔｒａｐ－１５がＡＤＣＣ効果を有するかどうかを確認した。ヒトＰＤ－１（配列番号１９）をコードする核酸配列を含むベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞株にトランスフェクトすることにより、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１細胞を調製した。ヒトＰＤ－１を安定的に発現するクローンを、限界希釈によって得た。

【0110】

ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１細胞を、ウェル当たり１００００個細胞の密度で播種し、アッセイバッファー（フェノールレッドを含有しないＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４１０６１－０２９）＋１％ＦＢＳ）中で３０分間、１００ｎＭまたは１０ｎＭのＴｒａｐ－１５またはＩｇＧ４コントロール（重鎖：配列番号２４；軽鎖：配列番号２５）とプレインキュベートした。健康なドナーからのＰＢＭＣエフェクター細胞を添加して、１０：１、２５：１、または５０：１のＥ／Ｔ（エフェクター細胞ＰＢＭＣ／標的細胞ＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１）比で、ＡＤＣＣ効果を開始した。Ｒａｊｉ細胞に対するリツキシマブのＡＤＣＣ効果を内部コントロールとして使用して、アッセイの質を確実なものとした。３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターにおいて２４時間インキュベートした後、細胞上清を回収し、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号ＣＫ１７）を使用して検出した。ＯＤ_490nmでの吸光度をＦ５０（Ｔｅｃａｎ）で読み取った。細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従って計算した。
細胞溶解％＝１００×（ＯＤ_サンプル－ＯＤ_{標的細胞+エフェクター細胞}）／（ＯＤ_最大放出－ＯＤ_最小放出）。
データをＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0111】

図７に示すデータは、Ｔｒａｐ－１５がＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１標的細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導しないことを示した。
実施例１０．Ｔｒａｐ－１５は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導しなかった

【0112】

ＣＤＣ効果を消失させるためにＴｒａｐ－１５のＦｃ領域を変異させる。ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを行い、Ｔｒａｐ－１５がＣＤＣ効果を有するかどうかを確認した。ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１細胞を、ウェル当たり５０００個細胞の密度で播種し、アッセイバッファー（フェノールレッドフリーＭＥＭ培地＋１％ＦＢＳ）中で３０分間、段階希釈したＴｒａｐ－１５およびＩｇＧコントロール（重鎖：配列番号２２；軽鎖：配列番号：２３）、（５０μｇ／ｍＬから開始し、７つの濃度ポイントに５倍希釈した）とプレインキュベートした。プレートに次いで、健康なドナーからの血漿を最終濃度２０ｖ／ｖ％で添加して、ＣＤＣ効果を開始した。３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターにおいて４時間インキュベートした後、細胞にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－Ｌｉｔｅ２．０ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ試薬（Ｖａｚｙｍｅ）を加え、ＲＬＵデータをＦ２００（Ｔｅｃａｎ）で読み取った。細胞溶解のパーセンテージを、以下の式に従って計算した。
細胞溶解％＝１００×（１－（ＲＬＵ_サンプル－ＲＬＵ_{バックグラウンド}）／（ＲＬＵ_{細胞+正常なヒト血漿}－ＲＬＵ_{バックグラウンド}））。

【0113】

図８に示すデータは、Ｔｒａｐ－１５がＣＨＯ－Ｋ１／ＰＤ－１発現ＰＤ－１標的細胞に対してＣＤＣ効果を誘導しないことを示した。
実施例１１．ＭＣ３８－ＯＶＡモデルに対するＴｒａｐ－１５の抗腫瘍効果

【0114】

ＭＣ３８－ＯＶＡ腫瘍モデルを有するｈＰＤ－１ノックインマウスにおいてＴｒａｐ－１５のインビボでの有効性を試験した。この試験では、ヒトＰＤ－１細胞外部分ノックインマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｐｄｃｄ１^{em1(PDCD1)Smoc}（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｃ）を用いた。

【0115】

ＭＣ３８細胞には、レトロウイルス形質導入を用いて、オボアルブミン（ＡＡＢ５９９５６）をコードする核酸が形質導入された。続いて、限界希釈によって細胞をクローン化した。ＯＶＡタンパク質を高度に発現するクローンをＭＣ３８－ＯＶＡ細胞株として選択した。

【0116】

５～６週間のＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｐｄｃｄ１^{em1(PDCD1)Smoc}マウスにそれぞれ１×１０⁶ＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を皮下移植し、前記マウスを、平均腫瘍容積が約８０ｍｍ³（長さ×幅²／２）に達した０日目にランダムに群に分けた。０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、および１７日目には、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのＴｒａｐ－１５、ニボルマブ（重鎖：配列番号２０；軽鎖：配列番号２１）およびＰＢＳをそれぞれ腹腔内投与した。試験中、週に２回キャリパー測定により腫瘍容積をモニタリングした。データを以下の表２と図９に示した。

【0117】

単剤療法としてのＴｒａｐ－１５による治療は、ＰＢＳ群と比較して有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。Ｔｒａｐ－１５の阻害効果はニボルマブよりも優れている。

【表2】

実施例１２．例示的な融合タンパク質の熱安定性

【0118】

この実施例では、Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４、およびＴｒａｐ－１５の熱安定性をテストした。簡単に説明すると、融合タンパク質を４０℃で２週間保存し、０日目、７日目、および１４日目にテストを行った。タンパク質の純度をサイズ排除クロマトグラフィーで測定した。特に、１００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ Ｎａ₂ＳＯ₄、ｐＨ７．０をランニングバッファーとして用いて、２０μｇの融合タンパク質をＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラムに注入した。すべての測定はＡｇｉｌｅｎｔ １２２０ ＨＰＬＣで行われた。ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを使用してデータを分析し、表３にまとめた。

【0119】

結果は、Ｔｒａｐ－１３、Ｔｒａｐ－１４およびＴｒａｐ－１５が、高温での２週間の保管中に比較的安定していることを示した。

【表3】

【0120】

本開示のシーケンスを以下にまとめる。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【0121】

本発明は、１つ以上の実施形態に関連して上記で説明されてきたが、本発明はそれらの実施形態に限定されず、説明は、添付の特許請求項の精神と範囲内に含まれる、すべての選択肢、修正および均等物をカバーすることを意図していることを理解すべきであろう。本明細書で引用されているすべての参照文献は、参照によりその全体がさらに組み込まれる。
本発明の態様の一部を以下に記載する。
１．ａ）ＴＧＦβに結合する、ヒトＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはその断片と、
ｂ）ＰＤ－１に結合し、かつ、配列番号２を含む重鎖可変領域の３ＣＤＲと配列番号３を含む軽鎖可変領域の３ＣＤＲとを含む、抗体またはその抗原結合断片と、を含む、組換え融合タンパク質であって、前記ヒトＴＧＦβＲ２細胞外ドメインが、リンカーを介して、前記抗体の重鎖のＣ末端に連結され、重鎖－リンカー－ＴＧＦβＲ２融合タンパク質を形成し、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、配列番号２を含む前記重鎖可変領域の３ＣＤＲが、ＳＹＹＩＨ、ＶＩＮＰＳＧＧＳＴＴＹＡＱＫＦＱＧおよびＧＳＹＳＳＧＷＤＹＹＹＹＹＧＭＤＶであり、配列番号３を含む前記軽鎖可変領域の３ＣＤＲが、ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＱＧＹＮＹＬＤ、ＬＧＳＮＲＡＳおよびＭＱＡＬＱＴＰＷＴであり、そして前記リンカーが、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む、組換え融合タンパク質。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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