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▶ ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-05
(45)【発行日】2024-06-13
(54)【発明の名称】がん診断及び治療のための新規ＰＳＭＡ特異的結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20240606BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240606BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20240606BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240606BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240606BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240606BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240606BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47
C12P21/02 C ZNA
C07K14/765
A61K38/17
A61P35/00
A61P13/08
C12N15/12
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021557014
(86)(22)【出願日】2020-04-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-08
(86)【国際出願番号】 EP2020060043
(87)【国際公開番号】W WO2020208083
(87)【国際公開日】2020-10-15
【審査請求日】2022-12-28
(31)【優先権主張番号】19168525.4
(32)【優先日】2019-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】513311653
【氏名又は名称】ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ボース－ドーネッケ，エヴァ
(72)【発明者】
【氏名】グローサー－ブレーニヒ，マンジャ
(72)【発明者】
【氏名】セッテレ，フロリアン
(72)【発明者】
【氏名】フィドラー，エリック
(72)【発明者】
【氏名】ハウプト，ウルリッヒ
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１３３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２３２３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５０５６７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１４９００２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００６／０２８４２９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１６／１２４６７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０１３１３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】SHEN, D. et al.，Evaluation of phage display discovered peptides as ligands for prostate-specific membrane antigen (PSMA)，PLOS ONE，vol.8, no.7，2013年07月25日，e.68339
【文献】AGGARWAL, S. et al.，A dimeric peptide that binds selectively to prostate-specific membrane antigen and inhibits its enzymatic activity，CANCER RES，vol.66, no.18，2006年09月15日，pp.9171-9177
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ １３／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質であって、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号１の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基において、アミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＷＮＰＮ、ＫＨＮＴＷ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＥＴＩ、ＧＤＧＤＶ、又はＷＴＰＳＩを含むことを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項2】
請求項１に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、さらに、配列番号１のユビキチンの６位及び８位に対応するアミノ酸は置換されていることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、さらに、配列番号１のユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸は置換されていることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項4】
請求項１に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、さらに、ユビキチン（配列番号１）の６位、８位、９位、１０位、１２位、及び４６位に対応するアミノ酸は置換されているか、又はさらに、ユビキチン（配列番号１）の９位及び１０位に対応するアミノ酸間に６以下のアミノ酸が挿入されていることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、請求項１～４のいずれか一項に記載の複数のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多量体であることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体であることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号３～１５、１９～２２、２４～５５の群から選択される、又はそれぞれ、これらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むか又はから成ることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、５００ｎＭ以下のＰＳＭＡの細胞外ドメインと特異的結合親和性を有することを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、化学部分との結合のための１つ以上の結合部位をさらに含み、前記化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択されることを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、放射性核種、蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、若しくは上記のいずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの診断的活性部分をさらに含むか、又はモノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、結合タンパク質、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはこれらの誘導体、若しくは上記いずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの治療的活性部分をさらに含むことを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質において、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む非構造化アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも１つの部分をさらに含むことを特徴とするＰＳＭＡ結合タンパク質。
【請求項12】
医療において使用するための組成物であって、前記組成物は、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を含むことを特徴とする組成物。
【請求項13】
ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断又はＰＳＭＡ関連腫瘍の治療において使用するための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
腫瘍の画像診断及びＰＳＭＡ関連腫瘍の放射線治療において使用するための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の製造方法であって、前記方法は、ａ）前記ＰＳＭＡ結合タンパク質を得るために適した条件下で宿主細胞を培養するステップ及びｂ）前記産生されたＰＳＭＡ結合タンパク質を単離するステップを備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して特異的な新規結合タンパク質に関する。本発明は、診断的又は治療的活性成分をさらに含むＰＳＭＡ結合タンパク質にさらに関する。本発明のさらなる態様は、医療分野、例えば、ＰＳＭＡ発現に関連するがんの診断及び治療におけるこれらのＰＳＭＡ結合タンパク質の使用を包含する。
【背景技術】
【0002】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、腫瘍、特に前立腺がんにおいて発現される。ＰＳＭＡの過剰発現は、他の固形腫瘍、例えば、乳がん、腎がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膀胱がん、胃がん又は脳がん（例えば、神経膠芽腫）、及び多発性骨髄腫の新生血管においても見られる。これは転移性疾患における特に高レベルを有するがんの進行と共に増加する。３ドメイン糖タンパク質（細胞外、膜貫通型、及び短い細胞内ドメイン）は、腫瘍栄養及び細胞増殖を媒介している。
【0003】
標的ＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体を、がん、特に前立腺がんの診断及び治療のために開発した。従来、新たに診断された前立腺がん患者及び再発性前立腺がん患者の画像診断及び診断染色のための唯一の承認薬は、放射線標識マウスモノクローナル抗体カプロマブペンデチドである。しかしながら、抗体は、ＰＳＭＡの細胞内エピトープとの結合のせいで治療効果がない。ＰＳＭＡの細胞外エピトープと結合する第二世代モノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体Ｊ５９１などを開発した。Ｊ５９１を、進行性固形腫瘍のインビボ画像診断又は転移性循環腫瘍細胞の捕獲に関して試験した。その治療的使用は、有害副作用及び短い血中半減期により限定される。
【0004】
診断的及び治療的アプローチ、例えば、ＰＳＭＡ放射免疫療法及びＰＳＭＡ放射性画像診断のための薬剤としてＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体は、さらなる主なデメリットを有する。ひとつは、複合体分子構造及び対応する複雑な製造方法である。他は、それらの大きいサイズであり、インビボでの組織透過性不良をもたらす。長い循環時間と合わせて、画像診断応用のための化合物をベースとする抗体は、高バックグラウンドシグナルのせいで低コントラストをもたらし得る。
【0005】
さらに、初期効果的治療に対する高頻度の耐性は、ＰＳＭＡを過剰発現する前立腺がん及び他のがんのための付加的及び改良された治療薬の必要性を成す。
【0006】
ＰＳＭＡ関連がんの診断及び治療は、現在ある選択肢により充分に対処されず、結果として、多くの患者は、現在のストラテジーから充分に効果を得られない。言うまでもなく、ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断及び治療のための新規ストラテジーに対する強い必要性がある。
【0007】
本発明の１つの目的は、ＰＳＭＡ陽性腫瘍の検出を含む標的診断及び治療選択肢を可能とするＰＳＭＡの特異的標的化のための分子の提供である。この腫瘍関連タンパク質の標的化は、新規診断及び治療経路のための満たされていない要求を有する患者に利益を提供し得る。ＰＳＭＡの標的化は、正常組織中のＰＳＭＡの低分布及び限定分布のために潜在的無毒性診断及び治療アプローチを示唆する。したがって、ＰＳＭＡに対する特異性を有する結合タンパク質は、がんに対する効果的医療の選択肢を可能とし得、患者の生活の質を最終的に改善する。
【0008】
本発明は、ＰＳＭＡ関連がんの診断及び治療における新規及び改良されたストラテジーのための新規ＰＳＭＡ結合分子を提供する。
【0009】
上記目的及び利点を、開示されるクレームの主題によって達成する。本発明は、例えば、ＰＳＭＡ結合タンパク質の提供により上記の必要性を満足する。上記概要は、必ずしも、本発明によって解決される全ての問題を説明していない。
【発明の概要】
【0010】
本開示は、特にこれらに限定されないが、次の［１］～［１５」を提供する。
［１］前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質であって、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＨＥＹＬ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、若しくはＷＷＮＰＮ、又はこれらと８０％の同一性を有するモチーフから選択される少なくとも１つのアミノ酸結合モチーフを含む、ＰＳＭＡ結合タンパク質。
［２］配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む、［１］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［３］結合モチーフのアミノ酸残基は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に相当し、好ましくは、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、又はこれと８０％の同一性を有するモチーフを含む、［２］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［４］さらに、配列番号１のユビキチンの６位及び８位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［５］さらに、配列番号１のユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［６］さらに、ユビキチン（配列番号１）の６位、８位、９位、１０位、１２位、及び４６位に対応するアミノ酸は置換されているか、又はさらにユビキチン（配列番号１）の９位及び１０位に対応するアミノ酸間に６以下のアミノ酸が挿入されているか、又はユビキチン（配列番号１）の１１位、３３位、５１位、４８位、及び７４位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［７］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、［１］～［６］のいずれか１つに記載の複数のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多量体、好ましくは、［１］～［６］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体である、［１］～［６］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［８］配列番号３～５５の群から選択される、又はそれぞれ、これらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むか又はから成る、［１］～［７］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［９］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、５００ｎＭ以下のＰＳＭＡの細胞外ドメインと特異的結合親和性を有する、［１］～［８］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１０］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、化学部分との結合のための１つ以上の結合部位をさらに含み、好ましくは、前記化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択される、［１］～［９］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１１］放射性核種、蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、若しくは上記のいずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの診断的活性部分をさらに含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１２］モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、結合タンパク質、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはこれらの誘導体、又は上記いずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの治療的活性部分をさらに含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１３］ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む非構造化アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも１つの部分をさらに含む、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１４］ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため、及びＰＳＭＡ関連腫瘍の放射線治療のための、［１］～［１３］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１５］医療において使用するため、好ましくは、前記ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため及びＰＳＭＡ関連腫瘍の放射線治療のための、［１］～［１４］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物。
［１６］［１］～［１５］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の製造方法であって、前記方法は、ａ）前記ＰＳＭＡ結合タンパク質を得るために適した条件下で宿主細胞を培養するステップ及びｂ）前記製造されたＰＳＭＡ結合タンパク質を単離するステップを含む、方法。
［１］前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質であって、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＨＥＹＬ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、若しくはＷＷＮＰＮ、又はこれらと８０％の同一性を有するモチーフから選択される少なくとも１つのアミノ酸結合モチーフを含む、ＰＳＭＡ結合タンパク質。
［２］配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む、［１］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［３］結合モチーフのアミノ酸残基は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に相当し、好ましくは、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、又はこれと８０％の同一性を有するモチーフを含む、［２］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［４］さらに、配列番号１のユビキチンの６位及び８位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［５］さらに、配列番号１のユビキチンの４２位、４４位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［６］さらに、ユビキチン（配列番号１）の６位、８位、９位、１０位、１２位、及び４６位に対応するアミノ酸は置換されているか、又はさらにユビキチン（配列番号１）の９位及び１０位に対応するアミノ酸間に６以下のアミノ酸が挿入されているか、又はユビキチン（配列番号１）の１１位、３３位、５１位、４８位、及び７４位に対応するアミノ酸は置換されている、［３］に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［７］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、［１］～［６］のいずれか１つに記載の複数のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多量体、好ましくは、［１］～［６］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体である、［１］～［６］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［８］配列番号３～５５の群から選択される、又はそれぞれ、これらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むか又はから成る、［１］～［７］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［９］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、５００ｎＭ以下のＰＳＭＡの細胞外ドメインと特異的結合親和性を有する、［１］～［８］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１０］前記ＰＳＭＡ結合タンパク質は、化学部分との結合のための１つ以上の結合部位をさらに含み、好ましくは、前記化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択される、［１］～［９］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１１］放射性核種、蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、若しくは上記のいずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの診断的活性部分をさらに含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１２］モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、結合タンパク質、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはこれらの誘導体、又は上記いずれかの組合せから必要に応じて選択される少なくとも１つの治療的活性部分をさらに含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１３］ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む非構造化アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも１つの部分をさらに含む、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１４］ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため、及びＰＳＭＡ関連腫瘍の放射線治療のための、［１］～［１３］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質。
［１５］医療において使用するため、好ましくは、前記ＰＳＭＡ関連腫瘍の診断又は治療において使用するため、好ましくは、腫瘍の画像診断のため及びＰＳＭＡ関連腫瘍の放射線治療のための、［１］～［１４］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物。
［１６］［１］～［１５］のいずれか１つに記載のＰＳＭＡ結合タンパク質の製造方法であって、前記方法は、ａ）前記ＰＳＭＡ結合タンパク質を得るために適した条件下で宿主細胞を培養するステップ及びｂ）前記製造されたＰＳＭＡ結合タンパク質を単離するステップを含む、方法。
【0011】
この纏めは、必ずしも、本発明の全ての特徴を記載しているとは限らない。他の実施形態は、続く詳細な説明の総説から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
図１～３は、配列番号１（ユビキチン）の６２～６６位に対応するアミノ酸における特徴的モチーフを有するＰＳＭＡ結合タンパク質の例を示す。かかるユビキチン変異タンパク質の構造的特徴は、ユビキチンにおいて置換されている（上列の数字）又はユビキチンの９位及び１０位間に挿入されている（上列の数字：図２中の９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ、９ｅ、９ｆ）対応するアミノ酸により分かる。機能的特徴は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）により決定されるＰＳＭＡに対する親和性、ＤＳＦにより決定される熱安定性、及び実施例に記載されている細胞結合として分かる。
【図1】図１は６２～６６位における５－アミノ酸モチーフＷＷＮＰＮを有するＰＳＭＡ結合タンパク質を示す。ユビキチンの６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６２～６６位、６８位、７０位、７２位に対応するアミノ酸は置換されている。いくつかの結合タンパク質では、さらなる置換の列に示されているさらなる置換が見られる。
【図2】図２は、６２～６６位に対応する５－アミノ酸モチーフＫＨＮＴＷを有するＰＳＭＡ結合タンパク質を示す。ユビキチンの４２位、４４位、６２～６６位、６８位、７０位、７２位に対応するアミノ酸は置換されており、６アミノ酸はユビキチンの９位及び１０位間に挿入されている。いくつかの結合タンパク質では、さらなる置換の列に示されているさらなる置換が見られる。
【図3】図３は、５－アミノ酸モチーフＧＦＡＨＲ又はＧＷＡＨＲ（又は類似のもの）及び／又は５－アミノ酸ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＰＴＩ、若しくはＧＤＧＤＶを有するＰＳＭＡ結合タンパク質を示す。ユビキチンの６位、８位、６２～６６位に対応するアミノ酸は置換されており；２つのユビキチン変異タンパク質は結合している。いくつかのＰＳＭＡ結合タンパク質では、「さらなる置換」の列に示されているように、さらなる置換は、例えば、ユビキチンの１１位、３３位、４８位、５１位、７４位で見られる。
【図4】フローサイトメトリーにより決定されるＰＳＭＡ結合タンパク質の機能的特徴。ヒストグラムは、ＰＳＭＡ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞又はＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ細胞（灰色ピーク）上の配列番号４の結合（１９１８７１と呼ぶ）；コントロールセルラインＨＥＫ２９３－ｐＥｎｔｒｙ又はＰＣ３上に結合がないことを確証させる。未修飾ユビキチン（ｂｉｓ－ｕｂｉ；白色ピーク）は、細胞上の結合がないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明者らは、新規ＰＳＭＡ結合タンパク質を提供することによってがんの診断及び治療のための医療選択肢を広げるための当技術分野における強力な継続している必要性を満足する解決方法を開発した。本明細書で定義されているＰＳＭＡ特異的タンパク質は、ＰＳＭＡに対する高特異的親和性を機能的特徴とする。特に、本発明は、ユビキチン変異タンパク質Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）をベースとするＰＳＭＡ結合タンパク質を提供する。本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、好ましい物理化学的特性、細菌中の高レベル発現を有する分子フォーマットを提供し、容易な製造方法を可能とする。新規ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡ関連がんの診断及び治療のための今までに対処されていない医療ストラテジーを広げ得る。詳細には、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、診断又は画像診断目的のため、例えば、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞の存在、及びＰＳＭＡを発現する腫瘍の放射線治療のために使用され得る。
【0014】
本発明を以下により詳細に説明する前に、本発明は、これらが変わり得るとき本明細書に記載されている特定の方法、プロトコール及び試薬に限定されないことを理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の態様及び実施形態を説明するためだけのものであり、附属のクレームにより反映される本発明の範囲を限定する目的はないことも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通に理解されるのと同じ意味を有する。これは、タンパク質工学及び精製の分野の当業者を含むが、技術的応用並びに治療及び診断において使用するための新規標的特異的結合分子開発の分野の当業者も含む。
【0015】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（ＩＵＰＡＣ勧告）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋoｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されている通りに定義される。
【0016】
続く本明細書及びクレーム全体を通して、文脈上他の意味を必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、指定された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を含むことを意味しているが、他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を排除することを意味しないと理解された。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」又は「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の限界を包含し得、何らかの理由により一定の範囲でかかる限界は必要であるべきである。
【0017】
いくつかの文書（例えば：特許、特許出願、科学出版物、製造仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号配列寄託など）は、本明細書全体を通して引用され得る。本明細書において、本発明が先行発明によりこのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきでない。本明細書で引用されている文書のいくつかは、「参照により組み入れられる」と見做してよい。かかる組み入れられる参照文献の定義若しくは教示又は本明細書に記載されている定義若しくは教示間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先する。
【0018】
本明細書で表される全配列は、附属の配列リストに開示されており、その内容及び開示全体で本明細書の開示内容の一部を形成する。
【0019】
全般的定義
用語「ＰＳＭＡ」は、前立腺特異的膜抗原を表す。ヒトＰＳＭＡは、短い細胞内ドメイン（残基１～１９）、膜貫通型ドメイン（残基２０～４３）、及び細胞外ドメイン（残基４４～７５０）を含む約１００ｋＤの糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ０４６０９（２０１７年３月１５日のバージョン）により表され；ヒトＰＳＭＡ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４４７６．１により表される。用語ＰＳＭＡは、Ｑ０４６０９と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を示すポリペプチドを含む。
用語「ＰＳＭＡ」は、前立腺特異的膜抗原を表す。ヒトＰＳＭＡは、短い細胞内ドメイン（残基１～１９）、膜貫通型ドメイン（残基２０～４３）、及び細胞外ドメイン（残基４４～７５０）を含む約１００ｋＤの糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ０４６０９（２０１７年３月１５日のバージョン）により表され；ヒトＰＳＭＡ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４４７６．１により表される。用語ＰＳＭＡは、Ｑ０４６０９と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を示すポリペプチドを含む。
【0020】
用語「ＰＳＭＡ結合タンパク質」は、ＰＳＭＡと高結合親和性を有するタンパク質を表す。
【0021】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合された２つ以上のアミノ酸のいずれもの鎖を表し、特定の長さの産生物を表さない。したがって、タンパク質、アミノ酸鎖、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を表すために使用される他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語ポリペプチドはこれらの用語のいずれかの代わり、又はこれと互換的に使用され得る。用語ポリペプチドは、当技術分野において周知であるポリペプチドの翻訳後修飾の産生物を表すことも意図される。
【0022】
用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」は、親ポリペプチド配列中の特定位置における参照アミノ酸の別のアミノ酸による置換、欠失、又は挿入を表す。公知の遺伝子コード、並びに組換え及び合成ＤＮＡ技術を考えると、当業者はアミノ酸多様体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【0023】
本明細書で使用されるとき、用語「変異タンパク質」は、例えば、配列番号１に記載のユビキチン若しくは配列番号２に記載のビスユビキチン、又は変異タンパク質がＰＳＭＡに対する特異的結合親和性を有する条件において、アミノ酸交換、挿入、欠失又はこれらのいずれかの組合せにより前記アミノ酸配列と異なる同様なタンパク質の誘導体を表す。
【0024】
用語「Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）」（Ｎａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨの登録商標）は、非免疫グロブリン由来結合タンパク質を表す。
【0025】
用語「置換」は、アミノ酸を別のアミノ酸により交換することと理解される。用語「挿入」は、アミノ酸を元のアミノ酸配列に付加することを含む。
【0026】
用語ユビキチンは、配列番号１に記載のユビキチン又は配列番号２に記載のビスユビキチン及び少なくとも９５％の同一性、例えば、標的（ＰＳＭＡ）との結合に影響を与えない４５位、７５位、７６位における点変異を有するタンパク質を表す。
【0027】
用語結合「親和性」及び「結合親和性」は、本明細書で互換的に使用され得、別のタンパク質、ペプチド、又はそのフラグメント若しくはドメインと結合するポリペプチドの能力を表す。結合親和性は、通常、評価するために使用される平衡解離定数（ＫＤ）及び二分子相互作用の強度を順位序列によって測定・報告される。
【0028】
用語「融合タンパク質」は、少なくとも第二タンパク質と遺伝子的に結合された少なくとも第一タンパク質を含むタンパク質に関する。融合タンパク質は、別々のタンパク質を最初にコードした２つ以上の遺伝子の結合により作製される。融合タンパク質は、これらに限定されないが、例えば、多量体形成部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー又はＰＳＭＡと異なる標的と結合する部分など、標的の結合に関連しない付加的ドメインをさらに含み得る。
【0029】
用語「アミノ酸配列同一性」は、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（又は相違性）の定量的比較を表す。参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要に応じて、配列同一性最大パーセントを達成するように配列アラインメント及びギャップ導入後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。配列同一性を決定するため、問い合わせタンパク質の配列を、参照タンパク質又はポリペプチドの配列にアラインメントする。配列アラインメントの方法は、当技術分野において周知である。例えば、アミノ酸配列同一性の程度を決定するため、当技術分野で公知のＳＩＭ局所相同性プログラムのアミノ酸配列と比較した任意のポリペプチドの同一性を使用するのが好ましい。マルチプルアラインメント解析のため、当技術分野の当業者に公知であるＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａが好ましく使用される。
【0030】
用語「多量体結合分子」は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合タンパク質を含む結合タンパク質を表す。前記結合タンパク質は、標的抗原の同じ若しくは重複エピトープ、例えば、ＰＳＭＡの重複エピトープと特異的に結合し得るか、又は標的抗原の異なるエピトープ、例えば、ＰＳＭＡの異なるエピトープと結合し得る。
【0031】
本明細書で使用されるとき、用語「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、非タンパク質性（化学的）部分又は第二タンパク質などの他の物質と化学的に結合された少なくとも第一タンパク質、例えば、本発明のＰＳＭＡ結合タンパク質を含むタンパク質に関する。
【0032】
用語「エピトープ」は、本明細書で定義されている結合タンパク質と結合することができるいずれもの分子決定因子を含み、結合タンパク質と結合している標的抗原（すなわち、ＰＳＭＡ）の領域であり、結合タンパク質と直接的に接触する特異的アミノ酸を含み得る。
【0033】
ＰＳＭＡ結合タンパク質の構造的特徴。本明細書で定義されている前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合タンパク質は、ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、及びＷＷＮＰＮ（配列番号５５～６１及び７２～７７）、又は、それぞれ、これらと少なくとも８０％同一性を有するアミノ酸モチーフから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸結合モチーフを含む。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の変異タンパク質を含む。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、及びＷＷＮＰＮ、又は類似モチーフの群から選択されるアミノ酸結合モチーフを含み、結合モチーフのアミノ酸残基は配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの変異タンパク質を含み、ユビキチン変異タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する位置において、ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、若しくはＷＷＮＰＮ、又は類似モチーフから選択される少なくとも１つのアミノ酸結合モチーフを含む。
【0034】
モチーフＷＷＮＰＮを有するＰＳＭＡ結合タンパク質
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的なアミノ酸モチーフＷＷＮＰＮを有する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの変異タンパク質を含み、ユビキチン変異タンパク質はユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する位置においてアミノ酸結合モチーフＷＷＮＰＮ、及び配列番号１の６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６８位、７０位、７２位に対応する位置におけるあらなる置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｐ、及びＴ６６Ｎにさらに、Ｋ６Ｙ又はＫ６Ｗ；Ｌ８Ｒ又はＬ８Ａ又はＬ８Ｋ；Ｔ９Ａ、Ｔ９Ｖ、Ｔ９Ｅ、又はＴ９Ｑ；Ｇ１０Ｌ又はＧ１０Ｆ；Ｔ１２Ｑ；Ｒ４２Ｍ又はＲ４２Ｋ又はＲ４２Ｔ；Ｉ４４Ｆ又はＩ４４Ｋ；Ａ４６Ｋ又はＡ４６Ｒ；Ｈ６８Ｓ；Ｖ７０Ｎ又はＶ７０Ｄ；Ｒ７２Ｄ又はＲ７２Ｎ又はＲ７２Ｇの群から選択されるさらなる置換により修飾された少なくとも１つのユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、例えば、これらに限定されないが、Ｅ１６Ａ、Ｅ１８Ｇ、Ｉ２３Ｖ、Ｋ２９Ｒ、Ｑ３１Ｒ、Ｋ３３Ｒ、Ｉ３６Ｔ、Ｋ４８Ｒ、Ｌ７１Ｒ、及びＬ７３Ｒ（例えば、配列番号３８、３９、４０、４１、４７、４８、４９、５０、５１参照）の群から選択される付加的１、２、又は３置換を有するユビキチン変異タンパク質を含む。
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的なアミノ酸モチーフＷＷＮＰＮを有する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの変異タンパク質を含み、ユビキチン変異タンパク質はユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する位置においてアミノ酸結合モチーフＷＷＮＰＮ、及び配列番号１の６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６８位、７０位、７２位に対応する位置におけるあらなる置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、Ｑ６２Ｗ、Ｋ６３Ｗ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｐ、及びＴ６６Ｎにさらに、Ｋ６Ｙ又はＫ６Ｗ；Ｌ８Ｒ又はＬ８Ａ又はＬ８Ｋ；Ｔ９Ａ、Ｔ９Ｖ、Ｔ９Ｅ、又はＴ９Ｑ；Ｇ１０Ｌ又はＧ１０Ｆ；Ｔ１２Ｑ；Ｒ４２Ｍ又はＲ４２Ｋ又はＲ４２Ｔ；Ｉ４４Ｆ又はＩ４４Ｋ；Ａ４６Ｋ又はＡ４６Ｒ；Ｈ６８Ｓ；Ｖ７０Ｎ又はＶ７０Ｄ；Ｒ７２Ｄ又はＲ７２Ｎ又はＲ７２Ｇの群から選択されるさらなる置換により修飾された少なくとも１つのユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、例えば、これらに限定されないが、Ｅ１６Ａ、Ｅ１８Ｇ、Ｉ２３Ｖ、Ｋ２９Ｒ、Ｑ３１Ｒ、Ｋ３３Ｒ、Ｉ３６Ｔ、Ｋ４８Ｒ、Ｌ７１Ｒ、及びＬ７３Ｒ（例えば、配列番号３８、３９、４０、４１、４７、４８、４９、５０、５１参照）の群から選択される付加的１、２、又は３置換を有するユビキチン変異タンパク質を含む。
【0035】
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位において置換を有するユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成り、ユビキチン変異タンパク質は６２位、６３位、６４位、６５位、６６位における特徴的な５つのアミノ酸モチーフＷＷＮＰＮを有する。図１は、配列番号１の６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位におけるアミノ酸置換を有するＰＳＭＡ結合タンパク質の例を示す。
【0036】
１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号３５～５１、例えば、これらに限定されないが、配列番号４０（Ａｆｆｉｌｉｎ－１８７１９１）（ＰＳＭＡ結合をもたらす配列番号１との異なる部分に下線を引いている）から成る群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。
【0037】
ＭＱＩＦＶＹＴＲＡＬＫＱＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＭＬＦＷＫＧＲＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＷＷＮＰＮＬＳＬＮＬＤＬＲＡＡ。
【0038】
モチーフＫＨＮＴＷ又はＶＡＹＲＰを有するＰＳＭＡ結合タンパク質
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的なアミノ酸モチーフＫＨＮＴＷを有する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）のＲ４２Ｈ、Ｉ４４Ｙ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｗ、Ｈ６８Ｅ、Ｖ７０Ｍ、及びＲ７２Ｆから選択される置換により修飾されたユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的なアミノ酸モチーフＫＨＮＴＷを有する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）のＲ４２Ｈ、Ｉ４４Ｙ、Ｑ６２Ｋ、Ｋ６３Ｈ、Ｅ６４Ｎ、Ｓ６５Ｔ、Ｔ６６Ｗ、Ｈ６８Ｅ、Ｖ７０Ｍ、及びＲ７２Ｆから選択される置換により修飾されたユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。
【0039】
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的なアミノ酸モチーフＶＡＹＲＰを有する。他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）のＲ４２Ｉ、Ｉ４４Ｗ、Ｑ６２Ｖ、Ｋ６３Ａ、Ｅ６４Ｙ、Ｓ６５Ｒ、Ｔ６６Ｐ、Ｈ６８Ｙ、Ｖ７０Ｔ、及びＲ７２Ａから選択される置換により修飾されたユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成る。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）のアミノ酸Ｔ９及びＧ１０間の４～８アミノ酸の挿入により、好ましくは、６アミノ酸の挿入によりさらに修飾されたユビキチン変異タンパク質を含む。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、９位及び１０位間の６アミノ酸モチーフの挿入を有し、６番目の位置のアミノ酸は好ましくは芳香族アミノ酸、又はＭである。かかる挿入のアミノ酸モチーフは、これらに限定されないが、ＦＥＨＸＳＦ（Ｘはいずれかのアミノ酸、好ましくはＰ、Ｈ、Ｋ、又はＮから選択される）；ＰＱＰＰＥＸ（ＸはＷ、Ｆ、又はＹから選択される）；ＰＰＦＡＦＷ、ＰＩＰＰＤＷ、又はＤＭＹＲＦＭを含んでよい。
【0041】
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの変異タンパク質を含むか又はから成り、ユビキチン変異タンパク質はユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する位置においてＫＨＮＴＷ又はＶＡＹＲＰから選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフ、並びにユビキチン（配列番号１）の４２位、４４位、６８位、７０位、７２位に対応する位置においてさらなる置換、並びにユビキチン（配列番号１）のアミノ酸Ｔ９及びＧ１０間の４～８アミノ酸の挿入を含む。
【0042】
様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１の４２位、４４位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸における置換及び配列番号１の９位の６アミノ酸の挿入を有するユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成り、ユビキチン変異タンパク質は６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する特徴的５アミノ酸モチーフＫＨＮＴＷ又はＶＡＹＲＰを有する。さらなる１つ、２つ、又は３つの位置は、例えば、これらに限定されないが、ユビキチンのＡ４６Ｖに置換されていてよい（配列番号２９参照）。
【0043】
図２は、配列番号１の４２位、４４位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位における特定のアミノ酸及び配列番号１の９位及び１０位間の６アミノ酸（図２の９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ、９ｅ、９ｆとして示されている）の挿入の例を示す。
【0044】
１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合は、配列番号２５～３４、例えば、配列番号２５（Ａｆｆｉｌｉｎ－１６４６６７）から成る群から選択されるアミノ酸を含む。
【0045】
ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＦＥＨＰＳＦＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＨＬＹＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＫＨＮＴＷＬＥＬＭＬＦＬＲＡＡ（ＰＳＭＡ結合をもたらす配列番号１との異なる部分に下線を引いている）。
【0046】
モチーフＧＷＡＨＲ／ＧＦＡＨＲ若しくは類似及び／又はＷＴＴＴＦ若しくは類似を有するＰＳＭＡ結合タンパク質
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的５アミノ酸モチーフＧＷＡＨＲ又はＧＦＡＨＲ又はＳＦＡＨＲ又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬ又はこれらの多様体を有するユビキチン変異タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、又はこれと８０％の同一性を有するモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基において、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＸ１Ｘ２ＡＨＸ３を含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、Ｘ１はＧ又はＳから選択され、Ｘ２は芳香族アミノ酸、好ましくはＷ又はＦから選択され、Ｘ３はＲ又はＬから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＧ（Ｘ）ＡＨＲを含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、Ｘは芳香族アミノ酸残基、好ましくは、ＸはＦ又はＷから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基において、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬを含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的５アミノ酸モチーフＧＷＡＨＲ又はＧＦＡＨＲ又はＳＦＡＨＲ又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬ又はこれらの多様体を有するユビキチン変異タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとする１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基においてアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、又はこれと８０％の同一性を有するモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基において、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＸ１Ｘ２ＡＨＸ３を含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、Ｘ１はＧ又はＳから選択され、Ｘ２は芳香族アミノ酸、好ましくはＷ又はＦから選択され、Ｘ３はＲ又はＬから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＧ（Ｘ）ＡＨＲを含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含み、Ｘは芳香族アミノ酸残基、好ましくは、ＸはＦ又はＷから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１に記載のユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸残基において、配列番号１に記載のユビキチンをベースとしアミノ酸結合モチーフＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬを含む１つ以上のユビキチン変異タンパク質を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチンの６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に特徴的５アミノ酸モチーフＷＴＴＴＦ（配列番号５８）又はＷＴＰＳＩ（配列番号７５）又はＷＴＥＴＩ（配列番号７６）又はＧＤＧＤＶ（配列番号７７）又はこれらの多様体を有するユビキチン変異タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、２つのユビキチン部分を含むか又はから成り、第一ユビキチン部分はモチーフＧＦＡＨＲ（配列番号５６）若しくはＧＷＡＨＲ（配列番号５７）若しくはＳＦＡＨＲ（配列番号７２）若しくはＳＹＡＨＲ（配列番号７３）若しくはＧＦＡＨＬ（配列番号７４）若しくは類似モチーフを有するか又は第二ユビキチン部分はモチーフＷＴＴＴＦ若しくはＷＴＰＳＩ若しくはＷＴＥＴＩ若しくはＧＤＧＤＶ若しくは類似モチーフを有する。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、２つのユビキチン部分を含むか又はから成り、第一ユビキチン部分はモチーフＧＦＡＨＲ又はＧＷＡＨＲ又はＳＦＡＨＲ又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬ又は類似モチーフを有し、第二ユビキチン部分はモチーフＷＴＴＴＦ又はＷＴＰＳＩ又はＷＴＥＴＩ又はＧＤＧＤＶ又は類似モチーフを有する。図３は、２つのユビキチン部分から成るＰＳＭＡ結合タンパク質中の６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位における特定のアミノ酸の例を示す。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、相互に融合された配列番号１の６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応するアミノ酸の置換を有する２つのユビキチン変異タンパク質を含むか又はから成り、Ｎ末端に位置するユビキチン変異タンパク質は６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する特徴的５アミノ酸モチーフＧＦＡＨＲ又はＧＷＡＨＲ又はＳＦＡＨＲ又はＳＹＡＨＲ又はＧＦＡＨＬを有し、Ｃ末端に位置するユビキチン変異タンパク質は図３に示されているように６２位、６３位、６４位、６５位、６６位に対応する特徴的５アミノ酸モチーフＷＴＴＴＦ又はＷＴＰＳＩ又はＷＴＥＴＩ又はＧＤＧＤＶを有する。
【0048】
いくつかの実施形態では、ユビキチン変異タンパク質は、Ｋ６Ｒ又はＫ６Ｗ；Ｌ８Ｍ、Ｌ８Ｐ、Ｌ８Ｑ、Ｌ８Ｗ、Ｌ８Ｄ、Ｌ８Ｇ、Ｌ８Ｈ、又はＬ８Ｉ；Ｑ６２Ｇ、Ｑ６２Ｓ、又はＱ６２Ｗ；Ｋ６３Ｆ、Ｋ６３Ｗ、Ｋ６３Ｇ、Ｋ６３Ｐ、又はＫ６３Ｙ；Ｅ６４Ａ又はＥ６４Ｇ；Ｓ６５Ｈ又はＳ６５Ｄ；及びＴ６６Ｒ、Ｔ６６Ｑ、又はＴ６６Ｌから選択される置換を有する。いくつかの実施形態では、ユビキチン変異タンパク質は、Ｋ６Ｍ、Ｋ６Ｌ、Ｋ６Ａ，又はＫ６Ｈ；Ｌ８Ｑ、Ｌ８Ｒ、Ｌ８Ｆ、Ｌ８Ｎ，又はＬ８Ｈ；Ｑ６２Ｗ又はＱ６２Ｇ；Ｋ６３Ｔ、Ｋ６３Ｈ，又はＫ６３Ｄ；Ｅ６４Ｔ、Ｅ６４Ｐ、Ｅ６４Ｅ，又はＥ６４Ｇ；Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ｙ，又はＳ６５Ｄ、及びＴ６６Ｆ、Ｔ６６Ｉ、Ｔ６６Ｌ，又はＴ６６Ｖから選択される置換を有する。
【0049】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、例えば、これらに限定されないが、ユビキチンの１０位、１１位、３３位、４８位、４８位、５１位、７４位の、特定の実施形態では、例えば、ユビキチンのＧ１０Ｑ、Ｋ１１Ｑ、Ｋ３３Ｔ、Ｋ４８Ｔ、Ｅ５１Ａ、Ｒ７４Ｃ（例えば、配列番号１１、１２、１７、１９参照）の群から選択されるさらなる置換によりさらに修飾されたユビキチン変異タンパク質を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、相互に結合された２つのユビキチン変異タンパク質を含む、すなわち、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ビスユビキチン（配列番号２）の変異タンパク質を含む。
【0051】
１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、例えば、配列番号３～２４から成る群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む（ＰＳＭＡ結合もたらす配列番号１又は配列番号２との異なる部分に下線を引いている）。
【0052】
配列番号３（Ａｆｆｉｌｉｎ－１６２４６２）
ＭＱＩＦＶＲＴＰＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＧＦＡＨＲＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＭＱＩＦＶＭＴＱＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＷＴＴＴＦＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ；
配列番号４（Ａｆｆｉｌｉｎ－１９１８７１）ＭＱＩＦＶＲＴＱＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＧＷＡＨＲＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＭＱＩＦＶＨＴＮＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＷＴＥＴＩＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ。
ＭＱＩＦＶＲＴＰＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＧＦＡＨＲＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＭＱＩＦＶＭＴＱＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＷＴＴＴＦＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ；
配列番号４（Ａｆｆｉｌｉｎ－１９１８７１）ＭＱＩＦＶＲＴＱＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＧＷＡＨＲＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡＭＱＩＦＶＨＴＮＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＷＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＷＴＥＴＩＬＨＬＶＬＲＬＲＡＡ。
【0053】
本発明のＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号３～５５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はからなる。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号３～５５のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。例えば、これらに限定されないが、選択されたＰＳＭＡ結合タンパク質のアミノ酸配列を、図１、図２、及び図３に示す。
【0054】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、又は８５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、ユビキチン（配列番号１）又はビスユビキチン（配列番号２）のアミノ酸配列と７４％の同一性～９０％の同一性のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％のいずれかのアミノ酸同一性を有してよい。
【0056】
多量体。好ましい実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、本明細書で定義されている複数のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む多量体である。多量体は、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質を含んでよい。１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、相互に結合された２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質を含み、すなわち、ＰＳＭＡ結合タンパク質は二量体、三量体、又は四量体などであり得る。いくつかの実施形態では、多量体は、上記定義されているようにＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体である。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ホモ二量体である。本明細書で理解されるホモ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は、同じアミノ酸配列を有する２つのＰＳＭＡ結合タンパク質が相互に結合されているタンパク質である。ホモ二量体を、配列番号３～５１又はこれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかの群のいずれか１つの２つの同じタンパク質を融合することによって製造することができる。例えば、これらに限定されないが、ホモ二量体は、配列番号５２（配列番号３の二量体）及び配列番号５３（配列番号２５の二量体）に例示されている。
【0057】
他の実施形態では、多量体は、ヘテロ二量体であり、例えば、ＰＳＭＡ結合タンパク質の２つのアミノ酸配列は異なる。例えば、ヘテロ二量体を、配列番号５４（配列番号２５及び配列番号３の二量体、Ｎ末端からＣ末端）及び配列番号５５（配列番号３及び配列番号２５の二量体、Ｎ末端からＣ末端）に示されているように製造した。
【0058】
いくつかの実施形態では、２つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質は、直接的に結合している。いくつかの実施形態では、２つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ペプチドリンカーによって結合している。様々な実施形態では、２つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質は、３０アミノ酸以下のペプチドリンカーによって結合している。他の実施形態では、２つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸のペプチドリンカーによって結合している。１つの実施形態では、２つのＰＳＭＡ結合タンパク質は、１６アミノ酸によって結合している。
【0059】
１つの実施形態は、グリシン、セリン、アラニン、又はプロリンの群の少なくとも２つ又はそれ以上から選択されるアミノ酸からなるリンカーに関する。いくつかの実施形態では、２つ以上のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＳＡＰＡＡＳＰＳＰＡＡＰＡＰＳＰＡＳＰＡＰＡＳＰＡＳＡＰＳＡＰＡＳＡＰＰＡＡＳＡ（配列番号６２）又はＰＡＡＰＡＰＳＰＡＳＰＡＰＡＳＰＡＳＡＰＳ（配列番号６３）又はこれらと少なくとも９０％の同一性を有するペプチドリンカーのいずれか１つによるアミノ酸配列のペプチドリンカーによって結合されている。タンパク質の融合のための他のリンカーは、当技術分野において公知であり、使用することができる。
【0060】
機能的特性化。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＦＡＣＳにより決定される細胞において発現されたＰＳＭＡと結合し、及び／又は表面プラズモン共鳴アッセイにより決定される５００ｎＭ以下のＰＳＭＡに対する結合親和性を有する。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡに対する５００ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、及び１ｎＭ未満の測定可能な結合親和性を有するＰＳＭＡと結合する。適切な方法は当業者に公知であり、又は文献に記載されている。結合親和性を決定するための方法はそれ自体公知であり、例えば、当技術分野において公知の次の方法から選択することができる：酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、反応速度排除分析（ＫｉｎＥｘＡアッセイ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、フローサイトメトリー、蛍光分光法技術、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析超遠心、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、及び高感度ケミルミネッセンス法（ＥＣＬ）。一部の方法は下記実施例に記載されている。通常、解離定数ＫＤを、２０℃～３０℃の温度範囲、例えば、２０℃、２５℃、又は３０℃で決定する。特に別段に指定されない限り、本明細書に記載されているＫＤ値はＳＰＲにより２５℃において決定される。ＫＤ値が低いほど、その結合パートナーに対する生体分子の結合親和性はより大きい。ＫＤ値が高いほど、結合パートナーは、より弱く相互と結合する。図１、図２，図３及び実施例において実施例を提供する。本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質の結合は、ＰＳＭＡに対して極めて特異的である。ユビキチン（配列番号１）は、ＰＳＭＡと結合しない。本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質はＰＳＭＡと結合するが、表面プラズモン共鳴アッセイにより決定されるとき、免疫グロブリンＩｇＧ１のヒトＦｃドメインと検出できるほど結合しない。５００ｎＭ未満のＫＤを有するＰＳＭＡとの結合は、ＰＳＭＡ関連がんのための標的医療の応用にとって重要であり得る。さらに、５００ｎＭ未満のＫＤを有するＰＳＭＡ結合を有するタンパク質は、潜在的有害副作用を低減したかもしれない。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、（ａ）ＧＦＡＨＲ、ＧＷＡＨＲ、ＳＦＡＨＲ、ＳＹＡＨＲ、ＧＦＡＨＬ、ＷＴＴＴＦ、ＷＴＰＳＩ、ＷＴＥＴＩ、ＧＨＥＹＬ、ＧＤＧＤＶ、ＫＨＮＴＷ、ＶＡＹＲＰ、及びＷＷＮＰＮ、又はこれらと８０％の同一性を有するモチーフから選択されるユビキチン（配列番号１）の６２位、６３位、６４位、６５位、及び６６位に対応する位置において５アミノ酸残基モチーフ；（ｂ）配列番号１と８０％～９３％配列同一性；並びに（ｂ）ＰＳＭＡに対して５００ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有するユビキチン変異タンパク質を含む。
【0062】
最大半量効果濃度ＥＣ５０は、特定の露光時間後にベースライン及び最大値間の中間の応答を含むＰＳＭＡ結合タンパク質の濃度を表し、したがって、その最大効果の５０％が観察されるＰＳＭＡ結合タンパク質濃度であり、この場合、細胞結合、フローサイトメトリー実験において最大半量蛍光強度シグナルである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡ発現細胞に対して１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、及び１ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、３７℃で少なくとも２４時間マウス血清の存在下でのインキュベーション後、１ｎＭ未満のＰＳＭＡ発現細胞に対するＥＣ５０を有する。適切な方法は当業者に公知である。ＥＣ５０値が低いほど、ＰＳＭＡに対するＰＳＭＡ結合タンパク質の結合はより大きい。血清存在下でさえ安定なＰＳＭＡ結合タンパク質の例を表４に示す。
【0063】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、８５℃以下の高温において安定である。安定性分析のため、例えば、化学的又は物理的アンフォールディングに関連した分光学的又は蛍光ベース方法は、当業者に公知である。例えば、分子の安定性を、標準的方法を用いて、熱融点（Ｔｍ）、分子の半量がアンフォールディングする摂氏温度（℃）の測定によって決定することができる。通常、Ｔｍが高いほど、分子はより安定である。温度安定性を、実施例及び図１、図２、図３にさらに詳細に記載されている示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定した。
【0064】
ＰＳＭＡ結合タンパク質を比較する競合結合実験は、異なるモチーフを有するＰＳＭＡ結合タンパク質が同じでない又は重複していないエピトープと結合し得ることを示す（実施例参照）。例えば、モチーフＫＨＮＴＷを有する配列番号２５は、モチーフＧＦＡＨＲ及びＷＴＴＴＦを有する配列番号１５と異なるエピトープと結合する。したがって、特定のＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡ結合を得るために競合せず、特定の診断又は治療応用に特に適している。
【0065】
ＰＳＭＡ過剰発現細胞との細胞ＰＳＭＡ結合分析によってさらなる機能的特性化を行った。免疫蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリー分析は、ヒト起源由来ＰＳＭＡポジティブ腫瘍セルライン及び生細胞のＰＳＭＡとの、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質の特定の結合を確証させた（実施例参照）。
【0066】
結合部位。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、化学部分の結合のための１つ以上の結合部位をさらに含む。結合部位は、ＰＳＭＡ結合タンパク質を化学部位と結合するための他の化学基と反応することができる。結合部位の定義数及び定義位置は、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質との、化学部分の部位特異的結合を可能とする。したがって、多数の化学部分は、必要に応じて、ＰＳＭＡ結合タンパク質と結合することができる。結合部位数を、それに応じて化学部分の量を調節するように当業者によって特定の応用のために最適数に調節することができる。選択された実施形態では、結合部位を、１つ以上のシステイン残基、１つ以上のリジン残基、１つ以上のチロシン残基、１つ以上のトリプトファン残基、又は１つ以上のヒスチジン残基など、特定の化学で標識化することができる１つ以上のアミノ酸の群から選択してよい。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、１～６結合部位など、２結合部位、又は１結合部位など、１～２０結合部位を含んでよい。
【0067】
結合ドメイン。１つの実施形態は、１つ以上の結合部位を含む１～８０アミノ酸の少なくとも１つの結合ドメインを含むＰＳＭＡ結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、１～８０アミノ酸の結合ドメインは、アラニン、プロリン、又はセリン、及び結合部位としてシステインを含んでよい。アミノ酸ＳＡＣの結合ドメインを有するＰＳＭＡ結合タンパク質の例を、配列番号５（Ｃ末端アミノ酸ＳＡＣを有するＡｆｆｉｌｉｎ－１９１８７１）に提供する。他の実施形態では、１～８０アミノ酸残基の結合ドメインは、アラニン、プロリン、セリン、及び結合部位としてシステインから成ってよい。１つの実施形態では、結合ドメインは、２０～６０％のアラニン、２０～４０％のプロリン、１０～６０％のセリン、及び本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質のＣ末端又はＮ末端における結合部位として１つ以上のシステイン残基から成る。いくつかの実施形態では、アミノ酸アラニン、プロリン、及びセリンを、最大以下の２、３、４、又は５同一アミノ酸残基、好ましくは、最大の３アミノ酸が隣接するように、結合ドメインアミノ酸配列全体にわたって無作為に分布させる。１～２０結合ドメインの組成は、異なっていてもよく、同じでもよい。
【0068】
結合部位（システイン）との結合ドメインの選択された例のアミノ酸組成を表１に示す。
【0069】
【0070】
いくつかの実施形態では、化学部分は、キレート剤、薬剤、トキシン、染料、及び小分子のいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、化学部分の少なくとも１つは、化合物を本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質に標的化された化合物と、１つ以上のさらなる部分を結合するための錯生成剤として設計されたキレート剤である。１つの実施形態は、キレート剤が、実施例に記載されているように、１つ以上の放射性同位体又は他の検出可能な標識を結合するための錯生成剤である、ＰＳＭＡ結合タンパク質に関する。
【0071】
診断部分。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、診断部分をさらに含む。他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、１つより多い診断部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、かかる診断部分は、放射性核種蛍光タンパク質、感光剤、染料、若しくは酵素、又は上記のいずれかの組合せから選択してよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの診断部分を含むＰＳＭＡ結合タンパク質を、例えば、造影剤として、例えば、腫瘍細胞若しくは腫瘍転移、腫瘍分布、及び／又は腫瘍再発を評価するために使用することができる。がん細胞の検出又はモニター方法は、画像診断方法を含む。かかる方法は、例えば、放射性イメージング又は光ルミネセンス若しくは蛍光によってＰＳＭＡ関連がん細胞の画像診断を含む。
【0072】
治療部分。様々な実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、治療活性部分をさらに含む。他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、１つより多い治療活性部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、かかる治療活性部分を、モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、ユビキチン変異タンパク質（Ａｆｆｉｌｉｎ）、受容体の細胞外ドメイン若しくはそのフラグメント、放射性核種、細胞傷害性化合物、サイトカイン、ケモカイン、酵素、若しくはその誘導体、又は上記のいずれかの組合せから選択してよい。いくつかの実施形態では、治療活性成分を含むＰＳＭＡ結合タンパク質を、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞への上記成分のいずれかの標的化遺伝子導入に使用してよく、その中に蓄積して、それにより、正常細胞に対する低レベルの有害性をもたらす。
【0073】
放射性核種。インビボ若しくはインビトロでの画像診断における応用又は放射線療法のために適切な放射性核種としては、例えば、γ線放射性同位体の群、ポジトロン放射体の群、β線放射体の群、及びα線放射体の群が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、適切な結合パートナーとしては、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）若しくはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などのキレート剤又はそれらの活性化誘導体、ナノ粒子及びリポソームが挙げられる。様々な実施形態では、ＤＯＴＡは、さらなる詳細に実施例に記載されているように画像診断のための放射性同位体及び他の薬剤に錯生成剤として適し得る。
【0074】
薬物動態を調節する部分。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン結合タンパク質、又は免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、多糖類（例えば、ヒドロキシエチルデンプン）、又はアミノ酸アラニン、グリシン、セリン、プロリンを含む多量体などの流体力学半径を増大する非構造化アミノ酸配列から必要に応じて選択される薬物動態を調節する少なくとも１つの部分をさらに含む。様々な実施形態では、前記部分は、少なくとも１．５倍ＰＳＭＡ結合タンパク質の半減期を増大する。延長された半減期を有するＰＳＭＡ結合タンパク質の製造のためのいくつかの技術は当技術分野において公知であり、例えば、上記のＰＳＭＡ結合タンパク質を用いた薬物動態を調節する部分の直接融合又は化学カップリング法がある。薬物動態を調節する部分を、例えば、ペプチドリンカー配列又は上記カップリング部位によりＰＳＭＡ結合タンパク質の１つ又はいくつかの部位において結合することができる。
【0075】
ＰＳＭＡ結合タンパク質へのタンパク質性又は非タンパク質性部分の結合を、当技術分野において周知の化学的方法を適用して行ってよい。いくつかの実施形態では、システイン又はリジン残基の誘導体化に特異的な結合化学を適用でき得る。化学結合を、当業者に周知の化学によって行うことができ、置換、付加若しくは環化付加又は酸化化学（例えば、ジスルフィド生成）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0076】
精製／検出のための分子。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸は、ＰＳＭＡ結合タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又は両方のいずれかにおいて延長することができる。追加の配列は、例えば、精製又は検出のために導入される配列を含み得る。１つの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、特定のクロマトグラフィーカラム物質との親和性を付与する１つ以上のペプチド配列を含む。かかる配列の典型的な例としては、Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号７１参照）、オリゴヒスチジンタグ、グルタチオンＳ－転移酵素、マルトース結合タンパク質、インテイン、インテインフラグメント、又はタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【0077】
医薬用途。様々な実施形態は、医薬において使用するための本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質に関する。１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質を、ＰＳＭＡ発現に関連するがんを診断又は治療するための医薬において使用する。本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡ関連がん細胞又はがん組織の選択的診断及び治療を可能とする。ＰＳＭＡは、腫瘍細胞において上方制御されることが分かっている。ＰＳＭＡは、前立腺がん並びに、例えば、これらに限定されないが、肝がん、甲状腺がん、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫、リンパ節、及び骨転移、並びに他の固形腫瘍から選択される、好ましくは、乳がん、腎（ｒｅｎａｌ）／腎（ｋｉｄｎｅｙ）がん、多発性骨髄腫、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膀胱がん及び胃がんから選択されるその転移において高度に発現される。
【0078】
１つの実施形態は、ＰＳＭＡ関連がんを有する対象の診断（モニタリングを含む）方法であり、前記診断（モニタリング）方法は、必要に応じて放射活性分子と結合された記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を対象に投与することを含む。様々な実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質を、必要に応じて、ＰＳＭＡ結合タンパク質が放射活性分子と結合されているＰＳＭＡ関連がんの診断のために使用してよい。いくつかの実施形態では、放射活性又は蛍光などの標識を有するＰＳＭＡ結合タンパク質を使用する画像診断方法を、例えば、ＰＳＭＡ関連腫瘍細胞、ＰＳＭＡ関連腫瘍分布、ＰＳＭＡ関連腫瘍の再発を評価、及び／又は治療処置に対する患者の応答を評価するために、特定の組織又は細胞上のＰＳＭＡを可視化するために使用することができる。
【0079】
１つの実施形態は、ＰＳＭＡ関連がんを有する対象の治療方法であり、前記治療方法は、必要に応じて放射活性分子及び／又は細胞傷害薬と結合された記載のＰＳＭＡ特異的結合タンパク質を対象に投与することを含む。様々な実施形態では、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質を、必要に応じて、ＰＳＭＡ結合タンパク質が細胞傷害薬及び／又は放射活性分子と結合されているＰＳＭＡ関連がんの治療のために使用してよい。いくつかの実施形態は、ＰＳＭＡ関連腫瘍細胞の治療のために、特に、ＰＳＭＡ関連腫瘍細胞、例えば、悪性細胞を制御又は殺生するために適切な放射性同位体又は細胞傷害性化合物で標識化されたＰＳＭＡ結合タンパク質の使用に関する。１つの実施形態では、放射線の治癒線量を、ＰＳＭＡ関連腫瘍細胞に選択的に送達するが、正常細胞に送達しない。
【0080】
組成物。様々な実施形態は、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物に関する。医薬において使用するため、好ましくは、前立腺がん及びその転移、肝がん、甲状腺がん、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫、リンパ節、及び骨転移、腎（ｒｅｎａｌ）／腎（ｋｉｄｎｅｙ）がん、多発性骨髄腫、脳腫瘍、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膀胱がん、胃がん、及びその他などの様々なＰＳＭＡ関連がん腫瘍の診断又は治療において使用するための上記定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物。上記定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物を、診断及び治療目的の両方の臨床応用のために使用してよい。詳細には、上記のＰＳＭＡ結合タンパク質を含む組成物を、ＰＳＭＡを発現する病的細胞を画像診断、モニタリング、及び排除又は不活性化するための臨床応用のために使用してよい。
【0081】
様々な実施形態は、本明細書で定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質並びに診断的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含むＰＳＭＡ関連がんの診断のための診断用組成物に関する。これらとしては、例えば、安定剤、表面活性剤、塩類、緩衝剤、着色料などが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、液体製剤、凍結乾燥物、顆粒剤の形態、乳剤又はリポソーム製剤の形態であり得る。
【0082】
本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質を含む診断用組成物を、上記のＰＳＭＡ関連がんの診断のために使用することができる。
【0083】
様々な実施形態は、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質、並びに薬剤的に（例えば、治療的に）許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む疾病の治療のための医薬（例えば、治療用）組成物に関する。医薬（例えば、治療用）組成物は、それ自体公知のさらなる助剤及び賦形剤を必要に応じて含有してよい。これらとしては、例えば、安定剤、表面活性剤、塩類、緩衝剤、着色料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0084】
本明細書に定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質を含む医薬組成物を、上記の疾病の治療のために使用することができる。
【0085】
組成物は、本明細書に定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質の効果的用量を含む。投与しようとするタンパク質量は、生物、疾病の種類、患者の年齢及び体重並びにそれ自体公知のさらなる因子に依存する。ガレヌス製剤（ｇａｌｅｎｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に応じて、これらの組成物を、注射若しくは点滴、全身的、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮により非経口的に、又は他の従来使用されている適用方法により投与することができる。
【0086】
組成物は、液体製剤、凍結乾燥物、クリーム剤、局所塗布用ローション剤、エアロゾル剤の形態、散剤、顆粒剤の形態、乳剤又はリポソーム剤の形態であり得る。製剤の種類は、疾病の種類、投与経路、疾病の重症度、医薬の技術分野の当業者に公知の患者及び他に依存する。
【0087】
組成物の様々な成分を、使用説明書を備えるキットとして包装してよい。
【0088】
ＰＳＭＡ結合タンパク質の製造。本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質を、プレーン有機合成ストラテジー、固相支援合成技術、フラグメントライゲーション技術など多くの従来及び周知の技術又は市販自動合成装置によって製造してよい。一方、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質を、従来の組換え技術単独又は従来の合成技術との組合せで製造してもよい。さらに、本明細書に記載されているＰＳＭＡ結合タンパク質を、細胞フリーインビトロ転写／翻訳によって製造してもよい。
【0089】
様々な実施形態は、本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。１つの実施形態は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記単離ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【0090】
様々な実施形態は、前記ＰＳＭＡ結合タンパク質の発現及び必要に応じて前記ＰＳＭＡ結合タンパク質を単離することを可能とする適切な条件下、宿主細胞の培養することを含む本明細書に開示されているＰＳＭＡ結合タンパク質の製造方法に関する。
【0091】
例えば、ＰＳＭＡ結合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞内で発現され得、産生されたＰＳＭＡ結合タンパク質を単離することができる。宿主細胞は、前記核酸分子又はベクターを含む。適切な宿主細胞としては、原核生物又は真核生物が挙げられる。ベクターは、宿主細胞内にタンパク質コード情報を導入するために使用することができるいずれかの分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。様々な細胞培養システム、例えば、これらに限定されないが、哺乳類、酵母、植物、又は昆虫を使用して組換えタンパク質を発現することもできる。原核生物又は真核生物宿主細胞を培養するために適切な条件は、当業者に周知である。タンパク質製造の目的のための細胞培養及びタンパク質発現を、あらゆる規模で、少量振盪フラスコから開始し大きな発酵槽まで、当業者に周知の技術を適用して行うことができる。
【0092】
１つの実施形態は、上記詳細のように結合タンパク質の製造方法を対象とし、前記方法は、次のステップ：（ａ）本明細書で定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質をコードする核酸を製造するステップ；（ｂ）発現ベクターに前記核酸を導入するステップ；（ｃ）宿主細胞内に前記発現ベクターを導入するステップ；（ｄ）宿主細胞を培養するステップ；（ｅ）ＰＳＭＡ結合タンパク質が発現される培養条件に宿主細胞を付し、それにより、本明細書で定義されているＰＳＭＡ結合タンパク質を産生させるステップ；（ｆ）必要に応じて、ステップ（ｅ）で産生されたＰＳＭＡ結合タンパク質を単離するステップ；及び（ｇ）必要に応じて、本明細書で定義されているさらなる機能的部分とＰＳＭＡ結合タンパク質を結合するステップを含む。
【0093】
概して、精製ＰＳＭＡ結合タンパク質の、培養混合液からの単離を、遠心分離、沈殿、凝結、クロマトグラフィーの種々の実施形態、ろ過、透析、濃縮及びこれらの組合せ、及びその他などの従来の方法及び当技術分野において周知の技術を適用して行うことができる。クロマトグラフィー法は、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、又はアフィニティクロマトグラフィーを含む。
【0094】
簡易精製のため、ＰＳＭＡ結合タンパク質を、分離材料とのさらに高い親和性を有する他のペプチド配列と融合することができる。好ましくは、ＰＳＭＡ結合タンパク質の機能性に有害な影響を与えないか、又は特異的プロテアーゼ切断部位の導入により精製後分離することができるような融合を選択する。かかる方法も当業者に公知である。
【実施例】
【0095】
本発明をさらに例証するために、以下の実施例を提供する。ＰＳＭＡとの結合をもたらすユビキチン（配列番号１又は配列番号２）の特定の修飾によって本発明を詳細に例示する。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、以下の実施例は上記説明に基づいて本発明の実用性を単に示すだけである。
【0096】
実施例１．ＰＳＭＡ結合タンパク質の同定
ライブラリー構築及びクローニング。無作為化アミノ酸位置を含むユビキチンライブラリーを、ｔｒｉｐｌｅｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ、独国）により合成あるいは合成トリヌクレオチドホスホラミダイト（ＥＬＬＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により生成される無作為化オリゴヌクレオチドによる社内合成して無作為化位置のシステイン及び他のアミノ酸残基を同時に除いてバランスのよいアミノ酸分布を達成した。
ライブラリー構築及びクローニング。無作為化アミノ酸位置を含むユビキチンライブラリーを、ｔｒｉｐｌｅｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ、独国）により合成あるいは合成トリヌクレオチドホスホラミダイト（ＥＬＬＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により生成される無作為化オリゴヌクレオチドによる社内合成して無作為化位置のシステイン及び他のアミノ酸残基を同時に除いてバランスのよいアミノ酸分布を達成した。
【0097】
いくつかのライブラリーを使用してＰＳＭＡ結合タンパク質を同定した。
ライブラリーＳＰＶ２：アミノ酸位置６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位に無作為化されたユビキチン（配列番号１）。
ライブラリーＳＰＬ２７：６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸に無作為化されたユビキチン（配列番号１）並びにユビキチンのＴ９及びＧ１０間に導入された６無作為化アミノ酸の挿入。アミノ酸残基Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＰｈｅは挿入において出現しなかった。
ライブラリーＳＰＶＦ１９：アミノ酸位置６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、７２位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位に無作為化されたビスユビキチン（配列番号２）（これは、両方のユビキチン部分における６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位の無作為化に対応する；ライブラリーＳＰＶＦ１９では、２つのユビキチン部分は直接結合している）。
ライブラリーＳＰＶ２：アミノ酸位置６位、８位、９位、１０位、１２位、４２位、４４位、４６位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位に無作為化されたユビキチン（配列番号１）。
ライブラリーＳＰＬ２７：６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、及び７２位に対応するアミノ酸に無作為化されたユビキチン（配列番号１）並びにユビキチンのＴ９及びＧ１０間に導入された６無作為化アミノ酸の挿入。アミノ酸残基Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＰｈｅは挿入において出現しなかった。
ライブラリーＳＰＶＦ１９：アミノ酸位置６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６８位、７０位、７２位、８２位、８４位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位に無作為化されたビスユビキチン（配列番号２）（これは、両方のユビキチン部分における６位、８位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位の無作為化に対応する；ライブラリーＳＰＶＦ１９では、２つのユビキチン部分は直接結合している）。
【0098】
対応するｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲにより増幅し、当業者に公知の標準的方法を用いて修飾ｐＣＤ８７ＳＡファージミド（本明細書ではｐＣＤ１２とも呼ぶ）でライゲートした。ｐＣＤ１２ファージミドは、修飾ｔｏｒＡリーダー配列を含み、Ｎ末端に追加のアミノ酸なしでタンパク質プロセシングを行う。ライゲーション混合物のアリコートを、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８（Ｌｕｃｉｇｅｎ）のエレクトロポレーションのために使用した。特に指定されない限り、確率された組換え遺伝子方法を、例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹに記載されているように使用した。
【0099】
標的発現、精製及び分析。
ヒトＰＳＭＡの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０４６０９；残基４５～７５０）をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と遺伝子的に融合し、次いで、Ｎ末端にＨｉｓタグ化した。ヒトコドン使用頻度を有する完全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により提供され、哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４にクローン化され、振盪フラスコ中２５０ｍｌの規模で、哺乳類Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で発現された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＰＳＭＡに対する抗体及びヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を用いて免疫ブロット解析により発現を分析した。大規模発現の１３０ｍｌ細胞培養液の上澄液を遠心分離し、タンパク質Ａ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のアフィニティクロマトグラフィーへの適用のためにろ過した。標的タンパク質を、穏やかなｐＨシフト（ｐＨ４）により溶離し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＸＫ１６／６００ゲルろ過カラムに適用した。９ｍｇのＨｉｓ－Ｆｃ－ＰＳＭＡを回収することができた；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びＳＥ－ＨＰＬＣ分析により標的タンパク質の純度を確認した。基質Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタメート（ＮＡＡＧ）に対する標的タンパク質の酵素活性を確認した。
ヒトＰＳＭＡの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列（ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０４６０９；残基４５～７５０）をヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と遺伝子的に融合し、次いで、Ｎ末端にＨｉｓタグ化した。ヒトコドン使用頻度を有する完全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により提供され、哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４にクローン化され、振盪フラスコ中２５０ｍｌの規模で、哺乳類Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内で発現された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＰＳＭＡに対する抗体及びヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を用いて免疫ブロット解析により発現を分析した。大規模発現の１３０ｍｌ細胞培養液の上澄液を遠心分離し、タンパク質Ａ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のアフィニティクロマトグラフィーへの適用のためにろ過した。標的タンパク質を、穏やかなｐＨシフト（ｐＨ４）により溶離し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＸＫ１６／６００ゲルろ過カラムに適用した。９ｍｇのＨｉｓ－Ｆｃ－ＰＳＭＡを回収することができた；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びＳＥ－ＨＰＬＣ分析により標的タンパク質の純度を確認した。基質Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタメート（ＮＡＡＧ）に対する標的タンパク質の酵素活性を確認した。
【0100】
ＴＡＴファージディスプレイによる一次選択。選択システムとしてＴＡＴファージディスプレイを用いて、ナイーブライブラリーを、標的ＰＳＭＡに対して濃縮した。形質転換受容性のある細菌ＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎｅ）を、ライブラリーを運ぶファージミドｐＣＤ１２を用いて形質転換した後、当業者に公知の標準的方法を用いてファージ増幅及び精製を行った。選択のため、標的タンパク質を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）タンパク質Ａ又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）タンパク質Ｇ上のヒトＰＳＭＡの細胞外ドメインのＦｃ融合として固定化した。ファージインキュベーション中の標的濃度は、２００ｎＭ（第１ラウンド）から１００ｎＭ（第２ラウンド）及び５０ｎＭ（第３ラウンド）及び２５ｎＭ（第４ラウンド）まで低下した。選択ラウンドの一部では、マウス血清を、血清安定性が増大した選択分子に添加した。標的ファージ複合体を、上澄液から磁気的に分離し、数回洗浄した。標的結合ファージをトリプシンによって溶離した。Ｆｃ結合多様体のファージライブラリーを枯渇させるため、ＩｇＧ１の固定Ｆｃフラグメント（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を有するファージの事前選択を、ラウンド２及び３前に行った。標的特異的ファージプールを同定するため、各選択ラウンドの溶離及び再増幅されたファージを、ファージプールＥＬＩＳＡにより分析した。中間結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）のウェルを、それぞれ、ＰＳＭＡ－Ｆｃ（２．５μｇ／ｍｌ）及びＩｇＧ１のＦｃフラグメント（２．５μｇ／ｍｌ）で被覆した。結合ファージを、α－Ｍ１３ ＨＲＰ結合抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。
【0101】
標的結合ファージプールの発現ベクターへのクローン化。ファージプールＥＬＩＳＡにおける標的と特異的結合を示す選択プールを、当技術分野において公知の方法に従ってＰＣＲにより増幅し、適切な制限ヌクレアーゼで切断し、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＩＢＡ ＧｍｂＨ）を含む発現ベクターｐＥＴ－２８ａの誘導体（Ｍｅｒｃｋ、独国）にライゲートした。
【0102】
単一コロニーヒット分析。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｍｅｒｃｋ、独国）の形質転換後、カナマイシン耐性単一コロニーを生育した。標的結合修飾ユビキチン多様体の発現を、自動誘導培地を用いて３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）における培養によって行った。細胞を収穫し、その後、それぞれ、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって化学的又は酵素的に、及び凍結／解凍サイクルにより機械的に溶解した。遠心分離後、得られた上澄液をＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ ３８４ ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）において固定された標的を用いてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。結合タンパク質の検出を、ＴＭＢ－Ｐｌｕｓ基質（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ、独国）と組み合わせてＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＨＲＰ複合体（ＩＢＡ ＧｍｂＨ）により行った。０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液の添加により反応を停止し、４５０ｎｍ対６２０ｎｍにおいてプレートリーダーで測定した。
【0103】
成熟ライブラリーの構築。各選択多様体の成熟のため、結合分子を２つのモジュールに分割するモジュールシャッフリングアプローチを使用した。配列番号１に基づいたユビキチン変異タンパク質のため、第一モジュールは、アミノ酸１～４０及び第二モジュールアミノ酸３２～７６を含む。配列番号２に基づいたビスユビキチン変異タンパク質のため、第一モジュールは、アミノ酸１～７７及び第二モジュールアミノ酸７１～１５２を含む。モジュールシャッフリング成熟ライブラリーのクローン化のため、多様体のいずれかのモジュールを一定に保持し、元のライブラリーのネイティブ第二モジュールと融合し、その逆も行った。２つのモジュールの融合を、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより行った。得られた成熟ライブラリーのｃＤＮＡを、上記ｐＣＤ１２を用いてライゲートした。あるいは、予め確定された分子又はプールのさらなる変異が誘発される変異性ＰＣＲアプローチを使用した。
【0104】
成熟選択及び分析
成熟選択及び分析親和性成熟のため、計画の２ラウンドを行った。両ラウンドのため、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントでの事前選択を行った。選択ラウンドの一部では、マウス血清を、血清安定性が増大した選択分子に添加した。特異的標的結合に関する成熟及び選択プールを分析するため、ファージプールＥＬＩＳＡを行い、次いで、ポジティブプールを発現ベクターｐＥＴ－２８ａにクローン化し、上記のようにヒットＥＬＩＳＡを行った。
成熟選択及び分析親和性成熟のため、計画の２ラウンドを行った。両ラウンドのため、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントでの事前選択を行った。選択ラウンドの一部では、マウス血清を、血清安定性が増大した選択分子に添加した。特異的標的結合に関する成熟及び選択プールを分析するため、ファージプールＥＬＩＳＡを行い、次いで、ポジティブプールを発現ベクターｐＥＴ－２８ａにクローン化し、上記のようにヒットＥＬＩＳＡを行った。
【0105】
実施例２．ＰＳＭＡ結合タンパク質の発現及び精製
ＰＳＭＡ結合分子を当業者に公知の標準的方法を用いて発現ベクターにクローン化し、精製して下記のように分析した。
ＰＳＭＡ結合分子を当業者に公知の標準的方法を用いて発現ベクターにクローン化し、精製して下記のように分析した。
【0106】
Ｔ７プロモーターの規制下、低複製プラスミドシステムを用いてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）内で、全構築物は発現された。培地（自動誘導培地）中に含まれるラクトースにより誘導後、タンパク質を、ほとんど可溶な形態で細胞質によって産生した。新たな確定されたプラスミドで形質転換後、単一コロニーから、全ての一夜の培養液に播種した。
【0107】
Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）に従ってＺＹＭ５０５２自動誘導培地中、ＰＳＭＡ結合タンパク質を産生した。２ｘＹＴ培地中２０～１００ｍＬの容量で振盪フラスコ中、一夜の培養液を飽和するまで生育した。主培養液を０．０５～０．１のＯＤ６００まで接種し、整流装置を用いても用いなくても振盪フラスコ中２００ｒｐｍの回転式振盪機で３０℃、２４時間まで５０μｇ／ｍＬカナマイシンと共にＺＹＭ５０５２中でインキュベートした。発現レベルに応じて、各々３５０ｍＬ培地を含む１Ｌ振盪フラスコ中、又は各々１Ｌ培地を含む５Ｌフラスコ中のいずれかを使用した。
【0108】
親和性タグを有するＡｆｆｉｌｉｎタンパク質を、アフィニティクロマトグラフィー及びゲルろ過により精製した。アフィニティクロマトグラフィー精製後、Aｋｔａシステム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ ＨＰＬＣ又はＳＥＣ）を行った。カラムは１２０ｍｌの容積であり、２ＣＶと平衡を保っていた。サンプルを、１ｍｌ／分の流速で適用した。分別捕集は、シグナル強度が１０ｍＡＵに達したときに開始する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析後、ポジティブフラクションをプールし、これらのタンパク質濃度を測定した。
【0109】
親和性タグを有しない二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を、エンドトキシンの量を低減するために陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次いで、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
【0110】
最終的に、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００ＨＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。さらなる分析としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣが挙げられる。モル吸光係数を用いて２８０ｎｍにおいて吸光度を測定することによってタンパク質濃度を決定した。例えば、配列番号５の純度は、ＳＥ－ＨＰＬＣによれば９８％である。Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム及びＰＬＲＰ－Ｓ（５μｍ、３００Å）カラム（Ａｇｉｌｅｎｔｓ）を用いてＲＰクロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を行った。
【0111】
実施例３．ＰＳＭＡ結合タンパク質は高温において安定である
本発明の結合タンパク質の熱安定性を、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によって決定した。各サンプルを０．１μｇ／μＬの濃度において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ９６（Ｒｏｃｈｅ）に移し、ＳＹＰＲＯ橙色染料を適切な希釈で添加した。２０～９０℃の温度勾配を、毎分１℃の加熱速度でプログラムした（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、Ｒｏｃｈｅ）。４６５ｎｍの励起波長及び５８０ｎｍの発光波長において蛍光を常に測定した（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、Ｒｏｃｈｅ）。熱的アンフォールディング転移の中間点（Ｔｍ、融点）を、図１，図２、及び図３に選択された変異タンパク質について示す。本発明のＰＳＭＡ結合タンパク質は、８５℃以下の融点を有する。配列番号５のＴｍは６９．３℃であり、配列番号６のＴｍは８４．２℃である。選択された二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の熱安定性について、表２参照。
本発明の結合タンパク質の熱安定性を、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によって決定した。各サンプルを０．１μｇ／μＬの濃度において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ９６（Ｒｏｃｈｅ）に移し、ＳＹＰＲＯ橙色染料を適切な希釈で添加した。２０～９０℃の温度勾配を、毎分１℃の加熱速度でプログラムした（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、Ｒｏｃｈｅ）。４６５ｎｍの励起波長及び５８０ｎｍの発光波長において蛍光を常に測定した（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０、Ｒｏｃｈｅ）。熱的アンフォールディング転移の中間点（Ｔｍ、融点）を、図１，図２、及び図３に選択された変異タンパク質について示す。本発明のＰＳＭＡ結合タンパク質は、８５℃以下の融点を有する。配列番号５のＴｍは６９．３℃であり、配列番号６のＴｍは８４．２℃である。選択された二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の熱安定性について、表２参照。
【0112】
実施例４．ＰＳＭＡ結合タンパク質の分析（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＰＲランニングバッファーと平衡を保った。表面露出カルボン酸を、ＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を通過させることにより活性化し、反応性エステル基を得た。標的に対して１：３の比（ｈＩｇＧ－Ｆｃ：標的）で、７００～１５００ＲＵ ＰＳＭＡ－Ｆｃ（オンリガンド）をフローセルに固定し、ＩｇＧ－Ｆｃ（オフリガンド）を別のフローセルに固定した。リガンド固定化後のアタノールアミンの注射を使用して未反応のＮＨＳ基を遮断した。リガンド結合時、タンパク質分析物を表面に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答又は応答単位（ＲＵ）としてプロットした。分析物を、３０μｌ／分の流速で段階希釈してチップに適用した。会合を１２０秒行い、解離を３６０秒行った。各実行後、チップ表面を３０μｌ再生バッファーで再生し、ランニングバッファーと平衡を保った。希釈系列はポジティブコントロールの役割をしたが、未修飾ユビキチンの希釈系列はネガティブコントロールである。コントロールサンプルを３０μｌ／分の流速でマトリックスに適用したが、これらは６０秒間で会合し、１２０秒間で解離した。再生及び再平衡を前述のように行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用により結合試験を行い；データ評価を、ラングミュア１：１モデル（ＲＩ＝０）を用いて、製造者により提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより操作した。１：１ラングミュアモデルでデータをフィッティング後、例えば、ＫＤ値を算出し、図１、図２、図３、及び表２に示した。評価された解離定数（ＫＤ）をオフターゲットに対して標準化し、示した。例えば、配列番号５のＫＤは、ｈＰＳＭＡ－Ｆｃに対して１．８ｎＭであり（１１００ＲＵ、タンパク質Ａによる固定化）；配列番号６のＫＤは１１３ｎＭであり、配列番号２２のＫＤは４８４ｎＭであり、配列番号４５のＫＤは３３ｎＭであり、配列番号２６のＫＤは９．３ｎＭである。表２は、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のＳＰＲにより決定された結合親和性及び温度安定性（実施例３参照）を示す。
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＰＲランニングバッファーと平衡を保った。表面露出カルボン酸を、ＥＤＣ及びＮＨＳの混合物を通過させることにより活性化し、反応性エステル基を得た。標的に対して１：３の比（ｈＩｇＧ－Ｆｃ：標的）で、７００～１５００ＲＵ ＰＳＭＡ－Ｆｃ（オンリガンド）をフローセルに固定し、ＩｇＧ－Ｆｃ（オフリガンド）を別のフローセルに固定した。リガンド固定化後のアタノールアミンの注射を使用して未反応のＮＨＳ基を遮断した。リガンド結合時、タンパク質分析物を表面に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答又は応答単位（ＲＵ）としてプロットした。分析物を、３０μｌ／分の流速で段階希釈してチップに適用した。会合を１２０秒行い、解離を３６０秒行った。各実行後、チップ表面を３０μｌ再生バッファーで再生し、ランニングバッファーと平衡を保った。希釈系列はポジティブコントロールの役割をしたが、未修飾ユビキチンの希釈系列はネガティブコントロールである。コントロールサンプルを３０μｌ／分の流速でマトリックスに適用したが、これらは６０秒間で会合し、１２０秒間で解離した。再生及び再平衡を前述のように行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用により結合試験を行い；データ評価を、ラングミュア１：１モデル（ＲＩ＝０）を用いて、製造者により提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより操作した。１：１ラングミュアモデルでデータをフィッティング後、例えば、ＫＤ値を算出し、図１、図２、図３、及び表２に示した。評価された解離定数（ＫＤ）をオフターゲットに対して標準化し、示した。例えば、配列番号５のＫＤは、ｈＰＳＭＡ－Ｆｃに対して１．８ｎＭであり（１１００ＲＵ、タンパク質Ａによる固定化）；配列番号６のＫＤは１１３ｎＭであり、配列番号２２のＫＤは４８４ｎＭであり、配列番号４５のＫＤは３３ｎＭであり、配列番号２６のＫＤは９．３ｎＭである。表２は、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のＳＰＲにより決定された結合親和性及び温度安定性（実施例３参照）を示す。
【0113】
【0114】
実施例５．機能的特性化：細胞表面発現ＰＳＭＡとの結合（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーを使用して細胞表面露出ＰＳＭＡとのＰＳＭＡ結合タンパク質の結合を分析した。ＰＳＭＡ過剰発現ヒト前立腺がんセルラインＬＮＣａＰ、ＰＳＭＡ過剰発現トランスフェクトＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞、ＰＳＭＡ非発現ＰＣ３細胞及び空ベクターコントロールＨＥＫ２９３－ｐＥｎｔｒｙ細胞を使用した。細胞をトリプシン処理し、ＦＣＳを含む培地に再懸濁し、洗浄し、予備冷却されたＦＡＣＳブロッキングバッファーで染色した。１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を細胞染色のために調製し、１００μｌを、それぞれ、各セルラインに対して三通り９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェル中に充填した。いくつかの実験において、ポジティブコントロールとして、ＰＳＭＡ結合タンパク質の異なる濃度、例えば、５０ｎＭ、又は０．５μｇ／ｍｌモノクローナル抗ヒトＰＳＭＡ抗体（クローンＬＮＩ－１７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３４２５０２）を、ＰＳＭＡ過剰発現及びコントロール細胞に添加した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号７１参照）を含んだ。４５分後、上澄液を取り出し、ＦＡＣＳブロッキングバッファー中に１：３００希釈した、１００μｌ／ウェルウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た；Ａ００６２６）を添加した。抗ＰＳＭＡ抗体を、ポジティブコントロールウェル中において１：１０００希釈の抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ－１０６８０）を用いて検出した。他のウェルからの抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体の除去後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；Ａ１１００８）を１：１０００希釈で適用した。励起波長４８８ｎｍ及び発光波長５２５／３０ｎｍにおいてＭｅｒｃｋ－ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ装置でフローサイトメトリー測定を行った。本発明の全てのＰＳＭＡ結合タンパク質（二量体を含む）は、ＬＮＣａＰ細胞及びＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞の細胞表面発現ＰＳＭＡと結合していること（図１、図２、図３参照；結合は、図において「はい」で示す）、及びＰＳＭＡネガティブセルラインＨＥＫ２９３－ｐＥｎｔｒｙ又はＰＣ３細胞で結合しないことを示した。ユビキチンは、ＬＮＣａＰ細胞及びＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞で結合しないことを示した。ＰＳＭＡ発現細胞でのポジティブ結合も、抗ＰＳＭＡ抗体に対して観察された。例えば、配列番号４は、ＨＥＫ－ＰＳＭＡ及びＬＮＣａＰ細胞との強い細胞結合を示した。
フローサイトメトリーを使用して細胞表面露出ＰＳＭＡとのＰＳＭＡ結合タンパク質の結合を分析した。ＰＳＭＡ過剰発現ヒト前立腺がんセルラインＬＮＣａＰ、ＰＳＭＡ過剰発現トランスフェクトＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞、ＰＳＭＡ非発現ＰＣ３細胞及び空ベクターコントロールＨＥＫ２９３－ｐＥｎｔｒｙ細胞を使用した。細胞をトリプシン処理し、ＦＣＳを含む培地に再懸濁し、洗浄し、予備冷却されたＦＡＣＳブロッキングバッファーで染色した。１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を細胞染色のために調製し、１００μｌを、それぞれ、各セルラインに対して三通り９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェル中に充填した。いくつかの実験において、ポジティブコントロールとして、ＰＳＭＡ結合タンパク質の異なる濃度、例えば、５０ｎＭ、又は０．５μｇ／ｍｌモノクローナル抗ヒトＰＳＭＡ抗体（クローンＬＮＩ－１７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；３４２５０２）を、ＰＳＭＡ過剰発現及びコントロール細胞に添加した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号７１参照）を含んだ。４５分後、上澄液を取り出し、ＦＡＣＳブロッキングバッファー中に１：３００希釈した、１００μｌ／ウェルウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから得た；Ａ００６２６）を添加した。抗ＰＳＭＡ抗体を、ポジティブコントロールウェル中において１：１０００希釈の抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ－１０６８０）を用いて検出した。他のウェルからの抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体の除去後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た；Ａ１１００８）を１：１０００希釈で適用した。励起波長４８８ｎｍ及び発光波長５２５／３０ｎｍにおいてＭｅｒｃｋ－ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ装置でフローサイトメトリー測定を行った。本発明の全てのＰＳＭＡ結合タンパク質（二量体を含む）は、ＬＮＣａＰ細胞及びＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞の細胞表面発現ＰＳＭＡと結合していること（図１、図２、図３参照；結合は、図において「はい」で示す）、及びＰＳＭＡネガティブセルラインＨＥＫ２９３－ｐＥｎｔｒｙ又はＰＣ３細胞で結合しないことを示した。ユビキチンは、ＬＮＣａＰ細胞及びＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞で結合しないことを示した。ＰＳＭＡ発現細胞でのポジティブ結合も、抗ＰＳＭＡ抗体に対して観察された。例えば、配列番号４は、ＨＥＫ－ＰＳＭＡ及びＬＮＣａＰ細胞との強い細胞結合を示した。
【0115】
実施例６．細胞表面発現ＰＳＭＡとの結合（免疫細胞化学及び蛍光顕微鏡）
５０ｎＭの濃度を、ＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ細胞及びコントロールセルラインＰＣ３（ＰＳＭＡ発現なし）で試験した。ビスユビキチンを、非ＰＳＭＡ結合タンパク質に対するコントロールとして使用し、１μｇ／ｍｌ抗ＰＳＭＡ抗体はＰＳＭＡ結合に対するポジティブコントロールの役割をした。ポリ－Ｄ－溶解素被覆Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ－Ｓｌｉｄｅｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に１×１０５細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種した。７２時間を超えて培養後、細胞をメタノール（５分、－２０℃）で固定し、次いで、遮断（ＰＢＳ中の５％ウマ胎児血清、１時間）し、室温で４５分間５０ｎＭのＰＳＭＡ結合タンパク質と共にインキュベーションした。ウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（１：５００）と共に１時間、その後、抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８抗体（１：１０００）と共に１時間のインキュベーションによりＰＳＭＡ結合を検出した。４μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで核を染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。ＬＮＣａＰ細胞の二量体配列番号５４、二量体配列番号５５及び単量体配列番号２５のＰＳＭＡ結合を確証したが、ＰＣ３細胞との結合は観察できなかった。
５０ｎＭの濃度を、ＰＳＭＡ発現ＬＮＣａＰ細胞及びコントロールセルラインＰＣ３（ＰＳＭＡ発現なし）で試験した。ビスユビキチンを、非ＰＳＭＡ結合タンパク質に対するコントロールとして使用し、１μｇ／ｍｌ抗ＰＳＭＡ抗体はＰＳＭＡ結合に対するポジティブコントロールの役割をした。ポリ－Ｄ－溶解素被覆Ｌａｂ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｃｈａｍｂｅｒ－Ｓｌｉｄｅｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に１×１０５細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種した。７２時間を超えて培養後、細胞をメタノール（５分、－２０℃）で固定し、次いで、遮断（ＰＢＳ中の５％ウマ胎児血清、１時間）し、室温で４５分間５０ｎＭのＰＳＭＡ結合タンパク質と共にインキュベーションした。ウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（１：５００）と共に１時間、その後、抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８抗体（１：１０００）と共に１時間のインキュベーションによりＰＳＭＡ結合を検出した。４μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで核を染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。ＬＮＣａＰ細胞の二量体配列番号５４、二量体配列番号５５及び単量体配列番号２５のＰＳＭＡ結合を確証したが、ＰＣ３細胞との結合は観察できなかった。
【0116】
実施例７．機能的特性化：ＰＳＭＡ結合タンパク質は種晶組織で発現されたＰＳＭＡと結合する（免疫組織化学）
凍結ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍及びＦ９同系移植腫瘍スライスの組織片を使用して、本発明の結合タンパク質を分析した。組織片を、１０分間氷冷アセトンで固定した。ＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号７１参照）を含んだ。遮断し、配列番号５４の５０ｎＭ及び１０ｎＭの二量体、配列番号５２及び配列番号５３の１００ｎＭ及び１０ｎＭの二量体並びに１００ｎＭのコントロールタンパク質未修飾ビスユビキチンと共にインキュベートした後、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（１：５００）と共に１時間、切片をインキュベートした。次いで、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ（商標）ポリマー（Ｌｅｉｃａ、ＲＥ７２９０－ＣＥ）で、切片を処理した。ＡＥＣ溶液（ＤＡＫＯ）で１分間、切片をインキュベートしてタンパク質の結合を可視化した。核をマイアーのヘマラム溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１０９２４９）で染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。２μｇ／ｍｌの抗ＰＳＭＡ抗体ＧＣＰ－０４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１４μｇ／ｍｌのＧＣＰ－０５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆiｃ）は、ポジティブコントロールの役割をした。ＬＮＣａＰ腫瘍組織の５０ｎＭヘテロ二量体（配列番号５４）及び１００ｎＭホモ二量体（配列番号５２及び配列番号５３）の強いＰＳＭＡ結合を確証した。抗ＰＳＭＡ抗体ＧＣＰ－０４及びＧＣＰ－０５は同じ染色パターンを示したが、未修飾ユビキチンは染色しなかった。Ｆ９腫瘍組織の非特異的染色は観察されなかった。
凍結ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍及びＦ９同系移植腫瘍スライスの組織片を使用して、本発明の結合タンパク質を分析した。組織片を、１０分間氷冷アセトンで固定した。ＰＳＭＡ結合タンパク質の二量体は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグ（例えば、配列番号７１参照）を含んだ。遮断し、配列番号５４の５０ｎＭ及び１０ｎＭの二量体、配列番号５２及び配列番号５３の１００ｎＭ及び１０ｎＭの二量体並びに１００ｎＭのコントロールタンパク質未修飾ビスユビキチンと共にインキュベートした後、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐタグ抗体（１：５００）と共に１時間、切片をインキュベートした。次いで、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ（商標）ポリマー（Ｌｅｉｃａ、ＲＥ７２９０－ＣＥ）で、切片を処理した。ＡＥＣ溶液（ＤＡＫＯ）で１分間、切片をインキュベートしてタンパク質の結合を可視化した。核をマイアーのヘマラム溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１０９２４９）で染色した。全インキュベーションステップを室温で行った。２μｇ／ｍｌの抗ＰＳＭＡ抗体ＧＣＰ－０４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１４μｇ／ｍｌのＧＣＰ－０５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆiｃ）は、ポジティブコントロールの役割をした。ＬＮＣａＰ腫瘍組織の５０ｎＭヘテロ二量体（配列番号５４）及び１００ｎＭホモ二量体（配列番号５２及び配列番号５３）の強いＰＳＭＡ結合を確証した。抗ＰＳＭＡ抗体ＧＣＰ－０４及びＧＣＰ－０５は同じ染色パターンを示したが、未修飾ユビキチンは染色しなかった。Ｆ９腫瘍組織の非特異的染色は観察されなかった。
【0117】
実施例８．ＰＳＭＡ結合タンパク質の競合分析
単離ＰＳＭＡ－Ａｆｆｉｌｉｎタンパク質が同じ又は異なるＰＳＭＡエピトープと結合するかどうかを調査するため、次のアッセイを行った：ＰＳＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質（６０ｎＭ）を、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて組換えタンパク質Ａと結合されたＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定し、１０００応答単位（ＲＵ）を得た。第一実験では、配列番号２５（モチーフＫＨＮＴＷ）及び配列番号１５（モチーフＧＦＡＨＲ及びＷＴＴＴＦ）を、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ ３０μｌ／分の流速で１つの規定濃度（０．５μＭ）で注射した。第二実験では、同じフローチャネルに、先ず５００ｎＭの配列番号２５を、チップ表面が飽和するまで事前ロードした。次のステップでは、５００ｎＭの配列番号１５を、第一実験と同様に適用した。あるいは、第二実験では、同じフローチャネルに、先ず５００ｎＭの配列番号１５を、チップ表面が飽和するまで事前ロードし、次いで、５００ｎＭの配列番号２５をロードした。
単離ＰＳＭＡ－Ａｆｆｉｌｉｎタンパク質が同じ又は異なるＰＳＭＡエピトープと結合するかどうかを調査するため、次のアッセイを行った：ＰＳＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質（６０ｎＭ）を、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて組換えタンパク質Ａと結合されたＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定し、１０００応答単位（ＲＵ）を得た。第一実験では、配列番号２５（モチーフＫＨＮＴＷ）及び配列番号１５（モチーフＧＦＡＨＲ及びＷＴＴＴＦ）を、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳＴ ３０μｌ／分の流速で１つの規定濃度（０．５μＭ）で注射した。第二実験では、同じフローチャネルに、先ず５００ｎＭの配列番号２５を、チップ表面が飽和するまで事前ロードした。次のステップでは、５００ｎＭの配列番号１５を、第一実験と同様に適用した。あるいは、第二実験では、同じフローチャネルに、先ず５００ｎＭの配列番号１５を、チップ表面が飽和するまで事前ロードし、次いで、５００ｎＭの配列番号２５をロードした。
【0118】
実験は、モチーフＫＨＮＴＷを有するＰＳＭＡ結合タンパク質の結合がモチーフＧＦＡＨＲ及びＷＴＴＴＦを有するＰＳＭＡ結合タンパク質の存在による影響を受けなかったこと、その逆もまた同じであることを示した。したがって、これらのＰＳＭＡ結合タンパク質が異なる又は重複しないＰＳＭＡエピトープと、すなわち、異なる表面露出アミノ酸と結合するという結論に至る競合は観察されなかった。
【0119】
実施例９：ＤＯＴＡとの融合タンパク質の標識化
二量体タンパク質を、室温で３時間、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．０中の２０倍過剰のマレイミド－ＤＯＴＡ（２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、ＣｈｅＭａｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。ＤＯＴＡ分子と相互作用するかもしれない金属イオンを低減するため、全カラム及びＡＫＴＡ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、３０分間、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液と共にインキュベートした。溶液を調製するため、金属フリー又は金属低減成分のみを使用した。インキュベーション後、サンプルを、１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０～５．８中のゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、非結合ＤＯＴＡ分子から分離した。標識化タンパク質のサンプルを、室温で１時間、５ｍＭ塩化鉄（ＩＩ）と共にインキュベートして、ＤＯＴＡ分子が放射性同位体との結合に使用可能であることを証明した。インキュベーション後、非結合鉄を、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて除去した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を使用して、標識化の程度を決定した。
二量体タンパク質を、室温で３時間、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．０中の２０倍過剰のマレイミド－ＤＯＴＡ（２，２’，２’’－（１０－（２－（（２－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）エチル）アミノ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸、ＣｈｅＭａｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。ＤＯＴＡ分子と相互作用するかもしれない金属イオンを低減するため、全カラム及びＡＫＴＡ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、３０分間、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液と共にインキュベートした。溶液を調製するため、金属フリー又は金属低減成分のみを使用した。インキュベーション後、サンプルを、１００ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ５．０～５．８中のゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、非結合ＤＯＴＡ分子から分離した。標識化タンパク質のサンプルを、室温で１時間、５ｍＭ塩化鉄（ＩＩ）と共にインキュベートして、ＤＯＴＡ分子が放射性同位体との結合に使用可能であることを証明した。インキュベーション後、非結合鉄を、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて除去した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を使用して、標識化の程度を決定した。
【0120】
実施例１０：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を次のように行った：融合タンパク質を、Ｃ１８－Ｐ１０－ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＺＴＣ１８Ｓ０９６）を用いて精製・濃縮した。チップを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで溶離した。サンプルを２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液で処理し、２，５－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）マトリックス（Ｂｒｕｋｅｒ、カタログ番号８２３１８２９）に包埋した。融合タンパク質の質量を、ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）ｓｐｅｅｄ質量分析装置（Ｂｒｕｋｅｒ）で測定した。タンパク質校正標準（Ｂｒｕｋｅｒ、パーツ番号８２０６３５５及びパーツ番号８２０７２３４）を、ａｕｔｏｆｌｅｘ ｓｐｅｅｄ質量分析装置の調節のために使用した。
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を次のように行った：融合タンパク質を、Ｃ１８－Ｐ１０－ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＺＴＣ１８Ｓ０９６）を用いて精製・濃縮した。チップを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで溶離した。サンプルを２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液で処理し、２，５－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）マトリックス（Ｂｒｕｋｅｒ、カタログ番号８２３１８２９）に包埋した。融合タンパク質の質量を、ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）ｓｐｅｅｄ質量分析装置（Ｂｒｕｋｅｒ）で測定した。タンパク質校正標準（Ｂｒｕｋｅｒ、パーツ番号８２０６３５５及びパーツ番号８２０７２３４）を、ａｕｔｏｆｌｅｘ ｓｐｅｅｄ質量分析装置の調節のために使用した。
【0121】
ＤＯＴＡ標識を有する及び有しない融合タンパク質を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により分析し、ピークを比較した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析は、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質に標識化されたＤＯＴＡ分子は、塩化鉄（ＩＩ）分子との結合に使用可能であることを示している。
【0122】
ＫＤは、融合タンパク質の標識化後に僅かに変化するが、標識化は、標的への融合タンパク質の親和性に有意に影響を与えるとは言えない。結果を表３に纏めている。
【0123】
【0124】
実施例１１．ＰＳＭＡ結合タンパク質の血清安定性（フローサイトメトリー）
たとえ血清が存在してもＰＳＭＡ結合タンパク質が安定することを分析した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；例えば、配列番号７８参照）を含んだ。ＧＦＡＨＲを有するユビキチン変異タンパク質、又はこれと８０％同一性を有するモチーフ、例えば、配列番号４又は配列番号１１をベースとするＰＳＭＡ結合タンパク質を、３７℃０時間又は２４時間、１００％マウス血清中１μＭ～５．６ｐＭの段階希釈と共にインキュベートした。１００μｌのＡｆｆｉｌｉｎ血清溶液を使用してＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞における血清安定性を分析した。上澄みを取り出した後、１μｇ／ｍｌ抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｆ１８０４）及び抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１０６８０）を用いて結合を証明した。ＦＡＣＳ分析は、マウス血清における２４時間インキュベーション後でさえＰＳＭＡ結合を確認した（表４参照）。さらに、ＰＳＭＡ結合タンパク質を試験し、ＰＳＭＡとの結合を血清の存在下でも確認した。
たとえ血清が存在してもＰＳＭＡ結合タンパク質が安定することを分析した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、精製及び検出目的のため、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；例えば、配列番号７８参照）を含んだ。ＧＦＡＨＲを有するユビキチン変異タンパク質、又はこれと８０％同一性を有するモチーフ、例えば、配列番号４又は配列番号１１をベースとするＰＳＭＡ結合タンパク質を、３７℃０時間又は２４時間、１００％マウス血清中１μＭ～５．６ｐＭの段階希釈と共にインキュベートした。１００μｌのＡｆｆｉｌｉｎ血清溶液を使用してＨＥＫ２９３－ＰＳＭＡ細胞における血清安定性を分析した。上澄みを取り出した後、１μｇ／ｍｌ抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｆ１８０４）及び抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１０６８０）を用いて結合を証明した。ＦＡＣＳ分析は、マウス血清における２４時間インキュベーション後でさえＰＳＭＡ結合を確認した（表４参照）。さらに、ＰＳＭＡ結合タンパク質を試験し、ＰＳＭＡとの結合を血清の存在下でも確認した。
【0125】
【0126】
実施例１２．ＰＳＭＡ結合タンパク質の血清安定性（ＥＬＩＳＡ）
高結合９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、７８１０６１）を、４℃で一夜、２．５μｇ／ｍｌのＰＳＭＡ－Ｆｃで固定した。Ａｆｆｉｌｉｎ－１９１８７１（Ｃ末端ＳＡＣを有する；配列番号５）の段階希釈及びルテチウムＬｕ３＋で標識化された配列番号５ Ｄｏｔａを、３７℃で一夜、１００％マウス血清中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、室温において２時間、３％ＢＳＡ／０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで遮断した。血清の存在下、０時間又は２４時間インキュベーション後の段階希釈を、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、ウェルを、室温で１時間、ビオチン化抗ユビキチン抗体（１：１０００）と共にインキュベートした。結合を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：１０，０００）で可視化した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、２４時間の血清インキュベーション後、ＫＤの有意なシフトを示さない。例えば、ＥＬＩＳＡ分析は、０．７５±０．０２のＫＤを有するマウス血清中の２４時間インキュベーション後でさえ、配列番号５及びルテチウムＬｕ３＋で標識化された配列番号５ Ｄｏｔａの、ＰＳＭＡとの結合を確証した（マウス血清中０時間のインキュベーションにおける０．５３±０．０２のＫＤと比較して）。
高結合９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、７８１０６１）を、４℃で一夜、２．５μｇ／ｍｌのＰＳＭＡ－Ｆｃで固定した。Ａｆｆｉｌｉｎ－１９１８７１（Ｃ末端ＳＡＣを有する；配列番号５）の段階希釈及びルテチウムＬｕ３＋で標識化された配列番号５ Ｄｏｔａを、３７℃で一夜、１００％マウス血清中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、室温において２時間、３％ＢＳＡ／０．５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで遮断した。血清の存在下、０時間又は２４時間インキュベーション後の段階希釈を、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートでインキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、ウェルを、室温で１時間、ビオチン化抗ユビキチン抗体（１：１０００）と共にインキュベートした。結合を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：１０，０００）で可視化した。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、２４時間の血清インキュベーション後、ＫＤの有意なシフトを示さない。例えば、ＥＬＩＳＡ分析は、０．７５±０．０２のＫＤを有するマウス血清中の２４時間インキュベーション後でさえ、配列番号５及びルテチウムＬｕ３＋で標識化された配列番号５ Ｄｏｔａの、ＰＳＭＡとの結合を確証した（マウス血清中０時間のインキュベーションにおける０．５３±０．０２のＫＤと比較して）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】