▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-30
(45)【発行日】2024-06-07
(54)【発明の名称】標的化された細胞表面編集のための複合体
(51)【国際特許分類】
A61P 35/00 20060101AFI20240531BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240531BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240531BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240531BHJP
A61K 47/62 20170101ALI20240531BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20240531BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240531BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240531BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240531BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240531BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240531BHJP
C12N 9/24 20060101ALI20240531BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240531BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240531BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20240531BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240531BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240531BHJP
【ＦＩ】
A61P35/00
A61K38/47
A61K39/395 L
A61K39/395 N
A61K39/395 Y
A61K45/00
A61K47/62
A61K47/65
A61K47/68
A61P1/04
A61P15/00
C07K16/28
C07K19/00
C12N9/24
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/56
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
【請求項の数】
13
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022131521
(22)【出願日】2022-08-22
(62)【分割の表示】P 2018567883の分割
【原出願日】2017-06-30
(65)【公開番号】P2022176981
(43)【公開日】2022-11-30
【審査請求日】2022-09-20
(31)【優先権主張番号】62/357,645
(32)【優先日】2016-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】ウッズ、 エリオット シー．
(72)【発明者】
【氏名】シャオ、 ハン
(72)【発明者】
【氏名】ベルトッツィ、 キャロライン アール．
(72)【発明者】
【氏名】グレイ、 メリッサ
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５３１０３１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｋ ３８／４７
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４７／６２
Ａ６１Ｋ ４７／６５
Ａ６１Ｋ ４７／６８
Ａ６１Ｐ １／０４
Ａ６１Ｐ １５／００
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ ９／２４
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／５６
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌治療用の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、標的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分と、標的細胞表面編集酵素と、を含む、複合体を含み、
前記標的化部分は抗体であり、前記酵素はシアリダーゼであり、
前記薬学的組成物はさらに薬学的に許容される担体を含み、
ただしグリコシル化プロドラッグと組み合されて投与される薬学的組成物を除く、
薬学的組成物。
【請求項2】
前記抗体はＩｇＧ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）
２
、または（ｓｃＦｖ’）
２
である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記シアリダーゼが前記抗体の重鎖と複合体化される、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記シアリダーゼが前記抗体のＦｃ領域と複合体化される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記シアリダーゼが前記重鎖のＣ末端と複合体化される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記複合体が融合タンパク質である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記細胞表面分子が腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
前記癌細胞が、癌腫細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、および結腸癌細胞からなる群から選択される、請求項７または８に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
前記腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
前記シアリダーゼがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、哺乳動物ノイラミニダーゼ、およびヒトノイラミニダーゼからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
前記シアリダーゼが、ヒトノイラミニダーゼ１、ヒトノイラミニダーゼ２、ヒトノイラミニダーゼ３、およびヒトノイラミニダーゼ４からなる群から選択されるヒトノイラミニダーゼである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物と、それを必要とする個体に前記薬学的組成物を投与するための説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１日に出願
された米国仮特許出願第６２／３５７，６４５号の利益を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１日に出願
された米国仮特許出願第６２／３５７，６４５号の利益を主張する。
【0002】
連邦政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＧＭ０５９９０７およびＣＡ１０８７
８１下で政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＧＭ０５９９０７およびＣＡ１０８７
８１下で政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0003】
序文
癌に対する免疫応答を強化する治療法は、難治性腫瘍との戦いにおいて革命的であるこ
とが証明されている。免疫細胞は活性化受容体および抑制性受容体からのシグナルを統合
して、挑戦的な標的に対する応答を決定する。活性化シグナルはそれらの細胞に病理の存
在を警告し、抑制性シグナルは健康な「自己」に対面していることを細胞に伝える。成功
した腫瘍は、しばしば抑制性受容体のリガンドを過剰発現させることによって、免疫細胞
認識を妨げるメカニズムを進化させる。この発見は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的
とする臨床的に承認されたＴ細胞チェックポイント阻害剤において具体化されるように、
抑制性免疫細胞シグナル伝達を遮断することを目的とする新たな治療戦略をもたらした。
進行中の前臨床試験は、複数の免疫学的経路を標的とする治療法の組み合わせに焦点を当
てている。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、他のＴ細胞チェックポイント
抑制因子を標的とするものと組み合わせて、同系腫瘍モデルにおいて改善された抗腫瘍活
性を示す。これらの介入を補完するのは、自然免疫細胞、特にナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞、マクロファージおよび樹状細胞を標的とする療法である。
癌に対する免疫応答を強化する治療法は、難治性腫瘍との戦いにおいて革命的であるこ
とが証明されている。免疫細胞は活性化受容体および抑制性受容体からのシグナルを統合
して、挑戦的な標的に対する応答を決定する。活性化シグナルはそれらの細胞に病理の存
在を警告し、抑制性シグナルは健康な「自己」に対面していることを細胞に伝える。成功
した腫瘍は、しばしば抑制性受容体のリガンドを過剰発現させることによって、免疫細胞
認識を妨げるメカニズムを進化させる。この発見は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的
とする臨床的に承認されたＴ細胞チェックポイント阻害剤において具体化されるように、
抑制性免疫細胞シグナル伝達を遮断することを目的とする新たな治療戦略をもたらした。
進行中の前臨床試験は、複数の免疫学的経路を標的とする治療法の組み合わせに焦点を当
てている。例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、他のＴ細胞チェックポイント
抑制因子を標的とするものと組み合わせて、同系腫瘍モデルにおいて改善された抗腫瘍活
性を示す。これらの介入を補完するのは、自然免疫細胞、特にナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞、マクロファージおよび樹状細胞を標的とする療法である。
【発明の概要】
【0004】
標的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分および標的細胞表面編集酵素を含む複合
体が提供される。また、複合体を含む組成物およびキット、ならびに複合体を使用する方
法も提供される。複合体を作製する方法もまた提供される。
体が提供される。また、複合体を含む組成物およびキット、ならびに複合体を使用する方
法も提供される。複合体を作製する方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】免疫回避戦略、および本開示の一実施形態によるそのような免疫回避を低減する方法を概略的に示す。
【図2】抗体－シアリダーゼ複合体の調製およびそれらの電気泳動およびＥＳＩ－ＭＳ分析を示す。
【図3】シアリダーゼの電気泳動分析、加水分解活性、およびフローサイトメトリー、ならびにそれら活性の画像解析を示す。
【図4】異なる乳癌細胞株におけるシアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、細胞表面シアリル化レベルおよび種々の受容体のリガンドレベルを示す。
【図5】シアリダーゼの非存在下または存在下における単離した末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図6】野生型および熱不活性化Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの特徴付けに用いられる様々なアッセイを示す。
【図7】Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧおよびその複合体のＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示す。
【図8】Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの加水分解活性を示す。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｔＳｉａの加水分解活性もまた示される。
【図9】トラスツズマブ－シアリダーゼ複合体処理した場合、またはしない場合の、種々の細胞株における細胞表面シアル酸のレベルを示す画像を示す。種々の細胞株における２つのトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体による細胞表面シアル酸の除去を比較するフローサイトメトリーデータも示されている。
【図10】抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下における種々の細胞株上のＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａリガンドを示す画像を示す。
【図11】抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの存在下での単離した末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図12】ＨＥＲ－２発現癌細胞に対するトラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体の活性を示す。
【図13】ＨＥＲ２＋発現癌細胞に対するシアリダーゼ、トラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体の存在下での単離された単球集団および分化されたマクロファージのシグレック発現レベルおよび細胞傷害性を示す。
【図14】ＨＥＲ２＋発現癌細胞に対するシアリダーゼ、トラスツズマブまたはトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体の存在下での単離されたγδＴ細胞の細胞傷害性を示す。
【図15】抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧおよびシアリダーゼの混合物による末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を、指定した遮断抗体の非存在下または存在下で示す。
【図16】白血球上のＣＤ５６およびＣＤ３マーカーを分析するフローサイトメトリーデータを示す。
【図17】シアリダーゼ処理がリツキシマブ誘導補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強することを示すデータを示す。
【図18】Ｒａｍｏｓ細胞がＤａｕｄｉ細胞よりも高レベルのシグレック－９リガンドを有することを示すデータを示す。
【図19】シアリダーゼがリツキシマブを補体依存的に増強することを実証するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0006】
標的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分および標的細胞表面編集酵素を含む複合
体（コンジュゲート）が提供される。また、複合体を含む組成物およびキット、ならびに
複合体を使用する方法も提供される。複合体を作製する方法もまた提供される。
体（コンジュゲート）が提供される。また、複合体を含む組成物およびキット、ならびに
複合体を使用する方法も提供される。複合体を作製する方法もまた提供される。
【0007】
本開示の複合体、組成物、および方法をより詳細に記載する前に、複合体、組成物、お
よび方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得るこ
とが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するた
めのものであるにすぎず、複合体、組成物、および方法の範囲は添付の特許請求の範囲の
みによって限定されるため、用語は限定的であることは意図されないこともまた理解され
たい。
よび方法は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得るこ
とが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するた
めのものであるにすぎず、複合体、組成物、および方法の範囲は添付の特許請求の範囲の
みによって限定されるため、用語は限定的であることは意図されないこともまた理解され
たい。
【0008】
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り下限の単位の１０分の
１まで、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値、およびその記載された範囲内
のあらゆる他の記載されたまたは介在する値は、複合体、組成物、および方法内に包含さ
れることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小
さい範囲内に含まれてもよく、また、記載される範囲内の任意の特定の除外される限界を
条件として、やはり複合体、組成物、および方法内に包含される。記載される範囲に限度
の１つまたは両方が含まれている場合、その含まれる限度のいずれかまたは両方を除く範
囲も、複合体、組成物、および方法に含まれる。
１まで、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値、およびその記載された範囲内
のあらゆる他の記載されたまたは介在する値は、複合体、組成物、および方法内に包含さ
れることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小
さい範囲内に含まれてもよく、また、記載される範囲内の任意の特定の除外される限界を
条件として、やはり複合体、組成物、および方法内に包含される。記載される範囲に限度
の１つまたは両方が含まれている場合、その含まれる限度のいずれかまたは両方を除く範
囲も、複合体、組成物、および方法に含まれる。
【0009】
特定の範囲は、数値の前に「約」という用語が付されて本明細書で提示される。本明細
書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行
する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の
記載された数に近いか近似であるかを決定するにあたり、記載されていない近似または近
い数は、それが提示されている文脈において具体的に記載された数と実質的に等価な数で
あり得る。
書に使用される「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行
する数に近いかまたはほぼ等しい数のための文言的サポートを提供する。ある数が特定の
記載された数に近いか近似であるかを決定するにあたり、記載されていない近似または近
い数は、それが提示されている文脈において具体的に記載された数と実質的に等価な数で
あり得る。
【0010】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、複
合体、組成物、および方法が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味
を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の複合体、組成物およ
び方法もまた、複合体、組成物および方法の実施または試験において使用することができ
るが、代表的な例示的複合体、組成物および方法をここに記載する。
合体、組成物、および方法が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味
を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の複合体、組成物およ
び方法もまた、複合体、組成物および方法の実施または試験において使用することができ
るが、代表的な例示的複合体、組成物および方法をここに記載する。
【0011】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許
が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本
明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記
載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前の
その開示のためのものであり、提供される刊行年は、個別に確認を必要とし得る実際の刊
行年とは異なる場合があるので、本複合体、組成物および方法が、その刊行物よりも先行
する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本
明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記
載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前の
その開示のためのものであり、提供される刊行年は、個別に確認を必要とし得る実際の刊
行年とは異なる場合があるので、本複合体、組成物および方法が、その刊行物よりも先行
する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0012】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」およ
び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意
されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意され
たい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」
などのような排他的な用語の使用または「否定的」限定の使用のための先行基礎としての
役割を果たすことを意図している。
び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意
されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意され
たい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」
などのような排他的な用語の使用または「否定的」限定の使用のための先行基礎としての
役割を果たすことを意図している。
【0013】
明瞭さのために別々の実施形態の文脈中で記載された、複合体、組成物、および方法の
特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが認識される。
逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される、複合体、組成物、および
方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよ
い。実施形態のすべての組み合わせは、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよ
び／または組成物を包含する程度にまで、本開示によって具体的に包含され、まさに各お
よびすべての組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示
される。さらに、そのような変数を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブ
コンビネーションも、本発明の複合体、組成物および方法によって具体的に包含され、そ
のような各サブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本
明細書に開示される。
特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが認識される。
逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される、複合体、組成物、および
方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよ
い。実施形態のすべての組み合わせは、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよ
び／または組成物を包含する程度にまで、本開示によって具体的に包含され、まさに各お
よびすべての組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示
される。さらに、そのような変数を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブ
コンビネーションも、本発明の複合体、組成物および方法によって具体的に包含され、そ
のような各サブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本
明細書に開示される。
【0014】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の
実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの
実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要
素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理
的に可能な他の順序で実施することができる。
実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの
実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要
素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理
的に可能な他の順序で実施することができる。
【0015】
複合体
上記に要約したように、本開示の態様は複合体を含む。特定の態様では、複合体は、標
的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分、および標的細胞表面編集酵素を含む。
上記に要約したように、本開示の態様は複合体を含む。特定の態様では、複合体は、標
的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分、および標的細胞表面編集酵素を含む。
【0016】
標的化部分
特定の実施形態によれば、本開示の複合体は、標的化部分を含む。標的化部分は変化し
てもよく、例えば標的細胞上の細胞表面分子の性質に基づいて選択してもよい。使用され
得る標的化部分の非限定的な例には、抗体、リガンド、アプタマー、ナノ粒子、および小
分子が含まれる。
特定の実施形態によれば、本開示の複合体は、標的化部分を含む。標的化部分は変化し
てもよく、例えば標的細胞上の細胞表面分子の性質に基づいて選択してもよい。使用され
得る標的化部分の非限定的な例には、抗体、リガンド、アプタマー、ナノ粒子、および小
分子が含まれる。
【0017】
特定の態様では、標的化部分は、細胞表面分子に特異的に結合する。本明細書中で使用
される場合、「細胞表面分子に特異的に結合する」または「細胞表面分子に特異的」であ
る標的化部分は、他の細胞表面分子よりも高い親和性でその細胞表面分子に結合する標的
化部分を指す。特定の実施形態によれば、標的化部分は、約１０－５Ｍ以下、約１０－６
Ｍ以下、または約１０－７Ｍ以下、または約１０－８Ｍ以下、または約１０－９Ｍ、１０
－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ以下のＫｄの、細胞表面分子に対する結合
親和性を示す。そのような親和性は、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例
えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器、製造業者によって概説された一般的な手順を用い
る）、ラジオイムノアッセイ、または別の方法などの従来技術を用いて容易に測定され得
る。
される場合、「細胞表面分子に特異的に結合する」または「細胞表面分子に特異的」であ
る標的化部分は、他の細胞表面分子よりも高い親和性でその細胞表面分子に結合する標的
化部分を指す。特定の実施形態によれば、標的化部分は、約１０－５Ｍ以下、約１０－６
Ｍ以下、または約１０－７Ｍ以下、または約１０－８Ｍ以下、または約１０－９Ｍ、１０
－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ以下のＫｄの、細胞表面分子に対する結合
親和性を示す。そのような親和性は、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例
えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器、製造業者によって概説された一般的な手順を用い
る）、ラジオイムノアッセイ、または別の方法などの従来技術を用いて容易に測定され得
る。
【0018】
特定の実施形態によれば、標的化部分は抗体である。用語「抗体」および「免疫グロブ
リン」は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）の抗体または免疫グロブリ
ン、完全長抗体（例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドの２二量体からなる四量体からな
る抗体）；一本鎖抗体；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ
’）２および二重特異性抗体を含むがこれらに限定されない、標的細胞の細胞表面分子に
特異的結合を保持する、抗体の断片（例えば、完全長抗体または一本鎖抗体の断片）；キ
メラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト化完全長抗体、ヒ
ト化半抗体またはヒト化抗体フラグメント）；および、抗体の抗原結合部分および非抗体
タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えばインビボ造影剤、放射性同位体
、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識されてもよい
。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対
のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。
リン」は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ
３またはＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）の抗体または免疫グロブリ
ン、完全長抗体（例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドの２二量体からなる四量体からな
る抗体）；一本鎖抗体；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ
’）２および二重特異性抗体を含むがこれらに限定されない、標的細胞の細胞表面分子に
特異的結合を保持する、抗体の断片（例えば、完全長抗体または一本鎖抗体の断片）；キ
メラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト化完全長抗体、ヒ
ト化半抗体またはヒト化抗体フラグメント）；および、抗体の抗原結合部分および非抗体
タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えばインビボ造影剤、放射性同位体
、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識されてもよい
。抗体は、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対
のメンバー）などの他の部分とさらに複合体化することができる。
【0019】
特定の態様では、標的化部分が抗体である場合、抗体は、標的細胞表面編集酵素の非存
在下でも治療抗体であってもよく、例えば、（例えば、抗体依存性細胞傷害性および／ま
たは別の機構を介して）癌、免疫関連障害、内皮細胞関連障害などの治療においてそれ自
身で有効性を有する抗体であってよい。例えば、抗体は、腫瘍関連細胞表面分子または腫
瘍特異的細胞表面分子に特異的に結合する治療用抗体であってもよい。
在下でも治療抗体であってもよく、例えば、（例えば、抗体依存性細胞傷害性および／ま
たは別の機構を介して）癌、免疫関連障害、内皮細胞関連障害などの治療においてそれ自
身で有効性を有する抗体であってよい。例えば、抗体は、腫瘍関連細胞表面分子または腫
瘍特異的細胞表面分子に特異的に結合する治療用抗体であってもよい。
【0020】
本開示の複合体において使用され得る腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面
分子に特異的に結合する抗体の非限定的な例としては、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕ
ｍｕｍａｂ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、シクツムマブ（Ｃ
ｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄ
ａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄ
ｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシジツマブ（
Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エンフォルツマブ（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、エノチクマブ
（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、ガニツマブ（
Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、インテツム
マブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマ
ブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、レキサツムマブ（
Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ（
Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎ
ｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏ
ｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎ
ｉｔｕｍｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔ
ｕｍｕｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉ
ｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕ
ｍｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、タレクスツマブ（Ｔａｒ
ｅｘｔｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、トベツマブ（Ｔｏｖ
ｅｔｕｍａｂ）、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅ
ｎｃｕｍａｂ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕ
ｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍ
ａｂ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍ
ａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏ
ｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａ
ｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ
）、モキセツモマブ（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ
）、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ
）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）
、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タプリツモ
マブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、トシツ
モマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ア
バゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、オレゴボマブ
（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒ
ｅｃｏｌｏｍａｂ）、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕ
ｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅ
ｎｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デルロツキシマブ（Ｄｅｒ
ｌｏｔｕｘｉｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、エンシツキシマブ
（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ギレンツキシマブ
（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、インダツキシマブ（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イサツ
キシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、マージツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、
リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ウブ
リツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ
）、アビツズマブ（Ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ
）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ
）、ブロンチクツズマブ（Ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕ
ｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブ（Ｃｉｔａｔｕｚ
ｕｍａｂ）、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔ
ｕｚｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕ
ｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔ
ｕｚｕｍａｂ）、エマンクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（Ｅｍ
ｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エタラシ
ズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）
、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａ
ｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａ
ｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、リファツズマブ（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕ
ｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚ
ｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕ
ｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕ
ｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａ
ｔｕｚｕｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（
Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、パルサツズマ
ブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ピナツズマ
ブ（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズ
マブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズ
マブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツ
ズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、バンド
ルツズマブ（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、バヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）
、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ
）、ソフィツズマブ（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍ
ａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔ
ｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ブロンツベトマブ
（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、またはそ
の抗原結合性バリアントが挙げられる。本明細書で使用される場合、「バリアント」は、
抗体が特定の抗原（例えば、トラスツズマブの場合のＨＥＲ２）に結合するが、親抗体よ
りも少ないまたは多いアミノ酸を有するか、親抗体に対して１つ以上のアミノ酸置換を有
するか、またはそれらの組み合わせを有する。
分子に特異的に結合する抗体の非限定的な例としては、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕ
ｍｕｍａｂ）、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、シクツムマブ（Ｃ
ｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄ
ａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄ
ｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、デュシジツマブ（
Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エンフォルツマブ（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、エノチクマブ
（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、ガニツマブ（
Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、インテツム
マブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマ
ブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、レキサツムマブ（
Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、マパツムマブ（
Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎ
ｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏ
ｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎ
ｉｔｕｍｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔ
ｕｍｕｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉ
ｒｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕ
ｍｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、タレクスツマブ（Ｔａｒ
ｅｘｔｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、トベツマブ（Ｔｏｖ
ｅｔｕｍａｂ）、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅ
ｎｃｕｍａｂ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕ
ｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍ
ａｂ）、アナツモマブ（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍ
ａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏ
ｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａ
ｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ
）、モキセツモマブ（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナプツモマブ（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ
）、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ
）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）
、サツモマブ（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、タプリツモ
マブ（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、トシツ
モマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ア
バゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、オレゴボマブ
（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、カプロマブ（Ｃａｐｒｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒ
ｅｃｏｌｏｍａｂ）、ナコロマブ（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕ
ｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅ
ｎｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デルロツキシマブ（Ｄｅｒ
ｌｏｔｕｘｉｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、エンシツキシマブ
（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ギレンツキシマブ
（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、インダツキシマブ（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イサツ
キシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）、マージツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、
リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ウブ
リツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ
）、アビツズマブ（Ａｂｉｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ
）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ
）、ブロンチクツズマブ（Ｂｒｏｎｔｉｃｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕ
ｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブ（Ｃｉｔａｔｕｚ
ｕｍａｂ）、クリバツズマブ（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔ
ｕｚｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕ
ｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔ
ｕｚｕｍａｂ）、エマンクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エミベツズマブ（Ｅｍ
ｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エタラシ
ズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）
、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａ
ｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａ
ｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、リファツズマブ（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕ
ｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚ
ｕｍａｂ）、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕ
ｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕ
ｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａ
ｔｕｚｕｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（
Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブ（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、パルサツズマ
ブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ピナツズマ
ブ（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、シブロツズ
マブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズ
マブ（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツ
ズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ツコツズマブ（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、バンド
ルツズマブ（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、バヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）
、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ
）、ソフィツズマブ（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍ
ａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔ
ｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ブロンツベトマブ
（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、またはそ
の抗原結合性バリアントが挙げられる。本明細書で使用される場合、「バリアント」は、
抗体が特定の抗原（例えば、トラスツズマブの場合のＨＥＲ２）に結合するが、親抗体よ
りも少ないまたは多いアミノ酸を有するか、親抗体に対して１つ以上のアミノ酸置換を有
するか、またはそれらの組み合わせを有する。
【0021】
特定の態様では、標的化部分は、癌を治療するために承認された以下の表１に示す治療
用抗体またはその抗原結合性バリアントである。また、表１には、治療用抗体が特異的に
結合する、対応する腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子、ならびに抗体
が治療用に承認された癌のタイプが示されている。
用抗体またはその抗原結合性バリアントである。また、表１には、治療用抗体が特異的に
結合する、対応する腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子、ならびに抗体
が治療用に承認された癌のタイプが示されている。
【表1】
【0022】
表１の略語は、以下の通りである：ＡＬＬ、急性リンパ球性白血病；ＡＭＬ、急性骨髄
性白血病；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ－Ａ
ｂｅｌｓｏｎチロシンキナーゼ；ＣＬＬ、慢性リンパ球性白血病；ＣＴＬＡ－４、細胞傷
害性Ｔリンパ球関連抗原４；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＥＧＦＲ、上皮細胞増殖因子受容体；
ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着因子；ＨＥＲ２、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２；ＮＨＬ、非
ホジキンリンパ腫；ＮＳＣＬＣ、非小細胞性肺癌；ＰＡＰ、前立腺酸性ホスファターゼ；
ＰＤ－１、プログラム化細胞死受容体１；ＲＣＣ、腎細胞癌；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因
子；ＶＥＧＦ－Ｒ２、血管内皮増殖因子受容体２。
性白血病；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ－Ａ
ｂｅｌｓｏｎチロシンキナーゼ；ＣＬＬ、慢性リンパ球性白血病；ＣＴＬＡ－４、細胞傷
害性Ｔリンパ球関連抗原４；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＥＧＦＲ、上皮細胞増殖因子受容体；
ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着因子；ＨＥＲ２、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２；ＮＨＬ、非
ホジキンリンパ腫；ＮＳＣＬＣ、非小細胞性肺癌；ＰＡＰ、前立腺酸性ホスファターゼ；
ＰＤ－１、プログラム化細胞死受容体１；ＲＣＣ、腎細胞癌；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因
子；ＶＥＧＦ－Ｒ２、血管内皮増殖因子受容体２。
【0023】
いくつかの実施形態では、標的化部分は、以下の表２に示す治療用抗体またはその抗原
結合性バリアントである。また、表２には、治療用抗体が特異的に結合する対応する腫瘍
関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子、ならびに抗体を含む複合体を用いて治
療することができる癌タイプの例も示されている。
結合性バリアントである。また、表２には、治療用抗体が特異的に結合する対応する腫瘍
関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子、ならびに抗体を含む複合体を用いて治
療することができる癌タイプの例も示されている。
【表2】
【0024】
表２の略語は、以下の通りである：Ａ２ａＲ、アデノシンＡ２ａ受容体；ＡＫＡＰ４、
Ａキナーゼアンカータンパク質４；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＡＬＬ、急性リンパ球性
白血病；ＢＡＧＥ、Ｂ黒色腫抗原；ＢＯＲＩＳ、ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇ
ｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｉｔｅｓ；ＣＥＡ、癌胎児性抗原；ＣＬＬ
、慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＣＳ１、ＣＤ２サブセット１；ＣＴＬＡ
－４、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４；ＥＢＡＧ９、エストロゲン受容体結合部位関連
抗原９；ＥＧＦ、上皮細胞増殖因子；ＥＧＦＲ、上皮細胞増殖因子受容体；ＮＳＣＬＣ、
非小細胞性肺癌；ＧＡＧＥ、Ｇ抗原；ＧＤ２、ジシアロガングリオシドＧＤ２；ｇｐ１０
０、糖タンパク質１００；ＨＰＶ－１６、ヒトパピローマウイルス１６；ＨＳＰ１０５、
ヒートショックタンパク質１０５；ＩＤＨ１、イソクエン酸脱水素酵素１型；ＩＤＯ１、
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ１；ＫＩＲ、キラー細胞免疫グロブリン様
の受容体；ＬＡＧ－３、リンパ球活性化遺伝子３；ＬＹ６Ｋ、リンパ球抗原６複合体Ｋ；
ＭＡＧＥ－Ａ３、黒色腫抗原３；ＭＡＧＥ－Ｃ２、黒色腫抗原Ｃ２；ＭＡＧＥ－Ｄ４、黒
色腫抗原Ｄ４；Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１
；ＭＥＴ、Ｎメチル－Ｎ’－ニトロソグアニジンヒト骨肉腫形質転換遺伝子；ＭＵＣ１、
ムチン１；ＭＵＣ４、ムチン４；ＭＵＣ１６、ムチン１６；ＮＨＬ、非ホジキンリンパ腫
；ＮＹ－ＥＳＯ－１、ニューヨーク食道扁平上皮癌１；ＰＤ－１、プログラム化細胞死受
容体１；ＰＤ－Ｌ１、プログラム化細胞死受容体リガンド１；ＰＲＡＭＥ、黒色腫の優先
発現抗原；ＰＳＡ、前立腺特異的抗原；ＲＣＣ、腎細胞癌；ＲＯＲ１、受容体チロシンキ
ナーゼオーファン受容体１；ＳＣＣＨＮ、頭頸部の扁平上皮癌；ＳＰＡＧ－９、精子関連
抗原９；ＳＳＸ１、滑膜肉腫Ｘ染色体破断点１；ＴＩＭ－３、Ｔ細胞免疫グロブリンドメ
インおよびムチンドメイン－３；ＶＩＳＴＡ、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメイン免疫グロブリ
ン含有サプレッサー；ＷＴ１、ウィルムス腫瘍１；ＸＡＧＥ－１ｂ、Ｘ染色体抗原１ｂ。
Ａキナーゼアンカータンパク質４；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ＡＬＬ、急性リンパ球性
白血病；ＢＡＧＥ、Ｂ黒色腫抗原；ＢＯＲＩＳ、ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇ
ｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｉｔｅｓ；ＣＥＡ、癌胎児性抗原；ＣＬＬ
、慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＣＳ１、ＣＤ２サブセット１；ＣＴＬＡ
－４、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４；ＥＢＡＧ９、エストロゲン受容体結合部位関連
抗原９；ＥＧＦ、上皮細胞増殖因子；ＥＧＦＲ、上皮細胞増殖因子受容体；ＮＳＣＬＣ、
非小細胞性肺癌；ＧＡＧＥ、Ｇ抗原；ＧＤ２、ジシアロガングリオシドＧＤ２；ｇｐ１０
０、糖タンパク質１００；ＨＰＶ－１６、ヒトパピローマウイルス１６；ＨＳＰ１０５、
ヒートショックタンパク質１０５；ＩＤＨ１、イソクエン酸脱水素酵素１型；ＩＤＯ１、
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ１；ＫＩＲ、キラー細胞免疫グロブリン様
の受容体；ＬＡＧ－３、リンパ球活性化遺伝子３；ＬＹ６Ｋ、リンパ球抗原６複合体Ｋ；
ＭＡＧＥ－Ａ３、黒色腫抗原３；ＭＡＧＥ－Ｃ２、黒色腫抗原Ｃ２；ＭＡＧＥ－Ｄ４、黒
色腫抗原Ｄ４；Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原１
；ＭＥＴ、Ｎメチル－Ｎ’－ニトロソグアニジンヒト骨肉腫形質転換遺伝子；ＭＵＣ１、
ムチン１；ＭＵＣ４、ムチン４；ＭＵＣ１６、ムチン１６；ＮＨＬ、非ホジキンリンパ腫
；ＮＹ－ＥＳＯ－１、ニューヨーク食道扁平上皮癌１；ＰＤ－１、プログラム化細胞死受
容体１；ＰＤ－Ｌ１、プログラム化細胞死受容体リガンド１；ＰＲＡＭＥ、黒色腫の優先
発現抗原；ＰＳＡ、前立腺特異的抗原；ＲＣＣ、腎細胞癌；ＲＯＲ１、受容体チロシンキ
ナーゼオーファン受容体１；ＳＣＣＨＮ、頭頸部の扁平上皮癌；ＳＰＡＧ－９、精子関連
抗原９；ＳＳＸ１、滑膜肉腫Ｘ染色体破断点１；ＴＩＭ－３、Ｔ細胞免疫グロブリンドメ
インおよびムチンドメイン－３；ＶＩＳＴＡ、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメイン免疫グロブリ
ン含有サプレッサー；ＷＴ１、ウィルムス腫瘍１；ＸＡＧＥ－１ｂ、Ｘ染色体抗原１ｂ。
【0025】
いくつかの実施形態では、標的化部分は、以下の表３に示す治療用抗体またはその抗原
結合性バリアントである。また、治療用抗体が特異的に結合する、対応する腫瘍関連細胞
表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子も表３に提供される。
結合性バリアントである。また、治療用抗体が特異的に結合する、対応する腫瘍関連細胞
表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子も表３に提供される。
【表3】
【0026】
いくつかの実施形態では、本開示の複合体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツ
ムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、およびその
抗原結合性バリアントから選択される、標的化部分としての治療用抗体を含む。
ムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、およびその
抗原結合性バリアントから選択される、標的化部分としての治療用抗体を含む。
【0027】
特定の態様では、本開示の複合体は、標的化部分として治療用抗体を含み、治療用抗体
は、トラスツズマブまたはそのＨＥＲ２結合性バリアントである。トラスツズマブの重鎖
および軽鎖アミノ酸配列は公知であり、以下の表４に提供される。
は、トラスツズマブまたはそのＨＥＲ２結合性バリアントである。トラスツズマブの重鎖
および軽鎖アミノ酸配列は公知であり、以下の表４に提供される。
【表4】
【0028】
標的化部分が抗体である場合、標的細胞表面編集酵素は、抗体の任意の適切な領域と複
合体化され得る。特定の態様では、標的化部分は軽鎖ポリペプチドを有する抗体であり、
標的細胞表面編集酵素は軽鎖、例えば軽鎖のＣ末端または内部領域と複合体化される。特
定の実施形態によれば、標的化部分は、重鎖ポリペプチドを有する抗体であり、標的細胞
表面編集酵素は、重鎖、例えば、重鎖のＣ末端または内部領域で複合体化される。重鎖を
有する抗体が結晶化可能な断片（Ｆｃ）領域を含む場合、標的細胞表面編集酵素はＦｃ領
域、例えばＦｃ領域のＣ末端または内部領域と複合体化されることができる。
合体化され得る。特定の態様では、標的化部分は軽鎖ポリペプチドを有する抗体であり、
標的細胞表面編集酵素は軽鎖、例えば軽鎖のＣ末端または内部領域と複合体化される。特
定の実施形態によれば、標的化部分は、重鎖ポリペプチドを有する抗体であり、標的細胞
表面編集酵素は、重鎖、例えば、重鎖のＣ末端または内部領域で複合体化される。重鎖を
有する抗体が結晶化可能な断片（Ｆｃ）領域を含む場合、標的細胞表面編集酵素はＦｃ領
域、例えばＦｃ領域のＣ末端または内部領域と複合体化されることができる。
【0029】
特定の実施形態によれば、標的化部分はリガンドである。本明細書中で使用される場合
、「リガンド」は、生物学的目的を果たすために生体分子と複合物（コンプレックス）を
形成する物質である。リガンドは、標的細胞の表面上の細胞表面分子と複合物を形成する
循環因子、分泌因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、小
分子および核酸から選択される物質であってもよい。特定の態様では、標的化部分がリガ
ンドである場合、リガンドは、細胞表面分子との複合物形成が起こるがそのような複合物
形成の正常な生物学的結果は生じないように改変される。特定の態様では、リガンドは、
標的細胞上に存在する細胞表面受容体のリガンドである。目的の細胞表面受容体には、受
容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非受容体チロシンキナーゼ（非ＲＴＫ）、増殖因子受
容体などが含まれるが、これらに限定されない。本開示の複合体が標的化部分としてリガ
ンドを含む場合、標的細胞表面編集酵素は、リガンドの任意の適切な領域、例えば、標的
細胞表面分子と結合する（例えば、特異的に結合する）リガンドの能力に干渉しないまた
は実質的に干渉しない、結合領域と複合体化され得る。
、「リガンド」は、生物学的目的を果たすために生体分子と複合物（コンプレックス）を
形成する物質である。リガンドは、標的細胞の表面上の細胞表面分子と複合物を形成する
循環因子、分泌因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、小
分子および核酸から選択される物質であってもよい。特定の態様では、標的化部分がリガ
ンドである場合、リガンドは、細胞表面分子との複合物形成が起こるがそのような複合物
形成の正常な生物学的結果は生じないように改変される。特定の態様では、リガンドは、
標的細胞上に存在する細胞表面受容体のリガンドである。目的の細胞表面受容体には、受
容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非受容体チロシンキナーゼ（非ＲＴＫ）、増殖因子受
容体などが含まれるが、これらに限定されない。本開示の複合体が標的化部分としてリガ
ンドを含む場合、標的細胞表面編集酵素は、リガンドの任意の適切な領域、例えば、標的
細胞表面分子と結合する（例えば、特異的に結合する）リガンドの能力に干渉しないまた
は実質的に干渉しない、結合領域と複合体化され得る。
【0030】
特定の態様では、標的化部分はアプタマーである。「アプタマー」とは、標的細胞表面
分子に対する特異的結合親和性を有する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を意味する
。アプタマーは、選択および合成の容易性、高い結合親和性および特異性、低い免疫原性
、および汎用性のある合成アクセス可能性のような、標的細胞表面編集酵素の標的送達の
ためのある望ましい特性を示す。細胞表面分子に結合するアプタマーは既知であり、例え
ば、ＴＴＡ１（細胞外マトリックスタンパク質テネイシン－Ｃに対する腫瘍標的化アプタ
マー）を含む。本開示の複合体において使用されるアプタマーとしては、Ｚｈｕ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ １０（１）：３９－４５、Ｓｕｎ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１８２、お
よびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８（２７）
：４１８５－４１９４に記載されるものが挙げられる。
分子に対する特異的結合親和性を有する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を意味する
。アプタマーは、選択および合成の容易性、高い結合親和性および特異性、低い免疫原性
、および汎用性のある合成アクセス可能性のような、標的細胞表面編集酵素の標的送達の
ためのある望ましい特性を示す。細胞表面分子に結合するアプタマーは既知であり、例え
ば、ＴＴＡ１（細胞外マトリックスタンパク質テネイシン－Ｃに対する腫瘍標的化アプタ
マー）を含む。本開示の複合体において使用されるアプタマーとしては、Ｚｈｕ ｅｔ
ａｌ．（２０１５）ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ １０（１）：３９－４５、Ｓｕｎ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１８２、お
よびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８（２７）
：４１８５－４１９４に記載されるものが挙げられる。
【0031】
特定の実施形態によれば、標的化部分はナノ粒子である。本明細書で使用する「ナノ粒
子」は、１ｎｍ～１０００ｎｍ、２０ｎｍ～７５０ｎｍ、５０ｎｍ～５００ｎｍ、１００
ｎｍ～３００ｎｍ、例えば１２０～２００ｎｍの範囲で、少なくとも１つの寸法を有する
粒子である。ナノ粒子は、球状、回転楕円体状、棒状、円盤状、角錐状、立方体状、円筒
状、ナノヘリ型、ナノスプリング状、ナノ形状、矢印涙形、テトラポッド形、プリズム形
、または任意の他の適切な幾何学的または非幾何学的形状を含むことができる。特定の態
様では、ナノ粒子は、その表面に、例えば、抗体、リガンド、アプタマー、小分子など、
本明細書に記載される１つ以上の他の標的化部分を含む。本開示の複合体に使用されるナ
ノ粒子としては、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．６
２（２）：９０－９９；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（６）
：５７２５－５７４０、およびＢｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０（１５）：１６１５－１６２６に記載されるものが挙げられ
る。
子」は、１ｎｍ～１０００ｎｍ、２０ｎｍ～７５０ｎｍ、５０ｎｍ～５００ｎｍ、１００
ｎｍ～３００ｎｍ、例えば１２０～２００ｎｍの範囲で、少なくとも１つの寸法を有する
粒子である。ナノ粒子は、球状、回転楕円体状、棒状、円盤状、角錐状、立方体状、円筒
状、ナノヘリ型、ナノスプリング状、ナノ形状、矢印涙形、テトラポッド形、プリズム形
、または任意の他の適切な幾何学的または非幾何学的形状を含むことができる。特定の態
様では、ナノ粒子は、その表面に、例えば、抗体、リガンド、アプタマー、小分子など、
本明細書に記載される１つ以上の他の標的化部分を含む。本開示の複合体に使用されるナ
ノ粒子としては、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．６
２（２）：９０－９９；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（６）
：５７２５－５７４０、およびＢｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０（１５）：１６１５－１６２６に記載されるものが挙げられ
る。
【0032】
特定の態様では、標的化部分は小分子である。「小分子」とは、１０００原子質量単位
（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態では、小分子は
７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、または２
００ａｍｕ以下である。特定の態様では、小分子はポリマー中に存在するような反復分子
単位から作られていない。特定の態様では、標的細胞表面分子は、リガンドが小分子であ
る受容体であり、複合体の小分子は、受容体の小分子リガンド（またはその誘導体）であ
る。目的の標的細胞に複合体を標的化する際に使用される低分子が知られている。ほんの
一例として、葉酸（ＦＡ）誘導体は、例えば多くの上皮腫瘍において過剰発現される葉酸
受容体に結合することによってある種の癌細胞を効果的に標的とすることが示されている
。例えば、Ｖｅｒｇｏｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎ
ｃｏｌ．７（４）：２０６－２１８を参照されたい。別の例では、小分子シグマ－２は、
癌細胞の標的化において有効であることが証明されている。例えば、Ｈａｓｈｉｍ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８（５）：９５６－９６
７を参照されたい。シグマ－２は、膵臓癌細胞を含む多くの増殖腫瘍細胞において過剰発
現されるシグマ－２受容体の小分子リガンドである。特定の態様では、本開示の複合体は
、小分子薬物複合体（ＳＭＤＣ）の文脈において標的細胞上の細胞表面分子と結合するこ
とによって目的の標的細胞に複合体を標的化するのに有効であることが実証された小分子
を、標的化部分として含む。
（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態では、小分子は
７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、または２
００ａｍｕ以下である。特定の態様では、小分子はポリマー中に存在するような反復分子
単位から作られていない。特定の態様では、標的細胞表面分子は、リガンドが小分子であ
る受容体であり、複合体の小分子は、受容体の小分子リガンド（またはその誘導体）であ
る。目的の標的細胞に複合体を標的化する際に使用される低分子が知られている。ほんの
一例として、葉酸（ＦＡ）誘導体は、例えば多くの上皮腫瘍において過剰発現される葉酸
受容体に結合することによってある種の癌細胞を効果的に標的とすることが示されている
。例えば、Ｖｅｒｇｏｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎ
ｃｏｌ．７（４）：２０６－２１８を参照されたい。別の例では、小分子シグマ－２は、
癌細胞の標的化において有効であることが証明されている。例えば、Ｈａｓｈｉｍ ｅｔ
ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８（５）：９５６－９６
７を参照されたい。シグマ－２は、膵臓癌細胞を含む多くの増殖腫瘍細胞において過剰発
現されるシグマ－２受容体の小分子リガンドである。特定の態様では、本開示の複合体は
、小分子薬物複合体（ＳＭＤＣ）の文脈において標的細胞上の細胞表面分子と結合するこ
とによって目的の標的細胞に複合体を標的化するのに有効であることが実証された小分子
を、標的化部分として含む。
【0033】
標的細胞表面編集酵素
上記に要約したように、本開示の複合体には、標的細胞表面編集酵素が含まれる。本明
細書中で使用される場合、「標的細胞表面編集酵素」は、標的細胞の対応する細胞表面分
子に標的化部分が結合する際に、標的細胞の表面上の１つ以上の分子の構造変化をもたら
す酵素である。特定の態様では、構造変化は、標的化部分が結合する細胞表面分子に対す
るものである。他の態様では、構造変化は、標的化部分が結合する細胞表面分子以外の標
的細胞の表面上の分子に対するものである。
上記に要約したように、本開示の複合体には、標的細胞表面編集酵素が含まれる。本明
細書中で使用される場合、「標的細胞表面編集酵素」は、標的細胞の対応する細胞表面分
子に標的化部分が結合する際に、標的細胞の表面上の１つ以上の分子の構造変化をもたら
す酵素である。特定の態様では、構造変化は、標的化部分が結合する細胞表面分子に対す
るものである。他の態様では、構造変化は、標的化部分が結合する細胞表面分子以外の標
的細胞の表面上の分子に対するものである。
【0034】
特定の態様では、標的細胞表面編集酵素は、野生型酵素（すなわち、天然に見出される
酵素）である。他の態様では、酵素は野生型酵素ではない。例えば、標的細胞表面編集酵
素は、野生型酵素の非天然誘導体であってもよい。このような誘導体は、対応する野生型
酵素の酵素活性を少なくとも部分的に保持する。利用され得る酵素誘導体には、対応する
野生型酵素より少ないアミノ酸またはより多くのアミノ酸を有するものが含まれる。ある
いは、またはさらに、酵素誘導体は、対応する野生型酵素と比較して、１つ以上のアミノ
酸置換またはアミノ酸修飾を含むことができる。
酵素）である。他の態様では、酵素は野生型酵素ではない。例えば、標的細胞表面編集酵
素は、野生型酵素の非天然誘導体であってもよい。このような誘導体は、対応する野生型
酵素の酵素活性を少なくとも部分的に保持する。利用され得る酵素誘導体には、対応する
野生型酵素より少ないアミノ酸またはより多くのアミノ酸を有するものが含まれる。ある
いは、またはさらに、酵素誘導体は、対応する野生型酵素と比較して、１つ以上のアミノ
酸置換またはアミノ酸修飾を含むことができる。
【0035】
分子内の標的細胞表面編集酵素によって標的細胞の表面上で行われる構造変化の例は、
分子の切断である。特定の態様では、標的細胞表面編集酵素によって切断される分子はポ
リマーである。標的細胞表面編集酵素によって切断され得る（例えば、分解され得る）細
胞表面ポリマーとしては、ポリペプチド、多糖類、糖タンパク質などが挙げられるが、こ
れらに限定されない。例えば、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上のポリペプチ
ド（または目的のそのサブグループ）を切断するプロテアーゼであってもよい。特定の態
様では、標的細胞表面編集酵素によって切断されるポリマーは、多糖類（または「グリカ
ン」）、すなわちグリコシド結合した単糖類を含む分子である。そのような実施形態では
、標的細胞表面編集酵素は、例えば、グリコシド加水分解酵素（例えば、シアリダーゼ）
であってもよい。
分子の切断である。特定の態様では、標的細胞表面編集酵素によって切断される分子はポ
リマーである。標的細胞表面編集酵素によって切断され得る（例えば、分解され得る）細
胞表面ポリマーとしては、ポリペプチド、多糖類、糖タンパク質などが挙げられるが、こ
れらに限定されない。例えば、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上のポリペプチ
ド（または目的のそのサブグループ）を切断するプロテアーゼであってもよい。特定の態
様では、標的細胞表面編集酵素によって切断されるポリマーは、多糖類（または「グリカ
ン」）、すなわちグリコシド結合した単糖類を含む分子である。そのような実施形態では
、標的細胞表面編集酵素は、例えば、グリコシド加水分解酵素（例えば、シアリダーゼ）
であってもよい。
【0036】
特定の実施形態によれば、細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上の分子（例えば、ポリマー）の末端残基を切断する（例えば、加水分解する）。特定の態様では、末端残基は、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質、およびガングリオシドから選択される分子中に存在する。いくつかの実施形態では、末端残基は末端シアル酸残基である。末端残基が末端シアル酸残基である場合、細胞表面編集酵素は、シアル酸（ノイラミン酸）のグリコシド結合を切断し、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、糖脂質、および他の基質から末端シアル酸残基を放出するシアリダーゼ（または上記の誘導体）が挙げられる。
【0037】
本開示の複合体において使用され得るシアリダーゼには、原核生物シアリダーゼおよび
真核生物シアリダーゼが含まれるが、これらに限定されない。使用され得る原核生物シア
リダーゼには、細菌シアリダーゼが含まれる。本開示の複合体に使用される細菌シアリダ
ーゼの一例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ（例えば、
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２９７６８）である。本開示の複合体に使用される細菌シアリダ
ーゼの別の例は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ
ＫＢ－Ｐ０Ｃ６Ｅ９）である。使用され得る真核生物シアリダーゼには、例えば、哺乳動
物シアリダーゼおよび非哺乳動物真核生物シアリダーゼが含まれる。目的の哺乳動物シア
リダーゼ（または哺乳動物ノイラミニダーゼ）には、霊長類、例えばヒトまたは非ヒトノ
イラミニダーゼ由来のものが含まれる。特定の態様では、シアリダーゼはヒトシアリダー
ゼである。特定の実施形態によれば、ヒトシアリダーゼは、ヒトノイラミニダーゼ１（例
えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９５１９）、ヒトノイラミニダーゼ２（例えば、Ｕｎｉ
ＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｙ３Ｒ４）、ヒトノイラミニダーゼ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｕ
Ｑ４９）およびヒトノイラミニダーゼ４（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ８ＷＷＲ８）
から選択される。シアリダーゼは、切断された誘導体、対応する野生型シアリダーゼより
も多くのアミノ酸を含む誘導体、１つ以上のアミノ酸置換を含む誘導体（例えば、１つ以
上の保存的置換、１つ以上の非保存的置換、非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換な
ど）のような、上記野生型シアリダーゼのいずれかの誘導体であり得ることが理解される
であろう。誘導体は、親野生型シアリダーゼのグリコシド加水分解酵素活性の少なくとも
一部を保持する。
真核生物シアリダーゼが含まれるが、これらに限定されない。使用され得る原核生物シア
リダーゼには、細菌シアリダーゼが含まれる。本開示の複合体に使用される細菌シアリダ
ーゼの一例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ（例えば、
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２９７６８）である。本開示の複合体に使用される細菌シアリダ
ーゼの別の例は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａシアリダーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ
ＫＢ－Ｐ０Ｃ６Ｅ９）である。使用され得る真核生物シアリダーゼには、例えば、哺乳動
物シアリダーゼおよび非哺乳動物真核生物シアリダーゼが含まれる。目的の哺乳動物シア
リダーゼ（または哺乳動物ノイラミニダーゼ）には、霊長類、例えばヒトまたは非ヒトノ
イラミニダーゼ由来のものが含まれる。特定の態様では、シアリダーゼはヒトシアリダー
ゼである。特定の実施形態によれば、ヒトシアリダーゼは、ヒトノイラミニダーゼ１（例
えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９５１９）、ヒトノイラミニダーゼ２（例えば、Ｕｎｉ
ＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｙ３Ｒ４）、ヒトノイラミニダーゼ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９Ｕ
Ｑ４９）およびヒトノイラミニダーゼ４（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ８ＷＷＲ８）
から選択される。シアリダーゼは、切断された誘導体、対応する野生型シアリダーゼより
も多くのアミノ酸を含む誘導体、１つ以上のアミノ酸置換を含む誘導体（例えば、１つ以
上の保存的置換、１つ以上の非保存的置換、非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換な
ど）のような、上記野生型シアリダーゼのいずれかの誘導体であり得ることが理解される
であろう。誘導体は、親野生型シアリダーゼのグリコシド加水分解酵素活性の少なくとも
一部を保持する。
【表5】
【0038】
特定の実施形態によれば、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上のリガンドを編
集する（例えば、すべてまたは一部を切断する）。いくつかの実施形態では、リガンドは
免疫受容体のリガンドである。目的の免疫受容体リガンドとしては、抑制性免疫受容体の
リガンドが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の態様では、標的細胞表
面編集酵素は抑制性免疫受容体のリガンドを切断し、抑制性免疫受容体はナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細
胞、好塩基球および好酸球から選択される細胞上に存在する。例として、標的細胞表面編
集酵素によって編集される標的細胞の表面上のリガンドは、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン
（シグレック）受容体、例えばシグレック７、シグレック９、および／または同様のもの
のリガンドを含む。特定の実施形態によれば、このようなリガンドはシアログリカンであ
る。
集する（例えば、すべてまたは一部を切断する）。いくつかの実施形態では、リガンドは
免疫受容体のリガンドである。目的の免疫受容体リガンドとしては、抑制性免疫受容体の
リガンドが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の態様では、標的細胞表
面編集酵素は抑制性免疫受容体のリガンドを切断し、抑制性免疫受容体はナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細
胞、好塩基球および好酸球から選択される細胞上に存在する。例として、標的細胞表面編
集酵素によって編集される標的細胞の表面上のリガンドは、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン
（シグレック）受容体、例えばシグレック７、シグレック９、および／または同様のもの
のリガンドを含む。特定の実施形態によれば、このようなリガンドはシアログリカンであ
る。
【0039】
特定の態様では、標的細胞表面編集酵素によって影響される標的細胞の表面上の分子の
構造変化は、分子の酸化である。
構造変化は、分子の酸化である。
【0040】
いくつかの実施形態では、標的細胞表面編集酵素によって影響される標的細胞の表面上
の分子の構造変化は、分子の還元である。
の分子の構造変化は、分子の還元である。
【0041】
特定の態様では、標的細胞表面編集酵素は、部分を分子に添加することによって、標的
細胞の表面上の分子の構造変化をもたらす。例えば、標的細胞表面編集酵素は、ドナー分
子から分子に官能基を転移させるトランスフェラーゼであってもよい。いくつかの実施形
態では、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上の分子にリン酸基を付加するキナー
ゼである。
細胞の表面上の分子の構造変化をもたらす。例えば、標的細胞表面編集酵素は、ドナー分
子から分子に官能基を転移させるトランスフェラーゼであってもよい。いくつかの実施形
態では、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上の分子にリン酸基を付加するキナー
ゼである。
【0042】
いくつかの実施形態によれば、標的細胞表面編集酵素は、分子から部分を除去すること
によって、標的細胞の表面上の分子の構造変化をもたらす。例えば、標的細胞表面編集酵
素は、分子からアクセプター分子に官能基を転移させるトランスフェラーゼであってもよ
い。いくつかの実施形態では、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上の分子からリ
ン酸基を除去するホスファターゼである。
によって、標的細胞の表面上の分子の構造変化をもたらす。例えば、標的細胞表面編集酵
素は、分子からアクセプター分子に官能基を転移させるトランスフェラーゼであってもよ
い。いくつかの実施形態では、標的細胞表面編集酵素は、標的細胞の表面上の分子からリ
ン酸基を除去するホスファターゼである。
【0043】
標的細胞
標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、標的化される細胞に基づいて選択されても
よい。特定の実施形態によれば、標的細胞は、癌細胞、免疫細胞、内皮細胞、および上皮
細胞から選択される。目的の標的細胞には、特定の疾患または病態に関連する細胞が含ま
れるが、これに限定されない。例えば、標的細胞は正常に機能する細胞（例えば、正常に
機能する免疫細胞など）であってもよく、細胞表面編集酵素は、それを必要とする個体に
とって治療的な態様で細胞の機能を調節し、例えば、個体の疾患を治療するのに有益な細
胞の機能を高めるなどする。
標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、標的化される細胞に基づいて選択されても
よい。特定の実施形態によれば、標的細胞は、癌細胞、免疫細胞、内皮細胞、および上皮
細胞から選択される。目的の標的細胞には、特定の疾患または病態に関連する細胞が含ま
れるが、これに限定されない。例えば、標的細胞は正常に機能する細胞（例えば、正常に
機能する免疫細胞など）であってもよく、細胞表面編集酵素は、それを必要とする個体に
とって治療的な態様で細胞の機能を調節し、例えば、個体の疾患を治療するのに有益な細
胞の機能を高めるなどする。
【0044】
他の態様では、標的細胞は正常細胞ではない。目的とする非正常標的細胞としては、癌
細胞が挙げられるが、これに限定されない。「癌細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、
異常な細胞増殖、密度依存性の増殖阻害の損失、足場非依存性の増殖能力、免疫無防備状
態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍増殖および／もしくは発達、ならびに／または細胞形
質転換の任意の適切な指標を促進することができる能力のうちの１つ以上によって特徴付
けることができる、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「癌細胞
」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍
、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの癌細胞を包含する。特定の態様では、癌細胞
は癌腫細胞である。特定の実施形態によれば、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細
胞、結腸癌細胞、および上記表１および２に記載の癌タイプのいずれかの癌細胞から選択
される。
細胞が挙げられるが、これに限定されない。「癌細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、
異常な細胞増殖、密度依存性の増殖阻害の損失、足場非依存性の増殖能力、免疫無防備状
態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍増殖および／もしくは発達、ならびに／または細胞形
質転換の任意の適切な指標を促進することができる能力のうちの１つ以上によって特徴付
けることができる、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「癌細胞
」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「癌性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍
、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などの癌細胞を包含する。特定の態様では、癌細胞
は癌腫細胞である。特定の実施形態によれば、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細
胞、結腸癌細胞、および上記表１および２に記載の癌タイプのいずれかの癌細胞から選択
される。
【0045】
特定の態様では、標的細胞が癌細胞である場合、標的化部分が結合する癌細胞の表面上
の分子は、腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子である。「腫瘍関連細胞
表面分子」とは、正常組織の細胞上での発現が制限され悪性細胞上で発現される細胞表面
分子、正常細胞に比べて悪性細胞上ではるかに高い密度で発現される細胞表面分子、また
は発生的に発現される細胞表面分子を意味する。
の分子は、腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子である。「腫瘍関連細胞
表面分子」とは、正常組織の細胞上での発現が制限され悪性細胞上で発現される細胞表面
分子、正常細胞に比べて悪性細胞上ではるかに高い密度で発現される細胞表面分子、また
は発生的に発現される細胞表面分子を意味する。
【0046】
標的細胞が癌細胞である場合、癌細胞は、標的化部分が結合する腫瘍関連細胞表面分子
または腫瘍特異的細胞表面分子を発現し得る。特定の態様において、このような細胞表面
分子は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／Ｃ
ＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン－４、メソテリ
ン、膜貫通型糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｓ
ＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、ＣＡ－ＩＸ、インテグリン、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型（
ＣＸＣＲ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ニューロピリ
ン－１（ＮＲＰ１）、マトリプターゼ、上記の表１、２および３に記載の任意の細胞表面
分子、および対象の他の腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子から選択される。
または腫瘍特異的細胞表面分子を発現し得る。特定の態様において、このような細胞表面
分子は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／Ｃ
ＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン－４、メソテリ
ン、膜貫通型糖タンパク質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｓ
ＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、ＣＡ－ＩＸ、インテグリン、Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型（
ＣＸＣＲ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ニューロピリ
ン－１（ＮＲＰ１）、マトリプターゼ、上記の表１、２および３に記載の任意の細胞表面
分子、および対象の他の腫瘍関連または腫瘍特異的細胞表面分子から選択される。
【0047】
複合体を作製する方法
本開示の複合体を作製する方法もまた提供される。
本開示の複合体を作製する方法もまた提供される。
【0048】
標的化部分および／または標的細胞表面編集酵素を産生することを望む場合（例えば、
特定の標的化部分および／または標的細胞表面編集酵素が市販されていないため）、この
方法は、標的化部分および標的細胞表面編集酵素の一方または両方を産生することを含み
得る。
特定の標的化部分および／または標的細胞表面編集酵素が市販されていないため）、この
方法は、標的化部分および標的細胞表面編集酵素の一方または両方を産生することを含み
得る。
【0049】
所望の複合体の成分（すなわち、標的化部分または標的細胞表面編集酵素）がペプチド
またはポリペプチドである場合、組換え法を用いて成分を生成することができる。例えば
、所望の複合体の成分をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。成分
をコードするＤＮＡは、成分の発現を確実にする発現ベクター中の１つ以上の制御配列に
作動可能に連結され得る。発現制御配列には、プロモーター（例えば、天然に関連するプ
ロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素、および転写終
結配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御配列は、原核または真核宿主細胞
を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中のプロモーター系であり
得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発
現、および成分の収集および精製に適した条件下で維持される。
またはポリペプチドである場合、組換え法を用いて成分を生成することができる。例えば
、所望の複合体の成分をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。成分
をコードするＤＮＡは、成分の発現を確実にする発現ベクター中の１つ以上の制御配列に
作動可能に連結され得る。発現制御配列には、プロモーター（例えば、天然に関連するプ
ロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素、および転写終
結配列が含まれるが、これらに限定されない。発現制御配列は、原核または真核宿主細胞
を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中のプロモーター系であり
得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発
現、および成分の収集および精製に適した条件下で維持される。
【0050】
所望の複合体の成分（すなわち、標的化部分または標的細胞表面編集酵素）がペプチド
またはポリペプチドである場合、成分は、化学的ペプチド合成技術を用いて生成され得る
。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行し得る
。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合した後、配列中の残りのアミノ酸を逐次的
に付加する固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、所望の複合体の成分を化学合成するた
めの適切な方法の例である。成分を合成するために、ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどの様々な
形態のＳＰＰＳが利用可能である。簡潔には、小さな不溶性の多孔質ビーズを、ペプチド
鎖が構築される機能的単位で処理することができる。カップリング／脱保護のサイクルを
繰り返した後、結合した固相の遊離Ｎ末端アミンを単一のＮ－保護アミノ酸ユニットにカ
ップリングさせる。次いで、このユニットを脱保護して、新たなＮ末端アミンを露出させ
、さらなるアミノ酸を結合させることができる。ペプチドは、固相に固定化されたままで
あり、切断される前に濾過プロセスを受ける。
またはポリペプチドである場合、成分は、化学的ペプチド合成技術を用いて生成され得る
。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行し得る
。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合した後、配列中の残りのアミノ酸を逐次的
に付加する固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、所望の複合体の成分を化学合成するた
めの適切な方法の例である。成分を合成するために、ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどの様々な
形態のＳＰＰＳが利用可能である。簡潔には、小さな不溶性の多孔質ビーズを、ペプチド
鎖が構築される機能的単位で処理することができる。カップリング／脱保護のサイクルを
繰り返した後、結合した固相の遊離Ｎ末端アミンを単一のＮ－保護アミノ酸ユニットにカ
ップリングさせる。次いで、このユニットを脱保護して、新たなＮ末端アミンを露出させ
、さらなるアミノ酸を結合させることができる。ペプチドは、固相に固定化されたままで
あり、切断される前に濾過プロセスを受ける。
【0051】
一旦合成されると（化学的または組換え的に）、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティ
ーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、
ゲル電気泳動などの標準的な手順に従って成分を精製することができる。
ーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、
ゲル電気泳動などの標準的な手順に従って成分を精製することができる。
【0052】
標的化部分および標的細胞表面編集酵素が得られたら、様々な複合体化（コンジュゲー
ション）方法が利用可能であり、特定の方法は、所望の複合体中の標的化部分および標的
細胞表面編集酵素の性質／タイプに基づいて選択され得る（例えば、標的化部分および標
的細胞表面編集酵素中の利用可能な、または提供された反応性官能基に基づいて）。本開
示の複合体を生成するための標的化部分および標的細胞表面編集酵素を安定に会合させる
のに使用することを見出すバイオコンジュゲーション戦略は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ １，２００８，Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９５，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４５：２０５－２１；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：２などに記載されているものが挙げ
られる。
ション）方法が利用可能であり、特定の方法は、所望の複合体中の標的化部分および標的
細胞表面編集酵素の性質／タイプに基づいて選択され得る（例えば、標的化部分および標
的細胞表面編集酵素中の利用可能な、または提供された反応性官能基に基づいて）。本開
示の複合体を生成するための標的化部分および標的細胞表面編集酵素を安定に会合させる
のに使用することを見出すバイオコンジュゲーション戦略は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ １，２００８，Ｈａｕｇｌａｎｄ，１９９５，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４５：２０５－２１；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：２などに記載されているものが挙げ
られる。
【0053】
特定の実施形態によれば、標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、互いに直接複合
体化されており、すなわち、複合体の成分は、リンカーを使用せずに互いと複合体化され
る。他の態様では、標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、リンカーを介して互いと
複合体化される。任意の適切なリンカーを使用することができる。本開示の複合体に使用
されるリンカーとしては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイ
ミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシ
ンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイ
ミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなど、だが
それに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー、プロパン酸を
含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリン
カーが挙げられる。特定の態様では、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含
む。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは
、可撓性であっても剛性であってもよい。対象となるペプチドリンカーには、Ｃｈｅｎ
ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３
５７－１３６９に記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。ある
態様では、リンカーがペプチドリンカーである場合、複合体は融合タンパク質である。複
合体が融合タンパク質である場合、本開示は、そのような融合タンパク質をコードする核
酸、プロモーターに作動可能に連結されたそのような核酸を含む発現ベクター、およびこ
のような融合タンパク質、核酸、および／または発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、
哺乳動物宿主細胞）をさらに提供する。特定の態様では、リンカーは血清安定性である。
血清安定リンカーは既知であり、例えばＰＥＧ、スルホンリンカー（例えば、フェニルオ
キサジアゾールスルホンリンカー（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉ
ｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（８）：１４０２－７を参照のこと））などを含むリンカー
が挙げられる。
体化されており、すなわち、複合体の成分は、リンカーを使用せずに互いと複合体化され
る。他の態様では、標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、リンカーを介して互いと
複合体化される。任意の適切なリンカーを使用することができる。本開示の複合体に使用
されるリンカーとしては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイ
ミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシ
ンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイ
ミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなど、だが
それに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー、プロパン酸を
含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリン
カーが挙げられる。特定の態様では、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含
む。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは
、可撓性であっても剛性であってもよい。対象となるペプチドリンカーには、Ｃｈｅｎ
ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３
５７－１３６９に記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。ある
態様では、リンカーがペプチドリンカーである場合、複合体は融合タンパク質である。複
合体が融合タンパク質である場合、本開示は、そのような融合タンパク質をコードする核
酸、プロモーターに作動可能に連結されたそのような核酸を含む発現ベクター、およびこ
のような融合タンパク質、核酸、および／または発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、
哺乳動物宿主細胞）をさらに提供する。特定の態様では、リンカーは血清安定性である。
血清安定リンカーは既知であり、例えばＰＥＧ、スルホンリンカー（例えば、フェニルオ
キサジアゾールスルホンリンカー（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉ
ｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２５（８）：１４０２－７を参照のこと））などを含むリンカー
が挙げられる。
【0054】
標的化部分と標的細胞表面編集酵素を、リンカーを介して連結するために多くの戦略が
利用可能である。例えば、複合体の１つの成分は、リンカーをその成分に共有結合させる
ことによって誘導体化することができ、リンカーは、その成分の「ケミカルハンドル」と
反応することができる官能基を有し、リンカーは、他方の成分の「ケミカルハンドル」と
反応することができる第２の官能基を有する。リンカー上の官能基は変化してもよく、所
望の複合体の成分上のケミカルハンドルとの適合性に基づいて選択してもよい。複合体成
分は、リンカーの官能基と反応するのに有用な官能基をすでに含んでいてもよく、または
このような官能基は、所望の複合体の一方または両方の成分に提供されてもよい。複合体
の成分をリンカーに結合させるために使用され得る官能基には、活性エステル、イソシア
ネート、イミドエステル、ヒドラジド、アミノ基、アルデヒド、ケトン、光反応性基、マ
レイミド基、アルファ－ハロ－アセチル基、エポキシド、アジリジンなどが挙げられるが
、これに限定されるものではない。ヨードアセトアミド、マレイミド、ベンジルハライド
およびブロモメチルケトンのような試薬は、チオールのＳ－アルキル化によって反応して
安定なチオエーテル生成物を生成する。例えば、ｐＨ６．５～７．５において、マレイミ
ド基はスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。ＮＢＤハロゲン
化物のようなアリール化試薬は、求核剤による芳香族ハロゲン化物の類似の置換によって
、チオールまたはアミンと反応する。チオラートアニオンは中性チオールよりも良い求核
剤なので、システインは、そのｐＫａ（タンパク質構造コンテキストに応じて、約８．３
）より上で反応性がより高くなる。チオールはまた、イソチオシアネートおよびスクシン
イミジルエステルを含む特定のアミン反応性試薬と反応する。ＴＳ－Ｌｉｎｋシリーズの
試薬は、可逆チオール修飾に利用できる。
利用可能である。例えば、複合体の１つの成分は、リンカーをその成分に共有結合させる
ことによって誘導体化することができ、リンカーは、その成分の「ケミカルハンドル」と
反応することができる官能基を有し、リンカーは、他方の成分の「ケミカルハンドル」と
反応することができる第２の官能基を有する。リンカー上の官能基は変化してもよく、所
望の複合体の成分上のケミカルハンドルとの適合性に基づいて選択してもよい。複合体成
分は、リンカーの官能基と反応するのに有用な官能基をすでに含んでいてもよく、または
このような官能基は、所望の複合体の一方または両方の成分に提供されてもよい。複合体
の成分をリンカーに結合させるために使用され得る官能基には、活性エステル、イソシア
ネート、イミドエステル、ヒドラジド、アミノ基、アルデヒド、ケトン、光反応性基、マ
レイミド基、アルファ－ハロ－アセチル基、エポキシド、アジリジンなどが挙げられるが
、これに限定されるものではない。ヨードアセトアミド、マレイミド、ベンジルハライド
およびブロモメチルケトンのような試薬は、チオールのＳ－アルキル化によって反応して
安定なチオエーテル生成物を生成する。例えば、ｐＨ６．５～７．５において、マレイミ
ド基はスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。ＮＢＤハロゲン
化物のようなアリール化試薬は、求核剤による芳香族ハロゲン化物の類似の置換によって
、チオールまたはアミンと反応する。チオラートアニオンは中性チオールよりも良い求核
剤なので、システインは、そのｐＫａ（タンパク質構造コンテキストに応じて、約８．３
）より上で反応性がより高くなる。チオールはまた、イソチオシアネートおよびスクシン
イミジルエステルを含む特定のアミン反応性試薬と反応する。ＴＳ－Ｌｉｎｋシリーズの
試薬は、可逆チオール修飾に利用できる。
【0055】
アミン反応性基に関しては、第一級アミンは、ポリペプチド鎖のＮ末端およびリシン（
Ｌｙｓ、Ｋ）アミノ酸残基の側鎖に存在する。典型的な生物学的またはタンパク質試料中
の利用可能な官能基の中で、第一級アミンは特に求核性であり、それらをいくつかの反応
性基との複合体化のための容易な標的とする。例えば、ＮＨＳエステルは、カルボジイミ
ド分子のカルボジイミド活性化によって形成される反応性基である。ＮＨＳエステル活性
化架橋剤および標識化合物は、生理的条件からわずかにアルカリ性の条件まで（ｐＨ７．
２～９）で第一級アミンと反応して安定なアミド結合を生じる。この反応はＮ－ヒドロキ
シスクシンイミド（ＮＨＳ）を放出する。また、一例として、イミドエステル架橋剤は、
第一級アミンと反応してアミジン結合を形成する。イミドエステル架橋剤は、アルカリ性
ｐＨでアミンと迅速に反応するが、短い半減期を有する。ｐＨがよりアルカリ性になるに
つれて、半減期およびアミンとの反応性が増大する。このように、架橋は、ｐＨ８よりも
ｐＨ１０で行うとより効率的である。ｐＨ１０未満の反応条件では副反応が起こる可能性
があるが、アミジン形成はｐＨ８～１０の間で優位である。
Ｌｙｓ、Ｋ）アミノ酸残基の側鎖に存在する。典型的な生物学的またはタンパク質試料中
の利用可能な官能基の中で、第一級アミンは特に求核性であり、それらをいくつかの反応
性基との複合体化のための容易な標的とする。例えば、ＮＨＳエステルは、カルボジイミ
ド分子のカルボジイミド活性化によって形成される反応性基である。ＮＨＳエステル活性
化架橋剤および標識化合物は、生理的条件からわずかにアルカリ性の条件まで（ｐＨ７．
２～９）で第一級アミンと反応して安定なアミド結合を生じる。この反応はＮ－ヒドロキ
シスクシンイミド（ＮＨＳ）を放出する。また、一例として、イミドエステル架橋剤は、
第一級アミンと反応してアミジン結合を形成する。イミドエステル架橋剤は、アルカリ性
ｐＨでアミンと迅速に反応するが、短い半減期を有する。ｐＨがよりアルカリ性になるに
つれて、半減期およびアミンとの反応性が増大する。このように、架橋は、ｐＨ８よりも
ｐＨ１０で行うとより効率的である。ｐＨ１０未満の反応条件では副反応が起こる可能性
があるが、アミジン形成はｐＨ８～１０の間で優位である。
【0056】
多数の他の合成化学基が一級アミンとの化学結合を形成し、例えばイソチオシアネート
、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロライド、アルデヒド、グリオキサール
、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、カルボジイミド、無水物
、およびフルオロフェニルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。そのような
基は、アシル化またはアルキル化のいずれかによってアミンに結合する。
、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロライド、アルデヒド、グリオキサール
、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、カルボジイミド、無水物
、およびフルオロフェニルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。そのような
基は、アシル化またはアルキル化のいずれかによってアミンに結合する。
【0057】
一実施形態によれば、標的化部分、標的細胞表面編集酵素、またはその両方の化学的ハ
ンドルは、その化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を成分へ組み込むことによって提
供される。非天然アミノ酸は、化学合成または組換えアプローチを介して、例えば、宿主
細胞における翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために適切な直交アミノアシルｔＲＮＡ
シンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して、取り込まれ得る。成分中に存在する非天然アミノ
酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、
ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、アリール
ハライド、ボロン酸、または他の適切な官能基であってもよく、リンカー上の官能基は、
非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。
ンドルは、その化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸を成分へ組み込むことによって提
供される。非天然アミノ酸は、化学合成または組換えアプローチを介して、例えば、宿主
細胞における翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために適切な直交アミノアシルｔＲＮＡ
シンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して、取り込まれ得る。成分中に存在する非天然アミノ
酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、
ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、アリール
ハライド、ボロン酸、または他の適切な官能基であってもよく、リンカー上の官能基は、
非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。
【0058】
他の態様では、標的化部分、標的細胞表面編集酵素、またはその両方のケミカルハンド
ルは、非天然アミノ酸を含まないアプローチを用いて提供される。例えば、非天然アミノ
酸を含まない成分は、反応性離脱基または他の求電子性基を有するリンカー構築物との置
換反応における求核試薬として、例えば、成分の求核性官能基（例えば、Ｎ末端アミンま
たはリジンの第一級アミン、または任意の他の求核性アミノ酸残基）を利用することによ
って、リンカーと複合体化されることができる。
ルは、非天然アミノ酸を含まないアプローチを用いて提供される。例えば、非天然アミノ
酸を含まない成分は、反応性離脱基または他の求電子性基を有するリンカー構築物との置
換反応における求核試薬として、例えば、成分の求核性官能基（例えば、Ｎ末端アミンま
たはリジンの第一級アミン、または任意の他の求核性アミノ酸残基）を利用することによ
って、リンカーと複合体化されることができる。
【0059】
特定の態様では、標的細胞表面編集酵素は標的化部分に部位特異的に複合体化されるか
、標的化部分は標的細胞表面編集酵素に部位特異的に複合体化されるか、またはその両方
である。いくつかの実施形態では、部位特異的複合体化は、反応性官能基を有する非天然
アミノ酸を標的化部分および／または標的細胞表面編集酵素の所定の位置に組み込むこと
によって達成される。非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みの詳細は、例
えば、Ｙｏｕｎｇ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１１
０３９－１１０４４に見出すことができる。
、標的化部分は標的細胞表面編集酵素に部位特異的に複合体化されるか、またはその両方
である。いくつかの実施形態では、部位特異的複合体化は、反応性官能基を有する非天然
アミノ酸を標的化部分および／または標的細胞表面編集酵素の所定の位置に組み込むこと
によって達成される。非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的組み込みの詳細は、例
えば、Ｙｏｕｎｇ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１１
０３９－１１０４４に見出すことができる。
【0060】
特定の態様では、標的化部分はＣ末端アルデヒドタグを有し、Ｃ末端アルデヒドをアミ
ノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）と反応さ
せ、続いてビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）
標識標的細胞表面編集酵素と反応させることによって部位特異的複合体化を達成する。こ
の例示的な実施形態は、以下の実験セクションでより詳細に説明される。
ノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）と反応さ
せ、続いてビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）
標識標的細胞表面編集酵素と反応させることによって部位特異的複合体化を達成する。こ
の例示的な実施形態は、以下の実験セクションでより詳細に説明される。
【0061】
特定の態様では、標的化部分はＣ末端アルデヒドタグを有し、Ｃ末端アルデヒドをアミ
ノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）と反応さ
せることによって部位特異的複合体化が達成される。標的細胞表面編集酵素はアルデヒド
タグ配列（ＳＬＣＴＰＳＲＧＳ）を有し、アルデヒドタグシステインをジベンゾシクロオ
クチン－テトラポリエチレングリコール－マレイミド（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド
）と反応させた後、ＴＥＧ－Ｎ３標識された標的化部分との反応によって、部位特異的複
合体化が達成される。この例示的な実施形態は、以下の実験セクションでより詳細に説明
される。
ノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）と反応さ
せることによって部位特異的複合体化が達成される。標的細胞表面編集酵素はアルデヒド
タグ配列（ＳＬＣＴＰＳＲＧＳ）を有し、アルデヒドタグシステインをジベンゾシクロオ
クチン－テトラポリエチレングリコール－マレイミド（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド
）と反応させた後、ＴＥＧ－Ｎ３標識された標的化部分との反応によって、部位特異的複
合体化が達成される。この例示的な実施形態は、以下の実験セクションでより詳細に説明
される。
【0062】
したがって、本開示の態様は、標的細胞表面上で細胞表面分子に結合する標的化部分と
標的細胞表面編集酵素を複合体化することを含む方法を含む。１つ以上（例えば、２つ以
上、３つ以上、４つ以上など）の標的細胞表面編集酵素を標的化部分と複合体化すること
ができる。標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、本明細書に記載の標的化部分およ
び標的細胞表面編集酵素のいずれかであり得る。ほんの一例として、いくつかの実施形態
では、標的細胞表面編集酵素はシアリダーゼ（例えば、本明細書に記載のシアリダーゼの
いずれか）であり、標的化部分は抗体（例えば、本明細書に記載の抗体のいずれか、例と
して、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレ
ンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、リツキシマブなどを含む）である。上記
のように、複合体化は、標的部分、標的細胞表面編集酵素、またはその両方に関して部位
特異的であり得る（例えば、所定の位置における非天然アミノ酸の官能基を介して）。
標的細胞表面編集酵素を複合体化することを含む方法を含む。１つ以上（例えば、２つ以
上、３つ以上、４つ以上など）の標的細胞表面編集酵素を標的化部分と複合体化すること
ができる。標的化部分および標的細胞表面編集酵素は、本明細書に記載の標的化部分およ
び標的細胞表面編集酵素のいずれかであり得る。ほんの一例として、いくつかの実施形態
では、標的細胞表面編集酵素はシアリダーゼ（例えば、本明細書に記載のシアリダーゼの
いずれか）であり、標的化部分は抗体（例えば、本明細書に記載の抗体のいずれか、例と
して、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレ
ンツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、リツキシマブなどを含む）である。上記
のように、複合体化は、標的部分、標的細胞表面編集酵素、またはその両方に関して部位
特異的であり得る（例えば、所定の位置における非天然アミノ酸の官能基を介して）。
【0063】
組成物
また、本開示の複合体を含む組成物も提供される。組成物は、本明細書に記載された複
合体（例えば、本明細書に記載の標的化部分および標的細胞表面編集酵素のいずれかを有
する複合体）のいずれかを含み得る。特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する
本開示の複合体を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。
１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）
、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタ
ンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、
２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－ア
ミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２
０などの非イオン性洗浄剤）、リボヌクレアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤など
は、このような組成物に存在してもよい。
また、本開示の複合体を含む組成物も提供される。組成物は、本明細書に記載された複
合体（例えば、本明細書に記載の標的化部分および標的細胞表面編集酵素のいずれかを有
する複合体）のいずれかを含み得る。特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する
本開示の複合体を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液などの水性液体媒体であってもよい。
１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）
、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタ
ンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、
２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－ア
ミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、溶解剤、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２
０などの非イオン性洗浄剤）、リボヌクレアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤など
は、このような組成物に存在してもよい。
【0064】
薬学的組成物もまた提供される。薬学的組成物は、本開示の複合体のいずれか、および
薬学的に許容される担体を含む。薬学的組成物は、一般に、治療有効量の複合体を含む。
「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味し、例えば、対照と比
較して、標的細胞またはその集団に関連する疾患または障害の症状の軽減などの有益なま
たは所望の治療結果（予防的な結果を含む）をもたらすのに十分な量を意味する。有効量
は１回以上の投与で投与することができる。
薬学的に許容される担体を含む。薬学的組成物は、一般に、治療有効量の複合体を含む。
「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な用量を意味し、例えば、対照と比
較して、標的細胞またはその集団に関連する疾患または障害の症状の軽減などの有益なま
たは所望の治療結果（予防的な結果を含む）をもたらすのに十分な量を意味する。有効量
は１回以上の投与で投与することができる。
【0065】
本開示の複合体は、治療用投与のための種々の製剤に組み込むことができる。より具体
的には、複合体は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによっ
て、薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶
液、注入剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、またはガス状形態の
製剤に製剤化することができる。
的には、複合体は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによっ
て、薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶
液、注入剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、またはガス状形態の
製剤に製剤化することができる。
【0066】
患者への投与に適した（例えば、ヒト投与に適した）本開示の複合体の製剤は、一般的
に滅菌されており、さらに、選択された投与経路に従って患者に投与することが禁じられ
た検出可能な発熱物質または他の汚染物質を含んでいないようにされ得る。
に滅菌されており、さらに、選択された投与経路に従って患者に投与することが禁じられ
た検出可能な発熱物質または他の汚染物質を含んでいないようにされ得る。
【0067】
薬学的剤形では、複合体をその薬学的に許容される塩の形態で投与することができ、ま
たはそれらを単独でもしくは適切な会合で使用することができ、ならびに他の薬学的活性
化合物、例えば抗癌剤（小分子抗癌剤を含むが、これに限定されない）、免疫チェックポ
イント阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせと共に組み合わせて使用することができ
る。以下の方法および担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
たはそれらを単独でもしくは適切な会合で使用することができ、ならびに他の薬学的活性
化合物、例えば抗癌剤（小分子抗癌剤を含むが、これに限定されない）、免疫チェックポ
イント阻害剤、およびそれらの任意の組み合わせと共に組み合わせて使用することができ
る。以下の方法および担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【0068】
経口製剤の場合、例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャ
ガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム
、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデン
プンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシ
ウムまたはタルクなどの潤滑剤、および所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤お
よび香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、複合体を単
独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
ガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム
、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデン
プンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシ
ウムまたはタルクなどの潤滑剤、および所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤お
よび香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒またはカプセル剤を製造するために、複合体を単
独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。
【0069】
複合体は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、大脳内、脳室内、髄腔内
、皮下など）投与用に製剤化することができる。特定の態様では、複合体は、植物油もし
くは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレング
リコール等の水性溶媒または非水性溶媒に複合体を溶解、懸濁または乳化することによっ
て、また必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の
通常の添加剤を用いて、注射用に製剤化することができる。
、皮下など）投与用に製剤化することができる。特定の態様では、複合体は、植物油もし
くは他の類似の油、合成脂肪族グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレング
リコール等の水性溶媒または非水性溶媒に複合体を溶解、懸濁または乳化することによっ
て、また必要であれば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の
通常の添加剤を用いて、注射用に製剤化することができる。
【0070】
複合体を含む薬学的組成物は、所望の純度を有する複合体を任意の生理学的に許容され
る担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することに
よって調製することができる。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用さ
れる投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸
塩および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびク
エン酸を含む抗酸化剤；防腐剤（例えばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、
ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベ
ンザルコニウムまたはそれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リシ
ン、ヒスチジン、グルタミン酸、Ｄ、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラ
ニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み
合わせなどのアミノ酸；単糖、二糖および他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）ポ
リペプチド；タンパク質、例えばゼラチンまたは血清アルブミン；ＥＤＴＡなどのキレー
ト剤；トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラ
クトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコ
サミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸などの糖；および／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂ
ｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、トリトン－Ｘまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など
の非イオン性界面活性剤を含む。
る担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤および／または等張化剤と混合することに
よって調製することができる。許容される担体、賦形剤および／または安定剤は、使用さ
れる投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸
塩および他の有機酸；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびク
エン酸を含む抗酸化剤；防腐剤（例えばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、
ｍ－クレゾール、ｐ－クロル－ｍ－クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベ
ンザルコニウムまたはそれらの組み合わせ）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リシ
ン、ヒスチジン、グルタミン酸、Ｄ、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラ
ニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、およびそれらの組み
合わせなどのアミノ酸；単糖、二糖および他の炭水化物；低分子量（約１０残基未満）ポ
リペプチド；タンパク質、例えばゼラチンまたは血清アルブミン；ＥＤＴＡなどのキレー
ト剤；トレハロース、ショ糖、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラ
クトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコ
サミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸などの糖；および／または、Ｔｗｅｅｎ、Ｂ
ｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、トリトン－Ｘまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など
の非イオン性界面活性剤を含む。
【0071】
薬学的組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体
形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるべきである。凍結
乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中
に除去された容積に相当する）を加えることである。しかしながら、抗菌剤を含む溶液は
、非経口投与のための薬学的組成物の製造のために使用され得る。
形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるべきである。凍結
乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中
に除去された容積に相当する）を加えることである。しかしながら、抗菌剤を含む溶液は
、非経口投与のための薬学的組成物の製造のために使用され得る。
【0072】
複合体の水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、または約５．０～約６．０の範囲
、またはあるいは、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範
囲内のｐＨに適した緩衝液の例には、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液
、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例え
ば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ
～約５０ｍＭであり得る。
、またはあるいは、約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範
囲内のｐＨに適した緩衝液の例には、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液
、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例え
ば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ
～約５０ｍＭであり得る。
【0073】
製剤の張度を調節するために、等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化
剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖、ならび
にそれらの組み合わせの群からの任意の成分が挙げられる。いくつかの実施形態では、水
性製剤は等張性であるが、高張または低張溶液も適し得る。「等張性」という用語は、生
理的食塩水または血清など、それが比較される何らかの他の溶液と同じ張度を有する溶液
を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０
ｍＭの量で使用され得る。
剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびアミノ酸、糖、ならび
にそれらの組み合わせの群からの任意の成分が挙げられる。いくつかの実施形態では、水
性製剤は等張性であるが、高張または低張溶液も適し得る。「等張性」という用語は、生
理的食塩水または血清など、それが比較される何らかの他の溶液と同じ張度を有する溶液
を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量で、例えば、１００ｍＭ～３５０
ｍＭの量で使用され得る。
【0074】
凝集を減少させるために、および／または製剤中の微粒子の形成を最小限にするために
、および／または吸着を低減するために、界面活性剤もまた製剤に添加されてもよい。界
面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレ
ンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマ
ー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベ
ート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標）で販売）およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０
（商標）で販売）である。適切なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の名称で販売
されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（
商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～
約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
、および／または吸着を低減するために、界面活性剤もまた製剤に添加されてもよい。界
面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレ
ンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマ
ー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベ
ート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標）で販売）およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０
（商標）で販売）である。適切なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の名称で販売
されているものである。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（
商標）の商標で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～
約１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【0075】
凍結乾燥プロセス中の不安定化条件から複合体を保護するために、凍結乾燥保護剤を添
加してもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを
含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、および
アミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護
剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれることができる。
加してもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを
含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）、および
アミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護
剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれることができる。
【0076】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本開示の複合体、および上記で同定された
１つ以上の薬剤（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）を含み、ベンジルア
ルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプ
ロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組み合わせなどの、１つ以上の
防腐剤を実質的に含まない。他の実施形態では、防腐剤が製剤中に、例えば約０．００１
～約２％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれる。
１つ以上の薬剤（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）を含み、ベンジルア
ルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチルまたはプ
ロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組み合わせなどの、１つ以上の
防腐剤を実質的に含まない。他の実施形態では、防腐剤が製剤中に、例えば約０．００１
～約２％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれる。
【0077】
方法
上記に要約したように、本開示の複合体を使用する方法もまた提供される。ある態様で
は、本開示の方法は、それを必要とする個体に、治療有効量の本開示の複合体のいずれか
、または本開示の薬学的組成物のいずれかを投与することを含む。
上記に要約したように、本開示の複合体を使用する方法もまた提供される。ある態様で
は、本開示の方法は、それを必要とする個体に、治療有効量の本開示の複合体のいずれか
、または本開示の薬学的組成物のいずれかを投与することを含む。
【0078】
特定の態様では、投与は、個体における免疫経路を調節する。例えば、投与は、抑制性
免疫受容体経路、補体経路、ペア型免疫グロブリン様２型受容体（ＰＩＬＲ）経路、およ
びナチュラルキラーグループ２、メンバーＤタンパク質（ＮＫＧ２Ｄ）経路から選択され
る免疫経路を調節することができる。特定の態様では、標的細胞はその表面上にリガンド
を含み、投与は標的細胞表面編集酵素によるリガンドの編集をもたらす。リガンドは、本
明細書の他の場所に記載されている任意の方法で編集することができる。特定の実施形態
によれば、リガンドの編集は、リガンドのすべてまたは一部の切断を含む。ほんの一例と
して、リガンドはシアログリカンであってもよく、標的細胞表面編集酵素はシアリダーゼ
であってもよく、編集にはシアログリカンの末端シアル酸残基の切断が含まれてもよい。
複合体のシアリダーゼは、細菌シアリダーゼ、哺乳動物ノイラミニダーゼなどであっても
よい。シアリダーゼが哺乳動物ノイラミニダーゼである場合、哺乳動物ノイラミニダーゼ
は、ヒトノイラミニダーゼ、例えばヒトノイラミニダーゼ１、ヒトノイラミニダーゼ２、
ヒトノイラミニダーゼ３およびヒトノイラミニダーゼ４から選択されるヒトノイラミニダ
ーゼであり得る。
免疫受容体経路、補体経路、ペア型免疫グロブリン様２型受容体（ＰＩＬＲ）経路、およ
びナチュラルキラーグループ２、メンバーＤタンパク質（ＮＫＧ２Ｄ）経路から選択され
る免疫経路を調節することができる。特定の態様では、標的細胞はその表面上にリガンド
を含み、投与は標的細胞表面編集酵素によるリガンドの編集をもたらす。リガンドは、本
明細書の他の場所に記載されている任意の方法で編集することができる。特定の実施形態
によれば、リガンドの編集は、リガンドのすべてまたは一部の切断を含む。ほんの一例と
して、リガンドはシアログリカンであってもよく、標的細胞表面編集酵素はシアリダーゼ
であってもよく、編集にはシアログリカンの末端シアル酸残基の切断が含まれてもよい。
複合体のシアリダーゼは、細菌シアリダーゼ、哺乳動物ノイラミニダーゼなどであっても
よい。シアリダーゼが哺乳動物ノイラミニダーゼである場合、哺乳動物ノイラミニダーゼ
は、ヒトノイラミニダーゼ、例えばヒトノイラミニダーゼ１、ヒトノイラミニダーゼ２、
ヒトノイラミニダーゼ３およびヒトノイラミニダーゼ４から選択されるヒトノイラミニダ
ーゼであり得る。
【0079】
投与が標的細胞表面編集酵素による標的細胞上のリガンドの編集をもたらす場合、リガ
ンドは抑制性免疫受容体のリガンドであり得る。特定の態様では、リガンドは、ナチュラ
ルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マ
スト細胞、好塩基球および好酸球からなる群から選択される免疫細胞上に存在する抑制性
免疫受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、抑制性免疫受容体は、シアル酸
結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）受容体である。
ンドは抑制性免疫受容体のリガンドであり得る。特定の態様では、リガンドは、ナチュラ
ルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マ
スト細胞、好塩基球および好酸球からなる群から選択される免疫細胞上に存在する抑制性
免疫受容体のリガンドである。いくつかの実施形態では、抑制性免疫受容体は、シアル酸
結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）受容体である。
【0080】
特定の態様では、本開示の方法は、例えば癌を治療するために、複合体または薬学的組
成物を、癌を有する個体に投与することを含む。本開示の方法に従って治療することがで
きる癌は、上記の表１および２に記載の癌のいずれかを含むが、これに限定されない。複
合体は、個体の癌細胞の表面上の腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に
結合する標的化部分（例えば、上記の表１、２および３に記載の抗体のいずれかの治療用
抗体）を含み得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は癌腫細胞である。特定の実施形態
によれば、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、および上記表１お
よび２に記載の癌タイプのいずれかの癌細胞から選択される。特定の態様では、細胞表面
分子は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。細胞表面分子がＨＥＲ２である
場合、標的化は、例えば、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブまたは別の適切な抗
ＨＥＲ２抗体）であり得る。
成物を、癌を有する個体に投与することを含む。本開示の方法に従って治療することがで
きる癌は、上記の表１および２に記載の癌のいずれかを含むが、これに限定されない。複
合体は、個体の癌細胞の表面上の腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子に
結合する標的化部分（例えば、上記の表１、２および３に記載の抗体のいずれかの治療用
抗体）を含み得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は癌腫細胞である。特定の実施形態
によれば、癌細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、および上記表１お
よび２に記載の癌タイプのいずれかの癌細胞から選択される。特定の態様では、細胞表面
分子は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である。細胞表面分子がＨＥＲ２である
場合、標的化は、例えば、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブまたは別の適切な抗
ＨＥＲ２抗体）であり得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、投与には、本開示の複合体または薬学的組成物を投与するこ
とが含まれ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。特定の態様では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表１に示される抗体であり、方法は、表
１に記載の抗体に対応する、同一のまたは異なる癌のタイプを治療する（例えば、抗体依
存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強させることによって）ためのものである。
とが含まれ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。特定の態様では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表１に示される抗体であり、方法は、表
１に記載の抗体に対応する、同一のまたは異なる癌のタイプを治療する（例えば、抗体依
存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強させることによって）ためのものである。
【0082】
特定の態様では、投与には、本開示の複合体または薬学的組成物を投与することが含ま
れ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。いくつかの実施形態では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表２に示す抗体であり、方法は、表２に
記載の抗体に対応する同一または異なるタイプの癌を治療する（例えば、増強された抗体
依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって）ためのものである。
れ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。いくつかの実施形態では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表２に示す抗体であり、方法は、表２に
記載の抗体に対応する同一または異なるタイプの癌を治療する（例えば、増強された抗体
依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって）ためのものである。
【0083】
いくつかの実施形態では、投与には、本開示の複合体または薬学的組成物を投与するこ
とが含まれ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。特定の態様では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表３に示される抗体であり、方法は癌を
治療する（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強によって）ためのものであ
る。
とが含まれ、複合体には、抗体である標的化部分が含まれる。特定の態様では、それを必
要とする個体は癌を有し、複合体の標的化部分は表３に示される抗体であり、方法は癌を
治療する（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増強によって）ためのものであ
る。
【0084】
特定の態様では、投与には、本開示の複合体または薬学的組成物を投与することが含ま
れ、複合体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニ
ツムマブ、オファツムマブおよびリツキシマブから選択される抗体である標的化部分を含
む。
れ、複合体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニ
ツムマブ、オファツムマブおよびリツキシマブから選択される抗体である標的化部分を含
む。
【0085】
本開示の複合体は、インビボおよびエクスビボ方法、ならびに全身および局所投与経路
を含む、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与される。
従来のおよび薬学的に許容可能な投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮
内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経
路が含まれる。投与経路は、複合体および／または所望の効果に応じて、組み合わせるこ
とができ、または必要に応じて調節することができる。複合体は、単回投与または複数回
投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、複合体は経口投与される。いく
つかの実施形態では、複合体は、吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態では
、複合体は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、複合体は局所的に投与される。
いくつかの実施形態では、複合体は眼に投与される。いくつかの実施形態では、複合体は
、頭蓋内に投与される。いくつかの実施形態では、複合体は静脈内投与される。いくつか
の実施形態では、複合体は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のための注射によ
って、または局所部位に投与される。
を含む、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与される。
従来のおよび薬学的に許容可能な投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮
内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経
路が含まれる。投与経路は、複合体および／または所望の効果に応じて、組み合わせるこ
とができ、または必要に応じて調節することができる。複合体は、単回投与または複数回
投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、複合体は経口投与される。いく
つかの実施形態では、複合体は、吸入経路を介して投与される。いくつかの実施形態では
、複合体は鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、複合体は局所的に投与される。
いくつかの実施形態では、複合体は眼に投与される。いくつかの実施形態では、複合体は
、頭蓋内に投与される。いくつかの実施形態では、複合体は静脈内投与される。いくつか
の実施形態では、複合体は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のための注射によ
って、または局所部位に投与される。
【0086】
様々な個体が本方法に従って治療可能である。一般に、そのような個体は、肉食動物（
例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、お
よび霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳動物のクラス内の生
物を説明するために広く使用される「哺乳動物」または「哺乳類」である。いくつかの実
施形態では、個体はヒトである。
例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、お
よび霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳動物のクラス内の生
物を説明するために広く使用される「哺乳動物」または「哺乳類」である。いくつかの実
施形態では、個体はヒトである。
【0087】
「治療する」または「治療」とは、個体を苦しめている病理学的状態に関連する症状の
少なくとも改善を意味し、改善とは、例えば、標的細胞表面の編集が有益である標的細胞
またはその集団に関連する（例えば、それらによって引き起こされる）疾患または障害等
、治療されている病理学的状態に関連する症状などのパラメータの規模が少なくとも減少
することを意味するために広い意味で使用される。したがって、治療はまた、個体がその
病理学的状態、または少なくともその病理学的状態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむこ
とがないように、病理学的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制された
、例えば、発生するのを防止された、または停止された、例えば、中止された状況も含む
。
少なくとも改善を意味し、改善とは、例えば、標的細胞表面の編集が有益である標的細胞
またはその集団に関連する（例えば、それらによって引き起こされる）疾患または障害等
、治療されている病理学的状態に関連する症状などのパラメータの規模が少なくとも減少
することを意味するために広い意味で使用される。したがって、治療はまた、個体がその
病理学的状態、または少なくともその病理学的状態を特徴付ける症状にそれ以上苦しむこ
とがないように、病理学的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制された
、例えば、発生するのを防止された、または停止された、例えば、中止された状況も含む
。
【0088】
投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュー
ルは、個体の体内における複合体蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師
は、最適な投薬量、投薬方法および反復率を決定することができる。最適投与量は、複合
体の相対効力に応じて変わり得、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルなどにおい
て有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重
の０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇであり、日、週、月、または年１回以上投与することが
できる。治療する医師は、測定された滞留時間、および体液または組織中の薬物の濃度に
基づいて、投与の繰り返し率を推定することができる。治療が成功した後、被験体に疾患
状態の再発を防止するために維持療法を受けさせることが望ましい場合もあり、１日１回
以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年１回、または他の任意の適切な頻度の維持用量
で、複合体を投与する。
ルは、個体の体内における複合体蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師
は、最適な投薬量、投薬方法および反復率を決定することができる。最適投与量は、複合
体の相対効力に応じて変わり得、一般にインビトロおよびインビボ動物モデルなどにおい
て有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重
の０．０１μｇ～１００ｇ／ｋｇであり、日、週、月、または年１回以上投与することが
できる。治療する医師は、測定された滞留時間、および体液または組織中の薬物の濃度に
基づいて、投与の繰り返し率を推定することができる。治療が成功した後、被験体に疾患
状態の再発を防止するために維持療法を受けさせることが望ましい場合もあり、１日１回
以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年１回、または他の任意の適切な頻度の維持用量
で、複合体を投与する。
【0089】
本開示の治療方法は、単一タイプの複合体を個体に投与することを含んでもよく、また
は２つ以上のタイプの複合体（例えば、異なる複合体のカクテル）を個体に投与すること
を含んでもよく、２つ以上のタイプの複合体は、同じタイプまたは異なるタイプの標的細
胞の表面を編集するように設計することができる。
は２つ以上のタイプの複合体（例えば、異なる複合体のカクテル）を個体に投与すること
を含んでもよく、２つ以上のタイプの複合体は、同じタイプまたは異なるタイプの標的細
胞の表面を編集するように設計することができる。
【0090】
特定の態様では、本開示の複合体は、併用療法の一部として第２の治療剤と組み合わせ
て個体に投与される。そのような投与は、複合体および第２の薬剤を同時に投与すること
、または複合体および第２の薬剤を順次投与することを含み得る。いくつかの実施形態で
は、個体は癌を有し、第２の治療剤は抗癌剤である。目的の抗癌剤には、抗癌抗体（例え
ば、上記の表１、２および３に記載の抗体のいずれか）、小分子抗癌剤などが含まれるが
、これらに限定されない。
て個体に投与される。そのような投与は、複合体および第２の薬剤を同時に投与すること
、または複合体および第２の薬剤を順次投与することを含み得る。いくつかの実施形態で
は、個体は癌を有し、第２の治療剤は抗癌剤である。目的の抗癌剤には、抗癌抗体（例え
ば、上記の表１、２および３に記載の抗体のいずれか）、小分子抗癌剤などが含まれるが
、これらに限定されない。
【0091】
いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）
、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ
）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ
）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、
テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、アキ
シチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（
ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、ダブラフェニブ
（ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌ
ｏｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎ
ｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ニロチ
ニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、パソパ二ブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎ
ａｔｉｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏ
ｌｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎ
ｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎ
ｉｂ）、エンザルタミド（ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルベストラント（ｆｕｌｖｅ
ｓｔｒａｎｔ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イキサベピロン（ｉｘａｂｅ
ｐｉｌｏｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）、ビスモードジブ（ｖｉｓｍｏｄ
ｅｇｉｂ）、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔ
ｒｅｘｅｄ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆ
ｉｌｚｏｍｉｂ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓ
ｉｒｏｌｉｍｕｓ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、オマセタキシン（ｏｍａｃｅｔ
ａｘｉｎｅ）、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄ
ｏｍｉｄｅ）、ポマリドミド（ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ロミデプシン（ｒｏｍｉｄ
ｅｐｓｉｎ）、ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ブリガチニブ（ｂｒｉｇａｔ
ｉｎｉｂ）、リボシクリブ（ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ）、ミドスタウリン（ｍｉｄｏｓｔａ
ｕｒｉｎ）、テロトリスタットエチル（ｔｅｌｏｔｒｉｓｔａｔｅｔｈｙｌ）、ニラパリ
ブ（ｎｉｒａｐａｒｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、レンバチニ
ブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ルカパリブ（ｒｕｃａｐａｒｉｂ）、グラニセトロン（ｇ
ｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）、ドロマビノール（ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ）、ベネトクラク（ｖ
ｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ（ｃｏｂｉ
ｍｅｔｉｎｉｂ）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、パルボシクリブ（
ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）、タリモジンラヘルパレプベク（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅｌａｈ
ｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、トリフルリジンおよ
びチピラシル（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｔｉｐｉｒａｃｉｌ）、イキサゾミ
ブ（ｉｘａｚｏｍｉｂ）、ソネイドギブ（ｓｏｎｉｄｅｇｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓ
ｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ロラピタント（ｒｏｌａｐｉｔａｎｔ）、ウリジントリアセテー
ト（ｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、トラベクテジン（ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ
）、ネツピタントおよびパロノセトロン（ｎｅｔｕｐｉｔａｎｔ ａｎｄ ｐａｌｏｎｏ
ｓｅｔｒｏｎ）、ベリノスタット（ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔ
ｉｎｉｂ）、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）、イデラリシブ（ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ）
、およびセリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）から選択される低分子抗癌剤である。
、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ベキサロテン（ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ
）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ
）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、
テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、アキ
シチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ボスチニブ（ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ）、カボザンチニブ（
ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）、ダブラフェニブ
（ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌ
ｏｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔｉｎ
ｉｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ニロチ
ニブ（ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ）、パソパ二ブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、ポナチニブ（ｐｏｎ
ａｔｉｎｉｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ、ルキソリチニブ（ｒｕｘｏ
ｌｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎ
ｉｂ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎ
ｉｂ）、エンザルタミド（ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ）、フルベストラント（ｆｕｌｖｅ
ｓｔｒａｎｔ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イキサベピロン（ｉｘａｂｅ
ｐｉｌｏｎｅ）、ネララビン（ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）、ビスモードジブ（ｖｉｓｍｏｄ
ｅｇｉｂ）、カバジタキセル（ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔ
ｒｅｘｅｄ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆ
ｉｌｚｏｍｉｂ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓ
ｉｒｏｌｉｍｕｓ）、エリブリン（ｅｒｉｂｕｌｉｎ）、オマセタキシン（ｏｍａｃｅｔ
ａｘｉｎｅ）、トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄ
ｏｍｉｄｅ）、ポマリドミド（ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ロミデプシン（ｒｏｍｉｄ
ｅｐｓｉｎ）、ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ブリガチニブ（ｂｒｉｇａｔ
ｉｎｉｂ）、リボシクリブ（ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ）、ミドスタウリン（ｍｉｄｏｓｔａ
ｕｒｉｎ）、テロトリスタットエチル（ｔｅｌｏｔｒｉｓｔａｔｅｔｈｙｌ）、ニラパリ
ブ（ｎｉｒａｐａｒｉｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、レンバチニ
ブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ルカパリブ（ｒｕｃａｐａｒｉｂ）、グラニセトロン（ｇ
ｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）、ドロマビノール（ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ）、ベネトクラク（ｖ
ｅｎｅｔｏｃｌａｘ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ（ｃｏｂｉ
ｍｅｔｉｎｉｂ）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、パルボシクリブ（
ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）、タリモジンラヘルパレプベク（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅｌａｈ
ｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、トリフルリジンおよ
びチピラシル（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｔｉｐｉｒａｃｉｌ）、イキサゾミ
ブ（ｉｘａｚｏｍｉｂ）、ソネイドギブ（ｓｏｎｉｄｅｇｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓ
ｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、ロラピタント（ｒｏｌａｐｉｔａｎｔ）、ウリジントリアセテー
ト（ｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、トラベクテジン（ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ
）、ネツピタントおよびパロノセトロン（ｎｅｔｕｐｉｔａｎｔ ａｎｄ ｐａｌｏｎｏ
ｓｅｔｒｏｎ）、ベリノスタット（ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、イブルチニブ（ｉｂｒｕｔ
ｉｎｉｂ）、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）、イデラリシブ（ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ）
、およびセリチニブ（ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ）から選択される低分子抗癌剤である。
【0092】
特定の態様では、第２の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。目的の免疫チ
ェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３
、またはＢ７ファミリーのメンバーを標的とする阻害剤（例えば、抗体）が含まれるが、
これらに限定されない。
ェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３
、またはＢ７ファミリーのメンバーを標的とする阻害剤（例えば、抗体）が含まれるが、
これらに限定されない。
【0093】
特定の実施形態によれば、複合体および第２の治療剤は、個々の使用のために認可され
た投薬レジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、第２の治療剤の投与は、
複合体が第２の治療剤の投与なしで投与される場合に使用されるのと比較して、１回以上
の低用量および／または低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を伴う投薬レジ
メンに従って投与されるよう、複合体を個体に投与することを可能にする。特定の態様で
は、複合体の投与は、第２の治療剤が複合体の投与なしで投与される場合に利用されるの
と比較して、個体に投与される第２の治療剤が、１回以上のより低用量および／またはよ
り低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を含む投与レジメンに従って投与され
ることを可能にする。
た投薬レジメンに従って投与される。いくつかの実施形態では、第２の治療剤の投与は、
複合体が第２の治療剤の投与なしで投与される場合に使用されるのと比較して、１回以上
の低用量および／または低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を伴う投薬レジ
メンに従って投与されるよう、複合体を個体に投与することを可能にする。特定の態様で
は、複合体の投与は、第２の治療剤が複合体の投与なしで投与される場合に利用されるの
と比較して、個体に投与される第２の治療剤が、１回以上のより低用量および／またはよ
り低頻度の投与、および／またはサイクル数の減少を含む投与レジメンに従って投与され
ることを可能にする。
【0094】
特定の態様では、併用投与される薬剤の所望の相対的投薬レジメンは、例えばエクスビ
ボ、インビボおよび／またはインビトロモデルを使用して、経験的に評価または決定され
てもよい。いくつかの実施形態では、そのような評価または経験的決定は、インビボ、患
者集団において（例えば、相関が確立されるように）、または代わりに特定の対象の個体
において行われる。
ボ、インビボおよび／またはインビトロモデルを使用して、経験的に評価または決定され
てもよい。いくつかの実施形態では、そのような評価または経験的決定は、インビボ、患
者集団において（例えば、相関が確立されるように）、または代わりに特定の対象の個体
において行われる。
【0095】
特定の態様では、複合体および第２の治療剤の１つ以上の用量は、個体に同時に投与さ
れる。そのようないくつかの実施形態では、そのような薬剤は、同じ薬学的組成物中に存
在して投与され得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、複合体および第２の治療
剤は、異なる組成でおよび／または異なる時間に個体に投与される。例えば、複合体は、
第２の治療剤の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。あるいは、
第２の治療剤は、複合体の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。
投与されるべき第２の薬剤は、投与されるべき第１の薬剤投与後の少なくとも１時間後、
３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または最長５
日以上後に開始する期間に投与されてもよい。
れる。そのようないくつかの実施形態では、そのような薬剤は、同じ薬学的組成物中に存
在して投与され得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、複合体および第２の治療
剤は、異なる組成でおよび／または異なる時間に個体に投与される。例えば、複合体は、
第２の治療剤の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。あるいは、
第２の治療剤は、複合体の投与の前に（例えば、特定のサイクルで）投与されてもよい。
投与されるべき第２の薬剤は、投与されるべき第１の薬剤投与後の少なくとも１時間後、
３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、または最長５
日以上後に開始する期間に投与されてもよい。
【0096】
キット
上記に要約したように、本開示はキットを提供する。特定の実施形態によれば、キット
は、本開示の複合体または組成物のいずれかを含む。キットは、例えば、本開示の方法を
実施する際に、用途を見出す。例えば、本方法を実施するためのキットは、単位用量（例
えば、アンプル）または複数用量形態で存在する、本開示の組成物の量を含んでもよい。
したがって、特定の実施形態では、キットは、本開示の複合体を含む組成物の１つ以上の
（例えば、２つ以上の）単位用量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位用量」という
用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象の単一の投与量として適切な物
理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された、
所定量の組成物を含有する。単位用量の量は、使用される特定の複合体、達成されるべき
効果、および対象における複合体に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに
他の実施形態では、キットは組成物の単一の複数投与量を含み得る。
上記に要約したように、本開示はキットを提供する。特定の実施形態によれば、キット
は、本開示の複合体または組成物のいずれかを含む。キットは、例えば、本開示の方法を
実施する際に、用途を見出す。例えば、本方法を実施するためのキットは、単位用量（例
えば、アンプル）または複数用量形態で存在する、本開示の組成物の量を含んでもよい。
したがって、特定の実施形態では、キットは、本開示の複合体を含む組成物の１つ以上の
（例えば、２つ以上の）単位用量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位用量」という
用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象の単一の投与量として適切な物
理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された、
所定量の組成物を含有する。単位用量の量は、使用される特定の複合体、達成されるべき
効果、および対象における複合体に関連する薬力学などの様々な要因に依存する。さらに
他の実施形態では、キットは組成物の単一の複数投与量を含み得る。
【0097】
キットの成分は、別々の容器に存在してもよく、または複数の成分が単一の容器に存在
してもよい。適切な容器は、単一チューブ（例えば、バイアル）、プレートの１つ以上の
ウェル（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などを含む。
してもよい。適切な容器は、単一チューブ（例えば、バイアル）、プレートの１つ以上の
ウェル（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などを含む。
【0098】
特定の実施形態によれば、本開示のキットは、それを必要とする個体を治療するために
組成物を使用するための説明書を含む。説明書は、適切な記録媒体に記録することができ
る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そ
のようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構
成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態
では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット
などの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存
在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットには存在しないが、例えばイン
ターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この
実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードで
きるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、
適切な基材上に記録される。
組成物を使用するための説明書を含む。説明書は、適切な記録媒体に記録することができ
る。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そ
のようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構
成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態
では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット
などの適切なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存
在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットには存在しないが、例えばイン
ターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この
実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードで
きるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、
適切な基材上に記録される。
【0099】
以下の実施例は例示のために提供され、限定するものではない。
【実施例】
【0100】
実験
物質および方法
ＰＢＳ緩衝液、ＤＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地および熱不活性化
ウシ胎仔血清を、Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから得た。Ｘ－ＶＩＶＯ１５無血
清培地はＬｏｎｚａから購入した。ＬＢ寒天、２ｘＹＴおよび抗生物質－抗真菌剤はＦｉ
ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのための４～１２％Ｂｉ
ｓ－ＴｒｉｓゲルはＢｉｏ－Ｒａｄから購入した。熱不活性化ヒト雄性ＡＢ血清は、Ｓｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヒト組換えＩＬ－２、ヒト組換えＩＬ－４、およ
びヒト組換えＩＬ－１３はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。アルデヒドタグを有するヒ
ト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧは、Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｅ
ｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からの寄贈品であった。吸光スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｍａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。Ｐｉｅｒｃ
ｅ大容量エンドトキシン除去スピンカラム、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ発色性エンドトキシン
定量キットおよびＬＤＨ細胞傷害性アッセイキットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）およびアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミ
ノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）をＢｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した
。ジベンゾシクロオクチン－テトラポリエチレングリコール－マレイミド（ＤＢＣＯ－Ｐ
ＥＧ４－マレイミド）をＣｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓから購入した。Ｂ
ｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から２’－（４－メチルウンベ
リフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）を入手した。他
の化学物質はすべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく使
用した。
物質および方法
ＰＢＳ緩衝液、ＤＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地および熱不活性化
ウシ胎仔血清を、Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから得た。Ｘ－ＶＩＶＯ１５無血
清培地はＬｏｎｚａから購入した。ＬＢ寒天、２ｘＹＴおよび抗生物質－抗真菌剤はＦｉ
ｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのための４～１２％Ｂｉ
ｓ－ＴｒｉｓゲルはＢｉｏ－Ｒａｄから購入した。熱不活性化ヒト雄性ＡＢ血清は、Ｓｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ヒト組換えＩＬ－２、ヒト組換えＩＬ－４、およ
びヒト組換えＩＬ－１３はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。アルデヒドタグを有するヒ
ト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧは、Ｃａｔａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｅ
ｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からの寄贈品であった。吸光スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｍａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。Ｐｉｅｒｃ
ｅ大容量エンドトキシン除去スピンカラム、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ発色性エンドトキシン
定量キットおよびＬＤＨ細胞傷害性アッセイキットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）およびアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミ
ノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）をＢｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した
。ジベンゾシクロオクチン－テトラポリエチレングリコール－マレイミド（ＤＢＣＯ－Ｐ
ＥＧ４－マレイミド）をＣｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓから購入した。Ｂ
ｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から２’－（４－メチルウンベ
リフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）を入手した。他
の化学物質はすべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく使
用した。
【0101】
以下の抗体および組換えタンパク質を使用した：シグレック－７－Ｆｃキメラ、シグレ
ック－９－Ｆｃキメラ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラタンパク質、ＡＦ４８８標識抗シグレッ
ク－７ｍＡｂ（クローン１９４２１１）および遮断性抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂ（クローン１４
９８１０）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。フルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンは、ＥＹ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２ｍＡｂ（クローン２４Ｄ２）
、ＡＦ６４７標識抗ＣＤ１６ｍＡｂ（クローン３Ｇ８）、ＡＦ６４７標識抗ＣＤ５６ｍＡ
ｂ（クローンＨＣＤ５６）、遮断性抗シグレック－７ｍＡｂ（クローンＳ７．７）、遮断
性抗シグレック－９ｍＡｂ（クローンＫ８）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。ＴＲＩ
ＴＣ標識抗ＦｃｍＡｂはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
ＦＩＴＣ標識ＣＤ３ｍＡｂ（クローンＢＷ２６４／５６）をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔ
ｅｃから購入した。Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧは、Ｃａｔ
ａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からの
寄贈品であった。
ック－９－Ｆｃキメラ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラタンパク質、ＡＦ４８８標識抗シグレッ
ク－７ｍＡｂ（クローン１９４２１１）および遮断性抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂ（クローン１４
９８１０）をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。フルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンは、ＥＹ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２ｍＡｂ（クローン２４Ｄ２）
、ＡＦ６４７標識抗ＣＤ１６ｍＡｂ（クローン３Ｇ８）、ＡＦ６４７標識抗ＣＤ５６ｍＡ
ｂ（クローンＨＣＤ５６）、遮断性抗シグレック－７ｍＡｂ（クローンＳ７．７）、遮断
性抗シグレック－９ｍＡｂ（クローンＫ８）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから入手した。ＴＲＩ
ＴＣ標識抗ＦｃｍＡｂはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
ＦＩＴＣ標識ＣＤ３ｍＡｂ（クローンＢＷ２６４／５６）をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔ
ｅｃから購入した。Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧは、Ｃａｔ
ａｌｅｎｔ Ｐｈａｒｍａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からの
寄贈品であった。
【0102】
細胞株および細胞培養：
乳癌細胞ＳＫＢＲ３、ＨＣＣ－１９５４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－１、Ｂ
Ｔ－２０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＳＫＢＲ３
、ＨＣＣ－１９５４、ＺＲ－７５－１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、１０％熱不活性化
ウシ胎児血清、０．４％抗生物質－抗真菌剤およびＬ－グルタミン（３００ｍｇ／Ｌ）を
添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で維持した。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ－２０、およ
びＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、０．４％抗生物質－抗真菌
剤、Ｌ－グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、Ｌ－グルタミン（５８４ｍｇ／Ｌ）およびピルビ
ン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／Ｌ）で補充したＤＭＥＭ培地で維持した。
乳癌細胞ＳＫＢＲ３、ＨＣＣ－１９５４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＺＲ－７５－１、Ｂ
Ｔ－２０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＳＫＢＲ３
、ＨＣＣ－１９５４、ＺＲ－７５－１およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、１０％熱不活性化
ウシ胎児血清、０．４％抗生物質－抗真菌剤およびＬ－グルタミン（３００ｍｇ／Ｌ）を
添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で維持した。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ－２０、およ
びＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、０．４％抗生物質－抗真菌
剤、Ｌ－グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、Ｌ－グルタミン（５８４ｍｇ／Ｌ）およびピルビ
ン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／Ｌ）で補充したＤＭＥＭ培地で維持した。
【0103】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康な血液バンクドナーから得て、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａ
ｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥ－１７－１４
４０－０２）密度勾配分離を用いて単離した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳＮＫ細胞単離キット（
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９２－６５７）およびＬＳカラム（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０４２－４０１）を使用して製造業者のプロトコー
ルに従って、ネガティブ選択によってＰＢＭＣから単離し、５％の熱不活性化ヒト雄性Ａ
Ｂ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロ
イキン－２（－２）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５中で使用前に一
晩培養した。ＮＫ細胞の濃縮は、９５％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞をもたらすよ
うにフローサイトメトリーによって確認した（図１６参照）。Ｐａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ
単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０９６－５３７）を用いてＰＢＭ
Ｃから単球を単離した。ＣＤ１６＋ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０９１－７６５）を用いてＣＤ１６＋単球をＰＢＭＣから単離した
。新鮮なＰＢＭＣを単離した後、血清フリーＲＰＭＩのＴ７５フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ１３６８０６５）中で新たに単離したＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ
２で２時間プレーティングした後、培地を除去し、単球を単離するためにリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ＋Ｃａ＋Ｍｇ）で細胞を３回洗浄することによって、Ｍ１およびＭ２分極マク
ロファージを獲得した。残りの単球をＲＰＭＩ＋２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清中で６
日間、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－０３）と
共にインキュベートし、続いて１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中で、１０
０ｎｇ／ｍＬの細菌性リポポリサッカライド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｔｌｒｌ－３ｐｅｌ
ｐｓ）および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－０２Ｂ
Ｃ）と共に４日間インキュベートすることにより、Ｍ１分極細胞を生成した。ＲＰＭＩ＋
２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清中で単球を５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐ
ｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－２５）と共に６日間インキュベートし、続いて２０ｎｇ／ｍＬ
の組換えヒトＩＬ－１３（担体を含まない）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ５７１１０２）および
１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－４（担体を含まない）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ５７４
００４）と共に４日間インキュベートすることによりＭ２分極マクロファージを生成した
。ヒトγδＴ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトガンマ／デルタＴ細胞単離キット（Ｓ
ｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ １９２５５）を用いたネガティブ選択によってＰＢＭＣから
単離した。
ｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥ－１７－１４
４０－０２）密度勾配分離を用いて単離した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳＮＫ細胞単離キット（
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９２－６５７）およびＬＳカラム（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０４２－４０１）を使用して製造業者のプロトコー
ルに従って、ネガティブ選択によってＰＢＭＣから単離し、５％の熱不活性化ヒト雄性Ａ
Ｂ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロ
イキン－２（－２）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５中で使用前に一
晩培養した。ＮＫ細胞の濃縮は、９５％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞をもたらすよ
うにフローサイトメトリーによって確認した（図１６参照）。Ｐａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ
単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０９６－５３７）を用いてＰＢＭ
Ｃから単球を単離した。ＣＤ１６＋ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ１３０－０９１－７６５）を用いてＣＤ１６＋単球をＰＢＭＣから単離した
。新鮮なＰＢＭＣを単離した後、血清フリーＲＰＭＩのＴ７５フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ１３６８０６５）中で新たに単離したＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ
２で２時間プレーティングした後、培地を除去し、単球を単離するためにリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ＋Ｃａ＋Ｍｇ）で細胞を３回洗浄することによって、Ｍ１およびＭ２分極マク
ロファージを獲得した。残りの単球をＲＰＭＩ＋２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清中で６
日間、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－０３）と
共にインキュベートし、続いて１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中で、１０
０ｎｇ／ｍＬの細菌性リポポリサッカライド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｔｌｒｌ－３ｐｅｌ
ｐｓ）および２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮγ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－０２Ｂ
Ｃ）と共に４日間インキュベートすることにより、Ｍ１分極細胞を生成した。ＲＰＭＩ＋
２０％の熱不活性化ウシ胎仔血清中で単球を５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐ
ｅｐｒｏＴｅｃｈ３００－２５）と共に６日間インキュベートし、続いて２０ｎｇ／ｍＬ
の組換えヒトＩＬ－１３（担体を含まない）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ５７１１０２）および
１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－４（担体を含まない）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ５７４
００４）と共に４日間インキュベートすることによりＭ２分極マクロファージを生成した
。ヒトγδＴ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトガンマ／デルタＴ細胞単離キット（Ｓ
ｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ １９２５５）を用いたネガティブ選択によってＰＢＭＣから
単離した。
【0104】
ＦＡＣＳ分析：
細胞を、シアリダーゼ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、またはＰ
ＢＳコントロールと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、
抗体、溶液中で予め二次抗Ｆｃ抗体と複合物形成させた受容体－Ｆｃ融合タンパク質、ま
たはＦＩＴＣ標識ＳＮＡレクチンから選択されたプローブを含む、０．５％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含む冷ＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。細胞および抗体／融合タンパク
質を暗所で３０分間４℃でインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄した
後、細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで培養し、次いでフローサイトメトリーで分析
した。すべてのフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０．０（Ｔｒｅｅ
Ｓｔａｒ）を使用して分析した。
細胞を、シアリダーゼ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、またはＰ
ＢＳコントロールと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、
抗体、溶液中で予め二次抗Ｆｃ抗体と複合物形成させた受容体－Ｆｃ融合タンパク質、ま
たはＦＩＴＣ標識ＳＮＡレクチンから選択されたプローブを含む、０．５％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含む冷ＰＢＳ中に細胞を再懸濁した。細胞および抗体／融合タンパク
質を暗所で３０分間４℃でインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄した
後、細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで培養し、次いでフローサイトメトリーで分析
した。すべてのフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０．０（Ｔｒｅｅ
Ｓｔａｒ）を使用して分析した。
【0105】
シアリダーゼの発現および精製：
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＶＤ３６４
で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００は、イリノイ大学アーバ
ナシャンペーン校のＥｒｉｃ Ｒ．Ｖｉｍｒ教授から寄贈品であった。３７℃で１２時間
、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２ｘＹＴ培地で細胞を増殖させた。イン
キュベートした後、４，７００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を収集した。ペレ
ットを浸透圧ショック緩衝液（２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのＴｒｉ
ｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１０分間穏やかに振とうした。細胞を遠心
分離（９，０００×ｇで１０分間）によって収集し、ペレットを氷冷した純水に再懸濁し
た。４℃で１０分間インキュベートした後、９，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清
を得た。タンパク質を精製するために、サンプルをＡｍｉｃｏｎ限外濾過装置（膜分子質
量カットオフ、３０，０００Ｄａ）を用いてさらに濃縮し、０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で再構成し、ＨｉｔｒａｐＱ－ＨＰ陰イオン交換体カラム（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－１１５４－０１）にロ
ードした。タンパク質を０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中のＮａＣ
ｌの勾配で流速５ｍＬ／分で溶出した。クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ
－ＰＡＧＥにより決定した予想される分子質量を有するタンパク質画分を集めてプールし
た。エンドトキシンは、高容量エンドトキシン除去スピンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８２７５）を使用して除去し、サンプルのエンドトキ
シン濃度をＬＡＬ発色性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８２８２）によって測定した。
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＶＤ３６４
で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００は、イリノイ大学アーバ
ナシャンペーン校のＥｒｉｃ Ｒ．Ｖｉｍｒ教授から寄贈品であった。３７℃で１２時間
、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２ｘＹＴ培地で細胞を増殖させた。イン
キュベートした後、４，７００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を収集した。ペレ
ットを浸透圧ショック緩衝液（２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのＴｒｉ
ｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、室温で１０分間穏やかに振とうした。細胞を遠心
分離（９，０００×ｇで１０分間）によって収集し、ペレットを氷冷した純水に再懸濁し
た。４℃で１０分間インキュベートした後、９，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清
を得た。タンパク質を精製するために、サンプルをＡｍｉｃｏｎ限外濾過装置（膜分子質
量カットオフ、３０，０００Ｄａ）を用いてさらに濃縮し、０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で再構成し、ＨｉｔｒａｐＱ－ＨＰ陰イオン交換体カラム（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－１１５４－０１）にロ
ードした。タンパク質を０．０２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中のＮａＣ
ｌの勾配で流速５ｍＬ／分で溶出した。クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ
－ＰＡＧＥにより決定した予想される分子質量を有するタンパク質画分を集めてプールし
た。エンドトキシンは、高容量エンドトキシン除去スピンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８２７５）を使用して除去し、サンプルのエンドトキ
シン濃度をＬＡＬ発色性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８２８２）によって測定した。
【0106】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ遺伝子を、Ｎ末端ヘキサ
ヒスチジンタグおよびＣ末端アルデヒドタグ（ＳＬＣＴＰＳＲＧＳ）を有するｐＥＴ１５
１ベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ
Ｃ２５２７Ｈ）に形質転換した。細胞を、０．６の光学密度に達するまで３７℃でアンピ
シリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２ｘＹＴ培地で増殖させ、次いで０．３ｍＭのＩ
ＰＴＧを添加し、細胞を３７℃で１６時間振とうしながら増殖させた。インキュベートし
た後、４，７００×ｇ、１０分間の遠心分離によって細胞を収集した。ペレットを５０ｍ
Ｌの溶解緩衝液（リン酸緩衝食塩水（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＴ２１０
４０ｃｖ）＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋１０ｍＭイミダゾールに再懸濁した。プロテアーゼ阻
害剤錠剤（Ｓｉｇｍａ５８９２９７０００１）および１μＬのヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｒｃｅ ８８７０２）を加え、溶解緩衝液中で細胞を
４℃で２時間振とうさせた。細胞を、ホモジナイザーを介して溶解し、２５０ｍＭイミダ
ゾール溶出を伴うニッケル－ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ８８２２１）を
用いて精製した。クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定
した予想される分子質量を有するタンパク質画分を集めてプールした。エンドトキシンは
、高容量エンドトキシン除去スピンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、８８２７５）を使用して除去し、サンプルのエンドトキシン濃度をＬＡＬ発色
性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８
８２８２）によって測定した。
ヒスチジンタグおよびＣ末端アルデヒドタグ（ＳＬＣＴＰＳＲＧＳ）を有するｐＥＴ１５
１ベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ
Ｃ２５２７Ｈ）に形質転換した。細胞を、０．６の光学密度に達するまで３７℃でアンピ
シリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２ｘＹＴ培地で増殖させ、次いで０．３ｍＭのＩ
ＰＴＧを添加し、細胞を３７℃で１６時間振とうしながら増殖させた。インキュベートし
た後、４，７００×ｇ、１０分間の遠心分離によって細胞を収集した。ペレットを５０ｍ
Ｌの溶解緩衝液（リン酸緩衝食塩水（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＴ２１０
４０ｃｖ）＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋１０ｍＭイミダゾールに再懸濁した。プロテアーゼ阻
害剤錠剤（Ｓｉｇｍａ５８９２９７０００１）および１μＬのヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍ
ｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ｐｉｅｒｃｅ ８８７０２）を加え、溶解緩衝液中で細胞を
４℃で２時間振とうさせた。細胞を、ホモジナイザーを介して溶解し、２５０ｍＭイミダ
ゾール溶出を伴うニッケル－ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ８８２２１）を
用いて精製した。クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定
した予想される分子質量を有するタンパク質画分を集めてプールした。エンドトキシンは
、高容量エンドトキシン除去スピンキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ、８８２７５）を使用して除去し、サンプルのエンドトキシン濃度をＬＡＬ発色
性エンドトキシン定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８
８２８２）によって測定した。
【0107】
ＭｕＮｅｕＮＡｃを用いるシアリダーゼの活性アッセイ：
Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に０．１ｍＭの２’－
（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡ
ｃ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を含有する５０μＬの
溶液に、５μＬのシアリダーゼ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液に３０～
６０ｎＭ、ｐＨ７．０）を添加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、混合物を
１５０μＬの０．１Ｍグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）で希釈した。蛍光分光
光度計（励起３６０ｎｍ；発光４４０ｎｍ）で蛍光を読み取った。活性はＵ／ｍｇとして
報告され、単位は、ｐＨ７のＤＰＢＳ緩衝液中で１分当たり１μｍｏｌのメチルウンベリ
フェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。
Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に０．１ｍＭの２’－
（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡ
ｃ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を含有する５０μＬの
溶液に、５μＬのシアリダーゼ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液に３０～
６０ｎＭ、ｐＨ７．０）を添加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、混合物を
１５０μＬの０．１Ｍグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．４）で希釈した。蛍光分光
光度計（励起３６０ｎｍ；発光４４０ｎｍ）で蛍光を読み取った。活性はＵ／ｍｇとして
報告され、単位は、ｐＨ７のＤＰＢＳ緩衝液中で１分当たり１μｍｏｌのメチルウンベリ
フェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。
【0108】
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの調製：
精製したＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含
むＤＰＢＳ緩衝液中の２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を４℃で一晩、１２当量のビシクロノ
ニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）と反応させた。過剰の
リンカーをＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を用いて除去した。標識の程度は、ＥＳＩ－ＭＳによっ
て決定した（図６Ｂ参照）。前述の通り、Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧを作製した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、まず、３７℃で１０日間、ｐＨ
４．５の１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液において、Ｃ末端アルデヒドタグ（１２０
μＭ）を有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧをアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド
（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）（１０ｍＭ）に結合させ、続いて、ＰＤ－１０脱塩カラ
ム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１
）を使用して、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（ｐＨ７．０）を有するＤＰＢＳ緩衝液へと緩衝
液交換を行うことにより調製した。次いで、得られた複合体を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋
（ｐＨ７．０）を含むＤＰＢＳ緩衝液中の総タンパク質濃度１２０ｍｇ／ｍＬで１：２８
のモル比で標識シアリダーゼに結合させた。室温で３日間インキュベートした後、抗Ｈｅ
ｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａをサイズ排除クロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００により精
製した。精製した生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびＥＳＩ－ＭＳで分析した。
精製したＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含
むＤＰＢＳ緩衝液中の２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を４℃で一晩、１２当量のビシクロノ
ニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）と反応させた。過剰の
リンカーをＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を用いて除去した。標識の程度は、ＥＳＩ－ＭＳによっ
て決定した（図６Ｂ参照）。前述の通り、Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧを作製した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、まず、３７℃で１０日間、ｐＨ
４．５の１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液において、Ｃ末端アルデヒドタグ（１２０
μＭ）を有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧをアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド
（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）（１０ｍＭ）に結合させ、続いて、ＰＤ－１０脱塩カラ
ム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１
）を使用して、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（ｐＨ７．０）を有するＤＰＢＳ緩衝液へと緩衝
液交換を行うことにより調製した。次いで、得られた複合体を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋
（ｐＨ７．０）を含むＤＰＢＳ緩衝液中の総タンパク質濃度１２０ｍｇ／ｍＬで１：２８
のモル比で標識シアリダーゼに結合させた。室温で３日間インキュベートした後、抗Ｈｅ
ｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａをサイズ排除クロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００により精
製した。精製した生成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびＥＳＩ－ＭＳで分析した。
【0109】
精製Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ（Ｃａ２＋およびＭ
ｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液中３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を２０当量のＤＢＣＯ－ＰＥ
Ｇ４－マレイミドと４℃で一晩反応させた。過剰のリンカーをＰＤ－１０脱塩カラム（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を用
いて除去した。標識の程度はＥＳＩ－ＭＳによって決定した（図６Ｂ参照）。前述の通り
、Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧを作製した。抗Ｈｅｒ２－Ｉ
ｇＧ－Ｓｉａは、まず、３７℃で１０日間、ｐＨ４．５の１００ｍＭの酢酸アンモニウム
緩衝液において、Ｃ末端アルデヒドタグ（１２０μＭ）を有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧをア
ミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）（１０
ｍＭ）に結合させ、続いて、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を使用して、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋
（ｐＨ７．０）を有するＤＰＢＳ緩衝液へと緩衝液交換を行うことにより調製した。次い
で、得られた複合体を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（ｐＨ７．０）を含むＤＰＢＳ緩衝液中
の総タンパク質濃度２５ｍｇ／ｍＬで１：１４のモル比で標識シアリダーゼに結合させた
。室温で３日間インキュベートした後、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａをサイズ排除クロマ
トグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。精製した生成物をＳＤＳ－ＰＡＧ
ＥゲルおよびＥＳＩ－ＭＳで分析した。
ｇ２＋を含むＤＰＢＳ緩衝液中３ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を２０当量のＤＢＣＯ－ＰＥ
Ｇ４－マレイミドと４℃で一晩反応させた。過剰のリンカーをＰＤ－１０脱塩カラム（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を用
いて除去した。標識の程度はＥＳＩ－ＭＳによって決定した（図６Ｂ参照）。前述の通り
、Ｃ末端アルデヒドタグを有するヒト化抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧを作製した。抗Ｈｅｒ２－Ｉ
ｇＧ－Ｓｉａは、まず、３７℃で１０日間、ｐＨ４．５の１００ｍＭの酢酸アンモニウム
緩衝液において、Ｃ末端アルデヒドタグ（１２０μＭ）を有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧをア
ミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥＧ－Ｎ３）（１０
ｍＭ）に結合させ、続いて、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－０８５１－０１）を使用して、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋
（ｐＨ７．０）を有するＤＰＢＳ緩衝液へと緩衝液交換を行うことにより調製した。次い
で、得られた複合体を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（ｐＨ７．０）を含むＤＰＢＳ緩衝液中
の総タンパク質濃度２５ｍｇ／ｍＬで１：１４のモル比で標識シアリダーゼに結合させた
。室温で３日間インキュベートした後、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａをサイズ排除クロマ
トグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。精製した生成物をＳＤＳ－ＰＡＧ
ＥゲルおよびＥＳＩ－ＭＳで分析した。
【0110】
細胞傷害性アッセイ：
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、単球、ＣＤ１６＋単球、Ｍ１マクロファー
ジ、またはＭ２マクロファージのＡＤＣＣ活性の結果としての、乳癌細胞からの乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）放出を測定することによって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を分
析した。腫瘍細胞（標的細胞）を、シアリダーゼまたはｍＡｂの存在下または非存在下で
、三重に、種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比でＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球またはマ
クロファージ（エフェクター細胞）と共にインキュベートした。典型的な実験では、１０
０μＬのエフェクター細胞を１００μＬの標的細胞を含むＶ底９６ウェルプレートに２×
１０５細胞／ｍＬで添加した。４時間後、上清を回収し、細胞傷害性アッセイキット（Ｔ
ｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８９５４）を用いて、製造者のプ
ロトコールに従ってＬＤＨ放出を測定した。４９０ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭ
ａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。特異的溶解は、１０
０×（実験的－エフェクター細胞自然放出－標的細胞自然放出）／（標的細胞最大放出－
標的細胞自然放出）として計算した。
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、単球、ＣＤ１６＋単球、Ｍ１マクロファー
ジ、またはＭ２マクロファージのＡＤＣＣ活性の結果としての、乳癌細胞からの乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）放出を測定することによって、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を分
析した。腫瘍細胞（標的細胞）を、シアリダーゼまたはｍＡｂの存在下または非存在下で
、三重に、種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比でＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球またはマ
クロファージ（エフェクター細胞）と共にインキュベートした。典型的な実験では、１０
０μＬのエフェクター細胞を１００μＬの標的細胞を含むＶ底９６ウェルプレートに２×
１０５細胞／ｍＬで添加した。４時間後、上清を回収し、細胞傷害性アッセイキット（Ｔ
ｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８８９５４）を用いて、製造者のプ
ロトコールに従ってＬＤＨ放出を測定した。４９０ｎｍでの吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭ
ａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。特異的溶解は、１０
０×（実験的－エフェクター細胞自然放出－標的細胞自然放出）／（標的細胞最大放出－
標的細胞自然放出）として計算した。
【0111】
蛍光顕微鏡：
複合体のＨＥＲ２特異的酵素活性の視覚化のために、細胞をＰＢＳ緩衝液中で種々の濃
度の抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａと３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し
た後、細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。固定した細胞を
０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄し、続いて０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロ
ッキングした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳ中で、ＦＩＴＣ標識ＳＮＡ（１：１００）および
ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２抗体（１：１００）と共に、暗所室温で３０分間、穏やかに振
とうしながら細胞をインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄した後、Ｄ
ＡＰＩ（１０ｍＭストックからの１：１２５０希釈）をＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋共鳴走査共
焦点顕微鏡で画像化する直前に加えた。
複合体のＨＥＲ２特異的酵素活性の視覚化のために、細胞をＰＢＳ緩衝液中で種々の濃
度の抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａと３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し
た後、細胞を、４％ホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。固定した細胞を
０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄し、続いて０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロ
ッキングした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳ中で、ＦＩＴＣ標識ＳＮＡ（１：１００）および
ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２抗体（１：１００）と共に、暗所室温で３０分間、穏やかに振
とうしながら細胞をインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３回洗浄した後、Ｄ
ＡＰＩ（１０ｍＭストックからの１：１２５０希釈）をＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋共鳴走査共
焦点顕微鏡で画像化する直前に加えた。
【0112】
ＮＫ腫瘍細胞シナプスの視覚化のために、腫瘍細胞をＰＢＳ緩衝液中の６ｎＭの抗Ｈｅ
ｒ２－ＩｇＧまたは６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａと共に３７℃で１時間インキュ
ベートした。新たに単離されたＮＫ細胞を２：１のＥ／Ｔ比で腫瘍細胞に添加し、３７℃
で１５分間一緒にインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で２０分間、Ｐ
ＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３
回洗浄し、続いて０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。細胞を、ＰＢ
Ｓ緩衝液中でＡＦ４８８標識抗シグレック７（１：１００）、ＴＲＩＴＣ標識抗Ｆｃ（１
：４００）、およびＡＦ６４７標識抗ＣＤ１６＋（１：１００）の混合物と共に３０分間
暗所で穏やかに振とうしながら室温でインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３
回洗浄した後、ＤＡＰＩ（１０ｍＭストックからの１：１２５０希釈）をＮｉｋｏｎ Ａ
１Ｒ＋共鳴走査共焦点顕微鏡で画像化する直前に加えた。
ｒ２－ＩｇＧまたは６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａと共に３７℃で１時間インキュ
ベートした。新たに単離されたＮＫ細胞を２：１のＥ／Ｔ比で腫瘍細胞に添加し、３７℃
で１５分間一緒にインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で２０分間、Ｐ
ＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３
回洗浄し、続いて０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。細胞を、ＰＢ
Ｓ緩衝液中でＡＦ４８８標識抗シグレック７（１：１００）、ＴＲＩＴＣ標識抗Ｆｃ（１
：４００）、およびＡＦ６４７標識抗ＣＤ１６＋（１：１００）の混合物と共に３０分間
暗所で穏やかに振とうしながら室温でインキュベートした。０．５％ＢＳＡのＰＢＳで３
回洗浄した後、ＤＡＰＩ（１０ｍＭストックからの１：１２５０希釈）をＮｉｋｏｎ Ａ
１Ｒ＋共鳴走査共焦点顕微鏡で画像化する直前に加えた。
【0113】
統計分析
統計解析はＰｒｉｓｍ６を用いて行った。データは、３回の実験の平均±ＳＤとして示
され、有意性は、別段の記載がない限り、ｔ検定を用いて決定された。＊＊＝ｐ＜０．０
０５、＊＝ｐ＜０．０５、およびｐ値＞０．０５を有意とみなした。
統計解析はＰｒｉｓｍ６を用いて行った。データは、３回の実験の平均±ＳＤとして示
され、有意性は、別段の記載がない限り、ｔ検定を用いて決定された。＊＊＝ｐ＜０．０
０５、＊＝ｐ＜０．０５、およびｐ値＞０．０５を有意とみなした。
【0114】
序文
十分に豊富である場合、シアル酸残基で終結するグリカンは、例えば補体因子Ｈの徴集
およびその後の代替物補体カスケードの下方制御などのいくつかの経路を介して、および
ほとんどのタイプの白血球で見られる免疫抑制性シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレッ
ク）を免疫学的シナプスにリクルートすることによって、免疫活性化を抑制する「健康な
自己」の兆候を作り出す。シアリル化状態は、免疫学的認識を誘発または回避する細胞の
能力において重要な役割を果たす。
十分に豊富である場合、シアル酸残基で終結するグリカンは、例えば補体因子Ｈの徴集
およびその後の代替物補体カスケードの下方制御などのいくつかの経路を介して、および
ほとんどのタイプの白血球で見られる免疫抑制性シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレッ
ク）を免疫学的シナプスにリクルートすることによって、免疫活性化を抑制する「健康な
自己」の兆候を作り出す。シアリル化状態は、免疫学的認識を誘発または回避する細胞の
能力において重要な役割を果たす。
【0115】
シアリル化されたグリカンのアップレギュレーションは、不良な予後および腫瘍の免疫
原性の低下と相関している。癌細胞の過シアル酸化は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性
（ＡＤＣＣ）の主要なメディエーターであるＮＫ細胞による免疫監視の回避に寄与する可
能性がある。シアル化グリカンの高密度集団は、ＮＫ細胞関連のシグレック－７および／
またはシグレック－９を免疫シナプスにリクルートすることができる（図１）。ＰＤ－１
と同様に、これらのシグレックは、活性化ＮＫ細胞受容体からのシグナルの抑制を媒介す
る、細胞質の免疫受容体チロシンベース抑制（ＩＴＩＭ）モチーフを有する（図１）。腫
瘍標的の操作された過シアル酸化は、シグレック－７依存的に、自然免疫ＮＫ細胞殺滅お
よびＡＤＣＣから保護的である。同様に、腫瘍細胞をシアリダーゼで処理することによる
シアル酸の酵素的除去は、遮断抗体によるシグレック－７またはシグレック－９の阻害と
同様に、ＮＫ細胞媒介殺傷を増強する。癌細胞グリカンのシアリル化はまた、ＮＫ活性化
受容体であるナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）とその同族リガンドとの相互作用を
破壊し、それによって腫瘍細胞からのＮＫ活性化シグナルを減少させる（図１）。逆に、
細胞表面シアル酸の除去は、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合を増加させることによってＮＫ細胞
活性化を増強する。したがって、腫瘍進行の微小進化過程において、過シアル酸化は、Ｎ
Ｋ活性化シグナルを減少させる一方、免疫シナプスから発するＮＫ抑制シグナルを増強す
ることによって選択的利点を提供する。
原性の低下と相関している。癌細胞の過シアル酸化は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性
（ＡＤＣＣ）の主要なメディエーターであるＮＫ細胞による免疫監視の回避に寄与する可
能性がある。シアル化グリカンの高密度集団は、ＮＫ細胞関連のシグレック－７および／
またはシグレック－９を免疫シナプスにリクルートすることができる（図１）。ＰＤ－１
と同様に、これらのシグレックは、活性化ＮＫ細胞受容体からのシグナルの抑制を媒介す
る、細胞質の免疫受容体チロシンベース抑制（ＩＴＩＭ）モチーフを有する（図１）。腫
瘍標的の操作された過シアル酸化は、シグレック－７依存的に、自然免疫ＮＫ細胞殺滅お
よびＡＤＣＣから保護的である。同様に、腫瘍細胞をシアリダーゼで処理することによる
シアル酸の酵素的除去は、遮断抗体によるシグレック－７またはシグレック－９の阻害と
同様に、ＮＫ細胞媒介殺傷を増強する。癌細胞グリカンのシアリル化はまた、ＮＫ活性化
受容体であるナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）とその同族リガンドとの相互作用を
破壊し、それによって腫瘍細胞からのＮＫ活性化シグナルを減少させる（図１）。逆に、
細胞表面シアル酸の除去は、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合を増加させることによってＮＫ細胞
活性化を増強する。したがって、腫瘍進行の微小進化過程において、過シアル酸化は、Ｎ
Ｋ活性化シグナルを減少させる一方、免疫シナプスから発するＮＫ抑制シグナルを増強す
ることによって選択的利点を提供する。
【0116】
シアル酸を用いたＮＫ活性化受容体およびＮＫ抑制性受容体を標的とする免疫回避戦略
を図１に概略的に示す。シアル酸を過剰発現する癌細胞では、過シアル酸付加グリカンは
ＮＫ抑制性受容体と相互作用し、ＮＫ細胞活性化の抑制をもたらす。抗体－シアリダーゼ
複合体による細胞表面シアル酸の除去は、シアリル化グリカンとＮＫ抑制性受容体との相
互作用を無効にし、ＮＫ活性化受容体とそのリガンドとの結合を増加させ、それによって
ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対する腫瘍細胞感受性を高める。
を図１に概略的に示す。シアル酸を過剰発現する癌細胞では、過シアル酸付加グリカンは
ＮＫ抑制性受容体と相互作用し、ＮＫ細胞活性化の抑制をもたらす。抗体－シアリダーゼ
複合体による細胞表面シアル酸の除去は、シアリル化グリカンとＮＫ抑制性受容体との相
互作用を無効にし、ＮＫ活性化受容体とそのリガンドとの結合を増加させ、それによって
ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対する腫瘍細胞感受性を高める。
【0117】
腫瘍特異的脱シアリル化は、ＮＫ細胞による腫瘍細胞溶解を増強する強力な介入であり
得ると結論づけられた。抗体－酵素複合体（ＡＥＣ：antibody-enzyme conjugate）は、
腫瘍細胞グリコカリックスを選択的に編集し、多くの抗体癌治療薬によって利用される治
療的に重要な機構であるＡＤＣＣによるＮＫ細胞殺滅を増強することができることがここ
に報告されている。組換えシアリダーゼを、ＨＥＲ２標的治療用モノクローナル抗体トラ
スツズマブに化学的に融合させた。抗体－シアリダーゼ複合体はＨＥＲ２依存的に腫瘍細
胞を脱シアリル化し、抑制性シグレックのリガンドを破壊しながらＮＫＧ２Ｄ結合を増強
し、トラスツズマブ単独と比較してＮＫ細胞殺滅を増幅した（図１）。
得ると結論づけられた。抗体－酵素複合体（ＡＥＣ：antibody-enzyme conjugate）は、
腫瘍細胞グリコカリックスを選択的に編集し、多くの抗体癌治療薬によって利用される治
療的に重要な機構であるＡＤＣＣによるＮＫ細胞殺滅を増強することができることがここ
に報告されている。組換えシアリダーゼを、ＨＥＲ２標的治療用モノクローナル抗体トラ
スツズマブに化学的に融合させた。抗体－シアリダーゼ複合体はＨＥＲ２依存的に腫瘍細
胞を脱シアリル化し、抑制性シグレックのリガンドを破壊しながらＮＫＧ２Ｄ結合を増強
し、トラスツズマブ単独と比較してＮＫ細胞殺滅を増幅した（図１）。
【0118】
実施例１－コレラ菌およびネズミチフス菌シアリダーゼの適性
トラスツズマブＡＥＣのための適切なシアリダーゼを同定するために、前述の通り、酵
素のパネルを発現および精製し（図３ＡおよびＢ）、この目的によく適したものとしてＶ
ｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシア
リダーゼを同定した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダ
ーゼは、前述の通り発現および精製された。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル
およびＥＳＩ－ＭＳによって測定した（図２Ｂ、２Ｅおよび図３Ｂ、ならびに図７Ａ、７
Ｆ）。およそ１５ｍｇの酵素を１リットルの培養細胞から精製し、すでに報告の蛍光発生
基質２’－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｍｕ
ＮｅｕＮＡｃ）で測定した場合、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅについては１０Ｕ／ｍｇ以上、お
よびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍについては１１４Ｕ／ｍｇ以上のインビトロ加水分解活
性を有し、ここで単位は、ＤＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）中、毎分１μｍｏｌのメチルウンベ
リフェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシア
リダーゼが細胞表面グリカンからシアル酸を効率的に除去できるかどうかを決定するため
に、細胞表面標識に対するその効果をＦＩＴＣ標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素
（ＳＮＡ）で試験した。同様に、シグレック－７、シグレック－９またはＮＫＧ２Ｄの外
部ドメインを含む受容体－Ｆｃキメラを用いて、細胞標識に対するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
処理の効果を評価した。シアリダーゼによる種々の腫瘍細胞系の３７℃で１時間の脱シア
リル化は、ＳＮＡならびにシグレック－７－Ｆｃおよびシグレック－９－Ｆｃキメラの結
合を有意に減少させた（図４）。ＳＮＡ結合の減少とともに、シアリダーゼ処理後の大部
分の乳癌細胞株について、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラの結合能の増加が観察された（図４Ｄ
）。
トラスツズマブＡＥＣのための適切なシアリダーゼを同定するために、前述の通り、酵
素のパネルを発現および精製し（図３ＡおよびＢ）、この目的によく適したものとしてＶ
ｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシア
リダーゼを同定した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダ
ーゼは、前述の通り発現および精製された。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル
およびＥＳＩ－ＭＳによって測定した（図２Ｂ、２Ｅおよび図３Ｂ、ならびに図７Ａ、７
Ｆ）。およそ１５ｍｇの酵素を１リットルの培養細胞から精製し、すでに報告の蛍光発生
基質２’－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｍｕ
ＮｅｕＮＡｃ）で測定した場合、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅについては１０Ｕ／ｍｇ以上、お
よびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍについては１１４Ｕ／ｍｇ以上のインビトロ加水分解活
性を有し、ここで単位は、ＤＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）中、毎分１μｍｏｌのメチルウンベ
リフェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシア
リダーゼが細胞表面グリカンからシアル酸を効率的に除去できるかどうかを決定するため
に、細胞表面標識に対するその効果をＦＩＴＣ標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ凝集素
（ＳＮＡ）で試験した。同様に、シグレック－７、シグレック－９またはＮＫＧ２Ｄの外
部ドメインを含む受容体－Ｆｃキメラを用いて、細胞標識に対するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ
処理の効果を評価した。シアリダーゼによる種々の腫瘍細胞系の３７℃で１時間の脱シア
リル化は、ＳＮＡならびにシグレック－７－Ｆｃおよびシグレック－９－Ｆｃキメラの結
合を有意に減少させた（図４）。ＳＮＡ結合の減少とともに、シアリダーゼ処理後の大部
分の乳癌細胞株について、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラの結合能の増加が観察された（図４Ｄ
）。
【0119】
抗体－シアリダーゼ複合体の調製および特徴付けを図２に示す。図２Ａは、抗体－ｖｉ
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ複合体の調製を概略的に示す。図２Ｂは、クマ
シー染色によって視覚化された非還元条件下（レーン３、４および５）および還元条件（
レーン６、７および８）におけるシアリダーゼ、トラスツズマブおよびシアリダーゼ－ト
ラスツズマブ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。染色済みタンパク質ラダー：レーン
１、２および９。図２Ｃは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼを有する抗体
シアリダーゼ複合体のＥＳＩ－ＭＳを示す。図２Ｄは、抗体－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ複合体の調製を概略的に示す。図２Ｅは、クマシー染
色によって視覚化された、非還元条件下（レーン３、４、５および６）でのシアリダーゼ
、ＤＢＣＯ改変シアリダーゼ、トラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合
体、および還元条件下（レーン７および８）でのトラスツズマブおよびトラスツズマブ－
シアリダーゼ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。染色済みタンパク質ラダー：レーン
１、２および９。図２Ｆは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダー
ゼとの抗体－シアリダーゼ複合体のＥＳＩ－ＭＳを示す。
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ複合体の調製を概略的に示す。図２Ｂは、クマ
シー染色によって視覚化された非還元条件下（レーン３、４および５）および還元条件（
レーン６、７および８）におけるシアリダーゼ、トラスツズマブおよびシアリダーゼ－ト
ラスツズマブ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。染色済みタンパク質ラダー：レーン
１、２および９。図２Ｃは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼを有する抗体
シアリダーゼ複合体のＥＳＩ－ＭＳを示す。図２Ｄは、抗体－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ複合体の調製を概略的に示す。図２Ｅは、クマシー染
色によって視覚化された、非還元条件下（レーン３、４、５および６）でのシアリダーゼ
、ＤＢＣＯ改変シアリダーゼ、トラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合
体、および還元条件下（レーン７および８）でのトラスツズマブおよびトラスツズマブ－
シアリダーゼ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。染色済みタンパク質ラダー：レーン
１、２および９。図２Ｆは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダー
ゼとの抗体－シアリダーゼ複合体のＥＳＩ－ＭＳを示す。
【0120】
図３は、シアリダーゼのパネルの特徴付けを示す。図３Ａは、基質２’－（４－メチル
ウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）上のシア
リダーゼの活性を示す。クマシー染色によって可視化した野生型ヒトノイラミニダーゼ２
、ヒトノイラミニダーゼ３、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍシアリダーゼ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、およびＡ．ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓシアリダーゼのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図３Ｂに示す。図３Ｃは、ＺＲ－７
５－１乳癌細胞からの、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびヒ
トノイラミニダーゼ２によるシグレック９リガンド切断のフローサイトメトリーを示す。
ＢＴ－２０細胞上のシグレック－７リガンドは、図３Ｄに示すように、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒ
ａｅシアリダーゼによる処理後に効率的に除去される。
ウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）上のシア
リダーゼの活性を示す。クマシー染色によって可視化した野生型ヒトノイラミニダーゼ２
、ヒトノイラミニダーゼ３、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍシアリダーゼ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ、およびＡ．ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓシアリダーゼのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を図３Ｂに示す。図３Ｃは、ＺＲ－７
５－１乳癌細胞からの、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびヒ
トノイラミニダーゼ２によるシグレック９リガンド切断のフローサイトメトリーを示す。
ＢＴ－２０細胞上のシグレック－７リガンドは、図３Ｄに示すように、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒ
ａｅシアリダーゼによる処理後に効率的に除去される。
【0121】
シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、異なる乳癌細胞株の細胞表面シアリ
ル化レベルの分析を図４Ａに示す。シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、異
なる乳癌細胞株におけるシグレック－７のリガンドレベルを図４Ｂに示す。シアリダーゼ
処理した場合、またはしない場合の、異なる乳癌細胞株におけるシグレック－９のリガン
ドレベルを図４Ｃに示す。シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、異なる乳癌
細胞株におけるＮＫＧ２Ｄのリガンドレベルを図４Ｄに示す。
ル化レベルの分析を図４Ａに示す。シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、異
なる乳癌細胞株におけるシグレック－７のリガンドレベルを図４Ｂに示す。シアリダーゼ
処理した場合、またはしない場合の、異なる乳癌細胞株におけるシグレック－９のリガン
ドレベルを図４Ｃに示す。シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、異なる乳癌
細胞株におけるＮＫＧ２Ｄのリガンドレベルを図４Ｄに示す。
【0122】
実施例２－細胞表面シアル酸の除去は、ＡＤＣＣに対する感受性を高める
細胞表面シアル酸の除去がＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対する感受性を増強できることを
実証するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＨＥＲ２ ２
＋）およびＢＴ－２０（ＨＥＲ２ １＋）細胞株を、精製されたヒト末梢血ＮＫ細胞を用
いて３０ｎＭトラスツズマブの存在下で、シアリダーゼ処理ありおよびなしで処理した。
種々のシアリダーゼ処理細胞株を用いたトラスツズマブ誘導性ＡＤＣＣにおいて、最大細
胞死滅のおよそ５％～１００％の増加が観察された（図５）。増強されたＡＤＣＣがシア
リダーゼ酵素活性に起因することを確認するために、加水分解活性アッセイおよび熱不活
性化されたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼを用いるＡＤＣＣアッセイも実施した。８
０℃で２０分間加熱することによるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの不活性化は、シ
アル酸含有グリカンに対する加水分解活性の喪失ならびにＡＤＣＣにおける増強の喪失を
もたらした（図６）。シアリダーゼをトラスツズマブと複合体化することにより、細胞表
面上のシアリダーゼの局所濃度の増加が近位増強活性を提供し、組織特異的にさらにその
効果を増強するだけでなく、酵素活性の乱雑さを制限することが期待された。
細胞表面シアル酸の除去がＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対する感受性を増強できることを
実証するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＨＥＲ２ ２
＋）およびＢＴ－２０（ＨＥＲ２ １＋）細胞株を、精製されたヒト末梢血ＮＫ細胞を用
いて３０ｎＭトラスツズマブの存在下で、シアリダーゼ処理ありおよびなしで処理した。
種々のシアリダーゼ処理細胞株を用いたトラスツズマブ誘導性ＡＤＣＣにおいて、最大細
胞死滅のおよそ５％～１００％の増加が観察された（図５）。増強されたＡＤＣＣがシア
リダーゼ酵素活性に起因することを確認するために、加水分解活性アッセイおよび熱不活
性化されたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼを用いるＡＤＣＣアッセイも実施した。８
０℃で２０分間加熱することによるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの不活性化は、シ
アル酸含有グリカンに対する加水分解活性の喪失ならびにＡＤＣＣにおける増強の喪失を
もたらした（図６）。シアリダーゼをトラスツズマブと複合体化することにより、細胞表
面上のシアリダーゼの局所濃度の増加が近位増強活性を提供し、組織特異的にさらにその
効果を増強するだけでなく、酵素活性の乱雑さを制限することが期待された。
【0123】
図５Ａは、ＢＴ－２０乳癌細胞単独（無処置）に対する、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（
Ｔｒａｓ）の存在下、または抗ＨＥＲ２－ＩｇＧとヒトノイラミニダーゼ２（Ｎｅｕ２）
、ヒトノイラミニダーゼ３（Ｎｅｕ３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ
（ＶＣＳｉａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ（ＳＴＳ
ｉａ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（ＡＵＳｉａ
）、もしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ（ＣＰＳｉ
ａ）との存在下での、健常ドナー由来の単離末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図５Ｂ
は、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、またはシアリダーゼ
（３０ｎＭ）と抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）との混合物の非存在下または存在下で、
２：１および４：１のＥ／Ｔ比において、異なる乳癌細胞に対する健常ドナー由来単離末
梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５
Ｔｒａｓ）の存在下、または抗ＨＥＲ２－ＩｇＧとヒトノイラミニダーゼ２（Ｎｅｕ２）
、ヒトノイラミニダーゼ３（Ｎｅｕ３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ
（ＶＣＳｉａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼ（ＳＴＳ
ｉａ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ（ＡＵＳｉａ
）、もしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ（ＣＰＳｉ
ａ）との存在下での、健常ドナー由来の単離末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図５Ｂ
は、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、またはシアリダーゼ
（３０ｎＭ）と抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）との混合物の非存在下または存在下で、
２：１および４：１のＥ／Ｔ比において、異なる乳癌細胞に対する健常ドナー由来単離末
梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５
【0124】
図６は、野生型および熱不活性化Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの特徴
付けを示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ（３０ｎＭ）とシアリダーゼ（３０ｎＭ）との混合物、熱不活性化シアリダーゼ
（ＨＩ－シアリダーゼ３０ｎＭ）、または、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）と熱不活性
化シアリダーゼ（３０ｎＭ）との混合物の非存在下または存在下における、ＢＴ－２０細
胞に対する単離末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を４：１のＥ／Ｔ比で図６Ａに示す。２’－
（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡ
ｃ）を用いた野生型および熱不活性化Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの加水分解活性
を図６Ｂに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化シアリダーゼ処理した場
合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ｌｅｃｔ
ｉｎ（ＳＮＡ）リガンドのレベルを図６Ｃに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱
不活性化シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のシグレッ
ク－７リガンドのレベルを図６Ｄに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化
シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のシグレック－９リ
ガンドのレベルを図６Ｅに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化シアリダ
ーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドのレベ
ルを図６Ｆに示す。＊＊ｐ＜０．００５、ＮＳ：有意ではない
付けを示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ（３０ｎＭ）とシアリダーゼ（３０ｎＭ）との混合物、熱不活性化シアリダーゼ
（ＨＩ－シアリダーゼ３０ｎＭ）、または、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）と熱不活性
化シアリダーゼ（３０ｎＭ）との混合物の非存在下または存在下における、ＢＴ－２０細
胞に対する単離末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を４：１のＥ／Ｔ比で図６Ａに示す。２’－
（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭｕＮｅｕＮＡ
ｃ）を用いた野生型および熱不活性化Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼの加水分解活性
を図６Ｂに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化シアリダーゼ処理した場
合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ｌｅｃｔ
ｉｎ（ＳＮＡ）リガンドのレベルを図６Ｃに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱
不活性化シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のシグレッ
ク－７リガンドのレベルを図６Ｄに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化
シアリダーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のシグレック－９リ
ガンドのレベルを図６Ｅに示す。３０ｎＭ野生型シアリダーゼまたは熱不活性化シアリダ
ーゼ処理した場合、またはしない場合の、ＢＴ－２０細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドのレベ
ルを図６Ｆに示す。＊＊ｐ＜０．００５、ＮＳ：有意ではない
【0125】
実施例３ー抗体－シアリダーゼ複合体の調製および特徴付け
シアリダーゼ－トラスツズマブＡＥＣを設計する際の重要な関心事は、ＡＤＣＣを開始
させる相互作用であるＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）への結合を損なわない酵素結合の部位
を同定することであった。免疫エフェクター機能への干渉を避けるために付着部位が調整
されている抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の分野からインスピレーションを得た。したがっ
て、シアリダーゼは、ＦｃγＲＩＩＩが結合するＣＨ２ドメインから遠く離れたトラスツ
ズマブの重鎖のＣ末端の近くに連結するように選択された。部位特異的複合体化のための
アルデヒドタグ法は、タンパク質－タンパク質化学的融合体および部位特異的抗体－薬物
複合体のアセンブリにおけるその使用の前例に基づいて使用された。上述したように、Ｃ
末端アルデヒドタグを有するトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ）を得た。官能化され
た抗体を最初にアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥ
Ｇ－Ｎ３）にカップリングさせた（図２Ａ）。並行して、シアリダーゼを調製した。Ｖ．
ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼは、ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）によってリシン残基上でランダムに官能化された。一晩反応させ
た後、過剰のリンカーを除去し、シアリダーゼのＢＣＮ－ＮＨＳ修飾の程度をＥＳＩ－Ｍ
Ｓによって測定した（図７Ｂ）。最後に、アジド官能化リンカーで装飾されたトラスツズ
マブを、銅フリーのクリック化学反応を介してＢＣＮ官能化Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリ
ダーゼと複合化した（図２Ａ）。所望の複合体を、サイズ排除カラムを用いて精製し、そ
の見かけの分子量（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、約３１２ｋＤａ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ
により確認した（図２Ｂ）。ＥＳＩ－ＭＳ分析は、シアリダーゼがトラスツズマブの重鎖
に共有結合していることを確認した（図２Ｃおよび図７Ｅ）。最終ＡＥＣのシアリダーゼ
活性を、蛍光発生基質ＭｕＮｅｕＮＡｃを用いて評価した。８５％以上の酵素活性が、化
学共役プロセス後に残った（図８）。あるいは、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドと一晩
反応させることによって、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼをＣ末端アルデヒド
タグ上のシステインに部位特異的に複合体化し、この過剰のリンカーを除去した後、ＤＢ
ＣＯとＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼとの複合体化がＥＳＩ－ＭＳによって完
全であると判定された（図７Ｇ）。最後に、アジドリンカーを有するトラスツズマブを、
銅フリーのクリックケミストリーを介してＤＢＣＯ官能化Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシ
アリダーゼに結合した（図２Ｄ）。所望の複合体を、サイズ排除カラムを用いて精製し、
その見かけの分子量（抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ－ＳｔＳｉａ、約２４０ｋＤａ）をＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥにより確認した（図２Ｅ）。ＥＳＩ－ＭＳ分析は、シアリダーゼがトラスツズマブ
の重鎖に共有結合していることを確認した（図２Ｆおよび図７Ｈ）。最終ＡＥＣのシアリ
ダーゼ活性を、蛍光発生基質ＭｕＮｅｕＮＡｃを用いて評価した。Ｃ末端タグ上の遊離シ
ステインに対する化学的複合体化プロセスの後、遊離アルデヒドタグシアリダーゼと比較
して酵素活性のわずかな増加が生じた（図８）。
シアリダーゼ－トラスツズマブＡＥＣを設計する際の重要な関心事は、ＡＤＣＣを開始
させる相互作用であるＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）への結合を損なわない酵素結合の部位
を同定することであった。免疫エフェクター機能への干渉を避けるために付着部位が調整
されている抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の分野からインスピレーションを得た。したがっ
て、シアリダーゼは、ＦｃγＲＩＩＩが結合するＣＨ２ドメインから遠く離れたトラスツ
ズマブの重鎖のＣ末端の近くに連結するように選択された。部位特異的複合体化のための
アルデヒドタグ法は、タンパク質－タンパク質化学的融合体および部位特異的抗体－薬物
複合体のアセンブリにおけるその使用の前例に基づいて使用された。上述したように、Ｃ
末端アルデヒドタグを有するトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ）を得た。官能化され
た抗体を最初にアミノオキシ－テトラエチレングリコール－アジド（アミノオキシ－ＴＥ
Ｇ－Ｎ３）にカップリングさせた（図２Ａ）。並行して、シアリダーゼを調製した。Ｖ．
ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼは、ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＢＣＮ－ＮＨＳ）によってリシン残基上でランダムに官能化された。一晩反応させ
た後、過剰のリンカーを除去し、シアリダーゼのＢＣＮ－ＮＨＳ修飾の程度をＥＳＩ－Ｍ
Ｓによって測定した（図７Ｂ）。最後に、アジド官能化リンカーで装飾されたトラスツズ
マブを、銅フリーのクリック化学反応を介してＢＣＮ官能化Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリ
ダーゼと複合化した（図２Ａ）。所望の複合体を、サイズ排除カラムを用いて精製し、そ
の見かけの分子量（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、約３１２ｋＤａ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ
により確認した（図２Ｂ）。ＥＳＩ－ＭＳ分析は、シアリダーゼがトラスツズマブの重鎖
に共有結合していることを確認した（図２Ｃおよび図７Ｅ）。最終ＡＥＣのシアリダーゼ
活性を、蛍光発生基質ＭｕＮｅｕＮＡｃを用いて評価した。８５％以上の酵素活性が、化
学共役プロセス後に残った（図８）。あるいは、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドと一晩
反応させることによって、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼをＣ末端アルデヒド
タグ上のシステインに部位特異的に複合体化し、この過剰のリンカーを除去した後、ＤＢ
ＣＯとＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼとの複合体化がＥＳＩ－ＭＳによって完
全であると判定された（図７Ｇ）。最後に、アジドリンカーを有するトラスツズマブを、
銅フリーのクリックケミストリーを介してＤＢＣＯ官能化Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシ
アリダーゼに結合した（図２Ｄ）。所望の複合体を、サイズ排除カラムを用いて精製し、
その見かけの分子量（抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ－ＳｔＳｉａ、約２４０ｋＤａ）をＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥにより確認した（図２Ｅ）。ＥＳＩ－ＭＳ分析は、シアリダーゼがトラスツズマブ
の重鎖に共有結合していることを確認した（図２Ｆおよび図７Ｈ）。最終ＡＥＣのシアリ
ダーゼ活性を、蛍光発生基質ＭｕＮｅｕＮＡｃを用いて評価した。Ｃ末端タグ上の遊離シ
ステインに対する化学的複合体化プロセスの後、遊離アルデヒドタグシアリダーゼと比較
して酵素活性のわずかな増加が生じた（図８）。
【0126】
図７は、シアリダーゼ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧおよびその複合体のＥＳＩ－ＭＳスペクト
ルを示す。精製Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼのＥＳＩ－ＭＳスペクトル
を図７Ａに示す。１：１２のモル比でＢＣＮ－ＮＨＳで標識したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシ
アリダーゼのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７Ｂに示す。Ｃ末端アルデヒドタグを有する抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７Ｃに示す。アミノオキシ－ＴＥＧ－ア
ジドと複合体化したＣ末端アルデヒドタグを有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧのＥＳＩ－ＭＳス
ペクトルを図７Ｄに示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｉａのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７
Ｅに示す。精製Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼのＥＳＩ－
ＭＳを図７Ｆに示す。１：２０のモル比でＤＢＣＯ＿ＰＥＧ４－マレイミドで標識したＳ
．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＥＳＩ－ＭＳを図７Ｇに示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｔ－
ＳｉａのＥＳＩ－ＭＳスペクトル
ルを示す。精製Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼのＥＳＩ－ＭＳスペクトル
を図７Ａに示す。１：１２のモル比でＢＣＮ－ＮＨＳで標識したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシ
アリダーゼのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７Ｂに示す。Ｃ末端アルデヒドタグを有する抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７Ｃに示す。アミノオキシ－ＴＥＧ－ア
ジドと複合体化したＣ末端アルデヒドタグを有する抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧのＥＳＩ－ＭＳス
ペクトルを図７Ｄに示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｉａのＥＳＩ－ＭＳスペクトルを図７
Ｅに示す。精製Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼのＥＳＩ－
ＭＳを図７Ｆに示す。１：２０のモル比でＤＢＣＯ＿ＰＥＧ４－マレイミドで標識したＳ
．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＥＳＩ－ＭＳを図７Ｇに示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｔ－
ＳｉａのＥＳＩ－ＭＳスペクトル
【0127】
図８は、基質２’－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミ
ン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）に対するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ－Ｓｉａ、ならびにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ－ＳｔＳｉａの加水分解活性を示す。
ン酸（ＭｕＮｅｕＮＡｃ）に対するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ－Ｓｉａ、ならびにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼおよび抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧ－ＳｔＳｉａの加水分解活性を示す。
【0128】
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｉａがＨＥＲ２発現細胞上のシアル酸を特異的に除去できるこ
とをさらに実証するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８
（ＨＥＲ２ ０）を６ｎＭまたは６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの非存在下また
は存在下でインキュベートした。図９および図１０に示すように、６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧ－Ｓｉａでの１時間の処理は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の存在下でさえＳＫＢＲ
３細胞の選択的脱シアリル化をもたらした（図９）。しかしながら、この効果は用量依存
的である。ＳＫＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の表面シアル酸レベルは両方とも
６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａで１時間の処理により減少した。様々な濃度の抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａで処理した細胞の混合物についてフローサイトメトリーを用い
てこの効果を定量した（図９Ａ）。しかし、レクチンドメインを欠く、より小さなシアリ
ダーゼを有する別の複合体（抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ－Ｓｔ－Ｓｉａ）では、オフターゲット
ＨＥＲ２ ０ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の表面シアル酸レベルは、約１μＭの抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ－Ｓｔ－Ｓｉａ複合体というはるかに高い濃度とするまで変わらなかった（図
９Ｂ）。
とをさらに実証するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８
（ＨＥＲ２ ０）を６ｎＭまたは６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの非存在下また
は存在下でインキュベートした。図９および図１０に示すように、６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧ－Ｓｉａでの１時間の処理は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の存在下でさえＳＫＢＲ
３細胞の選択的脱シアリル化をもたらした（図９）。しかしながら、この効果は用量依存
的である。ＳＫＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の表面シアル酸レベルは両方とも
６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａで１時間の処理により減少した。様々な濃度の抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａで処理した細胞の混合物についてフローサイトメトリーを用い
てこの効果を定量した（図９Ａ）。しかし、レクチンドメインを欠く、より小さなシアリ
ダーゼを有する別の複合体（抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ－Ｓｔ－Ｓｉａ）では、オフターゲット
ＨＥＲ２ ０ ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の表面シアル酸レベルは、約１μＭの抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ－Ｓｔ－Ｓｉａ複合体というはるかに高い濃度とするまで変わらなかった（図
９Ｂ）。
【0129】
図９は、異なるＨＥＲ２発現癌細胞を用いたトラスツズマブおよびトラスツズマブ－シ
アリダーゼ複合体のインビトロでの特徴付けを示す。ＨＥＲ２高発現細胞株であるＳＫＢ
Ｒ３上の細胞表面シアル酸は、６ｎＭトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体を用いて選択
的に除去することができる。スケールバー、２５μｍ
アリダーゼ複合体のインビトロでの特徴付けを示す。ＨＥＲ２高発現細胞株であるＳＫＢ
Ｒ３上の細胞表面シアル酸は、６ｎＭトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体を用いて選択
的に除去することができる。スケールバー、２５μｍ
【0130】
図１０は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下におけるＳＫＢ
Ｒ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞上のＳＮＡリガンドを示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下でのＳＫＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の
個々の培養上のＳＮＡリガンドを図１０Ａに示す。細胞を３７℃で１時間、ＲＰＭＩ－１
６４０培地中の６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体またはＰＢＳと共にインキュ
ベートし、ＦＩＴＣ標識ＳＮＡレクチン、ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２およびＤＡＰＩ核染
色で染色した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下でのＳＫＢＲ
３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の混合物上のＳＮＡリガンドを図１０Ｂに示す。ＳＫ
ＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を１：１の比で混合し、一晩培養した。細胞混合
物を、６ｎＭまたは６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在
下で、３７℃で１時間インキュベートした。スケールバー＝２５μｍ
Ｒ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞上のＳＮＡリガンドを示す。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下でのＳＫＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の
個々の培養上のＳＮＡリガンドを図１０Ａに示す。細胞を３７℃で１時間、ＲＰＭＩ－１
６４０培地中の６ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体またはＰＢＳと共にインキュ
ベートし、ＦＩＴＣ標識ＳＮＡレクチン、ＡＦ６４７標識抗Ｈｅｒ２およびＤＡＰＩ核染
色で染色した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在下でのＳＫＢＲ
３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の混合物上のＳＮＡリガンドを図１０Ｂに示す。ＳＫ
ＢＲ３およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を１：１の比で混合し、一晩培養した。細胞混合
物を、６ｎＭまたは６０ｎＭの抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ複合体の非存在下または存在
下で、３７℃で１時間インキュベートした。スケールバー＝２５μｍ
【0131】
ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣに対する抗体－シアリダーゼ複合体の効果を評価するために、
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの存在下で、４：１および８：１
のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ比）比で、種々の乳癌細胞株（ＳＫＢＲ３、ＨＥＲ２ ３
＋、ＨＣＣ－１９５４、ＨＥＲ２ ３＋、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＨＥＲ２ ２＋、ＺＲ
－７５－１、ＨＥＲ２ １＋、ＢＴ－２０、ＨＥＲ２ １＋、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ
ＥＲ２ １＋、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＨＥＲ２ ０）を使用して細胞傷害性アッセイを
実施した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、ＨＥＲ２
１＋細胞株ＺＲ－７５－１、ＢＴ－２０、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１で最大細胞死滅の
３３％～１４０％の増加を示した（図１１）。さらに、ＢＴ－２０細胞を、シアリダーゼ
（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（
３０ｎＭ）の非存在下または存在下で、様々なＥ／Ｔ比で精製ヒト末梢血ＮＫ細胞に曝露
した（図１２Ａ）。ＢＴ－２０細胞系のシアリダーゼ単独処理は、異なるＥ／Ｔ比におい
て、ほとんどＮＫ細胞媒介細胞傷害性を示さなかった。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較して、
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、様々な比率で有意に改善された細胞溶解を示した。４の
Ｅ／Ｔ比で、最大の増強が認められた。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧの２１％±１に対して、抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの４６％±１細胞溶解。ＮＫ細胞を枯渇させたＰＢＭＣはほとん
ど細胞溶解を示さなかったので、ＡＤＣＣはＮＫ細胞によって媒介されている可能性が高
いことが確認された（図１２Ｂ）。
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの存在下で、４：１および８：１
のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ比）比で、種々の乳癌細胞株（ＳＫＢＲ３、ＨＥＲ２ ３
＋、ＨＣＣ－１９５４、ＨＥＲ２ ３＋、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＨＥＲ２ ２＋、ＺＲ
－７５－１、ＨＥＲ２ １＋、ＢＴ－２０、ＨＥＲ２ １＋、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈ
ＥＲ２ １＋、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＨＥＲ２ ０）を使用して細胞傷害性アッセイを
実施した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、ＨＥＲ２
１＋細胞株ＺＲ－７５－１、ＢＴ－２０、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１で最大細胞死滅の
３３％～１４０％の増加を示した（図１１）。さらに、ＢＴ－２０細胞を、シアリダーゼ
（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（
３０ｎＭ）の非存在下または存在下で、様々なＥ／Ｔ比で精製ヒト末梢血ＮＫ細胞に曝露
した（図１２Ａ）。ＢＴ－２０細胞系のシアリダーゼ単独処理は、異なるＥ／Ｔ比におい
て、ほとんどＮＫ細胞媒介細胞傷害性を示さなかった。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較して、
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、様々な比率で有意に改善された細胞溶解を示した。４の
Ｅ／Ｔ比で、最大の増強が認められた。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧの２１％±１に対して、抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａの４６％±１細胞溶解。ＮＫ細胞を枯渇させたＰＢＭＣはほとん
ど細胞溶解を示さなかったので、ＡＤＣＣはＮＫ細胞によって媒介されている可能性が高
いことが確認された（図１２Ｂ）。
【0132】
図１１は、４：１および８：１のＥ／Ｔ比で、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）または
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎＭ）の存在下で、異なる乳癌細胞に対する健常ドナ
ーからの単離した末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性データを示す。
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎＭ）の存在下で、異なる乳癌細胞に対する健常ドナ
ーからの単離した末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性データを示す。
【0133】
図１２は、異なるＨＥＲ２発現癌細胞に対するトラスツズマブおよびトラスツズマブ－
シアリダーゼ複合体のインビトロ活性を示す。ＮＫ細胞を使用して、シアリダーゼ（３０
ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎ
Ｍ）の非存在下または存在下で、ＢＴ－２０細胞を用いて行った細胞傷害性アッセイを図
１２Ａに示す。ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣを使用して、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎＭ）の非存在下ま
たは存在下で、ＢＴ－２０細胞を用いて行った細胞傷害性アッセイの結果を図１２Ｂに示
す。シグレック－７－Ｆｃ、シグレック－９－Ｆｃ、およびＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ結合と相関
してＡＤＣＣの増強において見られる傾向を図１２Ｃ～１２Ｆに示す。示された濃度のト
ラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体の存在下での異なるＨＥＲ２発
現癌細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を図１２Ｇ～１２Ｊに示す。トラスツズマブま
たはトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体処理によるＮＫ細胞上のシグレック－７分布の
蛍光顕微鏡分析を図１２Ｋに示す。シグレック－７は、トラスツズマブ処理によってＮＫ
シナプスへの徴集を示した。トラスツズマブ－シアリダーゼ複合体を用いてＳＫＢＲ３細
胞上のシアル酸を除去した後、ＮＫ腫瘍シナプスへのシグレック－７の徴集は失われる。
スケールバー、１０μｍ、＊＊ｐ＜０．００５
シアリダーゼ複合体のインビトロ活性を示す。ＮＫ細胞を使用して、シアリダーゼ（３０
ｎＭ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎ
Ｍ）の非存在下または存在下で、ＢＴ－２０細胞を用いて行った細胞傷害性アッセイを図
１２Ａに示す。ＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣを使用して、シアリダーゼ（３０ｎＭ）、抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（３０ｎＭ）の非存在下ま
たは存在下で、ＢＴ－２０細胞を用いて行った細胞傷害性アッセイの結果を図１２Ｂに示
す。シグレック－７－Ｆｃ、シグレック－９－Ｆｃ、およびＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ結合と相関
してＡＤＣＣの増強において見られる傾向を図１２Ｃ～１２Ｆに示す。示された濃度のト
ラスツズマブおよびトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体の存在下での異なるＨＥＲ２発
現癌細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を図１２Ｇ～１２Ｊに示す。トラスツズマブま
たはトラスツズマブ－シアリダーゼ複合体処理によるＮＫ細胞上のシグレック－７分布の
蛍光顕微鏡分析を図１２Ｋに示す。シグレック－７は、トラスツズマブ処理によってＮＫ
シナプスへの徴集を示した。トラスツズマブ－シアリダーゼ複合体を用いてＳＫＢＲ３細
胞上のシアル酸を除去した後、ＮＫ腫瘍シナプスへのシグレック－７の徴集は失われる。
スケールバー、１０μｍ、＊＊ｐ＜０．００５
【0134】
単球およびマクロファージによって媒介される細胞傷害性に対する抗体－シアリダーゼ
複合体の効果を評価するために、種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で、Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ単独（ＶＣＳｉａ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ
）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）の存在下で、乳癌細胞株（ＳＫＢ
Ｒ３、ＨＥＲ２ ３＋、ＢＴ－２０、ＨＥＲ２ １＋）を用いて細胞傷害性アッセイを行
った。総単球集団は腫瘍細胞の全死滅率が低かったが、シグレック３、７、および９を主
に発現する単離ＣＤ１６＋単球は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）用いた処理と比較し
て、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）複合体を用いた処置で約１００％の増加
を示した（図１３）。シグレック３、６、７、および９を発現する分化Ｍ１マクロファー
ジ、およびシグレック３、５、６、７、８、９、１０、および１１を発現するＭ２マクロ
ファージはいずれも、トラスツズマブ単独とは対照的に、トラスツズマブ－シアリダーゼ
複合体によって腫瘍細胞の細胞傷害性死滅の増加を示す（図１３）。γδＴ細胞媒介細胞
傷害性も、トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）またはシアリダーゼ（ＶＣＳｉａ）単独で処理す
るのではなくトラスツズマブシアリダーゼ複合体（Ｔ－Ｓｉａ）によって、増強すること
ができる（図１４）。
複合体の効果を評価するために、種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で、Ｖｉｂｒｉ
ｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ単独（ＶＣＳｉａ）、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ
）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）の存在下で、乳癌細胞株（ＳＫＢ
Ｒ３、ＨＥＲ２ ３＋、ＢＴ－２０、ＨＥＲ２ １＋）を用いて細胞傷害性アッセイを行
った。総単球集団は腫瘍細胞の全死滅率が低かったが、シグレック３、７、および９を主
に発現する単離ＣＤ１６＋単球は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）用いた処理と比較し
て、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）複合体を用いた処置で約１００％の増加
を示した（図１３）。シグレック３、６、７、および９を発現する分化Ｍ１マクロファー
ジ、およびシグレック３、５、６、７、８、９、１０、および１１を発現するＭ２マクロ
ファージはいずれも、トラスツズマブ単独とは対照的に、トラスツズマブ－シアリダーゼ
複合体によって腫瘍細胞の細胞傷害性死滅の増加を示す（図１３）。γδＴ細胞媒介細胞
傷害性も、トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）またはシアリダーゼ（ＶＣＳｉａ）単独で処理す
るのではなくトラスツズマブシアリダーゼ複合体（Ｔ－Ｓｉａ）によって、増強すること
ができる（図１４）。
【0135】
図１３Ａは、フローサイトメトリーによって決定されたヒト単離単球集団のシグレック
発現レベルを示す。図１３Ｂは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ２－Ｉｇ
Ｇ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）と２４時間インキュ
ベートした後のＢＴ－２０乳癌細胞に対する単離されたヒト単球の細胞傷害性データを１
：８のＥ：Ｔ比で示す。図１３Ｃは、単球集団から単離されたＣＤ１６＋単球のシグレッ
ク受容体発現レベルを示す。図１３Ｄは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ
２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＢＴ
－２０乳癌細胞と４時間インキュベートした後の健康なドナーからのＣＤ１６＋単球の細
胞傷害性データを示す。図１３Ｅは、前述の通りＭ１マクロファージに分化した健康なド
ナーから単離した単球のシグレック受容体発現レベルを示す。図１３Ｆは、Ｖ．ｃｈｏｌ
ｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞と２４時間インキュベートした後の
健康なドナーから単離された単球から分化したＭ１マクロファージからの細胞傷害性デー
タを示す。図１３Ｇは、前述の通りＭ２マクロファージに分化した健康なドナーから単離
された単球のシグレック受容体発現レベルを示す。図１３Ｈは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシ
アリダーゼ、抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ
－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞と２４時間インキュベートした後の健康なドナ
ーから単離された単球から分化したＭ２マクロファージからの細胞傷害性データを示す。
図１３Ｉは、（１３Ｅおよび１３Ｆ）からのＭ２マクロファージのＣＤ１６発現レベルを
示す。
発現レベルを示す。図１３Ｂは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ２－Ｉｇ
Ｇ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）と２４時間インキュ
ベートした後のＢＴ－２０乳癌細胞に対する単離されたヒト単球の細胞傷害性データを１
：８のＥ：Ｔ比で示す。図１３Ｃは、単球集団から単離されたＣＤ１６＋単球のシグレッ
ク受容体発現レベルを示す。図１３Ｄは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ
２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＢＴ
－２０乳癌細胞と４時間インキュベートした後の健康なドナーからのＣＤ１６＋単球の細
胞傷害性データを示す。図１３Ｅは、前述の通りＭ１マクロファージに分化した健康なド
ナーから単離した単球のシグレック受容体発現レベルを示す。図１３Ｆは、Ｖ．ｃｈｏｌ
ｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞と２４時間インキュベートした後の
健康なドナーから単離された単球から分化したＭ１マクロファージからの細胞傷害性デー
タを示す。図１３Ｇは、前述の通りＭ２マクロファージに分化した健康なドナーから単離
された単球のシグレック受容体発現レベルを示す。図１３Ｈは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシ
アリダーゼ、抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ
－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３乳癌細胞と２４時間インキュベートした後の健康なドナ
ーから単離された単球から分化したＭ２マクロファージからの細胞傷害性データを示す。
図１３Ｉは、（１３Ｅおよび１３Ｆ）からのＭ２マクロファージのＣＤ１６発現レベルを
示す。
【0136】
図１４は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、抗ＨＥＲ２－ＩｇＧ（Ｔｒａｓ）、ま
たは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３細胞の存在下で５
：１のＥ：Ｔで、単離されたγδＴ細胞の細胞傷害性を示す。
たは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ（Ｔ－Ｓｉａ）およびＳＫ－ＢＲ－３細胞の存在下で５
：１のＥ：Ｔで、単離されたγδＴ細胞の細胞傷害性を示す。
【0137】
実施例４－抗体－シアリダーゼ複合体を用いたＡＤＣＣの増強のメカニズム
以前の研究は、癌細胞の過シアル酸化が、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの結合の減少、なら
びに抑制性受容体のシグレック－７およびシグレック－９の結合の増強をもたらし、それ
によってＮＫ媒介性細胞傷害性を減少させることを示唆している。トラスツズマブ－シア
リダーゼ複合体を用いたＡＤＣＣ増加の機序を調べるために、ＡＤＣＣの倍数増加を、種
々の乳癌細胞株における受容体結合と相関させた。ＮＫ媒介性ＡＤＣＣの最も高い増加を
有する細胞株は、シグレック－７およびシグレック－９結合の最高レベルと相関していた
（図１２Ｃ～１２Ｅ）。シグレック－７およびシグレック－９表面リガンドの発現が最も
高いＢＴ－２０およびＺＲ－７５－１細胞を、トラスツズマブ－シアリダーゼ複合体で処
理すると、トラスツズマブ単独と比較してＡＤＣＣが２倍超増強された。対照的に、複合
体は、シグレック－７およびシグレック－９表面リガンドの最も低い発現を有するＭＤＡ
－ＭＢ－４５３細胞のＡＤＣＣにほとんど有意な改善をもたらさなかった。抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧ－Ｓｉａが、抑制性受容体シグレック－７およびシグレック－９の結合の減少によ
り、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄとの相互作用の増強とともにＡＤＣＣを増強したことをさら
に実証するために、シグレック－７、シグレック－９およびＮＫＧ２Ｄに対する遮断抗体
を使用してリガンド－受容体相互作用を特異的に遮断した。５μｇ／ｍＬの抗シグレック
－７および抗シグレック－９抗体は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧを伴うＢＴ－２０細胞に対して
有意に増強されたＮＫ細胞の細胞傷害性をもたらしたが、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧおよびシア
リダーゼの混合物を伴うＢＴ－２０細胞に対してはもたらさなかった。さらに、ＮＫＧ２
Ｄ受容体の遮断は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ媒介性ＡＤＣＣと比較して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ
とシアリダーゼの混合物処理細胞におけるＡＤＣＣに対してより大きな効果を示した（図
１５）。
以前の研究は、癌細胞の過シアル酸化が、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの結合の減少、なら
びに抑制性受容体のシグレック－７およびシグレック－９の結合の増強をもたらし、それ
によってＮＫ媒介性細胞傷害性を減少させることを示唆している。トラスツズマブ－シア
リダーゼ複合体を用いたＡＤＣＣ増加の機序を調べるために、ＡＤＣＣの倍数増加を、種
々の乳癌細胞株における受容体結合と相関させた。ＮＫ媒介性ＡＤＣＣの最も高い増加を
有する細胞株は、シグレック－７およびシグレック－９結合の最高レベルと相関していた
（図１２Ｃ～１２Ｅ）。シグレック－７およびシグレック－９表面リガンドの発現が最も
高いＢＴ－２０およびＺＲ－７５－１細胞を、トラスツズマブ－シアリダーゼ複合体で処
理すると、トラスツズマブ単独と比較してＡＤＣＣが２倍超増強された。対照的に、複合
体は、シグレック－７およびシグレック－９表面リガンドの最も低い発現を有するＭＤＡ
－ＭＢ－４５３細胞のＡＤＣＣにほとんど有意な改善をもたらさなかった。抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧ－Ｓｉａが、抑制性受容体シグレック－７およびシグレック－９の結合の減少によ
り、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄとの相互作用の増強とともにＡＤＣＣを増強したことをさら
に実証するために、シグレック－７、シグレック－９およびＮＫＧ２Ｄに対する遮断抗体
を使用してリガンド－受容体相互作用を特異的に遮断した。５μｇ／ｍＬの抗シグレック
－７および抗シグレック－９抗体は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧを伴うＢＴ－２０細胞に対して
有意に増強されたＮＫ細胞の細胞傷害性をもたらしたが、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧおよびシア
リダーゼの混合物を伴うＢＴ－２０細胞に対してはもたらさなかった。さらに、ＮＫＧ２
Ｄ受容体の遮断は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ媒介性ＡＤＣＣと比較して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ
とシアリダーゼの混合物処理細胞におけるＡＤＣＣに対してより大きな効果を示した（図
１５）。
【0138】
図１５は、５μｇ／ｍＬの遮断性抗ＮＫＧ２Ｄ（クローン１４９８１０）、抗シグレッ
ク－７（クローンＳ７．７）、抗シグレック－９（クローンＳ９）、抗シグレック－７（
クローンＳ７．７）と抗シグレック－９（クローンＳ９）との混合物、または、マウスＩ
ｇＧ１アイソタイプ抗体（クローンＭＯＰＣ－２１）の非存在下または存在下で、抗Ｈｅ
ｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）とシアリダーゼ（３
０ｎＭ）との混合物を用いた、４：１のＥ／Ｔ比におけるＢＴ－２０細胞に対する健常ド
ナーから単離された末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性に関する結果を示す。＊ｐ＜０．０５、
＊＊ｐ＜０．００５、ｎｓ：有意ではない
ク－７（クローンＳ７．７）、抗シグレック－９（クローンＳ９）、抗シグレック－７（
クローンＳ７．７）と抗シグレック－９（クローンＳ９）との混合物、または、マウスＩ
ｇＧ１アイソタイプ抗体（クローンＭＯＰＣ－２１）の非存在下または存在下で、抗Ｈｅ
ｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）、または抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（３０ｎＭ）とシアリダーゼ（３
０ｎＭ）との混合物を用いた、４：１のＥ／Ｔ比におけるＢＴ－２０細胞に対する健常ド
ナーから単離された末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性に関する結果を示す。＊ｐ＜０．０５、
＊＊ｐ＜０．００５、ｎｓ：有意ではない
【0139】
実施例５－抗体－シアリダーゼ複合体と抗体単独との比較
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ単独に対して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｉａのＡＤＣＣ誘導能力を
直接比較するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）、ＺＲ－７５－１（ＨＥＲ２ １＋
）、ＢＴ－２０（ＨＥＲ２ １＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２ ０）の４つの異
なる乳癌細胞株を用いて、細胞傷害性の用量応答を測定した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較
して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、３つのＨＥＲ２発現細胞株すべてにおいて４のＥ
／Ｔ比でより細胞傷害性である。ＨＥＲ２ ３＋細胞株については、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ
－Ｓｉａは、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（ＥＣ５０１７７±５４ｐＭ）よりもわずかに良好であ
った７６±１４ｐＭのＥＣ５０でＳＫＢＲ３細胞を死滅させた。ＨＥＲ２ １＋細胞株Ｚ
Ｒ－７５－１およびＢＴ－２０について、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧより約１０倍細胞傷害性である（ＺＲ－７５－１細胞：抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉ
ａ ＥＣ５０ １３５±４７ｐＭ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ ＥＣ５０ １１４３±２７４ｐ
Ｍ、ＢＴ－２０細胞：抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １７０±３４ｐＭ、抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ ＥＣ５０ １８２３±８５０ｐＭ）（図１２Ｇ～１２Ｊおよび表６）。
ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の溶解は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ－Ｓｉａのいずれについてもほとんど観察されなかった（図１２Ｊ）。次に、
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと非複合体シアリダーゼ（抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ）との混合物の違いを試験した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓ
ｉａは、ＳＫＢＲ３細胞（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ ７６±１４ｐＭ、抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ ＥＣ５０ １３６±５２ｐＭ）、ＺＲ－７５－１細胞
（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １３５±４７ｐＭ；抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シ
アリダーゼ ＥＣ５０ ４９２±６７ｐＭ）、およびＢＴ－２０細胞（抗Ｈｅｒ２－Ｉｇ
Ｇ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １７０±３４ｐＭ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ ＥＣ５
０ ６９２±１５６ｐＭ）においてより低いＥＣ５０を示した（表６）。抗Ｈｅｒ２－Ｉ
ｇＧと非複合体型シアリダーゼとの混合物と比べた複合体の効力の増大は、酵素活性に関
する近接効果の証拠である。
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ単独に対して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－ＳｉａのＡＤＣＣ誘導能力を
直接比較するために、ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２ ３＋）、ＺＲ－７５－１（ＨＥＲ２ １＋
）、ＢＴ－２０（ＨＥＲ２ １＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＥＲ２ ０）の４つの異
なる乳癌細胞株を用いて、細胞傷害性の用量応答を測定した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと比較
して、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、３つのＨＥＲ２発現細胞株すべてにおいて４のＥ
／Ｔ比でより細胞傷害性である。ＨＥＲ２ ３＋細胞株については、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ
－Ｓｉａは、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ（ＥＣ５０１７７±５４ｐＭ）よりもわずかに良好であ
った７６±１４ｐＭのＥＣ５０でＳＫＢＲ３細胞を死滅させた。ＨＥＲ２ １＋細胞株Ｚ
Ｒ－７５－１およびＢＴ－２０について、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａは、抗Ｈｅｒ２－
ＩｇＧより約１０倍細胞傷害性である（ＺＲ－７５－１細胞：抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉ
ａ ＥＣ５０ １３５±４７ｐＭ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ ＥＣ５０ １１４３±２７４ｐ
Ｍ、ＢＴ－２０細胞：抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １７０±３４ｐＭ、抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ ＥＣ５０ １８２３±８５０ｐＭ）（図１２Ｇ～１２Ｊおよび表６）。
ＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の溶解は、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ
２－ＩｇＧ－Ｓｉａのいずれについてもほとんど観察されなかった（図１２Ｊ）。次に、
抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ、および抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧと非複合体シアリダーゼ（抗Ｈ
ｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ）との混合物の違いを試験した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓ
ｉａは、ＳＫＢＲ３細胞（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ ７６±１４ｐＭ、抗
Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ ＥＣ５０ １３６±５２ｐＭ）、ＺＲ－７５－１細胞
（抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １３５±４７ｐＭ；抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シ
アリダーゼ ＥＣ５０ ４９２±６７ｐＭ）、およびＢＴ－２０細胞（抗Ｈｅｒ２－Ｉｇ
Ｇ－Ｓｉａ ＥＣ５０ １７０±３４ｐＭ、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ／シアリダーゼ ＥＣ５
０ ６９２±１５６ｐＭ）においてより低いＥＣ５０を示した（表６）。抗Ｈｅｒ２－Ｉ
ｇＧと非複合体型シアリダーゼとの混合物と比べた複合体の効力の増大は、酵素活性に関
する近接効果の証拠である。
【表6】
【0140】
実施例６－シアリダーゼ処理はリツキシマブ誘導性ＣＤＣを増強する
Ｄａｕｄｉ細胞株またはＲａｍｏｓ細胞株のＢ細胞リンパ腫細胞をシアリダーゼまたは
ＰＢＳコントロールを用いて３７℃で１時間処理して細胞表面を脱シアリル化し、正常ヒ
ト血清（１：４、補体タンパク質を含む）およびリツキシマブ（１０μｇ／ｍｌ）を加え
、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。上清を回収し、溶解した細胞からのＬＤ
Ｈ放出を測定するキットを使用して細胞死（細胞傷害性）を測定し、その後、完全に界面
活性剤で溶解した細胞を「１００％死滅」標準として比較した。図１７について：ＳｉＡ
ｓｅ：シアリダーゼ処理細胞、リツキシマブなし。リツキサン：ＰＢＳ処理および１０μ
ｇ／ｍｌのリツキシマブ。ＳｉａＡｓｅ＋リツキサン：シアリダーゼ処理および１０μｇ
／ｍｌのリツキシマブ。＊ｐ＜０．０５
Ｄａｕｄｉ細胞株またはＲａｍｏｓ細胞株のＢ細胞リンパ腫細胞をシアリダーゼまたは
ＰＢＳコントロールを用いて３７℃で１時間処理して細胞表面を脱シアリル化し、正常ヒ
ト血清（１：４、補体タンパク質を含む）およびリツキシマブ（１０μｇ／ｍｌ）を加え
、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。上清を回収し、溶解した細胞からのＬＤ
Ｈ放出を測定するキットを使用して細胞死（細胞傷害性）を測定し、その後、完全に界面
活性剤で溶解した細胞を「１００％死滅」標準として比較した。図１７について：ＳｉＡ
ｓｅ：シアリダーゼ処理細胞、リツキシマブなし。リツキサン：ＰＢＳ処理および１０μ
ｇ／ｍｌのリツキシマブ。ＳｉａＡｓｅ＋リツキサン：シアリダーゼ処理および１０μｇ
／ｍｌのリツキシマブ。＊ｐ＜０．０５
【0141】
Ｄａｕｄｉ細胞は、リツキシマブ誘導補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）において約１０
％の増加を経験する。一方、Ｒａｍｏｓは、脱シアリル化後にほぼ２倍のＣＤＣを経験す
る。
％の増加を経験する。一方、Ｒａｍｏｓは、脱シアリル化後にほぼ２倍のＣＤＣを経験す
る。
【0142】
実施例７－Ｒａｍｏｓ細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞よりも高レベルのシグレック－９リガンド
を有する
前述の実施例のＲａｍｏｓ細胞で見られる脱シアリル化によるＣＤＣへのより大きな効
果は、より高い初期シアリル化によって説明することができた。
を有する
前述の実施例のＲａｍｏｓ細胞で見られる脱シアリル化によるＣＤＣへのより大きな効
果は、より高い初期シアリル化によって説明することができた。
【0143】
５μｇ／ｍｌのＳｉｇ－Ｆｃおよび４μｇ／ｍｌの抗Ｆｃ二次抗体においてシグレック
－Ｆｃ融合タンパク質を予め複合物形成させ、細胞と共に４℃で３０分間インキュベート
した。次いで、細胞を３回洗浄し、フローサイトメトリーを行った。別に、細胞を抗Ｆｃ
二次抗体（同じ４μｇ／ｍｌ）で処理し、次いで上記のように洗浄し、フローサイトメト
リーを行った。二次抗体でのみ処理した細胞に対する、シグレック－Ｆｃ融合で処理した
細胞の蛍光の増加は、結合が二次試薬ではなくシグレック－Ｆｃタンパク質によることを
示している。
－Ｆｃ融合タンパク質を予め複合物形成させ、細胞と共に４℃で３０分間インキュベート
した。次いで、細胞を３回洗浄し、フローサイトメトリーを行った。別に、細胞を抗Ｆｃ
二次抗体（同じ４μｇ／ｍｌ）で処理し、次いで上記のように洗浄し、フローサイトメト
リーを行った。二次抗体でのみ処理した細胞に対する、シグレック－Ｆｃ融合で処理した
細胞の蛍光の増加は、結合が二次試薬ではなくシグレック－Ｆｃタンパク質によることを
示している。
【0144】
図１８に示すのは、Ｄａｕｄｉ細胞株およびＲａｍｏｓ細胞株の３回の実験的反復のシ
グレック－９－Ｆｃ結合の平均＋／－標準偏差である。Ｒａｍｏｓ細胞は約２５％高いシ
グレック－９結合を示し、したがって細胞表面により多くのシアル酸を発現している可能
性が高い。
グレック－９－Ｆｃ結合の平均＋／－標準偏差である。Ｒａｍｏｓ細胞は約２５％高いシ
グレック－９結合を示し、したがって細胞表面により多くのシアル酸を発現している可能
性が高い。
【0145】
実施例８－シアリダーゼは補体依存的にリツキシマブを増強する
補体タンパク質Ｃ１ｑは、補体依存性細胞傷害性の「古典経路」の重要な開始成分であ
る。これは、標的細胞上の抗体に結合し、続いて、細胞死につながる補体カスケードを開
始させる、Ｃ１複合物を形成するのに役立つ。図１９に示すように、Ｃ１ｑなしでは、シ
アリダーゼおよび／またはリツキシマブは細胞を効率的に溶解しない。このデータは、シ
アリダーゼ処理が、古典経路を介してリツキシマブ誘導性ＣＤＣを増強することを示して
いる。これらの実験は図１７のように行ったが、赤色の棒グラフについては、正常ヒト血
清の代わりに、Ｃ１ｑを枯渇させた血清を添加した。青い棒グラフは、正常ヒト血清で処
理した細胞を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
補体タンパク質Ｃ１ｑは、補体依存性細胞傷害性の「古典経路」の重要な開始成分であ
る。これは、標的細胞上の抗体に結合し、続いて、細胞死につながる補体カスケードを開
始させる、Ｃ１複合物を形成するのに役立つ。図１９に示すように、Ｃ１ｑなしでは、シ
アリダーゼおよび／またはリツキシマブは細胞を効率的に溶解しない。このデータは、シ
アリダーゼ処理が、古典経路を介してリツキシマブ誘導性ＣＤＣを増強することを示して
いる。これらの実験は図１７のように行ったが、赤色の棒グラフについては、正常ヒト血
清の代わりに、Ｃ１ｑを枯渇させた血清を添加した。青い棒グラフは、正常ヒト血清で処
理した細胞を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【0146】
免疫シナプスに対する抗体－シアリダーゼ複合体の効果
以前の研究では、シグレック－７がＮＫ標的細胞の免疫学的シナプスに徴集され、免疫
受容体のチロシンに基づく抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を介した抑制性シグナル伝達を誘導
することが実証された。免疫シナプスに対する、複合体化されたシアリダーゼの効果を評
価するために、免疫シナプスをＡＤＣＣ中に画像化した。ＳＫＢＲ３細胞を、抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａとプレインキュベートし、次いでそれらを精
製ヒト末梢血ＮＫ細胞と共にインキュベートして、シナプス形成を誘導した。次いで、細
胞を固定し、シグレック－７、ＨＥＲ２、ＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）について染色し、蛍
光顕微鏡で画像化した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ処置では、シグレック－７は、ＮＫ細胞で形
成された免疫学的シナプスにおいてＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）と共局在し、ＮＫ細胞活性
化の抑制受容体としての役割と一致する（図１２Ｋ）。対照的に、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａで処理したＳＫＢＲ３細胞は、ＣＤ１６の効率的な徴集にもかかわらず、シグレッ
ク－７の徴集をほとんど示さない。これらの結果は、トラスツズマブ－シアリダーゼ複合
体がＡＤＣＣを促進しながら免疫癌細胞シナプスを効果的にリモデリングすることを示し
ている。
以前の研究では、シグレック－７がＮＫ標的細胞の免疫学的シナプスに徴集され、免疫
受容体のチロシンに基づく抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を介した抑制性シグナル伝達を誘導
することが実証された。免疫シナプスに対する、複合体化されたシアリダーゼの効果を評
価するために、免疫シナプスをＡＤＣＣ中に画像化した。ＳＫＢＲ３細胞を、抗Ｈｅｒ２
－ＩｇＧまたは抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－Ｓｉａとプレインキュベートし、次いでそれらを精
製ヒト末梢血ＮＫ細胞と共にインキュベートして、シナプス形成を誘導した。次いで、細
胞を固定し、シグレック－７、ＨＥＲ２、ＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）について染色し、蛍
光顕微鏡で画像化した。抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ処置では、シグレック－７は、ＮＫ細胞で形
成された免疫学的シナプスにおいてＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）と共局在し、ＮＫ細胞活性
化の抑制受容体としての役割と一致する（図１２Ｋ）。対照的に、抗Ｈｅｒ２－ＩｇＧ－
Ｓｉａで処理したＳＫＢＲ３細胞は、ＣＤ１６の効率的な徴集にもかかわらず、シグレッ
ク－７の徴集をほとんど示さない。これらの結果は、トラスツズマブ－シアリダーゼ複合
体がＡＤＣＣを促進しながら免疫癌細胞シナプスを効果的にリモデリングすることを示し
ている。
【0147】
ここでは、ＡＤＣＣに対する感受性を高めるために組織特異的細胞表面グリカン編集を
行うことができる複合体の新しいクラスが報告されている。複合体は、複数の免疫刺激経
路を同時に標的とする単一抗体療法のための第１の手段を提供する。抗体－シアリダーゼ
複合体による腫瘍細胞の処理は、Ｆｃ－ＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）相互作用を介してＮＫ
細胞を能動的に徴集するだけでなく、腫瘍免疫シナプスに対する抑制性シグレック受容体
の徴集を効果的に遅延させ、正確なグリコカリックス編集を通じて活性化ＮＫＧ２Ｄリガ
ンドを暴露する。トラスツズマブ治療と比較して、新規のトラスツズマブ－シアリダーゼ
複合体は、ＨＥＲ２発現細胞を殺滅するためにＮＫ細胞を効率的に誘導することができ、
低量の抗原を有する乳癌細胞を標的とするのにさらに効率的である。トラスツズマブは現
在非常に高いＨＥＲ２発現レベルを有する患者にのみ処方されているので、これはより控
えめなＨＥＲ２発現腫瘍を治療する能力に関して重要な意味を有する。
行うことができる複合体の新しいクラスが報告されている。複合体は、複数の免疫刺激経
路を同時に標的とする単一抗体療法のための第１の手段を提供する。抗体－シアリダーゼ
複合体による腫瘍細胞の処理は、Ｆｃ－ＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）相互作用を介してＮＫ
細胞を能動的に徴集するだけでなく、腫瘍免疫シナプスに対する抑制性シグレック受容体
の徴集を効果的に遅延させ、正確なグリコカリックス編集を通じて活性化ＮＫＧ２Ｄリガ
ンドを暴露する。トラスツズマブ治療と比較して、新規のトラスツズマブ－シアリダーゼ
複合体は、ＨＥＲ２発現細胞を殺滅するためにＮＫ細胞を効率的に誘導することができ、
低量の抗原を有する乳癌細胞を標的とするのにさらに効率的である。トラスツズマブは現
在非常に高いＨＥＲ２発現レベルを有する患者にのみ処方されているので、これはより控
えめなＨＥＲ２発現腫瘍を治療する能力に関して重要な意味を有する。
【0148】
特に、マクロファージおよび樹状細胞も、抑制性シグレック（各々シグレック－９およ
びシグレック－５）を発現する。したがって、過シアル酸化は、細胞および補体因子によ
る自然免疫ターゲティングに対して広く保護的であり得る。
びシグレック－５）を発現する。したがって、過シアル酸化は、細胞および補体因子によ
る自然免疫ターゲティングに対して広く保護的であり得る。
【0149】
単一の経路をそれぞれ標的とする現在の癌免疫療法とは異なり、グリコカリックス編集
は、免疫系の武器の諸分野にわたる複数の経路に影響を及ぼし得る。
は、免疫系の武器の諸分野にわたる複数の経路に影響を及ぼし得る。
【0150】
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の条項によっても定義される。
【0151】
１．標的細胞の細胞表面分子に結合する標的化部分と、
標的細胞表面編集酵素と、を含む、複合体。
標的細胞表面編集酵素と、を含む、複合体。
【0152】
２．標的化部分が、抗体、リガンド、アプタマー、ナノ粒子、および小分子からなる群
から選択される、条項１に記載の複合体。
から選択される、条項１に記載の複合体。
【0153】
３．標的化部分が抗体である、条項２に記載の複合体。
【0154】
４．抗体がＩｇＧ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２または（ｓｃＦｖ
’）２である、条項３に記載の複合体。
’）２である、条項３に記載の複合体。
【0155】
５．抗体がＩｇＧ１である、条項３に記載の複合体。
【0156】
６．抗体がモノクローナル抗体である、条項３～５のいずれか一項に記載の複合体。
【0157】
７．抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、条項３～６のいずれか一項に記載の複合
体。
体。
【0158】
８．標的細胞表面編集酵素が抗体の軽鎖と複合体化される、条項３～７のいずれか一項
に記載の複合体。
に記載の複合体。
【0159】
９．標的細胞表面編集酵素が抗体の重鎖と複合体化される、条項３～７のいずれか一項
に記載の複合体。
に記載の複合体。
【0160】
１０．標的細胞表面編集酵素が、抗体のＦｃ領域と複合体化される、条項９に記載の複
合体。
合体。
【0161】
１１．標的細胞表面編集酵素が重鎖のＣ末端と複合体化される、条項９に記載の複合体
。
。
【0162】
１２．標的細胞表面編集酵素が標的化部分と部位特異的に複合体化される、条項１～１
１のいずれか一項に記載の複合体。
１のいずれか一項に記載の複合体。
【0163】
１３．標的化部分が、標的細胞表面編集酵素が部位特異的に複合体化される非天然アミ
ノ酸を含む、条項１２に記載の複合体。
ノ酸を含む、条項１２に記載の複合体。
【0164】
１４．標的細胞表面編集酵素が、リンカーを介して標的化部分と複合体化される、条項
１～１３のいずれか一項に記載の複合体。
１～１３のいずれか一項に記載の複合体。
【0165】
１５．リンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、条項１４に記載の複合体
。
。
【0166】
１６．リンカーがペプチドである、条項１４に記載の複合体。
【0167】
１７．複合体が融合タンパク質である、条項１６に記載の複合体。
【0168】
１８．標的細胞が、癌細胞、免疫細胞、および内皮細胞からなる群から選択される、条
項１～１５のいずれか一項に記載の複合体。
項１～１５のいずれか一項に記載の複合体。
【0169】
１９．標的細胞が癌細胞である、条項１８に記載の複合体。
【0170】
２０．細胞表面分子が腫瘍関連細胞表面分子である、条項１９に記載の複合体。
【0171】
２１．細胞表面分子が腫瘍特異的細胞表面分子である、条項１９に記載の複合体。
【0172】
２２．癌細胞が癌腫細胞である、条項１９～２１のいずれか一項に記載の複合体。
【0173】
２３．癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、および結腸癌細胞からなる群から
選択される、条項１９～２２のいずれか一項に記載の複合体。
選択される、条項１９～２２のいずれか一項に記載の複合体。
【0174】
２４．細胞表面分子がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、条項２２または
条項２３に記載の複合体。
条項２３に記載の複合体。
【0175】
２５．標的化部分がトラスツズマブである、条項２４に記載の複合体。
【0176】
２６．標的化部分が、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ
、オファツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項３～１８のいず
れか一項に記載の複合体。
、オファツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項３～１８のいず
れか一項に記載の複合体。
【0177】
２７．標的細胞表面編集酵素が、標的細胞の表面上の分子を切断し、標的細胞の表面上
の分子を酸化し、標的細胞の表面上の分子を還元し、標的細胞の表面上の分子に部分を付
加し、または標的細胞の表面上の分子から部分を除去する、条項１～２６のいずれか一項
に記載の複合体。
の分子を酸化し、標的細胞の表面上の分子を還元し、標的細胞の表面上の分子に部分を付
加し、または標的細胞の表面上の分子から部分を除去する、条項１～２６のいずれか一項
に記載の複合体。
【0178】
２８．標的細胞表面編集酵素が、標的細胞の表面上の分子を切断する、条項１～２６の
いずれか一項に記載の複合体。
いずれか一項に記載の複合体。
【0179】
２９．標的細胞の表面上の分子がリガンドである、条項２８に記載の複合体。
【0180】
３０．リガンドが抑制性免疫受容体のリガンドである、条項２９に記載の複合体。
【0181】
３１．抑制性免疫受容体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、
好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球からなる群か
ら選択される免疫細胞上に存在する、条項３０に記載の複合体。
好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球からなる群か
ら選択される免疫細胞上に存在する、条項３０に記載の複合体。
【0182】
３２．抑制性免疫受容体が、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）受容体である
、条項３１に記載の複合体。
、条項３１に記載の複合体。
【0183】
３３．シグレック受容体がシグレック７である、条項３２に記載の複合体。
【0184】
３４．シグレック受容体がシグレック９である、条項３２に記載の複合体。
【0185】
３５．リガンドがシアログリカンである、条項２９～３４のいずれか一項に記載の複合
体。
体。
【0186】
３６．標的細胞表面編集酵素がシアリダーゼである、条項１～３５のいずれか一項に記
載の複合体。
載の複合体。
【0187】
３７．シアリダーゼがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼで
ある、条項３６に記載の複合体。
ある、条項３６に記載の複合体。
【0188】
３８．シアリダーゼがＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼである、条項３６
に記載の複合体。
に記載の複合体。
【0189】
３９．シアリダーゼが哺乳動物ノイラミニダーゼである、条項３６に記載の複合体。
【0190】
４０．哺乳動物ノイラミニダーゼがヒトノイラミニダーゼである、条項３９に記載の複
合体。
合体。
【0191】
４１．ヒトノイラミニダーゼが、ヒトノイラミニダーゼ１、ヒトノイラミニダーゼ２、
ヒトノイラミニダーゼ３、およびヒトノイラミニダーゼ４からなる群から選択される、条
項４０に記載の複合体。
ヒトノイラミニダーゼ３、およびヒトノイラミニダーゼ４からなる群から選択される、条
項４０に記載の複合体。
【0192】
４２．標的化部分と複合体化される２つ以上の標的細胞表面編集酵素を含む、条項１～
４１のいずれか一項に記載の複合体。
４１のいずれか一項に記載の複合体。
【0193】
４３．条項１～４２のいずれか一項に記載の複合体と
薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【0194】
４４．組成物が非経口投与用に製剤される、条項４３に記載の組成物。
【0195】
４５．条項１～４２のいずれか一項に記載の複合体、または条項４３もしくは条項４４
に記載の組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
に記載の組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
【0196】
４６．癌を有する個体に、条項１～４２のいずれか一項に記載の複合体、または条項４
３もしくは条項４４に記載の組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
３もしくは条項４４に記載の組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
【0197】
４７．ＡＤＣＣを必要とする個体に、条項１～３９のいずれか一項に記載の複合体、ま
たは条項４０もしくは条項４１に記載の組成物を投与することを含む、抗体依存性細胞傷
害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法。
たは条項４０もしくは条項４１に記載の組成物を投与することを含む、抗体依存性細胞傷
害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法。
【0198】
４８．投与が個体における免疫経路を調節する、条項４５～４７のいずれか一項に記載
の方法。
の方法。
【0199】
４９．免疫経路が、抑制性免疫受容体経路、補体経路、ペア型免疫グロブリン様２型受
容体（ＰＩＬＲ）経路、およびナチュラルキラーグループ２、メンバーＤタンパク質（Ｎ
ＫＧ２Ｄ）経路からなる群から選択される、条項４８に記載の方法。
容体（ＰＩＬＲ）経路、およびナチュラルキラーグループ２、メンバーＤタンパク質（Ｎ
ＫＧ２Ｄ）経路からなる群から選択される、条項４８に記載の方法。
【0200】
５０．標的細胞がその表面上にリガンドを含み、投与が標的細胞表面編集酵素によるリ
ガンドの編集をもたらす、条項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
ガンドの編集をもたらす、条項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
【0201】
５１．リガンドの編集が、リガンドの全部または一部の切断を含む、条項５０に記載の
方法。
方法。
【0202】
５２．リガンドが抑制性免疫受容体のリガンドである、条項５０または条項５１に記載
の方法。
の方法。
【0203】
５３．抑制性免疫受容体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、
好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球からなる群か
ら選択される免疫細胞上に存在する、条項５２に記載の方法。
好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好塩基球、および好酸球からなる群か
ら選択される免疫細胞上に存在する、条項５２に記載の方法。
【0204】
５４．抑制性免疫受容体が、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）受容体である
、条項５３に記載の方法。
、条項５３に記載の方法。
【0205】
５５．シグレック受容体がシグレック７である、条項５４に記載の方法。
【0206】
５６．シグレック受容体がシグレック９である、条項５４に記載の方法。
【0207】
５７．リガンドがシアログリカンである、条項５０～５６のいずれか一項に記載の方法
。
。
【0208】
５８．標的細胞表面編集酵素がシアリダーゼである、条項５７に記載の方法。
【0209】
５９．シアリダーゼがＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍシアリダーゼで
ある、条項５８に記載の方法。
ある、条項５８に記載の方法。
【0210】
６０．シアリダーゼがＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼである、条項５８
に記載の方法。
に記載の方法。
【0211】
６１．シアリダーゼが哺乳動物ノイラミニダーゼである、条項５８に記載の方法。
【0212】
６２．哺乳動物ノイラミニダーゼがヒトノイラミニダーゼである、条項６１に記載の方
法。
法。
【0213】
６３．ヒトノイラミニダーゼが、ヒトノイラミニダーゼ１、ヒトノイラミニダーゼ２、
ヒトノイラミニダーゼ３、およびヒトノイラミニダーゼ４からなる群から選択される、条
項６２に記載の方法。
ヒトノイラミニダーゼ３、およびヒトノイラミニダーゼ４からなる群から選択される、条
項６２に記載の方法。
【0214】
６４．標的細胞表面編集酵素によるリガンドの編集が、標的細胞表面上のナチュラルキ
ラーグループ２、メンバーＤタンパク質（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄを
増加させることによりナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を増強する、条項５０～６３
のいずれか一項に記載の方法。
ラーグループ２、メンバーＤタンパク質（ＮＫＧ２Ｄ）リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄを
増加させることによりナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を増強する、条項５０～６３
のいずれか一項に記載の方法。
【0215】
６５．個体が癌を有し、複合体が、個体の癌細胞の表面上の腫瘍関連細胞表面分子また
は腫瘍特異的細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、条項４５～６４のいずれか一項
に記載の方法。
は腫瘍特異的細胞表面分子に結合する標的化部分を含む、条項４５～６４のいずれか一項
に記載の方法。
【0216】
６６．癌細胞が癌腫細胞である、条項６５に記載の方法。
【0217】
６７．癌細胞が、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、および結腸癌細胞からなる群から
選択される、条項６５または条項６６に記載の方法。
選択される、条項６５または条項６６に記載の方法。
【0218】
６８．細胞表面分子がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）である、条項６６または
条項６７に記載の方法。
条項６７に記載の方法。
【0219】
６９．標的化部分がトラスツズマブである、条項６８に記載の方法。
【0220】
７０．標的化部分が、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ
、オファツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項４５～６３のい
ずれか一項に記載の方法。
、オファツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項４５～６３のい
ずれか一項に記載の方法。
【0221】
７１．条項１～４２のいずれか一項に記載の複合体、または条項４３もしくは条項４４
の組成物を含むキット。
の組成物を含むキット。
【0222】
７２．キットが１つ以上の単位用量で複合体または組成物を含む、条項７１に記載のキ
ット。
ット。
【0223】
７３．キットが２つ以上の単位用量で複合体または組成物を含む、条項７２に記載のキ
ット。
ット。
【0224】
７４．複合体または組成物を使用して、それを必要とする個体を治療するための説明書
を含む、条項７１～７３のいずれか一項に記載のキット。
を含む、条項７１～７３のいずれか一項に記載のキット。
【0225】
７５．個体が癌を有し、説明書は、個体に、癌を治療するための治療有効量の複合体ま
たは組成物を投与するためのものである、条項７４に記載のキット。
たは組成物を投与するためのものである、条項７４に記載のキット。
【0226】
７６．
標的細胞の表面上の細胞表面分子に結合する標的化部分に標的細胞表面編集酵素を複合
体化することを含む、方法。
標的細胞の表面上の細胞表面分子に結合する標的化部分に標的細胞表面編集酵素を複合
体化することを含む、方法。
【0227】
７７．複合体化は、標的細胞表面編集酵素を標的化部分と部位特異的に複合体化するこ
とを含む、条項７６に記載の方法。
とを含む、条項７６に記載の方法。
【0228】
７８．複合体化は、標的細胞表面編集酵素を標的化部分の非天然アミノ酸と部位特異的
に複合体化することを含む、条項７７に記載の方法。
に複合体化することを含む、条項７７に記載の方法。
【0229】
７９．標的細胞表面編集酵素が、リンカーを介して標的化部分と複合体化される、条項
７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
【0230】
８０．リンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、条項７９に記載の方法。
【0231】
８１．リンカーがペプチドである、条項７９に記載の方法。
【0232】
８２．複合体が融合タンパク質である、条項８１に記載の方法。
【0233】
８３．標的細胞表面編集酵素がシアリダーゼであり、標的化部分が抗体である、条項７
６～８０のいずれか一項に記載の方法。
６～８０のいずれか一項に記載の方法。
【0234】
８４．抗体が抗ＨＥＲ２抗体である、条項８３に記載の方法。
【0235】
８５．抗体がトラスツザマブである、条項８４に記載の方法。
【0236】
８６．抗体が、セツキシマブ、ダラツムマブ、ギレンツキシマブ、パニツムマブ、オフ
ァツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項８３に記載の方法。
ァツムマブ、およびリツキシマブからなる群から選択される、条項８３に記載の方法。
【0237】
８７．条項８２に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【0238】
８８．条項８７に記載の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクター
。
。
【0239】
８９．条項８７に記載の核酸または条項８８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【0240】
９０．宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、条項８９に記載の宿主細胞。
【0241】
このように、上記は単に本開示の原理を説明しているにすぎない。当業者であれば、た
とえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、そ
の精神および範囲内に含まれる種々の構成を作ることができることが理解されよう。さら
に、本明細書で引用されたすべての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理お
よび発明者らが当該技術を促進することに寄与する概念を理解する上で読者を助けること
を意図しているものであり、このような具体的に列挙された例および条件に限定されるも
のではないと解釈されるべきである。本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそ
の特定の例を記載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物
の両方を包含するように意図されている。そのような等価物は、現在既知の等価物および
将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす開発された任意の
要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示し説明した例
示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および
趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
とえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、そ
の精神および範囲内に含まれる種々の構成を作ることができることが理解されよう。さら
に、本明細書で引用されたすべての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理お
よび発明者らが当該技術を促進することに寄与する概念を理解する上で読者を助けること
を意図しているものであり、このような具体的に列挙された例および条件に限定されるも
のではないと解釈されるべきである。本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそ
の特定の例を記載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物
の両方を包含するように意図されている。そのような等価物は、現在既知の等価物および
将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす開発された任意の
要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示し説明した例
示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および
趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】