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▶ テグ キョンプク インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-27
(45)【発行日】2024-06-04
(54)【発明の名称】ＧＦＲＡＬ拮抗抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240528BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240528BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240528BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240528BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240528BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240528BHJP
A23L 33/00 20160101ALI20240528BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240528BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20240528BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240528BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240528BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A23L33/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P1/14
C12N15/13
C12P21/08
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022574556
(86)(22)【出願日】2021-06-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-12
(86)【国際出願番号】 KR2021006865
(87)【国際公開番号】W WO2021246773
(87)【国際公開日】2021-12-09
【審査請求日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】10-2020-0067543
(32)【優先日】2020-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0068874
(32)【優先日】2021-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519341706
【氏名又は名称】テグ キョンプク インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＧＵ ＧＹＥＯＮＧＢＵＫ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100175477
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 林太郎
(72)【発明者】
【氏名】イエ キョンムー
(72)【発明者】
【氏名】イ ボムヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョン ジョンウォン
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１３０１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１３２２４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ０７Ｋ １６／１８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
を含む、抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
請求項１に記載の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片をコーディングする、核酸分子。
【請求項3】
請求項２に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項4】
請求項３に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、細胞。
【請求項5】
請求項１に記載の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
請求項１に記載の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項7】
請求項１に記載の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
前記抗ガン剤は、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートからなる群から選択された何れか１つ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
請求項1に記載の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む、抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または改善用健康機能食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＧＦＲＡＬ拮抗抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
１９７５年、最初の単クローン抗体を導出した以来、抗原に対する強い結合親和力を有する抗体の特性を用いて、１９９４年、最初に抗体治療剤が発売され、治療用抗体は、医薬品中で最も速い成長を記録している。２００７年、基準治療用抗体の世界市場規模は、２７０億ドルであり、２０１１年４４７億ドル、２０１６年５７７億ドルに持続的な成長を示している。このような成長に基づいて、２０１４年度基準全世界医薬品売上のうち、抗体医薬品の売上比重は、１０％を記録し、２０１６年度売上上位１０個の医薬品のうち、６個が抗体医薬品である。化学合成物質を基盤とした既存の治療剤に比べて、抗体医薬品は、高い結合特異性及び人体内の安定性によって相対的に副作用が少なく、治療効能は優れていると証明されており、抗体医薬品の開発分野は、新薬研究開発の次世代核心分野としして脚光を浴びている。これと共に、抗体医薬品の開発過程に必須的な高分子タンパク質発現、生産、精製及び工学技術などの飛躍的な発展と臨床実験成功率とが高くて、抗体医薬品は、次世代治療剤として定着するものと見られる。
【0003】
癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ、Ｃａｎｃｅｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｏｒｅｘｉａ－ｃａｃｈｅｘｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、持続的な食欲不振及び体重減少を特徴とした過度な異化状態を意味し、これにより、筋肉及び脂肪分解の増加、栄養学的代謝不均衡、基礎代謝量の増加などを招いて、全体的な身体機能の低下をもたらす。このようなＣＡＣＳは、癌患者で重要な死亡原因の１つであり、否定的な治療結果を予測することができる最も重要な独立予後因子である。さらに、抗ガン化学療法や放射線治療または手術などの治療による栄養摂取の制限などが伴われて治療に対する反応率が低く、効率的な治療の進行も難しくなって、結果として患者の生存率や生活の質を低下させる主要原因である。それにも拘らず、ＣＡＣＳは、過小評価されており、未充足医療需要が残っているが、現在、一般的な食欲促進剤、筋肉合成促進剤などとしては効果的な治療を期待しにくい状況である。
【0004】
ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）は、免疫反応、代謝作用などに関与して生体内で多様な機能を行うサイトカインである。正常な状況でＧＤＦ１５は、ほとんどの組織で低濃度で発現され、肝、腎臟、心臓及び肺のような組織の損傷時に、その数値が大きく増加する。２００７年、前立腺癌患者の体内で食欲不振を通じた悪液質を誘導する物質が、ＧＤＦ１５であり、前立腺癌患者の場合、血液内のＧＤＦ１５の濃度が正常者の１０～１００倍に増加し、癌患者の食欲不振を通じた体重減少とＧＤＦ１５濃度との間に明らかな相関関係があることが明かになった（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００７；１２（１０）；１３３３－４０）。２０１６年、ＧＤＦ１５が多様な癌腫で悪液質を誘導する主要サイトカインであることが明かされ、ＧＤＦ１５抗体は、多様な癌悪液質マウスモデルで体重の増加と筋肉、脂肪組織の損失を緩和し、悪液質の改善効果を示した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｃｈｅｘｉａ，ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ２０１６；７：４６７－４８２）。
【0005】
２０１５年、シスプラチンのような化学抗ガン剤を処理した時の副作用としてＧＤＦ１５発現が増加し、食欲不振と悪液質症状とを通じて抗ガン治療に対する抵抗性を増加させるということが知られた（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１５；１０（１）；ｅ０１１５３７２）。２０１７年、ＧＤＦ１５が受容体ＧＦＲＡＬを通じて食欲を抑制するという事実が明らかになり、ＧＤＦ１５単独処理あるいはシスプラチン処理後、ＧＤＦ１５の信号伝達過程は、ＧＦＲＡＬ依存的に作用するということが明かになった（Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；５５０（７６７５）；２５５－２５９）。ＧＦＲＡＬは、共同受容体ＲＥＴと共に細胞の内部に信号を伝達し、抗体医薬品の接近が可能な脳血管障壁の外側である後脳（ｈｉｎｄｂｒａｉｎ）ＡＰ（Ａｒｅａ ｐｏｓｔｒｅｍａ）、ＮＴＳ（Ｎｕｃｌｅｕｓ ｔｒａｃｔｕｓ ｓｏｌｉｔａｒｉｓ）地域に特異的に発現する。
【0006】
これにより、抗ＧＦＲＡＬ抗体は、シスプラチンのような白金抗ガン剤の投与によってＣＡＣＳを経験する癌患者の食欲不振現象を改善し、それによる体重の増加と骨格筋代謝量の増加とを通じて抗ガン化学療法に対する抵抗性を減らして、癌患者の福祉増加及び生命延長に寄与することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、該核酸分子を含む組換え発現ベクター及び該組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供することである。
【0009】
本発明のさらに他の目的は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防、改善または治療用組成物を提供することである。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防、改善または治療用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記目的を果たすために、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0012】
また、本発明は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0013】
また、本発明は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0014】
また、本発明は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0015】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を提供する。
【0016】
また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0017】
また、本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0018】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0019】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0020】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0021】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【0022】
本発明は、ＧＦＲＡＬ拮抗抗体及びその用途に関するものであって、より詳細に、本発明は、特定配列の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片に係わるものです。前記抗ＧＦＲＡＬ抗体は、癌関連食欲不振または悪液質症候群及び化学療法抗ガン剤の副作用の改善または治療に有用に活用されうると予想される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】エポキシビーズと抗原ＧＦＲＡＬ（マウス及びヒト）とを利用したファージディスプレイ方法を図示して示した図面である。
【図2】酸性バッファを利用した溶出後、ファージディスプレイの各ラウンド別のバクテリオファージライブラリーのＧＦＲＡＬに対する結合力を多重ファージ酵素結合免疫吸着分析法を通じて確認した結果である。
【図3】リガンドＧＤＦ１５を利用した溶出後、ファージディスプレイの各ラウンド別のバクテリオファージライブラリーのＧＦＲＡＬに対する結合力を多重ファージ酵素結合免疫吸着分析法を通じて確認した結果である。
【図4】単一ファージ酵素結合免疫吸着分析法進行後、ＧＦＲＡＬに対する結合力を確認した４種の単クローンの結果である。
【図5】４種の単クローンのＣＤＲ部位別のアミノ酸配列を確認した結果である。
【図6】４種の単クローンをタンパク質で発現、精製後、ＧＦＲＡＬに対する結合力を酵素結合免疫吸着分析法を通じて確認した結果である。
【図7】単クローンＡ１１がＧＦＲＡＬに結合することを免疫細胞化学法で確認した結果である。
【図8】商業用抗体がＧＦＲＡＬに結合することを免疫細胞化学法で確認した結果である。
【図9】単クローンＡ１１のＧＦＲＡＬに対する結合力を表面プラスモン共鳴を通じて確認した結果である。
【図10】ＧＦＲＡＬ／ＲＥＴ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ過発現細胞で単クローンＡ１１によるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現減少をレポーターアッセイを通じて確認した結果である。
【図11】ＧＦＲＡＬ／ＲＥＴ過発現細胞で単クローンＡ１１によるｐＥＲＫ発現減少をウェスタンブロットを通じて確認した結果である。
【図13】マウスモデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの体重減少効果の緩和を確認した結果である。
【図14】マウスモデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの食欲減少効果の緩和を確認した結果である。
【図15】マウスモデルでシスプラチンによって変化したＧＤＦ１５の濃度を確認した結果である。
【図16】マウスモデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの脂肪量減少効果の緩和を確認した結果である。
【図17】マウスモデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの筋肉量減少効果の緩和を確認した結果である。
【図18】マウスモデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの活性抑制を免疫組織化学法を通じて確認した結果である。
【図19】同種移植マウス腫瘍モデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの体重減少効果の緩和を確認した結果である。
【図20】同種移植マウス腫瘍モデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの食欲減少効果の緩和を確認した結果である。
【図21】同種移植マウス腫瘍モデルでシスプラチンによって変化したＧＤＦ１５の濃度を確認した結果である。
【図22】同種移植マウス腫瘍モデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの脂肪量減少効果の緩和を確認した結果である。
【図23】同種移植マウス腫瘍モデルで単クローンＡ１１によるシスプラチンの筋肉量減少効果の緩和を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0025】
また、本発明は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0026】
また、本発明は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0027】
また、本発明は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【0028】
一方、配列番号１ないし配列番号２４で表されるアミノ酸からなるＣＤＲは、下記の表１に記載した。
【0029】
【表1】
【0030】
本発明において、用語、「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割を行うタンパク質分子を意味し、その例として、単クローン抗体、多クローン抗体、全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び抗体断片をいずれも含みうる。また、前記用語、「抗体」は、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ、トリアボディまたはテトラボディを含みうる。
【0031】
本発明において、用語、「単クローン抗体」は、実質的に同じ抗体集団から収得した単一分子組成の抗体分子を称し、このような単クローン抗体は、多クローン抗体が複数個のエピトープに結合することができるものとは異なって、特定エピトープについて単一結合性及び親和度を示す。本発明において、用語、「全長抗体」は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスでガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。ＩｇＧは、サブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）であって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【0032】
本発明において、用語、「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＨ及び３個の不変領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片をいずれも含みうる。また、本発明において、用語、「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＬ及び不変領域ＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片をいずれも含みうる。
【0033】
本発明において、用語、「断片」、「抗体断片」及び「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合機能を保有する本発明の抗体の任意の断片を称するものであって、互換的に使われる。例示的な抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含むが、これに制限されるものではない。
【0034】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＧＦＲＡＬに特異的に結合する能力を示すことができる範囲内で、本明細書に記載の抗体の配列だけではなく、その生物学的均等物も含みうる。例えば、抗体の結合親和度及び／またはその他の生物学的特性をさらに改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは、全部正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは、類似したサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似した形状を有するということが分かる。したがって、利点に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物であると言える。
【0035】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を提供する。
【0036】
本明細書で使われる用語、「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸分子の配列は、変形され、前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【0037】
また、本発明は、前記核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0038】
本発明において、「ベクター」は、クローン遺伝子（または、クローンＤＮＡの他の切片）を運ぶのに使われる自ら複製されるＤＮＡ分子を意味する。
【0039】
本発明において、「発現ベクター」は、目的したコーディング配列と、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須的な適正核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を意味する。発現ベクターは、望ましくは、１つ以上の選択性マーカーを含みうる。前記マーカーは、通常の化学的な方法で選択される特性を有する核酸配列であって、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別することができるあらゆる遺伝子がこれに該当する。その例としては、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｇ４１８）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子があるが、これに限定されるものではなく、当業者によって適切に選択可能である。
【0040】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうち、如何なるものでもベクターに使われる。有用な発現調節配列の例には、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶのプロモーターとエンハンサー、レトロウイルスのＬＴＲ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記フォスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ－交配システムのプロモーター及び原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られた構成と誘導のその他の他の配列及びこれらの多様な組み合わせが含まれうる。
【0041】
本発明の抗体を発現するベクターは、軽鎖と重鎖とが１つのベクターで同時に発現されるベクターシステムであるか、または軽鎖と重鎖とをそれぞれ別途のベクターで発現させるシステムいずれも可能である。後者の場合、２つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて宿主細胞に導入される。同時形質転換は、軽鎖及び重鎖をコーディングするそれぞれのベクターＤＮＡを同時に宿主細胞に導入した後、軽鎖と重鎖とを全部発現する細胞を選別する方法である。標的形質転換は、軽鎖（または、重鎖）を含むベクターで形質転換された細胞を選別し、軽鎖を発現する選別された細胞を重鎖（または、軽鎖）を含むベクターで再び形質転換して、軽鎖及び重鎖いずれもを発現する細胞を最終的に選別する方法である。
【0042】
また、本発明は、組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0043】
本発明のベクターを安定しながら連続的にクローニング及び発現させる細胞は、関連技術分野に公知の任意の宿主細胞である、例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス及びバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を含むが、これらに制限されるものではない。
【0044】
前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法において、形質転換細胞の培養は、関連技術分野に公知の適当な培地と培養条件とによって行われうる。このような培養過程は、通常の技術者であれば、選択される菌株によって容易に調整して使用することができる。細胞培養は、細胞の成長方式によって懸濁培養と付着培養、培養方法によって回分式、流加式及び連続培養式の方法に区分される。培養に使われる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。
【0045】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0046】
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含み、前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の癌転移の予防または治療用組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。
【0047】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時に、タンパク質またはペプチドは、消化になるために、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化され、本発明の組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与される。
【0048】
本発明の薬学組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常熟練した医者は、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。
【0049】
本発明の薬学組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化して、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【0050】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む癌関連食欲不振または悪液質症候群（ＣＡＣＳ）の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0051】
前記健康機能食品組成物は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ、飲料または丸の形態で提供され、前記健康食品組成物は、有効成分である本発明による組成物の以外に、他の食品または食品添加物と共に使われ、通常の方法によって適切に使われる。有効成分の混合量は、その使用目的、例えば、予防、健康または治療的処置によって適するように決定される。
【0052】
前記健康機能食品組成物に含有された抗体またはその抗原結合断片の有効容量は、前記薬学組成物の有効容量に準じて使用することができるが、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記範囲以下であり、有効成分は、安全性面で何らの問題がないために、前記範囲以上の量でも使われるということは確実である。
【0053】
前記健康食品の種類には、特別な制限がなく、例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含んだ酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられる。
【0054】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0055】
また、本発明は、前記抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片を有効成分として含む抗ガン剤による食欲不振または悪液質の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0056】
より望ましくは、前記抗ガン剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）からなる群から選択された何れか１つ以上であるが、これらに制限されるものではない。
【0057】
また、本発明の抗ＧＦＲＡＬ抗体またはその抗原結合断片は、抗ガン補助剤として使われることもある。本発明において、抗ガン補助剤とは、抗ガン剤の投与時に、誘発される副作用を改善することができることを意味する。すなわち、本発明の抗ガン補助剤を抗ガン剤と併用して投与することにより、抗ガン剤によって誘発される多様な副作用の発生を予防することができる。本発明の前記補助剤は、抗ガン剤と同時に（ｓｉｍｕｔａｎｅｏｕｓ）、別途に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）に投与される。前記本発明による抗ガン補助剤の投与順序、すなわち、抗ガン剤と抗ガン補助剤との中から如何なるものを如何なる時点で、同時に、個別的または順次に投与するか否かは医者や専門家によって決定される。このような投与順序は、多くの因子によって変わりうる。
【0058】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【0059】
＜実施例１＞細胞培養
【0060】
ＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞（ヒト胚芽腎臓）は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン及びストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養し、Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞（ヒト胚芽腎臟）は、Ｅｘｐｉ－２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【0061】
＜実施例２＞ファージディスプレイ方法
【0062】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０エポキシビーズ（＃１４３０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組換えヒトＧＦＲＡＬ（＃９６４７－ＧＲ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）または組換えマウスＧＦＲＡＬ（＃９８４４－ＧＲ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を結合させた後、ヒト患者由来のｓｃＦｖライブラリーを利用したファージディスプレイを進めた。ヒトＧＦＲＡＬとマウスＧＦＲＡＬとについて交互にそれぞれ２回のパンニングを進めた。ファージを常温で一般ビーズに１時間反応させた後、結合していない上澄み液をＧＦＲＡＬ結合ビーズに２時間反応させ、３～８回洗浄後、ＧＦＲＡＬと結合したファージを組換えヒトＧＤＦ１５リガンド（＃８１４６－ＧＤ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）または酸性バッファ（０．１Ｍグリシン－塩化水素、ｐＨ２．２）を用いて溶出した。
【0063】
＜実施例３＞多重クローンファージ酵素結合免疫吸着分析法
【0064】
９６ ｗｅｌｌ ｈａｌｆ ａｒｅａ ｐｌａｔｅ（＃３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を組換えヒトＧＦＲＡＬまたは組換えマウスＧＦＲＡＬ、またはウシ血清アルブミンと４℃で一晩中反応させてコーティングした後、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。以後、５％脱脂牛乳が含まれたＰＢＳで３７℃で１時間ブロッキングさせた。以後、ラウンド別のファージライブラリーと３７℃で２時間反応させた後、ＰＢＳを用いて５回洗浄し、ＨＲＰが接合された抗ファージ抗体（＃１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄した。最後に、ＴＭＢを用いて常温で１０分間発色させた後、停止液を用いて発色を停止させた。以後、マイクロプレートリーダー機を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0065】
＜実施例４＞単クローンファージ酵素結合免疫吸着分析法
【0066】
単クローンファージの獲得のために、９６ ｗｅｌｌ ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（＃９００６０、Ｂｉｏｎｅｅｒ）の各ウェルにカルベニシリン（＃Ｃ１３８９、Ｓｉｇｍａ）が５０ｕｇ／ｍｌの濃度で含まれたＳＢメディアを分注し、ファージライブラリーを含んだコロニーを接種させて、３７℃、２５０ｒｐｍの条件で３時間培養した。以後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを１０１０ ｐｈａｇｅ／ｍｌの濃度で処理し、同じ条件で２時間さらに培養した。以後、カナマイシン（＃Ｋ４０００、Ｓｉｇｍａ）を７０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理し、一晩中培養した。ファージ酵素結合免疫吸着分析法の進行時に、ブロッキング後、培養液のうち一部を処理し、残りの過程は、多重クローンファージ酵素結合免疫吸着分析法と同様に進めた。
【0067】
＜実施例５＞高性能液体クロマトグラフィーを利用した精製方法
【0068】
ＧＦＲＡＬに結合力を有する単クローンのｓｃＦｖ配列は、ｐＦＵＳＥベクター（＃ｐｆｕｓｅ ｈｇ１ｆｃ２、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に基づいて構成された発現ベクターでｓｆｉＩ制限酵素を用いて移された後、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内に形質注入された。形質注入は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を使用して進めた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を５００ｍｌのフラスコに約２．５×１０６細胞／ｍｌの密度で培養し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（＃３１９８５－０７０、Ｇｉｂｃｏ）培地下にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ、ｓｃＦｖを発現するベクターを混合して処理した後、３７℃、１２５ｒｐｍの条件で一晩中培養した。翌日ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １と２とを処理した後、３日間さらに培養して、ｓｃｆｖ－Ｆｃ形態の抗体を生成させた。次いで、上澄み液をＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）錠剤機とＩｇＧ分離カラム（＃１７－０４０４－０１、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とを用いて錠剤した。２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）でカラムに抗体を結合させた後、０．１Ｍグリシン－塩化水素バッファ（ｐＨ２．７）で溶出する過程を進めた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４－３０Ｋ（＃ＵＦＣ８０３０２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓｐｉｎ－Ｘ ｆｉｌｔｅｒ（＃８１６０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で滅菌した。内毒素は、内毒素除去カラム（＃８８２７４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて除去し、濃度は、ＢＣＡキット（＃２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
【0069】
＜実施例６＞抗体酵素結合免疫吸着分析法
【0070】
９６ ｗｅｌｌ ｈａｌｆ ａｒｅａ ｐｌａｔｅを組換えヒトＧＦＲＡＬまたは組換えマウスＧＦＲＡＬ、またはウシ血清アルブミンと４℃で一晩中反応させてコーティングした後、１次抗体でクローンｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体を、２次抗体でＨＲＰ接合された抗ヒトＩｇＧ抗体（＃Ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）を使用して酵素結合免疫吸着分析法を進めた。
【0071】
＜実施例７＞ＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞への形質注入
【0072】
ＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞を６ウェルプレートに約１×１０６細胞／ウェルの密度で接種し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地下にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（＃１１６６８－０２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧＦＲＡＬを発現するベクター（＃ＯＨｕ３１１８３Ｄ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＲＥＴを発現するベクター（＃ＨＧ１１９９７－ＣＦ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を１：１の比率で混合して処理した後、３７℃で一晩中培養した。翌日上澄み液を除去し、１０％ウシ胎児血清が添加された新鮮な培地に取り替えた。以後、ＥＲＫ信号伝達過程にルシフェラーゼを発現させるベクターを注入した後、３７℃で一晩中培養及び翌日上澄み液を除去し、１０％ウシ胎児血清が添加された新鮮な培地に取り替える過程をさらに進めた。
【0073】
＜実施例８＞免疫細胞化学法
【0074】
形質注入されたＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞を４ウェル細胞培養スライド（＃１５４５２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に約５×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、４％パラホルムアルデヒドを常温で１０分処理して固定した。次いで、１％ ＢＳＡ、５％ヤギ血清が含まれた０．１％ ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて１時間ブロッキングした。次いで、１次抗体で精製したクローン抗体または商業用ＧＦＲＡＬ抗体（＃Ａｂ１０７７１９、Ａｂｃａｍ）と１時間反応させた。ＰＢＳＴで３～５回洗浄後、ＦＩＴＣが結合された抗ヒトＩｇＧ抗体（＃９７２２４、Ａｂｃａｍ）または抗ウサギＩｇＧ抗体（＃Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間反応させた。ＰＢＳＴで３～５回洗浄後、ＤＡＰＩが含まれたＰＢＳを１５分処理した。マウンティング進行後、顕微鏡で蛍光を観察した。
【0075】
＜実施例９＞表面プラスモン共鳴分析法
【0076】
ヒト組換えＧＦＲＡＬに対するクローン抗体の結合程度の測定のために、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍを使用した。ヒト組換えＧＦＲＡＬをリガンドにして２０ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解後、ｐＨ６．０条件でアミン結合を用いてＰＥＧチップに固定させた。次いで、結合アッセイは、ｐＨ７．４条件でＰＢＳに溶解されたクローン抗体を分析物として進め、３０μｌ／ｍｌの流速で注入された。結合時間は、４分、解離時間は、６分で進め、センサー表面は、５～１０ｍＭ水酸化ナトリウムを注入して再生した。結合曲線と結合定数Ｋａ及び解離定数Ｋｄ、そして、平衡定数ＫＤ値は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアを使用して計算した。
【0077】
実験の結果、図９のような結合曲線を示し、結合定数Ｋａ値は、５．５５６×１０－５／Ｍ・ｓ、解離定数Ｋｄ値は、１．０８３×１０－３／ｓ、そして、平衡定数Ｋａ値は、ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａの計算方式を通じて１．９５ｎＭに計算された。
【0078】
＜実施例１０＞抗体によるルシフェラーゼの発現分析
【0079】
形質注入されたＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞を９６ウェルプレートに約７×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、２時間血清欠乏状態に保持し、以後、２時間クローン抗体を処理して反応させた。次いで、５分間ヒト組換えＧＤＦ１５を処理し、ルシフェラーゼ酵素の基質が含まれた試薬（＃Ｅ２６１０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光程度を測定した。
【0080】
実験の結果、図１０のように、ＧＤＦ１５のみを処理した時、発光値が増加し、クローンＡ１１及びＤ１２を前処理した実験群で処理濃度に依存的に減少することを確認した。
【0081】
＜実施例１１＞抗体によるｐＥＲＫの発現分析
【0082】
形質注入されたＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞を２４ウェルプレートに約２×１０５細胞／ウェルの密度で接種し、２時間血清欠乏状態に保持し、以後、２時間クローン抗体を処理して反応させた。次いで、５分間ヒト組換えＧＤＦ１５を処理し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を収穫してウェスタンブロットを進めた。細胞質または細胞膜タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。以後、それぞれの一次抗体と培養し、ＨＲＰが接合された二次抗体で培養した。ＥＣＬ検出試薬（＃３４０９５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＲＰＮ２２０９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してイメージを視覚化し、ＥＣＬハイパーフィルム（ＡＧＦＡ、Ｍｏｒｓｔｅｌ）を使用して定量化した。フィルム内のイメージは、ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して数値化し、ＡＡＴ ＢｉｏｑｕｅｓｔのＩＣ５０ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを通じてグラフで示した。
【0083】
実験の結果、図１１のように、ＧＤＦ１５のみを処理した実験群でｐＥＲＫの発現量が増加し、クローンＡ１１を前処理した実験群でｐＥＲＫ発現量が処理濃度に依存的に減少することを確認し、ＩＣ５０値は、４．９μｇ／ｍｌに測定された。フィルム内のイメージは、定量化して図１２のように示した。
【0084】
＜実施例１２＞抗体によるシスプラチンの副作用の緩和分析
【0085】
８週齢のマウスにシスプラチンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度で注入し、効能がない対照群抗体あるいはクローンＡ１１を１０ｍｇ／ｋｇ注入した後、シスプラチンによって誘導される副作用が緩和されるかを確認した。薬物は、一週間に２回の間隔で注入した。
【0086】
実験の結果、図１３のように、シスプラチンによって誘導される体重減少効果がＡ１１によって復旧されることを確認し、図１４のように、食欲減少効果も緩和させるということを確認した。図１５から分かるように、ＧＤＦ１５の発現程度は、対照群グループとＡ１１処理グループとで差がなかった。具体的な脂肪及び筋肉の重量変化は、図１６と図１７とのように定量して示した。図１８を通じてＡ１１の効果が、マウス脳のＧＦＲＡＬの作用を抑制することを通じて表われるということを確認した。
【0087】
＜実施例１３＞免疫組織化学法
【0088】
実施例１２で実験を進めたマウスを灌流固定して、固定させた脳組織を３０ｕｍの厚さに冷凍切片した。切片した組織は、１％ ＢＳＡ、５％ヤギ血清が含まれた０．１％ ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて１時間ブロッキングした後、１次抗体で商業用ＧＦＲＡＬ抗体（＃Ａｂ１０７７１９、Ａｂｃａｍ）、ｃ－Ｆｏｓ抗体（＃ｓｃ－１６６９４０、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８が結合された抗マウスＩｇＧ抗体（＃Ａ１１００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４が結合された抗ウサギＩｇＧ抗体（＃Ａ１１００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、ＤＡＰＩが含まれたＰＢＳを１５分処理した。マウンティング進行後、顕微鏡で蛍光を観察した。
【0089】
＜実施例１４＞同種移植マウス腫瘍モデルで抗体によるシスプラチンの副作用の緩和分析
【0090】
８週齢のマウスにＢ１６Ｆ１０－Ｌｕｃ細胞を約１×１０６細胞測量して注入した後、癌サイズが一定サイズ以上育った後、シスプラチンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度で注入し、効能がない対照群抗体あるいはクローンＡ１１を１０ｍｇ／ｋｇ注入して抗ガン治療モデルでシスプラチンによって誘導される副作用が緩和されるかを確認した。薬物は、一週間に２回の間隔で注入した。
【0091】
実験の結果、図１９のように、抗ガン治療状況でシスプラチンによって誘導される体重減少効果が、Ａ１１によって復旧されることを確認し、図２０のように、食欲減少効果も緩和させるということを確認した。図２１から分かるように、ＧＤＦ１５の発現程度は、対照群グループとＡ１１処理グループとで差がなかった。具体的な脂肪及び筋肉の重量変化は、図２２と図２３とのように定量して示した。
【0092】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とその等価物とによって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】