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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-29
(45)【発行日】2024-06-06
(54)【発明の名称】アミノ酸をヒドロキシル化するための融合タンパク質及び生成物
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240530BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20240530BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240530BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240530BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240530BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240530BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20240530BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240530BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C12N9/02
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/62 Z
C12N15/53
C12P21/02 B
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021507833
(86)(22)【出願日】2019-08-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019046883
(87)【国際公開番号】W WO2020037243
(87)【国際公開日】2020-02-20
【審査請求日】2022-06-23
(31)【優先権主張番号】62/719,419
(32)【優先日】2018-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517239441
【氏名又は名称】モダン メドウ，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100217663
【弁理士】
【氏名又は名称】末広 尚也
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ダイ，リキシン
(72)【発明者】
【氏名】スリヴァスタヴァ，プーナム
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００５／０１９４７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００３／０２５１６２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Biochemical Journal，2017年，Vol.474, pp.751-769
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質であって、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、前記融合タンパク質のＮ末端にあり、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、前記融合タンパク質のＣ末端にある、融合タンパク質。
【請求項2】
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、微生物。
【請求項5】
Ｎ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、Ｃ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む、微生物。
【請求項6】
Ｎ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、及びＣ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを含む融合タンパク質と、ヒドロキシル化される第２のタンパク質と、を含む、微生物。
【請求項7】
前記微生物は、桿菌、大腸菌、及び糸状菌からなる群から選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項8】
前記微生物は、酵母である、請求項４～６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項9】
前記第２のタンパク質は、コラーゲン、組換えコラーゲン、およびコラーゲン様タンパク質からなる群から選択される、請求項６～８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項10】
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、請求項４～９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項11】
タンパク質をヒドロキシル化するためのインビトロの方法であって、ヒドロキシル化されるタンパク質を含有する微生物を溶解して溶解物を生成することと、請求項１～３のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を前記溶解物に添加することと、前記融合タンパク質によってヒドロキシル化される前記タンパク質のヒドロキシル化を促進する反応条件下で、前記溶解物及び前記融合タンパク質をインキュベートすることと、を含む、方法。
【請求項12】
前記溶解物は、前記融合タンパク質を添加する前に精製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ヒドロキシル化は、５～１２の範囲のｐＨで起こる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ヒドロキシル化は、１６℃～４０℃の範囲の温度で起こる、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヒドロキシル化は、３０分～１時間にわたって起こる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ヒドロキシル化タンパク質を作製するための方法であって、請求項６に記載の微生物を提供することと、前記微生物を、前記第２のタンパク質をヒドロキシル化するのに十分な時間、培地中で増殖させることと、を含む、方法。
【請求項17】
前記微生物は、酵母である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記酵母は、ピキア・パストリスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記微生物は、５０時間～７２時間増殖させる、請求項１６～１８のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（配列表）
本出願は、電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれる配列表を含む。
本出願は、電子的に提出され、その全体が参照により組み込まれる配列表を含む。
【0002】
（発明の分野）
本明細書では、操作されたタンパク質及び発酵におけるそれらの使用、タンパク質の産生方法、並びにインビトロ及びインビボでのタンパク質のヒドロキシル化のための方法が記載されている。
本明細書では、操作されたタンパク質及び発酵におけるそれらの使用、タンパク質の産生方法、並びにインビトロ及びインビボでのタンパク質のヒドロキシル化のための方法が記載されている。
【背景技術】
【0003】
微生物を使用して、商業的用途のための化合物を作製する業界全体がある。微生物は、一般的に、この化合物を作製するために必要なＤＮＡで操作される。これらの微生物の例としては、酵母及び細菌が挙げられる。作製される化合物としては、薬物、芳香剤、香料、タンパク質などが挙げられる。
【0004】
融合タンパク質は、別個のタンパク質を最初に作製した２つ以上の遺伝子の連結を通して生成される。薬物開発における融合タンパク質を作製する１つの目的は、それぞれの「親」タンパク質から得られる融合タンパク質に特性を付与することである。
【発明の概要】
【0005】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットと、可溶性タンパク質パートナーと、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、によってコードされる融合タンパク質を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－２、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、可溶性タンパク質パートナーは、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット、マルトース結合タンパク質、低分子ユビキチン様修飾因子、カルモジュリン結合タンパク質、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である。
【0007】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、を含む融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、融合タンパク質のＮ末端にある。特定の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、融合タンパク質のＣ末端にある。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を提供し、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、融合タンパク質のＮ末端にあり、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、融合タンパク質のＣ末端にある。
【0009】
ある特定の実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である。いくつかの実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる。
【0010】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される任意の融合タンパク質を含む微生物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む微生物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、Ｃ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む微生物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを含む融合タンパク質と、ヒドロキシル化される第２のタンパク質と、を含む微生物を提供する。ある特定の実施形態では、微生物は、桿菌、大腸菌、及び糸状菌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、微生物は、酵母である。具体的な実施形態では、第２のタンパク質は、コラーゲン、組換えコラーゲン、コラーゲン様タンパク質などからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示は、皮膚に本明細書に開示される融合タンパク質を適用すること、を含む個体の皮膚へスキンケアの有益性を提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、クリーム、ローション、軟膏剤、ゲル、セラム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される組成物に配合される。いくつかの実施形態では、スキンケアの有益性は、しわ予防、皮膚色素沈着の改善、水分補給、挫瘡の低減、挫瘡の予防、黒色面皰の低減、黒色面皰の予防、皮膚線条の低減、皮膚線条の予防、セルライトの予防、セルライトの低減及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、サリチル酸、レチノール、過酸化ベンゾイル、ビタミンＣ、グリセリン、α－ヒドロキシ酸、ヒドロキノン、コウジ酸、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される他のスキンケア有益性成分と組み合わされる。
【0012】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒドロキシル化されるタンパク質を含有する微生物を提供することと、本明細書に開示される融合タンパク質を提供することと、微生物を溶解して溶解物を生成することと、特定の濃度の融合タンパク質を溶解物に添加することと、融合タンパク質によってタンパク質のヒドロキシル化を促進する反応条件下で、溶解物及び融合タンパク質をインキュベートすることと、を含むタンパク質のヒドロキシル化のためのインビトロでの方法を提供する。いくつかの実施形態では、溶解物は、融合タンパク質を添加する前に精製される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質濃度は、約１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ～約５ｕＭの範囲である。特定の実施形態では、ヒドロキシル化は、約５～約１２の範囲のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化は、約１６℃～約４０℃の範囲の温度で起こる。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル化は、約３０分～約１時間にわたって起こる。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で開示される微生物を提供することと、微生物を、第２のタンパク質をヒドロキシル化するのに十分な時間、培地中で増殖させることと、を含むヒドロキシル化タンパク質を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、微生物は、酵母である。特定の実施形態では、酵母は、ピキア・パストリスである。いくつかの実施形態では、微生物は、約５０時間～約７２時間増殖させる。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、を含む微生物を提供する。
【0015】
更なる態様及び実施形態は、以下の詳細な説明において見出される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５３を生成するように実施例１に記載されるように使用されたＭＭＶ－１３０を示す。
【0017】
【図2】ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５４を生成するように実施例３に記載されるように使用されたＭＭＶ１５６を示す。
【0018】
【図3】ピキア・パストリス酵母株ＰＰ２６８を生成するように実施例３に記載されるように使用されたＭＭＶ－１９１。
【0019】
【図4】ピキア・パストリス酵母株ＰＰ３３６を生成して、「ＧＳＧＳＧＳ」のリンカー配列を有するＮ末端にＰ４ＨＡ１及びＣ末端にＰ４ＨＢを有する融合タンパク質を発現するように、実施例１に記載されるように産生され、ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５３に形質転換されたＭＭＶ－２９０ベクターを示す。
【0020】
【図5】ピキア・パストリス酵母株ＰＰ３３５を生成して、Ｎ末端にＰ４ＨＢ及びＣ末端にＰ４ＨＡ１を有する融合タンパク質を発現するように、実施例２に記載されるように産生され、ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５３に形質転換されたＭＭＶ－２８９ベクターを示す。
【0021】
【図6】実施例４に記載されるように、ＡＢ融合タンパク質のＤＮＡ配列（すなわち、実施例３に記載されるようなＮ末端にＰ４ＨＡ１及びＣ末端にＰ４ＨＢを有する融合タンパク質）を含むＭＭＶ－４００ベクターを示す。
【0022】
【図7】実施例５に記載されるように、ＡＢ融合タンパク質のＤＮＡ配列、６個の連続したヒスチジンのアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を表すヌクレオチド配列、２個の終止コドン、及びＡＯＸ１転写ターミネーターを含むＭＭＶ－５０２ベクターを示す。
【0023】
【図8】実施例５に記載されるように、Ｐ４ＨＢサブユニットタンパク質のＣ末端、６個の連続したヒスチジンのアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を表すヌクレオチド配列、２個の終止コドン、及びＡＯＸ１転写ターミネーターを含むＭＭＶ－５０３ベクターを示す。
【0024】
【図9】実施例７に使用されるＭＭＶ４１１ベクターを示す。
【0025】
【図10】実施例１に記載されるようなＭＭＶ－６４４ベクターを示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本明細書で記載されたものに類似するか、又は、本明細書で記載されたものと同等のすべての方法及び材料が、本開示の実施又は試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及ぶ他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先するものとする。更に、これらの材料、方法、及び例は、他に明示されない限り、単に例示的なものであり、限定を意図するものではない。
【0027】
いくつかの実施形態では、本開示は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットのＤＮＡ配列と、可溶性タンパク質パートナーのＤＮＡ配列と、によってコードされる融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１（Ｐ４ＨＡ１）及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４ＨＢ）を含む。ある特定の実施形態では、単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、本明細書に開示される融合タンパク質の代わりに、任意の実施形態で使用することができる。
【0028】
Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢ遺伝子は、プロリル４－ヒドロキシラーゼの成分、２つの同一のαサブユニット及び２つのβサブユニット（ヘテロ四量体）からなるコラーゲン合成の重要な酵素をコードする。Ｐ４ＨＡコード化タンパク質は、いくつかの異なる型のαサブユニットの１つであり、活性酵素の触媒部位の大部分を提供する。例えば、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４５（２）：１０６－１２４（２０１０）を参照。Ｐ４ＨＡは、二量体化ドメイン、基質結合ドメイン及び触媒ドメインの３つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である。ある特定の実施形態では、単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、細菌、ウイルス、真菌類及び藻類なる群から選択される種由来である。ある特定の実施形態では、単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ミミウイルス（ＤＮＡ配列：配列番号１５、タンパク質配列：配列番号１６）由来である。例えば、Ｒｕｔｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８：４４４５－４４５５（２０１４）及びＳｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ．３６：３２２－３３１（２０１７）を参照。コラーゲン及び関連タンパク質において、プロリル４－ヒドロキシラーゼは、新しく合成されるプロコラーゲン鎖の適切な３次元フォールディングに重要である４－ヒドロキシプロリンの形成を触媒する。Ｐ４ＨＢタンパク質は、ジスルフィド異性化酵素としても知られている。これは、Ｐ４ＨＢ遺伝子によってコードされるヒトにおける酵素である。ヒトＰ４ＨＢ遺伝子は、染色体１７ｑ２５内に局在する。このタンパク質は、プロリル４－ヒドロキシラーゼファミリータンパク質とは異なって多機能性であり、ジスルフィド形成、切断、及び異性化のための酸化還元酵素として作用する。Ｐ４ＨＢの活性は、厳密に制御され、二量体解離及び基質結合の両方は、触媒作用のプロセス中の酵素活性を増強する可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｐ４ＨＢは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である。
【0029】
Ｐ４ＨＡ（ＮＣＢＩ参照：ＸＰ＿００５２２６４４３．１、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ１ＲＭＵ３）、Ｐ４ＨＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＩ４６２７２．１、ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ０５３０７）、Ｐ４ＨＡ３（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ４ＨＡ３）、及びＰ４ＨＡ２（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｇ３Ｎ２Ｆ２）のＤＮＡ配列が知られており、市販されている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、その後、ライゲーション又はオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）を通して、フレーム内の第２のタンパク質のＤＮＡ配列を付加することによって作製される。その後、融合タンパク質のＤＮＡ配列は、単一タンパク質として細胞によって発現される。
【0030】
融合タンパク質を作製するための１つの技術は、ライゲーショであり、これは酵素の作用による２つの核酸断片の結合である。外来ＤＮＡ断片をプラスミドに挿入する場合など、組換えＤＮＡ分子を生成するために、ＤＮＡ断片は互いに結合される。ＤＮＡ断片の末端は、１つのＤＮＡ末端の３’－ヒドロキシルと別のＤＮＡ末端の５’－ホスホリルとの間でのホスホジエステル結合の形成によって互いに結合される。融合タンパク質を作製するための別の技術は、オーバーラップ伸長ＰＣＲであり、オーバーラップ伸長によるスプライシングとしても知られている。オーバーラップ伸長ＰＣＲは、配列の特定の点に特定の変異を挿入するため、又はより小さなＤＮＡ断片をより大きいポリヌクレオチドにスプライスするために使用される。サッカロマイセスセレビシエα接合因子シグナルなどの分泌シグナル配列を、単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットの前に配置して、産生培地中の宿主からタンパク質を分泌することができる。
【0031】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１（Ｐ４ＨＡ１）のＤＮＡ配列又はプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－２（Ｐ４ＨＡ２）のＤＮＡ配列又はプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－３（Ｐ４ＨＡ３）のＤＮＡ配列及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４ＨＢ）のＤＮＡ配列と、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１（Ｐ４ＨＡ１）のＤＮＡ配列又はプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－２（Ｐ４ＨＡ２）のＤＮＡ配列又はプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－３（Ｐ４ＨＡ３）のＤＮＡ配列及び、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４ＨＢ）、マルトース結合タンパク質、低分子ユビキチン様修飾因子、カルモジュリン結合タンパク質、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼなどから選択される可溶性タンパク質パートナーのＤＮＡ配列と、の組み合わせによってコードされ得る。活性プロリル４－ヒドロキシラーゼ複合体は、ウシ、ヒト、ラット、マウス、線虫などの種由来のＰ４Ｈサブユニットが含まれ得る。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢを含む。
【0032】
本明細書に記載されている融合タンパク質を作製する場合、Ｎ末端にＰ４ＨＡ又はＰ４ＨＢを有するタンパク質を作製することが可能である。驚くべきことに、Ｎ末端にＰ４ＨＡを有する融合タンパク質は、遊離プロリンの存在下で、機能的ヒドロキシル化酵素を酵母に形成するが、Ｎ末端にＰ４ＨＢを有する融合タンパク質は、機能的ヒドロキシル化酵素を酵母に形成しないことを見出した。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端にＰ４ＨＡ及びＣ末端に第２のタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端にＰ４ＨＡ及びＣ末端にＰ４ＨＢを有する。
【0033】
Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢをコードする融合タンパク質のＤＮＡ、又は単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットのＤＮＡは、生物に形質転換又はトランスフェクトされ得る。好適な生物としては、酵母、細菌、真菌などが挙げられる。いくつかの実施形態では、細菌は、桿菌又は大腸菌であり得る。いくつかの実施形態では、微生物は、糸状菌であり得る。いくつかの実施形態では、生物は、酵母であり得る。ある特定の実施形態では、酵母は、ピキア・パストリスであり得る。一般的に、機能的ヒドロキシル化酵素にとって、複数のトランスフェクション／形質転換反応が必要である。本明細書に記載されている融合タンパク質により、より効率的なプロセスを可能にする。本明細書に記載されている融合タンパク質により、形質転換反応数が、２つ（例えば、Ｐ４ＨＡ１において１つ及びＰ４ＨＢにおいて１つ）の代わりに１つに低減する。酵素が別々に形質転換される場合、酵素は３つの反応を経て、有効な酵素であるために四量体を形成する。四量体は、例えば、２つのＰ４ＨＡサブユニット及び２つのＰ４ＨＢサブユニットからなる。３つの反応とは、以下のように、１）第１の二量体を形成するように第１のＰ４ＨＡ及び第１のＰ４ＨＢを組み合わせることと、２）第２の二量体を形成するように第２のＰ４ＨＡ及び第２のＰ４ＨＢを組み合わせることと、３）この２つの二量体が四量体を形成することと、である。酵素が別々に形質転換される場合、すべてのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢが、四量体を形成するように反応するわけではない。融合タンパク質は、有効な四量体を形成するために、別の融合タンパク質との１つの反応が必要である。本開示の有益性は、融合タンパク質（２つの分子）が、別個のタンパク質（４つのタンパク質）よりも効率よく四量体を形成することである。２つの融合タンパク質は、１つの四量体を形成する。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質は、より効率的かつ有効なヒドロキシル化酵素を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質のインビトロヒドロキシル化のための方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質のインビボヒドロキシル化のための方法で使用することができる。
【0034】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、インビトロでタンパク質をヒドロキシル化するために使用できる。コラーゲンなどのタンパク質を含む微生物を溶解させて、溶解物を生成することができる。溶解物をプロセシングして、精製タンパク質を生成することができる。融合タンパク質を、タンパク質の精製サンプルに添加することでき、又は溶解物に添加することができる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化反応のための補助因子としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、又は鉄（ＩＩ）（例えばＦｅＳＯ４）のうちの１つ以上を挙げることができる。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル化反応のための基質は、ＡＫＧ、分子コラーゲン及び分子酸素から選択することができる。いくつかの実施形態では、効率的なヒドロキシル化を助けるために、ウシ血清アルブミン及び／又はカタラーゼを反応物に添加することができる。ヒドロキシル化反応は、約１６℃～約４０℃（例えば約３２℃）の範囲の温度で実施されてよい。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化反応は、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃又は約４０℃で実施することができる。溶解物を添加される融合タンパク質の量は、１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ～約５ｕＭ（例えば約２．５ｕＭ）の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、溶解物を添加される融合タンパク質の量は、１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ、約０．１ｕＭ、約０．１５ｕＭ、約０．２ｕＭ、約０．２５ｕＭ、約０．３ｕＭ、約０．３５ｕＭ、約０．４ｕＭ、約０．５ｕＭ、約０．６ｕＭ、約０．７ｕＭ、約０．８ｕＭ、約０．９ｕＭ、約１．０ｕＭ、約１．１ｕＭ、約１．２ｕＭ、約１．３ｕＭ、約１．４ｕＭ、約１．５ｕＭ、約１．６ｕＭ、約１．７ｕＭ、約１．８ｕＭ、約１．９ｕＭ、約２．０ｕＭ、約２．５ｕＭ、約３．０ｕＭ、約３．５ｕＭ、約４．０ｕＭ、約４．５ｕＭ又は約５ｕＭであり得る。精製タンパク質に添加される融合タンパク質の量は、１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、０．０５ｕＭ～５ｕＭ（例えば２．５ｕＭ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、精製タンパク質に添加される融合タンパク質の量は、１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ、約０．１ｕＭ、約０．１５ｕＭ、約０．２ｕＭ、約０．２５ｕＭ、約０．３ｕＭ、約０．３５ｕＭ、約０．４ｕＭ、約０．５ｕＭ、約０．６ｕＭ、約０．７ｕＭ、約０．８ｕＭ、約０．９ｕＭ、約１．０ｕＭ、約１．１ｕＭ、約１．２ｕＭ、約１．３ｕＭ、約１．４ｕＭ、約１．５ｕＭ、約１．６ｕＭ、約１．７ｕＭ、約１．８ｕＭ、約１．９ｕＭ、約２．０ｕＭ、約２．５ｕＭ、約３．０ｕＭ、約３．５ｕＭ、約４．０ｕＭ、約４．５ｕＭ又は約５ｕＭであり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化は、約５～約１２（例えば約７．５）の範囲のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．０、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１、約１１．５又は約１２であり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化は、約３０分～約５時間（例えば約１時間）にわたって起こる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化は、約３０分、約４５分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間又は約５時間にわたって起こる。反応後、融合タンパク質は、酸を添加して溶液のｐＨを４に下げること、又は５０％～８０％メタノールを添加することによって不活性化されてよい。実施形態では、インビトロヒドロキシル化は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９３２，０５３号の任意の方法開示を使用して実施することができる。
【0035】
あるいは、融合タンパク質のＤＮＡ配列を、微生物にトランスフェクトし、細胞内／インビボでタンパク質をヒドロキシル化するために利用することができる。トランスフェクトされた微生物は、当業者に周知の条件下で、特定の微生物に適した培地中で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、反応に好適な培地は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのためのＬＢ（Lysogeny broth、溶原性ブロス）、ピキアのためのＢＭＧＹ（緩衝グリセロール複合培地）、ピキアのためのＹＰＤ（酵母抽出ペプトンデキストロース）、又はピキアのためのＨＭＰ（ヘキサメタリン酸ナトリウム）であり得る。培地の温度は、約１６℃～約４２℃の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、培地の温度は、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃又は約４２℃であり得る。いくつかの実施形態では、微生物はピキアであり、培地の温度は、約２８℃～約３６℃（例えば約３２℃）の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、培地の温度は、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃又は約３６℃であり得る。微生物は、約５０時間～約７２時間（例えば約６８時間）の範囲の時間、増殖させることができる。いくつかの実施形態では、微生物は、約５０時間、約５１時間、約５２時間、約５３時間、約５４時間、約５５時間、約５６時間、約５７時間、約５８時間、約５９時間、約６０時間、約６１時間、約６２時間、約６３時間、約６４時間、約６５時間、約６６時間、約６７時間、約６８時間、約６９時間、約７０時間、約７１時間又は約７２時間、増殖させることができる。ある特定の実施形態では、ヒドロキシル化反応のための基質は、ＡＫＧ、分子コラーゲン及び分子酸素からなる群から選択することができる。
【0036】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ配列は、融合タンパク質プロモーターのＤＮＡ配列；融合タンパク質ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌の１つ及び酵母の１つから選択される複製起点のＤＮＡ配列；並びに／又は酵母ゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列（酵母に形質転換するときに効率よく改善するための任意の）と共に、ベクターに配置することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、生物に挿入されている（又はエピソームである）。いくつかの実施形態では、その後、ベクターは、エレクトロポレーションなどの当技術分野で既知の方法によって微生物に形質転換することができる。
【0037】
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１（Ｐ４ＨＡ１）及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット（Ｐ４ＨＢ）をコードする融合タンパク質のＤＮＡ、並びにヒドロキシル化される第２のタンパク質をコードするＤＮＡは、微生物に形質転換され得る。ヒドロキシル化修飾は、プロリン、リシン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンを含むが、これらに限定されない様々なアミノ酸で起こることができる。ヒドロキシル化され得る好適なタンパク質としては、コラーゲンなどが挙げられる。本明細書に記載の任意の実施形態、任意の方法、及び／又は任意の反応では、単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、融合タンパク質の代わりに使用することができる。
【0038】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ配列は、融合タンパク質プロモーターのＤＮＡ配列；融合タンパク質ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌の１つ及び酵母の１つから選択される複製起点のＤＮＡ配列；並びに／又は宿主生物のゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列と共に、ベクターに配置することができる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル化される第２のタンパク質のＤＮＡ配列は、第２のタンパク質プロモーターのＤＮＡ配列；第２のタンパク質ターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌の１つ及び酵母の１つから選択される複製起点のＤＮＡ配列；並びに／又は宿主生物のゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列と共に、ベクターに配置することができる。いくつかの実施形態では、その後、２つのベクターは、エレクトロポレーションなどの当技術分野で既知の方法によって微生物に形質転換される。
【0039】
あるいは、いくつかの実施形態では、オールインワンベクターを使用することができ、プロモーター及びターミネーターを含む、融合タンパク質のＤＮＡ；プロモーター及びターミネーターを含む、第２のタンパク質のＤＮＡ；プロモーター及びターミネーターを含む、選択マーカーのＤＮＡ；並びに／又はゲノムに組み込むための生物のゲノムと相同性を有するＤＮＡは、オールインワンベクターに含まれる。その後、オールインワンベクターは、エレクトロポレーションなどの当技術分野で既知の方法によって微生物に形質転換することができる。
【0040】
プロモーターは、タンパク質の産生を改善することができることが当該技術分野で知られている。プロモーターは、ベクターに含まれるＤＮＡ配列である。本開示での使用に好適なプロモーターとしては、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーター、ｐＤＦ脱抑制プロモーター、ｐＣＡＴ脱抑制プロモーター、Ｄａｓ１－Ｄａｓ２メタノール誘発双方向プロモーター、ｐＨＴＸ１構成的双方向プロモーター、ｐＧＣＷ１４－ｐＧＡＰ１構成的双方向性プロモーター及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
ターミネーターは、酵母に組み込まれたベクターに利用される各オープンリーディングフレームの末端で必要とされる。いくつかの実施形態では、ターミネーターのＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。
【0042】
複製起点は、複製を開始するために必要である。いくつかの実施形態では、複製起点のＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。
【0043】
酵母が微生物である場合、酵母ゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列が必要であり、ベクターに組み込むことができる。
【0044】
選択マーカーは、首尾よく形質転換されている酵母生物を選択するために使用される。マーカーは、抗生物質耐性に関連することがある。マーカーはまた、ある特定のアミノ酸（栄養要求性マーカー）の有無にかかわらず増殖する能力に関連し得る。好適な栄養要求性マーカーとしては、ＡＤＥ、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、選択マーカーのＤＮＡ配列をベクターに組み込むことができる。本開示は、融合タンパク質を発現する細胞を増殖させる方法、融合タンパク質を発現させる方法、融合タンパク質を単離及び精製する方法を含む。本開示はまた、本明細書に記載されるような融合タンパク質の使用を含む。
【0045】
具体的には、本明細書に記載の融合タンパク質は、パーソナルケア組成物に有用であり得る。パーソナルケア組成物の場合、融合タンパク質は皮膚に適用され得る。融合タンパク質は、完全に若しくはある程度に、単離又は精製され得る（例えば、少なくとも２５％精製される、少なくとも５０％精製される、少なくとも６５％精製される、少なくとも７５％精製される、少なくとも８５％精製される、少なくとも９０％精製される、少なくとも９５％精製される、少なくとも９６％精製される、少なくとも９７％精製される、少なくとも９８％精製される、少なくとも９９％精製される、又は１００％精製される）。言い換えると、融合タンパク質は、精製タンパク質としてパーソナルケア製品に添加されてもよく、タンパク質から見つけられる画分の一部として添加することができる。融合タンパク質は、クリーム、ローション、軟膏剤、ゲル、セラムなどに作製され得る。
【0046】
パーソナルケア組成物は、皮膚へ局所適用するのに好適な製剤を提供し得る。組成物は、化粧品的に許容可能な担体を更に含み得る。化粧品的に許容可能な担体は、組成物の約５０重量％～約９９重量％（例えば、組成物の約８０重量％～約９５％）を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は、組成物の約５０重量％、約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９６重量％、約９７重量％、約９８重量％又は約９９重量％であり得る。組成物は、ローション、クリーム、ゲル、スティック、スプレー、シェービングクリーム、軟膏剤、クレンジング液体ウォッシュ及び固形バー、ペースト、粉末、ムース、マスク、ピール、メーキャップ、並びに拭き取りなどの液体組成物が挙げられるが、これらに限定されない多種多様な製品タイプに作製され得る。これらの製品タイプは、溶液、エマルジョン（例えば、マイクロエマルジョン及びナノエマルジョン）、ゲル、固形物及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されない数タイプの化粧品的に許容可能な担体を含み得る。以下は、このような担体の非限定的な例である。他の担体は、当業者によって配合され得る。
【0047】
本開示で有用な局所用組成物は、溶液として配合することができる。溶液は、一般的に、水性溶媒（例えば、化粧品的に許容可能な水性溶媒の約５０％～約９９％又は約９０％～約９５％）を含む。いくつかの実施形態では、溶液は、化粧品的に許容可能な水性溶媒の約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９であり得る。局所用組成物は、皮膚軟化剤を含む溶液として配合されてもよい。このような組成物は、好ましくは、約２％～約５０％の皮膚軟化剤（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％又は約５０％の皮膚軟化剤（複数可）を含むことができる。本明細書で使用されるように、「皮膚軟化剤」は、乾燥の予防又は軽減のために、並びに皮膚の保護のために使用される材料を指す。多種多様な好適な皮膚軟化剤が知られており、パーソナルケア組成物において有用であり得る。好適な材料の多数の例を含む、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｅｄｓ．Ｗｅｎｎｉｎｇｅｒ ａｎｄ ＭｃＥｗｅｎ，（Ｔｈｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９７）（以下、「ＣＴＦＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」）を参照。
【0048】
ローションは、このような溶液から作製することができる。ローションは、一般的に、約１％～約２０％（例えば、約５％～約１０％）の皮膚軟化剤（複数可）、及び約５０％～約９０％（例えば、約６０％～約８０％）の水を含む。いくつかの実施形態では、ローションは、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、又は約２０％の皮膚軟化剤（複数可）であり得る。いくつかの実施形態では、ローションは、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％の水であり得る。
【0049】
溶液から配合され得る別のタイプの製品は、クリームであり得る。クリームは、一般的に、約５％～約５０％（例えば、約１０％～約２０％）の皮膚軟化剤（複数可）及び約４５％～約８５％（例えば、約５０％～約７５％）の水を含む。いくつかの実施形態では、クリームは、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％の皮膚軟化剤（複数可）であり得る。いくつかの実施形態では、クリームは、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、又は約８５％の水であり得る。
【0050】
更に溶液から配合され得る別のタイプの製品は、軟膏剤であり得る。軟骨剤は、動物又は植物油又は半固体炭化水素の単純な塩基を含み得る。軟膏剤は、約２％～約１０％の皮膚軟化剤（複数可）に加えて、約０．１％～約２％の増粘剤（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態では、軟膏剤は、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％の皮膚軟化剤（複数可）であり得る。いくつかの実施形態では、軟膏剤は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．６％、約０．８％、約１．０％、約１．２％、約１．４％、約１．６％、約１．８％又は約２．０％の増粘剤（複数可）であり得る。本明細書で有用な増粘剤又は粘度増加剤のより完全な開示は、ＣＴＦＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋに見出すことができる。
【0051】
パーソナルケア組成物は、エマルジョンとして配合されてもよい。担体がエマルジョンであり得る場合、約１％～約１０％（例えば、約２％～約５％）の担体は、乳化剤（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％の担体は、乳化剤（複数可）を含む。乳化剤は、非イオン性、陰イオン性、又は陽イオン性であってもよい。好適な乳化剤は、例えば、ＣＴＦＡ Ｈａｎｄｂｏｏｋに開示されている。
【0052】
ローション及びクリームは、エマルジョンとして配合することができる。一般的には、このようなローションは、０．５％～約５％の乳化剤（複数可）を含む。このようなクリームは、一般的に、約１％～約２０％（例えば、約５％～約１０％）の皮膚軟化剤（複数可）；約２０％～約８０％（例えば、３０％～約７０％）の水；及び約１％～約１０％（例えば、約２％～約５％）の乳化剤（複数可）を含む。
【0053】
ローション及びクリームなどの、水中油型及び油中水型の単一のエマルジョンスキンケア組成物は、化粧品分野で周知であり、パーソナルケア組成物に有用である。油中水中水型などの多相エマルジョン組成物も有用である。一般に、このような単相又は多相エマルジョンは、必須成分として、水、皮膚軟化剤及び乳化剤を含む。
【0054】
本開示のパーソナルケア組成物はまた、ゲル（例えば、好適なゲル化剤（複数可）を使用した水溶性ゲル）として配合することができる。水溶性ゲルに好適なゲル化剤としては、天然ゴム、アクリル酸及びアクリレートポリマー及びコポリマー、並びにセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース）が挙げられるが、これらに限定されない。油（鉱油など）に好適なゲル化剤としては、水素化ブチレン／エチレン／スチレンコポリマー及び水素化エチレン／プロピレン／スチレンコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。このようなゲルは、一般的に、約０．１重量％～５重量％のこのようなゲル化剤を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約１．０重量％、約１．５重量％、約２．０重量％、約２．５重量％、約３．０重量％、約３．５重量％、約４．０重量％、約４．５重量％、又は約５．０重量％のこのようなゲル化剤を含む。
【0055】
本開示の対象において有用なパーソナルケア組成物は、前述の成分に加えて、技術確立したレベルで皮膚に使用するための組成物に従来使用される多種多様な更なる油溶性材料及び／又は水溶性材料を含み得る。
【0056】
パーソナルケア組成物は、必要に応じて及び／又は週１回以上～１日１回以上（例えば、１日２回）の適用の範囲の定期的レジメンの一部として、皮膚に適用され得る。使用される量は、エンドユーザーの年齢及び物理的条件、治療の期間、使用される特定の化合物、製品、又は組成物、利用される特定の化粧品的に許容される担体、並びに同様の要因によって変化する。
【0057】
本明細書に記載の融合タンパク質は、しわ予防、皮膚色素沈着の改善、水分補給、挫瘡の低減、挫瘡の予防、黒色面皰の低減、黒色面皰の予防、皮膚線条の低減、皮膚線条の予防、セルライトの予防、セルライトの低減などのパーソナルケア用途におけるスキンケアの有益性に有用であり得る。改善された皮膚色素沈着とは、皮膚色素沈着を均等にするか、又は皮膚色素沈着を低減し、色白の皮膚を提供するかのいずれかを意味する。
【0058】
本明細書に記載の融合タンパク質は、サリチル酸、レチノール、過酸化ベンゾイル、ビタミンＣ、グリセリン、α－ヒドロキシ酸、ヒドロキノン、コウジ酸、ヒアルロン酸などであるが、これらに限定されない他のスキンケア有益性成分と組み合わされ得る。
【0059】
コラーゲンプロリル４ヒドロキシラーゼは、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ＰＨＤ４などを含むプロリルヒドロキシラーゼドメインタンパク質（prolyl hydroxylase domain、ＰＨＤ）と同様の保存ドメインを含有する。これらのＰＨＤは、低酸素誘導因子（hypoxia-inducible factor、ＨＩＦ）のヒドロキシル化を調節する重要な役割を果たす。ＨＩＦは、低酸素下で特定の核補助因子と相互作用するＤＮＡ結合転写因子であり、一連の低酸素関連遺伝子をトランス活性化し、適応応答を作動させる。細胞内のこの役割により、ＨＩＦは、ホメオスタシス、血管新生及び嫌気代謝などの多くの細胞機能に関連している。細胞内のＨＩＦの上方制御及び下方制御は、癌性細胞の血管新生又は増殖を引き起こし得るため、ＨＩＦ及びプロリルヒドロキシラーゼは、それらの治療可能性のためにますます研究されている。したがって、本明細書に記載の融合タンパク質は、プロリルヒドロキシラーゼドメインタンパク質に適用可能であり得る。
【0060】
本明細書の文脈において、すべての刊行物、特許出願、特許、及び本明細書で言及される他の参考文献は、別途記載されていない場合には、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれ、その全体が本開示の一部とみなされるものとする。
【0061】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が優先するものとする。
【0062】
量、濃度、又は他の値若しくはパラメーターが範囲として与えられる場合、又は上限値及び下限値のリストとして与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかにかかわらず、任意の上限及び下限範囲の任意の対から形成されるすべての範囲を具体的に開示するものとして理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に記載されている場合、特段明記しない限り、その範囲は、その端点、並びに範囲内のすべての整数及び分画を含むことが意図される。本開示の範囲は、範囲を定義するときに列挙される特定の値に限定されることを意図するものではない。
【0063】
更に、別途明示的に記載されない限り、項目の１つ若しくは複数の範囲又はリストが提供される場合、これは、このような範囲若しくはリスト内の任意の単一の記述された値又は項目を明示的に開示するものとして理解されるべきであり、それらの任意の組み合わせは、同じ若しくは任意の他のリスト内の任意の他の個々の値又は項目を明示的に開示するものとして理解されるべきである。
【0064】
本明細書で使用される場合、用語「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「含む（includes）」、「含むこと（including）」、「有する（has）」、「有すること（having）」又はこれらの任意の他の変形は、排他的ではない包含を網羅することを意図するものである。例えば、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、このようなプロセス、方法、物品、若しくは装置に明示的に列挙されていない、又は固有の他の要素を含むことができる。
【0065】
更に、別途明示的に記載されない限り、「又は」及び「及び／又は」は包括的であり、排他的ではないことを指す。例えば、条件Ａ又はＢ、又はＡ及び／又はＢは、Ａは真であり（又は存在し）、Ｂは偽である（又は存在しない）、Ａは偽であり（又は存在しない）、Ｂは真である（又は存在しない）、並びにＡ及びＢの両方は真である（又は存在する）のいずれかを満たしている。
【0066】
本明細書の様々な要件及び成分を説明するための「ａ」又は「ａｎ」の使用は、単に便宜上であり、本開示の一般的な意味を与えるものである。本明細書は、１つ又は少なくとも１つを含むように読み取られるべきであり、単数形はまた、別途意味するものではない限り、複数を含むものとする。
【0067】
上記の説明は、当業者がその製造及び使用を可能にするように、それを製造及び使用する方法及びプロセスを提供し、この実施可能性は、具体的には、添付の特許請求の範囲の主題に提供され、これは元の説明の一部を構成する。
【0068】
本明細書で使用される場合、語句「からなる群から選択される」、「から選択される」などは、指定された材料の混合物を含む。
【0069】
本明細書では、特徴又は要素が別の特徴又は要素の「上」と呼ばれる場合、それは、他の特徴若しくは要素又は介在する特徴及び／若しくは要素上に直接存在することができる。対照的に、特徴又は要素が、別の特徴又は要素の「～の上に直接」と呼ばれる場合、介在する特徴又は要素は存在しない。特徴若しくは要素が別の特徴若しくは要素に「接続された」、「取り付けられた」又は「結合された」と呼ばれる場合、他の特徴若しくは要素又は介在する特徴若しくは要素に直接接続、取り付け、又は結合され得ることも理解されるであろう。対照的に、特徴若しくは要素が、別の特徴若しくは要素に「直接接続された」、「直接に取り付けられた」又は「直接結合された」と呼ばれる場合、介在する特徴又は要素は存在しない。一実施形態に関して記載又は示されているが、記載又は図示された特徴及び要素は、他の実施形態に適用することができる。「隣接する」別の特徴に配置された構造又は特徴を参照することは、隣接する特徴と重なり合う又は下にある部分を有し得ることも当業者に理解されるであろう。
【0070】
「～の下」、「下方」、「下部」、「上方」、「上部」などの空間的に相対的な用語は、図に示されるような別の要素（複数可）又は特徴（複数可）に対するある要素又は特徴の関係を説明するために記述を容易にするために、本明細書で使用され得る。空間的に相対する用語は、図に示される向きに加えて、使用中又は動作中のデバイスの異なる向きを包含することが意図されることが理解されるであろう。例えば、図中のデバイスが反転された場合、他の要素又は特徴の「～の下」又は真下」と記載される要素は、他の要素又は特徴の「上方」に配向される。したがって、「～の下」という例示的用語は、「上方」」及び「～の下」の配向の両方を包含することができる。デバイスは、別途配向され（９０度又は他の向きで回転させる）、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈することができる。同様に、用語「上向き」、「下向き」、「垂直」、「水平」などは、特段の指示がない限り、説明の目的のために本明細書で使用される。
【0071】
用語「第１」及び「第２」は、様々な特徴／要素を説明するために本明細書で使用することができるが、文脈に特段の指示がない限り、これらの特徴／要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特徴／要素を別の特徴／要素と区別するために使用することができる。したがって、以下に説明する第１の特徴／要素は第２の特徴／要素と呼ぶことができ、同様、以下に説明する第２の特徴／要素は本開示の教示から逸脱することなく第１の特徴／要素と呼ぶことができる。
【0072】
用語「約」が使用される場合、特定の効果又は結果を特定の許容差内で得ることができ、当業者は、許容差を得る方法を知っている。用語「約」が、範囲の値又は端点を説明する際に使用される場合、本開示は、言及される特定の値又は端点を含むと理解されるべきである。実施形態では、「約」は、最大１０％（すなわち、±１０％）の範囲を意味することができる。
【0073】
本明細書に列挙される任意の数値範囲は、その中に包含されるすべての部分範囲を含むことを意図する。
【0074】
本明細書に含まれる実施例及び図は、限定ではなく例示として、主題が実施され得る具体的な実施形態を示す。上述したように、他の実施形態は、本開示の範囲から逸脱することなく、構造的及び論理的な置換及び変更を行うことができるように、利用され、そしてそこから誘導することができる。本発明の主題のこのような実施形態は、実際に複数の発明が開示されている場合、本出願の範囲を任意の単一の発明又は発明の概念に自発的に限定することを意図することなく、単に便宜的に個々に又は集合的に言及されてもよい。したがって、具体的な実施形態を本明細書に図示し説明してきたが、同じ目的を達成するために計算された任意の構成を、示された具体的な実施形態に置き換えてもよい。本開示は、様々な実施形態における任意の及びすべての適合又は変形を網羅することを意図している。上記の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態は、上記の説明を検討することにより当業者には明らかであろう。
【0075】
上記の説明は、当業者が本明細書に開示されるすべての融合タンパク質を作製及び使用することを可能にするために提示され、特定の用途及びその要件の文脈において提供される。好ましい実施形態に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかとなり、本明細書で定義される一般的原理は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の実施形態及び用途に適用されてもよい。したがって、本開示は、示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理及び特徴と一致する最も広い範囲を与えられるものである。
【0076】
本開示を概して説明してきたが、ある特定の実施例を参照することにより、更なる理解を得ることができ、これは、例示のみを目的として本明細書に提供され、特段明記しない限り、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0077】
実施例１：
ウシＰ４ＨＡ１（配列番号１）及びＰ４ＨＢ（配列番号２）のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ２．０から取得した。プライマーＭＭ－１０９０（配列番号３）；ＭＭ－７５０（配列番号４）；ＭＭ－０７８２（配列番号５）、ＭＭ－０７８３（配列番号６）；ＭＭ－０７８４（配列番号７）；ＭＭ－０７８５（配列番号８）及びベクターＭＭＶ２９０（配列番号９）にアセンブルされたＧｉｂｓｏｎを有するテンプレートとしてＤＮＡ配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った（Ｇｉｂｓｏｎ ＤＧ，Ｙｏｕｎｇ Ｌ，Ｃｈｕａｎｇ ＲＹ，Ｖｅｎｔｅｒ ＪＣ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ＣＡ，Ｓｍｉｔｈ ＨＯ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３－５．）。最終ベクターＭＭＶ２９０（図４）を配列決定により確認し、ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５３に形質転換して、Ｎ末端にＰ４ＨＡ１及びＣ末端にＰ４ＨＢを有するＰＰ３３６株を生成した。
ウシＰ４ＨＡ１（配列番号１）及びＰ４ＨＢ（配列番号２）のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ２．０から取得した。プライマーＭＭ－１０９０（配列番号３）；ＭＭ－７５０（配列番号４）；ＭＭ－０７８２（配列番号５）、ＭＭ－０７８３（配列番号６）；ＭＭ－０７８４（配列番号７）；ＭＭ－０７８５（配列番号８）及びベクターＭＭＶ２９０（配列番号９）にアセンブルされたＧｉｂｓｏｎを有するテンプレートとしてＤＮＡ配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った（Ｇｉｂｓｏｎ ＤＧ，Ｙｏｕｎｇ Ｌ，Ｃｈｕａｎｇ ＲＹ，Ｖｅｎｔｅｒ ＪＣ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ＣＡ，Ｓｍｉｔｈ ＨＯ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３－５．）。最終ベクターＭＭＶ２９０（図４）を配列決定により確認し、ピキア・パストリス酵母株ＰＰ１５３に形質転換して、Ｎ末端にＰ４ＨＡ１及びＣ末端にＰ４ＨＢを有するＰＰ３３６株を生成した。
【0078】
ＭＭＶ－１３０（図１）をＰｍｅ Ｉで消化し、ＰＰ１に形質転換して、ＰＰ１５３を生成させた。ＰＰ１５３は、ｐＤＦプロモーターによって駆動される野生型コラーゲンを含有する。
【0079】
単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼα（配列番号１５）のＤＮＡ配列をＩＤＴから取得した。プライマーＭＭ－０５７９（配列番号１８）；ＭＭ－０５８０（配列番号１９）；ＭＭ－１５６９（配列番号２０）、ＭＭ－１５７０（配列番号２１）；ＭＭ－０７８４（配列番号７）及びベクターＭＭＶ－６４４（配列番号１７）にアセンブルされたＧｉｂｓｏｎを有するテンプレートとしてＤＮＡ配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。最終ベクターＭＭＶ－６４４（図１０）を配列決定により確認し、ピキア・パストリス酵母株ＰＰ９７に形質転換して、ＰＰ７６５株を生成した。
【0080】
ＭＭＶ－６４４（図１０）をＳｗａ Ｉで消化し、ＰＰ９７に形質転換して、ＰＰ７６５を生成させた。ＰＰ７６５は、ｐＤＦプロモーターによって駆動されるＣ末端に６Ｘ Ｈｉｓタグを有する単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼ、及び酵母α接合因子からの分泌シグナルを含有する。
実施例２：
実施例２：
【0081】
ウシＰ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ２．０から取得した。ＭＭ－１０９０；ＭＭ－７５０；ＭＭ－７７９；ＭＭ－７８０；ＭＭ－７８１；ＭＭ－３６９及びベクターＭＭＶ２８９（配列番号１０）にアセンブルされたＧｉｂｓｏｎを有するテンプレートとしてＤＮＡ配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。最終ベクターＭＭＶ２８９（図５）を配列決定により確認し、酵母株ＰＰ１５３に形質転換して、Ｎ末端にＰ４ＨＢ及びＣ末端にＰ４ＨＡ１を有するＰＰ３３５株を生成した。
実施例３：
実施例３：
【0082】
ＰＰ３３６株を２ｍＬのＢＭＧＹ培地を有する２４ウェルプレートに接種し、９００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間増殖させた。細胞を、沈降させ、８００ｕＬの溶解緩衝液中でＱｉａｇｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒを使用して溶解させた。溶解緩衝液は、２．５ｍＬの１ＭのＨＥＰＥＳ；最終濃度５０ｍＭ、４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；最終濃度１５０ｍＭ、５ｍＬのグリセロール；最終濃度１０％、０．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；最終濃度１％、及び４２ｍＬのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水で作製した。上清は、Ｎ末端にＰ４ＨＡ１及びＣ末端にＰ４ＨＢを有する融合タンパク質（ＡＢ融合タンパク質）を含有し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上にロードし、ＰＶＤＦメンブレンに移した。融合タンパク質は、ウエスタンブロットにおいてＰ４ＨＢ抗体によって探索された。
【0083】
ＰＰ７６５株を２ｍＬのＢＭＧＹ培地を有する２４ウェルプレートに接種し、９００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間増殖させた。細胞を沈降させ、培地を回収した。単量体のプロリル４－ヒドロキシラーゼを含有する上清をＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上にロードし、ＰＶＤＦメンブレンに移した。融合タンパク質は、ウエスタンブロットにおいてＨｉｓタグ抗体によって探索された。
【0084】
ＰＰ３３５株を使用して同様の手順を行い、Ｎ末端にＰ４ＨＢ及びＣ末端にＰ４ＨＡ１を有する融合タンパク質（ＢＡ融合タンパク質）を生成した。
【0085】
ＡＢ２２融合タンパク質において、クマシー染色及びウエスタンブロットの両方によって分子量が約１２０ｋＤａの融合タンパク質を検出した。ＢＡ融合タンパク質において、両方の方法によって融合タンパク質を検出することはできなかった。
【0086】
ＰＰ３３６株を２ｍＬのＢＭＧＹ発酵培地を有する２４ウェルプレートに接種し、９００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４８時間増殖させた。同時に、コラーゲン、Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢのＤＮＡ配列を有するベンチマーク酵母株ＰＰ２６８を、同じ条件下で別々に増殖させた。
【0087】
【0088】
サンプルＰＰ３３６及びＰＰ２６８を、以下の手順に従ってペプシンアッセイによって分析し、ペプシンに対するコラーゲン三量体の感受性を評価した。ＰＰ３３６は、ＰＰ２６８と同様のペプシン耐性を有する。
【0089】
ＰＰ３３６及びＰＰ２６８のプロリンヒドロキシル化をアミノ酸分析により分析した。ＰＰ３３６は、ＰＰ２６８について観察されたものと同様の又はより良好なプロリンヒドロキシル化を有する。
【0090】
ペプシンアッセイは以下の手順で行った：
１．ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロトコルあたりの各サンプルの全タンパク質を得るためにビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを行う。総タンパク質をすべてのサンプルの最低濃度に標準化する。
２．１００ｕＬの溶解物をマイクロ遠心チューブに入れる。
３．以下を含むマスターミックスを作製する：
ａ．３７％ＨＣｌ（１００ｍＬあたり０．６ｍＬの酸）及び
ｂ．ペプシン（ストックは脱イオン水中に１ｍｇ／ｍＬであり、ペプシンの最終添加によりペプシン：全タンパク質（重量：重量）が１：２５の比にならなければならない。
ｃ．全タンパク質のステップ＃１の標準化に基づいて、ペプシンの量は最終的な添加で変化するため、作製されたスプレッドシートを用いて調節する。
４．ペプシンを加えた後、ピペットで３回混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートしてペプシン反応を起こさせる。
５．１時間後、１：１容量のβ－メルカプトエタノールを含むＬＤＳローディング緩衝液を各サンプルに加え、７０℃で７分間インキュベートする。β
６．その後、１４，０００ｒｐｍで１分間回転させて濁りを除去する。
実施例４：
１．ペプシン処理の前に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロトコルあたりの各サンプルの全タンパク質を得るためにビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを行う。総タンパク質をすべてのサンプルの最低濃度に標準化する。
２．１００ｕＬの溶解物をマイクロ遠心チューブに入れる。
３．以下を含むマスターミックスを作製する：
ａ．３７％ＨＣｌ（１００ｍＬあたり０．６ｍＬの酸）及び
ｂ．ペプシン（ストックは脱イオン水中に１ｍｇ／ｍＬであり、ペプシンの最終添加によりペプシン：全タンパク質（重量：重量）が１：２５の比にならなければならない。
ｃ．全タンパク質のステップ＃１の標準化に基づいて、ペプシンの量は最終的な添加で変化するため、作製されたスプレッドシートを用いて調節する。
４．ペプシンを加えた後、ピペットで３回混合し、サンプルを室温で１時間インキュベートしてペプシン反応を起こさせる。
５．１時間後、１：１容量のβ－メルカプトエタノールを含むＬＤＳローディング緩衝液を各サンプルに加え、７０℃で７分間インキュベートする。β
６．その後、１４，０００ｒｐｍで１分間回転させて濁りを除去する。
実施例４：
【0091】
コラーゲン及び融合タンパク質のＤＮＡを含まない酵母株ＰＰ９７を、ＹＰＤ培地及び８０ｍＭプロリンで一晩増殖させ、増殖培養物を生成した。２０ｍＬのＹＰＤ培地及び８０ｍＭプロリンに、５ｍＬの増殖培養物を接種し、３００ｒｐｍで３０℃で１時間インキュベートした。細胞を５０００ｒｐｍで４℃で５分間採取し、滅菌水で２回洗浄し、その後１０ｍＬの形質転換用緩衝液と混合し、１０ｍＭ ＤＤＴで２５℃で２５分間インキュベートした。細胞を採取し、冷たいソルビトールで２回洗浄し、その後ＡＢ融合タンパク質のＤＮＡ配列を含有するＭＭＶ４００（配列番号１１及び図６））をエレクトロポレーションで形質転換した。細胞を、全持続時間にわたって存在する８０ｍＭプロリンを有するゼオシン５００プレートで３時間インキュベートした後、細胞を播種した。プレートを２日間３０℃でインキュベートし、実施例３に記載の手順に従って、コロニーをスクリーニングした。結果は、融合タンパク質がプロリンの存在下で空の宿主細胞に形質転換されたことを示した。
【0092】
ＹＰＤ培地にプロリンが存在しない場合、コロニーは存在しないか又は形成されたコロニーはほとんど存在しなかった。これらのコロニーをウエスタンブロットによって分析すると、すべてのコロニーはＡＢ融合タンパク質に対して陰性であった。ＹＰＤ培地に添加した８０ｍＭプロリンを用いた実験では、６／６コロニーをウエスタンブロットによって分析し、それらのすべてはＡＢ融合タンパク質に対して陽性であった。
実施例５：
実施例５：
【0093】
ベクターＭＭＶ２９０（図４）（配列番号９）を、ＢｇｌＩＩ及びＭｌｕＩ及びインサートとアセンブルされたＧｉｂｓｏｎ（配列番号１２）で消化し、ＡＢ融合タンパク質のＣ末端に、６個の連続したヒスチジンのアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を表すヌクレオチド配列、２個の終止コドン、及びＡＯＸ１転写ターミネーターを包含し、ベクターＭＭＶ５０２（図７）を生成した。
【0094】
ベクターＭＭＶ１５６（図２）（配列番号１３）を、ＢｇｌＩＩ及びＭｌｕＩ及びインサートとアセンブルされたＧｉｂｓｏｎ（配列番号１２）で消化し、Ｐ４ＨＢサブユニットタンパク質のＣ末端に、６個の連続したヒスチジンのアミノ酸（Ｈｉｓタグ）を表すヌクレオチド配列、２個の終止コドン、及びＡＯＸ１転写ターミネーターを包含し、ベクターＭＭＶ５０３（図８）を生成した。
【0095】
ＭＭＶ５０２をＰＰ１５３に形質転換して、ＰＰ５４８株を生成した。この株を、ウエスタンブロット及びクマシー染色ゲルを含む様々な方法を使用して、タンパク質含量について培養、溶解、及びアッセイした。ウエスタンブロットによって、ＡＢ融合タンパク質の存在を確認した。クマシー染色ゲルによって、Ｈｉｓタグ（１１９ｋＤａ）を有するＡＢ融合タンパク質の分子量を確認した。ＰＰ５４８株の高発現変異体を、振とうフラスコ及び発酵槽中で増殖させた。コンフルエントになれば、細胞を遠心分離してペレット化し、洗浄した。その後、細胞を、８００ｕＬの溶解緩衝液中でＱｉａｇｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒを使用して溶解させた。溶解緩衝液は、２．５ｍＬの１ＭのＨＥＰＥＳ；最終濃度５０ｍＭ、４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；最終濃度１５０ｍＭ、５ｍＬのグリセロール；最終濃度１０％、０．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；最終濃度１％、及び４２ｍＬのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水で作製した。溶解物を遠心分離し、可溶性画分をＮｉｃｋｅｌ－ＮＴＡアガロースビーズと共にインキュベートした。清澄化した溶解物－ビーズ混合物を、ビーズを保持するカラムに適用した。続いて、Ｎｉｃｋｅｌ－ＮＴＡビーズを、異なる濃度のイミダゾールで洗浄し、場合によっては、１，１０－フェナントロリン及びＥＤＴＡなどの他の化学物質を含む。その後、プラスミドＭＭＶ５０２によりコードされたＨｉｓタグを有するＡＢ融合タンパク質を、３００ｍＭイミダゾールで洗浄することによって溶出させた。これらの溶出液を組み合わせ、又は分離したままにし、Ａｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－１５フィルタカラムを使用して緩衝液交換を行って、残留イミダゾールを除去した。その後、ＡＢ融合タンパク質を次のアッセイに使用した。
【0096】
ＭＭＶ５０３をＰＰ１５３に形質転換し、ＰＰ５４９株を生成した。この株を、ウエスタンブロット及びクマシー染色ゲルを含む様々な方法を使用して、タンパク質含量について培養、溶解、及びアッセイした。ウエスタンブロットによって、Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢ酵素の存在を確認した。クマシー染色ゲルによって、Ｐ４ＨＡ（６１ｋＤａ）及びＰ４ＨＢ（５７ｋＤａ）酵素の分子量を確認した。ＰＰ５４９株の高発現変異体を、振とうフラスコ及び発酵槽中で増殖させた。コンフルエントになれば、細胞を遠心分離してペレット化し、洗浄した。その後、細胞を、８００ｕＬの溶解緩衝液中でＱｉａｇｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒを使用して溶解させた。溶解緩衝液は、２．５ｍＬの１ＭのＨＥＰＥＳ；最終濃度５０ｍＭ、４３８．３ｍｇのＮａＣｌ；最終濃度１５０ｍＭ、５ｍＬのグリセロール；最終濃度１０％、０．５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；最終濃度１％、及び４２ｍＬのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水で作製した。溶解物を遠心分離し、可溶性画分をＮｉｃｋｅｌ－ＮＴＡアガロースビーズと共にインキュベートした。清澄化した溶解物－ビーズ混合物を、ビーズを保持するカラムに適用した。続いて、Ｎｉｃｋｅｌ－ＮＴＡビーズを、異なる濃度のイミダゾールで洗浄し、場合によっては、１，１０－フェナントロリン及びＥＤＴＡなどの他の化学物質を含む。その後、プラスミドＭＭＶ５０３によりコードされたＨｉｓタグを有するＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢを、３００ｍＭイミダゾールで洗浄することによって溶出させた。溶離を組み合わせ、又は分離したまま維持し、Ａｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－１５フィルタカラムを使用して緩衝液交換を行って、残留イミダゾールを除去した。その後、Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢタンパク質を、その後のアッセイに使用した。
実施例６：
実施例６：
【0097】
αケトグルタル酸のヒドロキシル化結合脱炭酸に基づく方法での修飾によって、ＰＰ５４８からの融合タンパク質酵素活性を確認した（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｍｙｌｌｙｌａ，Ｒ．（１９８２）Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８２，２４５－３０４；Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｍｙｌｌｙｌａ，Ｒ．（１９９７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｒｏｎ－ ａｎｄ ２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｌｙｌ ４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１６，１１７３－１１８０）。活性測定は、（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）１０ペプチドモデル基質上のヒドロキシル化反応におけるＡＢ融合タンパク質による経時的なαケトグルタル酸消費に基づくものであった。ＡＢ融合タンパク質量は、反応毎に０．１２～０．４ｎｍｏｌの範囲である。０～１０分の範囲の異なる時点で選択されたサンプル５０μｌを、０．５Ｍ ＨＣｌ中の１５０μｌの３０ｍＭ ｏ－フェニレンジアミンに、９６ディープウェルプレート中で混合することによって反応を停止させた。プレートを９５℃に設定されたヒートブロックに１０分間置き、色形成を停止し、その後、氷上で２分間冷却した。その後、５０ｕｌのサンプルを黒色９６ウェルプレート中で３０μｌ １．２５Ｍ ＮａＯＨと混合した。サンプルの蛍光を、プレートリーダー上の発光４２０、励起３４０で読み取った。αケトグルタル酸濃度は、同じアッセイ条件下で実施されたαケトグルタル酸標準サンプルから誘導した。時間ゼロ濃度からサンプル濃度を減算することにより、αケトグルタル酸消費を計算した。
【0098】
ＰＰ５４８からのＰ４ＨＡ及びＰ４ＨＢ酵素活性は、上記と同じアッセイによって確認した。
【0099】
結果は、天然Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢタンパク質を有するサンプルよりもＡＢ融合タンパク質を有するサンプル中には、αケトグルタル酸が少ないことが示された。これは、ＡＢ融合タンパク質が天然Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢタンパク質よりも活性であることを示す。
実施例７：
実施例７：
【0100】
ＭＭＶ４１１（配列番号１４及び図９）をＰｍｅ Ｉで消化し、ＰＰ９７に形質転換して、ＰＰ４３４を生成させた。
【0101】
単一コロニーを、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩一定振とうしながら、５０ｍＬのＢＭＧＹ培地に接種した。翌日、５００ｍＬの新鮮なＢＭＧＹ培地に、１Ｌの三角フラスコに一晩増殖させた培養物を接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日間一定振とうしながら増殖させた。
【0102】
ＰＰ４３４細胞を、５．６６７ｍＬリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ－７．４）中に再懸濁した（１ｇの湿潤細胞重量（ｗｃｗ））。マトリックスＤビーズを使用して、間に１分間の冷却を有する５サイクルで、細胞をビーズビーター内で溶解させて、全細胞溶解物を生成した。その後、細胞溶解物全体をいくつかの１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに入れ、５分毎に静かに混合しながら７０℃で３０分間加熱した。その後、細胞溶解物全体を４℃で５分間２１０００×ｇで沈降させた。上清を氷上に１０分間置いた。Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（１ｇのｗｃｗの０．５ｍＬの床体積）を脱イオン水で３回平衡化し、８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによってエタノールを除去した。清澄化した溶解物を平衡化されたＮｉ－ＮＴＡ樹脂に添加し、エンドオーバーエンド回転により、４℃で６０分間インキュベートした。上清を、８００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって回収した。樹脂を、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ－７．４、２０ｍＭイミダゾールで、８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによって洗浄した。その後、樹脂を、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ－７．４、２５０ｍＭイミダゾールで、８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによって洗浄した。８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによって、溶出緩衝液で、４℃で５分間（エンドオーバーエンド回転）インキュベートした後、タンパク質を、５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭイミダゾールで３回溶出させた。ＳＤＳＰＡＧＥ上で、サンプルを分析した（上清及びペレットの両方を、細胞溶解物全体と共に）。その後、サンプルを、少なくとも１つの緩衝液交換（少なくとも１００ｘのサンプル体積で透析）を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で透析した。
－ＰＰ５４７の作製
－ＰＰ５４７の作製
【0103】
ベクターＭＭＶ３６３を、２２ｋＤ小型Ｐｒｅ－Ｐｒｏ－Ｃｏｌ３及び関連するプロモーターｐＤＦ及びターミネーターＡＯＸ１ＴＴ、Ｆｌａｇ及びＨＡタグ、マーカー発現及び関連するプロモーター及びターミネーターのＤＮＡ配列、細菌及び酵母の複製起点（複数可）のＤＮＡ配列、並びに組み込みのための酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ（複数可）配列（複数可）を含むように改変した。ベクターＭＭＶ８８は、Ｐｒｅ－Ｐｒｏ－Ｃｏｌ３ドメインのソースＤＮＡであった。ベクターＭＭＶ１３０は、Ｃｏｌ３Ａ１ドメイン＋ＨＡ及びＦｌａｇタグのソースＤＮＡであった。Ｃｏｌ３Ａ１ポリペプチドの全長は、１９０アミノ酸（ａａ）である。３つの断片を一緒にＧｉｂｓｏｎ化させ、得られたプラスミドをＭＭＶ３８３とした。
【0104】
ＭＭＶ３８３を、組み込みのためにＡｏｘランディングパッドを使用してＰＰ９７に形質転換した。得られたピキア株はＰＰ４１４であった。その後のウエスタンブロットは、２２ｋＤ小型Ｃｏｌ３分子の分泌を示した。
【0105】
ＰＰ４１４をＭＭＶ５０２、ＭＭＶ２９０のＨｉｓタグ付きバージョンで形質転換し、ＰＰ５４７を生成した。
－ＰＰ６３５及びＰＰ６３６の作製
－ＰＰ６３５及びＰＰ６３６の作製
【0106】
ＰＰ９７の単一コロニーを、８０ｍＭプロリンを有する１５ｍＬのＹＰＤ培地に接種し、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で一晩増殖させた。翌日、培地の体積を、８０ｍＭプロリンを有する新鮮なＹＰＤで２倍にし、振とうしながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で別時間増殖させた。細胞を３，５００ｇで５分間沈降させた。滅菌水で２回洗浄し、１０ｍＬの形質転換緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、０．６Ｍソルビトール）に再懸濁し、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、十分に混合した。再懸濁液を室温で３０分間インキュベートした。細胞を３，５００ｘｇで５分間沈降し、ペレットを５ｍＬの氷冷１Ｍソルビトールに再懸濁し、再度３，５００×ｇで５分間沈降した。５ｍＬの１Ｍソルビトールを用いた洗浄を２回繰り返した。洗浄したペレットを、５００μｌの氷冷１Ｍソルビトール中に再懸濁し、１００μｌのこの再懸濁液を、予め冷却された０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに等分した。ＭＭＶ５０２（図７）及びＭＭＶ５０３（図８）の線状化ＤＮＡ配列を、細胞（別個のキュベット内）に加え、ピペッティングにより混合した。また、線状化ＤＮＡ配列の代わりに、水を細胞混合物に添加した陰性対照も設定した。混合物を氷上で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ピキア－ＷＵプロトコル（１５００ｖ、２５ｕＦ、２００Ｗ）を使用してパルスすることによってエレクトロポレーションを行い、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）はエレクトロポレーションに使用された。細胞を、ＹＰＤ及び１Ｍソルビトール（１：１）の５００μｌ混合物に直ちに移し、３０℃で２時間インキュベートした。この２時間インキュベートした培養物の１００μｌ分割量を、７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８抗生物質プレート上に播種した。プレートを３０℃で２日間インキュベートした。
【0107】
２日間のインキュベーション後にプレート上に出現したコロニーを拾い、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＢＭＧＹ培地に接種した。接種は、２ｍＬ培養及び２４ウェルフォーマットで行った。プレートを振とうしながら３０℃（９００ｒｐｍ）で２日間インキュベートした。各２ｍＬの培養物を沈降させ、１００ｍｇのペレットを、１ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５％グリセロール及び１％ＥＤＴＡ、ｐＨ－７．５）に再懸濁した。溶解は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ及びＹマトリックスビーズを使用して１５分間行った。溶解物をＳＤＳ Ｌｉｃｏｒローディング色素と５：１の比率で混合し、９０℃で１０分間加熱し、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上にロードした。ゲルをＰＶＤＦメンブレンに移した。抗Ｈｉｓ及び抗コラーゲン抗体を使用してウエスタンブロットを展開した。Ｐ４ＨはＨｉｓタグ付けされているため、融合Ｐ４Ｈは、赤色チャネルにおいて１１０ｋＤａタンパク質として示されるのに対し、双方向発現Ｐ４ＨＡ／Ｂは、赤色チャネルにおいて５９ｋＤａで示される。ブロットにおいてコラーゲンバンドは観察されず、Ｐ４Ｈプラスミドがコラーゲンを用いずに形質転換されたことを確認した。融合Ｐ４Ｈの高発現を示したクローンをＰＰ６３５として確認し、双方向発現Ｐ４Ｈの高発現を示したクローンをＰＰ６３６として確認した。
【0108】
各株の単一コロニーを、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩一定振とうしながら、５０ｍＬのＢＭＧＹ培地に別々に接種した。翌日、５００ｍＬの新鮮なＢＭＧＹ培地に、１Ｌの三角フラスコに一晩増殖させた培養物を接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日間一定振とうしながら増殖させた。
【0109】
細胞（０．４５ｇ ｗｃｗ（湿潤細胞重量））を、０．６５ｍＬの溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）中に再懸濁して、４５％懸濁液を得た。マトリックスＤビーズを使用して、５サイクル（間に１分間の冷却）で、細胞をビーズビーター内で溶解させて、溶解物を生成した。溶解物を沈降させ、上清及びペレットを清澄化した（４℃、１０分、１６０００×ｇ）。清澄化した溶解物を取り出し、氷上に置いた。ペレットを、溶解緩衝液のｗｃｗの２倍で再懸濁し、１６０００×ｇで１０分間遠心分離して、より清澄化した溶解物を回収した。清澄化した溶解物を一緒に組み合わせた。Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（１ｇのｗｃｗの０．０２５ｍＬ以上の床体積、及び適切にスケールアップ）を脱イオン水で３回平衡化し、８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによってエタノールを除去した。清澄化した溶解物を平衡化されたＮｉ－ＮＴＡ樹脂に添加し、エンドオーバーエンド回転により、４℃で一晩インキュベートした。上清を、８００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって回収した。樹脂を、５０ｍＭイミダゾールを含有する１０カラム体積の溶解緩衝液で、８００×ｇで２分間４℃で遠心分離することによって洗浄した。その後、樹脂を、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ－７．４、２５０ｍＭイミダゾールで、８００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって洗浄した。タンパク質を、８００×ｇで５分間４℃で遠心分離することによって、４℃で５分間溶出緩衝液でインキュベートした後（エンドオーバー回転）、３００ｍＭイミダゾールを含有する５ｍＬの溶解緩衝液で溶出させた。溶出は２回以上実施した（合計３回）。ＳＤＳＰＡＧＥ上で、サンプルを分析した（上清及びペレットの両方を、細胞溶解物全体と共に）。サンプルを、少なくとも１つの緩衝液交換（少なくとも１００ｘのサンプル体積で透析）を用いて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で透析して、精製されたコラーゲン溶解物を生成した。
－精製されたコラーゲンモノマーとのインビトロヒドロキシル化反応
１）以下の表に従って、４０反応（反応毎に２５０ｕｌ）の反応混合物を調製した。
２）２５０ｕｌの反応物について、２０ｕｌの上記混合物を各チューブに等分した（各反応を３回行った）。
３）１ｇ／ＬのＢＳＡ、０．１ｇ／Ｌのカタラーゼ及び水を添加して最終体積を２５０ｕＬにする。
４）５ｕＭの融合タンパク質を添加する
５）２ｕＭのコラーゲンサンプルを添加する
６）３２℃で２分間反応物をインキュベートする
７）２．５ｕｌの０．４Ｍ ２－オキソグルタレートを添加し、ウェルを混合する
８）３２℃で１時間インキュベートする
９）１００ｕｌの各反応物を新しいチューブに移し、ヒドロキシプロリンアッセイのサンプルに引き継ぐ
－ヒドロキシプロリンアッセイ
１．以下の溶液を調製した：
Ａ．クエン酸／酢酸緩衝液（１００ｍＬ用）
５％ クエン酸（５ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ１９０９、一水和物）
１．２％ 氷酢酸（１．２ｍＬ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３８－５００）
７．２４％ 酢酸ナトリウム（７．２４ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２８８９）
３．５％ 水酸化ナトリウム（３．４ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、３０６５７６）
Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で１００ｍＬにする
Ｂ．クロラミンＴ（２０ｍＬ用）
１．４１ｇ クロラミンＴ
１０ｍＬ イソプロパノール
１０ｍＬ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水
Ｃ．Ｅｈｒｌｉｃｈ溶液（２０ｍＬ用）
４ｇ ｐ－ジメチルベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）
６ｍＬ 塩酸
１４ｍＬ イソプロパノール
Ｄ．クロラミンＴ／クエン酸－酢酸塩溶液（２０ｍＬ用）
４ｍＬ クロラミンＴ（上記から）
１６ｍＬ クエン酸／酢酸緩衝液（上記から）
２．サンプル調製：
ａ．コラーゲンを含有する１００ｕＬのインビトロヒドロキシル化反応物をガラスアンバーバイアル瓶に入れた。
ｂ．５００ｕＬの濃縮ＨＣｌを加え、バイアル瓶にしっかりと蓋をした。
ｃ．バイアル瓶を、少なくとも１８時間、ヒートブロックで１２５℃でインキュベートした。
ｄ．サンプルをｓｐｅｅｄ ｖａｃを用いて乾燥させた。
ｅ．乾燥サンプルを、２２５ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水でバイアル瓶に再懸濁させた。
ｆ．サンプルを遠心分離して、１０，０００Ｘｇで５分間沈殿及び残渣を除去し、アッセイで使用する上清を除去した。
３．標準曲線調製：
ａ．１０００ｕｇ／ｍＬのヒドロキシプロリンの原液を調製した
ｂ．原液を使用して、５０ｕｇ／ｍＬのトップの標準濃度を調製した
ｃ．５０ｕｇ／ｍＬ溶液を使用して、標準曲線について以下の濃度を作製した：２５、１８．７５、１２．５、６．２５、３．１２５ｕｇ／ｍＬ
ｄ．０ｕｇ／ｍＬ＝水
ｅ．これらの標準物を、ウェルＡ１～Ａ７に、その複製Ｂ１～Ｂ７と共に、９６ウェルプレート内に配置した
４．内部対照：
ａ．工程２ａ～ｄに続いて、コラージュを含有するインビトロヒドロキシル化反応の代わりに、４００ｕＬのＩＩＩ型コラーゲン（Ａｂｃａｍ、ａｂ７５２８）を使用した
ｂ．４００ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁させた
ｃ．内部対照を９６ウェルプレートのＡ８及びＢ８に配置した
５．内部対照定量：
ａ．ＩＩＩ型コラーゲンのストックバイアル瓶から５０ｕＬの分割量を取り、ｑＳＤＳ上で実行した。
ｂ．ｑＳＤＳによって得られた濃度を使用して、内部対照のヒドロキシル化率を計算した。
６．ヒドロキシプロリンアッセイ：
ａ．５０ｕＬの標準物を添加し、４回サンプリングした（２つの複製物は、クロラミンＴが添加されないブランクである）
ｂ．分析される各反応物（標準曲線ウェルを含む）については、１００ｕＬのクロラミンＴ／クエン酸－酢酸塩溶液を添加した。
ｃ．ブランクについては、１００ｕＬの水／クエン酸－酢酸塩溶液（これらのサンプル中に酸化が生じない）を添加した。
ｄ．プレートに蓋をして、振とうしながら３０℃で２５分間インキュベートした。
ｅ．１００ｕＬのＥｒｈｌｉｃｈ溶液を添加し、ウェルが透明になるまで各ウェルを十分に混合した。
ｆ．プレートに蓋をして、振とうしながら６５℃で２５分間インキュベートした。
ｇ．熱源からプレート（複数可）を除去し、５６０ｎｍですべてのサンプル／ブランクの吸光度を測定した。
ｈ．使用されるコラーゲンの分子量を得ることによって、ヒドロキシル化率を計算した。また、上記の使用されるコラーゲンの螺旋領域におけるヒドロキシプロリン部位及びプロリンの数も必要とされる。
ｉ．例示的なパーセント（％）ヒドロキシプロリン計算：
ＰＰ６８５コラーゲンの分子量＝９４，７５２ｇ／ｍｏｌ
ヒドロキシプロリンの分子量＝１３１．１３ｇ／ｍｏｌ
螺旋領域におけるヒドロキシプロリン部位の＃＝１４５
螺旋領域におけるプロリン部位の＃＝２４６
ＩＶＯＨ反応におけるＰＰ６８５コラーゲン濃度＝０．０８４ｇ／Ｌ
ａ．ＩＶＯＨ反応の標準曲線から得られたヒドロキシプロリンの濃度
・３．９１ｕｇ／ｍＬ
・増倍係数を用いた補正＝３．１Ｘ３．９１ｕｇ／ｍＬ＝１２．１ｕｇ／ｍＬ
ｂ．マイクログラム（ｕｇ）に換算したヒドロキシプロリンの濃度
・ウェルあたりに使用される５０ｕＬのサンプル
・（５０ｕＬＸ１２．１ｕｇ／ｍＬ）は１０００＝０．６０７ｕｇのヒドロキシプロリンで割る
ｃ．ＩＶＯＨ反応で使用されるコラーゲンのマイクログラム
・ウェルあたり５０ｕＬのサンプル
・（５０ｕＬＸ０．０８４ｇ／Ｌ）に１Ｘ１０６＝４．２ｕｇを掛ける
ｄ．ＰＰ６８５コラーゲンのｎｍｏｌ
・（４．２ｕｇ／１Ｘ１０６ｕｇ）Ｘ１ｇ＝４．２Ｘ１０－６ｇ
・（４．２Ｘ１０－６ｇ）／（９４７５２．７６ｇ／ｍｏｌのＰＰ６８５コラーゲン）＝４．４Ｘ１０－１１ｍｏｌ
・４．４Ｘ１０－１１ｍｏｌＸ（１Ｘ１０９ｎｍｏｌ／１ｍｏｌ）＝０．０４４ｎｍｏｌ
ｅ．ヒドロキシプロリンのｎｍｏｌ
・（０．６０７ｕｇ／１３１．１３ｇ／ｍｏｌ）Ｘ１０００＝４．６ｎｍｏｌヒドロキシプロリン
ｆ．ｎｍｏｌプロリン
・０．０４４ｎｍｏｌコラーゲンＸ２４６＝１０．８ｎｍｏｌプロリン
ｇ．ヒドロキシプロリンのパーセント％
・（４．６ｎｍｏｌ／１０．８ｎｍｏｌ）Ｘ１００＝４２％ヒドロキシル化
－結果
－精製されたコラーゲンモノマーとのインビトロヒドロキシル化反応
１）以下の表に従って、４０反応（反応毎に２５０ｕｌ）の反応混合物を調製した。
【表1】
３）１ｇ／ＬのＢＳＡ、０．１ｇ／Ｌのカタラーゼ及び水を添加して最終体積を２５０ｕＬにする。
４）５ｕＭの融合タンパク質を添加する
５）２ｕＭのコラーゲンサンプルを添加する
６）３２℃で２分間反応物をインキュベートする
７）２．５ｕｌの０．４Ｍ ２－オキソグルタレートを添加し、ウェルを混合する
８）３２℃で１時間インキュベートする
９）１００ｕｌの各反応物を新しいチューブに移し、ヒドロキシプロリンアッセイのサンプルに引き継ぐ
－ヒドロキシプロリンアッセイ
１．以下の溶液を調製した：
Ａ．クエン酸／酢酸緩衝液（１００ｍＬ用）
５％ クエン酸（５ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ１９０９、一水和物）
１．２％ 氷酢酸（１．２ｍＬ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ３８－５００）
７．２４％ 酢酸ナトリウム（７．２４ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２８８９）
３．５％ 水酸化ナトリウム（３．４ｇ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、３０６５７６）
Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で１００ｍＬにする
Ｂ．クロラミンＴ（２０ｍＬ用）
１．４１ｇ クロラミンＴ
１０ｍＬ イソプロパノール
１０ｍＬ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水
Ｃ．Ｅｈｒｌｉｃｈ溶液（２０ｍＬ用）
４ｇ ｐ－ジメチルベンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）
６ｍＬ 塩酸
１４ｍＬ イソプロパノール
Ｄ．クロラミンＴ／クエン酸－酢酸塩溶液（２０ｍＬ用）
４ｍＬ クロラミンＴ（上記から）
１６ｍＬ クエン酸／酢酸緩衝液（上記から）
２．サンプル調製：
ａ．コラーゲンを含有する１００ｕＬのインビトロヒドロキシル化反応物をガラスアンバーバイアル瓶に入れた。
ｂ．５００ｕＬの濃縮ＨＣｌを加え、バイアル瓶にしっかりと蓋をした。
ｃ．バイアル瓶を、少なくとも１８時間、ヒートブロックで１２５℃でインキュベートした。
ｄ．サンプルをｓｐｅｅｄ ｖａｃを用いて乾燥させた。
ｅ．乾燥サンプルを、２２５ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水でバイアル瓶に再懸濁させた。
ｆ．サンプルを遠心分離して、１０，０００Ｘｇで５分間沈殿及び残渣を除去し、アッセイで使用する上清を除去した。
３．標準曲線調製：
ａ．１０００ｕｇ／ｍＬのヒドロキシプロリンの原液を調製した
ｂ．原液を使用して、５０ｕｇ／ｍＬのトップの標準濃度を調製した
ｃ．５０ｕｇ／ｍＬ溶液を使用して、標準曲線について以下の濃度を作製した：２５、１８．７５、１２．５、６．２５、３．１２５ｕｇ／ｍＬ
ｄ．０ｕｇ／ｍＬ＝水
ｅ．これらの標準物を、ウェルＡ１～Ａ７に、その複製Ｂ１～Ｂ７と共に、９６ウェルプレート内に配置した
４．内部対照：
ａ．工程２ａ～ｄに続いて、コラージュを含有するインビトロヒドロキシル化反応の代わりに、４００ｕＬのＩＩＩ型コラーゲン（Ａｂｃａｍ、ａｂ７５２８）を使用した
ｂ．４００ｕＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁させた
ｃ．内部対照を９６ウェルプレートのＡ８及びＢ８に配置した
５．内部対照定量：
ａ．ＩＩＩ型コラーゲンのストックバイアル瓶から５０ｕＬの分割量を取り、ｑＳＤＳ上で実行した。
ｂ．ｑＳＤＳによって得られた濃度を使用して、内部対照のヒドロキシル化率を計算した。
６．ヒドロキシプロリンアッセイ：
ａ．５０ｕＬの標準物を添加し、４回サンプリングした（２つの複製物は、クロラミンＴが添加されないブランクである）
ｂ．分析される各反応物（標準曲線ウェルを含む）については、１００ｕＬのクロラミンＴ／クエン酸－酢酸塩溶液を添加した。
ｃ．ブランクについては、１００ｕＬの水／クエン酸－酢酸塩溶液（これらのサンプル中に酸化が生じない）を添加した。
ｄ．プレートに蓋をして、振とうしながら３０℃で２５分間インキュベートした。
ｅ．１００ｕＬのＥｒｈｌｉｃｈ溶液を添加し、ウェルが透明になるまで各ウェルを十分に混合した。
ｆ．プレートに蓋をして、振とうしながら６５℃で２５分間インキュベートした。
ｇ．熱源からプレート（複数可）を除去し、５６０ｎｍですべてのサンプル／ブランクの吸光度を測定した。
ｈ．使用されるコラーゲンの分子量を得ることによって、ヒドロキシル化率を計算した。また、上記の使用されるコラーゲンの螺旋領域におけるヒドロキシプロリン部位及びプロリンの数も必要とされる。
ｉ．例示的なパーセント（％）ヒドロキシプロリン計算：
ＰＰ６８５コラーゲンの分子量＝９４，７５２ｇ／ｍｏｌ
ヒドロキシプロリンの分子量＝１３１．１３ｇ／ｍｏｌ
螺旋領域におけるヒドロキシプロリン部位の＃＝１４５
螺旋領域におけるプロリン部位の＃＝２４６
ＩＶＯＨ反応におけるＰＰ６８５コラーゲン濃度＝０．０８４ｇ／Ｌ
ａ．ＩＶＯＨ反応の標準曲線から得られたヒドロキシプロリンの濃度
・３．９１ｕｇ／ｍＬ
・増倍係数を用いた補正＝３．１Ｘ３．９１ｕｇ／ｍＬ＝１２．１ｕｇ／ｍＬ
ｂ．マイクログラム（ｕｇ）に換算したヒドロキシプロリンの濃度
・ウェルあたりに使用される５０ｕＬのサンプル
・（５０ｕＬＸ１２．１ｕｇ／ｍＬ）は１０００＝０．６０７ｕｇのヒドロキシプロリンで割る
ｃ．ＩＶＯＨ反応で使用されるコラーゲンのマイクログラム
・ウェルあたり５０ｕＬのサンプル
・（５０ｕＬＸ０．０８４ｇ／Ｌ）に１Ｘ１０６＝４．２ｕｇを掛ける
ｄ．ＰＰ６８５コラーゲンのｎｍｏｌ
・（４．２ｕｇ／１Ｘ１０６ｕｇ）Ｘ１ｇ＝４．２Ｘ１０－６ｇ
・（４．２Ｘ１０－６ｇ）／（９４７５２．７６ｇ／ｍｏｌのＰＰ６８５コラーゲン）＝４．４Ｘ１０－１１ｍｏｌ
・４．４Ｘ１０－１１ｍｏｌＸ（１Ｘ１０９ｎｍｏｌ／１ｍｏｌ）＝０．０４４ｎｍｏｌ
ｅ．ヒドロキシプロリンのｎｍｏｌ
・（０．６０７ｕｇ／１３１．１３ｇ／ｍｏｌ）Ｘ１０００＝４．６ｎｍｏｌヒドロキシプロリン
ｆ．ｎｍｏｌプロリン
・０．０４４ｎｍｏｌコラーゲンＸ２４６＝１０．８ｎｍｏｌプロリン
ｇ．ヒドロキシプロリンのパーセント％
・（４．６ｎｍｏｌ／１０．８ｎｍｏｌ）Ｘ１００＝４２％ヒドロキシル化
－結果
【表2】
【0110】
結果は、必要な補助因子及び適切な反応条件（温度及びｐＨ）の存在下で、両方の株（ＰＰ５４７及びＰＰ６３５）中の融合タンパク質は、非融合タンパク質を含有するＰＰ６３６株よりも高い％までコラーゲン基質をヒドロキシ化することができたことが示された。ＰＰ５４７及びＰＰ６３５は、当初は株並びにタンパク質安定性に必要とされると考えられた前者のコラーゲンの小断片の存在により異なった。これは、融合タンパク質が安定であり、非融合タンパク質と比較して、インビトロでより良好なジオキシゲナーゼとして機能することができ、それによって非融合対応物を上回る利点を提供することが示された。Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢの両方の融合は、タンパク質構造及び安定性を助ける機能性四量体につながるタンパク質の化学量論的量をもたらした。ヒドロキシル化％の結果を質量分析により確認した。
実施例８
実施例８
【0111】
ＮａＰＯ４緩衝液を使用してｐＨ１２で溶解した細胞に対して、溶解物中のインビトロヒドロキシル化を行った後、０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４、２ｍＭアスコルビン酸、２５ｍＭ ＤＴＴ及び２５ｍＭ αケトグルタル酸と混合した。混合物をｐＨ７．５に調整し、反応を進行させるためにインキュベータ内で振とうすることにより、３２℃で３時間インキュベートした。反応終了後、ｐＨを４に落とし、反応物を２５℃で一晩（～１８時間）混合し、～７，０００ｘｇで遠心分離して上清を回収した。上清を水又は緩衝液に対して透析し、ヒドロキシプロリンアッセイで使用した。
実施例９
実施例９
【0112】
インビボヒドロキシル化のために、いくつかのシャペロン及び酵素の助けを借りて、粗い小胞体でコラーゲンを合成した。コラーゲンのフォールディング機構は、本明細書で使用される株に存在するＰ４ＨＡ－Ｂ融合タンパク質の一部である、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）によって補助された。ＰＤＩは、タンパク質の非コラーゲンＮ及びＣ末端における正しいジスルフィド結合形成を助け、融合タンパク質のＰ４ＨＡ部分によるプロリン残基のヒドロキシル化が続く。ヒドロキシル化反応の形成に関与する補助因子は、ＥＲ（小胞体）中に存在し、インビボヒドロキシル化のために重要な細胞小器官を作製した。コラーゲンが合成されると、ＥＲ中に存在するシャペロンによって安定化され、Ｐ４ＨＡ－Ｂ融合タンパク質によってヒドロキシル化され、ここでＢサブユニットは更に安定化し、及び又は三量体化に役立つ一方で、サブユニットは、そのジオキシゲナーゼ活性を使用してプロリン残基をヒドロキシ化する。
【0113】
本開示の多くの修正及び変形は、上記の教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内では、本開示は、本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されてもよいことを理解されたい。
本発明は以下の態様を包含する。
［１］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットと、
可溶性タンパク質パートナーと、を含む、融合タンパク質。
［２］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、によってコードされる、融合タンパク質。
［３］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－２、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－３からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］
前記可溶性タンパク質パートナーは、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット、マルトース結合タンパク質、低分子ユビキチン様修飾因子、カルモジュリン結合タンパク質、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［５］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［６］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む、融合タンパク質。
［７］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、を含む、融合タンパク質。
［８］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、前記融合タンパク質のＮ末端にある、［６］又は［７］に記載の融合タンパク質。
［９］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、前記融合タンパク質のＣ末端にある、［６］～［８］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１０］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質であって、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、前記融合タンパク質のＮ末端にあり、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、前記融合タンパク質のＣ末端にある、融合タンパク質。
［１１］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である、［６］～［１０］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１２］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、［６］～［１１］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１３］
［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、微生物。
［１４］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む、微生物。
［１５］
Ｎ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、Ｃ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む、微生物。
［１６］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを含む融合タンパク質と、
ヒドロキシル化される第２のタンパク質と、を含む、微生物。
［１７］
前記微生物は、桿菌、大腸菌、及び糸状菌からなる群から選択される、［１３］～［１６］のいずれか一項に記載の微生物。
［１８］
前記微生物は、酵母である、［１３］～［１６］のいずれか一項に記載の微生物。
［１９］
前記第２のタンパク質は、コラーゲン、組換えコラーゲン、コラーゲン様タンパク質などからなる群から選択される、［１６］～［１８］のいずれか一項に記載の微生物。
［２０］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の微生物。
［２１］
個体の皮膚へスキンケアの有益性を提供するための方法であって、前記皮膚に［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を適用することを含む、方法。
［２２］
前記融合タンパク質は、クリーム、ローション、軟膏剤、ゲル、セラム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される組成物に配合される、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記スキンケアの有益性は、しわ予防、皮膚色素沈着の改善、水分補給、挫瘡の低減、挫瘡の予防、黒色面皰の低減、黒色面皰の予防、皮膚線条の低減、皮膚線条の予防、セルライトの予防、セルライトの低減及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、［２１］又は［２２］に記載の方法。
［２４］
前記融合タンパク質は、サリチル酸、レチノール、過酸化ベンゾイル、ビタミンＣ、グリセリン、α－ヒドロキシ酸、ヒドロキノン、コウジ酸、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される他のスキンケア有益性成分と組み合わされる、［２１］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
タンパク質をヒドロキシル化するためのインビトロの方法であって、ヒドロキシル化されるタンパク質を含有する微生物を提供することと、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を提供することと、前記微生物を溶解して溶解物を生成することと、特定の濃度の前記融合タンパク質を前記溶解物に添加することと、前記融合タンパク質によって前記タンパク質の前記ヒドロキシル化を促進する反応条件下で、前記溶解物及び前記融合タンパク質をインキュベートすることと、を含む、方法。
［２６］
前記溶解物は、前記融合タンパク質を添加する前に精製される、［２５］に記載の方法。
［２７］
前記融合タンパク質濃度は、約１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ～約５ｕＭの範囲である、［２５］又は［２６］に記載の方法。
［２８］
前記ヒドロキシル化は、約５～約１２の範囲のｐＨで起こる、［２５］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
前記ヒドロキシル化は、約１６℃～約４０℃の範囲の温度で起こる、［２５］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
前記ヒドロキシル化は、約３０分～約１時間にわたって起こる、［２５］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
ヒドロキシル化タンパク質を作製するための方法であって、［１３］～［２０］のいずれか一項に記載の微生物を提供することと、前記微生物を、前記第２のタンパク質をヒドロキシル化するのに十分な時間、培地中で増殖させることと、を含む、方法。
［３２］
前記微生物は、酵母である、［３１］に記載の方法。
［３３］
前記酵母は、ピキア・パストリスである、［３２］に記載の方法。
［３４］
前記微生物は、約５０時間～約７２時間増殖させる、［３１］～［３３］のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
［３５］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、を含む、微生物。
本発明は以下の態様を包含する。
［１］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットと、
可溶性タンパク質パートナーと、を含む、融合タンパク質。
［２］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、によってコードされる、融合タンパク質。
［３］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－２、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－３からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］
前記可溶性タンパク質パートナーは、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニット、マルトース結合タンパク質、低分子ユビキチン様修飾因子、カルモジュリン結合タンパク質、及びグルタチオンＳ－トランスフェラーゼからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［５］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［６］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む、融合タンパク質。
［７］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、を含む、融合タンパク質。
［８］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、前記融合タンパク質のＮ末端にある、［６］又は［７］に記載の融合タンパク質。
［９］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、前記融合タンパク質のＣ末端にある、［６］～［８］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１０］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、
プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質であって、
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、前記融合タンパク質のＮ末端にあり、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、前記融合タンパク質のＣ末端にある、融合タンパク質。
［１１］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットは、ウシ、ヒト、ラット、マウス、細菌、ウイルス、魚及び線虫からなる群から選択される種由来である、［６］～［１０］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１２］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、［６］～［１１］のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［１３］
［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、微生物。
［１４］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む、微生物。
［１５］
Ｎ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１と、Ｃ末端に位置するプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットと、を含む融合タンパク質を含む、微生物。
［１６］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１、及びプロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットを含む融合タンパク質と、
ヒドロキシル化される第２のタンパク質と、を含む、微生物。
［１７］
前記微生物は、桿菌、大腸菌、及び糸状菌からなる群から選択される、［１３］～［１６］のいずれか一項に記載の微生物。
［１８］
前記微生物は、酵母である、［１３］～［１６］のいずれか一項に記載の微生物。
［１９］
前記第２のタンパク質は、コラーゲン、組換えコラーゲン、コラーゲン様タンパク質などからなる群から選択される、［１６］～［１８］のいずれか一項に記載の微生物。
［２０］
前記プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニット－１は、配列番号１の核酸によってコードされ、前記プロリル４－ヒドロキシラーゼβサブユニットは、配列番号２の核酸によってコードされる、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の微生物。
［２１］
個体の皮膚へスキンケアの有益性を提供するための方法であって、前記皮膚に［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を適用することを含む、方法。
［２２］
前記融合タンパク質は、クリーム、ローション、軟膏剤、ゲル、セラム及びこれらの組み合わせからなる群から選択される組成物に配合される、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記スキンケアの有益性は、しわ予防、皮膚色素沈着の改善、水分補給、挫瘡の低減、挫瘡の予防、黒色面皰の低減、黒色面皰の予防、皮膚線条の低減、皮膚線条の予防、セルライトの予防、セルライトの低減及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、［２１］又は［２２］に記載の方法。
［２４］
前記融合タンパク質は、サリチル酸、レチノール、過酸化ベンゾイル、ビタミンＣ、グリセリン、α－ヒドロキシ酸、ヒドロキノン、コウジ酸、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択される他のスキンケア有益性成分と組み合わされる、［２１］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
タンパク質をヒドロキシル化するためのインビトロの方法であって、ヒドロキシル化されるタンパク質を含有する微生物を提供することと、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を提供することと、前記微生物を溶解して溶解物を生成することと、特定の濃度の前記融合タンパク質を前記溶解物に添加することと、前記融合タンパク質によって前記タンパク質の前記ヒドロキシル化を促進する反応条件下で、前記溶解物及び前記融合タンパク質をインキュベートすることと、を含む、方法。
［２６］
前記溶解物は、前記融合タンパク質を添加する前に精製される、［２５］に記載の方法。
［２７］
前記融合タンパク質濃度は、約１ｕＭのヒドロキシル化されるタンパク質に基づいて、約０．０５ｕＭ～約５ｕＭの範囲である、［２５］又は［２６］に記載の方法。
［２８］
前記ヒドロキシル化は、約５～約１２の範囲のｐＨで起こる、［２５］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
前記ヒドロキシル化は、約１６℃～約４０℃の範囲の温度で起こる、［２５］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
前記ヒドロキシル化は、約３０分～約１時間にわたって起こる、［２５］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
ヒドロキシル化タンパク質を作製するための方法であって、［１３］～［２０］のいずれか一項に記載の微生物を提供することと、前記微生物を、前記第２のタンパク質をヒドロキシル化するのに十分な時間、培地中で増殖させることと、を含む、方法。
［３２］
前記微生物は、酵母である、［３１］に記載の方法。
［３３］
前記酵母は、ピキア・パストリスである、［３２］に記載の方法。
［３４］
前記微生物は、約５０時間～約７２時間増殖させる、［３１］～［３３］のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
［３５］
プロリル４－ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードするＤＮＡ配列と、
可溶性タンパク質パートナーをコードするＤＮＡ配列と、を含む、微生物。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】