特許 7497417 新規ＩＬ－１０変異体タンパク質及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-31

(45)【発行日】2024-06-10

(54)【発明の名称】新規ＩＬ－１０変異体タンパク質及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/54 20060101AFI20240603BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240603BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20240603BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240603BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240603BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240603BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20240603BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240603BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240603BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240603BHJP

【ＦＩ】

C07K14/54 ZNA

C07K19/00

C12N15/24

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

A61K38/20

A61P37/00

A61P37/06

C07K16/00

C07K14/705

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2022501238

(86)(22)【出願日】2020-07-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-22

(86)【国際出願番号】 KR2020008871

(87)【国際公開番号】W WO2021006605

(87)【国際公開日】2021-01-14

【審査請求日】2022-03-01

(31)【優先権主張番号】10-2019-0082149

(32)【優先日】2019-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】521498069

【氏名又は名称】プロジェン・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(73)【特許権者】

【識別番号】516351304

【氏名又は名称】ジェネクシン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸＩＮＥ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】１７２ Ｍａｇｏｋｊｕｎｇａｎｇ－ｒｏ， Ｇａｎｇｓｅｏ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０７７８９ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】シン，ウンジュ

(72)【発明者】

【氏名】ナム，ウンジュ

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５３０９８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５０４４２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０００－５１６０８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／０４５３３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５０５１７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Josephson K, et al.，Design and analysis of an engineered human interleukin-10 monomer，J Biol Chem，vol.275, no.18，2005年05月05日，p.13552-7，doi: 10.1074/jbc.275.18.13552

【文献】Definition: IL10_HUMAN，Database Uniprot [online]，2019年07月03日，[検索日 2023.2.14], Internet:<URL: https://rest.uniprot.org/unisave/P22301?format=txt&versions=197>，Accession no. P22301

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ａ６１Ｋ ３８／２０

Ａ６１Ｐ ３７／００

Ａ６１Ｐ ３７／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４６で記載されるか、または配列番号４６で８７番目のアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）がアラニン（Ａ）で置換されているヒトインターロイキン－１０（以下、ＩＬ－１０）タンパク質の成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）において、少なくとも１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目のアミノ酸であるリシンの間にグリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）で構成される９ａ．ａ．の長さを有するスペーサーペプチドが挿入され、配列番号１または配列番号３９に記載されているアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する、単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質。

【請求項2】

配列番号１または３９で記載されるアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質。

【請求項3】

配列番号４６で記載されるヒトインターロイキン－１０（以下、ＩＬ－１０）タンパク質の成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）において、少なくとも１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目のアミノ酸であるリシンの間にグリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）で構成される９ａ．ａ．の長さを有するスペーサーペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質は配列番号１または配列番号３９に記載されているアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する融合タンパク質。

【請求項4】

前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質は、配列番号１または３９で記載されるアミノ酸配列で構成される、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

他の機能を担当する一つ以上の融合パートナータンパク質（ｐａｒｔｎｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記融合パートナータンパク質は、標的タンパク質に特異的に結合する抗体、前記抗体の抗原－結合断片、前記標的タンパク質に特異的に結合する抗体ミメティック、抗体のＦｃ領域、抗体Ｆｃ領域受容体、前記抗体Ｆｃ領域受容体のＦｃ領域結合細胞外ドメイン、二量体化ドメイン、サイトカイン、または免疫調節ペプチドである、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記抗体Ｆｃ領域は配列番号６乃至９のうちいずれか一つのアミノ酸配列で構成される、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記抗体Ｆｃ領域受容体はＩｇＥ Ｆｃ受容体のαサブユニットまたはその細胞外ドメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記抗体の抗原－結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｖ_ＮＡＲまたはＶ_ＨＨである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記抗体ミメティックは、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｌｉｎ、ａｆｆｉｍｅｒ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｌｐｈａｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ａｖｉｍｅｒ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、ｒｅｐｅｂｏｄｙ、ＶＬＲ、またはｎａｎｏＣＬＡＭＰである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記抗体のＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭのＦｃ領域または前記Ｉｇサブクラスのうち２つ以上の抗体Ｆｃ領域内のドメインが混合されたハイブリッドＦｃである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

前記二量体化ドメインは、抗体のヒンジドメイン、ＬＩＭ／ｄｏｕｂｌｅ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆ、ＲＡＧ１ドメイン、ＨＡＴ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＴＲＦＨ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、Ｓｔａｔ３ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、またはＬＦＢ１／ＨＮＦ１ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

前記サイトカインはＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１α、またはＴＧＦ－βである、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記免疫調節ペプチドはＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）である、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

請求項１または請求項２に記載の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質、または請求項３乃至請求項１４のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項17】

請求項１または請求項２に記載の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質、または請求項３乃至請求項１４のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む免疫抑制用薬学的組成物。

【請求項18】

請求項１または請求項２に記載の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質、または請求項３乃至請求項１４のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、免疫疾患治療用薬学的組成物。

【請求項19】

前記免疫疾患は、１型糖尿病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節リウマチ、乾癬または乾癬性関節炎、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハシモト甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、炎症性筋疾患(ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｙｏｐｈａｔｈｙ)、自己免疫性血管炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、自己免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、溶血性貧血（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）、アレルギー性疾患、またはセリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）で構成される群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は変異体タンパク質に関し、より詳しくは、生産性と免疫抑制能力が向上された新規ＩＬ－１０変異体タンパク質及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン１０（以下、「ＩＬ－１０」と称する）は、サイトカイン合成阻害因子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ， ＣＳＩＦ）と呼ばれるやく３７ｋＤａの非共有結合された同種二量体で発現される抗－炎症性サイトカインである。ＩＬ－１０は免疫寛容の誘導と維持に重要な役割をし、このような優勢な抗－炎症特性は長期間知られていた。ＩＬ－１０は、ＴＮＦα、ＩＬ－１、ＩＬ－６、及びＩＬ－１２だけでなく、ＩＬ－２及びＩＮＦγのようなＴｈ１サイトカインのような炎症性サイトカイン（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌を抑制し、マクロファージ、Ｂ細胞及びＴ細胞の分化及び増殖を調節する（Ｇｌｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２４６：１０２－１０７， ２０１１；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，６８３－７６５（２００１）；Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：９１５－９２４，１９９１），Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２８１－２９２，２００４）。また、これは抗原提示の強力な抑制剤であって、ＭＨＣ ＩＩ発現だけでなく共刺激因子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上向き調節を抑制する（Ｍｏｓｓｅｒ＆Ｙｈａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２６：２０５－２１８，２００８）。このような特性のため、ＩＬ－１０を炎症性腸疾患や乾癬のような免疫疾患などの治療剤として使用しようとする研究が進められてきた。

【0003】

しかし、ＩＬ－１０は免疫刺激活性という正反対の作用も有するという二重特性を有すると知られている。それに関し、詳しくは、ＩＬ－１０はＢ細胞の活性化を刺激し、Ｂ細胞の生存を延長し、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に寄与する。また、ＮＫ細胞の増殖とサイトカインの生成を刺激し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の特定部分の集団の増殖を促進する成長因子の役割をする(Ｍｏｓｓｅｒ＆Ｙｈａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２６：２０５－２１８，２００９；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６５８－２６６５，１９９９；Ｓａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４７２９－４７３７，２０００；Ｒｏｗｂｏｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３１８８－３１９３，１９９８）。人間において高容量（それぞれ２０及び２５μｇ／ｋｇ）のＩＬ－１０はＩＮＦγの生産を増加させると重要に報告されている（Ｌａｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：２７８３－２７８９，２０００；Ｔｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ５０：１９１－１９５，２００２）。

【0004】

そこで、ＩＬ－１０タンパク質の８７番目アミノ酸であるイソロイシンが免疫活性化に関連しており、それをアラニンに置換すれば免疫活性作用が抑制されるということが報告されている（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１（２）：２１３－２２３，２０００）。しかし、前記変異体ＩＬ－１０の場合、野生型に比べＩＬ－１０Ｒ１との親和性が非常に弱いと確認されており、同等な免疫活性のためには高容量の投与が必要という短所がある。

【0005】

一方、ＩＬ－１０タンパク質は構造的特性のため組換えタンパク質として生産する際に多量の不溶性凝集体が生成されるが、これは生産性において大きな問題点を引き起こす。そこで、ＩＬ－１０の２次構造上、４番目及び５番目のαらせんの間に６ａ．ａ．のリンカーペプチドを導入することで二量体を形成しない単量体性ＩＬ－１０が開発されたが（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３５５２－１３５５７，２０００）、体内半減期が短くて活性が非常に低いため、それを治療剤として使用するのに障害となっている。このような低い体内安定性を克服するために、ＩｇＡのＦｃドメインに融合タンパク質の形態で発現させる試みが行われたが（Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，７（１０）：ｅ４６４６０，２０１２）、ＩＬ－１０活性の回復は制限的であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は上述した問題点を含む様々な問題点を解決するためのものであって、より効率的で体内安定性及び安全性が確保される新たなＩＬ－１０変異体タンパク質を提供することを目的とする。しかし、本発明の保護範囲は前記目的に制限されない。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一観点によると、ヒトインターロイキン－１０（以下、ＩＬ－１０）タンパク質の成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目のアミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ.ａ.の長さを有するスペーサーペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質が提供される。

【0008】

本発明の他の一観点によると、前記ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ．ａ．の長さを有するスペーサーペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。

【0009】

本発明のまた他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが提供される。

【0010】

本発明の更に他の一観点によると、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。

【0011】

本発明の更に他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を有効成分として含有する免疫抑制剤が提供される。

【0012】

本発明の更に他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を有効成分として含有する免疫疾患治療剤が提供される。

【0013】

本発明の更に他の一観点によると、治療的に有効な量の前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を免疫抑制を必要とする個体に投与するステップを含む前記個体の免疫抑制方法が提供される。

【発明の効果】

【0014】

本発明の一実施例による単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質は、ＩＬ－１０タンパク質の二重特性のうち一つである免疫活性化作用を抑制するだけでなく、単量体の形態で発現されながらも生産効率が増進され、他の生理活性タンパク質と融合タンパク質の形態で発現されてもその活性がそのまま維持されるなど、従来のＩＬ－１０変異体タンパク質に比べ優れた特性を示すため、新たな免疫抑制剤及び／または免疫疾患治療剤として使用される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＩＬ－１０二量体（左側）、前記ＩＬ－１０二量体の単量体（中央）、及び本発明の一実施例によってスペーサーペプチドが挿入されて安定的な単量体構造を有するＩＬ－１０単量体（右側）の３次元構造を示す構造図である。

【0016】

【図2a】二量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質をＦｃタンパク質に連結して構築した融合タンパク質の生産過程における非還元及び還元条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す写真である。

【0017】

【図2b】最終精製された前記二量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析で分析した結果を示すクロマトグラムである。

【0018】

【図2c】本発明の実施例１及び２による単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質をＦｃタンパク質に連結した融合タンパク質の精製過程におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った結果を示す写真である。

【0019】

【図2d】最終精製された前記実施例１（上端）及び２（下端）の単量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析で分析した結果を示す一連のクロマトグラムである。

【0020】

【図2e】本発明の比較例２の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質の非還元及び還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。

【0021】

【図2f】最終精製された比較例２の単量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析で分析した結果を示すクロマトグラムである。

【0022】

【図3a】本発明の実施例３による融合タンパク質（ＰＧ－０７５－８）を一時的に形質感染された細胞で発現させた後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを利用して精製する工程中にタンパク質の発現程度を確認するための非還元条件（左側）及び還元条件（右側）におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。

【0023】

【図3b】前記融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）を一時的に形質感染された細胞で発現させた後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを利用して精製する工程中に１０番目（Ａ１０）乃至１２番目（Ａ１２）の分画に対してＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって純度を確認した結果を示すクロマトグラムである。

【0024】

【図3c】本発明の比較例３による融合タンパク質（ＰＧ０７５－９）を一時的に形質感染された細胞で発現させた後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを利用して精製する工程中にタンパク質の発現程度を確認するための非還元条件（右側）及び還元条件（左側）におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。

【0025】

【図3d】前記融合タンパク質（ＰＧ０７５－９）を一時的に形質感染された細胞で発現させた後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを利用して精製する工程中に１１番目（Ａ１１）乃至１２番目（Ａ１２）の分画に対してＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって純度を確認した結果を示すクロマトグラムである。

【0026】

【図3e】本発明の前記実施例３による融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）を生産するように製造された安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）から前記融合タンパク質の精製工程によるタンパク質の発現程度を確認するための非還元条件（左側）及び還元条件（右側）におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。

【0027】

【図3f】前記安定化細胞株で最終精製された融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）の純度を確認するためのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果を示すクロマトグラムである。

【0028】

【図4a】本発明の比較例１及び２、そして実施例１及び２のＩＬ－１０融合タンパク質のＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖に及ぼす影響をＦＡＣＳ分析で調べた結果を示す一連のヒストグラムである。

【0029】

【図4b】前記図４ａの結果を定量化したグラフである。

【0030】

【図4c】本発明の比較例１及び２、そして実施例１及び２のＩＬ－１０融合タンパク質のＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖に及ぼす影響をＦＡＣＳ分析で調べた結果を示す一連のヒストグラムである。

【0031】

【図4d】前記図４ｃの結果を定量化したグラフである。

【0032】

【図5a】対照群であるｒｈＩＬ－１０、及び本発明の比較例１及び２、そして実施例１及び２のＩＬ－１０変異体融合タンパク質の処理濃度による骨髄由来肥満細胞の増殖能に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。

【0033】

【図5b】対照群であるｒｈＩＬ－１０と本発明の比較例１及び実施例１のＩＬ－１０変異体融合タンパク質の処理濃度を上げた後、骨髄由来肥満細胞の増殖能に及ぼす影響を分析した結果を示すグラフである。

【0034】

【図6a】比較例１の二量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の濃度による肥満細胞におけるＴＮＦ－αの分泌変化を分析した結果を示すグラフである。

【0035】

【図6b】本発明の実施例１及び２、そして比較例２の単量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の濃度による肥満細胞におけるＴＮＦ－αの分泌変化を分析した結果を示すグラフである。

【0036】

【図6c】本発明の一実施例による融合タンパク質ＰＧ０７５－８、及び比較例として二量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質（ＩＬ－１０Ｍ－１；Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ）の肥満細胞におけるＴＮＦ－αの分泌抑制能を分析した結果を示すグラフである。

【0037】

【図6d】本発明の一実施例による融合タンパク質ＰＧ０７５－８の処理濃度によるマクロファージにおけるＴＮＦ－αの分泌抑制能を分析した結果を示すグラフである。

【0038】

【図7】本発明の比較例１の二量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質（左側）、及び実施例１の単量体性ＩＬ－１０変異体融合タンパク質（右側）の処理濃度によるＩＬ－１０Ｒ１との親和度をＢＬＩ分析で確認した結果を示す一連のセンソグラムである。

【0039】

【図8a】比較例としてＦｃεＲＩα－ＦｃのマウスＩｇＥとの親和性をＢＬＩ分析で分析した結果を示すセンソグラムである。

【0040】

【図8b】本発明の実施例３の融合タンパク質ＰＧ０７５－８（ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ；下端）のマウスＩｇＥとの親和性をＢＬＩ分析で分析した結果を示すセンソグラムである。

【0041】

【図8c】本発明の実施例３の融合タンパク質ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ（ＰＧ０７５－８）のヒトＩｇＥとの親和度をＢＬＩ分析で分析した結果を示すセンソグラムである。

【0042】

【図9】本発明の一実施例による融合タンパク質を実験動物（ラット）に多様な経路（静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、及び皮下注射）で投与した後、最大３３０時間まで血清内に残っている融合タンパク質の量を定量することで薬物動態学分析を行った結果を示すグラフである。

【0043】

【図10】本発明の一実施例による融合タンパク質ＰＧ０７５－８を実験動物に投書する際、白血球（Ａ）、赤血球（Ｂ）、及び血小板（Ｃ）の数の変化が現れるのか否かを調べた血液毒性分析結果を示す一連のグラフである。

【0044】

【図11】本発明の一実施例による融合タンパク質ＰＧ０７５－８が実際動物でアレルギー症状を減少させるのか否かを調べたものであって、ＯＶＡで感作されたマウスに対してＯＶＡの経口投与で飲食物アレルギーを誘発させた後、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８及び比較例としてＩｇＥ ＴＲＡＰを投与した際の下痢症状の変化（Ａ）、実験終了後に犠牲されたマウスから測定された遊離ＩｇＥの濃度（Ｂ）、総ＩｇＥの濃度（Ｃ）、及びアレルギー因子として血中肥満細胞内の脱顆粒酵素（ＭＣＰＴ－１，ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ－１）の濃度（Ｄ）を測定した結果を示す一連のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明の一観点によると、ヒトインターロイキン－１０（以下、ＩＬ－１０）タンパク質の成熟型を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目のアミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ．ａ．の長さを有するスペーサーペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質が提供される。

【0046】

前記ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型の形態は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２２３０１に記載の１９－１７８番目のアミノ酸配列（配列番号４６）から由来するものである。

【0047】

前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質において、前記スペーサーペプチドは７乃至１１ａ．ａ．、８乃至１０ａ．ａ．または９ａ．ａ．の長さを有し、６、７、８、９、１０、１１、または１２ａ．ａ．の長さを有する。本発明の具体的な様態において、前記スペーサーペプチドはＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、（ＧＧＧＳＧＧ）_ｎ（単位体：配列番号５、ｎは１または２の整数）、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（単位体：配列番号１２、ｎは１または２の整数）、（ＧＧＳ）_ｎ（ｎは２乃至４の整数）、（ＧＳ）_ｎ（ｎは３乃至６の整数）、または（ＧＳＳＧＧＳ）_ｎ（単位体：配列番号１３、ｎは１乃至２の整数）のアミノ酸配列を有するスペーサーペプチドであり、前記スペーサーペプチドを構成するアミノ酸は免疫原性を誘発しないのであれば他の種類のアミノ酸に置換されてもよいが、好ましくは９ａ．ａ．の長さを有する。

【0048】

本文書で使用される用語である「スペーサーペプチド（ｓｐａｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、特定タンパク質の内部に挿入されて該当タンパク質の構造及び／または機能を変化させる役割をするペプチドを意味する。このような意味で、他の融合パートナーを連結するリンカーペプチドと区分されるが、通常のリンカーペプチドがするリンカーペプチドとして使用されてもよい。

【0049】

本発明の一実施例による単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0050】

前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質は、ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型の形態を基準に８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質であり、詳しくは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する。

【0051】

前記単量体性ＩＬ－１０タンパク質は、単量体性ＩＬ－１０を形成する構造を示すのであれば配列番号１または配列番号３９のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上同じものであってもよく、哺乳動物由来のタンパク質はいずれも含まれる。

【0052】

本発明の他の一観点によると、前記ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ.ａ.の長さを有するスペーサーペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。

【0053】

本発明で使用される用語である「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質またはタンパク質内の特定機能を担当するドメインがそれぞれのタンパク質またはドメインの本然の機能を担当するように連結された組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。前記２つ以上のタンパク質またはドメインの間には通常柔軟な構造を有するリンカーペプチド（ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）が挿入される。前記リンカーペプチドは、ＡＡＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４）、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号５）、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（単位体：配列番号１２、ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＧＳ）_ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＳ）_ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＳＳＧＧＳ）_ｎ（単位体：配列番号１３、ｎは１乃至１０の整数）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１４）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号１５）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１６）、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（単位体：配列番号１７、ｎは１乃至１０の整数）、ＣＲＲＲＲＲＲＥＡＥＡＣ（配列番号１８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ（配列番号１９）、ＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２０）、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＡ（配列番号２２）、ＰＡＰＡＰ（配列番号２３）、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ（配列番号２４）、ＰＬＧＬＷＡ（配列番号２５）、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号２６）、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ（配列番号２７）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２８）、ＧＦＬＧ（配列番号２９）、ＧＳＳＧＧＳＧＳＳＧＧＳＧＧＧＤＥＡＤＧＳＲＧＳＱＫＡＧＶＤＥ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３５）、ＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＧＳＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰ（配列番号３６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３７）、ＧＳＧＧＧＳＧＴＬＶＴＶＳＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３８）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４０）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４１）、ＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＫＮＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＴＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４３）、ＡＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）、及びＧＧＧＳＧＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４５）などが含まれる。

【0054】

前記融合タンパク質は他の機能を担当する一つ以上の融合パートナータンパク質（ｐａｒｔｎｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むが、このような融合パートナータンパク質は、標的タンパク質に特異的に結合する抗体、前記抗体の抗原－結合断片、前記標的タンパク質に特異的に結合する抗体ミメティック、抗体のＦｃ領域、抗体Ｆｃ領域受容体、前記抗体Ｆｃ領域受容体またはそのＦｃ領域結合細胞外ドメイン、二量体化ドメイン、サイトカイン、または免疫調節ペプチドである。

【0055】

前記融合タンパク質において、前記抗体の抗原結合断片はＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｖ_ＮＡＲまたはＶ_ＨＨであり、前記抗体ミメティックはａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｌｉｎ、ａｆｆｉｍｅｒ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｌｐｈａｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ａｖｉｍｅｒ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、ｒｅｐｅｂｏｄｙ、ＶＬＲ、またはｎａｎｏＣＬＡＭＰである。前記抗体のＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃであり、前記Ｉｇサブクラスのうち２つ以上のドメイン（ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインなど）が混合されたハイブリッドＦｃ（ｈｙＦｃ）であるが、前記ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり、特に、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲｃ）及び補体（Ｃ１ｑ）に対する親和度が低いよう、Ｆｃの効果器（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能である抗体依存性細胞障害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を担当する機能基部分に変異が誘導された変異体Ｆｃ及び／または胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦｃＲｎ）に対する選択的親和度が高くて血中半減期が増加されるように変異された変異体Ｆｃである。このうち、前記ハイブリッドＦｃ（ｈｙＦｃ）は韓国特許第８９７９３８号、第１３８０７３２号、第１３８０７２９号などの記載のものを使用し、前記変異体Ｆｃは国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００６３４６に記載の変形免疫グロブリンＦｃタンパク質（ＮＴＩＧ）である。より詳しくは、前記Ｆｃ領域は配列番号６乃至９で記載されるアミノ酸配列のうちいずれか一つのアミノ酸配列を含む。前記「ＮＴＩＧ」は、配列番号６及び７かならる群より選択されるハイブリッドＦｃ（ｈｙＦｃ）タンパク質の１８番目及び１９６番目アミノ酸が他のアミノ酸に変異されてＡＤＣＣ及びＣＤＣのような効果器機能がないながらもＦｃＲｎに対する選択的親和度が増加し、血中半減期が改善された変形Ｆｃドメインタンパク質を意味する。このような前記ＮＴＩＧは、配列番号８及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0056】

前記二量体化ドメインは、抗体のヒンジドメイン、ＬＩＭ／ｄｏｕｂｌｅ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆ、ＲＡＧ１ドメイン、ＨＡＴ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＴＲＦＨ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、Ｓｔａｔ３ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、またはＬＦＢ１／ＨＮＦ１ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎであるが、これに限らない。前記サイトカインはＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－α、またはＴＧＦ－βであり、前記免疫調節ペプチドはＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）である。特に、前記Ｆｃドメインが融合パートナータンパク質であれば、ヒンジ部分に存在するシステイン基の間に生成される分子間二硫化結合によって二量体を形成する。前記融合パートナータンパク質は、本発明の一実施例による単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質のＮ－末端またはＣ－末端のいずれにも連結される。併せて、この場合、上述した多様なリンカーペプチドを介して連結される。

【0057】

本文書で使用される用語である「抗体」は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）分子であって２つの同じ重鎖及び２つの同じ軽鎖が結合して生成される二重四量体タンパク質で前記軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）及び前記重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）によって構成される抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）によって抗原特異的結合をし、それによって抗原特異的体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発する。

【0058】

本文書で使用される用語である「抗体の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、抗体から由来する抗原結合能を有する断片であって、抗体をタンパク質切断酵素で切断して生成された断片はもちろん、組換え方式で生成された単一鎖断片をいずれも含むが、これにはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ、及びＶ_ＨＨが含まれる。

【0059】

本文書で使用される用語である「Ｆａｂ」は、抗原結合抗体断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）であり、抗体分子をタンパク質分解酵素であるパパインで切断して生成される断片で、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬの２つのペプチドの二量体であって、パパインによって生成された他の断片はＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）と称する。

【0060】

本文書で使用される用語である「Ｆ（ａｂ’）_２」は、抗体をタンパク質分解酵素であるペプシンで切断して生成される断片のうち抗原結合部位を含む断片であって、前記２つのＦａｂが二硫化結合で連結された四量体状を示す。ペプシンによって生成された他の断片はｐＦｃ’と称する。

【0061】

本文書で使用される用語である「Ｆａｂ」は、前記Ｆ（ａｂ’）_２を弱い還元条件で分離することで生成されるＦａｂと構造が類似した分子である。

【0062】

本文書で使用される用語である「ｓｃＦｖ」は「ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ」の略語であって実際の抗体の断片ではないが、抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を約２５ａ．ａ．サイズのリンカーペプチドで連結して製造した一種の融合タンパク質であり、固有の抗体断片ではないにもかかわらず、抗原結合能を有すると知られている（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（６）：１３６２－１３６７，１９９０）。

【0063】

本文書で使用される用語である「ｄｉａｂｏｄｙ」及び「ｔｒｉａｂｏｄｙ」は、それぞれ２つ及び３つのｓｃＦｖがリンカーによって連結された形態の抗体断片を意味する。

【0064】

本文書で使用される用語である「ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる抗体の単一可変領域断片からなる抗体断片である。主に重鎖から由来するｓｄＡｂが使用されるが、軽鎖から由来する単一可変領域断片も抗原に対して特異的結合をすると報告されている。重鎖及び軽鎖からなる通常の抗体とは異なって、単一鎖の二量体のみからなるサメ抗体の可変領域断片からなるＶ_ＮＡＲ、及びラクダ類抗体の可変領域断片からなるＶ_ＨＨもｓｄＡｂに含まれる。

【0065】

本文書で使用される「抗体ミメティック（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖が異種四合体の４次構造を形成して機能を発揮する通常の全長抗体とは異なって、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）などのように非抗体由来のタンパク質の骨組から製造される抗体と類似した機能、つまり、抗原結合能を有するタンパク質を含む概念である。このような抗体ミメティックとしては、タンパク質ＡのＺドメイン由来のＡｆｆｉｂｏｄｙ（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．Ａ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６６８－２６７６，２００８）、Ｇａｍｍａ－Ｂ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎまたはＵｂｉｑｕｉｔｉｎ由来のＡｆｆｉｌｉｎ（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２－１８５，２００７）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ由来のＡｆｆｉｍｅｒ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（１５）：６５５３－６５６０，２０１２）、Ｓａｃ７ｄ由来のＡｆｆｉｔｉｎ（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３ （５）：１０５８－１０６８，２００８）、Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌタンパク質由来のＡｌｐｈａｂｏｄｙ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：５２３７，２０１４）、ｌｉｐｏｃａｌｉｎ由来のＡｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７－２６８３，２００８）、多様な膜受容体のドメイン由来のＡｖｉｍｅｒ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６－１５６１，２００５）、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ由来のＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．１３（１５－１６）：６９５－７０１，２００８）、Ｆｙｎタンパク質のＳＨ３ドメイン由来のＦｙｎｏｍｅｒ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６－３２０４，２００７）、多様なタンパク質阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメイン由来のＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．９（２）：２６１－２６８，２００６）、フィブロネクチンの１０番目の第３型ドメイン由来のｍｏｎｏｂｏｄｙ（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９，２００７）、炭水化物結合モジュール３２－２由来のｎａｎｏＣＬＡＭＰ（Ｓｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．１３４：１１４－１２４，２０１７）、ヌタウナギ由来の可変性リンパ球受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＶＬＲ）（Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２０３－２２０，２０１２）、及び前記ＶＬＲを基に抗原親和性を向上させるように操作されたｒｅｐｅｂｏｄｙ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ：Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：３２９９－３３０４，２０１２）などが含まれる。

【0066】

前記融合タンパク質において、前記抗体Ｆｃ領域受容体はＩｇＥ Ｆｃ受容体のαサブユニットの細胞外ドメインである。

【0067】

本発明のまた他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが提供される。

【0068】

本発明の更に他の一観点によると、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。

【0069】

前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に連結される遺伝子コンストラクトの形態で含まれる。

【0070】

本文書で使用される用語である「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」とは、目的とする拡散配列（例えば、試験管内転写／翻訳システムで、または宿主細胞で）がその発現が行われるようにする方式で前記調節配列に連結されていることを意味する。

【0071】

前記「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサ、及び他の調節要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含む意味である。調節配列には、多くの宿主細胞で目的とする核酸が恒常的に発現されるように指示すること、特定の組織細胞でのみ目的とする核酸が発現されるように指示すること（例えば、組織特異的調節配列）、そして特定信号によって発現が誘導されるように指示すること（例えば、誘導性調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、及び所望のタンパク質発現の水準などのような因子によって異なり得るということは当業者であれば理解できる。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入されて前記融合タンパク質を発現する。前記真核細胞及び原核細胞で発現を可能にする調節配列は当業者によく知られている。上述したように、これらは通常転写開始を担当する調節配列、及び選択的に転写物の転写終結及び安定化を担当するポリ－Ａ信号を含む。更なる調節配列は、転写調節因子以外にも翻訳増進因子及び／または天然組み合わせまたは異種性プロモータ領域を含む。例えば、哺乳類の宿主細胞で発現を可能にする可能な調節配列は、ＣＭＶ－ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、ＳＶ４０、ＲＳＶ－プロモータ（ラウス肉腫ウイルス）、ヒト腎臓要素１α－プロモータ、糖質コルチコイド誘導性ＭＭＴＶ－プロモータ（モロニーマウス腫瘍ウイルス）、メタロチオネイン誘導性またはテトラシクリン誘導性プロモータ、またはＣＭＶ増幅剤またはＳＶ－４０増幅剤などのような増幅剤を含む。神経細胞内発現のために、神経細糸プロモータ（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＰＧＤＦ－プロモータ、ＮＳＥ－プロモータ、ＰｒＰ－プロモータ、またはｔｈｙ－１－プロモータなどが使用されるということが考慮されている。前記プロモータは当分野で知られており、文献（Ｃｈａｒｒｏｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７３９－２５７４５，１９９５）に記述されている。原核細胞内の発現のために、ｌａｃ－プロモータ、ｔａｃ－プロモータ、またはｔｒｐプロモータを含む多数のプロモータが開示されている。転写を開始する因子の他、前記調節配列は本発明の一実施例によるポリヌクレオチドの下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にＳＶ－４０－ポリ－Ａ部位またはＴＫ－ポリ－Ａ部位のような転写終結信号を含む。本文書において、適当な発現ベクターは当分野で知られており、その例としては、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＸ－２７（特許第１４４２２５４号）、ｐＸ（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１１４４－１１４７，１９９２）、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）ベクター、例えば、ｐＥＧ２０２及びｄｐＪＧ４－５（Ｇｙｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：７９１－８０３，１９９５）、または原核発現ベクター、例えば、λｇｔ１１またはｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。本発明の核酸分子以外にも、ベクターは分泌信号を暗号化するポリヌクレオチドを更に含んでもよい。前記分泌信号は当業者によく知られている。そして、使用された発現システムによって、融合タンパク質を細胞区画に導くリーダ配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が本発明の一実施例によるポリヌクレオチドのコード配列に組み合わせられるが、好ましくは解読されたタンパク質またはそのタンパク質を細胞質周辺または細胞外媒質に直接分泌するリーダ配列である。

【0072】

また、本発明のベクターは、例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造されるが、標準組換えＤＮＡ技術には、例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、不適合な結合を防止鵜するためにアルカリホスファターゼ処理によるリン酸基の除去、及びＴ４ ＤＮＡライゲーズによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られた信号ペプチドをコードするＤＮＡ、本発明の変異体ＩＬ－１０タンパク質またはそれを含む融合タンパク質を暗号化するＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクターに組み換えることで、本発明のベクターが製造される。前記調節配列が含まれているベクターは商業的に購入または製造することができるが、本発明の一実施例ではｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃベクターをバックボーンとして使用している。

【0073】

前記発現ベクターは分泌信号配列を暗号化するポリヌクレオチドを更に含むが、前記分泌信号配列は、細胞内で発現する組換えタンパク質の細胞外への分泌を誘導し、ｔＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）信号配列、ＨＳＶ ｇＤｓ（単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄｓ）信号配列、または成長ホルモン信号配列である。

【0074】

本発明の一実施例による前記発現ベクターは宿主細胞で前記タンパク質を発現するようにする発現ベクターであり、前記発現ベクターはプラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、ヒト人工染色体など、いかなる形態を示してもよい。

【0075】

本発明の更に他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を有効成分として含有する免疫抑制用組成物が提供される。

【0076】

併せて、前記免疫抑制用組成物は、公知の免疫抑制剤成分（免疫抑制の効能を有するｃｙｔｏｋｉｎｅ、Ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、免疫細胞の活性化、分化などに関与するｌｉｇａｎｄ及びそれに対する抗体、免疫細胞の活性阻害を与える抗体など）を更に含む。このような公知の免疫抑制剤としては、糖質コルチコイド、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗－ＣＤ２０抗体、抗－ＣＤ３抗体、抗－ＩＬ－２抗体、イムノフィリン阻害剤（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、インターフェロンβ、オピオイド（ｏｉｐｏｉｄ）、ＴＮＦα結合タンパク質、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、フィンゴリモド（ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ）、またはミリオシン（ｍｙｒｉｏｃｉｎ）である。前記糖質コルチコイドは、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、またはヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）であり、前記細胞増殖抑制剤はナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、白金錯体化合物（ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）、葉酸類似体（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、またはミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）である。前記イムノフィリン阻害剤は、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、またはエベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）である。

【0077】

本発明の更に他の一観点によると、前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を有効成分として含有する免疫疾患治療用薬学的組成物が提供される。

【0078】

前記薬学的組成物において、前記免疫疾患は、１型糖尿病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節リウマチ、乾癬または乾癬性関節炎、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハシモト甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、炎症性筋疾患(ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｙｏｐｈａｔｈｙ)、自己免疫性血管炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、自己免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、溶血性貧血（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）、アレルギー性疾患、またはセリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である。

【0079】

前記組成物は薬学的に許容可能な担体を含むが、前記担体以外にも薬学的に許容可能な補助剤、賦形剤、または希釈剤を更に含んでもよい。

【0080】

本文書で使用される用語である「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、人に投与される際に通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸’カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などを更に含んでもよい。

【0081】

また、本発明の一実施例による薬学的組成物は、哺乳動物に投与する際、活性生物の迅速な放出、または持続、または遅延された放出が可能であるように当業者に公知の方法を使用して剤形化される。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のセラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態を含む。

【0082】

本発明の一実施例による組成物は多様な経路で投与されるが、例えば、経口、非経口、例えば、坐剤、経皮、静脈、腹腔、筋肉内、病変内、鼻腔、脊椎管内投与で投与され、また、徐放型、または連続的または反復的放出のための移植装置を使用して投与される。投与回数は所望の範囲内で一日一回または数回に分けて投与し、投与期間も特に限らない。

【0083】

本発明の一実施例による組成物は、一般に使用される薬学的に許容可能な担体と共に適合の形態で剤形化される。薬学的に許容可能な担体としては、例えば、水、適合のオイル、食塩水、水性グルコース、及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤を更に含んでもよい。適合の安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などのような抗酸化剤がある。適合の保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチルまたはプロピルパラベン、及びクロロブタノールがある。また、本発明による組成物は、その投与方法や剤形によって、必要であれば懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前記例示したものをはじめ、本発明に適合の薬学的に許容可能な担体及び製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳細に記載されている。

【0084】

前記組成物の患者に対する投与量は、患者の伸長、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要素によって異なり得る。薬学的に活性のタンパク質は１００ｎｇ／体重（ｋｇ）－１０ｍｇ／体重（ｋｇ）の量で投与されるが、より好ましくは１乃至５００μｇ／ｋｇ（体重）で投与され、最も好ましくは５乃至５０μｇ／ｋｇ（体重）で投与されるが、前記要素を考慮して投与量が調節される。

【0085】

本発明の更に他の一観点によると、治療的に有効な量の前記単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質または前記融合タンパク質を免疫抑制を必要とする個体に投与するステップを含む前記個体の免疫抑制方法が提供される。

【0086】

前記方法において、前記免疫抑制を必要とする個体は人または人を除いた哺乳動物であり、臓器移植を受けた患者または免疫疾患にかかった個体であって、免疫抑制が必要な患者である。

【0087】

併せて、本発明の単量体性ＩＬ－１０タンパク質またはそれを含む融合タンパク質は治療的に有効な量で投与される。

【0088】

本文書で使用される用語である「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量の水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定される。本発明の組成物の治療的に有効な量は０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１ｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ乃至５００ｍｇ／ｋｇであるが、有効投与量は患者の年齢、性別、及び状態によって適切に調整される。

【0089】

以下、実施例及び実験例を介して本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下に開示される実施例及び実験例に限らず、互いに異なる様々な形態に具現されるものであって、以下の実施例及び実験例は本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。

【0090】

実施例：単量体性ヒトＩＬ－１０変異体の製造
本発明者らは、多様な単量体性ヒトＩＬ－１０変異体を考案した。詳しくは、ＩＬ－１０タンパク質の構造を分析し、二量体性ＩＬ－１０タンパク質が形成される際にＩＬ－１０のＮ末端と他のＩＬ－１０のＣ末端がペアをなすことに着目して、一つの分子のＩＬ－１０のＮ末端とＣ末端がペアを成すようにするための最小限のリンカーの長さを考案した。一つの分子のＩＬ－１０タンパク質のＮ末端部分とＣ末端部分が結合するためには１７．３Åの直線距離が必要であるが、そのためにはＮ末端部分とＣ末端部分の間に最小限７ａａ以上のリンカー長が必要であると予想された。この際、一つの分子の間のＮ末端部分とＣ末端部分が結合すべきであるため、過度に長いリンカーは逆に末端間の結合の妨害要素として作用すると予想され、９ａａの最適のリンカー長と構成しており、最大１２ａ.ａ.のリンカー長のスペーサーペプチドまで含まれるようにデザインすることができると予想された。

【0091】

詳しくは、本発明者らは、下記表１のような構成を有するヒトＩＬ－１０変異体タンパク質配列を決定し、Ｔｙｐｅ ＩＩ制限酵素であるＢｓａ ＩとＴ４ ｌｉｇａｓｅを使用してＮＴＩＧ Ｆｃサブ－ベクター、ＩＬ－１０Ｖｍサブ－ベクター、及び骨格ベクター（ｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｃｋｂｏｎｅ；Ｇｅｎｅｘｉｎｅ，Ｉｎｃ．）を一つのチューブで反応させることで、ベクターコンストラクトを製造した。

【0092】

本発明の一実施例によって製造された融合タンパク質の構造

【表1】

前記表１に記載したように、本発明の一実施例ではＩＬ－１０タンパク質のＮ－末端にＦｃドメインを連結しており、それによって二量体が形成されて、融合タンパク質の分離精製ステップを容易に行うことができる形態にＩＬ－１０変異体タンパク質を考案した。ここで使用されたＦｃタンパク質は、ＩｇＧ１のヒンジ部分とＩｇＤ及びＩｇＧ４のハイブリッドタンパク質であるＣＨ２及びＣＨ３部分で構成されたＦｃ変異体（配列番号８及び９）であって国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００６３４６に記載のものと同じものを使用しており、本文書では前記Ｆｃ変異体を便宜上「ＮＴＩＧ」と命名した。前記ＰＣＴ出願を本文書に参照として挿入する。前記Ｆｃ変異体タンパク質と本発明の一実施例によるＩＬ－１０変異体タンパク質の間には、配列番号２または３のアミノ酸配列で構成されるリンカーペプチド（ｌｉｎｋｅｒ １）を装入するように考案した。比較例１で使用されたＩＬ－１０タンパク質は、野生型ヒトＩＬ－１０タンパク質の８７番目アミノ酸であるイソロイシンをアラニンに置換することで免疫活性増進作用を抑制した変異体タンパク質（配列番号１０）であって、実施例１乃至２も同じく８７番目アミノ酸の置換を含んでいる。一方、実施例１及び２で使用されたＩＬ－１０タンパク質（配列番号３９）、そして比較例２で使用されたＩＬ－１０タンパク質（配列番号１１）は、１１６番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）と１１７番目アミノ酸であるリシン（Ｋ）の間にペプチドが挿入されたものであって、前記ペプチドとしては配列番号４または５で構成されるアミノ酸配列を有するスペーサーペプチドを使用しており、特に比較例２の配列番号５で記載されるアミノ酸配列で構成されるリンカーペプチド含むＩＬ－１０タンパク質（配列番号１１）は、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎなどが考案した単量体性ＩＬ－１０タンパク質と同じ構造を有する単量体性ＩＬ－１０を含む（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１８）：１３５５２－１３５５７，２０００）。前記のように考案されたそれぞれの融合タンパク質の構成要素を暗号化するポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅及びオリゴヌクレオチド合成によって製造した後、それをＢｓａ Ｉ制限酵素とＴ４ ｌｉｇａｓｅを利用してＮＴＩＧ ｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ、及びＩＬ－１０Ｖｍ ｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ及び骨格ベクター（ｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ，Ｇｅｎｅｘｉｎｅ，Ｉｎｃ．）にサブクローニングした後、一つのチューブで反応させて最終ベクターコンストラクトを製造した。前記のように製造されたベクターコンストラクトをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＥｘｐｉＣＨＯ ｋｉｔを利用して一時的発現を行った。詳しくは、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ ｃｅｌｌに前記のように製造されたベクターコンストラクトとキット内に含まれているＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を混合した後、８％ＣＯ_２及び３７℃の条件を備えている培養器で１日間培養してから、温度を３２℃まで下げて７日目まで培養を行った。

【0093】

次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ捕獲精製を行い、非還元及び還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって候補物質が精製されたのかを確認して、候補物質のｐＩ値を考慮した剤形化緩衝液で剤形化を行った。剤形化が完了された物質をＮａｎｏ ｄｒｏｐを利用して定量し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用して最終純度を確認した。図２ａ及び図２ｂは、ＩＬ－１０Ｍの培養及び精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用した純度を示している。図２ｃ及び図２ｄは、ＩＬ－１０Ｍ－１、ＩＬ－１０Ｍ－２の精製物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用した純度を示している。図２ｅ及び図２ｆは、ＩＬ－１０Ｍ－３の培養及び精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用した純度を示している。

【0094】

本発明の一実施例による融合タンパク質の生産結果

【表2】

その結果、表２及び図２ａ乃至図２ｆに示したように、非単量体性ＩＬ－１０を生産する場合（比較例１）はタンパク質の生産量が少なく、最も低い純度を示したが、単量体性ＩＬ－１０を生産する場合（実施例１及び２及び比較例２）はタンパク質の含量及び純度が大幅に増加すると示された。一方、比較例２の場合はタンパク質の含量が最も高かったが、純度の面では本願発明の実施例１のタンパク質が最も高い８２．７％の純度を示した。

【0095】

実施例３：ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍの製造
３－１：一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
本発明者らは、ＩｇＥと特異的に結合する受容体であるＦｃεＲＩαと、前記実施例１及び比較例２の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質（ＩＬ－１０Ｖｍ）がＦｃタンパク質で連結された融合タンパク質を考案した。

【0096】

詳しくは、本発明者らは、下記表３のような構成を有する融合タンパク質をそれぞれ暗号化するポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲを利用して製造した後、前記実施例１の方法と同じくＦｃεＲＩα ｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ、ＮＴＩＧ Ｆｃ ｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ、及びＩＬ－１０Ｖｍ ｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ及び骨格ベクター（ｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ，Ｇｅｎｅｘｉｎｅ， Ｉｎｃ．）にサブクローニングした後、一つのチューブで反応させて最終ベクターコンストラクトを製造した。

【0097】

【表3】

本発明者らは、前記融合タンパク質である実施例３のＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍを「ＰＧ０７５－８」と命名し、比較例３のＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍを「ＰＧ０７５－９」と命名した。前記のように製造された発現ベクターコンストラクトをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＥｘｐｉＣＨＯ ｋｉｔを利用して一時的発現を行った。詳しくは、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ ｃｅｌｌに前記のように製造されたベクターコンストラクトとキット内に含まれているＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を混合した後、８％ＣＯ_２及び３７℃の条件を備えている培養器で１日間培養してから、温度を３２℃まで下げて７日目まで２５０ｍＬ規模の培養を行った。

【0098】

次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ捕獲精製を行い、非還元及び還元条件におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって候補物質が精製されたのかを確認して、候補物質のｐＩ値を考慮した剤形化緩衝液で剤形化を行った。剤形化が完了された物質をＮａｎｏ ｄｒｏｐを利用して定量し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用して最終純度を確認した。図３ａ及び３ｂは、それぞれ実施例３のＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ（ＰＧ０７５－８）の培養及び精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用した純度を示している。図３ｃ及び３ｄは、それぞれ比較例３ののＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ（ＰＧ０７５－９）の培養及び精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用した純度を示している。

【0099】

前記図３ａ乃至３ｄに示したように、本発明の一実施例によるＩＬ－１０Ｖｍタンパク質は、実施例１の単量体性ＩＬ－１０変異体をＡＰＩ（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）であるＦｃεＲＩαと連結された形態の融合タンパク質を発現する場合、生産収率及び純度が非常に高く示されると確認されたが、比較例２の従来の単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質を適用する場合はタンパク質の収率及び純度が著しく落ちることが分かった。そこで、本発明者らは、実際ＡＰＩとして活性タンパク質がＩＬ－１０Ｖｍタンパク質と共に連結された形態の融合タンパク質を生産するための安定的細胞株の確立、及び実験室規模のタンパク質の生産には、本発明の実施例１のＩＬ－１０Ｖｍタンパク質を使用した。

【0100】

３－２：安定的細胞株の構築及び生産
そこで、本発明者らは、前記実施例３－１で構築した融合タンパク質を暗号化する遺伝子コンストラクトをｐＡＤ１５発現ベクター（ＷＯ２０１５／００９０５２Ａ）に挿入した後、ＣＨＯ ＤＧ４４（ｆｒｏｍ Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ）細胞にＮｅｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを利用して形質感染させた。１次スクリーニング過程でＨＴ（５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐａｍｉｎｅ）がない１０％ ｄＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，３００６７－３３４），ＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ，１２５６１，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２５６１－０４９），ＨＴ＋（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，１１０６７－０３０）培地を使用してＨＴ選別を行った。次に、ＤＨＦＲ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）－システムを利用して発現遺伝子を増幅するために、ＨＴ選別されたクローンを利用してメトトレキサート（ＭＴＸ）増幅を行った。高い生産性のクローンを確保するために、プレート上でミニプールの形態にＭＴＸ増幅を行っており、増幅が確認された一種に対して選別を行った後、ＬＤＣ（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ；９６ ｗｅｌｌｓ，３０ ｐｌａｔｅｓ）を行って最終細胞株を確保した。

【0101】

最終確保された細胞株をｈｙＣｅｌｌＣＨＯ培地７００ｍｌバッチ培養を行い、培養５日目に収得された培養液に対してＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製を行って精製されたタンパク質を確認して、精製されたタンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって量及び純度を分析した。

【0102】

その結果、図３ｅ及び３ｆで確認されるように、確立された安定的細胞株から本発明の一実施例による融合タンパク質が正常に発現されることが分かった。

【0103】

実験例１：混合リンパ球反応の分析
本発明者らは、前記実施例で製造された融合タンパク質の免疫抑制活性を確認するために、多数の供与者から提供された全血を利用して混合リンパ球反応を分析した。

【0104】

そのために、詳しくは、本発明者らは、１０人の供与者から提供された全血をＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離して末梢血液単核球を分離した。前記分離した単核球の数を計数した後、それらを混合して、バイアル（１ｍＬ）当たり５×１０^６細胞で細胞ストックを製造した。

【0105】

次に、前記供与者から受けた細胞と受容者の細胞を溶かし、細胞数を計数した後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で再懸濁した。受容者細胞を反応細胞及び刺激細胞に分け、受容者の刺激細胞と供与者の細胞に対して３，０００ｒａｄのガンマ線を照射して刺激した。次に、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｖ４５０）で受容者の反応細胞を染色し、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｒｅｄ（ＡＰＣ）で受容者の刺激細胞及び供与者細胞を染色した。１×１０^５ｃｅｌｌの反応細胞と１×１０^５ｃｅｌｌの受容者の反応細胞を１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地２００μｌに添加し混合した。前記混合された細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２の条件で６日間培養した。この際、比較例１及び２、そして実施例１及び２の融合タンパク質を０．５μＭの濃度で処理した。前記培養が終了された後、ＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳ分析に使用された抗体は、ＢＶ６５０－結合抗－ＣＤ３抗体、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合抗－ＰＤ１抗体、ＰＥ－ＴＲ－結合抗－ＣＤ１４抗体、ＰＥ－ＴＲ－結合抗－ＣＤ１９抗体、ＰｅｒＣｐ－結合抗－ＣＤ４抗体、Ｃｙ５．５－結合抗－ＣＤ４抗体、ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）－結合抗－ＣＤ８抗体、Ｈ７－結合抗－ＣＤ８抗体を使用した。 ￥

【0106】

前記ＦＡＣＳ分析結果、受容者反応細胞と受容者刺激細胞を反応させる場合（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ、以下、「Ａｕｔｏ」と略称する）は受容者ＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が示されないが、受容者反応細胞と供与者刺激細胞を反応させる場合（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ、以下、「Ａｌｌｏ」と略称する）は受容者ＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が確認された（図４ａ乃至図４ｄ）。図４ａ乃至図４ｄに示されたように、大きな差は見つからなかったが、比較例１の二量体性ＩＬ－１０融合タンパク質の場合はＣＤ４^＋増殖抑制能が最も強力に示されたことに対し、比較例２の単量体性ＩＬ－１０を含む融合タンパク質の場合は陰性対照群との差が見つからなかった。一方、本願発明の実施例１及び２による単量体性ＩＬ－１０を含む融合タンパク質は、前記比較例２に比べ優れた免疫抑制能を示した。同じく、ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖抑制能も比較例１の二量体性ＩＬ－１０融合タンパク質が最も高く示されており、本発明の実施例１及び２による単量体性ＩＬ－１０融合タンパク質は比較例１よりはＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖抑制能が低く示されたが、比較例２よりはＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖抑制能が高いと確認された。

【0107】

実験例２：肥満細胞増殖の分析
本発明者らは、本発明の単量体性ＩＬ－１０融合タンパク質の免疫刺激活性を調べることにした。

【0108】

詳しくは、１０％ＦＢＳ、１％抗生剤、ｒｍＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ及びｒｍＩＬ－３ １０ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ培地が入っている９６ウェルプレートに骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）を５×１０^３ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）になるように分注し、ヒト型組換えＩＬ－１０と比較例１及び２、そして実施例１及び２のＩＬ－１０融合タンパク質を濃度に合わせて希釈した後、前記９６ウェルプレートに１００μｌずつ処理し、３７℃及び５％ＣＯ_２条件で４日間培養した。次に、前記肥満細胞の増殖程度を測定するために、９６ウェルプレートにＭＴＳ試薬を２０μｌずつ分注し、前記９６ウェルプレートを３７℃の温度条件でＣＯ_２培養器に入れて２時間反応させた後、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ読取器を利用して５９５ｎｍで吸光度を測定した。

【0109】

【表4】

その結果、図５ａ及び前記表４で確認されるように、陽性対照群であるｒｈＩＬ－１０の肥満細胞増殖能が最も強く、比較例１及び２のＩＬ－１０融合タンパク質の場合はｒｈＩＬ－１０よりは低かったが、いずれも肥満細胞増殖能を有することが分かった。一方、本願発明の実施例１及び２のＩＬ－１０融合タンパク質は肥満細胞増殖能が殆ど示されなかった。これは本発明のＩＬ－１０変異体タンパク質がＩＬ－１０の二重活性のうち免疫活性化特性が完全に抑制されたタンパク質であることを示す結果である。しかし、前記実験結果の場合、本発明の実施例１及び２の融合タンパク質がいかなる活性もない形態に発現された結果であると解釈される恐れがあるため、本発明者らはｒｈＩＬ－１０、実施例１及び比較例１の融合タンパク質のみを対象に処理濃度を更に上げて同じ分析を行った。

【0110】

【表5】

その結果、前記表５及び図５ｂに示されたように、本願発明の実施例１の融合タンパク質は１００ｎＭという非常に高い濃度でのみ制限的な肥満細胞増殖能を示した。しかし、前記濃度は体内投与の際に使用される投与量に比べ著しく高い濃度であるため、体内投与の際に肥満細胞を刺激するなどの免疫機能の刺激効果は殆どないと期待される。

【0111】

実験例３：免疫抑制活性の分析
前記肥満細胞増殖能の分析に続いて、ＩＬ－１０融合タンパク質の肥満細胞におけるＴＮＦ－α分泌能の減少に及ぼす影響、つまり、免疫抑制活性を調べた。

【0112】

３－１：肥満細胞におけるＴＮＦ－α分泌抑制能の分析
そのために、詳しくは、１０％ＦＢＳ、１％抗生剤、ｒｍＳＣＦ ２０ｎｇ／ｍｌ及びｒｍＩＬ－３ １０ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ培地が入っている９６ウェルプレートに骨髄由来肥満細胞（ＢＭＭＣ）を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）になるように分注し、ヒト型組換えＩＬ－１０と比較例１、２、そして実施例１、２のＩＬ－１０融合タンパク質を濃度に合わせて希釈し、抗－ＤＮＰ ＩｇＥを３μｇ／ｍｌに希釈した後、９６ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、３７℃及び５％ＣＯ_２条件で２４日間培養した。次に、ＤＮＰ－ＢＳＡ（Ａｎｔｉｇｅｎ）が４００ｎｇ／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルプレートに５０μｌずつ添加した後、３７℃及び５％ＣＯ_２条件で一晩反応させた。次に、４℃で１，５００ｒｐｍの速度で５分間遠心分離した後、新しい９６ウェルプレートに回収された上澄み液１５０μｌを分注した後、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）を利用してＴＮＦ－αの濃度を測定した。

【0113】

【表6】

【表7】

その結果、前記表６及び表７、そして図６ａ乃至６ｃで確認されるように、比較例１（ＩＬ－１０Ｍ）の場合は濃度依存的なＴＮＦ－αの抑制活性を示した。この際、本発明の実施例１のＩＬ－１０Ｍ－１及び実施例２のＩＬ－１０Ｍ－２と比較例２のＩＬ－１０Ｍ－３の場合は比較例１と類似して濃度依存的なＴＮＦ－αの分泌減少能を示したが、その濃度が比較例１に比べ５倍程度高い濃度で同等な活性を示した。その上、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８の場合、より低い濃度でも非常に優れたＴＮＦ－αの分泌抑制能を示しており、ＩｇＥを効果的に遮断することが分かった。前記結果をまとめると、本願発明の一実施例によるＩＬ－１０変異体タンパク質は二量体型ＩＬ－１０変異体タンパク質に比べ免疫抑制活性は低く示されたが、ＩＬ－１０の二重特性のうち一つである免疫活性増進作用の抑制においては最も効果的であって、生産量及び純度の側面で最も有利なＩＬ－１０変異体タンパク質であることが分かった。

【0114】

特に本発明の一実施例によるＩＬ－１０変異体タンパク質は、類似して単量体の形態に発現される比較例２のＩＬ－１０変異体タンパク質に比べ濃度依存的なＴＮＦ－αの分泌刺激活性を示しており、ＦｃεＲＩαが融合された融合タンパク質として使用される場合（実施例３）もアレルギー反応の抑制活性に著しい効果があることが分かった。

【0115】

３－２：マクロファージにおけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ－α分泌抑制能の分析
本発明者らは、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８タンパク質の肥満細胞におけるＴＮＦ－αの分泌抑制能を確認したことに続けて、ＴＮＦ－α媒介の炎症反応に密接な関連がある免疫細胞であるマクロファージでも同じくＴＮＦ－αの分泌を抑制することができるのかを調べた。

【0116】

そのために、詳しくは、ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で用意し、９６ウェルプレートに１００μｌずつ分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で１２時間培養した。次に、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８を順次に希釈した後、前記培養中のＲＡＷ２６４．７細胞に処理した。この際、ＬＰＳ（４００ｎｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレートに１００μｌずつ処理することでＴＮＦ－αの発現を誘導した。次に、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で１２時間培養し、上澄み液１５０μＬを分離した後、上澄み液に含まれたＴＮＦ－αの発現量を実験例３－１と同じ方法によって測定した（表８及び図６ｄ）。

【0117】

本発明の一実施例による融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）のマクロファージにおけるＴＮＦ－αの分泌抑制能

【表8】

その結果、表８及び図６ｄで確認されるように、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８融合タンパク質は濃度依存的にマクロファージにおけるＴＮＦ－αの発現を抑制した。

【0118】

実験例４：ＩＬ－１０受容体との親和度分析
本発明者らは、前記実験例１乃至３の実験結果を基に、比較例１及び実施例２の融合タンパク質のＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ１）との親和度をバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ，ＢＬＩ）分析によって分析した。この際、対照群としては、ＦｃεＲＩαが連結されておらず、ハイブリッドＦｃ領域に野生型ＩＬ－１０の８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換されて、配列番号１０のアミノ酸配列を有する免疫活性化機能が抑制された二量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質（ＩＬ－１０Ｖ）が連結された融合タンパク質（ＩＬ－１０Ｖ）、及び、前記ＩＬ－１０Ｖの融合タンパク質でＩＬ－１０変異体タンパク質の１１６番目アミノ酸であるアスパラギン（Ｎ）と１１７番目アミノ酸であるリシン（Ｋ）の間にスペーサーペプチド（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、配列番号４）が挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質（ＩＬ－１０Ｖｍ、配列番号１）が連結された融合タンパク質（Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ）が使用された。前記ＮＴＩＧ－ＩＬ－１０Ｖｍは、ＦｃεＲＩαが連結されていないことを除いては本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８と同じである。

【0119】

そのために、まず本発明者らは、Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ^ＴＭ Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ２^ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８－５０９２）を利用し、９６ウェルプレートにＩＬ－１０Ｒ Ｈｉｓ－ｔａｇタンパク質を付着した。詳しくは、９６ウェルプレートにＤ．Ｗ．２００μｌを分注した後、前記キットに含まれているａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒを差し込んで１０分間水和させた。次に、Ｄ．Ｗ．２００μｌを更に分注した後、必要な試料量の１／２０でＥＤＣ：ＮＨＳを１：１で混合した後、Ｄ．Ｗ．に希釈して９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注した。次に、ＩＬ－１０Ｒ Ｈｉｓ－ｔａｇタンパク質を１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０溶液に１０μｇ／ｍｌになるように希釈した後、前記９６ウェルプレートに２００μｌずつ添加した。次に、１Ｍエタノールアミンを２００μｌずつ９６ウェルプレートに添加した後、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒプレートとサンプルプレートをＯｃｔｅｔ－２機器に入れて測定した。測定終了後、サンプルプレートに１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液を２００μｌ添加した後、基底値（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を決めた。次に、前記実施例で製造されたＮＴＩＧ－ＩＬ－１０融合タンパク質を多様な濃度（０．６２、１２５、２５０、５００、及び１，０００ｎＭ）で１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液に希釈した後、サンプルプレートに２００μｌで分注し、Ｏｃｔｅｔ （登録商標）－Ｋ２機器でＢＬＩ分析を行って結合親和度を測定した。

【0120】

【表9】

その結果、図７及び表９に示したように、本発明の一実施例による融合タンパク質（ＮＴＩＧ－ＩＬ－１０Ｖｍ）のＫＤ値は２９．２ｎＭで、比較例１の単量体性ＩＬ－１０融合タンパク質（ＮＴＩＧ－ＩＬ－１０Ｖ）のＫＤ値（１１．１ｎＭ）の約３倍程度に示された。よって、ＩＬ－１０Ｒとの親和力は比較例１の単量体性ＩＬ－１０融合タンパク質に比べ多少落ちると示された。従来の研究結果も、単量体性ＩＬ－１０の場合は二量体性ＩＬ－１０タンパク質に比べＩＬ－１０Ｒとの親和性が落ちろと示されているため、十分に予想できることであった。一方、本発明の実施例３の融合タンパク質（ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ、ＰＧ０７５－８）はＫＤ値が０．００１ｎＭ未満に示されて、ＩＬ－１０Ｒとの親和度がより高いと示された。これはＡＰＩであるＦｃεＲＩαと連結されたにもかかわらず、単量体性ＩＬ－１０変異体がＩＬ－１０Ｒに十分な結合能を有することを示す結果である。

【0121】

実験例５：ＩｇＥ結合能の分析
本発明者らは、実施例３で製造された融合タンパク質（ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ）のマウスＩｇＥ及びヒトＩｇＥとの親和度をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析によって分析した。

【0122】

そのために、まず本発明者らは、Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ^ＴＭ Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ２^ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８－５０９２）を利用し、９６プレートに対照群としてＩＬ－１０ＶｍがないＦｃεＲＩα－Ｆｃタンパク質、及び実施例３で製造された融合タンパク質を付着した。詳しくは、９６ウェルプレートにＤ．Ｗ．２００μｌを分注した後、前記キットに含まれているａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒを差し込んで１０分間水和させた。次に、Ｄ．Ｗ．２００μｌを更に分注した後、必要な試料量の１／２０でＥＤＣ：ＮＨＳを１：１で混合した後、Ｄ．Ｗ．に希釈して９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注した。次に、ＦｃεＲＩα－Ｆｃタンパク質及びＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ融合タンパク質を１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０溶液に１０μｇ／ｍｌになるように希釈した後、前記９６ウェルプレートに２００μｌずつ添加した。次に、１Ｍエタノールアミンを２００μｌずつ９６ウェルプレートに添加した後、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒプレートとサンプルプレートをＯｃｔｅｔ（登録商標）－Ｋ２機器に入れて測定した。測定終了後、サンプルプレートに１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液を２００μｌ添加した後、基底値を決めた。次に、前記実施例において、抗－ＤＮＰマウスＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ）を多様な濃度（５０ｐＭ乃至３．１２５ｎＭ）で１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液に希釈した後、サンプルプレートに２００μｌに分注し、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）－Ｋ２機器でＢＬＩ分析を行うことで結合親和度を測定した。

【0123】

【表10】

その結果、表８ａ及び表１０に示されたように、本発明の実施例による融合タンパク質（ＦｃεＲＩα－Ｆｃ－ＩＬ－１０Ｖｍ、ＰＧ０７５－８）のＫ_Ｄ値は０．２８４ｎＭであって対照群であるＦｃεＲＩα－Ｆｃの融合タンパク質より多少低く示されたが、この程度の差は有意な差ではないため、ＩＬ－１０タンパク質の付加によってＩｇＥとの結合能が落ちないことが分かった。前記結果と共に、本発明で使用したヒトＦｃεＲＩαとヒトＩｇＥとの結合度を測定するために、本発明者らは、実施例３の融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）とヒトＩｇＥとの結合親和度を上述した方法を利用して分析した。

【0124】

【表11】

その結果、図８ｂ及び表１１に示したように、本発明の一実施例による融合タンパク質は、ヒトＩｇＥとも前記マウスＩｇＥと類似した程度の親和度を示した。

【0125】

実験例６：薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の分析
本発明者らは、本発明の融合タンパク質が体内に投与される際にどれぐらいの安定性を有するのかを確認するために、薬物動態学分析を行った。

【0126】

詳しくは、各群当たり３頭のＳＤアットを対象に本発明の一実施例による融合タンパク質（ＰＧ０７５－８）を１ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈注射、腹腔注射、筋肉注射、及び皮下注射でそれぞれ１．０ｍＬ／ｋｇ、１．０ｍＬ／ｋｇ、０．４ｍＬ／ｋｇ、及び１．０ｍＬ／ｋｇの体積で投与した後、静脈注射の場合は０分、５分、１時間、５時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、及び３３６時間、そして他の投与方法（腹腔注射、筋肉注射、及び皮下注射）の場合は５分後の測定を除いては前記静脈注射と同じ時間帯に血清を採集して、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ ＥＬＩＳＡを利用して前記融合タンパク質を定量した。

【0127】

その結果、図９に示したように、本発明の一実施例による融合タンパク質は投与経路に構わず経時によって緩慢な減少傾向を示したが、これは本発明の一実施例による融合タンパク質が体内で相当期間安定的に維持されることを示す。

【0128】

実験例７：血液毒性の分析
従来の組換えＩＬ－１０は投与濃度を上げるか繰り返し投与する際に血液内のヘモグロビン濃度が減少することで貧血症状を起こし、血小板濃度が減少することで血小板減少症（ｔｈｒｏｍｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を起こす副作用が報告されている（Ｔｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（４）：２２０４－２２０９，２００２；Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１９（６）：１４７３－１４８２，２０００）。そこで、本発明者らは、本発明の一実施例による融合タンパク質がそのような副作用を示すのか否かについて調べた。

【0129】

そのために、詳しくは、本発明者らは、雌性ＩＣＲマウスを対象に群当たり３頭ずつ構成した後、各群ごとにＰＧ０７５－８を０、５０、１５０、及び３００ｍｇ／ｋｇの容量で投与し、薬物投与後１１日目に血液を採集して、血球分析器（Ｎ－Ｖ，ＳＹＳＭＥＸ，ＪＡＰＡＮ）を利用して鑑別白血球数（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔ）、総赤血球数（ｔｏｔａｌ ＲＢＣ）、及び血小板数（ｔｏｔａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔ）を分析した。その結果、図１０に示したように、ＰＧ０７５－８を投与する際、血球細胞などの数には全く影響を及ぼさなかった。

【0130】

実験例８：飲食物アレルギーに対する効能実験
本発明者らは、本発明の一実施例による融合タンパク質がＰＧ０７５－８が実際アレルギー疾患に対して効果を示すのか否かを確認するために、アレルギー誘発原である卵白アルブミン（ＯＶＡ）で感作した実験動物を対象に、ＯＶＡ経口投与の際に発生するアレルギー症状である下痢症状がどれぐらい改善されるのかを調べた。

【0131】

詳しくは、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｋｏａｔｅｃｈ）に対してＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）５０μｇ及びアラム（Ａｌｕｍ）１ｍｇを混合した溶液を１４日間隔で２回腹腔投与して感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）した。次に、２８、３０、３２、３４、３６日目に計５回にわたって２日間隔でＯＶＡ ５０ｍｇを経口投与し、腸に飲食物アレルギーを誘発した。その過程で、３１日目に各群を構成する薬物を投与した。第１群（対照群）にはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を、第２群にはＩｇＥ_ＴＲＡＰ（５ｍｇ／ｋｇ）を、第３群には本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８（７．３ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれモル数を合わせて計算し投与した。計５回に分かってＯＶＡを経口投与しながら下痢の発生有無を確認し、３７日目にマウスを剖検して、各群に属するマウスに対して小腸内肥満細胞の数、血中ＩｇＥの濃度、及び血中肥満細胞の脱顆粒酵素の濃度（ＭＣＰＴ－１，Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ－１）を分析した。その結果、図１１で確認されるように、本発明の一実施例によるＰＧ０７５－８を投与した群に属するマウスにおいて、対照群及びＩｇＥ_ＴＲＡＰ投与群のマウスに比べ食品アレルギーが緩和されるという効果が確認された。

【0132】

よって、本発明の一実施例によるＩＬ－１０Ｖｍと他の融合パートナーとしてＦｃεＲＩαを適用した融合タンパク質は、前記免疫細胞の活性化とそれらの機能、特に抗－炎症性サイトカインの分泌、抗原提示能などを抑制することで、過活性化された免疫機能に起因する多様な免疫関連疾患、例えば、アトピー性疾患、飲食品アレルギー、慢性特発性蕁麻疹（ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、喘息などのアレルギー疾患の治療に使用される。

【0133】

本発明上述した実施例及び実験例を参考に説明されたがこれは例示に過ぎず、該当技術分野の通常の知識を有する者であれば、これから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であることを理解できるはずである。よって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付した特許請求の範囲の技術的思想によって決められるべきである。

【産業上の利用可能性】

【0134】

本発明の一実施例による単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質とそれを含む融合タンパク質は、免疫関連疾患の治療剤の開発に非常に有用に使用される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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