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▶ イリアス バイオロジクス インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-03
(45)【発行日】2024-06-11
(54)【発明の名称】ＮＦ－κＢ抑制剤のエキソソーム基盤伝達の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240604BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240604BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240604BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240604BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240604BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240604BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61K35/12
A61K9/127
A61P13/12
A61K45/00
A61K47/42
C07K14/47
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022559527
(86)(22)【出願日】2021-03-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-12
(86)【国際出願番号】 IB2021052708
(87)【国際公開番号】W WO2021198961
(87)【国際公開日】2021-10-07
【審査請求日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】10-2020-0039011
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】63/112,154
(32)【優先日】2020-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/112,155
(32)【優先日】2020-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520154612
【氏名又は名称】イリアス バイオロジクス インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョイ，チュルヒ
(72)【発明者】
【氏名】チョイ，キュンスン
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ジェ－クァン
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５２８６７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Front. Immunol.，2019年，vol.10，Article 815, p.1-12
【文献】Inflammation，2016年，vol.39, no.2，p.569-574
【文献】Acta Cir. Bras.，2019年，vol.34, issue 2，e201900209, p.1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ １３／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
虚血－再灌流損傷（ＩＲＩ）又は敗血症により誘導された急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ；ＡＫＩ）を治療するための組成物であって、スーパーリプレッサー（ｓｕｐｅｒ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ；ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）を含むエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を含む、組成物。
【請求項2】
組成物が全身経路により投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
組成物が経口、経皮、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下または混合経路を通じて投与される、請求項１～２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項4】
全身経路が腹腔内又は静脈内経路である、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
抗炎症剤がさらに投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
エキソソームが光特異的結合タンパク質（ｐｈｏｔｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ｓｒＩκＢが配列番号１を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
ｓｒＩκＢを含むエキソソームが第１光特異的結合タンパク質及び／又は第２光特異的結合タンパク質をさらに含み、第１光特異的結合タンパク質がエキソソーム特異的マーカーに接合されて融合タンパク質Ｉを形成し；
第２光特異的結合タンパク質がｓｒＩκＢに接合されて融合タンパク質ＩＩを形成する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
虚血－再灌流損傷（ＩＲＩ）又は敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）により誘導された急性腎障害（ＡＫＩ）の治療のための薬剤学的組成物の製造のための、スーパーリプレッサー－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）を含むエキソソームの使用。
【請求項10】
組成物が全身経路により投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項11】
組成物が経口、経皮、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下または混合経路を通じて投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項12】
全身経路が腹腔内又は静脈内経路である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示内容は、ＮＦ－κＢの抑制剤を含有するエキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を用いて急性腎障害（ａｃｕｔｅ ｋｉｄｎｅｙ ｉｎｊｕｒｙ）を治療する方法に関する。本開示内容は、ＮＦ－κＢ抑制剤を含有するエキソソームを用いて敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）により誘発された疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＫＩは短期的副作用に寄与するだけでなく、生存者は慢性腎臓病（ＣＫＤ）及び末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）を病むことがある。病因の最も重要な構成要素の一つとして、ＮＦ－κＢの体系的抑制はＡＫＩの重症度に影響を及ぼす。葉酸により誘導された疾患モデルにおいて、ＮＦ－κＢの抑制はＲｅｌＡ及びＮＦ－κＢ２活性化を減少させてＡＫＩ損傷を軽減させる。
【0003】
８００超の合成及び天然材料は、ＮＦ－κＢの活性化の調節に部分的に関与することが公知となっている。いくつかの研究は、レニン－アンジオテンシン－アルドステロンシステム（ＲＡＡＳ）の遮断または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）遮断剤などのＮＦ－κＢ信号伝達の遮断が腎臓損傷を軽減させることを示した。しかし、これらの作用メカニズムは多面的で特異性が欠如する。ナノ技術の最近の進歩は、ＮＦ－κＢ信号伝達を標的化する特定の遺伝子配列またはナノ粒子を生産できるようにした。しかし、ＮＦ－κＢ抑制剤はまだヒトへの使用のためには商業的に承認されていない。
【0004】
統制されない炎症は、敗血症反応の顕著な特徴である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介される宿主病源体相互作用は、炎症誘発性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン、ケモカイン及び免疫活性化分子の生成を刺激する。この炎症誘発性反応後に、免疫細胞の多様な定量的及び機能的欠陥を含む補償免疫抑制反応が伴う。病源体により誘導された細胞変形は、このような変化を調節する時に中枢的役割をする核因子カッパーＢ（ＮＦ－κＢ）転写因子を用いて、宿主遺伝子発現の顕著な変化を伴う。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α及びインターロイキン（ＩＬ）－１を含みＮＦ－κＢの調節制御の下にいくつかのサイトカインは、この転写因子の追加活性化を誘導して炎症反応と敗血性ショックを強化できる。また、ＮＦ－κＢは、主にＢｃｌ－ｘＬ、Ａ１及びＡ２０などの抗アポトーシス遺伝子の転写を増強させることを通じてアポトーシス反応に関与する。従って、ＮＦ－κＢ活性化と関連した炎症は、２つの相互作用メカニズム、即ち、炎症誘発性媒介因子の発現増加及び好中球などの細胞母集団の寿命延長により悪化することがあり、これは、活性化して炎症誘発性分子を生成し、急性炎症プロセスで直接関与する。
【0005】
敗血症により誘発される肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、サイトカインストーム症候群（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、呼吸困難症候群（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び臓器不全（ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ）などの多様な疾患がある。敗血症は、急性微生物感染による先天性免疫系の活性化により誘発される全身炎症症候群であり、集中治療単位の死亡率の主要原因である。さらに、広範囲に相違する症状を有する敗血症により誘発された多様な疾患があり、そのうちの一部は致命的である。不幸にも、敗血症に対する一般的治療法（即ち、抗生剤）は、サイトカイン症候群または損傷された臓器などの敗血症により誘発された相違する疾患を治療するのに効果的でないことがある。現在、敗血症により誘発された疾患に対する臨床的使用が可能な治療法はない。従って、効果的な代替療法の開発が急務である。７００以上の抑制剤がＮＦ－κＢに対して報告されているが、現在まで治療剤として承認された抑制剤はない。さらに、多様なステロイド性及び非ステロイド性抗炎症剤はＮＦ－κＢを遮断することが公知となっているが、これらの効果はＮＦ－κＢを抑制するのに特異的でない。
【0006】
成功的な遺伝子及び薬物伝達は、需要者に悪影響を及ぼさないながら、標的分子を作用部位に安定的に伝達するための適切なベクターの選択を必要とする。組換えアデノウイルス、リポソーム、リガンド接合されたナノ粒子及び超音波微細気泡を含む多様な類型のベクターは、これらの安定性及び高ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）容量により薬物伝達に効率的であることが報告されている。しかし、特定のおそれ及び制限がこれらの使用と連関した。これらは網状内皮システムにより速やかに認識されて除去されたが、不均一な粒子サイズ及び非特異的吸収パターンは生物担体としての使用を制限した。アデノウイルスベクターの高い免疫原性は、投与後に免疫反応を誘発し得、ウイルス自体は高用量で毒性であり得る。リポソームの使用は、また、有害免疫原性及び非ＩｇＥ媒介された過敏反応を誘導しうる。
【0007】
治療用タンパク質を伝達するための現在の従来戦略は、合成ナノ粒子内のタンパク質のエンベロッピング（ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ）を含む。最も好ましいタンパク質伝達システムはリポソーム及び高分子ナノ粒子（ＰＮＰ）である。リポソームは、水性環境中の多様な大きさ及び形状に自己組織化燐脂質膜を有する合成小胞である。ＰＮＰは、１０～１０００ｍｍの大きさを有する固体コロイド粒子であり、カーゴ（ｃａｒｇｏ）タンパク質がナノ粒子マトリックス（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｍａｔｒｉｘ）に捕獲（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）または付着され得る生分解性高分子（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）で構成されている。しかし、リポソームは互いに融合または凝集する傾向があり、その結果、経時的にリポソームカーゴの早期放出をもたらす。ＰＮＰはリポソームより安定性がより良好であり得るが、生体適合性及び長期間潜在的安全性は依然として問題である。また、タンパク質をリポソーム及びＰＮＰでカプセル化することは、合成または組換えタンパク質の生成及び生体外カプセル化プロセスを必要とし、ＥＸＰＬＯＲ技術は、天然エキソソーム生合成を通じてカーゴローディングエキソソームを生成できる安定した細胞の生成及び維持を必要とする。また、エキソソームは生体適合性、固有の毒性の最小化または不在、循環中の長い半減期、組織を標的化する固有の能力などの理想的タンパク質伝達システムの多数の好ましい特徴を有している。
【0008】
最近、エキソソームは、遺伝子／薬物の伝達のための新規なバイオ担体として相当な注目を受けた。エキソソームは、生物活性物質を受容者細胞に伝達したり標的細胞の信号伝達経路に影響を及ぼすことにより、細胞間の通信で重要な役割をする細胞外小胞（ＥＶ）である。エキソソームは、他の生物活性剤より貯蔵しやすく、より大きい安定性を示す。エキソソームは、生物学的障壁を克服できる高い能力を有しており、特定細胞類型を標的化する表面分子を運搬することができ、従って、オフターゲット効果（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）をより少なく誘発する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第１０７０２５８１号
【文献】韓国特許第１０－２１００４２０号
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｎ． Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， １２２７７ （２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本開示内容は、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を対象体に投与することを含み、これを必要とする患者において急性腎障害（ＡＫＩ）を治療する方法を提供する。
【0012】
本開示内容は、また、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を対象体に投与することを含む、これを必要とする対象体において敗血症により誘発された疾患を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＨＥＫ２９３Ｔから生産された操作されたエキソソームの特性化。（Ａ）スーパーリプレッサー（ｓｕｐｅｒ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）ＩκＢローディングエキソソーム（エキソ－ｓｒＩκＢ）（上部）の生産に用いられるＤＮＡ作製物の概略図、及び光可逆的タンパク質－タンパク質相互作用を用いるカーゴタンパク質保有エキソソーム生合成、いわゆる、ＥＸＰＬＯＲ技術（下部）。（Ｂ）エキソ－ナイーブ及びエキソ－ｓｒＩκＢの代表的ＴＥＭイメージ。スケールバー：１００ｎｍ。（Ｃ）エキソ－ナイーブ（上部）及びエキソ－ｓｒＩκＢ（下部）の濃度及び大きさ分布はゼータビュー（Ｚｅｔａｖｉｅｗ）装置により決定された。（Ｄ）標的タンパク質（ｓｒＩκＢ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＤ９及びＧＦＰ）、エキソソーム陽性マーカー（ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ及びＧＡＰＤＨ）及びエキソソーム陰性マーカー（細胞小器官マーカー；プロヒビチン、カルネキシン、ＧＭ１３０及びヌクレオポリンｐ６２）の発現を分析するためのＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２０３Ｔ細胞由来のエキソソームのイムノブロッティング。ナイーブ細胞及びエキソ－ナイーブはエキソ－ｓｒＩκＢの陰性対照群として用いられた。
【図2】腎臓ＩＲＩ後のエキソ－ｓｒＩκＢの腎臓保護効果。（Ａ）腎臓ＩＲＩ手術及びエキソソーム伝達の実験図式。各マウスグループに３×１０９ｐｎのエキソ－ナイーブまたはエキソ－ｓｒＩκＢを１時間間隔で３回（計９×１０９ｐｎ）腹腔内注射した。ＩＲＩ手術後２４時間または４８時間後にマウスを犠牲にし、追加評価のために血清及び組織を収集した。（Ｂ－Ｄ）処理類型（エキソ－ナイーブ対エキソ－ｓｒＩκＢ）、薬物伝達時期（前処理対後処理）及び追跡時点により相違するグループ間のＢＵＮ、クレアチニン及びＮＧＡＬの血清水準（２４時間及び４８時間）、これは、エキソ－ｓｒＩκＢ処理の腎臓保護効果を奏する（前処理２４－ｈ、ｎ＝１０；前処理４８－ｈ、ｎ＝４－５；後処理２４－ｈ、ｎ＝５－１０；後処理４８－ｈ、ｎ＝４－１１）。（Ｅ）左側：各グループの腎臓切片で皮質管細胞（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌ）の代表的ＰＡＳ染色イメージ。通常の近位管刷子縁（ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒ）（＊）または刷子縁の損失（ｏ）；クロマチン凝縮（黒色矢印）；露出された（ｄｅｎｕｄｅｄ）基底膜（黒色矢印）；液胞化（ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ）（黄色矢印）；スケールバー、１００μＭ。右側：病理学的管損傷；各グループからの多数の腎臓サンプルは、エキソ－ナイーブ処理によるものよりエキソ－ｓｒＩκＢ処理による管損傷がより少ないことを示す（前処理２４－ｈ、ｎ＝５；後処理２４－ｈ、ｎ＝５）。グループ間の比較は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後試験と共に一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で提示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－虚偽及びエキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５及び＃＃＃Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－ＩＲＩ及びエキソ－ｓｒＩκＢ－ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図3】エキソ－ｓｒＩκＢ処理後にＩＲＩ誘導されたＮＦ－κＢ活性化の抑制。（Ａ）それぞれの実験マウスグループからの腎臓核抽出物を用いてＮＦ－κＢ ｐ６５発現のウェスタンブロット分析。核抽出物を細胞質分画から生化学的に分離し、ＮＦ－κＢ ｐ６５及びラミンＢ１発現をウェスタンブロッティングを通じて分析した。ＩＲＩ誘導されたＮＦ－κＢ信号伝達の活性化は、手術前後エキソ－ｓｒＩκＢ処理により有意に抑制された。（Ｂ）腎臓ＩＲＩ後のＮＦ－κＢ ｐ６５の増加したＤＮＡ結合活性は、手術前後エキソ－ｓｒＩκＢ処理により抑制された。（Ｃ）左側：各処理グループからのＮＦ－κＢ ｐ６５抗体を用いた代表的ＩＨＣイメージ。スケールバー、５０μＭ。右側：各実験グループにおいてＮＦ－κＢ ｐ６５の免疫組織化学検出を示すグラフ表示。エキソ－ｓｒＩκＢによる処理は、対照群グループと比較し、ＮＦ－κＢ発現を減少させた（前処理２４－ｈ、ｎ＝５－８；前処理４８時間、ｎ＝４－５；後処理２４－ｈ、ｎ＝５－１０；後処理４８－ｈ、ｎ＝４－１１）。グループ間の比較は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後試験と共に一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で表された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－虚偽及びエキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ及びエキソ－ｓｒＩκＢ－ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図4A-B】炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン及び接着分子の発現は、局所的かつ全身的にエキソ－ｓｒＩκＢ処理により悪影響を受ける。（Ａ）各実験グループから全体腎臓溶解物をｑＲＴ－ＰＣＲに用いて、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、Ｔｎｆ－α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５及びＣｘｃ１２を含み炎症誘発性サイトカインの発現水準を測定した。このような遺伝子のｍＲＮＡ水準は腎臓中のＩＲ損傷後に有意に増加し、この効果はエキソ－ｓｒＩκＢ処理により軽減された（前処理２４－ｈ、ｎ＝５－８；前処理４８－ｈ、ｎ＝４－５；後処理２４－ｈ、ｎ＝５－１０；後処理４８－ｈ、ｎ＝４－１１）。（Ｂ）各実験グループの血清を用いた多重サイトカイン研究は、また、エキソ－ｓｒＩκＢ処理による虚血後のマウスグループにおいて炎症誘発性サイトカイン水準の類似した減少傾向を示した。
【図4C-E】炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン及び接着分子の発現は、局所的かつ全身的にエキソ－ｓｒＩκＢ処理により悪影響を受ける。（Ｃ）ｑＲＴ－ＰＣＲデータは、虚血後のエキソ－ナイーブ処理グループにおいてＩｃａｍ－１ ｍＲＮＡの増加した水準及びエキソ－ｓｒＩκＢ処理によるＩｃａｍ－１ ｍＲＮＡの有意な減少を示す。（Ｄ）各グループからの全体腎臓溶解物のウェスタンブロット分析結果はエキソ－ｓｒＩκＢ処理によりＩＲ損傷腎臓においてＩＣＡＭ－１の減少した発現を立証した。（Ｅ）ＩＣＡＭ－１ ＩＨＣ染色（左側）及びＩＣＡＭ－１ ＩＨＣのグラフ表示（右側）を示す代表的腎臓切片は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理がＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの虚血後の腎臓でＩＣＡＭ－１発現を減少させたことを示す。スケールバー、５０μＭ（Ｂ－Ｅ：前処理２４－ｈ、ｎ＝５；前処理４８－ｈ、ｎ＝４－５；後処理２４－ｈ、ｎ＝５；後処理４８－ｈ、ｎ＝３－６）。グループ間の比較は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後試験とともに一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で表された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－虚偽及びエキソ－ナイーブＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、エキソナイーブ－ＩＲＩ及びエキソ－ｓｒＩκＢ－ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図5】エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＩＲ誘導された腎臓アポトーシスを改善する。（Ａ）左側：各実験グループからの腎臓から切断されたカスパーゼ－３と切断されたＰＡＲＰタンパク質の発現を比較したウェスタンブロット分析結果。右側：グラフ表示は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理が、エキソ－ナイーブ処理と比較し、切断されたカスパーゼ３の水準及び切断されたＰＡＲＰを低下させたことを示す。（Ｂ）左側：ＴＵＮＥＬ染色の代表的イメージ（ＦＩＴＣ標識）が提示されている。アポトーシス細胞は緑色（白色矢印）であり、ＤＡＰＩは対比染色として用いた。スケールバー、５０μＭ。右側：各グループからの腎臓切片においてＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す棒グラフ。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、より少ない数のアポトーシス細胞を誘導した（前処理２４－ｈ、ｎ＝５、前処理４８－ｈ、ｎ＝４－５、後処理２４－ｈ、ｎ＝５、後処理４８－ｈ、ｎ－３－６）。グループ間の比較は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後試験と共に一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で表した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－虚偽及びエキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１及び＃＃＃Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－ＩＲＩ及びエキソ－ｓｒＩκＢ ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図6A】腎臓虚血－再灌流損傷後のエキソソームの生体分布。（ａ）生体内イメージング及びエキソソーム伝達の実験図式。
【図6B-C】腎臓虚血－再灌流損傷後のエキソソームの生体分布。（ｂ）段階的生体内イメージングは、ＤｉＤ標識されたエキソソーム（緑色）の静脈エキソ－ｓｒＩκＢで処理された虚血後の腎臓において好中球（Ｌｙ６Ｇ＋、赤色）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋、青色）への吸収を示す。白色矢印は免疫細胞に含まれたＤｉＤ標識されたエキソソームを示す。白色波線は腎臓間質を示す。（ｃ）腎臓ＩＲＩ手術後の脾臓においてＤｉＤ標識されたエキソソーム（緑色）の生体分布は外部実質（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）において好中球（Ｌｙ６Ｇ＋、赤色）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋ 青色）へのエキソソーム吸収を示す。経過時間が表示される。スケールバー、２０μｍ。
【図7A-C】エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＩＲ誘導されたＡＫＩ後の腎臓免疫細胞母集団を調節する。（Ａ）手術後２４時間でマウスを犠牲にした。ＫＭＮＣは、酵素消化、機械的破壊及びパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度勾配を用いて濃厚化させた。このような方法を用いて決定された総腎臓細胞数は、実験グループ間で統計的差を示さなかった。（Ｂ）フローサイトメトリーのグラフ表示は、酵素消化、機械的破壊及びパーコール密度勾配を用いて、単離された腎臓細胞の中でＩＲＩ後に、より高比率の腎臓ＣＤ４５＋細胞を示した。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は腎臓免疫細胞の虚血後の急増（ｓｕｒｇｅ）を軽減させた。（Ｃ）追加の免疫細胞マーカーを用いて追加で染色した結果は、濃厚化したＫＭＮＣ中の好中球（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ＋）、炎症誘発性／抗炎症性単核食細胞（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋／ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）を含む多系統免疫細胞の頻度が、また、虚血後の腎臓でエキソ－ｓｒＩκＢ処理により減少したことを示した。
【図7D-F】エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＩＲ誘導されたＡＫＩ後の腎臓免疫細胞母集団を調節する。（Ｄ－Ｆ）Ｌｙ６Ｇ、Ｌｙ６Ｃ及びＦ４／８０を標的化する各実験グループの虚血後の腎臓について免疫蛍光研究を行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と接合された２次抗体を全ての免疫蛍光実験に用いた。データは、エキソ－ｓｒＩκＢ処理後の虚血後の腎臓でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色細胞（白色矢印）の減少した頻度を示し、これは、エキソ－ｓｒＩκＢ処理された腎臓に、より少ない好中球（Ｌｙ６Ｇ＋）及びエキソ－ｓｒＩκＢプロ／抗炎症性単核食細胞（Ｌｙ６Ｃ＋／Ｆ４／８０＋）があったことを示唆する。近位管細胞をＬＴＬ（緑色）で染色し、ＤＡＰＩを対比染色として用いた。スケールバー、５０μＭ、（実験グループ当たりｎ＝５）。グループ間の比較は、ボンフェローニ事後試験と共に一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で表示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブ－虚偽及びエキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、エキソ－ナイーブ－ＩＲＩ及びエキソ－ｓｒＩκＢ－ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図8A-F】エキソ－ｓｒＩκＢの静脈内伝達は虚血性ＡＫＩモデルにおいて腹腔内伝達と比較して類似した生物学的効果を奏する。（ａ）腎臓ＩＲＩ手術及びエキソソーム伝達の実験図式。各マウスグループに、再灌流１時間後９×１０９ｐｎのエキソ－ナイーブ、エキソ－ｓｒＩκＢまたはＰＢＳを静脈内注射した。ＩＲＩ手術後２４時間または４８時間にマウスを致死させ、追加評価のために血清及び組織を収集した。（ｂ－ｄ）治療類型（ＰＢＳ対エキソ－ナイーブ対エキソ－ｓｒＩκＢ）及び追跡観察時点（２４－ｈ及び４８－ｈ）により相違するグループ間のＢＵＮ、クレアチニン及びＮＧＡＬの血清水準、これは、エキソ－ｓｒＩκＢ処理の腎臓保護効果（実験グループ当たりｎ＝５）を示す。（ｅ）各実験マウスグループからの腎臓核抽出物を用いてＮＦ－κＢ ｐ６５発現のウェスタンブロット分析。核抽出物を細胞質分画から生化学的に分離し、ＮＦ－κＢ ｐ６５及びラミンＢ１発現はウェスタンブロッティングを通じて分析した。ＮＦ－κＢ信号伝達のＩＲＩ誘導された活性化は、手術後のエキソ－ｓｒＩκＢ処理により有意に抑制された。（ｆ）腎臓ＩＲＩ後のＮＦ－κＢ ｐ６５の上昇したＤＮＡ結合活性は手術後のエキソ－ｓｒＩκＢ処理により抑制された。
【図8G-H】エキソ－ｓｒＩκＢの静脈内伝達は虚血性ＡＫＩモデルにおいて腹腔内伝達と比較して類似した生物学的効果を奏する。（ｇ）ｑＲＴ－ＰＣＲデータは、虚血後のエキソ－ナイーブ処理グループでＩｃａｍ－１ ｍＲＮＡの増加した水準及びエキソ－ｓｒＩκＢ処理によりＩｃａｍ－１ ｍＲＮＡの顕著な減少を示す。（ｈ）各グループからの総腎臓溶解物のウェスタンブロット分析結果は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理によりＩＲ損傷した腎臓でＩＣＡＭ－１の減少した発現を立証した。グループ間の比較は、ボンフェローニ事後試験で一方向ＡＮＯＶＡを用いて評価した。データは平均±ＳＤ値で表した。ｎｓ；有意でない、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１．ＰＢＳ－虚偽及びエキソ－ナイーブ－ＩＲＩ手術グループ比較時。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、エキソ－ナイーブＩＲＩ及びエキソ－ｓｒＩκＢ－ＩＲＩ手術グループ比較時。
【図9】（１）操作されたエキソソーム生成及び特性化。（Ａ）スーパーリプレッサーＩκＢ－ローディングされたエキソソーム（エキソ－ｓｒＩκＢ）（上部）の生産に用いられるＤＮＡ作製物の概略図。融合タンパク質及び提案された活動を示す概略図（下部）。（Ｂ）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を通じたエキソ－ナイーブ及びエキソ－ｓｒＩκＢの形態学的特性化。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙまたはｓｒＩκＢを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びこれらＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのエキソソームを溶解させ、指示されたタンパク質に対して免疫ブロッティングした。
【図10】（２）エンドトキシン血症及び盲腸結紮及び穿孔（ＣＬＰ）誘導された敗血症においてエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果。（Ａ）リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）処理された、エキソ－ナイーブ及びエキソ－ｓｒＩκＢ処理された敗血症マウスの生存曲線。リポポリサッカライド（ＬＰＳ） Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５－６／グループ）、ＬＰＳ ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０／グループ）及びＣＬＰ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１４－１５／グループ）。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５ ＰＢＳ処理された敗血症グループと比較。（Ｂ）エキソソーム処理されたマウスの血漿で腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＬ－１β及びＣＣＬ４／マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）－１βの水準をＬＰＳ注射またはＣＬＰ後２４時間で測定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５ ＰＢＳ処理された敗血症グループと比較。†ｐ＜０．０５エキソ－ナイーブ処理された敗血症グループと比較。（Ｃ）虚偽（ｓｈａｍ）、ＰＢＳを有するＣＬＰ、エキソ－ナイーブを有するＣＬＰ、エキソ－ｓｒＩκＢを有するＣＬＰからの腎臓切片の皮質管細胞の代表的イメージ、近位管の正常な刷子縁（＊）または刷子縁損失（○）；クロマチン凝縮（白色矢印）；露出された基底膜（白色矢尻）；液胞化（黄色矢印）；スケールバー、１００μＭ。（Ｄ）各グループの代表的腎臓サンプルの病理学的腎臓損傷点数（ｓｃｏｒｅ）。＊ｐ＜０．０５ ＰＢＳ処理された敗血症グループと比較。†ｐ＜０．０５エキソ－ナイーブ処理された敗血症グループと比較。
【図11】（３）ＬＰＳ注射マウスにおいてエキソソーム生体分布。（Ａ）偽マウスの肝臓で好中球（ＬｙｓＭｇｆｐ／＋、緑色；Ｌｙ６Ｇ＋、青色）内にｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソソーム（赤色）吸収の生体内イメージング。（Ｂ）ＬＰＳ処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて肝臓のＬｙ６Ｇ＋好中球細胞（緑色）内部のｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソソーム（赤色）の代表的低速撮影（ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ）イメージング。（Ｃ）虚偽及びＬＰＳ処理されたＬｙｓＭＧＦＰ／＋マウスの脾臓内部でｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソソーム（赤色）の流れの段階的イメージ。経過時間が表示される。紫紅色、自己蛍光；スケールバー、５０μｍ。
【図12】（４）試験管内で核因子カッパーＢ（ＮＦ－κＢ）信号伝達に及ぼすエキソ－ｓｒＩκＢの抑制効果。（Ａ）ＨＥＫ２９３－ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ細胞（２×１０４細胞）を、エキソ－ナイーブまたはエキソ－ｓｒＩκＢ ２×１０５粒子と共に培養した。２４時間後、細胞を追加１８時間０．５ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αで処理した。ルシフェラーゼ活性を測定し、正規化した。（Ｂ）エキソ－ｓｒＩκＢはＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ細胞から容量依存的にＮＦ－κＢ活性化を抑制した。（Ｃ）ＴＨＰ－１細胞（５×１０５細胞）を１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで刺激させ、エキソ－ｓｒＩκＢ ５×１０６粒子で処理した。上清を収集し、ＴＮＦ－α及び単球走化性タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＣＰ）－１の生成に対して検定した。ＪＳＨ－２３（５０μＭ）を陽性対照群として用いた。＊＊ｐ＜０．０１ （Ｄ）ｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソ－ｓｒＩκＢと共に培養されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の免疫蛍光。代表的イメージが提示されている。核はＨｏｅｃｈｓｔで標識した。（Ｅ）ＨＵＶＥＣを３００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで２４時間刺激した。細胞を単一細胞懸濁液で収穫し、ヒト細胞間細胞付着分子（ＩＣＡＭ）－１に対する特定フィコエリトリン（ＰＥ）接合された抗体を用いてフローサイトメトリーを通じて評価した。
【図13】（Ｓ１）エキソソーム特性化。（Ａ）操作されたエキソソームを生成するために用いられる手順の概略図。（Ｂ）エキソ－ナイーブ、エキソ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びエキソ－ｓｒＩκＢの希釈されたサンプルで類似の大きさ分布を立証するナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）の代表的グラフ。
【図14】（Ｓ２）敗血症のマウスモデルにおいてエキソ－ｓｒＩκＢの抑制効果。（Ａ）体温変化は、野生型及びＬＰＳ処理されたＣ５７ＢＬ／６マウスに指示されたエキソソームを注射した後にモニタリングした。＊＊ｐ＜０．０１ ＰＢＳ処理されたＬＰＳグルーブと比較。（Ｂ）ＬＰＳ及びＰＢＳ（左側）、エキソ－ナイーブ（中間）及びエキソ－ｓｒＩκＢ（右側）で処理したＣ５７ＢＬ／６（上部パネル）及びＢＡＬＢ／ｃ（下部パネル）マウスの切片で腎臓皮質領域の代表的イメージ。近位管の正常刷子縁（＊）または刷子縁損失（○）；クロマチン凝縮（赤色矢印）；露出された基底膜（赤色矢印）；液胞化（青色矢印）；スケールバー、１００μＭ。（Ｃ）ＬＰＳ誘導された敗血症マウスのエキソ－ナイーブとエキソ－ｓｒＩκＢ処理されたグループ間の各臓器で浸潤されたＬｙ６Ｇ＋細胞の数の比教。（Ｄ）ＩＬ－１０の水準はＰＢＳ－、エキソ－ナイーブ－及びエキソ－ｓｒＩκＢ処理された敗血症マウスの血漿で測定した。ＮＳ、有意でない。
【図15】（Ｓ３）ＬＰＳチャレンジの存在または不在下のマウスにおけるエキソソームの生体分布。（Ａ）ＬＰＳの静脈内投与後に生体内イメージングシステムを用いて腎臓から検出されたｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソソームの分析。
【図16】（Ｓ４）ＨＵＶＥＣでＬＰＳ誘導された炎症反応に対するエキソ－ｓｒＩκＢの抑制効果。（Ａ）ＨＵＶＥＣ（７×１０４細胞）を２４時間エキソ－ｓｒＩκＢ １×１０７ 粒子と共に培養し、続いて、３６ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで刺激した。２４時間後に上清を収集し、それぞれＩＬ－８（左側）及びＭＣＰ－１（右側）の生産を分析した。ＪＳＨ－２３（５０μＭ）を陽性対照群として用いた。＊＊＊ｐ＜０．００１ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と比較。＃ｐ＜０．０５ ＬＰＳ単独で処理された細胞と比較。（Ｂ）ＨＵＶＥＣを２４時間エキソ－ｓｒＩκＢで前処理し、続いて、３６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ刺激を１時間行った。ウェスタンブロッティングを用いてｐ６５及びＩκＢαのタンパク質水準を評価した。ＧＡＰＤＨ及びヒストンＨ３（ＨＨ３）をそれぞれ細胞質細胞溶解物及び核分画に対する内因性対照群として用いた（左側）。この標的ＤＮＡ配列、５’－ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ－３’に対する核ＮＦ－κＢの結合は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を通じて測定した（右側）。
【図17】ＬＰＳ誘導された敗血症で肺損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果。 （１）肺胞；（２）毛細管；（３）好中球；（４）肺胞マクロファージ；（５）鬱血；（６）出血；（７）壊死を示すＨ＆Ｅ染色を示す。
【図18】ＬＰＳ誘導された敗血症で肺損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果。 虚偽、ナイーブエキソソーム、エキソ－ｓｒＩκＢ処理された敗血症マウスの生存曲線を示す。
【図19】ＬＰＳ誘導された敗血症で肺損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果。 エキソ－ｓｒＩκＢ処理された敗血症マウスの血漿中のＴＮＦ－αの水準を示す。
【図20】ＬＰＳ誘導された敗血症で肺損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果。 （１）中央静脈及び（２）免疫細胞の浸潤を示すＨ＆Ｅ染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本開示内容は、ＥＸＰＬＯＲ技術［参照：Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， １２２７７ （２０１６）］を提供し、これは、虚血性ＡＫＩ過程に及ぼすこれらの影響を評価するために、ｓｒＩκＢをエキソソームにローディングし、エキソ－ｓｒＩκＢを全身的に伝達するために用いられた。２つの組換えタンパク質、ＣＩＢＮ－ＥＧＦＰ－ＣＤ９及びｓｒＩκＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＲＹ２を生産したヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株を、青色光照明を用いてＣＲＹ２及びＣＩＢＮの一時的ドッキングを誘導することによりｓｒＩκＢ含有エキソソーム（エキソ－ｓｒＩκＢ）を生産するために用いた（図１Ａ）。対照群エキソソーム（エキソ－ナイーブ）は、無損傷のＨＥＫ２９３Ｔ細胞で生成した。結果は、光遺伝学的に操作されたエキソソームが治療剤として活用され得、エキソ－ｓｒＩκＢが免疫反応調節及びアポトーシスを通じてＩＲ誘導された腎臓損傷を軽減させることを確認した。
【0015】
本開示内容（特に、特許請求の範囲の文脈で）を説明する脈絡で用いられる用語の単数表現（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）及び類似の指示語は、本願で異なって明示されたり文脈により矛盾しない限り、単数及び複数をいずれも含むことと解釈されるべきである。本願において値の範囲を認容することは、単に範囲内にあるそれぞれの個別値を個別に言及する短縮方法として機能することが単に意図される。本願において特に指示されない限り、それぞれの個別値は、それぞれが本願において個別に言及されたことと同様に本明細書に導入される。本願に記載された全ての方法は、本願において特に指示されたり文脈上、明確に矛盾しない限り、任意の適した順序で行われ得る。本願に提供された任意の及び全ての例または例示的言語（例：「例えば」）の使用は、単に本開示内容をより十分に説明するためのものであり、特に請求された開示内容の範囲を制限しない。本明細書の如何なる言語も、本開示内容の実施に必須の任意の非請求要素を示すことと解釈されてはならない。
【0016】
本願に用いられたように、用語「約」は、例えば、ヌクレオチド配列の長さ、誤差程度、寸法、組成物中の成分量、濃度、容積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流速、圧力及びこれと類似の値及びこの範囲の変形を意味し、例えば、化合物、組成物、濃縮物または使用剤形を製造するために用いられる典型的測定及び取扱手続を通じて；この手続で不注意な誤りを通じて；これら方法を行うために用いられる出発物質または成分の製造、供給元または純度の差を通じて；及び考慮事項などを通じて発生し得る数量の変動を指す。用語「約」は、また、例えば、特定の初期濃度または混合物を有する組成物、剤形または細胞培養物の老化により相違する量、及び特定初期濃度または混合物を有する組成物または剤形の混合または処理により相違する量を含む。用語「約」により修正されても、添付の特許請求の範囲はこのような量に対する等価物を含む。用語「約」は、言及された基準値と類似した値の範囲を追加で指すことができる。特定の実施形態において、用語「約」は言及された基準値の５０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％以下に属する値の範囲を指す。
【0017】
本願で使用される「対象体」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ラビット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。
【0018】
ＡＫＩ
ＮＦ－κＢ信号伝達による免疫反応はＡＫＩに関与することができ、エキソ－ｓｒＩκＢは敗血症による腎臓損傷で腎臓損傷を改善する効果を発揮できる。本願の一部の実施例では、抑制剤の投与が虚血性ＡＫＩ過程を軽減させるかどうかを評価した。本願の実施例ではＥＸＰＬＯＲ技術を用いてＩＲＩ手術前後にｓｒＩκＢをマウスに伝達し、その結果を対照群と比較した。その結果、エキソ－ｓｒＩκＢ処理されたマウスは、対照群グループと比較し、より低水準の血清ＢＵＮ及びクレアチニン数値を示し、これによりＩＲ誘導されたＡＫＩから予防及び治療効果を発揮することを確認した。一方、エキソ－ｓｒＩκＢの投与が腎臓のＮＦ－κＢ信号に局所的に影響を及ぼすかどうかを確認した結果、エキソ－ｓｒＩκＢは、対照群グループと比較し、ＮＦ－κＢの核転座及び核結合活性を著しく減少させることが明らかになった。ＮＦ－κＢ経路は、免疫反応プロセスで重要な役割をすることができる。エキソ－ｓｒＩκＢ治療グループと対照群グループ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６でＰａｎ炎症性サイトカイン／ケモカインの遺伝子発現を比較した結果、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ２及びＴＮＦ－αを含む多数の炎症媒介因子の顕著な減少が確認された。最後に、本願の実施例では、ＮＦ－κＢ抑制剤の処理が腎臓免疫細胞母集団に影響を及ぼすかどうかを比較するためにフローサイトメトリーを行い、好中球、単核球／マクロファージ及びＴ細胞を含む多重免疫細胞母集団の頻度が顕著に減少することが観察された。
ＮＦ－κＢ信号伝達による免疫反応はＡＫＩに関与することができ、エキソ－ｓｒＩκＢは敗血症による腎臓損傷で腎臓損傷を改善する効果を発揮できる。本願の一部の実施例では、抑制剤の投与が虚血性ＡＫＩ過程を軽減させるかどうかを評価した。本願の実施例ではＥＸＰＬＯＲ技術を用いてＩＲＩ手術前後にｓｒＩκＢをマウスに伝達し、その結果を対照群と比較した。その結果、エキソ－ｓｒＩκＢ処理されたマウスは、対照群グループと比較し、より低水準の血清ＢＵＮ及びクレアチニン数値を示し、これによりＩＲ誘導されたＡＫＩから予防及び治療効果を発揮することを確認した。一方、エキソ－ｓｒＩκＢの投与が腎臓のＮＦ－κＢ信号に局所的に影響を及ぼすかどうかを確認した結果、エキソ－ｓｒＩκＢは、対照群グループと比較し、ＮＦ－κＢの核転座及び核結合活性を著しく減少させることが明らかになった。ＮＦ－κＢ経路は、免疫反応プロセスで重要な役割をすることができる。エキソ－ｓｒＩκＢ治療グループと対照群グループ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６でＰａｎ炎症性サイトカイン／ケモカインの遺伝子発現を比較した結果、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ２及びＴＮＦ－αを含む多数の炎症媒介因子の顕著な減少が確認された。最後に、本願の実施例では、ＮＦ－κＢ抑制剤の処理が腎臓免疫細胞母集団に影響を及ぼすかどうかを比較するためにフローサイトメトリーを行い、好中球、単核球／マクロファージ及びＴ細胞を含む多重免疫細胞母集団の頻度が顕著に減少することが観察された。
【0019】
ＩＲＩは炎症性カスケード及び酸化ストレスを誘導し、サイトカインストームを誘発し、アポトーシス及び隣接組織に対する構造的損傷を誘導する。ＮＦ－κＢ信号伝達経路はＩＲＩ刺激、特に、低酸素症／再灌流の初期段階中に損傷された細胞からの高水準の迅速な反応により細胞生存及び炎症を調節できる。例えば、移動性グループｂｏｘ １（ＨＭＧＢ１）、熱衝撃タンパク質（ＨＳＰ）及び病源体／損傷に連関した分子パターン（ＰＡＭＰ／ＤＡＭＰ）などの多数の内因性因子が放出される。これら内因性分子は、ＩＬ－１ＲなどのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びパターン認識受容体（ＰＲＰ）を刺激することができる。ＴＬＲ及びＩＬ－１Ｒは同一の細胞内ドメインを共有し、抑制タンパク質ＩκＢ残基をリン酸化し、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）を活性化し、これは最終的にプロテアソームによるＩκＢの分解を誘導する。このプロセスは、ヘテロ二量体（例：ｐ５０／ｐ６５）が細胞質から核に移動することを可能にし、これはＤＮＡに結合し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６及びＩＬ－８を含む炎症性媒介因子の転写を促進し、ＮＦ－κＢ信号伝達を加速化する。この炎症誘発性カスケードは、アポトーシスを誘導し、ＩＲＩに露出された腎管細胞で白血球の移動／活性化を促進することにより周辺の微細環境を調節できる。本開示内容の虚血性ＡＫＩモデルは、また、ＮＦ－κＢ信号伝達の活性化を誘導でき、これは偽手術グループと比較して腎臓免疫細胞母集団に有意に影響を及ぼす多数の炎症性サイトカイン／ケモカイン遺伝子の発現を誘導する。最近の研究には、ＴＬＲ拮抗剤、サイトカイン拮抗剤、ＩＫＫ複合体拮抗剤、プロテアソーム抑制剤、特定ＮＦ－κＢ複合体に特異的なデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及び多様な器官でＲｅｌタンパク質翻訳を抑制するＯＤＮが含まれる。これは、多様な薬理学的抑制剤を用いてＮＦ－κＢ信号伝達を抑制することによりＩＲＩでＮＦ－κＢを遮断する効果を奏する。セリン残基３２及び３６に突然変異を有するＩκＢαタンパク質はリン酸化されず、従って、細胞質においてＮＦ－κＢとの多量体として存在し、分解されないため、ＮＦ－κＢ核転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を保留（ｈｏｌｄｉｎｇ）する。この非分解性ＩκＢα、いわゆるスーパーリプレッサーＩκＢα（ｓｒＩκＢ）はアポトーシスを誘導し、抗腫瘍効果を奏することが公知となっている。
【0020】
本開示内容において、エキソ－ｓｒＩκＢの治療効果は急性腎炎を現す腎臓ＩＲＩモデルで提示される。エキソ－ｓｒＩκＢは、白血球の移動／活性化を制限できる炎症誘発性媒介因子の生産を下向調節し、炎症細胞の早期アポトーシスを誘導して炎症段階の早期終結を誘導することによりＡＫＩのプロセスを調節する。本開示内容において、エキソ－ｓｒＩκＢの投与は腎臓内免疫細胞母集団の頻度にのみ影響を及ぼし、脾臓内免疫細胞母集団の頻度には影響を及ぼさないことを確認した。このような結果は、エキソ－ｓｒＩκＢが細胞増殖を選択的に抑制したり、腎臓常駐免疫細胞でアポトーシスを促進することを示す。一方、エキソ－ｓｒＩκＢの生体内伝達は、損傷した腎臓への脾臓免疫細胞の流出を遮断することと解釈され得る。本開示内容において、エキソ－ｓｒＩκＢは、ＮＦ－κＢ信号の活性を抑制することにより、マウスにおいてＩＲ誘導されたＡＫＩを軽減させることが明らかになった。また、エキソ－ｓｒＩκＢの生体耐伝達は、炎症誘発性遺伝子の発現を減少させ、好中球、単核球／マクロファージ及びＴ細胞を含む腎臓免疫細胞母集団を減少させることにより腎臓の全体炎症状態を改善できる。従って、一つの側面で、本開示内容は、ｓｒＩκＢが搭載されたエキソソームに関し、より詳細には配列番号１のアミノ酸配列で表されるｓｒＩκＢが搭載されたエキソソームに関する。以下、ｓｒＩκＢはカーゴタンパク質と表されてもよい。
【0021】
一部の実施形態において、本願に記載されたＡＫＩは虚血再灌流（ＩＲ）誘導されたＡＫＩ、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）誘導されたＡＫＩまたは敗血症誘導されたＡＫＩであるが、これらに限定されない。虚血再灌流（ＩＲ）誘導された急性腎障害（ＡＫＩ）は、対象体が全身性低灌流を病んでおり、続いて、血流及び再酸素化の回復を伴う場合に発生し得る比較的一般的であるが、重症の医学的状態である。最も一般の臨床例は、腎臓移植または心臓手術を受けた患者、及び敗血症、外傷または心筋梗塞を有する患者を含む。腎臓ＩＲ損傷（ＩＲＩ）は、高罹患率／死亡率と関連があり、心臓、肺及び肝臓を含む他の遠位器官で機能障害を誘発することが公知となっている。ＩＲ誘導されたＡＫＩにおいて、低酸素症及び再灌流は活性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、続いて、アポトーシス及び炎症を含むカスケード反応、及び後続的に腎不全を発生させる。免疫学的反応は、腎臓ＩＲＩ及び修復に相当な影響を及ぼし得る。サイトカイン生産及び細胞生存を調節する核因子（ＮＦ）－κＢ信号伝達は、ＩＲ誘導されたＡＫＩに有意に関与し、この抑制は虚血性ＡＫＩを緩和させることができる。
【0022】
ＥＸＰＬＯＲ、外科的に操作されたエキソソーム技術を用いて、ＮＦ－κＢ（エキソ－ｓｒＩκＢ）のエキソソームスーパーリプレッサー抑制剤をエキソソームにローディングし、本願の実施例に提示された通り、腎臓ＩＲ手術後に／前にＢ６ ＷＴマウスに投与した。結果は、対照群エキソソーム（エキソ－ナイーブ）注射グループの結果と比較した。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、エキソ－ナイーブ処理グループより虚血後のマウスにおいて、より低水準の血清血中ウレア窒素、クレアチニン及び好中球ゼラチナーゼ連関のリポカリンをもたらした。エキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達は、虚血後の腎臓でＮＦ－κＢ活性を減少させてアポトーシスの水準を低下させた。虚血後の腎臓は、対照群と比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理により炎症誘発性サイトカイン及び付着分子の遺伝子発現の減少を示した。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、また、虚血後の腎臓免疫細胞母集団に有意に影響を及ぼし、対照群と比較して好中球、単核球／マクロファージ及びＴ細胞の頻度を低下させた。従って、エキソソーム伝達を通じたＮＦ－κＢ信号伝達の調節はＩＲ誘導されたＡＫＩを含むＡＫＩに対する新規な治療方法として用いられる。
【0023】
本発明のもう一つの実施形態において、エキソソームは、スーパー－リプレッサー（ＳＲ）ＩκＢ（ｓｒＩκＢ、配列番号１）と呼ばれるＮＦ－κＢの生物学的抑制剤の突然変異形態を含有するように操作される［参照：Ｎ． Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７， １２２７７ （２０１６）］。
【0024】
下記実施例に提示された通り、安定して形質感染された細胞においてエキソソームに多量のｓｒＩκＢのローディングのために、光遺伝学的に操作されたエキソソームシステム（ＥＸＰＬＯＲ）を用いた。下記実施例は、精製されたｓｒＩκＢローディングされたエキソソーム（エキソ－ｓｒＩκＢｓ）の腹腔内注射が敗血性マウスモデルにおいて死亡率と全身炎症を弱化させることを確認する。蛍光染料で標識されたエキソソームを用いた生体分布研究において、エキソ－ｓｒＩκＢはマウスの脾臓及び肝臓で、主に好中球で、及びより少ない程度の単核球で観察された。さらに、実施例はエキソ－ｓｒＩκＢが、脂質多糖類（ＬＰＳ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αに反応し、単核球ＴＨＰ－１細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で炎症反応を軽減させることを確認する。このような結果は、エキソ－ｓｒＩκＢがＮＦ－κＢ活性化を抑制することにより全身性炎症及び敗血症誘導された死亡から保護できることを確認する。
【0025】
本開示内容は、これを必要とする対象体において急性腎障害（ＡＫＩ）を治療する方法であり、対象体にＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢの抑制剤はＮＦ－κＢ抑制タンパク質、この断片及びこの混合物からなるグループから選択される。
【0026】
前記組成物は、エキソソーム生理学的に許容される水系溶液または懸濁液である。
【0027】
ＮＦ－κＢ抑制剤は、ＮＦ－κＢ抑制薬物、ＮＦ－κＢ抑制タンパク質またはこの断片、またはこれらの混合物から選択される。
【0028】
好ましくは、ＮＦ－κＢ抑制剤は、スーパーリプレッサーＩκＢ、ＩκＢ－α、ＩκＢ－β、ＩκＢ－ε、ＢＣＬ－３、これらの突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）、及びこれらの混合物からなるグループから選択される。
【0029】
本開示内容の更に他の好ましい実施形態において、本開示内容のエキソソームは、スーパーリプレッサー（ＳＲ）ＩκＢ（ｓｒＩκＢ、配列番号１）と呼ばれるＮＦ－κＢの突然変異形態の生物学的抑制剤を含有する。
【0030】
本開示内容の一つの実施形態において、ｓｒＩκＢは、Ａｌａで置換されたＩκＢ（配列番号２）のＳｅｒ３２及びＳｅｒ３６を有する。
【0031】
配列番号１ ホモサピエンス、スーパー－リプレッサー－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）
ＭＦＱＡＡＥＲＰＱＥＷＡＭＥＧＰＲＤＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＡＧＬＤＡＭＫＤＥＥＹＥＱＭＶＫＥＬＱＥＩＲＬＥＰＱＥＶＰＲＧＳＥＰＷＫＱＱＬＴＥＤＧＤＳＦＬＨＬＡＩＩＨＥＥＫＡＬＴＭＥＶＩＲＱＶＫＧＤＬＡＦＬＮＦＱＮＮＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩＴＮＱＰＥＩＡＥＡＬＬＧＡＧＣＤＰＥＬＲＤＦＲＧＮＴＰＬＨＬＡＣＥＱＧＣＬＡＳＶＧＶＬＴＱＳＣＴＴＰＨＬＨＳＩＬＫＡＴＮＹＮＧＨＴＣＬＨＬＡＳＩＨＧＹＬＧＩＶＥＬＬＶＳＬＧＡＤＶＮＡＱＥＰＣＮＧＲＴＡＬＨＬＡＶＤＬＱＮＰＤＬＶＳＬＬＬＫＣＧＡＤＶＮＲＶＴＹＱＧＹＳＰＹＱＬＴＷＧＲＰＳＴＲＩＱＱＱＬＧＱＬＴＬＥＮＬＱＭＬＰＥＳＥＤＥＥＳＹＤＴＥＳＥＦＴＥＦＴＥＤＥＬＰＹＤＤＣＶＦＧＧＱＲＬＴＬ
ＭＦＱＡＡＥＲＰＱＥＷＡＭＥＧＰＲＤＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＡＧＬＤＡＭＫＤＥＥＹＥＱＭＶＫＥＬＱＥＩＲＬＥＰＱＥＶＰＲＧＳＥＰＷＫＱＱＬＴＥＤＧＤＳＦＬＨＬＡＩＩＨＥＥＫＡＬＴＭＥＶＩＲＱＶＫＧＤＬＡＦＬＮＦＱＮＮＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩＴＮＱＰＥＩＡＥＡＬＬＧＡＧＣＤＰＥＬＲＤＦＲＧＮＴＰＬＨＬＡＣＥＱＧＣＬＡＳＶＧＶＬＴＱＳＣＴＴＰＨＬＨＳＩＬＫＡＴＮＹＮＧＨＴＣＬＨＬＡＳＩＨＧＹＬＧＩＶＥＬＬＶＳＬＧＡＤＶＮＡＱＥＰＣＮＧＲＴＡＬＨＬＡＶＤＬＱＮＰＤＬＶＳＬＬＬＫＣＧＡＤＶＮＲＶＴＹＱＧＹＳＰＹＱＬＴＷＧＲＰＳＴＲＩＱＱＱＬＧＱＬＴＬＥＮＬＱＭＬＰＥＳＥＤＥＥＳＹＤＴＥＳＥＦＴＥＦＴＥＤＥＬＰＹＤＤＣＶＦＧＧＱＲＬＴＬ
【0032】
配列番号２ ホモサピエンス、ＩκＢ－α
ＭＦＱＡＡＥＲＰＱＥＷＡＭＥＧＰＲＤＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥＹＥＱＭＶＫＥＬＱＥＩＲＬＥＰＱＥＶＰＲＧＳＥＰＷＫＱＱＬＴＥＤＧＤＳＦＬＨＬＡＩＩＨＥＥＫＡＬＴＭＥＶＩＲＱＶＫＧＤＬＡＦＬＮＦＱＮＮＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩＴＮＱＰＥＩＡＥＡＬＬＧＡＧＣＤＰＥＬＲＤＦＲＧＮＴＰＬＨＬＡＣＥＱＧＣＬＡＳＶＧＶＬＴＱＳＣＴＴＰＨＬＨＳＩＬＫＡＴＮＹＮＧＨＴＣＬＨＬＡＳＩＨＧＹＬＧＩＶＥＬＬＶＳＬＧＡＤＶＮＡＱＥＰＣＮＧＲＴＡＬＨＬＡＶＤＬＱＮＰＤＬＶＳＬＬＬＫＣＧＡＤＶＮＲＶＴＹＱＧＹＳＰＹＱＬＴＷＧＲＰＳＴＲＩＱＱＱＬＧＱＬＴＬＥＮＬＱＭＬＰＥＳＥＤＥＥＳＹＤＴＥＳＥＦＴＥＦＴＥＤＥＬＰＹＤＤＣＶＦＧＧＱＲＬＴＬ
ＭＦＱＡＡＥＲＰＱＥＷＡＭＥＧＰＲＤＧＬＫＫＥＲＬＬＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥＥＹＥＱＭＶＫＥＬＱＥＩＲＬＥＰＱＥＶＰＲＧＳＥＰＷＫＱＱＬＴＥＤＧＤＳＦＬＨＬＡＩＩＨＥＥＫＡＬＴＭＥＶＩＲＱＶＫＧＤＬＡＦＬＮＦＱＮＮＬＱＱＴＰＬＨＬＡＶＩＴＮＱＰＥＩＡＥＡＬＬＧＡＧＣＤＰＥＬＲＤＦＲＧＮＴＰＬＨＬＡＣＥＱＧＣＬＡＳＶＧＶＬＴＱＳＣＴＴＰＨＬＨＳＩＬＫＡＴＮＹＮＧＨＴＣＬＨＬＡＳＩＨＧＹＬＧＩＶＥＬＬＶＳＬＧＡＤＶＮＡＱＥＰＣＮＧＲＴＡＬＨＬＡＶＤＬＱＮＰＤＬＶＳＬＬＬＫＣＧＡＤＶＮＲＶＴＹＱＧＹＳＰＹＱＬＴＷＧＲＰＳＴＲＩＱＱＱＬＧＱＬＴＬＥＮＬＱＭＬＰＥＳＥＤＥＥＳＹＤＴＥＳＥＦＴＥＦＴＥＤＥＬＰＹＤＤＣＶＦＧＧＱＲＬＴＬ
【0033】
配列番号３ 組換えｓｒＩκＢαペプチド
ＤＲＨＤＡＧＬＤＡＭＫＤＥ
ＤＲＨＤＡＧＬＤＡＭＫＤＥ
【0034】
一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は、配列番号１または配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１で表される。
【0035】
一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１で表される。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２で表示される。
【0036】
本開示内容の特定の実施形態において、エキソソームは、光特異的結合タンパク質（ｐｈｏｔｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をさらに含む。一部の実施形態において、光特異的結合タンパク質は、照射時に互いに可逆的に相互作用する第１光特異的結合タンパク質及び／又は第２光特異的結合タンパク質を含む。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はエキソソーム特異的マーカーに接合して第１融合タンパク質（融合タンパク質Ｉ）を形成する。一部の実施形態において、第２光特異的結合タンパク質はＮＦ－κＢ抑制タンパク質に接合して第２融合タンパク質（融合タンパク質ＩＩ）を形成する。一部の実施形態において、融合タンパク質Ｉ及び融合タンパク質ＩＩは、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質を通じて可逆的に連結される。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質は、エキソソームの内側に向かう方向に位置するようにエキソソーム特異的マーカーに接合される。
【0037】
追加の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質は、ＣＩＢ、ＣＩＢＮ、ＰｈｙＢ、ＰＩＦ、ＦＫＦ１、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＣＲＹまたはＰＨＲを含むが、これらに限定されないグループから選択される。
【0038】
追加の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＩＢまたはＣＩＢＮであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＲＹまたはＰＨＲであるか；第１光特異的結合タンパク質はＣＲＹまたはＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢまたはＣＩＢＮである。
【0039】
追加の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＰｈｙＢであり、第２光特異的結合タンパク質はＰＩＦであるか、第１光特異的結合タンパク質はＰＩＦであり、第２光特異的結合タンパク質はＰｈｙＢである。
【0040】
追加の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＧＩＧＡＮＴＥＡであり、第２光特異的結合タンパク質はＦＫＦ１であるか、第１光特異的結合タンパク質はＦＫＦ１であり、第２光特異的結合タンパク質はＧＩＧＡＮＴＥＡである。
【0041】
一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ８２を含むが、これらに限定されないグループから選択される。追加の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ９である。追加の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ６３である。追加の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ８１である。追加の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ８２である。
【0042】
一部の実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約７５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約７５ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１００ｎｍ～約１２５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１２５ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１５０ｎｍ～約１７５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１７５ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する。実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０以上の直径及び／又は約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００以下の直径を有する。
【0043】
全ての細部事項を記載することなく、米国特許第１０７０２５８１号及び韓国特許第１０－２１００４２０号の内容は、本開示内容のＮＦ－κＢ抑制剤を含有するエキソソームを製造するための組成物及び方法を提供するために参照により本願に導入される。
【0044】
本開示内容は、また、治療学的有効薬物の持続放出を提供するが、従来の持続効果は治療剤の反復投与を必要とする。
【0045】
本開示内容はまた、ＮＦ－κＢ抑制剤を担持する細胞外小胞（エキソソーム）及び薬剤学的に許容される担体または担体らを含む薬剤学的組成物を提供する。
【0046】
ＩＲ誘導されたＡＫＩの病態生理学を理解するにおいて最近の注目すべき進歩にもかかわらず、虚血性ＡＫＩを治療するための臨床的効能及び安全性が立証された薬物は開発されておらず；従って、関連の死亡率及び罹患率の水準が重要である。ＮＦ－κＢ信号伝達はＩＲ誘導されたＡＫＩの過程に深く関与するため、エキソソームを用いたＮＦ－κＢ抑制剤の全身伝達が虚血性ＡＫＩ過程を軽減させるかを評価した。ＥＸＰＬＯＲ技術を用いて光学的に制御されたエキソソームの生合成を通じて、エキソ－ｓｒＩκＢをＩＲＩ手術前後にマウスに伝達し、結果を対照群グループの結果と比較した。その結果は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理の提供を受けたマウスグループがＩＲ誘導されたＡＫＩから保護されたことを示し；これは、対照群グループより良好な生化学的及び組織学的結果を示した。エキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達は虚血後の腎臓でＮＦ－κＢ信号伝達を抑制し、これは炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン及び付着分子の発現を減少させ、アポトーシスを軽減させた。最後に、ＮＦ－κＢ処理は腎臓免疫細胞母集団に影響を及ぼし、フローサイトメトリー及び免疫蛍光分析を通じて好中球、単核球／マクロファージ及びＴ細胞を含む複数の免疫細胞母集団頻度の顕著な減少が観察された。
【0047】
ＩＲＩの初期過程で、炎症誘発性カスケード及び酸化ストレスはＮＦ－κＢ経路活性化をもたらし、続いて、細胞生存及び炎症の調節を誘導する。低酸素症／再灌流の初期段階で高い移動性グループｂｏｘ１、熱衝撃タンパク質及び病源体／損傷連関した分子パターンを含む複数の内因性因子が放出され、このような分子はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）及びインターロイキン－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）などのパターン認識受容体を刺激する。このプロセスは、その後にＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）を活性化させてプロテアソームによるＩκＢ分解を誘導する。続いて、ヘテロ二量体（例：ｐ５０／ｐ６５）はシトソールから核に移動し、これらはＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６及びＩＬ－８を含む炎症媒介因子の転写を促進し、また、ＮＦ－κＢ信号伝達をさらに促進する。これら炎症誘発性カスケードは、ＩＲＩに提供された細尿管細胞でアポトーシスを誘導し、白血球の移動／活性化を促進させることにより周辺の微細環境を調節する。本実験的虚血性ＡＫＩモデルは、腎臓ＩＲＩ後のＮＦ－κＢ信号伝達の活性化を再現でき、これは腎臓免疫細胞母集団に有意に影響を及ぼす多発性炎症性サイトカイン／ケモカイン及び組織アポトーシスの増加した発現を誘導できる。
【0048】
最近の実験研究は、ＴＬＲ拮抗剤、サイトカイン拮抗剤（３３）、ＩＫＫ複合体拮抗剤、プロテアソーム抑制剤及び多様な器官で特定のＮＦ－κＢ複合体に特異的なデコイオリゴデオキシヌクレオチドを含み、ＮＦ－κＢ信号伝達の選択的薬理学的抑制剤を用いて、ＩＲＩに対するＮＦ－κＢ遮断の効果に関するより詳細な証拠を示した。ｓｒＩκＢは、セリン残基３２及び３６に突然変異を有する非分解性ＩκＢαタンパク質である。このタンパク質はＮＦ－κＢ核転座及び後続ＮＦ－κＢ信号伝達を防止する。ｓｒＩκＢは、好中球浸潤及び肺浮腫を減少させて肺ＩＲＩモデルにおいて保護効果を立証し、また、化学抵抗性を減少させて抗腫瘍効果を奏することが公知となっている。しかし、腎臓損傷の過程でｓｒＩκＢ処理の効果は完全に評価されていない。生命工学エキソソームをベクターとして用いることにより、チェら（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ）は、最近の敗血性ＡＫＩモデルにおいてｓｒＩκＢ処理の治療的利点を示した。下記実施例は、また、腎臓ＩＲＩモデルにおいてエキソ－ｓｒＩκＢ処理の保護効果を立証し、多様な類型のＡＫＩでエキソソームを通じてｓｒＩκＢ伝達の治療的潜在力を拡張する。
【0049】
炎症プロセスの調節は、虚血性ＡＫＩの分野において重要な治療的考察であった。脾臓切除術及び抗ＴＮＦ－α製剤、インフリキシマブの使用は、炎症性サイトカインの発現及びマクロファージ／単核球の蓄積を低下させ、実験的な虚血性ＡＫＩモデルにおいて保護効果を奏した。白血球及びマクロファージの移動を抑制することは腎臓機能を保存し、細胞死滅を軽減させた。提供された例は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理が炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン及び接着分子の発現を下向調節し、アポトーシスを減少させ、ＩＲ－損傷した腎臓で多系統免疫細胞の蓄積を軽減させることを示した。このような結果は、エキソ－ｓｒＩκＢが炎症誘発性カスケードの下向調節を通じて虚血性ＡＫＩの過程を変形させ、後続の白血球の移動／活性化を制限し、アポトーシスを防止することを示唆する。
【0050】
エキソソームは、他の類型のベクターをコンベアとして用いるよりいくつかの利点を有する。第１に、ＥＶは循環中の分解から自然に保護され、自己使用される場合に非免疫原性である。エキソソームはまた、これらの固有の細胞標的化の特性を通じて、血液－脳障壁などの天然障壁を克服できる。さらに、エキソソームは、吸収、細胞内運送及び標的細胞へのカーゴの最終伝達の過程で受容者細胞固有のメカニズムを用いる。このような特性を維持しながら、ＥＸＰＬＯＲ技術は、エキソソームから制御可能な可逆的分離を通じてカーゴタンパク質の細胞内水準を顕著に増加させることができた。治療タンパク質の細胞内伝達には、低精製効率、宿主に対する免疫反応の誘導及び限定されたシトソール伝達を含みいくつかの技術的障害があり、ＥＸＰＬＯＲ技術を用いたこのような新規のエキソソーム伝達方法は、以前の技術のものと比較し、エキソソームローディング性能、伝達効率及び純度を顕著に改善させた。下記実施例は、ＥＸＰＬＯＲ技術を用いたエキソ－ｓｒＩκＢの効率のよい伝達が実験的ＩＲＩ後に腎臓結果に有意な改善をもたらすことを示す。
【0051】
全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、腎臓内の免疫細胞母集団の頻度にのみ影響を及ぼすが、脾臓内のものには影響を及ぼさない。これは、増殖を軽減させたりアポトーシスを促進する腎臓常駐免疫細胞に選択的に作用したり、損傷した腎臓への脾臓免疫細胞の流出を遮断するエキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達に選択的に作用するエキソ－ｓｒＩκＢに関与できる。腎臓常駐免疫細胞及びリンパ器官からの免疫細胞は、相違する起源、表現型及び機能的特性を有することが公知となっている。キメラマウスまたは生体内イメージングを用いた追加研究は、滞留腎臓免疫細胞を循環免疫細胞と区別でき、全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理により影響を受ける免疫細胞母集団に対するより多くの情報を提供できる。
【0052】
活性治療剤のカーゴを伝達するための担体としてエキソソームを用いることは、ＩＲ誘導されたＡＫＩモデルにｓｒＩκＢを伝達する安全で効率のよい方法である。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、ＮＦ－κＢ信号伝達を下向調節し、虚血性損傷した腎臓において炎症及びアポトーシスを改善することによりマウスにおいてＩＲ誘導されたＡＫＩを軽減させる。エキソソームを用いて標的細胞に対する免疫抑制タンパク質の直接細胞内伝達は、ＩＲ誘導されたＡＫＩの有望な治療道具であり、ヒト腎臓ＩＲＩにおいてエキソ－ｓｒＩκＢの治療の可能性はさらに探索されなければならない。
【0053】
敗血症により誘発された疾患
敗血症は、多数の臓器不全及び過多な炎症反応を伴い、複雑な病態生理学的特徴を有し、あらゆる症状を効果的に治療できる治療剤を開発することは容易ではない。敗血症は、先天性免疫系の強力な活性化を通じて開示され、病源体によるパターン認識受容体（ＰＲＲ）の活性化により媒介され、補体システム、凝固システム及び血管内皮の活性化を誘導して正常な恒常性が困難である。
敗血症は、多数の臓器不全及び過多な炎症反応を伴い、複雑な病態生理学的特徴を有し、あらゆる症状を効果的に治療できる治療剤を開発することは容易ではない。敗血症は、先天性免疫系の強力な活性化を通じて開示され、病源体によるパターン認識受容体（ＰＲＲ）の活性化により媒介され、補体システム、凝固システム及び血管内皮の活性化を誘導して正常な恒常性が困難である。
【0054】
本願の実施例で提示された通り、エキソ－ｓｒＩκＢの効果は、敗血症マウスモデルにおいてＮＦ－κＢ活性の抑制を通じて炎症反応を解決し、臓器損傷を減少させることができた。ｓｒＩκＢは、ＮＦ－κＢが核に流入し、転写因子として作用することを防止する分解不可能な形態のＩκＢαである。例えば、ｓｒＩκＢがローディングされた免疫抑制性エキソソームを生成するために、機能性タンパク質をエキソソームに搭載できる最近の技術が活用された。敗血症マウスモデル（例えば、全身伝達）においてエキソ－ｓｒＩκＢを全身に伝達することにより、本願の実施例は、エキソソームが好中球及びマクロファージに伝達され、これは敗血症炎症反応の主要参加者であることを確認した。また、本実施例の両方のマウス敗血症モデルにおいて、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６などの炎症誘発性マーカーを有意に減少させたが、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０を減少させていない。エキソソームをＬＰＳ注射１時間後に注射した場合にも、エキソ－ｓｒＩκＢの有意な治療効果が観察された。従って、エキソ－ｓｒＩκＢによる処理は免疫抑制状態に転換される前に敗血症の初期段階にも適用され得る。
【0055】
炎症誘発性サイトカインは敗血症により誘発された急性腎障害（ＡＫＩ）において重要な役割をすることができる。本願の実施例においてＣＬＰ手術またはＬＰＳ注射により誘発されたＡＫＩを有するマウスモデルにおいて、組織病理学的検査の結果として、糸球体構造が破壊され、細尿管上皮細胞が縮退され、重症細胞内浮腫及び鬱血が敗血症誘導されたグループの細尿管で発生することを確認した。しかし、エキソ－ｓｒＩκＢ投与は病変の重症度、腎臓損傷及び炎症細胞の浸潤を減少させた。
【0056】
好中球の組織浸潤は、敗血症において主要なプロセスであり得る。例えば、好中球を枯渇させ、好中球の動員を抑制するための特異的付着分子を標的化する一部の研究では、敗血症において組織損傷を減少させることができ、保護され得ることが報告された。ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βは、ＭＣＰ－１及びＩＬ－８などのケモカインの発現のための主要媒介因子であり、これは、炎症反応中に好中球及び単核球／マクロファージに対する重要な化学誘引剤である。このようなケモカインは、活性化後の単核球／マクロファージの局所浸潤を開始する。しかし、ＨＵＶＥＣにおいて、エキソ－ｓｒＩκＢはＬＰＳ誘導されたＭＣＰ－１及びＩＬ－８の放出を減少させ、これにより単核球／マクロファージ浸潤を抑制することが示された。このようなデータは、本願の生体内研究で得られた結果と一致する。本実施例において、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は敗血症動物モデルの脾臓、腎臓、肺及び肝臓で好中球の浸潤を有意に減少させた。敗血症の病態生理学において好中球の重要な役割を考慮するとき、エキソ－ｓｒＩκＢの組織保護効果は、少なくとも腎臓において好中球の浸潤の減少と関連され得る。
【0057】
一部の実施形態において、脾臓は、腎臓及び肝臓などの他の臓器と比較し、高水準の好中球を示す。炎症誘発性サイトカインは脾臓で発生し得、他の臓器に影響を及ぼし得る。炎症誘発性サイトカインをコードする大部分の遺伝子は、ＬＰＳにより誘発された敗血性炎症反応において重要な転写因子の一つであるＮＦ－κＢの調節の下に存在し得る。エキソ－ｓｒＩκＢ処理の存在または不在によりＮＦ－κＢ反応リポータータンパク質の発現を本願の実施例で調査し、ｐ６５の転座を確認した。エキソ－ｓｒＩκＢは、ＮＦ－κＢサブユニット６５の核転座を遮断することにより、ＮＦ－κＢ信号活性化を抑制した。
【0058】
一部の実施形態において、エキソソームは、敗血症マウスモデルにおいて免疫抑制タンパク質の治療的伝達のためのメカニズムとして用いられる。エキソソームは、ｓｒＩκＢを細胞に伝達できる優れた担体であり、敗血症の治療のための新たなオプションを提供できる。免疫抑制タンパク質を生体内で標的細胞に直接伝達する方法は、以前に確立していないが、本開示内容によるエキソ－ｓｒＩκＢはＮＦ－κＢの抑制剤として作用し、これにより炎症関連遺伝子の発現及び直接炎症反応を抑制する。本願の実施例は、これを抑制して敗血症の炎症誘発性サイトカインストーム及びそれによる臓器損傷を軽減させることができる。
【0059】
脂質多糖類（ＬＰＳ；エンドトキシンモデル）または盲腸結紮及び穿孔（ＣＬＰ、多菌性モデル）のいずれか一つにより誘導された敗血症の動物モデルにおいて、最近の研究は、多様な化学的特性と作用メカニズムを有するＮＦ－κＢ抑制剤が敗血性致死から動物を保護するということを立証した。７００以上のＮＦ－κＢ抑制剤が報告されたが、現在までヒトに用いられるように承認されたＮＦ－κＢ遮断剤はない。多様なステロイド及び非ステロイド性抗炎症剤がＮＦ－κＢを遮断することが明らかになったが、これらの効果は非常に多面的（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）であり、特異性が欠如する。ＮＦ－κＢ活性化経路で核心要素の特異的抑制を目的とする新規の治療戦略は最近開発中であり、敗血症により誘発された一つ以上の疾患に対する敗血症治療及び治療としての潜在的効能に対する期待が高い。リン酸化部位を有さない操作されたＩκＢαタンパク質を発現する遺伝的作製物、スーパーリプレッサーＩκＢ（ｓｒＩκＢ）も用いられた。特定のリン酸化部位でＩκＢα突然変異（Ｓｅｒ３２及びＳｅｒ３６がＡｌａで代替される）は、延長された半減期を有するＩκＢαの優性活性形態をもたらす。このようなｓｒＩκＢはＩκＢαの安定した細胞質プールを誘導し、これにより核ＮＦ－κＢ活性化を防止する。
【0060】
ここで、エキソソームは、ｓｒＩκＢを治療用標的に伝達する治療用コンベアとして用いられた。エキソソームは、多様なタンパク質及び調節遺伝子を標的細胞に移動させる強力な治療媒介因子として認識されてきた。これらは非免疫原性ナノ小胞として機能し、血清プロテアーゼ及び免疫反応からこれらのカーゴを保護することができる。可溶性タンパク質をエキソソームにローディングすることはＥＸＰＬＯＲと呼ばれる技術により可能になり、これは、自然なエキソソーム生合成プロセス及び光遺伝学により制御される可逆的タンパク質－タンパク質相互作用を用いる。特定の標的タンパク質をエキソソームにローディングするために、２つの組換えタンパク質、ＣＩＢＮ－ＥＧＦＰ－ＣＤ９及びｓｒＩκＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＲＹ２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株が生成された（図１Ａ）。以前の研究と一致し、ＥＸＰＬＯＲ技術を用いて、ｓｒＩκＢローディングされたエキソソームを生産した。ｓｒＩκＢローディングエキソソームはエキソ－ｓｒＩκＢとして指定され、無損傷のＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成されたエキソソームはエキソ－ナイーブとして指定された。治療の目的でエキソ－ｓｒＩκＢを敗血症モデルに適用することにより、敗血症誘導された臓器損傷は改善され、炎症誘発性サイトカインの分泌を抑制し、これにより敗血症患者の全般的生存率を改善させた。
【0061】
本開示内容は、これを必要とする対象体において敗血症により誘発された疾患を治療する方法であって、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を前記対象体に投与することを含む、方法を提供する。
【0062】
実施形態において、疾患は肺炎、サイトカインストーム症候群、呼吸困難症候群及び臓器不全からなるグループから選択されるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、疾患は肺炎である。一部の実施形態において、疾患はサイトカインストーム症候群である。一部の実施形態において、疾患は呼吸困難症候群である。一部の実施形態において、疾患は臓器不全である。
【0063】
実施形態において、ＮＦ－κＢの抑制剤はＮＦ－κＢ抑制タンパク質、この断片及びこれらの混合物からなるグループから選択される。実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤はスーパー抑制剤（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）、ＩκＢ－α、ＩκＢ－β、ＩκＢ－ε、ＢＣＬ－３、これらの突然変異体及びこれらの混合物からなるグループから選択される。実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤はスーパーリプレッサー（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）である。
【0064】
実施形態において、組成物は、経口、経皮、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下または混合経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は経口経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は経皮経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は腹腔内経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は静脈内経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は筋肉内経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は皮下経路を通じて投与される。一部の実施形態において、組成物は混合経路を通じて投与される。
【0065】
実施形態において、方法は、抗炎症剤を対象体に投与することをさらに含む。
【0066】
実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームは、光特異的結合タンパクをさらに含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１または配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも８９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１で表される。
【0067】
一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも８９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号１で表される。一部の実施形態において、ＮＦ－κＢ抑制剤は配列番号２で表される。
【0068】
一部の実施形態において、光特異的結合タンパク質は第１光特異的結合タンパク質及び／又は第２光特異的結合タンパク質である。実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はエキソソーム特異的マーカーに接合されて融合タンパク質Ｉを形成し；第２光特異的結合タンパク質はＮＦ－κＢ抑制剤に接合されて融合タンパク質ＩＩを形成する。実施形態において、融合タンパク質Ｉ及び融合タンパク質ＩＩは、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質を通じて可逆的に連結される。実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はエキソソームの内側に向かう方向に位置するようにエキソソーム特異的マーカーに接合される。
【0069】
一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢ、ＣＩＢＮ、ＰｈｙＢ、ＰＩＦ ＦＫＦ１、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＣＲＹ及びＰＨＲからなるグループから選択される。実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＩＢであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＲＹである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＩＢＮであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＲＹである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＩＢであり、第２光特異的結合タンパク質はＰＨＲである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＩＢＮであり、第２光特異的結合タンパク質はＰＨＲである。
【0070】
一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＲＹまたはＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢまたはＣＩＢＮである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＲＹであり、第２－特異的結合タンパク質はＣＩＢである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＣＲＹであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢＮである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢである。一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質はＣＩＢＮである。
【0071】
一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＰｈｙＢであり、第２光特異的結合タンパク質はＰＩＦである。実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＰＩＦであり、第２光特異的結合タンパク質はＰｈｙＢである。
【0072】
一部の実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＧＩＧＡＮＴＥＡであり、第２光特異的結合タンパク質はＦＫＦ１である。実施形態において、第１光特異的結合タンパク質はＦＫＦ１であり、第２光特異的結合タンパク質はＧＩＧＡＮＴＥＡである。
【0073】
一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２からなるグループから選択される。一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ９である。一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ６３である。一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ８１である。一部の実施形態において、エキソソーム特異的マーカーはＣＤ８２である。
【0074】
一部の実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約７５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約７５ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１００ｎｍ～約１２５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１２５ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１５０ｎｍ～約１７５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約１７５ｎｍ～約２００ｍｍの直径を有する。実施形態において、エキソソームは約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、エキソソームは約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５ １５０以上の直径及び／又は約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５ １５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００以下の直径を有する。
【0075】
一部の実施形態において、前記組成物は生理学的に許容される担体または担体らをさらに含む薬剤学的組成物である。
【0076】
ＥＸＰＬＯＲ（登録商標）技術
最近、エキソソームは、遺伝子／薬物伝達のための新規なバイオ担体として重要な注目を受けた。エキソソームは、生物活性物質を受容者細胞に伝達したり、標的細胞の信号伝達経路に影響を及ぼすことにより細胞間の通信で重要な役割をする細胞外小胞（ＥＶ）である。エキソソームは貯蔵がより容易であり、より大きい安定性を示す。エキソソームは、生物学的障壁を克服できる高用量を有し、特定の細胞類型を標的化する表面分子を運搬でき、従って、オフ標的効果がより少ない。しかし、エキソソームの臨床的適用において、多量の純粋なエキソソームを得、可溶性タンパク質をエキソソームにローディングすることは重大な課題であった。イムら（Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．）により開発された新規な、光遺伝学的に操作されたエキソソーム技術である「光可逆的タンパク質－タンパク質相互作用を通じたタンパク質ローディングのためのエキソソーム」（ＥＸＰＬＯＲ）を使用し、エキソソームの生産効率及び生物学的互換性で顕著な発展がなされた。このＥＸＰＬＯＲ技術は、最近、チェら（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．）により実験的敗血症モデルに採択され；これらはスーパーリプレッサーＩκＢ（ｓｒＩκＢ）を含有するエキソソームをマウスに伝達した。これは、ＮＦ－κＢの核転座を防止するカッパーＢ（ＩκＢ）抑制剤の非分解性形態であった。これらの研究は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理がマウス敗血症モデルにおいて全身炎症反応及び後続する臓器機能障害を改善させることを示した。
最近、エキソソームは、遺伝子／薬物伝達のための新規なバイオ担体として重要な注目を受けた。エキソソームは、生物活性物質を受容者細胞に伝達したり、標的細胞の信号伝達経路に影響を及ぼすことにより細胞間の通信で重要な役割をする細胞外小胞（ＥＶ）である。エキソソームは貯蔵がより容易であり、より大きい安定性を示す。エキソソームは、生物学的障壁を克服できる高用量を有し、特定の細胞類型を標的化する表面分子を運搬でき、従って、オフ標的効果がより少ない。しかし、エキソソームの臨床的適用において、多量の純粋なエキソソームを得、可溶性タンパク質をエキソソームにローディングすることは重大な課題であった。イムら（Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．）により開発された新規な、光遺伝学的に操作されたエキソソーム技術である「光可逆的タンパク質－タンパク質相互作用を通じたタンパク質ローディングのためのエキソソーム」（ＥＸＰＬＯＲ）を使用し、エキソソームの生産効率及び生物学的互換性で顕著な発展がなされた。このＥＸＰＬＯＲ技術は、最近、チェら（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．）により実験的敗血症モデルに採択され；これらはスーパーリプレッサーＩκＢ（ｓｒＩκＢ）を含有するエキソソームをマウスに伝達した。これは、ＮＦ－κＢの核転座を防止するカッパーＢ（ＩκＢ）抑制剤の非分解性形態であった。これらの研究は、エキソ－ｓｒＩκＢ処理がマウス敗血症モデルにおいて全身炎症反応及び後続する臓器機能障害を改善させることを示した。
【0077】
実施例
動物：雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、延世医療センターの中央動物施設で特定の病源体非含有条件（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で飼育させた。全ての実験に６－７週齢の雄マウスを用いた。また、Ｃ５６ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、オリエントバイオ（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ）（大韓民国城南）から購入した。好中球及びマクロファージにおいてＧＦＰを本質的に発現するＬｙｓＭＧＦＰ／＋マウスは、Ｄｒ．Ｍ．Ｋｉｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）により寛大に提供された。
動物：雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、延世医療センターの中央動物施設で特定の病源体非含有条件（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で飼育させた。全ての実験に６－７週齢の雄マウスを用いた。また、Ｃ５６ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、オリエントバイオ（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ）（大韓民国城南）から購入した。好中球及びマクロファージにおいてＧＦＰを本質的に発現するＬｙｓＭＧＦＰ／＋マウスは、Ｄｒ．Ｍ．Ｋｉｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ， ＵＳＡ）により寛大に提供された。
【0078】
エキソソーム単離：２つの組換えタンパク質、ＣＩＢＮ－ＥＧＦＰ－ＣＤ９及びｓｒＩκＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＲＹ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を用いてｓｒＩκＢローディングされたエキソソームを生産した。無損傷のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をエキソ－ナイーブの生産に用いた。安定した細胞を３７℃で２４時間Ｔ１７５フラスコに播種した。培地を除去した後、細胞を洗浄し、エキソソーム枯渇した培地に再懸濁させた。続いて、細胞をＣＯ２インキュベータで４６０ｎｍ発光ダイオードの連続青色光照明に露光させた。７２時間後、細胞培養上清を回収し、遠心分離して細胞と破片を除去し、０．２２μｍのポリエーテルスルホンフィルタを通じて濾過し；タンジェンシャルフロー・フィルトレーション及びサイズ排除クロマトグラフィの組合わせを用いてエキソソームを単離した。一部の実施例において、エキソ－ｓｒＩκＢを生産するために、安定した細胞をＴ１７５フラスコに播種した。１日後、培地を注意して除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、エキソソーム枯渇した培地を添加した。続いて、細胞をＣＯ２インキュベータで４６０ｎｍ発光ダイオードの連続青色光照明に露光させた。７２時間後、細胞培養上清を回収し、１，０００ｇで１５分間遠心分離して細胞及び細胞破片を除去し、続いて、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルタを通じて濾過して巨大粒子を除去した。エキソソームを分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）基盤の膜濾過を用いて単離した。単離したエキソソームをＳＥＣで精製した。
【0079】
透過電子顕微鏡：ＴＥＭを通じてＥＶの形態を観察するために、５μＬのＥＶを１５秒間炭素コーティングされた銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）に吸収させた。過量の液体を除去した後、サンプルを２％のウラニルアセテート（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で陰性で染色した。ＴＥＭイメージは、２００ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｒｅｔｒｏｆｉｔ電子顕微鏡（ＦＥＩ ｃｏｍｐａｎｙ Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて得た。細胞外小胞（ＥＶ）は陰性染色を通じて形態学的に評価した。まず、ＰＢＳに懸濁した５μｌのＥＶをグロー放電炭素コーティングされた銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｔｆｉｅｌｄ， ＰＡ， ＵＳＡ）にローディングした。３～５秒間サンプルを吸着した後、グリッドを濾紙でブロッティングし、２％のウラニルアセテート（ＵＡ）で染色した。続いて、乾燥機を用いてサンプルを２０秒間乾燥させた。ＥＶは２００ｋＶの電圧でＴｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｒｅｔｒｏｆｉｔ（ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ， ＯＲ， ＵＳＡ）で観察した。
【0080】
ナノ粒子追跡分析：ＥＶの粒子数及び大きさ分布は４８８ｎｍのレーザが内蔵されたゼータビュー（Ｚｅｔａｖｉｅｗ）装置（ＰＭＸ１２０、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＮＴＡにより測定した。製造業者の指示に従って、粒子非含有ＰＢＳでサンプルを希釈した（血清１：１００～１：１００００）。サンプルを２５℃でカメラレベル７８及びシャッター８０で一定の流動条件で分析した。ＮＴＡにより決定された大きさ分布は、懸濁液でＥＶの流体力学的直径に対応する。ブラウン運動速度から粒子数を計算し、粒子運動速度を基盤に２次元ストークス－アインシュタイン方程式を用いて大きさを決定した。特定サンプルを０．２μＭの濾過されたＰＢＳで１：１００～１：１０，０００に希釈した。ＥＶ濃度はフレーム当たり５０～２００粒子数を基盤に測定された。各測定に対し、１１セル位置で２サイクルのスキャニングを下記設定で行った：焦点、自動焦点；全てのサンプルに対するカメラ感度、７８．０；シャッター、７０；及びセル温度、２５℃。ＥＶ濃度はｍｌ当りの粒子数（ｐｎ／ｍｌ）で表した。
【0081】
免疫ブロッティング：細胞をＨａｌｔ（登録商標）プロテアーゼ及びフォスファターゼ抑制剤カクテル（１００Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解させ、腎臓をトリトンＸ－１００溶解緩衝液に溶解させた。溶解物を４℃で１０－２０分間９，０００～１６，０００×ｇで遠心分離させ、上清を後続のイムノブロッティングのために－７０℃に保管した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ検定（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＭ）を用いて測定した。タンパク質抽出物をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に溶解させ、１００℃で５分間加熱した。タンパク質をアクリルアミド変性ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動してニトロセルロース（ＮＣ）膜に移した。トランスファー膜を遮断緩衝液Ａ（ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び５％無脂肪ミルク）で２２℃で１時間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、ｓｒＩκＢに対する１次抗体（カスタマイズ型抗体、Ａｂｅｌｏｎ、ソウル、大韓民国）、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＧＭ１３０、カルネキシン（Ａｂｃａｍ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＤ９、ＣＤ６３（ＳＢＩ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、プロヒビチン（ＮＯＶＵＳＢＩＯ， Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ）、ヌクレオポリンｐ６２（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＮＦ－κＢ（クローン８２４２Ｓ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、Ｌａｍｉｎ Ｂ１（Ｃｌｏｎｅ ａｂ１３３７４１），ＩＣＡＭ－１（Ｃｌｏｎｅ ＡＦ７９６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、切断されたカスパーゼ－３（Ｃｌｏｎｅ ９６６１Ｌ，細胞信号伝達技術）、切断されたＰＡＲＰ（クローン９５４４Ｓ、細胞信号伝達技術）及びβ－アクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で一晩中インキュベーションした。膜を特定の２次抗体で洗浄し、インキュベーションした後、これらを化学発光剤［Ｃｌａｒｉｔｙ及びＣｌａｒｉｔｙ Ｍａｘ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）またはＷｅｓｔ－Ｑ Ｐｉｃｏ Ｄｕｒａ ＥＣＬ溶液（ＧｅｎＤＥＰＯＴ， Ｋａｔｙ， ＴＸ）］を用いて発色させた。イメージ（Ｉｍａｇｅ）Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて各グループに対するバンドの相対的光学密度を測定した。
【0082】
マウス腎臓虚血再灌流モデル：マウスを、チレタミン／ゾラゼパム（Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標））－キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））混合物（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与を通じて麻酔させ、加熱された手術用パッド（３７℃）に位置させた。両側ＩＲＩは背側アプローチ法を使用して行った。腎臓のペディクルを解剖し、マイクロクランプ（Ｊｅｕｎｇｄｏ Ｂｉｏ ＆ Ｐｌａｎｔ、ソウル、大韓民国）を各腎臓ペディクルに３０分間位置させた。偽動物は、麻酔及び両側背側切開を単独で提供を受けた。手術中、マウスを温かい普通の生理食塩水１ｍｌで水和させて脱水を防止した。虚血３０分後、両クランプをいずれも除去し、Ａｕｔｏｃｌｉｐ（登録商標）創傷閉鎖システム（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州ホリストン）で創傷を閉鎖する前に血流回復を確認した。動物に飲食物及び飲水に自由にアプローチさせて回復させた。マウスをＩＲＩ手術の２４時間または４８時間後に犠牲にした。追加分析のために各マウスから血清、脾臓及び腎臓を収集した。Ｃｏｂａｓ Ｃ５０２自動分析機（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて血清ＢＵＮ及びクレアチニン数値を分析した。
【0083】
酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）：サンプルを１：１００～１０００倍に希釈した後に製造業者のプロトコル（マウスリポカリン－２／ＮＧＡＬ定量的ＥＬＩＳＡキット）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により、マウスＥＬＩＳＡキットを用いて血清ＮＧＡＬ水準を測定した。
【0084】
ＴＨＰ－１及びＨＵＶＥＣ培養物から収集された上清のＴＮＦ－α、ＩＬ－８及びＭＣＰ－１水準は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ ＵＳＡ）を用いて測定し、ＨＵＶＥＣでＮＦ－κＢ活性はトランスＡＭ ＮＦ－κＢ ｐ６５キット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。高級ＣＬＰ手続後に指した時点で心臓穿孔を通じて収集されたマウス血漿中のＴＮＦ－α、ＣＣＬ－４／マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）－１β、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの水準は、マウス磁気ルミネックスイースクリーニングアッセイキット（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ ｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。検定は、製造業者の指示に従って行った。全てのサンプル及び標準は、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）２００ＴＭシステム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて二重に検定した。指した時点で血清ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＣＣＬ４を測定するために、ＬＰＳエンドトキシン血症手続後の心臓穿孔を通じて血液サンプルを収集し、室温で２時間凝血させ、続いて、４℃で２０分間２，０００ｇで遠心分離した。
【0085】
ＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出：腎臓を収集し、小片に切断し、ＰＢＳで洗浄し、腎臓の重量によりＮＥ－ＰＥＲ核及び細胞質抽出試薬キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から得られた特定容積の細胞質抽出試薬（ＣＥＲ）１でビードで均質化した。１５秒の激烈な渦動及び１０分間の氷上におけるインキュベーション後、ＣＥＲ ＩＩを各腎臓サンプルに添加した後、氷上で１分間インキュベーションし、１６，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を細胞質抽出物で収集し、不溶性分画を核抽出試薬に懸濁させた。１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、全ての上清を収集して核抽出物として用いた。
【0086】
腎臓損傷点数及び免疫組織化学の組織病理学的評価：ホルマリン固定された及びパラフィン包埋された腎臓組織サンブルの５マイクロメートル厚の切片をヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）及びＩＨＣ染色を通じて処理した。組織学的に腎臓損傷を評価するために、各スライドをＨＥで染色した。腎臓病理学者（ＪＩＹ）は、盲目的に皮質部位の全体管中の壊死管の比率を点数化した。腎臓損傷は、総管中の損傷した管の比率により点数化した：０、正常；１、＜２５％損傷；２、２５～５０％損傷；３，５０～７５％損傷、４、７５～９０％損傷；及び５、＞９０％損傷。損傷した管に対する組織学的基準は、管刷子縁の損失、液胞化、クロマチン凝縮、及び露出された管基底膜を含んだ。一般に、５０－１００管を含む５つのランダムに選択された高出力領域で細尿管を評価して点数化した。
【0087】
ＩＨＣの場合、組織切片を脱パラフィン化し、エチルアルコールで再水和し、水道水で洗浄した。ブラック・アンド・デッカー（Ｂｌａｃｋ ＆ Ｄｅｃｋｅｒ）の植物性蒸し器を用いて、抗原を２０分間１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液で検索した。スライドを２２℃で３０分間１０％のロバ血清で遮断し、ＰＢＳを用いて洗浄した。ＮＦ－κＢ（Ｃｌｏｎｅ ８２４２Ｓ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）及びＩＣＡＭ－１（Ｃｌｏｎｅ ＡＦ７９６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する１次抗体を、ウシ血清アルブミン中の２％のカゼインを用いて適切な濃度に希釈し、スライドに添加し、４℃で一晩中インキュベーションした。洗浄後、２次抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を２２℃で１時間適用した。ジアミノベンジジンを２分間添加し、ヘマトキシリンを用いてスライドを対照染色した。染色強度の半定量的点数は、４００倍の倍率の下にデジタルイメージ分析（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．６ｒ５， Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ， ＰＡ）を通じて各切片で少なくとも５フィールドを調査して得た。
【0088】
ＮＦ－κＢのＤＮＡ結合活性の測定：２０μgの腎臓核抽出物を用いて、ＴｒａｎｓＡＭ ＮＦ－κＢ検定キット（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて製造業者のプロトコルによりＤＮＡに対するｐ６５／ｃ－Ｒｅｌ（ＮＦ－κＢ）の結合活性を測定した。
【0089】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応：全体腎臓ＲＮＡ抽出の確立した方法を用いた。簡単にいって、全体腎臓サンプルを７００μｌのＲＮＡｉｓｏ試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．， Ｏｔｓｕ， Ｓｈｉｇａ， Ｊａｐａｎ）で均質化させた。続いて、１６０μｌのクロロホルムを腎臓細胞の均質化したサンプルに添加した。続いて、混合物を３０秒間激烈に振盪させ、２２℃で３分間維持し、４℃で１６，０００×ｇで１５分間遠心分離した。３相の上部に位置した水性相を、他の相との汚染を防止するために、新鮮なチューブに注意して移した。４００μｌのイソプロパノールを添加して抽出されたＲＮＡを沈殿させ、４℃で３０分間１６，０００×ｇで遠心分離した。ＲＮＡペレットを７０％のエタノールで洗浄し、２分間空気乾燥し、滅菌されたジエチルピロカーボネート処理された蒸溜水に溶解させた。抽出されたＲＮＡの量及び品質は２６０及び２８０ｎｍの波長で分光光度測定で評価した。単離されたＲＮＡをＣＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ， Ｓｈｉｇａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅ，Ｊａｐａｎ）を用いてｃＤＮＡで逆転写させた。各ＤＮＡの５μｌを１０μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び５ｐｍｏｌのセンス／アンチセンスプライマーと混合した。プライマー濃度は、各プライマーに対する最適濃度を確認する予備実験後に決定した。ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、Ｉｌ－２、Ｉｌ－４、Ｉｌ－６、Ｉｌ－１０、Ｉｌ－１７α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ２、Ｉｆｎ－γ、Ｔｎｆ－α及びＩｃａｍ－１の発現水準はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。ＰＣＲ条件は次の通りである：初期加熱段階は９５℃で９分間行った後、９４．５℃で３０分間３５サイクルの変性、６０℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸長、７２℃で７分間最終拡張。各プライマーの配列データは表１に提示されている。
【0090】
【表1】
【0091】
各サンプルを分離チューブ中で三重に実行し、ｃＤＮＡを含まない陰性対照群を各検定に並行して実行した。リアルタイムＰＣＲ後、温度を２℃／ｍｉｎの速度で６０℃から９５℃に増加させて溶融曲線を作成した。それぞれの遺伝子の発現値を１８Ｓ ｒＲＮＡの値に対して正規化し、２－△△ＣＴとの比較ＣＴ方法を用いて相対倍数発現値を計算した。
【0092】
血清中の多重サイトカイン検定：ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７Ａ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを含む、１３個の炎症性サイトカイン及びケモカインは、１：２希釈された血清を用いて、メーカーのプロトコル（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によりミリフレックスマウスサイトカイン／ケモカイン磁気ビードパネル（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ）マルチプレックス検定キットを用いて分析した。定量化は、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）２００マイクロプレートリーダー（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行った。
【0093】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識検定：細胞死滅を、市販キット（Ｓ７１１０，Ｍｅｒｃｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてＦＩＴＣ標識されたＴＵＮＥＬ検定で評価した。ホルマリン固定された腎臓組織のＴＵＮＥＬ陽性細胞は、４００倍拡大したデジタルイメージ分析（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．６ｒ５，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）で各セクションの最小５フィールドを調査して確認した。
【0094】
マウスからの腎臓単核細胞及び脾臓細胞の単離：ＫＭＮＣは確立したプロトコルにより単離した。両方の腎臓を放血後に除去し、脱カプセル化し、微細に切り、３７℃で３０分間コラゲナーゼ類型Ｉ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）でインキュベーションした。酵素消化後、７０μｍのストレーナ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通じた組織の機械的破壊により単一細胞腎臓懸濁液を達成した。製造業者の指示に従って、等張性パーコール密度勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）（ブレーキオフモードで３０分間１，５００×ｇ）を用いてＲＴで遠心分離した後にＫＭＮＣを収集した。収集された細胞を洗浄し、５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） ＩＩ ＦＬ自動化細胞計数機（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて自動的に計数した。
【0095】
脾臓細胞は、７０μｍのストレーナ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて脾臓の機械的破壊を通じて収集し、ＲＢＣ溶解溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に３分間インキュベーションし、赤血球を除去する。
【0096】
腎臓ＣＤ４＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ選別：ＦＡＣＳ選別のために、ＫＭＮＣを抗ＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃブロック（クローン９３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に氷上で１０分間事前インキュベーションし、モノクローナルＡｂ抗ＣＤ４５（ＡＰＣ，Ｃｌｏｎｅ ３０－Ｆ１１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗Ｌｙ６Ｇ（ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ ７５０、Ｃｌｏｎｅ １Ａ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗Ｌｙ６Ｃ（ＦＩＴＣ、Ｃｌｏｎｅ ＨＫ１．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗Ｆ４／８０（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５，Ｃｌｏｎｅ ＢＭ８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗ＣＤ３（ＰＥ， Ｃｌｏｎｅ １７Ａ２， Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で４℃で３０分間染色した。ＦＡＣＳ緩衝液（５％ ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄及び再懸濁後、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．２）を用いて染色された細胞をＬＳＲＩＩで分析した。破片／致死細胞及び二重線を除去した後、各サンプルをＣＤ４５、Ｌｙ６Ｇ、Ｌｙ６Ｃ、Ｆ４／８０及びＣＤ３の発現に基づいて分析した。ＯｎｅＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補正に用いた。
【0097】
免疫蛍光：脱パラフィン化、再水化及び抗原検索を行った後、スライドを２２℃で３０分間１０％の塩素血清で遮断し、リン酸塩緩衝食塩水を用いてＴｗｅｅｎ－２０で洗浄した。Ｌｙ－６Ｇ（Ｃｌｏｎｅ ａｂ２５３７７，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ），Ｌｙ－６Ｃ（Ｃｌｏｎｅ ａｂ１５６２７，Ａｂｃａｍ）、Ｆ４／８０（Ｃｌｏｎｅ ａｂ６６４０，Ａｂｃａｍ）及びフルオレセイン（ＦＩＴＣ）接合されたローツステトラゴノロブスレクチン（ＬＴＬ）（Ｃｌｏｎｅ ＦＬ－１３２１ Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に対する１次抗体をウシ血清アルブミン中の２％のカゼインを用いて適切な濃度に希釈し、スライドに添加し、４℃で一晩中インキュベーションした。洗浄後、ヤギ抗ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ａｂ１５０１６７、Ａｂｃａｍ）を２２℃で１時間適用した。続いて、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＭＢＤ００１５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてスライドを対比染色した。染色強度は、デジタルイメージ分析（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．６ｒ５、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）を通じて４００倍の倍率で各セクションで最小５フィールドを調査して半定量的に点数化した。
【0098】
統計：データは、平均値±標準偏差（ＳＤ）値で表した。統計的差は、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたボンフェローニ事後試験を用いた一方向ＡＮＯＶＡを用いて分析した。Ｐ＜０．０５の場合、結果は統計学的に有意な差を示した。
【0099】
ＬＰＳのエンドトキシン血症モデル：ＬＰＳエンドトキシン血症のマウスモデルを生成するために、エシェリキア・コリ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）に由来するＬＰＳを雄マウスに注射した。
【0100】
高級ＣＬＰ敗血症モデル及び治療摂生：ＯＲＩＥＮＴＢＩＯ（大韓民国京畿道城南市）から購入した雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、小さい変更を伴うその前に記載された手続を用いて９－１０週齢で高級ＣＬＰに提供した。全てのマウスを収容し、国際実験動物管理協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）により承認された延世大医科大学生医学研究所の特定の病源体非含有地域で実験を行った。マウスを、全ての手続前に、８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン混合物のｉｐ注射を通じて麻酔した。麻酔後、腹膜を無菌方式で開封し、盲腸を遠位末端で４－０黒色絹糸１ｃｍを用いて結紮し、２３ゲージ（ｇａｕｇｅ）ニードルで穿孔した。穿孔後、ニードルを除去し、両方の穿孔を通じて少量の便を押し出して開通性を確保した。続いて、盲腸を腹腔内に再度入れ、腹部の切開部を６－０ナイロン縫合糸で封合し、ステンレススチール除去可能な創傷クリップを皮膚に用いた。この手続後、体重２０ｇ当たり予熱された食塩水１ｍｌを皮下投与した。虚偽処理されたマウスは、盲腸の結紮及び穿孔を除いては同様の手続を経た。この手続後、１．０×１０９粒子のエキソ－ナイーブまたはエキソ－ｓｒＩκＢを０、６、１２及び１８時間でｉｐ注射を通じてマウスに投与した。対照群として、同一容積のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を同様の方式で注射した。動物をＣＬＰ後に初期４８時間は２時間ごとに評価し、続いて、５日間は４時間ごとに評価した。サンプルを収集し、ＣＬＰ後１８時間以内に手続の結果を評価した。
【0101】
生体内イメージング：レーザースキャニング生体内共焦点顕微鏡（ＩＶＭ－Ｃ；ＩＶＩＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、大田、大韓民国）を用いて、エキソ－ｓｒＩκＢの生体分布及び抗腐敗効果を可視化した。生体内イメージングの間、ｈｏｍｏｅｏｔｈｅｒｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてマウスの体温を３７℃に維持した。マウスをゾレチル（３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔させた。肝臓、脾臓及び腎臓を含む内部臓器にアプローチするために、皮膚及び腹膜の両方に１０ｍｍの小さい切開を行った。露出された臓器は、イメージング中に食塩水を反復的に適用して水和状態に維持した。エキソソーム生体分布を、エキソ－ナイーブまたはエキソ－ｓｒＩκＢ注射前後に広域ｚ－スタック（ｓｔａｃｋ）イメージングを通じて可視化した。生体内でＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの好中球を蛍光標識するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ａ２０００９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と接合された抗－Ｌｙ６Ｇ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を静脈内注射した。ｍＣＬＩＮＧ ＡＴＴＯ ６４７Ｎ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で標識されたナイーブまたはｓｒＩκＢエキソソームを尾静脈カテーテルまたは３１－Ｇインシュリン注射器を通じて静脈内注射した。敗血症モデルを生成するために、イメージング前に１～１６時間高容量ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を静脈内注射した。
【0102】
共焦点顕微鏡検査：エキソソーム吸収分析のために、エキソソームをダルベッコ ＰＢＳ（ＤＰＢＳ）０．５ｍｌで希釈した。続いて、製造者の指示に従って、懸濁液を６４７Ｎ標識されたｍＣＬＩＮＧ－ＡＴＴＯ（シナプティック・システム）と共にインキュベーションした。続いて、遠心分離を通じて混合物のペレットを得、３００μｌの再懸濁されたペレットをＨＵＶＥＣと共にインキュベーションした。２４時間後、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド溶液に固定させた。Ｈｏｅｃｈｓｔは核染色に用いられた。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）７１０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてイメージを記録した。
【0103】
ルシフェラーゼ検定：ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＦ－κＢの反応要素（ＳＬ－００１２；Ｓｉｇｎｏｓｉｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）の下に調節されたルシフェラーゼ受容体作製物で安定してトランスフェクションさせ、製造業者の指示に従って成長させた。細胞を３７℃で２４時間エキソソームで処理し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＩＤ３マイクロプレートリーダ－（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した（Ｅ１５０１；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。
【0104】
フローサイトメトリー：ＨＵＶＥＣ上で発現された表面マーカーの水準をフローサイトメトリーを用いて評価した。細胞を分離し、遠心分離を通じて収穫し、ヒトＩＣＡＭ－１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的なフィコエリスリン（ＰＥ）接合された抗体で暗状態で３０分間氷上で標識し、続いて、広範囲に洗浄した。全てのサンプルをＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データはＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いて分析した。ＩｇＧｌｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的なＰＥ接合された抗体をアイソフォーム対照群として用いた。
【0105】
実施例１．操作されたエキソソームの特性化及び分析
エキソソーム製造、回収及び精製は、図１３に示された通り、以前の研究で完全に記載されている。粒子の大きさは大部分３０～１２０ｎｍであり、平均サイズは１０１ｎｍである。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）結果に応じて大きさを有する無損傷のカップ状の膜小胞を示した（図１、Ｂ及びＣ）。エキソ－ｓｒＩκＢに対するイムノブロッティング分析結果は、ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ及びＧＡＰＤＨなどの陽性エキソソームマーカーを有するｓｒＩκＢ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＤ９及びＧＦＰを含む標的タンパク質の強力な発現を示した。エキソ－ｓｒＩκＢは、プロヒビチン、カルネキシン、ＧＭ１３０及びヌクレオポリン６２を含む細胞小器官マーカーの発現が欠如した。エキソ－ナイーブはエキソソームマーカーを除いた如何なるマーカーも発現しなかった（図１Ｄ）。
エキソソーム製造、回収及び精製は、図１３に示された通り、以前の研究で完全に記載されている。粒子の大きさは大部分３０～１２０ｎｍであり、平均サイズは１０１ｎｍである。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）結果に応じて大きさを有する無損傷のカップ状の膜小胞を示した（図１、Ｂ及びＣ）。エキソ－ｓｒＩκＢに対するイムノブロッティング分析結果は、ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１、Ａｌｉｘ及びＧＡＰＤＨなどの陽性エキソソームマーカーを有するｓｒＩκＢ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＤ９及びＧＦＰを含む標的タンパク質の強力な発現を示した。エキソ－ｓｒＩκＢは、プロヒビチン、カルネキシン、ＧＭ１３０及びヌクレオポリン６２を含む細胞小器官マーカーの発現が欠如した。エキソ－ナイーブはエキソソームマーカーを除いた如何なるマーカーも発現しなかった（図１Ｄ）。
【0106】
実施例２．エキソ－ｓｒＩκＢの注射は腎臓虚血再灌流損傷を改善する。
まず、腎臓ＩＲＩ過程でエキソ－ｓｒＩκＢの役割を調査した。各実験グループを３×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢまたは、腎臓ＩＲＩの前後に、エキソ－ナイーブを１時間間隔（合計９×１０９ｐｎ）で３回腹腔内注射した。（前処理：ＩＲＩ手術前に３、２及び１時間、後処理：ＩＲＩ手術後に１、２及び３時間）。マウスを手術２４または４８時間後に犠牲にした（図２Ａ）。
まず、腎臓ＩＲＩ過程でエキソ－ｓｒＩκＢの役割を調査した。各実験グループを３×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢまたは、腎臓ＩＲＩの前後に、エキソ－ナイーブを１時間間隔（合計９×１０９ｐｎ）で３回腹腔内注射した。（前処理：ＩＲＩ手術前に３、２及び１時間、後処理：ＩＲＩ手術後に１、２及び３時間）。マウスを手術２４または４８時間後に犠牲にした（図２Ａ）。
【0107】
興味深いことに、エキソ－ｓｒＩκＢの提供を受けたマウスグループは、前処理及び後処理モデル（２４－ｈ／４８－ｈ ＢＵＮ及び両モデルにおいてクレアチニン、Ｐ＜０．００１）の両方で、ＩＲＩ手術後にエキソ－ナイーブ注射グループより血清血液ウレア窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの顕著に、より低い水準を示した（図２Ｂ及び２Ｃ）。血清好中球ゼラチナーゼ連関のリポカリン（ＮＧＡＬ）の水準は、エキソ－ナイーブグループと比較し、前処理及び後処理モデルのエキソ－ｓｒＩκＢ注射グループにおいて有意に減少した（Ｐ＜０．００１）（図２Ｄ）。組織学的評価結果は、また、前／後処理モデルにおいて、エキソ－ナイーブグループと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ治療の提供を受けたマウスグループで、より低い管損傷点数を示した（Ｐ＜０．０５対エキソ－ナイーブ注射グループ）（図２Ｅ）。総合的に、このようなデータはエキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達が虚血性ＡＫＩの進行を直接予防することを示す。
【0108】
実施例３．全身エキソ－ｓＩκＢ処理はＩＲ－損傷した腎臓において腎臓ＮＦ－κＢ信号伝達を抑制する。
全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理がＩＲ誘導されたＡＫＩ過程に影響を及ぼす根本的メカニズムを理解するために、エキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達をまず研究し、腎臓において局所ＮＦ－κＢ信号伝達を抑制するかどうかを決定した。それぞれ相違する実験グループの腎臓核抽出物中のＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質の発現はウェスタンブロッティングを通じて測定した。９×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢを用いた全身処理は、エキソ－ナイーブ処理グループで発見されたものと比較し、ＩＲＩ前（ＩＲＩ ２４時間後、Ｐ＜０．０５；４８時間、Ｐ＜０．０１）及びＩＲＩ後（ＩＲＩ ２４－／４８時間後、Ｐ＜０．０１）（図３Ａ）処理モデルにおいてＩＲ誘導されたＮＦ－κＢ核転座を減少させた。この発見は、各実験グループの腎臓核抽出物を用いてｐ６５のＤＮＡ結合活性を測定することにより再確認された。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、処理時点（前処理：ＩＲＩ ２４－／４８－時間後、Ｐ＜０．０５；後処理：ＩＲＩ ２－／４８時間、Ｐ＜０．０１）と関係なく、エキソ－ナイーブグループと比較し、腎臓ＩＲＩ後にＮＦ－κＢのＤＮＡ結合活性を有意に下向調節した（図３Ｂ）。ＮＦ－κＢ免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を通じた追加検証は、対照群処理グループと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループでＮＦ－κＢの発現が有意に減少したことが示された（前処理：ＩＲＩ ２４時間後、Ｐ＜０．０５；４８－ｈ、Ｐ＜０．００１及び後処理：ＩＲＩ ２４－／４８－ｈ後、Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。従って、全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＩＲ後の腎臓で腎臓ＮＦ－κＢ信号伝達を減少させることができる。
全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理がＩＲ誘導されたＡＫＩ過程に影響を及ぼす根本的メカニズムを理解するために、エキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達をまず研究し、腎臓において局所ＮＦ－κＢ信号伝達を抑制するかどうかを決定した。それぞれ相違する実験グループの腎臓核抽出物中のＮＦ－κＢ ｐ６５タンパク質の発現はウェスタンブロッティングを通じて測定した。９×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢを用いた全身処理は、エキソ－ナイーブ処理グループで発見されたものと比較し、ＩＲＩ前（ＩＲＩ ２４時間後、Ｐ＜０．０５；４８時間、Ｐ＜０．０１）及びＩＲＩ後（ＩＲＩ ２４－／４８時間後、Ｐ＜０．０１）（図３Ａ）処理モデルにおいてＩＲ誘導されたＮＦ－κＢ核転座を減少させた。この発見は、各実験グループの腎臓核抽出物を用いてｐ６５のＤＮＡ結合活性を測定することにより再確認された。エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、処理時点（前処理：ＩＲＩ ２４－／４８－時間後、Ｐ＜０．０５；後処理：ＩＲＩ ２－／４８時間、Ｐ＜０．０１）と関係なく、エキソ－ナイーブグループと比較し、腎臓ＩＲＩ後にＮＦ－κＢのＤＮＡ結合活性を有意に下向調節した（図３Ｂ）。ＮＦ－κＢ免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を通じた追加検証は、対照群処理グループと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループでＮＦ－κＢの発現が有意に減少したことが示された（前処理：ＩＲＩ ２４時間後、Ｐ＜０．０５；４８－ｈ、Ｐ＜０．００１及び後処理：ＩＲＩ ２４－／４８－ｈ後、Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。従って、全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＩＲ後の腎臓で腎臓ＮＦ－κＢ信号伝達を減少させることができる。
【0109】
実施例４．エキソ－ｓｒＩκＢは虚血後の腎臓の炎症を改善する。
全身性エキソソームｓｒＩκＢ処理が腎臓ＩＲＩ誘導された炎症を局所軽減させるかどうかを追加で調査するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を通じてＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、Ｉｌ－１０、Ｉｌ－１７α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ２、Ｉｆｎ－γ及びＴｎｆ－αを含む中枢炎症性媒介因子の遺伝子発現水準を決定した。ＩＲＩ前にエキソ－ＴＩκＢの９×１０９ｐｎを用いた処理は、ＩＲ損傷した腎臓でＥｘ－ナイーブ処理されたグループのものと比較し、Ｉｌ－１β、Ｉｌ－６、Ｔｎｆ－α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５及びＣｘｃ１２の発現水準を有意に抑制させた（図４Ａ）。多重サイトカイン分析は、また、相違する実験グループの血清を用いて行った。結果は、腎臓転写データより有意ではなかったが、対照群グループでのものと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループでＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ２を含む炎症性サイトカインの発現が減少する明白な傾向があった（図４Ｂ）。
全身性エキソソームｓｒＩκＢ処理が腎臓ＩＲＩ誘導された炎症を局所軽減させるかどうかを追加で調査するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を通じてＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、Ｉｌ－１０、Ｉｌ－１７α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ２、Ｉｆｎ－γ及びＴｎｆ－αを含む中枢炎症性媒介因子の遺伝子発現水準を決定した。ＩＲＩ前にエキソ－ＴＩκＢの９×１０９ｐｎを用いた処理は、ＩＲ損傷した腎臓でＥｘ－ナイーブ処理されたグループのものと比較し、Ｉｌ－１β、Ｉｌ－６、Ｔｎｆ－α、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５及びＣｘｃ１２の発現水準を有意に抑制させた（図４Ａ）。多重サイトカイン分析は、また、相違する実験グループの血清を用いて行った。結果は、腎臓転写データより有意ではなかったが、対照群グループでのものと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループでＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ２を含む炎症性サイトカインの発現が減少する明白な傾向があった（図４Ｂ）。
【0110】
さらに、付着分子の発現に対するエキソソームｓｒＩκＢの処理の効果は、処理グループの中で転写／翻訳細胞内付着分子１（ＩＣＡＭ－１）の水準を比較することにより評価した。ＱＲＴ－ＰＣＲ結果は、前／後処理のモデルの両方でエキソ－ｓｒＩκＢ処理グループでエキソ－ナイーブ処理より有意に低水準のＩｃａｍ－１発現を示した（図４Ｃ）。この結果は、ウェスタンブロッティング及びＩＨＣ染色を通じて翻訳水準で再現された（図４、Ｄ及びＥ）。従って、全身エキソ－ｓｒＩκＢ伝達は、ＩＲ誘導されたＡＫＩで炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン及び付着分子の発現を下向調節できる。
【0111】
実施例５．エキソ－ｓｒＩκＢは虚血後の腎臓でアポトーシスを軽減する。
プログラム細胞致死を調節する時にＮＦ－κＢの公知となった役割に基づいて、エキソ－ｓｒＩκＢが虚血後の腎臓でアポトーシスにいかに影響を及ぼしたかを調査した。腎臓ＩＲＩ手術は腎臓細胞で有意なアポトーシスを誘導し、これはウェスタンブロット分析で切断されたカスパーゼ－３及び切断されたポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）水準の急激な増加を示した。損傷の前／後にエキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達は、切断されたカスパーゼ－３及び切断されたＰＡＲＰの発現水準を実質的に下向調節でき、これはエキソ－ｓｒＩκＢが虚血後の腎臓でアポトーシスに対する保護効果を奏することを示唆する（図５Ａ）。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を用いて腎臓細胞損傷の程度を決定した。対照群と比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理された腎臓は前／後処理モデルにおいて有意に少ない数のＴＵＮＥＬ陽性細胞を示した（図５Ｂ）。
プログラム細胞致死を調節する時にＮＦ－κＢの公知となった役割に基づいて、エキソ－ｓｒＩκＢが虚血後の腎臓でアポトーシスにいかに影響を及ぼしたかを調査した。腎臓ＩＲＩ手術は腎臓細胞で有意なアポトーシスを誘導し、これはウェスタンブロット分析で切断されたカスパーゼ－３及び切断されたポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）水準の急激な増加を示した。損傷の前／後にエキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達は、切断されたカスパーゼ－３及び切断されたＰＡＲＰの発現水準を実質的に下向調節でき、これはエキソ－ｓｒＩκＢが虚血後の腎臓でアポトーシスに対する保護効果を奏することを示唆する（図５Ａ）。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を用いて腎臓細胞損傷の程度を決定した。対照群と比較し、エキソ－ｓｒＩκＢ処理された腎臓は前／後処理モデルにおいて有意に少ない数のＴＵＮＥＬ陽性細胞を示した（図５Ｂ）。
【0112】
実施例６．腎臓虚血再灌流損傷後のエキソソーム生体分布
腎臓ＩＲＩモデルにおいてエキソ－ｓｒＩκＢの生体分布は、細胞類型が虚血後の腎臓でエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果を調整することをより十分に理解するために調査した。マウスに、ＩＲＩ手術１時間前にフルオロクロム標識されたＬｙ６Ｇ及びＦ４／８０抗体を静脈内注射し、再灌流１時間後に９×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢを静脈内注射した。生体内イメージングは再灌流後１０分、５時間及び２４時間に行った（図６Ａ）。好中球を可視化するための抗Ｌｙ６Ｇ抗体（Ｆｌｕｏｒ ５５５）及びマクロファージを可視化するための抗Ｆ４／８０抗体（Ｆｌｕｏｒ ４８８）だけでなく、ＤｉＤ標識されたエキソソーム注射後の生体内イメージングはエキソ－ｓｒＩκＢ及びエキソ－ナイーブのいずれも虚血後の腎臓で好中球（Ｌｙ６Ｇ＋）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋）により吸収されるということを確認した（図６Ｂ）。本発明者らは、ＩＲＩ後の細尿管でＤｉＤ（緑色）信号の軽微な増加を観察し、細尿管細胞によるエキソソーム吸収可能性を高めたが、信号強度はＤｉＤ標識されたエキソソーム注射前のものと有意に相違しなかった（データは提示されない）。脾臓は同時に観察され、これは、外部実質領域の好中球及びマクロファージでエキソソームの吸収を示した（図６Ｃ）。内部実質領域は有意な吸収を示さなかった（データは提示されない）。
腎臓ＩＲＩモデルにおいてエキソ－ｓｒＩκＢの生体分布は、細胞類型が虚血後の腎臓でエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果を調整することをより十分に理解するために調査した。マウスに、ＩＲＩ手術１時間前にフルオロクロム標識されたＬｙ６Ｇ及びＦ４／８０抗体を静脈内注射し、再灌流１時間後に９×１０９ｐｎのエキソ－ｓｒＩκＢを静脈内注射した。生体内イメージングは再灌流後１０分、５時間及び２４時間に行った（図６Ａ）。好中球を可視化するための抗Ｌｙ６Ｇ抗体（Ｆｌｕｏｒ ５５５）及びマクロファージを可視化するための抗Ｆ４／８０抗体（Ｆｌｕｏｒ ４８８）だけでなく、ＤｉＤ標識されたエキソソーム注射後の生体内イメージングはエキソ－ｓｒＩκＢ及びエキソ－ナイーブのいずれも虚血後の腎臓で好中球（Ｌｙ６Ｇ＋）及びマクロファージ（Ｆ４／８０＋）により吸収されるということを確認した（図６Ｂ）。本発明者らは、ＩＲＩ後の細尿管でＤｉＤ（緑色）信号の軽微な増加を観察し、細尿管細胞によるエキソソーム吸収可能性を高めたが、信号強度はＤｉＤ標識されたエキソソーム注射前のものと有意に相違しなかった（データは提示されない）。脾臓は同時に観察され、これは、外部実質領域の好中球及びマクロファージでエキソソームの吸収を示した（図６Ｃ）。内部実質領域は有意な吸収を示さなかった（データは提示されない）。
【0113】
実施例７．エキソ－ｓｒＩκＢの全身伝達は腎臓ＩＲＩ後に腎臓免疫細胞母集団に影響を及ぼす
免疫細胞は、虚血性ＡＫＩの過程で重要な役割を提供することが公知となっており；従って、ＩＲＩ手術前にエキソソームｓｒＩκＢ処理を提供することが各免疫細胞類型の母集団に影響を及ぼすかを評価した。虚血性ＡＫＩの２４時間後、実験グループ間の機械的破壊、酵素分解及びパーコール密度勾配方法の複数の段階を通じて単離された腎臓細胞の総数に対する差異はなかったが、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループは、エキソ－Ｎｉａｖｅ処理されたグループのものより腎臓単核細胞（ＫＭＮＣ）の有意な低頻度を有した（Ｐ＜０．０５）（図７、Ａ及びＢ）。追加分析は、エキソ－ｓｒＩκＢ注射グループがエキソ－ナイーブ注射グループのものより総ＫＭＮＣ中の好中球（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ＋）（Ｐ＜０．０１）プロ／抗炎症性単核食細胞（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋／ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）（それぞれＰ＜０．０１／Ｐ＜０．０５）、及びＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）（Ｐ＜０．０５）の有意な低頻度を有することを示した（図７Ｃ）。ＩＲ損傷腎臓の免疫蛍光の結果は、また、エキソ－ｓｒＩκＢ注射腎臓で好中球及び単核食細胞頻度の減少を示した（図７Ｄ）。しかし、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、虚血性ＡＫＩ後の脾臓の総免疫細胞数または頻度に有意な影響を及ぼさなかった。エキソ－ｓｒＩκＢ及びエキソ－ナイーブ処理グループとの間でＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）を除いて、総免疫細胞（ＣＤ４５＋）、好中球（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ＋）、プロ／抗炎症単核食細胞（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋／ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）の総細胞数及び頻度の差はなかった。これは、虚血性ＡＫＩの前に全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理が腎臓免疫細胞の増殖／輸送に顕著な局所的影響を及ぼすが、脾臓免疫細胞には顕著な局所的影響を有さないことを確認する。
免疫細胞は、虚血性ＡＫＩの過程で重要な役割を提供することが公知となっており；従って、ＩＲＩ手術前にエキソソームｓｒＩκＢ処理を提供することが各免疫細胞類型の母集団に影響を及ぼすかを評価した。虚血性ＡＫＩの２４時間後、実験グループ間の機械的破壊、酵素分解及びパーコール密度勾配方法の複数の段階を通じて単離された腎臓細胞の総数に対する差異はなかったが、エキソ－ｓｒＩκＢ処理グループは、エキソ－Ｎｉａｖｅ処理されたグループのものより腎臓単核細胞（ＫＭＮＣ）の有意な低頻度を有した（Ｐ＜０．０５）（図７、Ａ及びＢ）。追加分析は、エキソ－ｓｒＩκＢ注射グループがエキソ－ナイーブ注射グループのものより総ＫＭＮＣ中の好中球（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ＋）（Ｐ＜０．０１）プロ／抗炎症性単核食細胞（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋／ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）（それぞれＰ＜０．０１／Ｐ＜０．０５）、及びＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）（Ｐ＜０．０５）の有意な低頻度を有することを示した（図７Ｃ）。ＩＲ損傷腎臓の免疫蛍光の結果は、また、エキソ－ｓｒＩκＢ注射腎臓で好中球及び単核食細胞頻度の減少を示した（図７Ｄ）。しかし、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は、虚血性ＡＫＩ後の脾臓の総免疫細胞数または頻度に有意な影響を及ぼさなかった。エキソ－ｓｒＩκＢ及びエキソ－ナイーブ処理グループとの間でＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋）を除いて、総免疫細胞（ＣＤ４５＋）、好中球（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ＋）、プロ／抗炎症単核食細胞（ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋／ＣＤ４５＋Ｆ４／８０＋）の総細胞数及び頻度の差はなかった。これは、虚血性ＡＫＩの前に全身エキソ－ｓｒＩκＢ処理が腎臓免疫細胞の増殖／輸送に顕著な局所的影響を及ぼすが、脾臓免疫細胞には顕著な局所的影響を有さないことを確認する。
【0114】
実施例８．エキソ－ｓｒＩκＢの静脈内伝達
腹腔内エキソソーム伝達において類似の保護効果が静脈内伝達で発見されるかどうかを検証するために、静脈内注射方式を用いて一部実験を繰り返した。改善された生化学的結果、その上、エキソ－ｓｒＩκＢの静脈内伝達によるＮＦ－κＢ信号伝達及びＩＣＡＭ－１発現の減少した水準は図８に示されたように再現された。従って、エキソ－ｓｒＩκＢ結果の静脈内伝達も虚血性ＡＫＩモデルで腹腔内伝達と比較して類似の生物学的効果をもたらす。
腹腔内エキソソーム伝達において類似の保護効果が静脈内伝達で発見されるかどうかを検証するために、静脈内注射方式を用いて一部実験を繰り返した。改善された生化学的結果、その上、エキソ－ｓｒＩκＢの静脈内伝達によるＮＦ－κＢ信号伝達及びＩＣＡＭ－１発現の減少した水準は図８に示されたように再現された。従って、エキソ－ｓｒＩκＢ結果の静脈内伝達も虚血性ＡＫＩモデルで腹腔内伝達と比較して類似の生物学的効果をもたらす。
【0115】
実施例９．ｓｒＩκＢローディングされたエキソソーム追加特性化及び分析
十分なエキソソームを生産するために、それぞれの細胞類型から培養培地を収集した。
十分なエキソソームを生産するために、それぞれの細胞類型から培養培地を収集した。
【0116】
ＨＵＶＥＣはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入して１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＣＯ，ＵＳＡ）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、内皮細胞成長補充剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。第３～第６継代培養間のＨＵＶＥＣを全ての実験に用いた。ヒト単核球（ＴＨＰ－１）をＡＴＣＣから購入し、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ Ｄａｅｇｕ Ｋｏｒｅａ）で培養した。
【0117】
タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）の組合わせを用いてエキソソームを単離した（図１３Ａ）。結合能力を超える不純物がＳＥＣカラムにローディングされる危険を減少させるために、サンプルを、ＴＦＦを通じて透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び濃縮させた。ＴＦＦ後、濃縮された培地を追加精製のためにＳＥＣカラムにローディングした。続いて、第２ＴＦＦを行ってエキソソームを濃縮させた。段階的精製を通じて単離された各類型のエキソソームはナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を通じて分析され、これによりエキソソームの大きさ及び濃度を特性化した（図１３Ｂ）。直径が３０～１２０ｎｍである粒子が全ての粒子の８０％以上を占め、平均サイズは１０１ｎｍで示され、これはエキソソーム特徴的大きさ範囲（３０～１２０ｎｍ）と一致する。また、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、エキソ－ナイーブ及びエキソ－ｓｒＩκＢから得られたＮＴＡ結果に対応する大きさを有する無損傷のカップ状の膜小胞（ｉｎｔａｃｔ ｃｕｐ－ｓｈａｐｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を示した（図９Ｂ）。本発明の製剤でエキソソームをさらに特性化するために、２つの一般的エキソソームマーカーを調査した。これらはウェスタンブロッティングを通じてテトラスパニンＣＤ６３及びＴＳＧ１０１であった。
【0118】
以前の研究で記載された通り、ウェスタンブロッティングを行った。下記タンパク質を標的化する抗体を用いた：ＩκＢα（ＣＳＴ４８１２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）， ｐ６５（ＣＳＴ６９５６Ｓ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， ＣＤ９（ＮＢＰ２－２２１８７；ＮＯＶＵＳＢＩＯ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ，ＵＳＡ）， ＣＤ６３（ＥＸＯＡＢ－ＣＤ６３Ａ－１；ＳＢＩ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）， ＴＳＧ１０１（ａｂ２２８０１３；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ），ＧＭ１３０（ａｂ５２６４９；Ａｂｃａｍ），ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－４７７２４；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ），Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（ａｂ１７９１；Ａｂｃａｍ），ｍＣｈｅｒｒｙ（ａｂ１２５０９６；Ａｂｃａｍ）及びＧＦＰ（ＣＳＴ２５５５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【0119】
ＣＤ６３及びＴＳＧ１０１の存在はサンプルで明確に観察される一方、骨脂由来汚染物質ＧＭ１３０は細胞溶解物のみで検出された（図９Ｃ）。エキソソーム製剤のこのような分析は、これらがエキソソームの特性を有することを示す。また、ｓｒＩκＢ安定した細胞株から単離されたエキソソームにｓｒＩκＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＲＹ２（１３０ｋＤａ）が強力にローディングされることを観察した。
【0120】
実施例１０．エキソ－ｓｒＩκＢは敗血症マウスで生存を改善させ、急性器官損傷を緩和させる
エキソ－ｓｒＩκＢの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射がエンドトキシン衝撃（ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ）から保護する効果があるかどうかを調査した。動物に致死量のＬＰＳ（Ｃ５７ＢＬ／６の場合、４０ｍｇ／ｋｇの体重、ＢＡＬＢ／ｃの場合、２０ｍｇ／ｋｇの体重）で単一ｉ．ｐ注射後、エキソ－ｓｒＩκＢを単一ｉ．ｐ．注射した（６時間間隔）。ＬＰＳ誘導された敗血症による死亡率が１００％である対照群Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢで処理されたマウスはＬＰＳ誘導死亡率に顕著に耐性を示し；マウスの大部分は敗血症から治癒（ｒｅｓｃｕｅ）され、生存が延長された（図１０Ａ、上部）。エキソ－ｓｒＩκＢ－媒介効果はＬＰＳ誘導された温度降下から適当な保護と関連があった（図１４Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いてＬＰＳ誘導された敗血症のマウスモデルを開発した。エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＬＰＳ誘導された敗血症の生存率を有意に改善させた（図１０Ａ、中間）。続けて、腹部敗血症の標準化したマウスモデルにおいてＣＬＰ誘導された敗血症モデルを用いて、生存においてエキソ－ｓｒＩκＢの役割を調査した。動物は７日のモニタリング期間生存し、これはエキソ－ｓｒＩκＢが敗血症死亡率に対して持続的保護を提供することを示す（図１０Ａ、下部）。エキソ－ｓｒＩκＢ処理が敗血症により誘導された炎症を緩和させるかどうかをさらに調査するために、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を使用して血清で主要炎症因子の濃度を決定した。ＬＰＳ誘導された敗血症を有するエキソ－ｓｒＩκＢ処理グループにおいて炎症誘発性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ－１β及びＩＬ－６及びケモカイン四塩化炭素（ＣＣＬ４）の発現水準が有意に減少することが観察された（図１０Ｂ、上部）。また、ＣＬＰグループにおいてＴＮＦ－α及びＣＣＬ４の血清水準が虚偽操作対照群マウスの血清水準より有意に高く観察されたが、ＣＬＰ及びエキソ－ｓｒＩκＢがいずれも処理されたマウスでは上昇しなかった（図１０Ｂ、下部）。このような結果はエキソ－ｓｒＩκＢがＬＰＳまたはＣＬＰにより誘導された炎症を緩和させ、急性炎症プロセスから敗血症マウスを保護することを示唆する。
エキソ－ｓｒＩκＢの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射がエンドトキシン衝撃（ｅｎｄｏｔｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ）から保護する効果があるかどうかを調査した。動物に致死量のＬＰＳ（Ｃ５７ＢＬ／６の場合、４０ｍｇ／ｋｇの体重、ＢＡＬＢ／ｃの場合、２０ｍｇ／ｋｇの体重）で単一ｉ．ｐ注射後、エキソ－ｓｒＩκＢを単一ｉ．ｐ．注射した（６時間間隔）。ＬＰＳ誘導された敗血症による死亡率が１００％である対照群Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢで処理されたマウスはＬＰＳ誘導死亡率に顕著に耐性を示し；マウスの大部分は敗血症から治癒（ｒｅｓｃｕｅ）され、生存が延長された（図１０Ａ、上部）。エキソ－ｓｒＩκＢ－媒介効果はＬＰＳ誘導された温度降下から適当な保護と関連があった（図１４Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いてＬＰＳ誘導された敗血症のマウスモデルを開発した。エキソ－ｓｒＩκＢ処理はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＬＰＳ誘導された敗血症の生存率を有意に改善させた（図１０Ａ、中間）。続けて、腹部敗血症の標準化したマウスモデルにおいてＣＬＰ誘導された敗血症モデルを用いて、生存においてエキソ－ｓｒＩκＢの役割を調査した。動物は７日のモニタリング期間生存し、これはエキソ－ｓｒＩκＢが敗血症死亡率に対して持続的保護を提供することを示す（図１０Ａ、下部）。エキソ－ｓｒＩκＢ処理が敗血症により誘導された炎症を緩和させるかどうかをさらに調査するために、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を使用して血清で主要炎症因子の濃度を決定した。ＬＰＳ誘導された敗血症を有するエキソ－ｓｒＩκＢ処理グループにおいて炎症誘発性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ－１β及びＩＬ－６及びケモカイン四塩化炭素（ＣＣＬ４）の発現水準が有意に減少することが観察された（図１０Ｂ、上部）。また、ＣＬＰグループにおいてＴＮＦ－α及びＣＣＬ４の血清水準が虚偽操作対照群マウスの血清水準より有意に高く観察されたが、ＣＬＰ及びエキソ－ｓｒＩκＢがいずれも処理されたマウスでは上昇しなかった（図１０Ｂ、下部）。このような結果はエキソ－ｓｒＩκＢがＬＰＳまたはＣＬＰにより誘導された炎症を緩和させ、急性炎症プロセスから敗血症マウスを保護することを示唆する。
【0121】
多数の研究は、急性腎損傷（ＡＫＩ）が敗血症の頻繁で深刻な合併症として、敗血症の５０％以上の事例で発生し、死亡率が非常に高いことを明らかにした。敗血症マウスモデルにおいてＣＬＰ誘導されたＡＫＩでエキソ－ｓｒＩκＢの役割を決定するために、腎臓組織学的検査を行った。偽手術を行ったグループと比較し、リン酸塩緩衝された食塩水（ＰＢＳ）で処理されたマウス及びエキソ－ナイーブマウスの細尿管細胞は、液胞化、刷子縁の喪失、及び管上皮細胞の核凝縮と関連して相当な損傷を示した（図１０Ｃ）。特に、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は管部位に対する損傷を顕著に減少させ、近位管を保存し、敗血症誘導された腎臓損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの治療の可能性を立証した。このような結果はＬＰＳ誘導されたＡＫＩの結果と一致する（図１４Ｂ）。組織学的腎臓損傷の重症度をさらに定量した結果、エキソ－ｓｒＩκＢ処理は両敗血症モデルで損傷点数を約５０％まで有意に減少させることが示された（図１０Ｄ）。エキソ－ｓｒＩκＢは、たとえ一部損傷した部位が発見されても、細尿管で退行性変化を改善させた。このようなデータは敗血症マウスで腎臓生理学的構造及び機能を改善するのにエキソ－ｓｒＩκＢの重大な重要性を示唆する。
【0122】
実施例１１．ＬＰＳ注射後のエキソソーム生体分布
ＬＰＳ注射された敗血症マウスモデルにおいてエキソソーム生体分布の変化を調査した。生体内生体分布は、注文製作された生体内ビデオレートレーザースキャニング共焦点顕微鏡システム（ｃｕｓｔｏｍ－ｍａｄｅ ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ ｖｉｄｅｏ－ｒａｔｅ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分析した。好中球（緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］及びＡｌｅｘａ ５５５）及びマクロファージ（ＧＦＰ）を可視化するために抗Ｌｙ６Ｇ抗体が既に注射されたＬｙｓＭｇｆｐ／＋トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスにｍＣＬＩＮＧ蛍光染料標識されたエキソソームを静脈内注射した。大部分のエキソソームが速やかに、即ち、静脈内エキソソーム注射後、数分間以内に好中球及びマクロファージにより吸収されることを観察した（図１１Ａ）。
ＬＰＳ注射された敗血症マウスモデルにおいてエキソソーム生体分布の変化を調査した。生体内生体分布は、注文製作された生体内ビデオレートレーザースキャニング共焦点顕微鏡システム（ｃｕｓｔｏｍ－ｍａｄｅ ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ ｖｉｄｅｏ－ｒａｔｅ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分析した。好中球（緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］及びＡｌｅｘａ ５５５）及びマクロファージ（ＧＦＰ）を可視化するために抗Ｌｙ６Ｇ抗体が既に注射されたＬｙｓＭｇｆｐ／＋トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスにｍＣＬＩＮＧ蛍光染料標識されたエキソソームを静脈内注射した。大部分のエキソソームが速やかに、即ち、静脈内エキソソーム注射後、数分間以内に好中球及びマクロファージにより吸収されることを観察した（図１１Ａ）。
【0123】
エキソソームは、主に肝臓の好中球に伝達され（図１１Ｂ）、ＬＰＳ誘導されたマウスの脾臓で、好中球及びマクロファージの動員増加及びエキソソーム摂取（ｕｐｔａｋｅ）増加が観察された（図１１Ｃ）。ｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソソームは、また、ＬＰＳ注射されたマウスの腎臓で好中球に伝達された（図１５Ａ）。このような観察は、敗血症マウスモデルにおいて治療用エキソソームが好中球及びマクロファージを標的に３０分以内に成功裏に伝達されたことを示唆する。
【0124】
実施例１２．エキソ－ｓｒＩκＢは敗血症連関の炎症を緩和させる
試験管内エキソ－ｓｒＩκＢの標的特異性及び効率を確認した。エキソ－ｓｒＩκＢはＮＦ－κＢルシフェラーゼリポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞においてＴＮＦ－α誘導されたＮＦ－κＢ活性化を有意に遮断したが、エキソ－ナイーブは遮断しなかった（図１２Ａ）。エキソ－ｓｒＩκＢの量を増加させることは容量依存的方式でＮＦ－κＢリポーター活性を減少させ、これはエキソソームから放出されたｓｒＩκＢがＮＦ－κＢ転写活性を防止することを示す（図１２Ｂ）。
試験管内エキソ－ｓｒＩκＢの標的特異性及び効率を確認した。エキソ－ｓｒＩκＢはＮＦ－κＢルシフェラーゼリポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞においてＴＮＦ－α誘導されたＮＦ－κＢ活性化を有意に遮断したが、エキソ－ナイーブは遮断しなかった（図１２Ａ）。エキソ－ｓｒＩκＢの量を増加させることは容量依存的方式でＮＦ－κＢリポーター活性を減少させ、これはエキソソームから放出されたｓｒＩκＢがＮＦ－κＢ転写活性を防止することを示す（図１２Ｂ）。
【0125】
全ての敗血症反応性細胞の中で、単核球／マクロファージは免疫反応を促進させるのに最も重要な役割をし、敗血症マウスにおいてこれら細胞の枯渇は死亡率を増加させる。ＴＨＰ－１細胞は細胞培養モデルで単核球として広範囲に用いられる。ＴＨＰ－１細胞がＬＰＳで刺激された時、エキソ－ナイーブと比較し、エキソ－ｓｒＩκＢによる処理はＮＦ－κＢ転写調節の下にある炎症性サイトカインＴＮＦ－α及び単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１の分泌を減少させた（図１２Ｃ）。また、エキソ－ｓｒＩκＢの効果を、ＮＦ－κＢの標的ＤＮＡ結合を妨害する、一般に用いられるＮＦ－κＢ抑制剤であるＪＳＨ－２３の効果と比較した。例示的データは、エキソ－ｓｒＩκＢ及びＪＳＨ－２３がＴＨＰ－１細胞でＬＰＳ誘導されたＮＦ－κＢ活性化及びサイトカイン生成の抑制と関連して匹敵する効果を奏することを示した（図１２Ｃ、レーン（ｌａｎｅ）４対レーン６）。
【0126】
敗血症は内皮に対する単核球付着を特徴とする。正常な条件で、内皮細胞は休止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）であり、単核球と相互作用しない。しかし、炎症環境で、活性化された内皮細胞は単核球に結合する細胞間細胞接着分子（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＩＣＡＭ）－１などの接着分子を発現する。接着分子の発現は敗血症の発生中に活性化することが広範囲に想定される。
【0127】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で細胞付着分子の発現に対するエキソ－ｓｒＩκＢの効果を研究するために、実施例は、まず、エキソ－ｓｒＩκＢｓが細胞に内在化するかどうかを調査した。ｍＣＬＩＮＧ標識されたエキソ－ｓｒＩκＢはＨＵＶＥＣで検出され、２４時間後に最大内在化が観察された（図１２Ｄ）。また、ＨＵＶＥＣでＩＣＡＭ－１発現がエキソ－ｓｒＩκＢ処理により有意に抑制されることを確認した（図１２Ｅ）。ＩＬ－８及びＭＣＰ－１は、また、血管内皮に対する単核球の移動及び付着を誘発し、これら細胞が周辺組織で血管外流出するように誘導した。ＩＬ－８及びＭＣＰ－１の発現は細菌及びウイルス感染による急性炎症中に、多様な組織において以前に観察され、重症敗血症と関連がある。エキソ－ｓｒＩκＢはＨＵＶＥＣでＮＦ－κＢの転写活性を抑制させることにより（図１６Ｂ）、ＬＰＳ誘導されたＩＬ－８及びＭＣＰ－１生産を抑制させたことが明らかになった（図１６Ａ）。このような結果は、エキソ－ｓｒＩκＢが敗血症でＮＦ－κＢ媒介された炎症反応を減少させることを確認する。
【0128】
実施例１３．ＬＰＳ誘導された敗血症において肺損傷に対するエキソ－ｓｒＩκＢの保護効果
動物は、致死量のＬＰＳ（３０ｍｇ／ｋｇの体重）で３０分間単一腹腔内注射、続いて、１０時間エキソ－ｓｒＩκＢ（１×１０１０）の単一静脈内注射の提供を受けた。肺組織を図１７に提示された通りＨ＆Ｅ染色で分析した。１０時間ＬＰＳを注射したグループは、好中球浸潤及び肺胞マクロファージの増殖、肺胞内及び肺胞外充血を示し、出血が進行された。肺胞内皮細胞の損傷、その上、歯槽骨壊死が観察される。エキソソーム投与は、鬱血が若干観察される場合にも、肺胞壁拡張、好中球浸潤及び肺胞マクロファージ増殖を軽減させた。
動物は、致死量のＬＰＳ（３０ｍｇ／ｋｇの体重）で３０分間単一腹腔内注射、続いて、１０時間エキソ－ｓｒＩκＢ（１×１０１０）の単一静脈内注射の提供を受けた。肺組織を図１７に提示された通りＨ＆Ｅ染色で分析した。１０時間ＬＰＳを注射したグループは、好中球浸潤及び肺胞マクロファージの増殖、肺胞内及び肺胞外充血を示し、出血が進行された。肺胞内皮細胞の損傷、その上、歯槽骨壊死が観察される。エキソソーム投与は、鬱血が若干観察される場合にも、肺胞壁拡張、好中球浸潤及び肺胞マクロファージ増殖を軽減させた。
【0129】
３０ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳを、１グループ当たり１０匹のマウスからなるＬＰＳ投与グループ（陰性対照群）及び３容量エキソ－ｓｒＩκＢ投与グループに投与した。投与３０分後、エキソ－ｓｒＩκＢをｉ．ｖで１回投与し、図１８に提示された通り７２時間生存率を評価した。対照群Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比較し、高容量のエキソ－ｓｒＩκＢで処理されたマウスはＬＰＳ誘導された死亡率に耐性があり、生存率が延長された。
【0130】
３０ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳを、１グループ当たり５匹のマウスからなるＬＰＳ投与グループ（陰性対照群）及び３容量エキソ－ｓｒＩκＢ投与グループに投与した。投与３０分後、エキソ－ｓｒＩκＢをｉ．ｖで１回投与し、各時点で剖検して血漿を得た。得られたＴＮＦ－αの血漿水準はＥＬＩＳＡ方法で測定した（図１９）。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αの発現水準はＬＰＳ誘導された敗血症を有するエキソ－ｓｒＩκＢ処理グループにおいて時間依存的方式で減少した。
【0131】
動物は、致死量のＬＰＳ（３０ｍｇ／ｋｇの体重）で３０分間単一腹腔内注射、続いて、エキソ－ｓｒＩκＢ（１×１０１０）の単一静脈内注射の提供を受けた。肝組織をＨ＆Ｅ染色で分析した（図２０）。ＬＰＳ投与１時間後、中央静脈周囲のＫｕｐｆｆｅｒ及び免疫細胞の浸潤が若干観察されたが、エキソソーム投与グループでは炎症細胞の浸潤が軽減された。ＬＰＳ投与１０時間後、Ｋｕｐｆｆｅｒ及び中央静脈周辺の免疫細胞の浸潤が有意に増加し、肝細胞間の結合組織損傷が観察された。エキソソーム投与グループでは浸潤が減少したが、肝細胞の壊死及び浮腫プロセスは次第に軽減することが予想された。従って、エキソソームの反復投与は保護効果を増強させることが期待される。
【0132】
ＡＫＩを治療するための実施形態
実施形態１．これを必要とする対象体において急性腎障害（ＡＫＩ）を治療するための方法であって、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を前記対象体に投与する、方法。
実施形態１．これを必要とする対象体において急性腎障害（ＡＫＩ）を治療するための方法であって、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を前記対象体に投与する、方法。
【0133】
実施形態２．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢの抑制剤がＮＦ－κＢ抑制タンパク質、この断片、及びこれらの混合物からなるグループから選択される、方法。
【0134】
実施形態３．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤がスーパーリプレッサー（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）、ＩκＢ－α、ＩκＢ－β、ＩκＢ－ε、ＢＣＬ－３、これらの突然変異体及びこれらの混合物からなるグループから選択される、方法。
【0135】
実施形態４．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤がスーパーリプレッサー（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）である、方法。
【0136】
実施形態５．前記実施形態のいずれか一つにおいて、組成物が経口、経皮、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または混合経路を通じて投与される、方法。
【0137】
実施形態６．前記実施形態のいずれか一つにおいて、対象体がヒトである、方法。
【0138】
実施形態７．前記実施形態のいずれか一つにおいて、前記方法が対象体に抗炎症剤を投与することをさらに含む、方法。
【0139】
実施形態８．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームが光特異的結合タンパク質をさらに含む、方法。
【0140】
実施形態９．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号１または配列番号と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【0141】
実施形態１０．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号１で表される、方法。
【0142】
実施形態１１．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号２で表される、方法。
【0143】
実施形態１２．前記実施形態のいずれか一つにおいて、前記光特異的結合タンパク質が第１光特異的結合タンパク質及び／又は第２光特異的結合タンパク質であり；第１光特異的結合タンパク質がエキソソーム特異的マーカーに接合されて融合タンパク質Ｉを形成し；第２光特異的結合タンパク質がＮＦ－κＢ抑制剤に接合されて融合タンパク質ＩＩを形成する、方法。
【0144】
実施形態１３．前記実施形態１２において、融合タンパク質Ｉ及び融合タンパク質ＩＩが第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質を通じて可逆的に結合する、方法。
【0145】
実施形態１４．前記実施形態１２または１３において、第１光特異的結合タンパク質がエキソソームの内側に向かう方向に位置するようにエキソソーム特異的マーカーに接合されている、方法。
【0146】
実施形態１５．前記実施形態１２～１４のいずれか一つにおいて、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質がＣＩＢ、ＣＩＢＮ、ＰｈｙＢ、ＰＩＦ、ＦＫＦ１、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＣＲＹ及びＰＨＲからなるグループから選択される、方法。
【0147】
実施形態１６．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＣＩＢまたはＣＩＢＮであり、第２光特異的結合タンパク質がＣＲＹまたはＰＨＲである、方法。
【0148】
実施形態１７．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＣＲＹまたはＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質がＣＩＢまたはＣＩＢＮである、方法。
【0149】
実施形態１８．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＰｈｙＢであり、第２光特異的結合タンパク質がＰＩＦである、方法。
【0150】
実施形態１９．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＰＩＦであり、第２光特異的結合タンパク質がＰｈｙＢである、方法。
【0151】
実施形態２０．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＧＩＧＡＮＴＥＡであり、第２光特異的結合タンパク質がＦＫＦ１である、方法。
【0152】
実施形態２１．前記実施形態１５において、第１光特異的結合タンパク質がＦＫＦ１であり、第２光特異的結合タンパク質がＧＩＧＡＮＴＥＡである、方法。
【0153】
実施形態２２．前記実施形態１２～２１において、エキソソーム特異的マーカーがＣＤ９、ＣＤ６３ ＣＤ８１及びＣＤＳ２からなるグループから選択される、方法。
【0154】
実施形態２３．前記実施形態のいずれか一つにおいて、エキソソームが約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する、方法。
【0155】
実施形態２４．前記実施形態のいずれか一つにおいて、エキソソームが約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する、方法。
【0156】
実施形態２５．前記実施形態のいずれか一つにおいて、組成物が生理学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である、方法。
【0157】
実施形態２６．ＡＫＩを治療するための実施形態１～１６に記載されたＮＦ－κＢ抑制剤をさらに含むエキソソームを含む組成物。
【0158】
実施形態２７．ＡＫＩを治療するための実施形態１～１６に記載されたＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の用途。
【0159】
他の疾患を治療するための実施形態
実施形態１．これを必要とする対象体において敗血症により誘発された疾患を治療する方法であって、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を前記対象体に投与することを含む、方法。
実施形態１．これを必要とする対象体において敗血症により誘発された疾患を治療する方法であって、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の有効量を前記対象体に投与することを含む、方法。
【0160】
実施形態２．前記実施形態のいずれか一つにおいて、疾患が肺炎、サイトカインストーム症候群、呼吸困難症候群、及び臓器不全からなるグループから選択される、方法。一部の実施形態において、疾患は肺炎である。一部の実施形態において、疾患はサイトカインストーム症候群である。一部の実施形態において、疾患は呼吸困難症候群である。一部の実施形態において、疾患は臓器不全である。
【0161】
実施形態３．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤がＮＦ－κＢ抑制タンパク質、この断片、及びこれらの混合物からなるグループから選択される、方法。
【0162】
実施形態４．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤がスーパーリプレッサー（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）、ＩκＢ－α、ＩκＢ－β、ＩκＢ－ε、ＢＣＬ－３、これらの突然変異体及びこれらの混合物からなるグループから選択される、方法。
【0163】
実施形態５．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤がスーパーリプレッサー（ＳＲ）－ＩκＢ（ｓｒＩκＢ）である、方法。
【0164】
実施形態６．前記実施形態のいずれか一つにおいて、組成物が経口、経皮、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または混合経路を通じて投与される、方法。
【0165】
実施形態７．前記実施形態のいずれか一つにおいて、対象体がヒトである、方法。
【0166】
実施形態８．前記実施形態のいずれか一つにおいて、前記方法が対象体に抗炎症剤を投与することをさらに含む、方法。
【0167】
実施形態９．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームが光特異的結合タンパク質をさらに含む、方法。
【0168】
実施形態１０．前記実施形態のいずれか一つにおいて、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号１または配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【0169】
実施形態１１．前記実施形態１０において、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号１で表される、方法。
【0170】
実施形態１２．前記実施形態１０において、ＮＦ－κＢ抑制剤が配列番号２で表される方法。
【0171】
実施形態１３．前記実施形態のいずれか一つにおいて、前記光特異的結合タンパク質が第１光特異的結合タンパク質及び／又は第２光特異的結合タンパク質であり；第１光特異的結合タンパク質がエキソソーム特異的マーカーに接合されて融合タンパク質Ｉを形成し；第２光特異的結合タンパク質がＮＦ－κＢ抑制剤に接合されて融合タンパク質ＩＩを形成する、方法。
【0172】
実施形態１４．前記実施形態１３において、融合タンパク質Ｉ及び融合タンパク質ＩＩが第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質を通じて可逆的に結合する方法。
【0173】
実施形態１５．前記実施形態１３または１４において、第１光特異的結合タンパク質がエキソソームの内側に向かう方向に位置するようにエキソソーム特異的マーカーに接合されている方法。
【0174】
実施形態１６．前記実施形態１３～１５のいずれか一つにおいて、第１光特異的結合タンパク質及び第２光特異的結合タンパク質がＣＩＢ、ＣＩＢＮ、ＰｈｙＢ、ＰＩＦ、ＦＫＦ１、ＧＩＧＡＮＴＥＡ、ＣＲＹ及びＰＨＲからなるグループから選択される、方法。
【0175】
実施形態１７．前記実施形態１６において、第１光特異的結合タンパク質がＣＩＢまたはＣＩＢＮであり、第２光特異的結合タンパク質がＣＲＹまたはＰＨＲである、方法。
【0176】
実施形態１８．前記実施形態のいずれか一つにおいて、第１光特異的結合タンパク質がＣＲＹまたはＰＨＲであり、第２光特異的結合タンパク質がＣＩＢまたはＣＩＢＮである、方法。
【0177】
実施形態１９．前記実施形態１６において、第１光特異的結合タンパク質がＰｈｙＢであり、第２光特異的結合タンパク質がＰＩＦである、方法。
【0178】
実施形態２０．前記実施形態１６において、第１光特異的結合タンパク質がＰＩＦであり、第２光特異的結合タンパク質がＰｈｙＢである、方法。
【0179】
実施形態２１．前記実施形態１６において、第１光特異的結合タンパク質がＧＩＧＡＮＴＥＡであり、第２光特異的結合タンパク質がＦＫＦ１である、方法。
【0180】
実施形態２２．前記実施形態１６において、第１光特異的結合タンパク質がＦＫＦ１であり、第２光特異的結合タンパク質がＧＩＧＡＮＴＥＡである、方法。
【0181】
実施形態２３．前記実施形態１３～２２において、エキソソーム特異的マーカーがＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ８２からなるグループから選択される、方法。
【0182】
実施形態２４．前記実施形態のいずれか一つにおいて、エキソソームが約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する方法。
【0183】
実施形態２５．前記実施形態のいずれか一つにおいて、エキソソームが約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する、方法。
【0184】
実施形態２６．前記実施形態のいずれか一つにおいて、組成物が生理学的に許容される担体をさらに含む薬剤学的組成物である、方法。
【0185】
実施形態２７．敗血症により誘発された疾患を治療するための実施形態１～１６に記載されたＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物。
【0186】
実施形態２８．敗血症により誘発された疾患を治療するための実施形態１～１６に記載されたＮＦ－κＢ抑制剤を含むエキソソームを含む組成物の用途。
【0187】
本開示内容は、多様な特定材料、過程及び実施例を参照して本願で記載及び説明されたが、本開示内容は、その目的のために選択された材料及び過程の特定組合わせに限定されないものと理解される。このような詳細の多数の変形が当業者により理解されるように暗示される。本明細書及び実施例は単に例示としてのみ考慮されることが意図され、本開示内容の真正な範囲及び精神は下記特許請求の範囲により提示される。本願で言及された全ての参考文献、特許及び特許出願はその全体が参照により本願に導入される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A-B】
【図4C-E】
【図5】
【図6A】
【図6B-C】
【図7A-C】
【図7D-F】
【図8A-F】
【図8G-H】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】