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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-04
(45)【発行日】2024-06-12
(54)【発明の名称】皮脂ＲＮＡ情報のデータ均質化方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240605BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240605BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240605BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240605BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6851 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022041811
(22)【出願日】2022-03-16
(65)【公開番号】P2023136284
(43)【公開日】2023-09-29
【審査請求日】2023-06-26
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】長森 夏海
(72)【発明者】
【氏名】井上 高良
(72)【発明者】
【氏名】上原 裕也
(72)【発明者】
【氏名】大矢 直樹
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５２３５４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２３３５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Genevieve BART et al.，Characterization of nucleic acids from extracellular vesicle-enriched human sweat，BMC Genomics，2021年，Vol. 22，Article number 425，DOI: 10.1186/s12864-021-07733-9
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／６８－ １／６８９７
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の被験者から採取された皮膚表上脂質を生体試料とし、そこから得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法であって、各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び
該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、
を含む方法。
【請求項2】
前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号２の塩基配列からなるプライマー及び配列番号３の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、又は配列番号６の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
前記核酸増幅反応をＲＴ－ＰＣＲ法により行う、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
前記核酸増幅反応を１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により行う、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記ヒト由来ＲＮＡ量の定量域が１００ａｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
前記解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を、１０ｆｇ／μＬ～５０ｐｇ／μＬの濃度範囲に揃える、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト由来の皮膚表上脂質から得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。核酸を用いた解析は、網羅的な解析方法が確立されており一度の解析で豊富な情報を得られる、及び一塩基多型やＲＮＡ機能等に関する多くの研究報告に基づいて解析結果の機能的な紐付けが容易であるといった利点を有する。生体由来の核酸は、血液等の体液、分泌物、組織等から抽出することができるが、最近、皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）に含まれるＲＮＡを生体の解析用の試料として用いること、ＳＳＬから表皮、汗腺、毛包及び皮脂腺のマーカー遺伝子が検出できることが報告されている（特許文献１）。
【0003】
細胞中に発現しているＲＮＡ配列を直接定量するＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）解析は、シグナル強度比を使うマイクロアレイでは定量が難しかった低発現遺伝子の検出を可能とし、高精度な発現プロファイルを取得できることから現在注目されている解析法である。遺伝子発現解析においては、試料中の特定のＲＮＡの濃度及び／又は相対的もしくは絶対的な量が決定され、特定のＲＮＡが定量化（定量）されるが、この場合には、精度が高く、２つ以上の個体に由来するＲＮＡ含有量の異なる試料におけるＲＮＡ発現データを良好に比較できる方法が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開公報第２０１８／００８３１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、ヒトＳＳＬから得られるＲＮＡ発現情報について解析する場合において、解析精度を向上するためのデータ均質化方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、ヒトＳＳＬに含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的としたＲＴ－ＰＣＲにより得られた増幅産物の量を指標とすることで、皮膚常在菌由来の多量のＲＮＡが混在するために従来直接定量が困難であったＳＳＬ中の微量なヒト由来ＲＮＡ量を間接的に定量できること、また、斯くして定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づき、所定量のヒト由来ＲＮＡを用いることで、ＳＳＬから得られるＲＮＡ発現情報を精度よく解析できることを見出した。
【0007】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
複数の被験者から採取された皮膚表上脂質を生体試料とし、そこから得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法であって、
該各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び
該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、
を含む方法。
複数の被験者から採取された皮膚表上脂質を生体試料とし、そこから得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法であって、
該各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び
該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、
を含む方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、複数のヒトＳＳＬ試料から得られるＲＮＡ発現情報を解析する場合に、ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量のばらつきに起因する試料依存的なＲＮＡ発現データのばらつきを低減することが可能となり、解析精度を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】（Ａ）ＳＳＬ試料間で、ヒトＲＮＡ含有液量のみ揃えた場合（対照）のシーケンスデータのヒートマップ、（Ｂ）ＳＳＬ試料間で、ヒトＲＮＡ含有液量と該液中のヒトＲＮＡ濃度を揃えた場合（濃度統一）のシーケンスデータのヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0011】
本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。
【0012】
本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、角層、表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。
【0013】
本明細書において、「ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子」とは、ヒトのリボソームの４０Ｓサブユニットの構成成分である１８Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子である。好ましくは、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子である。以下、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を単に１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と称することがある。
【0014】
本明細書において、「データの均質化」とは、ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量のばらつきに起因する試料依存的なＲＮＡ発現データのばらつきを低減又は抑制することをいう。
【0015】
一態様において、本発明は、複数の被験者から採取された皮膚表上脂質を生体試料とし、そこから得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法を提供する。本発明の方法は、該各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、を含む。
【0016】
本発明の方法における被験者は、ヒトであり、皮膚上にＳＳＬを有する。例えば、該被験者は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒトであり得る。あるいは、該被験者は、皮膚における遺伝子発現解析、又は該遺伝子発現解析を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の現在さらには将来の生理状態の検出を必要とするか又は希望するヒトであり得る。
【0017】
被験者から採取された皮膚表上脂質（ＳＳＬ）は、該被験者の皮膚細胞で発現したＲＮＡを含み、好ましくは該被験者の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺、及び真皮のいずれかで発現したＲＮＡを含み、より好ましくは該被験者の表皮、皮脂腺、毛包、及び汗腺のいずれかで発現したＲＮＡを含む（特許文献１参照）。したがって、本発明の方法において、ＳＳＬに含まれるＲＮＡは、好ましくは被験者の表皮、皮脂腺、毛包、汗腺及び真皮から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、より好ましくは表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも１部位由来のＲＮＡであり、さらに好ましくは、表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも２部位由来のＲＮＡであり、よりさらに好ましくは、表皮、皮脂腺、毛包及び汗腺から選択される少なくとも３部位由来のＲＮＡである。
【0018】
本発明の方法において、ＳＳＬに含まれるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等）、ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などを含み得る。本発明の方法におけるＳＳＬには、ｒＲＮＡを必須とし、それ以外の上記に挙げたＲＮＡの１種又は２種以上が含まれる。
【0019】
被験者の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材が水溶性の高い溶媒や水分を含んでいると、ＳＳＬの吸着が阻害されるため好ましくない。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、特に限定されず、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。
【0020】
被験者から採取されたＳＳＬは、直ちに後述のＲＮＡ抽出工程に用いられてもよく、又は、一定期間保存されてもよい。採取されたＳＳＬは、含有するＲＮＡの分解を極力抑えるために、採取後できるだけ速やかに低温条件で保存することが好ましい。本発明における該ＲＮＡ含有ＳＳＬの保存の温度条件は、０℃以下であればよく、好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、より好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±２０℃～－４０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－４０±１０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃である。該ＲＮＡ含有ＳＳＬの該低温条件での保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２ヶ月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。
【0021】
本発明の方法においては、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを鋳型として、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とした核酸増幅反応が行われる。好ましくは、ＳＳＬから抽出したＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が増幅される。
【0022】
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、生体試料からのＲＮＡの抽出又は精製に通常使用される方法、例えば、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）等のカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出等を用いることができる。
【0023】
逆転写には、ランダムプライマーを用いてもよいが、逆転写反応と続く遺伝子の増幅反応を１つのチューブ内で連続的に行うことができる観点から、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的としたプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）等が好ましく用いられる。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４１～５０℃、より好ましくは４２．５～４９℃、さらに好ましくは４２～４８℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは３０分以上、より好ましくは６０分以上、また、好ましくは１２０分以下に調整するのが好ましい。
該逆転写における伸長反応は、温度を好ましくは４１～５０℃、より好ましくは４２．５～４９℃、さらに好ましくは４２～４８℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは３０分以上、より好ましくは６０分以上、また、好ましくは１２０分以下に調整するのが好ましい。
【0024】
逆転写で得られたｃＤＮＡを鋳型とした１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅は、当該分野で通常用いられるＰＣＲの手順に従って実施することができる。ＰＣＲの手法としては、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ｑＰＣＲ）ともいう）、デジタルＰＣＲ等が挙げられる。
増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。
本発明においては、ＰＣＲの手法として、ＰＣＲの増幅産物量をリアルタイムでモニターし解析するリアルタイムＰＣＲを用いるのが、迅速性、簡便性及び定量性の点から好ましい。リアルタイムＰＣＲにおける増幅産物の検出法としては、当該分野で通常用いられる方法、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等が挙げられる。
増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。
本発明においては、ＰＣＲの手法として、ＰＣＲの増幅産物量をリアルタイムでモニターし解析するリアルタイムＰＣＲを用いるのが、迅速性、簡便性及び定量性の点から好ましい。リアルタイムＰＣＲにおける増幅産物の検出法としては、当該分野で通常用いられる方法、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等が挙げられる。
【0025】
インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに入り込むことで蛍光を発する物質（インターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） ＧｒｅｅｎＩ等）をＰＣＲ反応系に共存させ、増幅産物の生成に伴って増加する蛍光を検出することで増幅産物量をモニターする方法である。
【0026】
ＴａｑＭａｎプローブ法は、５’末端を蛍光物質（ＦＡＭ等）で、３’末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ等）で修飾した標的配列特異的なオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に共存させる方法である。該方法では、ＴａｑＭａｎプローブがＰＣＲ反応のアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、この状態では、プローブ上にクエンチャー物質が存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。次いで、伸長反応ステップのときに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光物質がプローブから遊離し、クエンチャー物質による抑制が解除されて蛍光を発する。該蛍光を検出することで増幅産物量をモニターすることができる。
【0027】
ＰＣＲの条件は、特に限定されず、ＰＣＲ毎に最適条件を定めればよいが、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は３～６０秒間である。
２）アニーリング：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
３）ＤＮＡ伸長反応：温度は、通常６５℃以上、好ましくは６８℃以上であり、通常７４℃以下、好ましくは７２℃以下である。また、通常６５～７４℃程度、好ましくは６８～７２℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能であり、この場合のＰＣＲ条件としては、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は３～６０秒間である。
２）アニーリング及びＤＮＡ伸長反応：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
上記１）～２）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は３～６０秒間である。
２）アニーリング：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
３）ＤＮＡ伸長反応：温度は、通常６５℃以上、好ましくは６８℃以上であり、通常７４℃以下、好ましくは７２℃以下である。また、通常６５～７４℃程度、好ましくは６８～７２℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能であり、この場合のＰＣＲ条件としては、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：温度は好ましくは９４～９９℃で、時間は３～６０秒間である。
２）アニーリング及びＤＮＡ伸長反応：温度は、通常５０℃以上、好ましくは５２℃以上、より好ましくは５５℃以上であり、通常６５℃以下、好ましくは６３℃以下、より好ましくは６０℃以下である。また、通常５０～６５℃、好ましくは５２～６３℃、より好ましくは５５～６０℃である。時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上であり、通常２分以下、好ましくは１分以下である。また、通常５秒～２分、好ましくは１０秒～１分である。
上記１）～２）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
【0028】
上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラー又はサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いて行うことができる。
【0029】
ＰＣＲの増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５塩基付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０～４０ｂｐが下限となり、５０ｂｐ以上が好ましく、９０ｂｐ以上がより好ましい。また、ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、３０～１０００ｂｐが好ましく、５０～７００ｂｐがより好ましく、９０～５００ｂｐがさらに好ましい。
【0030】
上記の測定に用いられるプライマー又はプローブ、すなわち、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に認識し増幅するためのプライマー、又は該１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出するためのプローブがこれに該当するが、これらは、該１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を構成する塩基配列に基づいて設計することができる。ここで「特異的に認識する」とは、例えばＲＴ－ＰＣＲ法において、実質的に１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のみが増幅される如く、該検出物又は生成物が該遺伝子又はそれに由来する核酸であると判断できることを意味する。
具体的には、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
一例において、斯かるプライマーは、配列番号２～７のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーであり得る。配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することが好ましく、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することがより好ましい。
別の一例において、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅は、配列番号１に示される配列に含まれる部分配列であって、好ましく配列番号８～１０のいずれかに示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅であることが好ましく、配列番号９に示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅であることがより好ましい。
具体的には、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ又はその相補鎖に相補的な一定数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、当該一定数の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
斯かるオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いる場合には、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができればよく、通常、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下の鎖長を有するものが挙げられる。また、プローブとして用いる場合には、特異的なハイブリダイゼーションができればよく、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を構成する塩基配列からなるＤＮＡ（又はその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、かつ例えば１００塩基以下、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下の鎖長のものが用いられる。
なお、ここで、「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、通常標識したものが用いられる。
一例において、斯かるプライマーは、配列番号２～７のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーであり得る。配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することが好ましく、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いて１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することがより好ましい。
別の一例において、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅は、配列番号１に示される配列に含まれる部分配列であって、好ましく配列番号８～１０のいずれかに示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅であることが好ましく、配列番号９に示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅であることがより好ましい。
【0031】
本発明の方法において、逆転写によるｃＤＮＡ合成（ＲＴ）及びＰＣＲは、１ステップで行ってもよく、２ステップで行ってもよい。このうち、単一チューブ内でＲＴ及びＰＣＲの一連の反応を連続的に行うことができ、簡便性に優れ、ＲＴとＰＣＲの操作間のコンタミネーションを防止することができる１ステップＲＴ－ＰＣＲが好ましい。１ステップＲＴ－ＰＣＲには、市販のキットを使用することができ、該キットとしては、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）等が挙げられる。
【0032】
本発明の方法においては、ＳＳＬに含まれるＲＮＡを鋳型とし、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として、ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量する。ここで、ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量とは、ＳＳＬ中のヒト由来ＲＮＡの濃度、又はＳＳＬ中のヒト由来ＲＮＡの相対的若しくは絶対的な含有量をいう。ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量は、例えば、当該分野で通常用いられる絶対定量法に従って算出することができる。
絶対定量法では、ヒト由来ＲＮＡの濃度が既知のスタンダードサンプルから調製した希釈系列を鋳型とし、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、Ｃｔ値を求める。ここで、Ｃｔ値とは、ＰＣＲの増幅産物量が一定量に達するときのサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）を意味する。ＰＣＲでは、理論的に１サイクルごとに増幅産物が２倍ずつ増えるため、スタンダードサンプルのヒト由来ＲＮＡ濃度と決定したＣｔ値をプロットすると、両者は直線で表される関係となり、これを検量線として用いることができる。次いで、ＳＳＬサンプルについても、同条件下で１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、Ｃｔ値を求める。このＣｔ値と検量線から、ＳＳＬサンプルに含まれるヒト由来ＲＮＡの濃度を算出することができる。また、サンプルのヒト由来ＲＮＡ濃度にサンプルの体積を乗算することで、該サンプルのヒト由来ＲＮＡ含有量を算出することができる。該スタンダードサンプルには、商業的に入手可能なヒト由来細胞の濃度既知のトータルＲＮＡ溶液を用いればよく、斯かるヒト由来細胞としては、例えば、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨｅＬａ）などが挙げられ、これらヒト由来細胞のトータルＲＮＡ溶液が市販されている。該スタンダードサンプルの希釈系列の濃度範囲は、１００ａｇ／μＬ以上が好ましく、１ｆｇ／μＬ以上がより好ましく、一方、１００ｎｇ／μＬ以下が好ましく、１０ｎｇ／μＬ以下がより好ましい。また、該濃度範囲は、１００ａｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬが好ましく、１ｆｇ／μＬ～１０ｎｇ／μＬがより好ましい。該濃度範囲の中で、３～１０段階程度の希釈系列を適宜調製すればよい。
絶対定量法では、ヒト由来ＲＮＡの濃度が既知のスタンダードサンプルから調製した希釈系列を鋳型とし、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、Ｃｔ値を求める。ここで、Ｃｔ値とは、ＰＣＲの増幅産物量が一定量に達するときのサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）を意味する。ＰＣＲでは、理論的に１サイクルごとに増幅産物が２倍ずつ増えるため、スタンダードサンプルのヒト由来ＲＮＡ濃度と決定したＣｔ値をプロットすると、両者は直線で表される関係となり、これを検量線として用いることができる。次いで、ＳＳＬサンプルについても、同条件下で１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、Ｃｔ値を求める。このＣｔ値と検量線から、ＳＳＬサンプルに含まれるヒト由来ＲＮＡの濃度を算出することができる。また、サンプルのヒト由来ＲＮＡ濃度にサンプルの体積を乗算することで、該サンプルのヒト由来ＲＮＡ含有量を算出することができる。該スタンダードサンプルには、商業的に入手可能なヒト由来細胞の濃度既知のトータルＲＮＡ溶液を用いればよく、斯かるヒト由来細胞としては、例えば、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）、ヒト子宮頸癌由来細胞（ＨｅＬａ）などが挙げられ、これらヒト由来細胞のトータルＲＮＡ溶液が市販されている。該スタンダードサンプルの希釈系列の濃度範囲は、１００ａｇ／μＬ以上が好ましく、１ｆｇ／μＬ以上がより好ましく、一方、１００ｎｇ／μＬ以下が好ましく、１０ｎｇ／μＬ以下がより好ましい。また、該濃度範囲は、１００ａｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬが好ましく、１ｆｇ／μＬ～１０ｎｇ／μＬがより好ましい。該濃度範囲の中で、３～１０段階程度の希釈系列を適宜調製すればよい。
【0033】
本発明の方法においては、斯くして定量された複数の被検者から採取されたＳＳＬ中のヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、ＲＮＡ発現情報の解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を、該被験者間で揃えるために所定量に調整する。ここで、所定量に調整するとは、解析に供するヒト由来ＲＮＡ溶液の濃度を予め設定された濃度範囲に調節することをいい、具体的は、１０ｆｇ／μＬ～５０ｐｇ／μＬが好ましく、５０ｆｇ／μＬ～２０ｐｇ／μＬがより好ましく、０．１ｐｇ／μＬ～１０ｐｇ／μＬがさらに好ましい。
【0034】
ＳＳＬから得られるＲＮＡ発現情報の解析手法は特に限定されないが、例えば、解析に供されたＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物を測定することにより取得することができる。発現レベルを測定する手段としては、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ等が挙げられ、好ましくはＲＮＡ－Ｓｅｑである。ＲＮＡの発現量は、マイクロアレイ解析を用いる場合にはシグナル強度比によって定量され、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析ではゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数（リードカウント値）により定量される。
【0035】
本発明の方法によれば、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の発現量を指標としてＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量を間接的に定量でき、所定量のヒト由来ＲＮＡを用いることで、ＳＳＬに含まれるヒト由来ＲＮＡ量のばらつきに起因する試料依存的なＲＮＡ発現データのばらつきを低減してデータを均質化し、ＳＳＬから得られるＲＮＡ発現情報を精度よく解析できる。例えば、複数のＳＳＬについてＲＮＡ発現情報をＲＮＡ－ｓｅｑにより解析する場合、シーケンスに用いるｃＤＮＡライブラリー濃度、シーケンスデータの遺伝子検出率、及びマッピングされたリード数のサンプル間のばらつき、並びにシーケンスデータ分布のばらつきを低減してデータを均質化でき、サンプル間の相関係数の向上や解析対象遺伝子数の増加が可能となる。
【0036】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0037】
〔１〕複数の被験者から採取された皮膚表上脂質を生体試料とし、そこから得られるＲＮＡ発現情報について解析を行うためのデータ均質化方法であって、
該各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び
該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、
を含む方法。
〔２〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号２の塩基配列からなるプライマー及び配列番号３の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、又は配列番号６の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応は、配列番号８～１０のいずれかに示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅反応である、〔１〕記載の方法。
〔５〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応は、配列番号９に示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅反応である、〔１〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕前記核酸増幅反応を好ましくはＲＴ－ＰＣＲ法、より好ましくはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行う、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記核酸増幅反応を１ステップＲＴ－ＰＣＲ法、より好ましくはリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により行う、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記ヒト由来ＲＮＡ量の定量域が好ましくは１００ａｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬであり、より好ましくは１ｆｇ／μＬ～１０ｎｇ／μＬである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を、好ましくは１０ｆｇ／μＬ～５０ｐｇ／μＬ、より好ましくは５０ｆｇ／μＬ～２０ｐｇ／μＬ、さらに好ましくは０．１ｐｇ／μＬ～１０ｐｇ／μＬの濃度範囲に揃える、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕ヒト由来ＲＮＡ量が既知の標準試料を鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量に基づいて検量線を作成することをさらに含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記生体試料について得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量と前記検量線から該生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量する、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記解析をＲＮＡ－Ｓｅｑにより行う、〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
該各生体試料に含まれるＲＮＡを鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量を指標として該各生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量すること、及び
該定量されたヒト由来ＲＮＡ量に基づいて、該解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を該各生体試料間で揃えること、
を含む方法。
〔２〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号２の塩基配列からなるプライマー及び配列番号３の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペア、又は配列番号６の塩基配列からなるプライマー及び配列番号７の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応に、配列番号４の塩基配列からなるプライマー及び配列番号５の塩基配列からなるプライマーからなるプライマーペアを用いる、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応は、配列番号８～１０のいずれかに示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅反応である、〔１〕記載の方法。
〔５〕前記ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする核酸増幅反応は、配列番号９に示される１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列の増幅反応である、〔１〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕前記核酸増幅反応を好ましくはＲＴ－ＰＣＲ法、より好ましくはリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行う、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記核酸増幅反応を１ステップＲＴ－ＰＣＲ法、より好ましくはリアルタイム１ステップＲＴ－ＰＣＲ法により行う、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記ヒト由来ＲＮＡ量の定量域が好ましくは１００ａｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬであり、より好ましくは１ｆｇ／μＬ～１０ｎｇ／μＬである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記解析に供するヒト由来ＲＮＡ量を、好ましくは１０ｆｇ／μＬ～５０ｐｇ／μＬ、より好ましくは５０ｆｇ／μＬ～２０ｐｇ／μＬ、さらに好ましくは０．１ｐｇ／μＬ～１０ｐｇ／μＬの濃度範囲に揃える、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕ヒト由来ＲＮＡ量が既知の標準試料を鋳型とし、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的として核酸増幅反応を行い、得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量に基づいて検量線を作成することをさらに含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記生体試料について得られた該ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物の量と前記検量線から該生体試料に含まれるヒト由来ＲＮＡ量を定量する、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記解析をＲＮＡ－Ｓｅｑにより行う、〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【0038】
以下、試験例、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0039】
試験例１ ＳＳＬの採取、ＲＮＡ抽出、及び網羅的遺伝子発現解析
１）被験者
健常女性１８名（２０～６０歳代）を被験者とした。
１）被験者
健常女性１８名（２０～６０歳代）を被験者とした。
【0040】
２）ＳＳＬの採取
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被検者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被検者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（乾熱処理済み）の２０ｍＬガラスバイアル瓶、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上に静置し、その後－８０℃にて保管した。
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被検者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被検者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（乾熱処理済み）の２０ｍＬガラスバイアル瓶、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ，ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上に静置し、その後－８０℃にて保管した。
【0041】
３）ＲＮＡ抽出及びシーケンシング
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡ ５μＬのうち、２．５μＬを以下のシーケンス解析のために使用し、残りの２．５μＬは、試験例２のリアルタイムＰＣＲで定量するために用いた。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを元に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡ ５μＬのうち、２．５μＬを以下のシーケンス解析のために使用し、残りの２．５μＬは、試験例２のリアルタイムＰＣＲで定量するために用いた。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
【0042】
試験例２ シーケンス解析による遺伝子発現量とリアルタイムＰＣＲ定量値に基くヒトＲＮＡ濃度の関連性検討
シーケンス解析により測定される遺伝子発現量とリアルタイムＰＣＲ法により測定される遺伝子発現量から導き出したヒトＲＮＡ濃度の関係を、以下により確認した。
シーケンス解析により測定される遺伝子発現量として、試験例１の３）で得たシーケンスデータの中から、一般的な内部標準遺伝子であるβアクチン（ＡＣＴＢ）の発現量を用いた（表１）。一方、ヒトＲＮＡ濃度は、ＡＣＴＢを目的遺伝子とする絶対定量法によるリアルタイムＰＣＲの定量値（Ｃｔ値）に基いて測定した。検量線を作成するためのターゲットテンプレートとして、濃度既知の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）ＲＮＡ溶液（タカラバイオ社、１００ｎｇ／μＬ）から希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／μＬ）を作成し、試験例１の３）と同様にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。ＳＳＬサンプルについては、試験例１の３）で得た逆転写産物をリアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとした。ヒトＡＣＴＢのＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いて、下記条件にてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＨＥＫサンプルとＳＳＬサンプルそれぞれについて、目的遺伝子として選定したＡＣＴＢのＣｔ値を取得した（表２）。
（リアルタイムＰＣＲ条件）
１．試薬
ＴａｑＭａｎＴＭ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：２０μＬ（２×Ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１０μＬ、２０×Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ：１μＬ、Ｈ２Ｏ：４μＬ、１０倍希釈したＳＳＬあるいはＮＨＥＫの逆転写産物：５μＬ）
サーマルサイクル：［９５℃、２０秒→（９５℃、３秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
得られたＣｔ値からＳＳＬサンプルのヒトＲＮＡ濃度を算出し、リアルタイムＰＣＲ定量データとした（表３）。リアルタイムＰＣＲ定量データとシーケンスデータ（Ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔ）間のデータ相関性を確認した結果、正の相関が確認された（Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数：０．７６４）。この結果からサンプルのＲＮＡ濃度が、該ＲＮＡのシーケンス解析から得られる遺伝子発現量に反映されることが明らかになった。また、いくつかのＳＳＬサンプルは検出限界に近いＣｔ値を示したことから、目的遺伝子にはより高発現の遺伝子を選択する必要性が示された。
シーケンス解析により測定される遺伝子発現量とリアルタイムＰＣＲ法により測定される遺伝子発現量から導き出したヒトＲＮＡ濃度の関係を、以下により確認した。
シーケンス解析により測定される遺伝子発現量として、試験例１の３）で得たシーケンスデータの中から、一般的な内部標準遺伝子であるβアクチン（ＡＣＴＢ）の発現量を用いた（表１）。一方、ヒトＲＮＡ濃度は、ＡＣＴＢを目的遺伝子とする絶対定量法によるリアルタイムＰＣＲの定量値（Ｃｔ値）に基いて測定した。検量線を作成するためのターゲットテンプレートとして、濃度既知の正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）ＲＮＡ溶液（タカラバイオ社、１００ｎｇ／μＬ）から希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／μＬ）を作成し、試験例１の３）と同様にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。ＳＳＬサンプルについては、試験例１の３）で得た逆転写産物をリアルタイムＰＣＲ測定のテンプレートとした。ヒトＡＣＴＢのＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いて、下記条件にてリアルタイムＰＣＲを行い、ＮＨＥＫサンプルとＳＳＬサンプルそれぞれについて、目的遺伝子として選定したＡＣＴＢのＣｔ値を取得した（表２）。
（リアルタイムＰＣＲ条件）
１．試薬
ＴａｑＭａｎＴＭ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：２０μＬ（２×Ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１０μＬ、２０×Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ：１μＬ、Ｈ２Ｏ：４μＬ、１０倍希釈したＳＳＬあるいはＮＨＥＫの逆転写産物：５μＬ）
サーマルサイクル：［９５℃、２０秒→（９５℃、３秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
得られたＣｔ値からＳＳＬサンプルのヒトＲＮＡ濃度を算出し、リアルタイムＰＣＲ定量データとした（表３）。リアルタイムＰＣＲ定量データとシーケンスデータ（Ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔ）間のデータ相関性を確認した結果、正の相関が確認された（Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数：０．７６４）。この結果からサンプルのＲＮＡ濃度が、該ＲＮＡのシーケンス解析から得られる遺伝子発現量に反映されることが明らかになった。また、いくつかのＳＳＬサンプルは検出限界に近いＣｔ値を示したことから、目的遺伝子にはより高発現の遺伝子を選択する必要性が示された。
【0043】
【表1】
【0044】
【表2】
【0045】
【表3】
【0046】
試験例３ 検量線作成に用いる目的遺伝子の選抜
ＳＳＬサンプルのヒトＲＮＡ濃度の定量に最適な目的遺伝子を選抜するために、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と一般的な内部標準遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰ０）の発現量をリアルタイムＰＣＲ定量により、絶対定量法で定量し、Ｃｔ値を比較した。本試験例で使用したプライマーの配列を表４に示す。表４の参考文献の欄は、斯かる配列が記載されている文献を示し、文献１は、Proc Natl Acad Sci USA., vol.106, No.9, 3384-3389 (2009)であり、文献２は、http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2804.pdfであり、文献３は、Virol J., vol.9, No.230 (2012)である。
ターゲットテンプレートには、ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液から、希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／μＬ）を作成し（ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液）、ＲＴ－ＰＣＲ反応は、逆転写反応とＰＣＲ反応を一つのチューブ内で連続して行う１ステップＲＴ－ＰＣＲ法で行った。
（ＲＴ－ＰＣＲ条件）
１．試薬
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：１０μＬ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１２５×）：０．０８μＬ、ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ（２×）：５．０μＬ、Ｈ２Ｏ：３．７２μＬ、ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液：１μＬ）
サーマルサイクル：［４８℃、３０分→９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
ＳＳＬサンプルのヒトＲＮＡ濃度の定量に最適な目的遺伝子を選抜するために、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と一般的な内部標準遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰ０）の発現量をリアルタイムＰＣＲ定量により、絶対定量法で定量し、Ｃｔ値を比較した。本試験例で使用したプライマーの配列を表４に示す。表４の参考文献の欄は、斯かる配列が記載されている文献を示し、文献１は、Proc Natl Acad Sci USA., vol.106, No.9, 3384-3389 (2009)であり、文献２は、http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2804.pdfであり、文献３は、Virol J., vol.9, No.230 (2012)である。
ターゲットテンプレートには、ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液から、希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／μＬ）を作成し（ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液）、ＲＴ－ＰＣＲ反応は、逆転写反応とＰＣＲ反応を一つのチューブ内で連続して行う１ステップＲＴ－ＰＣＲ法で行った。
（ＲＴ－ＰＣＲ条件）
１．試薬
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：１０μＬ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１２５×）：０．０８μＬ、ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ（２×）：５．０μＬ、Ｈ２Ｏ：３．７２μＬ、ＮＨＥＫのＲＮＡ溶液：１μＬ）
サーマルサイクル：［４８℃、３０分→９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
【0047】
【表4】
【0048】
各目的遺伝子のＣｔ値を表５に示す。一般的な内部標準遺伝子であるＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬＰ０と比較して、１８Ｓ ｒＲＮＡは、いずれのプライマーペアを用いた場合でも、より低いＣｔ値であった。これは、１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量が高く、検量線作成の目的遺伝子として選択すれば、検量線の濃度範囲をより低い範囲まで設定可能であることを意味する。従って、非常に微量なＳＳＬ中のヒトＲＮＡ濃度を間接的に定量する場合、１８Ｓ ｒＲＮＡは検量線作成により適した目的遺伝子である。
【0049】
【表5】
【0050】
実施例１ ＳＳＬ中のヒトＲＮＡ濃度定量値に基いた、ＲＮＡ発現情報解析
１）被験者
健常女性３０名（２０～６０歳代）を被験者とした。
１）被験者
健常女性３０名（２０～６０歳代）を被験者とした。
【0051】
２）ＳＳＬの採取
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被検者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被検者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（乾熱処理済み）の２０ｍＬガラスバイアル瓶、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ、ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上に静置し、その後－８０℃にて保管した。
あぶらとりフィルム（５．０ｃｍ×８．０ｃｍ、３Ｍ社）を用いて、被検者の顔全体から皮膚表上脂質（ＳＳＬ）を採取した。皮脂のクロスコンタミネーションを防ぐ為、被検者ごとに採取者のラボグローブは交換した。皮脂を採取したあぶらとりフィルムはただちに１ｇのモレキュラーシーブスを含むＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（乾熱処理済み）の２０ｍＬガラスバイアル瓶、或いは１ｇのモレキュラーシーブスを含む５ｍＬチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ ５ｍＬ、ＰＣＲ ｃｌｅａｎ）に入れ、ドライアイス上に静置し、その後－８０℃にて保管した。
【0052】
３）ＲＮＡ抽出
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを含む水性溶液を調製した。
上記２）の皮脂を採取したあぶらとりフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを含む水性溶液を調製した。
【0053】
４）ＳＳＬ中のヒトＲＮＡ濃度の算出
ＳＳＬ中のヒトＲＮＡ濃度を算出するため、１８Ｓ ｒＲＮＡを目的遺伝子とするリアルタイムＰＣＲ（１ステップＲＴ－ＰＣＲ）を行った。プライマーとして、上記表４に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする１８Ｓ＿０２＿ｆｏｒ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号４）及び１８Ｓ＿０２＿ｒｅｖ（Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号５）を使用した。検量線作成用のターゲットテンプレートには、濃度既知のヒト子宮頸癌由来（ＨｅＬａ）細胞ＲＮＡ（タカラバイオ社、１μｇ／μＬ）から希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、０．０００００１ｎｇ／μＬ）を作成して用いた（ＨｅＬａのＲＮＡ溶液）。ヒトＲＮＡ濃度を算出するターゲットテンプレートには、上記３）で調製したＲＮＡを含む水性溶液３０名分を用いた（ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液）。
（ＲＴ－ＰＣＲ条件）
１．試薬
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：１０μＬ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１２５×）：０．０８μＬ、ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ（２×）：５．０μＬ、Ｈ２Ｏ：３．７２μＬ、ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液又はＨｅＬａのＲＮＡ溶液：１μＬ）
サーマルサイクル：［４８℃、３０分→９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
ＳＳＬ中のヒトＲＮＡ濃度を算出するため、１８Ｓ ｒＲＮＡを目的遺伝子とするリアルタイムＰＣＲ（１ステップＲＴ－ＰＣＲ）を行った。プライマーとして、上記表４に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とする１８Ｓ＿０２＿ｆｏｒ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号４）及び１８Ｓ＿０２＿ｒｅｖ（Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号５）を使用した。検量線作成用のターゲットテンプレートには、濃度既知のヒト子宮頸癌由来（ＨｅＬａ）細胞ＲＮＡ（タカラバイオ社、１μｇ／μＬ）から希釈系列（１０、１、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１、０．００００１、０．０００００１ｎｇ／μＬ）を作成して用いた（ＨｅＬａのＲＮＡ溶液）。ヒトＲＮＡ濃度を算出するターゲットテンプレートには、上記３）で調製したＲＮＡを含む水性溶液３０名分を用いた（ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液）。
（ＲＴ－ＰＣＲ条件）
１．試薬
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
２．機器
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
３．反応系
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６－Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ，０．１ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）
反応量：１０μＬ（Ｆｗｄ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、Ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ（１００μＭ）：０．１μＬ、ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（１２５×）：０．０８μＬ、ＲＴ－ＰＣＲ Ｍｉｘ（２×）：５．０μＬ、Ｈ２Ｏ：３．７２μＬ、ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液又はＨｅＬａのＲＮＡ溶液：１μＬ）
サーマルサイクル：［４８℃、３０分→９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６０℃、１分）×４０サイクル］
【0054】
ＨｅＬａのＲＮＡ溶液とＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液のそれぞれについて取得した、目的遺伝子である１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＣｔ値を表６に示す。ＨｅＬａのＲＮＡ溶液のＣｔ値から作成した検量線に基いて算出したＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液中のヒトＲＮＡ濃度を表７に示す。
【0055】
【表6】
【0056】
【表7】
【0057】
５）ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液のヒトＲＮＡ濃度の統一
上記４）で得たヒトＲＮＡ濃度をもとに、各ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液のヒトＲＮＡ濃度を次のように調整した。ヒトＲＮＡ濃度が５ｐｇ／μＬ以上のものは希釈して５ｐｇ／μＬになるように調整した。ヒトＲＮＡ濃度が３ｐｇ／μＬ以上５ｐｇ／μＬ未満のものは、必要に応じて希釈して、３～３．５ｐｇ／μＬの範囲内となるように調整した。３ｐｇ／μＬ未満のものは、必要に応じて希釈して、０．１～０．７ｐｇ／μＬの範囲内となるように調整した。なお、希釈にはＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いた。
上記４）で得たヒトＲＮＡ濃度をもとに、各ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液のヒトＲＮＡ濃度を次のように調整した。ヒトＲＮＡ濃度が５ｐｇ／μＬ以上のものは希釈して５ｐｇ／μＬになるように調整した。ヒトＲＮＡ濃度が３ｐｇ／μＬ以上５ｐｇ／μＬ未満のものは、必要に応じて希釈して、３～３．５ｐｇ／μＬの範囲内となるように調整した。３ｐｇ／μＬ未満のものは、必要に応じて希釈して、０．１～０．７ｐｇ／μＬの範囲内となるように調整した。なお、希釈にはＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ-Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いた。
【0058】
６）シーケンシング
上記３）で得たＳＳＬ由来ＲＮＡの水性溶液を対象とするシーケンシングを行った。シーケンシングは上記３）で得た水性溶液をそのまま用いた場合（対照）と上記５）でヒトＲＮＡ濃度を調整した水性溶液を用いた場合（濃度統一）の２通りで行った。いずれの場合も、ＲＮＡ水溶液１．５μＬをシーケンシングに供した。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
上記３）で得たＳＳＬ由来ＲＮＡの水性溶液を対象とするシーケンシングを行った。シーケンシングは上記３）で得た水性溶液をそのまま用いた場合（対照）と上記５）でヒトＲＮＡ濃度を調整した水性溶液を用いた場合（濃度統一）の２通りで行った。いずれの場合も、ＲＮＡ水溶液１．５μＬをシーケンシングに供した。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。
得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した。
調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１に対して遺伝子マッピングすることで、各リード配列の由来する遺伝子を決定した。
【0059】
実施例２ シーケンスデータ分布の比較
実施例１で得た、ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液（以下、ＳＳＬサンプルと表記）のヒトＲＮＡ濃度を揃えて実施したシーケンスデータとヒトＲＮＡ濃度を揃えずにｖｏｌｕｍｅのみあわせて実施したシーケンスデータ（対照）の分布を比較した。各ＳＳＬサンプルのシーケンスに用いたｃＤＮＡライブラリー濃度、シーケンスデータの遺伝子検出率（シーケンス解析で解析可能な遺伝子数のうち検出された遺伝子数の割合）、及びマッピングされたリードの数を表８に示す。各値の分散を算出したところ、いずれの値もヒトＲＮＡ濃度を揃えて実施した方で分散が低かった。すなわち、ヒトＲＮＡ濃度を揃えて解析することにより、サンプル間の各数値のばらつきが低下し、データが均質化されていることが明らかになった。
実施例１で得た、ＳＳＬ由来ＲＮＡ水性溶液（以下、ＳＳＬサンプルと表記）のヒトＲＮＡ濃度を揃えて実施したシーケンスデータとヒトＲＮＡ濃度を揃えずにｖｏｌｕｍｅのみあわせて実施したシーケンスデータ（対照）の分布を比較した。各ＳＳＬサンプルのシーケンスに用いたｃＤＮＡライブラリー濃度、シーケンスデータの遺伝子検出率（シーケンス解析で解析可能な遺伝子数のうち検出された遺伝子数の割合）、及びマッピングされたリードの数を表８に示す。各値の分散を算出したところ、いずれの値もヒトＲＮＡ濃度を揃えて実施した方で分散が低かった。すなわち、ヒトＲＮＡ濃度を揃えて解析することにより、サンプル間の各数値のばらつきが低下し、データが均質化されていることが明らかになった。
【0060】
【表8】
【0061】
次に、皮脂ＲＮＡシーケンスデータの発現解析に用いるＤＥＳｅｑ２パッケージにより全サンプル及び全遺伝子の発現量分布を出力し、分散を比較した（表９）。また、各サンプルの全遺伝子の発現量分布の中央値を出力し、分散を比較した（表９）。その結果、いずれの項目も、ヒトＲＮＡ濃度を揃えて解析することによりばらつきが低下し、データが均質化されていることが明らかになった。
【0062】
【表9】
【0063】
さらに、ＤＥＳｅｑ２パッケージを用いて、データの正規化を行い、サンプル間のスピアマンの相関係数を算出し、ヒートマップを出力した（図１）。また、低シークエンスクオリティのカットオフをクリアしたサンプル及び低発現遺伝子のカットオフをクリアした遺伝子の個数を算出した（表１０）。その結果、対照と比較して、濃度を統一することにより相関性が向上することが確認された。解析対象遺伝子数に関しても、濃度を統一することで増加することが明らかになった。
【0064】
【表10】
【図1】
【配列表】