特許 7499503 蛋白質の構造変化の評価方法、評価装置および評価プログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-06

(45)【発行日】2024-06-14

(54)【発明の名称】蛋白質の構造変化の評価方法、評価装置および評価プログラム

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/19 20060101AFI20240607BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240607BHJP

【ＦＩ】

G01N21/19

G01N21/64 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020104065

(22)【出願日】2020-06-16

(65)【公開番号】P2021196301

(43)【公開日】2021-12-27

【審査請求日】2023-05-26

(73)【特許権者】

【識別番号】000232689

【氏名又は名称】日本分光株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100092901

【弁理士】

【氏名又は名称】岩橋 祐司

(74)【代理人】

【識別番号】100188260

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 愼二

(72)【発明者】

【氏名】堀口 靖夫

(72)【発明者】

【氏名】赤尾 賢一

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 仁子

(72)【発明者】

【氏名】早川 広志

【審査官】小野寺 麻美子

(56)【参考文献】

【文献】特開昭５３－０４２７９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－２４８２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１２３４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５０７４８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第４１６２８５１（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／９５８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させる手順と、
前記外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて蛍光スペクトル測定およびＣＤスペクトル測定を実行する手順と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルの各々の経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する手順と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示する手順と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する手順と、
を含むことを特徴とする蛋白質の構造変化の評価方法。

【請求項2】

請求項１記載の蛋白質の構造変化の評価方法において、
前記外部刺激としては、温度、ｐＨ、圧力、電場、磁場、光、応力、蛋白濃度、バッファーの種類、バッファー濃度のいずれかであることを特徴とする蛋白質の構造変化の評価方法。

【請求項3】

請求項１または２記載の蛋白質の構造変化の評価方法において、前記蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を表１のように評価することを特徴とする蛋白質の構造変化の評価方法。
［表１］
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
同時相関Φ 異時相関Ψ λ１とλ２の交差ピークにおける各スペクトル変化
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
正 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は同方向で同時に起こる
正 正 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより先に起こる
正 負 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は異方向で同時に起こる
負 正 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 負 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより先に起こる
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
λ１：蛋白質の三次構造の変化に反応する蛍光スペクトルの波長
λ２：蛋白質の二次構造の変化に反応するＣＤスペクトルの波長

【請求項4】

請求項１から３のいずれかに記載の蛋白質の構造変化の評価方法において、
複数の蛋白質試料について、試料毎に前記二次元相関スペクトルを画像データとして取得し、これらの画像データに対して、画像用の主成分分析を実行することを特徴とする蛋白質の構造変化の評価方法。

【請求項5】

蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させながら、当該外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルをデータとして受信する受信手段と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、前記蛍光スペクトルおよび前記ＣＤスペクトルの各々のデータの経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する演算手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示させる表示指令手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する評価手段と、
を備えることを特徴とする蛋白質の構造変化の評価装置。

【請求項6】

蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させながら、当該外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルをデータとして受信する受信手段と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、測定された前記蛍光スペクトルおよび前記ＣＤスペクトルの各々の経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する演算手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示させる表示指令手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する評価手段と、してコンピュータを機能させることを特徴とする蛋白質の構造変化の評価プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は蛋白質の構造変化の評価方法に関し、蛋白質の産業利用分野に属する。

【背景技術】

【0002】

円二色性スペクトルや蛍光スペクトルは、蛋白質の高次構造の変化を鋭敏に反映することが知られており、バイオ医薬品をはじめとする蛋白質の産業利用分野において、これらの測定が蛋白質の構造変化を評価する手法として重要な役割を担っている。

【0003】

蛋白質の構造は、大きく一次、二次、三次構造、四次構造に区分され、
一次構造は、蛋白質のアミノ酸配列を指し、
二次構造は、蛋白質一次構造の部分的な立体構造（αヘリックスやβシート）を指し、
三次構造は、蛋白質二次構造が空間的にまとまってできた蛋白質１分子がとる立体構造（コンフォメーション）を指し、
四次構造は、複数のポリペプチド鎖が集まって複合蛋白質を形成している状態を指す、
とされている。以下、ＣＤスペクトルや蛍光スペクトルを用いて蛋白質の高次構造の変化を評価する既存の手法（文献１から３）について説明する。

【0004】

＜円二色性測定＞
文献１は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸のＣＤスペクトルの測定例である。ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、水溶液中でのｐＨの変化に伴って、その二次構造が「αヘリックス－ランダムコイル転移」することが知られている。文献１の図３（ポリペプチドのＣＤ）を見ると、ｐＨ４．３及びｐＨ１１におけるポリ－Ｌ－グルタミン酸のＣＤスペクトルが４００～２００ｎｍの波長範囲で表示されている。

【0005】

文献１のＣＤスペクトルによると、ｐＨ４．３において、２２５ｎｍ付近に負のコットン効果が表れ、そのピークの大きさがαヘリックス含量の目安とされている。また、２００ｎｍ以下の短波長領域に、強い正のコットン効果が表れている。一方、ｐＨ１１の方は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸がランダムコイルの状態で存在するため、上記のコットン効果が著しく変化している。

【0006】

このように、ＣＤスペクトル中の特定の波長域のＣＤ強度の変化に基づいて、蛋白質の二次構造の変化を推定できることが説明されている。

【0007】

＜蛍光測定＞
蛍光測定は、蛋白質の三次構造の変化を評価する方法として用いることができる。例えば、蛋白質分子に内在する芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）を蛍光プローブとすることが多い。

【0008】

文献２には、このようなアミノ酸由来の蛍光スペクトルに基づいて、ｐＨや圧力などの物理パラメータを変化させた際の蛋白質の立体構造の変性過程を評価する手法が紹介されている。文献２の図１（左）は、卵白アレルゲン蛋白質のｐＨ条件を「４→１０．４→１２」の順に変えて測定した蛍光スペクトルを示している。この図では、蛍光スペクトルのピーク波長が３０４ｎｍ（チロシン由来の蛍光）から３４０ｎｍ（チロシネート由来の蛍光）へとシフトしている。このことから、塩基性側へのｐＨ変化に伴って、チロシンの側鎖ＯＨ基からＨ＋が解離し、チロシネートの濃度が上がった、と評価している。

【0009】

また、文献２の図１（右）は、卵白アレルゲン蛋白質の圧力条件を「５０気圧から７０００気圧まで段階的に加圧」して測定した蛍光スペクトルを示している。圧力変化に伴って、蛍光スペクトルの波長３０４ｎｍの蛍光強度（チロシン由来）が大幅に減少し、同時に波長３４０ｎｍの蛍光強度（チロシネート由来）が増加している。このことから、加圧に伴う三次構造の転移が生じて、チロシンを含む構造状態の割合が減少し、チロシネートを含む構造状態の割合が増加したものと、評価している。

【0010】

＜ＣＤと蛍光＞
文献３は、リゾチームの立体構造とリゾチーム内のトリプトファン残基の微環境が温度変化に伴ってどのように変化するかを、ＣＤスペクトル及び蛍光スペクトルに基づいて評価した例である。この手法は、リゾチーム（鶏卵白）の水溶液（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を試料にして、５ｍｍセルにてＣＤスペクトルを、１０ｍｍセルにて蛍光スペクトルを、２０℃から９０℃までの５℃間隔の温度インターバルで、それぞれのＣＤスペクトルを測定している。

【0011】

文献３の図１は、１９０～２６０ｎｍの波長範囲のＣＤスペクトルの温度変化測定の結果である。測定条件は、走査速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、レスポンス２ｓｅｃ、バンド幅１ｎｍ、データ間隔０．１ｎｍ、積算２回としている。文献３の図２は、波長２２０ｎｍのＣＤ強度の温度変化測定の結果である。

【0012】

文献３の図４は、３００～４００ｎｍの波長範囲の蛍光スペクトルの温度変化測定の結果である。測定条件は、励起波長２８０ｎｍ、励起光バンド幅２ｎｍ、データ間隔１ｎｍ、レスポンス１ｓｅｃとしている。文献３の図５は、波長３３９ｎｍの蛍光強度と波長３４９ｎｍの蛍光強度との比をとって、温度変化に伴うその比の変化を示している。

【0013】

文献３の図１のＣＤスペクトルによれば、２００ｎｍ以下の波長領域に見られたピークの強度が、温度上昇に伴って、大幅に減少しており、２０℃において波長２０７．７ｎｍにあった負のピークが、９０℃では波長２０２．８ｎｍまで短波長側にシフトしている。このことから、文献３では、温度上昇によってリゾチームのαヘリックス構造が解けて、ランダムコイル構造に変化したものと評価している。そして、文献３の図２のαヘリックス構造に由来する波長２２０ｎｍのＣＤ強度の変化から、７０～８０℃の温度域で急激な減少が認められ、変性温度が７３．９℃とされている。

【0014】

また、文献３の図４の蛍光スペクトルによれば、２０℃において波長３３９ｎｍにあった蛍光ピーク（吸収極大）が、温度上昇に伴って長波長側へシフトし、９０℃では波長３４８ｎｍに生じている。一般に、蛋白質の蛍光をモニターすることにより、トリプトファン残基の置かれた微環境についての知見が得られる。トリプトファン残基の蛍光ピークは、その周辺環境の極性に敏感に反応し、例えば、トリプトファン残基が蛋白質の内部に埋まった状態（非極性の環境）では、３３０ｎｍ付近にピークを示す。立体構造が変化して、トリプトファン残基が蛋白質の表面で水に接触した状態（極性の高い環境）になると、ピークが３５０ｎｍ付近までシフトすると言われている。そのため、文献３では、図４の蛍光スペクトルの変化から、リゾチームの熱変性によって蛋白質内部に埋まっていたトリプトファン残差が蛋白質表面に現れた、と評価している。

【0015】

さらに、文献３の図５では、図２と同様に、７０～７５℃の温度域でピーク比がもっとも大きく変化していることから、リゾチームの二次構造（αヘリックスの構造）の変化も、三次構造（トリプトファン残差を含む立体構造）の変化も、同じ温度域で生じていると評価している。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0016】

【文献】末永，“円二色性分散計（日本分光Ｊ－８２０）”，７頁，［online］，熊本大学薬学部附属創薬研究センター機器分析施設，［平成３１年６月１９日検索］，インターネット＜URL：http://iac.kuma-u.jp/equipment/details/pdf/23.pdf＞

【文献】前野，“高圧蛍光実験からタンパク質の隠れた構造を探る”，図１，［online］，日本生物物理学会，［平成３１年６月１９日検索］，インターネット＜URL：https://www.biophys.jp/highschool/D-16.html＞

【文献】“Ｊ－８２０＋ＦＭＯ－４２７Ｌを用いたリゾチームの温度変化測定”，図１－５，［online］，日本分光株式会社，［平成３１年６月１９日検索］，インターネット＜URL：https://www.jasco.co.jp/jpn/technique/200-CD-0005.pdf＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

特許文献１から３に示される通り、従来の評価方法では、ＣＤ測定や蛍光測定によってそれぞれのスペクトルを観察し、特定の波長域でのスペクトル形状の変化に着目することで、蛋白質の高次構造がどのように変化したかどうかを評価している。しかしながら、蛋白質全体の中で異なる構造変化（二次と三次構造の各々の変化など）が相対的にどのようなタイミングで生じているのかや、蛋白質全体が何ら構造変化していないことなどを評価するには、個々のスペクトルデータの観察だけでは不十分であり、専門的な知識や多くの経験に基づく判断が必要になってしまう。

【0018】

発明者らは、蛋白質全体の中で異なる構造変化が相対的にどのようなタイミングで生じているのか、蛋白質全体が何ら構造変化を起こしていないこと等を、簡易に評価できる手法があれば、バイオ医薬品をはじめとする蛋白質の産業利用分野の発展に非常に役立つのでは、と考えた。

【0019】

本発明の目的は、外部刺激が変化した際に生じる蛋白質の複数の構造変化を簡易に評価することができる評価方法、評価装置および評価プログラムを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0020】

すなわち、本発明に係る蛋白質の構造変化の評価方法は、
蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させる手順と、
前記外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて蛍光スペクトル測定およびＣＤスペクトル測定を実行する手順と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルの各々の経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する手順と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示する手順と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する手順と、を含むことを特徴とする。

【0021】

前記蛍光スペクトル測定では、蛋白質の三次構造の変化に反応する波長域が少なくとも含まれるように測定波長範囲を設定し、ＣＤスペクトル測定では、蛋白質の二次構造の変化に反応する波長域が少なくとも含まれるように測定波長範囲を設定するとよい。

【0022】

蛋白質への外部刺激としては、温度、ｐＨ、圧力、電場、磁場、光、応力、蛋白濃度、バッファーの種類、バッファー濃度のいずれかであることが好ましい。また、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を次表のように評価することが好ましい。
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
同時相関Φ 異時相関Ψ λ１とλ２の交差ピークにおける各スペクトル変化
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
正 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は同方向で同時に起こる
正 正 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより先に起こる
正 負 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は異方向で同時に起こる
負 正 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 負 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより先に起こる
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
λ１：蛋白質の三次構造の変化に反応する蛍光スペクトルの波長
λ２：蛋白質の二次構造の変化に反応するＣＤスペクトルの波長

【0023】

さらに、複数の蛋白質試料について、試料毎に前記二次元相関スペクトルを画像データとして取得し、これらの画像データに対して、画像用の主成分分析を実行することが好ましい。複数の蛋白質試料を、主成分にもとづいてグループ分けすることができる。

【0024】

次に、本発明に係る蛋白質の構造変化の評価装置は、
蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させながら、当該外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルをデータとして受信する受信手段と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、前記蛍光スペクトルおよび前記ＣＤスペクトルの各々のデータの経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する演算手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示させる表示指令手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する評価手段と、を備えることを特徴とする。

【0025】

また、本発明に係る蛋白質の構造変化の評価プログラムは、
蛋白質試料に対する外部刺激を経時的に変化させながら、当該外部刺激の変化中の複数のタイミングにおいて測定された蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルをデータとして受信する受信手段と、
蛍光スペクトルの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、測定された前記蛍光スペクトルおよび前記ＣＤスペクトルの各々の経時的変化についての二次元相関スペクトルである同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを演算する演算手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルを画像データとして表示手段に表示させる表示指令手段と、
前記同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルに現れる正または負のピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化の相関を評価する評価手段と、してコンピュータを機能させることを特徴とする。

【発明の効果】

【0026】

蛋白質の安定性評価（製造工程の評価を含む）においては、外部刺激の経時的変化に対する蛋白質の動的な構造変化、例えば、蛋白質の二次構造変化および三次構造変化についてのタイムラグを適切に把握できれば、より信頼性のある評価が可能になると言える。本発明では、外部刺激の変化を伴う蛋白質の蛍光スペクトル測定およびＣＤスペクトル測定によって得られたそれぞれのスペクトルデータから二次元相関スペクトルを演算し、それを例えば二次元画像データとしてモニターなどに表示する。

【0027】

二次元相関スペクトルの算出方法自体は、公知の算出方法を用いる。本発明では、二次元相関スペクトルの算出方法を使って、蛍光スペクトルのある波長（λ１）の蛍光強度の変化状態と、ＣＤスペクトルのある波長（λ２）のＣＤ強度の変化状態と、の相関をとる。二次元マップ状にすべての又は選択された所定の波長（λ１，λ２）の組合せについて、上記の相関をとる。二次元相関スペクトルは、その相関結果を、Ｘ軸に蛍光スペクトルの波長をとり、Ｙ軸にＣＤスペクトルの波長をとった二次元マトリックス状に表現させたものである。通常、二次元相関スペクトルは、同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトルがセットで算出される。

【0028】

ユーザーは、その二次元相関スペクトル（同時相関スペクトルおよび異時相関スペクトル）の画像データを観察することにより、その二次元相関スペクトルに表れた正または負のピークに基づいて、蛋白質に同時に生じる構造変化やタイムラグのある複数の構造変化を視覚的にかつ網羅的に把握することができる。言い換えると、蛋白質の複合的な構造変化を一目で把握して評価できるようになった。このような評価方法は、蛋白質の産業利用分野における研究・製造・品質管理などの現場に極めて有用な分析法として貢献できる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】第一実施形態に係る蛋白質の評価装置の機能ブロック図である。

【図2】前記評価装置とＣＤ／蛍光測定機からなるシステムの全体構成図である。

【図3】前記ＣＤ／蛍光測定機の試料部の一例を示す図である。

【図4】蛋白質の構造変化を評価する手順を示すフローチャートである。

【図5】表示装置に表示された二次元相関スペクトルの一例であり、（Ａ）は同時相関スペクトルを示し、（Ｂ）は異時相関スペクトルを示す図である。

【図6】第二実施形態に係る複数の蛋白質試料のグルーピングの手法の説明図であり、（Ａ）は複数の試料についての二次元相関スペクトル画像を示し、（Ｂ）は画像の主成分分析に基づいて試料を分類した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

第一実施形態
図１は、本発明の一実施形態に係る評価装置の機能ブロック図であり、この評価装置を用いて蛋白質の構造変化を評価する。本実施形態では、評価装置１０は、コンピュータで構成され、コンピュータが記憶媒体に記憶された評価プログラムを読み取って実行することにより、例えば、データ受信部１２、データ保持部１４、補正部１６、演算部１８、表示指令部２０、及び、評価部２２などとして機能する。

【0031】

データ受信部１２は、外部から蛋白質試料の蛍光スペクトルデータおよびＣＤスペクトルデータを受信する。データ保持部１４は、メモリー等からなり、スペクトルデータを保持する。補正部１６は、二次元相関スペクトルデータの演算が適切に実行されるようにデータ保持部１４から読み取ったスペクトルデータを補正する。演算部１８は、蛍光スペクトルデータおよびＣＤスペクトルデータに基づいて二次元相関スペクトルデータを演算する。表示指令部２０は、二次元相関スペクトルデータをデータ保持部１４に保持させるとともに、当該二次元相関スペクトルデータを表示装置（液晶ディスプレイ等）２４に画像表示させる。また、表示指令部２０は、適宜、蛍光スペクトルデータおよびＣＤスペクトルデータを表示装置２４に画像表示させてもよい。

【0032】

評価部２２は、二次元相関スペクトルデータに表れている蛋白質試料の構造変化の評価情報を、文字または図形を使って表示装置２４に表示させる。

【0033】

表示装置２４には、その評価情報が、二次元相関スペクトルデータ、蛍光スペクトルデータ又はＣＤスペクトルデータと共に表示される。或いは、これらのスペクトルデータとは独立して表示される。表示装置２４には、少なくとも二次元相関スペクトルデータを二次元画像データとして表示可能な公知の手段を採用できる。ここで、表示装置２４は、評価装置１０と一体でも、又は別体でもよい。

【0034】

図２は、評価装置１０とＣＤ／蛍光測定機３０からなるシステムの全体構成図である。ＣＤ／蛍光測定機３０の構成を図２を用いて簡単に説明する。ＣＤ／蛍光測定機３０は、蛋白質試料を測定対象として、外部刺激を経時的に変化させた際の、その変化中の複数のタイミングにおいて、ＣＤスペクトルデータおよび蛍光スペクトルデータを繰り返し測定する装置であり、図２に示すように、光源ランプ３１、分光器３２、偏光変調子（ＰＥＭ）３３、試料部３４、ＣＤ用の光検出器３５、蛍光用の分光器３６、蛍光用の光検出器３７、及び、両光検出器３５，３７からの信号を処理する信号処理部３８を備える。信号処理部３８では、測定機の動作条件の設定および測定条件の設定も行われる。信号処理部３８は、設定された条件に従って、ＰＥＭ３３の駆動制御、各分光器３２，３６の波長走査制御、試料部３４の温調制御やセル交換制御などを実行する。

【0035】

光源ランプ３１、分光器３２、ＰＥＭ３３の順で構成された照射光学系によって、ＰＥＭ３３の変調周波数ｆで偏光状態が周期的に変化する単波長光が形成されるとともに、分光器３２の選択波長が所定の波長範囲内で変更される。本実施形態では、選択波長毎に、ＰＥＭ３３の変調周波数で決まる周期で左／右に交替する円偏光が形成され、試料部３４を照射する。

【0036】

図３は、試料部３４に配置される温調セルホルダー３９および試料セル４０の平面図である。温調セルホルダー３９は、例えば、ペルチェ素子などの温度制御素子を内蔵した水冷式のセルホルダーであり、セルホルダー内の試料セル４０の温度を調整し、また、温度を経時的に変化させることができる。試料セル４０は、例えば、断面が矩形である内部空間を有したミクロ石英セルである。試料セル４０は、蛋白質試料の状態（通常は、液体等の媒質と蛋白質との混合状態）に応じて、蛋白質試料をセル内部に保持する構成や、蛋白質試料を連続的に流す構成から適宜選択される。

【0037】

ＰＥＭ３３からの単波長光は、試料セル４０の一方の窓板から入射し、内部の蛋白質試料を通過して、他方の窓板から出射した後、ＣＤ用の光検出器３５にて検出される。

【0038】

＜ＣＤスペクトルの測定＞
左右に交替する円偏光状態の単波長光が、蛋白質試料に含まれる円二色性の部位を透過すると、透過光の左円偏光の吸光度と右円偏光の吸光度とに差が生じる。この差は、光検出器３５からの光強度信号に交流成分として表れる。信号処理部３８は、ＰＥＭ３の変調周波数ｆの参照信号を使って、光強度信号から交流成分を検知し、ＣＤ強度信号を得る。また、分光器３２を駆動させて単波長光の波長を走査すると、波長に応じたＣＤ強度信号が得られ、これによって信号処理部３８はＣＤスペクトルデータを取得することができる。図３に、蛋白質試料のＣＤスペクトルデータの模式図を示す。

【0039】

試料セル４０は、さらに上記の一対の窓板に直角である第三の窓板を有する。

【0040】

＜蛍光スペクトルの測定＞
図２のシステム構成であれば、蛍光測定において、試料部の前段の分光器３２が励起光の波長を固定し、蛋白質試料からの蛍光を後段の分光器３６が波長を走査することによって、蛍光スペクトルデータ（励起光波長一定）を測定することができる。また、前段の分光器３２が励起光の波長を走査し、後段の分光器３６が蛋白質試料から発する蛍光から一定波長の成分を選択することによって、蛍光スペクトルデータ（蛍光波長一定）を測定することもできる。

【0041】

どちらの蛍光スペクトルデータを用いてもよい。ここでは、前者の場合について説明する。ＰＥＭ３３からの単波長光（励起光）の波長が一定、例えば２８０ｎｍの状態で、その単波長光が蛋白質試料に含まれる蛍光の部位（例えば蛍光プローブ）を励起すると、蛋白質試料は蛍光を発する。その蛍光は、試料セル４０の第三の窓板から出射して、蛍光用の分光器３６に入って波長毎の蛍光に分散された後、光検出器３７で検出される。蛍光用の分光器３６を駆動させて選択波長を走査することによって、信号処理部３８は、光検出器３７から選択波長毎の蛍光強度信号を得て、蛍光スペクトルデータを取得することができる。図３に、蛋白質試料の蛍光スペクトルデータの模式図を示す。

【0042】

なお、蛍光スペクトル測定中、ＰＥＭ３３を変調駆動させたままでも、変調駆動を停止させてもよい。

【0043】

従来、独立したＣＤ測定機と分光蛍光測定機を使って個別にスペクトル測定する場合や、１台のＣＤ測定機であっても、その試料部にＣＤ用セルと蛍光用セルを独立に配置してスペクトル測定する場合などでは、２つの試料セル内の蛋白質試料の外部刺激（特に、温度）の経時的な変化を同期させることが極めて難しかった。

【0044】

本実施形態では、図３の構成の試料部３４を採用することで、同一の試料セル内の蛋白質試料からＣＤスペクトルと蛍光スペクトルの両方が測定される。つまり、１つの試料セル４０によって、それぞれのスペクトルを同時に測定することができるため、２つの試料セルでの測定時のような外部刺激の「ずれ」を排除することができる。加えて、１回の測定で２つのスペクトルデータが得られるので、測定に必要な試料量を少なくすることができる。

【0045】

図４のフローチャートは、図２のシステム構成を用いた蛋白質の構造変化の評価手順（Ｓ１～Ｓ８）を示す。

【0046】

手順Ｓ１では、ＣＤ／蛍光測定機３０の動作条件を設定する。例えば、蛍光測定では、蛋白質の三次構造の変化に反応する波長域が少なくとも含まれるように測定波長範囲を設定する。ＣＤ測定では、蛋白質の二次構造の変化に反応する波長域が少なくとも含まれるように測定波長範囲を設定する。

【0047】

手順Ｓ２では、蛋白質試料に対する外部刺激の経時的変化の条件を設定する。外部刺激として、蛋白質の温度、ｐＨ、圧力、電場、磁場、光、応力、蛋白濃度、バッファーの種類、バッファー濃度などの物理パラメータから選択可能である。本実施形態では、一例として、温調セルホルダー３９を用いて、試料セル４０の蛋白質試料の温度を２０℃から９０℃まで経時的に変化させる条件に設定する。

【0048】

手順Ｓ３では、温調セルホルダー３９を上記の条件で駆動させて、外部刺激の経時的変化を発生させる。そして、蛋白質試料の温度を２０℃から９０℃まで経時的に変化させつつ、例えば５℃間隔の温度インターバルで、蛍光スペクトルとＣＤスペクトルの両方を繰り返し測定する。５℃間隔の各温度において、信号処理部３８は、各光検出器３５，３７からの強度信号を処理し、ＣＤスペクトルデータおよび蛍光スペクトルデータを得て、これらのデータを評価装置１０に出力する。手順Ｓ３までの実行の結果、２０℃、２５℃、・・・、９０℃の各温度で、蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルが同時に得られる。

【0049】

手順Ｓ４からＳ８までは、コンピュータ（評価装置１０）によるスペクトルデータ処理の流れを示し、手順Ｓ３まで完了した後、続けて処理を開始してもよい。或いは、外部刺激の経時的変化を共通条件にして、別のＣＤ測定機で測定したＣＤスペクトルデータと、別の分光蛍光測定機で測定した蛍光スペクトルデータとをデータ保持部１４に保存しておき、ユーザーの必要に応じて、コンピュータがこれらのスペクトルデータに対して評価プログラムを実行するようにしてもよい。

【0050】

ここでは、手順Ｓ３に続く一連の動作として、手順Ｓ４からＳ８までを説明する。まず、コンピュータは、信号処理部３８からの各々のスペクトルデータを受信し、メモリーなどのデータ保持部１４に保持する（手順Ｓ４）。ここで、コンピュータは、二次元相関スペクトルデータの適切な演算のために、データ保持部１４から読み取った各スペクトルデータに対して事前に補正を加えることができる（手順Ｓ５）。

【0051】

＜スペクトルデータの補正内容＞
蛍光スペクトルデータに対しては、励起光の高次光カット処理、ダーク補正、スペクトル補正を適宜実行する。また、ＣＤスペクトルデータに対しては、ベースライン補正、滴定測定のときの濃度補正を適時実行する。

【0052】

次に、コンピュータは、蛍光スペクトルデータの測定波長をＸ軸とし、ＣＤスペクトルの測定波長をＹ軸として、蛍光スペクトルデータの変化およびＣＤスペクトルデータの変化についての二次元相関スペクトルデータを演算する（手順Ｓ６）。

【0053】

＜二次元相関スペクトルの演算＞
二次元相関スペクトルは、スペクトルの経時的な変化（「動的スペクトル」とも呼ばれる。）を解析する手法として知られている。一般的な動的スペクトルデータから単に二次元相関スペクトルを演算するだけであれば、市販のソフトウェアを用いることができる。

【0054】

ここで、スペクトルデータの波長をλとして、動的蛍光スペクトルを（１）で表し、動的ＣＤスペクトルを（２）で表す。

【0055】

【数1】

【0056】

任意の波長λ１，λ２で、一定の相関時間τを置いて動的蛍光スペクトル（３）と動的ＣＤスペクトル（４）が測定されるならば、次式（５）の相互相関関数「Ｘ（τ）」を求めることができる。

【0057】

【数2】

【0058】

【数3】

【0059】

この相関関数「Ｘ（τ）」は、当該相関関数を複素数で表した際の実数部に相当する同時相関強度Φと、虚数部に相当する異時相関強度Ψとを用いて表現することもできる。同時相関強度Φと異時相関強度Ψは、２つの独立した波長λ１，λ２によって決定される二次元スペクトルである。

【0060】

コンピュータは、最も基本的な二次元相関スペクトルである、同時相関スペクトルと異時相関スペクトルを演算し（手順Ｓ６）、演算した二次元相関スペクトルを液晶ディスプレイ等の表示手段に表示させる（手順Ｓ７）。

【0061】

図５（Ａ），（Ｂ）は、モニター等に表示される同時相関スペクトルΦ（λ１，λ２）と異時相関スペクトルΨ（λ１，λ２）の一例をそれぞれ模式的に示したものである。各々の相関スペクトルのピークを、その高さに応じた色の変化によって表現しているが、等高線での表示や三次元立体表示にしてもよい。

【0062】

最後に、コンピュータは、二次元相関スペクトルに現れた正または負の交差ピークに基づいて、蛋白質試料の二次構造および三次構造の変化を評価する（手順Ｓ９）。

【0063】

ここで、蛋白質試料の構造変化の評価について簡単に説明する。

【0064】

図５（Ａ）の同時相関スペクトルΦ（λ１，λ２）には、蛍光の波長λ１１（３３０ｎｍ付近）とＣＤの波長λ２１（２００ｎｍ付近）との交点に正の交差ピークＰ１１が生じている。つまり、蛍光の波長λ１１とＣＤの波長λ２１の各強度が正の方向に同時相関している。

【0065】

正の方向の同時相関（交差ピークＰ１１）は、蛍光信号およびＣＤ信号がいずれも減少（又は増加）する場合であり、それぞれのスペクトル強度の変化の方向性が同じであると言える。そして、３３０ｎｍ付近における蛍光データからはトリプトファン由来の三次構造変化が読み取られ、２００－２３０ｎｍにおけるＣＤデータからはαヘリックスの二次構造変化が読み取られる。この例では、蛋白質の二次構造（例えばαヘリックスの構造）と三次構造（例えば蛍光プローブを含んだ立体構造）がどちらも崩壊している、或いは、二次構造と三次構造がどちらも生成していることの根拠となり得る。

【0066】

なお、同時相関スペクトルに負の交差ピークが生じていて、蛍光スペクトルおよびＣＤスペクトルの各強度が負の方向に同時相関（反相関とも呼ぶ。）している場合は、蛍光信号およびＣＤ信号の一方が減少し、同時に他方が増加する場合であり、例えば、蛋白質の二次構造と三次構造のうちの一方には変化がないが、他方には崩壊または生成といった変化が起きているということの根拠になり得る。

【0067】

このように、同時相関スペクトルにおける交差ピークの存在は、外部刺激の経時的変化に対する蛋白質の二次構造の変化と三次構造の変化との相互作用の可能性を示すものとして、重要な意味をもたらす。

【0068】

一方、図５（Ｂ）の異時相関スペクトルΨ（λ１，λ２）にも、蛍光の波長λ１２（３３０ｎｍ付近）とＣＤの波長λ２１（２００ｎｍ付近）との交点に正の交差ピークＰ２１が生じている。つまり、蛍光の波長λ１２とＣＤの波長λ２１の各強度が正の方向に異時相関している。

【0069】

図５（Ａ），（Ｂ）のように、ある波長の組合せ（λ１，λ２）において、正の方向の同時相関（交差ピークＰ１１）と正の方向の異時相関（交差ピークＰ２１）とが生じる場合は、蛍光およびＣＤの変化の方向性が同じで、蛍光強度の変化が先に生じ、ＣＤ強度の変化が遅れて生じることになる。例えば、蛋白質の三次構造の変化が先に進み、これに遅れて二次構造の変化が始まることの根拠となり得る。

【0070】

なお、正の方向の同時相関と負の方向の異時相関とが生じる場合は、蛍光およびＣＤの変化の方向性が同じであるが、ＣＤ強度の変化が先に生じ、蛍光強度の変化が遅れて生じることになる。例えば、蛋白質の二次構造の変化が先に進み、これに遅れて三次構造の変化が始まることの根拠となり得る。

【0071】

つまり、蛋白質への外部刺激の経時的変化に対して、先に、蛍光の３３０ｎｍ付近の強度変化（三次構造の変化）が生じ、その後に、ＣＤの２００ｎｍ付近の強度変化（二次構造の変化）が生じる、という、それぞれの構造変化のタイムラグを把握することができる。外部刺激の経時的変化に対する蛋白質の二次構造、三次構造がそれぞれどのような順序で変化するのかを知ることができ、蛋白質の熱安定性評価が容易になった。

【0072】

また、異時相関スペクトルにおいて交差ピークが現れていない波長の組合せは、信号強度の変化が同期している、つまり、構造変化の速さが同じであるか、又は、両方とも構造変化が生じていないことを示している。

【0073】

コンピュータの評価部７２による評価内容の表示例を図５（Ａ），（Ｂ）に示す。その他、表形式での表示や、文章での表示でもよい。

【0074】

次表に、二次元相関スペクトル（Φ、Ψ）の読み取り方の一例を示す。λ１は蛍光スペクトルの波長、λ２はＣＤスペクトルの波長を示す。表１に基づけば、図５の二次元相関スペクトル画像を読み取れば、同じ温度変化状況において、蛋白質試料は、αヘリックスの二次構造変化（ＣＤの変化）よりも、トリプトファン由来の三次構造変化（蛍光の変化）が先に生じたことが分かる。表１に基づく評価内容を図５の二次元相関スペクトルの画像に表示してもよい。

【0075】

［表１］
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
同時相関Φ 異時相関Ψ λ１とλ２の交差ピークにおける各スペクトル変化
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
正 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は同方向で同時に起こる
正 正 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより先に起こる
正 負 蛍光とＣＤの変化は同方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 ほぼゼロ 蛍光とＣＤの変化は異方向で同時に起こる
負 正 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより後に起こる
負 負 蛍光とＣＤの変化は異方向で蛍光はＣＤより先に起こる
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――

【0076】

抗体医薬開発などの分野では、蛋白質の温度変化依存の構造変化を適切に把握することが、製品開発、製造工程の確立および品質管理の上で、重要な事項になっている。本実施形態では、蛋白質の二次構造と三次構造の変化をモニタリングして、蛋白質の構造変化の評価が簡易になったため、蛋白質に付与される機能部位の効果の確認や変異の有無の把握をする上での重要な情報が容易に得られるようになった。昨今の目的部位をデザインするという抗体医薬分野での幅広い活用が期待される。

【0077】

第二実施形態
図６は、複数の蛋白質試料の二次元相関スペクトルデータを画像として、コンピュータが画像用の主成分分析を実行することを示した図である。本実施形態では、第一実施形態のシステム（図２）を用いており、図３の温調セルホルダー３９として、６連温調セルチェンジャー（水冷ペルチェ素子内蔵）を用いることで、６検体のスペクトル測定を同時に実行、または順次実行できるように構成されている。また、評価装置１０が画像用の主成分分析を実行する。

【0078】

例えば、バイオ医薬品の開発段階で、ネイティブの蛋白質からなる１検体と、何らかの機能基がそれぞれ異なる条件で付与された５検体とを用いて、蛋白質に機能基を付与したことによる影響の有無を確認するケースについて説明する。

【0079】

まず、温度変化条件の下、本実施形態のシステムを用いて、これら６検体の蛍光スペクトルデータおよびＣＤスペクトルデータを取得し、６セットの二次元相関スペクトルデータを得る（図６（Ａ））。そして、これら６セットの二次元相関スペクトル（同時相関スペクトル，異時相関スペクトル）を画像データとして、これらの画像の主成分分析を実行する。この画像分析には、市販の画像用の主成分分析ソフトウェアを用いることができる。

【0080】

画像についての主成分分析の結果、６検体をグループ分けすることができる。図６（Ｂ）は、画像データの第１主成分（ＰＣ１）と画像データの第２主成分（ＰＣ２）を用いた例である。例えば、ネイティブの蛋白質の異時相関スペクトル画像に対する、他の検体の異時相関スペクトル画像の一致性／不一致性の結果から、６検体をグルーピングすることができる。異時相関スペクトル画像について、同じグループに属することになった検体を、さらに、同時相関スペクトル画像の主成分分析結果に基づいて、細かくグループ分けすることもできる。

【0081】

図６（Ｂ）の例では、グループ１にはネイティブの検体（Ｎｏ．１）を含む複数の検体が含まれている。これらの検体は、ネイティブとの一致性が高く、蛋白質の構造変化が起こっていないことを示す判断の根拠に使える。

【0082】

なお、温度変化条件のケースでは、図３のような試料セルを用いて、２種類のスペクトル測定を同時に行うことで、２種類のスペクトル測定の実行時に蛋白質試料の温度条件を一致させることができるというメリットがある。しかし、蛍光測定およびＣＤ測定を別々に実行する場合でも、それぞれの蛋白質試料の温度変化を一致させることが可能であれば、２種類のスペクトルの同時測定は必須にはならない。

【0083】

ＣＤ測定機と蛍光測定機を用いて、２種類のスペクトルを測定する場合にも、本発明の評価手法を適用できる。

【符号の説明】

【0084】

１０ 評価装置（コンピュータ）
１２ データ受信部（受信手段）
１８ 演算部（二次元相関スペクトルの演算手段）
２０ 表示指令部（表示指令手段）
２２ 評価部（蛋白質試料の構造変化を評価する評価手段）
２４ 表示装置（表示手段）
３０ ＣＤ／蛍光測定機
３４ 試料部
３８ 信号処理部
３９ 温調セルホルダー（６連温調セルチェンジャー）
４０ 試料セル

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】