(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-06
(45)【発行日】2024-06-14
(54)【発明の名称】表面増強ラマン分光法タグを製造する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/65 20060101AFI20240607BHJP
B01J 13/00 20060101ALI20240607BHJP
B22F 1/00 20220101ALI20240607BHJP
B22F 1/0545 20220101ALI20240607BHJP
B22F 9/00 20060101ALI20240607BHJP
B22F 1/102 20220101ALI20240607BHJP
B22F 9/24 20060101ALI20240607BHJP
【ＦＩ】
G01N21/65
B01J13/00
B22F1/00 K
B22F1/0545
B22F9/00 B
B22F1/102
B22F9/24 F
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2022502101
(86)(22)【出願日】2020-07-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-20
(86)【国際出願番号】 EP2020069684
(87)【国際公開番号】W WO2021009090
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2023-06-13
(31)【優先権主張番号】62/874,158
(32)【優先日】2019-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】19192040.4
(32)【優先日】2019-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20163879.8
(32)【優先日】2020-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】311007051
【氏名又は名称】シクパ ホルディング ソシエテ アノニム
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＣＰＡ ＨＯＬＤＩＮＧ ＳＡ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｅｎｕｅ ｄｅ Ｆｌｏｒｉｓｓａｎｔ ４１，ＣＨ－１００８ Ｐｒｉｌｌｙ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(72)【発明者】
【氏名】ピオッティ， マルセロ エデュアルド
(72)【発明者】
【氏名】シェフラー， レイモンド エイチ．
(72)【発明者】
【氏名】コワルスキー， マーク
【審査官】横尾 雅一
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００８／０１１８９８６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５０７５００（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３２７５５１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００８／０００３５７６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３３６４３９２（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４
Ｂ０１Ｊ ３／００ － Ｂ０１Ｊ １３／００
Ｂ２２Ｆ １／００ － Ｂ２２Ｆ ８／００
Ｂ２２Ｆ ９／００ － Ｂ２２Ｆ ９／３０
Ｂ８２Ｙ ５／００ － Ｂ８２Ｙ ９９／００
Ｃ２２Ｃ １／０４ － Ｃ２２Ｃ １／０５９
Ｃ２２Ｃ ３３／０２
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、前記複数のナノ粒子の前記表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、前記複数のナノ粒子の前記表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、前記複数のナノ粒子の前記表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 前記第１のコロイドのナノ粒子の数と前記第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１になるように、前記第１のコロイドを前記第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせによって前記ナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｄ１） ステップｃ）で得られた前記第３のコロイドを、約２．２と、前記ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ
ｄ２） 塩溶液を、ステップｃ）で得られた前記第３のコロイドに添加するステップ
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた前記第３のコロイドに添加するステップ
ｅ） 凝集を停止するステップと、
を含む、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグを製造する方法。
【請求項2】
前記ステップｃ）において、前記第１のコロイドのナノ粒子の数と前記第２のコロイドのナノ粒子の数との比が約５：１～約１：１になるように、前記第１のコロイドを前記第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｄ２）において、前記塩溶液は無機塩溶液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ステップｂ）が、ｂ１）からｂ３）の順序で実施される以下のステップを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、前記複数のナノ粒子の前記表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） 前記コロイドのｐＨを、前記ナノ粒子の前記表面に吸着させるべき前記ラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下の前記ζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） 前記ラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られた前記コロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下の前記ζ電位値を維持するステップ
【請求項5】
前記ζ電位値が－４０ｍＶ未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記安定剤が、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びそれらの混合物から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第２のコロイドの前記ナノ粒子が、それらの表面にラマン活性レポーター分子のサブ単層又は単層を吸収している、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステップｂ３）で、前記ラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした前記溶液が２種以上の異なるラマン活性レポーター分子の混合物を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項9】
ステップｃ）で、前記第１のコロイドのナノ粒子の数と前記第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約４：１～約３：１である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ステップｄ１）が、ステップｃ）で得られた前記第３のコロイドに酸性溶液をさらに添加することを含み、同時に、得られるコロイドのｐＨ値が、約２．２と、前記ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるように混合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第１のコロイドのｐＨを、ステップｄ１）で得られた前記第３のコロイドのｐＨが、約２．２と、前記ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるように調整する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ステップｅ）が、以下のステップｅ１）～ｅ４）のいずれかを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。ｅ１） ステップｄ）で得られた前記コロイドのｐＨを、前記ナノ粒子の前記表面に吸着させるべき前記ラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整するステップ
ｅ２） ステップｄ）で得られた前記コロイドを水で希釈するステップ
ｅ３） ポリマーを、ステップｄ）で得られた前記コロイドに添加するステップ
ｅ４） 誘電体前駆体を、ステップｄ）で得られた前記コロイドに添加するステップ
【請求項13】
ステップｅ）が、ステップｅ３）から本質的になり、前記製造方法が、ステップｅ３）で得られた前記コロイドを水で希釈すること、及び／又は前記ＳＥＲＳタグを誘電体でコーティングすることをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ステップｃ）及びｄ）が、連続フローシステムにおいて同時に実施される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップｅ）が、連続フローシステムにおいて実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記第１のコロイドの前記複数のナノ粒子及び前記第２のコロイドの前記複数のナノ粒子が、同じサイズを有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記第１のコロイドのナノ粒子サイズが、前記第２のコロイドのナノ粒子サイズとは異なる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第１のコロイドの前記複数のナノ粒子の前記プラズモン表面及び／又は前記第２のコロイドの前記複数のナノ粒子の前記プラズモン表面が、金から作製されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［発明の分野］
本発明は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグの製造方法の分野に関する。本発明による製造方法は、再現性があり、用途が広く、それから、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体（ｌｏｗ－ｎｕｍｂｅｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を特徴とする大量のＳＥＲＳタグの有利な製造を可能にする。本明細書に記載されている本発明の製造方法によって製造されたＳＥＲＳタグによって、アンサンブルＳＥＲＳ応答の増加が実現される。
本発明は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグの製造方法の分野に関する。本発明による製造方法は、再現性があり、用途が広く、それから、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体（ｌｏｗ－ｎｕｍｂｅｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を特徴とする大量のＳＥＲＳタグの有利な製造を可能にする。本明細書に記載されている本発明の製造方法によって製造されたＳＥＲＳタグによって、アンサンブルＳＥＲＳ応答の増加が実現される。
【0002】
［発明の背景］
表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグは、同定及び認証を目的とした生成物のラベリングと、マイクロアレイテクノロジー、診断及びバイオイメージングにおける高スループットマルチプレックススクリーニングとを含む、様々な用途に有用であると証明されている。ＳＥＲＳタグとは、プラズモン表面を呈し、且つそれらの表面にラマン活性レポーター分子が吸着しているナノ粒子の凝集体である。プラズモン表面を呈するナノ粒子は、ラマン増幅に必要な電場の生成に関与しており、ラマン活性レポーター分子は、ＳＥＲＳタグの独自の振動指紋をもたらす。典型的には、凝集体は、外部コーティング層を呈し、この外部コーティング層は、ａ）ＳＥＲＳタグを外部媒体から分離し、それによって、ラマン活性レポーター分子が、ＳＥＲＳタグから浸出することが防がれ、ＳＥＲＳタグが、振動ノイズを生じさせ得る外部媒体の汚染から保護され、ｂ）ＳＥＲＳタグのコロイド安定性を高め、且つｃ）さらなる化学的官能化のための好都合な表面を形成する。これまで、ポリマー及びシリカが外部コーティング層として使用されてきた。
表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグは、同定及び認証を目的とした生成物のラベリングと、マイクロアレイテクノロジー、診断及びバイオイメージングにおける高スループットマルチプレックススクリーニングとを含む、様々な用途に有用であると証明されている。ＳＥＲＳタグとは、プラズモン表面を呈し、且つそれらの表面にラマン活性レポーター分子が吸着しているナノ粒子の凝集体である。プラズモン表面を呈するナノ粒子は、ラマン増幅に必要な電場の生成に関与しており、ラマン活性レポーター分子は、ＳＥＲＳタグの独自の振動指紋をもたらす。典型的には、凝集体は、外部コーティング層を呈し、この外部コーティング層は、ａ）ＳＥＲＳタグを外部媒体から分離し、それによって、ラマン活性レポーター分子が、ＳＥＲＳタグから浸出することが防がれ、ＳＥＲＳタグが、振動ノイズを生じさせ得る外部媒体の汚染から保護され、ｂ）ＳＥＲＳタグのコロイド安定性を高め、且つｃ）さらなる化学的官能化のための好都合な表面を形成する。これまで、ポリマー及びシリカが外部コーティング層として使用されてきた。
【0003】
プラズモン特性がナノ粒子の凝集状態に強く依存するため、アンサンブルＳＥＲＳ応答を増加させるには、少数凝集体の数が多いＳＥＲＳタグを生成することが非常に望ましい。少数凝集体の数が多いＳＥＲＳタグは、合成後選別技術又は制御された凝集体合成プロセスのいずれかによって生成した。
【0004】
例えば、単一ナノ粒子と二量体から八量体までのナノ粒子凝集体とを含有する混合物に適用されたフィールドフローフラクショネーションによって、二量体（１０％）、三量体（２１％）及び四量体（１３％）のＳＥＲＳタグが濃縮された画分が生成されたが、しかし、この画分は、高い割合の単一ナノ粒子（５２％）を含有していた（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１０９０３～１０９１０）。単一ナノ粒子と二量体から十二量体までの凝集体とを含有する混合物は、水性イオジキサノール密度勾配媒体などの高粘度密度勾配媒体中で遠心合成後選別法を使用することによって、二量体（５２％）及び三量体（３２％）ＳＥＲＳタグが濃縮された（米国特許第９８０２８１８号）。時間及び費用がかかるのみならず、合成後選別技術では、コーティングされていないＳＥＲＳタグの不安定化に繋がる（例えば高粘度試薬のための）過酷な条件を使用する必要がある。したがって、合成後選別技術は、シリカ又はポリマーでコーティングされたＳＥＲＳタグとのみ適合性がある。したがって、制御された凝集合成プロセスが、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を有するＳＥＲＳタグの生成に非常に有利である。
【0005】
固体支持体補助凝集によって、狭いサイズ分布を有するＳＥＲＳタグの生成が可能になった。Ｒｕａｎ等（Ａｄｖ．Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｔｅｒ．２０１４、２、６５～７３）は、平均直径１８０ｎｍのＡｕナノ球体コア１個あたり１８±２個の数の平均直径２４ｎｍのＡｕナノ球体サテライト（Ａｕ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ）を有する非対称コアサテライトＳＥＲＳタグの合成について記載した。合成は、臭化セチルトリメチルアンモニウムで安定化されたＡｕナノ粒子コアを酸化インジウムスズでコーティングされたスライドガラス又はシリコンウェーハに吸着させ、続いて、官能化された固体支持体を水／アセトニトリル中の４－アミノチオフェノールの溶液に浸漬し、ラマン活性レポーター分子をＡｕナノ粒子の表面に吸着させ、その後、平均直径２４ｎｍのＡｕナノ粒子の懸濁液に１時間浸漬することを伴う。ＳＥＲＳタグの凝集状態は、Ａｕナノ粒子サテライトの懸濁液中の官能化された固体支持体の浸漬時間を制御すること、及び／又は該懸濁液中のＡｕナノ粒子サテライトの濃度を減少させることによって制御することができる。Ｒｕａｎ等によって記載された方法は、Ａｕコロイドを安定化させるために臭化セチルトリメチルアンモニウム界面活性剤を使用することに基づいており、この使用によって、Ａｕナノ粒子コアでのラマン活性レポーター分子の吸着に利用可能な表面が大幅に減少し、それによって、ＳＥＲＳタグによってもたらされるＳＥＲＳシグナルの強度が大幅に低下する。Ａｕナノ粒子サテライトをＡｕナノ粒子コアに繋ぐために、凝集法では、Ａｕ表面に親和性のある２個の官能基を呈するラマン活性レポーター分子が用いられる。したがって、この方法は、Ａｕ表面に親和性のある２個の官能基を呈するラマン活性レポーター分子を有するＳＥＲＳタグの生成にのみ適用可能であり、このことは、ＳＥＲＳタグ指紋として使用すべきラマン活性レポーター分子に関して高い制限を表す。さらに、該方法は、長い反応時間を伴い、大量のＳＥＲＳタグの有利な製造には適していない。
【0006】
狭いサイズ分布のＳＥＲＳタグのさらなる固体支持体補助集合法は、Ｙｏｏｎ等（ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１２、８、７１９９～７２０８）によって記載された。この方法は、アミノ官能化スライドガラスに吸着したＡｕナノ粒子のサイズ依存性脱着傾向と、Ａｕナノ粒子サテライトをＡｕナノ粒子コアに繋ぐためのアルカンジチオールの使用とに基づく。平均直径５１ｎｍのＡｕナノ粒子コア１個あたり１３±３個の平均直径１３ｎｍのＡｕナノ粒子サテライトを有するＳＥＲＳタグが生成された。Ｙｏｏｎ等によって開発された方法は、ＳＥＲＳタグにラマン活性レポーター分子を組み込むことができるようである。しかしながら、該方法は、使用可能なＡｕナノ粒子のサイズと、ラマン活性レポーター分子に到達可能なＡｕナノ粒子コアの表面とに関して制限を呈する。さらに、この方法は、長い反応時間を必要とし、大量のＳＥＲＳタグの有利な製造には適していない。
【0007】
したがって、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を特徴とする大量のＳＥＲＳタグの有利な製造を可能にする、再現性があり、費用効率が高く、且つ用途の広い、ＳＥＲＳタグの製造方法がなおも必要とされている。少数凝集体の数が多いＳＥＲＳタグは、アンサンブルＳＥＲＳ応答を増加させるために非常に望ましい。
【0008】
［発明の概要］
したがって、本発明の目的は、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を特徴とする大量のＳＥＲＳタグの有利な製造を可能にする、用途の広く、費用効率が高く、且つ再現性のある、ＳＥＲＳタグの製造方法を提供することである。これは、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグ、好ましくは、セキュリティ要素としての使用のためのＳＥＲＳタグを製造する方法であって、
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む、方法によって達成される。
したがって、本発明の目的は、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を特徴とする大量のＳＥＲＳタグの有利な製造を可能にする、用途の広く、費用効率が高く、且つ再現性のある、ＳＥＲＳタグの製造方法を提供することである。これは、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグ、好ましくは、セキュリティ要素としての使用のためのＳＥＲＳタグを製造する方法であって、
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む、方法によって達成される。
【0009】
好ましくは、本明細書で特許請求及び記載されている方法におけるステップｂ）は、ｂ１）からｂ３）の順序で実施される以下のステップ：
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） ラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） ラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
【0010】
さらなる好ましい実施形態では、ステップｃ）及びｄ）は、連続フローシステムにおいて同時に実施される。さらなる好ましい実施形態では、第１のコロイドのナノ粒子サイズは、第２のコロイドのナノ粒子サイズとは異なる。
【0011】
実施例Ｅ１～Ｅ１４に示されるように、本明細書で特許請求される方法は、様々なラマン活性レポーター分子をＳＥＲＳタグに組み込むことを可能にし、特定のサイズのナノ粒子の組み合わせに限定されておらず、また、例えばＥ１～Ｅ８及びＥ１２～Ｅ１４に証明されているものと同じサイズを有するナノ粒子を含むＳＥＲＳタグの合成も可能にする。さらに、本明細書で特許請求され、記載されている製造方法は、例えば、図３ａ及び図３ｂに示されるような狭いサイズ分布と、例えば図３ａ及び図３ｂに示されるような高比率の少数凝集体とを有するＳＥＲＳタグを提供し、文献で公知の方法と比較して、反応時間が大幅に短くなっている。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1a】本発明によるＳＥＲＳタグの製造方法を概略的に示す。この製造方法は、プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子（１２１ａ）から本質的になる第２のコロイド（１２０ａ）であって、ナノ粒子が、それらの表面にラマン活性レポーター分子（１２２ａ）及び安定剤（図示せず）を吸着している、第２のコロイド（１２０ａ）を、プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子から本質的になる第１のコロイド（１３０ａ）であって、ナノ粒子が、それらの表面に安定剤（図示せず）を吸着している、第１のコロイド（１３０ａ）と組み合わせるステップと、ナノ粒子の凝集を誘導してＳＥＲＳタグ（１４０ａ）を形成するステップとを含む。
【図1b】本発明によるＳＥＲＳタグの製造方法の一実施形態を概略的に示す。この特定の製造方法では、連続フロー反応器は、２個の加圧タンク（１１１ｂ，１１２ｂ）と、Ｔ管継手（１１３ｂ）と、収集リザーバ（１１４ｂ）とを備え、２個の加圧タンク（１１１ｂ，１１２ｂ）はそれぞれ、管を介してＴ管継手（１１３ｂ）に接続されており、このＴ管継手（１１３ｂ）自体は、管を介して収集リザーバ（１１４ｂ）に接続されている。この製造方法は、同時に、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで、Ｔ管継手（１１３ｂ）を連続フロー反応器の収集リザーバ（１１４ｂ）に接続する管において、加圧タンク（１１２ｂ）によって供給され、且つプラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子から本質的になる第１のコロイド（１３０ｂ）であって、該ナノ粒子が、それらの表面に安定剤（図示せず）を吸着している、第１のコロイド（１３０ｂ）を、加圧タンク（１１１ｂ）によって供給され、且つプラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子（１２１ｂ）から本質的になる第２のコロイド（１２０ｂ）であって、該ナノ粒子が、それらの表面にラマン活性レポーター分子（１２２ｂ）及び安定剤（図示せず）を吸着している、第２のコロイド（１２０ｂ）と組み合わせて混合するステップを含む。約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨでの混合は、ナノ粒子の凝集を誘発する。凝集ステップは、収集リザーバ（１１４ｂ）で停止され、それによって、標的ＳＥＲＳタグ（１４０ｂ）がもたらされる。
【図1c】本発明によるＳＥＲＳタグの製造方法の一実施形態を概略的に示す。この特定の製造方法では、連続フロー反応器は、３個の加圧タンク（１１１ｃ，１１２ｃ，１５０ｃ）と、Ｔ管継手（１１３ｃ）と、収集リザーバ（１１４ｃ）とを備える。２個の加圧タンク（１１１ｃ，１１２ｃ）はそれぞれ、管を介してＴ管継手（１１３ｃ）に接続されており、このＴ管継手（１１３ｃ）自体は、管を介して収集リザーバ（１１４ｃ）に接続されている。この製造方法は、同時に、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで、Ｔ管継手（１１３ｃ）を連続フロー反応器の収集リザーバ（１１４ｃ）に接続する管において、加圧タンク（１１２ｃ）によって供給され、且つプラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子から本質的になる第１のコロイド（１３０ｃ）であって、ナノ粒子が、それらの表面に安定剤（図示せず）を吸着している、第１のコロイド（１３０ｃ）を、加圧タンク（１１１ｃ）によって供給され、且つプラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒（図示せず）に分散されたナノ粒子（１２１ｃ）から本質的になる第２のコロイド（１２０ｃ）であって、該ナノ粒子が、それらの表面にラマン活性レポーター分子（１２２ｃ）及び安定剤（図示せず）を吸着している、第２のコロイド（１２０ｃ）と組み合わせて混合するステップを含む。約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨでの混合は、ナノ粒子の凝集を誘発する。凝集ステップは、加圧タンク（１５０ｃ）に貯蔵されている水を収集リザーバ（１１４ｃ）に繋がる管に導入してコロイドを希釈することで、加圧タンク（１５０ｃ）に貯蔵されている塩基性溶液を収集リザーバ（１１４ｃ）に繋がる管に導入することで、加圧タンク（１５０ｃ）に貯蔵されているポリマーを収集リザーバ（１１４ｃ）に繋がる管に導入することで、又は加圧タンク（１５０ｃ）に貯蔵されている誘電体前駆体を収集リザーバ（１１４ｃ）に繋がる管に導入することで停止され、それによって、標的ＳＥＲＳタグ（１４０ｃ）がもたらされる。
【図2c】凝集反応時間に伴うＳＥＲＳシグナル強度の変化を示す。図２ｃは、実施例Ｅ１３に記載されているように製造されたＳＥＲＳタグの凝集反応時間に伴うＳＥＲＳ強度の変化を示す。横軸は、秒での凝集反応時間に対応し、縦軸は、７８５ｎｍの励起でのＳＥＲＳ応答に対応する。報告されたＳＥＲＳ強度は、所定の金濃度で１秒ごとに１００ｍｓの積分時間で測定され、このシグナル強度は、１２．５μｇＡｕ／ｍＬに希釈されて１秒の積分でスキャンされたサンプルと相関していた。
【図3b】実施例Ｅ９（図３ａ）及び１０（図３ｂ）によって製造された異なるサイズのナノ粒子を含有するＳＥＲＳタグから撮影されたＳＥＭ画像を示す。ＳＥＭ画像によって証明されているように、本発明によって製造されたＳＥＲＳタグは、二量体、三量体、及び四量体などの少数凝集体が豊富であり、狭いサイズ分布を示す。
【図4】該コロイドを１ＮのＨＣｌ水溶液又は１ＮのＮａＯＨ水溶液で滴定した場合の、第１のコロイドＡ２（黒丸でプロット）と第２のコロイドＤ２（黒三角でプロット）、Ｄ５（黒の菱形でプロット）とＤ６（黒四角でプロット）のζ電位値を示すプロットである。横軸は、ｐＨ値に対応し、縦軸は、ζ電位値（ｍＶ）に対応する。凝集が観察された（すなわち、コロイドが不安定である）条件は、丸で囲まれている。図４で証明されているように、－２５ｍＶ未満のζ電位値を特徴とする様々なコロイドが安定している。そのようなコロイドは、本発明による製造方法において、それぞれ第１及び第２のコロイドとして使用することができる。
【図5】フローシステムにおいて凝集するコロイドのＳＥＲＳシグナル強度の進展を示す。各測定は、長さ７ｍの透明なＦＥＰチューブに沿って１メートルのマーキングで行われた。実線で結ばれた菱形で表されるデータは、実施例Ｅ８に記載されているように生成されたＳＥＲＳタグにおいて取得された。点線で結ばれた円で表されたデータは、実施例Ｅ１１に記載されているように生成されたＳＥＲＳタグにおいて取得された。
【0013】
［詳細な説明］
定義
以下の定義は、本明細書に論じられている、特許請求の範囲に記載された用語の意味を解釈するために使用すべきである。
定義
以下の定義は、本明細書に論じられている、特許請求の範囲に記載された用語の意味を解釈するために使用すべきである。
【0014】
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ／ａｎ）」は、１つ及び１つより多くを示し、必ずしもその指示対象名詞を単数に限定するものではない。
【0015】
本明細書で使用される場合、「少なくとも」という用語は、１つ又は１つより多く、例えば、１つ又は２つ又は３つを定義することを意味している。
【0016】
本明細書で使用される「含む」という用語は、非排他的且つ非限定的であることを意図している。したがって、例えば、化合物Ａを含む溶液は、Ａ以外の他の化合物を含み得る。しかしながら、「含む」という用語は、その特定の実施形態として、「から本質的になる」及び「からなる」というより限定的な意味も包含し、そのため、例えば、「Ａ、Ｂ、及び任意選択でＣを含む溶液」は、Ａ及びＢから（本質的に）なる場合もあれば、Ａ、Ｂ、及びＣから（本質的に）なる場合もある。
【0017】
本明細書が「好ましい」実施形態／特徴に言及する場合、これらの「好ましい」実施形態／特徴の組み合わせもまた、「好ましい」実施形態／特徴のこの組み合わせに技術的に意味がある限り、開示されていると考えられるべきである。
【0018】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該の量又は値が、指定された特定の値又はその近傍のある他の値であり得ることを意味する。一般に、特定の値を示す「約」という用語は、値の±５％以内の範囲を示すことを意図している。一例として、「約１００」という語句は、１００±５の範囲、すなわち、９５～１０５の範囲を示す。好ましくは、「約」という用語で示される範囲は、値の±３％以内、より好ましくは±１％以内の範囲を示す。一般に、「約」という用語が使用される場合、本発明による同様の結果又は効果が、示された値の±５％の範囲内で得られ得ることが期待できる。
【0019】
驚くべきことに、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）タグ、好ましくは、セキュリティ要素としての使用のためのＳＥＲＳタグを製造する方法であって、
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは約４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む方法によって、高い費用効率及び有利な手段で、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を有する大量のＳＥＲＳタグが提供される。この方法は、ＳＥＲＳタグの指紋として使用すべきラマン活性レポーター分子に関して、又は第１及び第２のコロイドに含有されるプラズモン表面を有するナノ粒子のサイズに関して、制限がなく、それによって、様々なＳＥＲＳタグの製造が可能になる。
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは約４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む方法によって、高い費用効率及び有利な手段で、狭いサイズ分布及び高比率の少数凝集体を有する大量のＳＥＲＳタグが提供される。この方法は、ＳＥＲＳタグの指紋として使用すべきラマン活性レポーター分子に関して、又は第１及び第２のコロイドに含有されるプラズモン表面を有するナノ粒子のサイズに関して、制限がなく、それによって、様々なＳＥＲＳタグの製造が可能になる。
【0020】
当業者に周知であり、本明細書で使用されているように、ＳＥＲＳタグは、プラズモン表面と、ナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子とを呈する複数のナノ粒子の１つの凝集体を含む。プラズモン表面を呈するナノ粒子は、ラマン増幅に必要な電場の生成に関与しており、ラマン活性レポーター分子は、ＳＥＲＳタグの独自の振動指紋をもたらす。ＳＥＲＳタグは、表面にラマン活性分子が吸着したナノ粒子凝集体を外部媒体から分離する外部コーティング層をさらに含み得る。したがって、外部コーティング層は、ａ）ＳＥＲＳタグを外部媒体から分離し、それによって、ラマン活性レポーター分子が、ＳＥＲＳタグから浸出することが防がれ、ＳＥＲＳタグが、偽ピークを生じさせ得る外部媒体の汚染から保護され、ｂ）ＳＥＲＳタグのコロイド安定性を高め、且つｃ）さらなる化学的官能化のための好都合な表面を形成する。外部コーティング層は、シリカと、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（スチレン－ａｌｔ－マレイン酸）ナトリウム塩（ＰＳＭＡ）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）などのポリマーを含む。
【0021】
提示されているＳＥＲＳシグナルによると、本明細書で特許請求及び記載されている製造方法によって得られたＳＥＲＳタグは、文書及び物品を偽造及び違法な複製から保護するためのセキュリティ要素として特に有用である。本明細書で使用される場合、「セキュリティ要素」という用語は、セキュリティ文書又は物品の真正性を判定し、且つこれを偽造及び違法な複製から保護する目的で、セキュリティ文書又は物品に組み込まれ得る又は適用され得る要素を指す。セキュリティ要素は、本発明による製造方法によって得られたＳＥＲＳタグを含有するインク、ワニス、又はコーティング組成物でセキュリティ要素又は物品に印刷、コーティング、又は噴霧された証印、画像、パターン、又はグラフィック要素であり得る。或いは、ＳＥＲＳタグは、セキュリティ文書の基材に統合される場合、セキュリティ要素として機能し得る。「セキュリティ文書」及び「セキュリティ物品」という用語は、偽造又は違法な複製の試みに対して潜在的に責任を負わせるような価値を有し、通常、少なくとも１つのセキュリティ特徴によって偽造又は詐欺から保護されている、文書又は物品を指す。本書で使用されている「セキュリティ物品」という用語は、それらの内容を保証するために、偽造及び／又は違法な複製から保護すべきすべての物品を包含する。セキュリティ文書の例としては、価値のある文書及び価値のある商品が挙げられるが、これらに限定されることはない。価値のある文書の典型的な例としては、銀行券、証書、チケット、小切手、バウチャー、証紙、タックスラベル（ｔａｘ ｌａｂｅｌｓ）、契約書など、身分証明書、例えば、パスポート、身分証明書、査証、銀行カード、クレジットカード、トランザクションカード、アクセス文書、入場券などが挙げられるが、これらに限定されることはない。価値のある商品は、特に、化粧品、栄養補助品、医薬品、アルコール、タバコ製品、飲料又は食品、電気／電子製品、布地又は宝石、すなわち、例えば真正な薬などの包装の内容物を保証するために偽造及び／若しくは違法な複製から保護すべき物品のための包装材料を包含する。包装材料の例としては、認証ブランドラベル、改ざん証拠ラベル及びシールなどのラベルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0022】
本発明の意味において、「ナノ粒子」という用語は、２０±５ｎｍ～１６０±５ｎｍ、好ましくは４０±５ｎｍ～１４０±５ｎｍの範囲の最大物理的寸法（例えば、長さ、直径など）に対応するサイズを有する単一の粒子として定義される。本発明で使用されるナノ粒子は、プラズモン表面を有し、すなわち、ナノ粒子は、ラマン活性分子のラマン散乱を増強することができる外側表面を有する。ナノ粒子の外側表面は、既知のＳＥＲＳ増強材料から作製されている。好ましくは、ＳＥＲＳ増強材料は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、又はそれらの混合物若しくは合金から選択され、より好ましくは、金（Ａｕ）である。本発明で使用されるナノ粒子は、中実又は中空、好ましくは中実であり得る。中実ナノ粒子は、単一の材料、すなわち、ナノ粒子の外側表面のＳＥＲＳ増強材料から作製されていても、又はより多くの材料から作製されていても、すなわち、ナノ粒子のコアの材料（複数可）が、ナノ粒子の外側表面のＳＥＲＳ増強材料とは異なっていてもよい。中空ナノ粒子とは、コアが空所となっているナノ粒子である。ナノ粒子は、生成可能な任意の形状を有し得る。好ましくは、ナノ粒子は、中実Ａｕナノ粒子である。好ましくは、ナノ粒子は、球体、回転楕円体、ロッド、ディスク、角柱、及び立方体からなる群から選択される形状を有し、より好ましくは、球体及び回転楕円体から選択され、さらにより好ましくは、ナノ粒子は、回転楕円体の形状を有する。
【0023】
本明細書で使用される場合、「実質的に同じサイズを有するナノ粒子」という表現は、該ナノ粒子が、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）若しくは走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）などの電子顕微鏡法によって、又は該当する場合はＨａｉｓｓ及び共同研究者（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、４２１５～４２２１）の方法によって該ナノ粒子について決定される平均サイズの±２０ｎｍ以内、好ましくは±１０ｎｍ以内の最大物理的寸法（例えば、長さ、直径など）に対応するサイズを有することを意味する。
【0024】
第１のコロイド、第２のコロイド、及びステップｂ１）で用意されるコロイドのナノ粒子は、水性溶媒に分散されている。本明細書で使用される場合、「水性溶媒」という用語は、水、及び水と１種以上の水混和性溶媒との混合物を指し、水混和性溶媒は、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、及びアセトニトリルを含む一覧から選択される。
【0025】
この製造方法のステップａ）で用意される第１のコロイド、この製造方法のステップｂ）で用意される第２のコロイド、並びにこの製造方法のステップｂ１）で用意されるコロイドは、安定化の目的のポリマー又は界面活性剤を含有しない。ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）又は界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）によるコロイド安定化は、当技術分野で周知である。しかしながら、ラマン活性レポーター分子の添加前にポリマー及び界面活性剤がコロイドに添加されることから、ポリマー及び界面活性剤によって、ラマン活性レポーター分子の吸着のためのナノ粒子における利用可能な表面が大幅に減少し、凝集体内のコロイド粒子間の間隔が広がり、したがって、より低いＳＥＲＳシグナル強度を呈するＳＥＲＳタグが生じる。この欠点を回避するために、第１のコロイド、第２のコロイド、並びにステップｂ１）で用意されるコロイドは、界面活性剤及びポリマーを含まない。
【0026】
第１のコロイド、第２のコロイド、及びステップｂ１）で用意されるコロイドのナノ粒子の表面に吸着された安定剤は、好ましくは、カルボン酸、カルボン酸塩、リン酸、リン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びそれらの混合物から選択される。ナノ粒子表面へのラマン活性レポーター分子の吸着中のラマン活性レポーター分子と安定剤との間の競合を回避するために、好ましくは、安定剤は、ＳＥＲＳ増強材料に対して、特に金に対して親和性を示す基を含有しない。そのような基の例は、窒素含有基、硫黄含有基、エチニル基、シアノ基、及びイソシアニド基である。
【0027】
本明細書で使用される場合、「カルボン酸」という用語は、カルボキシル基（Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）を含む有機化合物を指し、乳酸などのモノカルボン酸（すなわち、単一のカルボキシル基を含有する有機化合物）、及びクエン酸などのポリカルボン酸（すなわち、２個以上のカルボキシル基を含有する有機化合物）を包含する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「カルボン酸塩」という用語は、カルボン酸のナトリウム塩又はカリウム塩を指す。
【0029】
好ましくは、安定剤は、カルボン酸、カルボン酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びそれらの混合物から選択される。さらにより好ましくは、安定剤は、クエン酸、クエン酸塩、乳酸、乳酸塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びそれらの混合物から選択される。クエン酸塩としては、クエン酸二水素一ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸二水素一カリウム、クエン酸水素二カリウム、及びクエン酸三カリウムが挙げられる。乳酸塩としては、乳酸ナトリウム及び乳酸カリウムが挙げられる。アスコルビン酸塩としては、アスコルビン酸ナトリウム及びアスコルビン酸カリウムが挙げられる。最も好ましい実施形態では、安定剤は、クエン酸、クエン酸二水素一ナトリウム、クエン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸二水素一カリウム、クエン酸水素二カリウム、及びクエン酸三カリウム、並びにそれらの混合物から選択される。
【0030】
有利には、本明細書で特許請求及び記載されている製造方法は、任意のラマン活性レポーター分子をＳＥＲＳタグに組み込むことを可能にする。好ましいラマン活性レポーター分子としては、ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは、－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨから、並びに／又はＮ含有ヘテロアリール基及び／若しくはＳ含有ヘテロアリール基から選択される１個以上の置換基で置換されたアリール基を含む完全共役分子が挙げられ、残基Ｒ１及びＲ２は、－Ｈ及びアルキルから、好ましくは－Ｈ及びＣ１～Ｃ４アルキルから互いに独立的に選択される。
【0031】
有機化学の当業者に公知であるように、完全共役分子とは、分子全体に広がる共役電子系を有する分子である。共役電子系とは、非局在化電子を有する接続されたｐ軌道の系である。
【0032】
当業者に周知であるように、「アリール基」とは、環炭素原子から１個の水素原子を除去することによって単環式又は多環式芳香族炭化水素化合物から誘導された基である。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントリル、及びピレニルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0033】
Ｓ含有ヘテロ芳香族化合物とは、環状共役π系の一部として硫黄ヘテロ原子を含有する芳香族化合物である。環状共役π系の一部として、Ｓ含有ヘテロ芳香族化合物は、１個以上の窒素原子をさらに含有し得る。Ｓ含有ヘテロアリール基の例としては、チオフェニル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イミダゾチアゾリル、及びイミダゾチアジアゾリルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0034】
Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物とは、環状共役π系の一部として少なくとも１個の窒素ヘテロ原子を含有する芳香族化合物である。環状共役π系の一部として、Ｎ含有ヘテロ芳香族化合物は、１個以上の酸素原子をさらに含有し得る。Ｎ含有ヘテロアリール基の例としては、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル、ジアザナフチル、キナロジニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニル、プリニル、アザフェナントリル、ジアザフェナントリル、アザアントラセニル、ジアザアントラセニル、アザピレニル、ジアザピレニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、及びベンゾオキサジアゾリルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0035】
好ましいラマン活性レポーター分子としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されることはない：
－ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨから選択される１個以上の置換基によって置換されたアリール基からなる完全共役化合物であって、アミノ基（－ＮＨ２）、Ｎ－アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ基、チオール基、エチニル基、シアノ基及びイソシアニド基、Ｎ含有ヘテロアリール基、又はＳ含有ヘテロアリール基を含む一覧から選択される１個以上の置換基によって置換されたアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
置換基Ｒ１及びＲ２が、本明細書で定義されている意味を有し、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
Ｎ含有ヘテロアリール基からなる完全共役化合物であって、Ｎ含有ヘテロアリール基又はＳ含有ヘテロアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
Ｓ含有ヘテロアリール基からなる完全共役化合物であって、Ｓ含有ヘテロアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
並びに
－ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは、－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨ、－ＮＲ３Ｒ４、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から選択される１個以上の置換基によって任意選択で置換されたＮ含有ヘテロアリール基、又は－ＮＲ５Ｒ６、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から選択される１個以上の置換基によって任意選択で置換されたＳ含有ヘテロアリール基から選択される１個以上、好ましくは少なくとも２個の置換基によって置換されたアリール基からなる完全共役化合物であって、水素原子に直接接続されており、置換基Ｒ１及びＲ２が、本明細書で定義されている意味を有し、置換基Ｒ３～Ｒ６が、－Ｈ及びアルキルから、好ましくは－Ｈ及びＣ１～Ｃ４アルキルから互いに独立的に選択される、完全共役化合物。
－ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨから選択される１個以上の置換基によって置換されたアリール基からなる完全共役化合物であって、アミノ基（－ＮＨ２）、Ｎ－アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ基、チオール基、エチニル基、シアノ基及びイソシアニド基、Ｎ含有ヘテロアリール基、又はＳ含有ヘテロアリール基を含む一覧から選択される１個以上の置換基によって置換されたアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
置換基Ｒ１及びＲ２が、本明細書で定義されている意味を有し、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
【化1】
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
Ｎ含有ヘテロアリール基からなる完全共役化合物であって、Ｎ含有ヘテロアリール基又はＳ含有ヘテロアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
【化2】
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
Ｓ含有ヘテロアリール基からなる完全共役化合物であって、Ｓ含有ヘテロアリール基に直接又はリンカー－Ｌ１－を介して接続されており、
リンカー－Ｌ１－が、－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
【化3】
から選択され、
置換基Ｒ８～Ｒ１５が、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される、完全共役化合物、
並びに
－ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは、－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨ、－ＮＲ３Ｒ４、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から選択される１個以上の置換基によって任意選択で置換されたＮ含有ヘテロアリール基、又は－ＮＲ５Ｒ６、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から選択される１個以上の置換基によって任意選択で置換されたＳ含有ヘテロアリール基から選択される１個以上、好ましくは少なくとも２個の置換基によって置換されたアリール基からなる完全共役化合物であって、水素原子に直接接続されており、置換基Ｒ１及びＲ２が、本明細書で定義されている意味を有し、置換基Ｒ３～Ｒ６が、－Ｈ及びアルキルから、好ましくは－Ｈ及びＣ１～Ｃ４アルキルから互いに独立的に選択される、完全共役化合物。
【0036】
－ＮＲ１Ｒ２、－ＳＨ、－≡、－≡Ｎ及び－Ｎ＝から、好ましくは－ＮＲ１Ｒ２及び－ＳＨから選択される１個以上の置換基によって置換されたアリール基は、好ましくは、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、及びＯ含有ヘテロアリール基から選択される、より好ましくは、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン化物、及びＯ含有ヘテロアリール基から選択される、１個以上のさらなる置換基を含有し得る。
【0037】
Ｎ含有ヘテロアリール基及びＳ含有ヘテロアリール基は、好ましくは、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、チオール、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、イソシアニド、エチニル、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、及びＯ含有ヘテロアリール基から、好ましくは、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン化物、及びＯ含有ヘテロアリール基から選択される１個以上のさらなる置換基を含有し得る。
【0038】
Ｏ含有ヘテロアリール基の例としては、フラニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、及びオキサジアゾリルが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0039】
好ましいラマン活性レポーター化合物は、一般式（Ｉ）：
の化合物であり、
式中、
Ａ１、Ｂ１、及びＣ１は、Ｎ、ＣＲ１６、及びＣＲ１７から互いに独立的に選択されるが、但し、Ａ１、Ｂ１、及びＣ１のうちの１つのみがＮであり、
Ａ２、Ｂ２、及びＣ２は、Ｎ、ＣＲ１８、及びＣＲ１９から互いに独立的に選択されるが、但し、Ａ２、Ｂ２、及びＣ２のうちの１つのみがＮであり、
Ｅ１、Ｄ１、Ｅ２、Ｄ２、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は、水素、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、チオール、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、イソシアニド、アルキニル、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、及びＯ含有ヘテロアリール基から、好ましくは、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン化物、及びＯ含有ヘテロアリール基から互いに独立的に選択され、
Ｘは、単結合であるか、又は－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
から選択されるリンカー－Ｌ２－であり、
式中、Ｒ８～Ｒ１５は、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される。
【化4】
の化合物であり、
式中、
Ａ１、Ｂ１、及びＣ１は、Ｎ、ＣＲ１６、及びＣＲ１７から互いに独立的に選択されるが、但し、Ａ１、Ｂ１、及びＣ１のうちの１つのみがＮであり、
Ａ２、Ｂ２、及びＣ２は、Ｎ、ＣＲ１８、及びＣＲ１９から互いに独立的に選択されるが、但し、Ａ２、Ｂ２、及びＣ２のうちの１つのみがＮであり、
Ｅ１、Ｄ１、Ｅ２、Ｄ２、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は、水素、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノ、チオール、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、イソシアニド、アルキニル、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、アルコキシカルボニル、及びＯ含有ヘテロアリール基から、好ましくは、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロゲン化物、及びＯ含有ヘテロアリール基から互いに独立的に選択され、
Ｘは、単結合であるか、又は－ＣＲ８＝ＣＲ９－、－Ｎ＝Ｎ－、－≡－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｏ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｍ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１０＝ＣＲ１１－ｐ－Ｃ６Ｈ４－ＣＲ１２＝ＣＲ１３－、－ＣＲ１４＝Ｎ－Ｎ＝ＣＲ１５－、
【化5】
から選択されるリンカー－Ｌ２－であり、
式中、Ｒ８～Ｒ１５は、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ホルミル、シアノ、ニトロ、ハロゲン化物、ヒドロキシカルボニル、及びアルコキシカルボニルから選択される。
【0040】
好ましくは、残基Ａ１及びＡ２は、一般式（Ｉ）においてＮである。より好ましくは、一般式（Ｉ）において、残基Ａ１及びＡ２はＮであり、置換基Ｅ１、Ｄ１、Ｅ２、Ｄ２、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ１９は水素である。
【0041】
ラマン活性レポーター分子としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されることはない：２－メルカプトピリジン；ベンゼンチオール；メルカプト安息香酸；４－ニトロベンゼンチオール；３，４－ジクロロベンゼンチオール；３－フルオロチオフェノール；４－フルオロチオフェノール；３－５－ビス（トリフルオロメチル）ベンゼンチオール；４－メルカプトフェノール；ビフェニル－４－チオール、７－メルカプト－４－メチルクマリン、１－（４－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－テトラゾール－５－チオール、２－フルオロチオフェノール、２－ナフタレンチオール、４－（（（３－メルカプト－５－（２－メトキシフェニル）－４Ｈ－１，２，４－トリアゾール－４－イル）イミノ）メチル）フェノール、（２－トリフルオロメチル）ベンゼンチオール、４－アミノチオフェノール、１－ナフタレンチオール、１，１’，４，１’’－テルフェニル－４－チオール、ビフェニル－４，４’－ジチオール、チオサリチル酸、４－（（（３－メルカプト－５－（２－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－トリアゾール－４－イル）イミノ）メチル）－１，２－ベンゼンジオール、４－（（（３－メルカプト－５－（２－ピリジニル）－４Ｈ－１，２，４－トリアゾール－４－イル）イミノ）メチル）安息香酸、２，３，４，６－テトラフルオロベンゼンチオール、（５－（４－メトキシフェニル）－１，３，４－オキシダゾール－２－チオール）、（Ｅ）－１，２－ジ（ピリジン－４－イル）エテン、５－（ピリジン－４－イル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－チオール、及び１，４－ビス（（Ｅ）－２－（ピリジン－４－イル）ビニル）ベンゼン。
【0042】
ステップａ）で用意される第１のコロイドは、－２５ｍＶ以下のζ電位値を特徴とする。ステップｂ）で用意される第２のコロイドは、－２５ｍＶ以下のζ電位値を特徴とする。
【0043】
本明細書で使用される場合、コロイドのζ電位値は、１ｍＬの折り畳まれたキャピラリーセルを有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳを用いて０．０５ｍｇナノ粒子材料／ｍＬの濃度の該コロイドについて測定したζ電位値を指す。必要に応じて、すなわち、０．０５ｍｇナノ粒子材料／ｍＬ超の濃度のコロイドの場合、ζ電位測定の前に、コロイドを脱イオン水で希釈して、０．０５ｍｇナノ粒子材料／ｍＬの濃度を達成する。
【0044】
好ましくは、第１のコロイド及び第２のコロイドのナノ粒子材料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、０．６６ｍｇ／ｍＬ未満であり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約０．３０ｍｇ／ｍＬに含まれ、例えば、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１０ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２０ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、及び０．３０ｍｇ／ｍＬである。
【0045】
第１のコロイドと第２のコロイドとを組み合わせることに続いて、例えば、第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは約４：１～約３：１になるように、第１のコロイドに第２のコロイドを単純に添加することによって、ナノ粒子の凝集を誘発する。本明細書に記載されている凝集は、第２のコロイドのナノ粒子と第１のコロイドのナノ粒子との選択的凝集からなり、すなわち、第１のコロイドのナノ粒子と第１のコロイドのナノ粒子との凝集はなく、第２のコロイドのナノ粒子と第２のコロイドのナノ粒子との凝集は、ないか、又は無視できる程度のものである。
【0046】
ナノ粒子の凝集は、ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によって誘発される。
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によって誘発される。
【0047】
好ましい実施形態では、ナノ粒子の凝集の誘発は、ステップｄ１）、すなわち、ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合するステップを含む。ラマン活性レポーター分子の正味電荷及び該正味電荷に対応するｐＨ値は、Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ＣｈｅｍＡｘｏｎ．ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ／＃／ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）などのオンラインツールを介して予測することができる。約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで、第１のコロイドのナノ粒子と第２のコロイドのナノ粒子との選択的凝集が起こる。
【0048】
或いは、ナノ粒子の凝集の誘発は、ステップｄ２）、すなわち、塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップを含む。塩で誘発されるナノ粒子の凝集は、コロイド化学の当業者にとって、ナノ粒子の凝集を誘発する周知の方法である（ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ２０１８、１９、２４～２８）。水溶液などの溶液として製造方法のステップｄ２）で使用すべき無機塩の例としては、フッ化ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0049】
さらなる代替的な実施形態では、ナノ粒子の凝集の誘発は、ステップｄ３）、すなわち、水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップを含む。水混和性溶媒は、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、及びアセトニトリルを含む一覧から選択される。
【0050】
本発明による好ましい製造方法は、
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは約４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む。
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは約４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含む。
【0051】
好ましくは、本明細書に記載されている製造方法では、ステップｂ）は、ｂ１）からｂ３）の順序で実施される以下のステップ：
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とを含み、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） ラマン活性分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とを含み、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） ラマン活性分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
【0052】
本明細書で特許請求されている製造方法のステップｂ１）で用意されるコロイドは、プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になる。本明細書で特許請求されている製造方法のステップａ）で用意される第１のコロイドは、プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になる。本明細書で特許請求されている製造方法のステップｂ）で用意される第２のコロイドは、プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になる。したがって、第１のコロイドのナノ粒子及び第２のコロイドのナノ粒子は、それらの表面に、第１のコロイドのナノ粒子と第２のコロイドのナノ粒子との間のロックアンドキーメカニズムを介した特定の相互作用を可能にする分子又は有機体を示さない。そのような分子の例としては、抗体、タンパク質、抗原、相補的ＤＮＡ鎖、及び相補的ＲＮＡ鎖が挙げられる。そのような有機体の例としては、細菌、ウイルス、及び胞子が挙げられる。したがって、第１のコロイド、第２のコロイド、並びにステップｂ１）で用意されるコロイドは、界面活性剤及びポリマーを含まないことに加えて、抗体、タンパク質、抗原、相補的ＤＮＡ鎖、及び相補的ＲＮＡ鎖などの分子、並びに細菌、ウイルス、及び胞子などの有機体も含まない。
【0053】
本発明による製造方法のステップｂ２）では、コロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持する。ラマン活性レポーター分子の正味電荷及び該正味電荷に対応するｐＨ値は、Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ＣｈｅｍＡｘｏｎ．ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ／＃／ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）などのオンラインツールを介して予測することができる。
【0054】
好ましくは、ステップｂ２）で、コロイドのｐＨを、約８．２～約１２．１で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持する。より好ましい実施形態では、コロイドのｐＨを、ステップｂ２）で約１１．０の値で調整する。
【0055】
本発明によるステップｂ３）では、溶媒のラマン活性レポーター分子の溶液を、ステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持する。ラマン活性レポーター分子の溶液を調製するために使用される溶媒は、ラマン活性レポーター分子を溶解するのに適した任意の水性溶媒及び任意の有機溶媒を包含する。有機溶媒の例としては、アルコール、好ましくは、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、並びにアセトニトリルから選択されるものが挙げられるが、これらに限定されることはない。水性溶媒としては、水、並びに水と、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、及びアセトニトリルなどの水混和性溶媒との混合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0056】
本発明による好ましい製造方法は、
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含み、
ステップｂ）は、ｂ１）からｂ３）の順序で実施される以下のステップ：
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、約８．０～約１２．１、好ましくは約８．２～１２．１に含まれる値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） 一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
ａ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第１のコロイドを用意するステップと、
ｂ） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、第２のコロイドを用意するステップと、
ｃ） 第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約２５：１～約１：１、好ましくは約５：１～約１：１、より好ましくは４：１～約３：１になるように、第１のコロイドを第２のコロイドと組み合わせ、第３のコロイドを用意するステップと、
ｄ） ステップｄ１）～ｄ３）のいずれか又はそれらの組み合わせ：
ｄ１） ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨで混合するステップ、
ｄ２） 塩溶液、好ましくは無機塩溶液を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ、
ｄ３） 水混和性溶媒を、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに添加するステップ
によってナノ粒子の凝集を誘発するステップと、
ｅ） 凝集を停止するステップと
を含み、
ステップｂ）は、ｂ１）からｂ３）の順序で実施される以下のステップ：
ｂ１） プラズモン表面及び実質的に同じサイズを有し、水性溶媒に分散された複数のナノ粒子と、該複数のナノ粒子の表面に吸着した安定剤とから本質的になり、且つ－２５ｍＶ以下のζ電位値を有する、コロイドを用意するステップ、
ｂ２） コロイドのｐＨを、約８．０～約１２．１、好ましくは約８．２～１２．１に含まれる値で調整し、同時に、－２５ｍＶ以下、好ましくは－４０ｍＶ未満のζ電位値を維持するステップ、並びに
ｂ３） 一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液をステップｂ２）で得られたコロイドに添加し、同時に、－２５ｍＶ以下のζ電位値を維持するステップ
を含む。
【0057】
本発明者等は、ラマン活性レポーター分子のサブ単層又は単層が、第２のコロイドに含有されるナノ粒子の表面に吸着されることを確実にすることによって、本発明によって製造されたＳＥＲＳタグのシグナルの強度をさらに増加させることができることを見出した。したがって、本発明によるさらなる好ましい実施形態は、本明細書で特許請求されているＳＥＲＳタグの製造方法であって、第２のコロイドのナノ粒子が、それらの表面にラマン活性レポーター分子のサブ単層又は単層を吸収している、製造方法に関する。本明細書で使用される場合、第２のコロイドのナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子の単層とは、該ナノ粒子の表面に吸着した１つのラマン活性レポーター分子の厚さの層を指す。本明細書で使用される場合、ラマン活性レポーター分子のサブ単層とは、ラマン活性レポーター分子の不完全な単層を指す。ラマン活性レポーター分子のサブ単分子層又は単層が第２のコロイドのナノ粒子の表面に吸着されることを確実にするために、ステップｂ２）で得られたコロイドにステップｂ３）で添加されるラマン活性レポーター分子の量は、第２のコロイドのナノ粒子の形状及びサイズに応じて、当業者に周知の方法によって計算される必要がある。
【0058】
本明細書で特許請求されている製造方法はまた、異なるラマン活性レポーター分子の混合物、すなわち、２種以上の異なるラマン活性レポーター分子の混合物を含むＳＥＲＳタグの調製も可能にする。これは、限られた数の異なるラマン活性レポーター分子を異なる比率で組み合わせることによって、該ＳＥＲＳタグがそれぞれ固有のＳＥＲＳシグナルを特徴とする様々なＳＥＲＳタグを利用可能にすることから、特に有利である。そのようなＳＥＲＳタグを達成するために、ステップｂ）で用意される第２のコロイドのナノ粒子は、それらの表面に異なるラマン活性レポーター分子の混合物（すなわち、２種以上の異なるラマン活性レポーター分子の混合物）を吸収するように調製される。そのような第２のコロイドは、この製造方法のステップｂ３）で、２種以上の異なるラマン活性レポーター分子を含む、ラマン活性分子を溶媒に溶かした溶液を使用することによって、又はこの製造方法のステップｂ３）を連続的に実施し、異なるラマン活性レポーター分子を含有する異なる溶液を毎回使用することによって、調製され得る。したがって、本発明によるさらなる実施形態は、ステップｂ３）で、ラマン活性レポーター分子を溶媒に溶かした溶液が２種以上の異なるラマン活性レポーター分子の混合物を含む、製造方法に関する。本発明による他のさらなる実施形態は、ステップｂ３）が、残りのｎ－１回のステップで使用される残りのｎ－１個の溶液で使用されるラマン活性レポーター分子とは構造的に異なるラマン活性レポーター分子を含有する溶液を毎回使用して、ｎ≧２でｎ回連続的に実施される、製造方法に関する。本明細書で使用される場合、異なるラマン活性レポーター分子とは、異なる化学構造を有し、且つ異なるＳＥＲＳスペクトルをもたらす、ラマン活性レポーター分子を指す。
【0059】
少数凝集体の数をさらに増加させ、それによって、本明細書で特許請求されている製造方法によって製造されたＳＥＲＳタグによってもたらされるＳＥＲＳシグナルの強度をさらに増加させるために、ステップｃ）で、第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比が、約５：１～約１：１、好ましくは約４：１～約３：１の比になることが好ましい。例えば実施例１０及び図３ｂによって証明されているように、第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比を約５：１～約１：１にすると、二量体、三量体、及び四量体などの少数凝集体の数が多いＳＥＲＳタグが利用可能になる。
【0060】
ステップｄ１）に記載されている方法によって凝集を誘発するためには、ステップｃ）で得られた第３のコロイドを、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨで混合する必要があり、このｐＨは、一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子の場合、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨである。これは、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに酸性溶液を添加することによって、又はステップｄ１）で得られたコロイドが必要ｐＨ値を有するように第１のコロイドのｐＨを調整することによって達成することができる。
【0061】
したがって、本発明による実施形態は、ステップｄ１）が、ステップｃ）で得られた第３のコロイドに酸性溶液をさらに添加することを含み、同時に、得られるコロイドのｐＨが、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるように混合し、このｐＨが、一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子の場合、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨである、製造方法を対象とする。適切な酸性溶液としては、酢酸、塩酸、及び硝酸が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0062】
追加の製造ステップを回避するためには、第１のコロイドのｐＨ値を、ステップｄ１）で得られたコロイドが、約２．２と、ラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値との間に含まれるｐＨを有するように調整することが好都合であり、このｐＨは、一般式（Ｉ）のラマン活性レポーター分子の場合、約２．２～約６．１、好ましくは約２．６～約５．７に含まれるｐＨである。
【0063】
本明細書で特許請求されている製造方法はまた、ステップｅ）凝集停止を含む。好ましくは、ステップｅ）は、以下のステップｅ１）～ｅ４）：
ｅ１） ステップｄ）で得られたコロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整するステップ、
ｅ２） ステップｄ）で得られたコロイドを、好ましくは、コロイドのナノ粒子濃度が６×１０９個のナノ粒子／ｍＬ未満になるように、水で希釈するステップ、
ｅ３） ポリマーを、ステップｄ）で得られたコロイドに添加するステップ、
ｅ４） 誘電体前駆体を、ステップｄ）で得られたコロイドに添加するステップ
のいずれかを含む。
ｅ１） ステップｄ）で得られたコロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整するステップ、
ｅ２） ステップｄ）で得られたコロイドを、好ましくは、コロイドのナノ粒子濃度が６×１０９個のナノ粒子／ｍＬ未満になるように、水で希釈するステップ、
ｅ３） ポリマーを、ステップｄ）で得られたコロイドに添加するステップ、
ｅ４） 誘電体前駆体を、ステップｄ）で得られたコロイドに添加するステップ
のいずれかを含む。
【0064】
本明細書で特許請求されている本発明の製造方法では、凝集は、方法ｅ１）～ｅ４）のいずれかによって停止することができる。
【0065】
ステップｅ１）に記載されているように、ステップｄ）で得られたコロイドのｐＨを、ナノ粒子の表面に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値で調整すると、ナノ粒子凝集体間の静電反発力が増加し、凝集プロセスの停止がもたらされる。ラマン活性レポーター分子の正味電荷及び該正味電荷に対応するｐＨ値は、Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ＣｈｅｍＡｘｏｎ．ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍ／＃／ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）などのオンラインツールを介して予測することができる。
【0066】
ステップｅ３）に記載されているように、ステップｄ）で得られたコロイドにポリマーを添加すると、ナノ粒子凝集体間の立体反発が増加し、凝集プロセスの停止がもたらされる。有利には、ステップｅ３）で使用されるポリマーは、ＳＥＲＳタグによって呈されるＳＥＲＳシグナルに影響しない。適切なポリマーとしては、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0067】
ステップｅ４）に記載されているように、ステップｄ）で得られたコロイドに誘電体前駆体を添加すると、ナノ粒子凝集体が少なくとも１層の誘電体でカプセル化され、それによって、ＳＥＲＳタグが安定し、暗黙的に凝集プロセスが停止する。好ましくは、誘電体前駆体は、シリカ前駆体である。シリカ前駆体としては、エタノール中のテトラエチルオルトシリケート及び３－アミノプロピルトリメトキシシランの溶液、エタノール中のテトラエチルオルトシリケート及び（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシランの溶液、水中のケイ酸ナトリウムの溶液、及び水中の（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシランの溶液が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【0068】
或いは、ステップｄ）で得られたコロイドを水で希釈することによって、凝集プロセスを停止することができる。好ましくは、凝集は、ステップｄ）で得られたコロイドを１２．５μｇ／ｍＬ以下のナノ粒子材料濃度［μｇ／ｍＬ］に達するように水で希釈することによって停止される（例えば、Ｅ１～Ｅ８、Ｅ１１～Ｅ１４を参照）。或いは、凝集は、ステップｄ）で得られたコロイドを６×１０９個のナノ粒子／ｍＬ未満のナノ粒子濃度に達するように水で希釈することによって停止される。
【0069】
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＳＥＲＳタグの製造方法であって、ステップｅ）が、ステップｅ３）から本質的になり、製造方法が、ステップｅ３）で得られたコロイドを水で希釈すること、及び／又はＳＥＲＳタグを誘電体でコーティングすることをさらに含む、製造方法を対象とする。
【0070】
さらなる好ましい実施形態では、本明細書で特許請求されている製造方法のステップｃ）及びｄ）は、連続フローシステムにおいて同時に実施される。この特定の製造方法では、連続フロー反応器が使用される。そのような連続フロー反応器は、図１ｂ及び図１ｃに概略的に示されており、管を介してＴ管継手（１１３ｂ，１１３ｃ）に接続された２個の加圧タンク（１１１ｂ，１１２ｂ，１１１ｃ，１１２ｃ）と、収集リザーバ（１１４ｂ，１１４ｃ）とを備える。第２のコロイドが加圧タンク（１１１ｂ，１１１ｃ）に貯蔵されており、第１のコロイドが加圧タンク（１１２ｂ，１１２ｃ）に貯蔵されている。大気に開放されている容器（１１４ｂ，１１４ｃ）を使用して、ＳＥＲＳタグを収集し、任意選択で凝集を停止する（１１４ｃ）。コロイド輸送には、加圧タンク（１１１ｂ，１１２ｂ，１１１ｃ，１１２ｃ）それぞれをＴ管継手（１１３ｂ，１１３ｃ）に接続する管が使用される。Ｔ管継手（１１３ｂ，１１３ｃ）を収集容器（１１４ｂ，１１４ｃ）に接続するさらなる管が、凝集を実施するために使用される。凝集によって得られたナノ粒子凝集体は、収集容器（１１４ｂ）に収集され、そこで凝集が停止する。
【0071】
製造方法のステップｃ）及びｄ）が連続フローシステムにおいて同時に行われる場合、ステップｅ）も連続フローシステムにおいて実施されることがさらに好ましい。
【0072】
上述のように、ＳＥＲＳタグの製造方法で使用されるナノ粒子は、球体、回転楕円体、ロッド、ディスク、角柱、及び立方体などの製造可能な任意の形状を有し得る。好ましくは、本明細書で特許請求されている本発明の製造方法で使用されるプラズモン表面を有するナノ粒子の形状は、球体及び回転楕円体から選択される。さらにより好ましくは、該ナノ粒子は、回転楕円体の形状を有する。
【0073】
好ましい実施形態では、第１のコロイドのナノ粒子及び第２のコロイドのナノ粒子は、同じサイズを有する。好都合なことに、ＳＥＲＳタグのそのような製造方法では、第２のコロイド（すなわち、ステップｂ１）で供されるコロイド）の調製に使用されるコロイドは、第１のコロイドである。
【0074】
代替的な実施形態では、第１のコロイドのナノ粒子サイズは、第２のコロイドのナノ粒子サイズとは異なる。例えば、第１のコロイドのナノ粒子のサイズは、第２のコロイドのナノ粒子のサイズより小さい場合があり、それによって、図３ａに示されるＳＥＲＳタグと同様の構造を有するＳＥＲＳタグが得られるか、又は第１のコロイドのナノ粒子のサイズは、第２のコロイドのナノ粒子のサイズより大きい場合があり、それによって、図３ｂに示されるＳＥＲＳタグと同様の構造を有するＳＥＲＳタグが得られる。
【0075】
本明細書で特許請求されている製造方法は、好ましくはコロイドを用いて行われ、第１のコロイドのナノ粒子のプラズモン表面及び／又は第２のコロイドのナノ粒子のプラズモン表面は、金から作製されており、より好ましくは中実金ナノ粒子を含むコロイドを用いて、さらにより好ましくはクエン酸塩で安定化された金コロイドを用いて作製されている。
【0076】
［実施例］
これより、本発明を以下の非限定的な実施例に関してより詳細に説明する。
これより、本発明を以下の非限定的な実施例に関してより詳細に説明する。
【0077】
全般
以下の試薬を以下のサプライヤーから得た：
テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（＞９９．９％；ＣＡＳ番号：１６９６１－２５－４）、水素化ホウ素ナトリウム（９９．９９％；ＣＡＳ番号：１６９４０－６６－２）、クエン酸ナトリウム三塩基二水和物（≧９９．５％；ＣＡＳ番号：６１３２－０４－３）、（Ｅ）－１，２－ジ（ピリジン－４－イル）エテン（９７％；ＣＡＳ番号：１３３６２－７８－２）、５－（ピリジン－４－イル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－チオール（９７％；ＣＡＳ番号：１５２６４－６３－８）、水酸化ナトリウム（ＡＣＳ試薬、≧９７％；ＣＡＳ番号：１３１０－７３－２）、塩酸ヒドロキシルアミン（９９．９９９％；ＣＡＳ番号：５４７０－１１－１）、テレフタルアルデヒド（ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ、９９％、ＣＡＳ番号：６２３－２７－８）、４－メチルピリジン（９９％；ＣＡＳ番号：１０８－８９－４）、無水酢酸（ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ、≧９９％；ＣＡＳ番号：１０８－２４－７）、ジクロロメタン（無水、９９．８％；ＣＡＳ番号：７５－０９－２）、及びメタノール（ＨＰＬＣ、≧９９．９％；ＣＡＳ番号：６７－５６－１）を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩酸（微量金属グレード、３４～３７％；ＣＡＳ番号：７６４７－０１－０）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
以下の試薬を以下のサプライヤーから得た：
テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（＞９９．９％；ＣＡＳ番号：１６９６１－２５－４）、水素化ホウ素ナトリウム（９９．９９％；ＣＡＳ番号：１６９４０－６６－２）、クエン酸ナトリウム三塩基二水和物（≧９９．５％；ＣＡＳ番号：６１３２－０４－３）、（Ｅ）－１，２－ジ（ピリジン－４－イル）エテン（９７％；ＣＡＳ番号：１３３６２－７８－２）、５－（ピリジン－４－イル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－チオール（９７％；ＣＡＳ番号：１５２６４－６３－８）、水酸化ナトリウム（ＡＣＳ試薬、≧９７％；ＣＡＳ番号：１３１０－７３－２）、塩酸ヒドロキシルアミン（９９．９９９％；ＣＡＳ番号：５４７０－１１－１）、テレフタルアルデヒド（ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ、９９％、ＣＡＳ番号：６２３－２７－８）、４－メチルピリジン（９９％；ＣＡＳ番号：１０８－８９－４）、無水酢酸（ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ、≧９９％；ＣＡＳ番号：１０８－２４－７）、ジクロロメタン（無水、９９．８％；ＣＡＳ番号：７５－０９－２）、及びメタノール（ＨＰＬＣ、≧９９．９％；ＣＡＳ番号：６７－５６－１）を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。塩酸（微量金属グレード、３４～３７％；ＣＡＳ番号：７６４７－０１－０）をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【0078】
ζ電位値は、１ｍＬの折り畳まれたキャピラリーセル（ＤＴＳ１０６０）を有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳを使用して測定した。光吸収スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３分光光度計及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ６５０で記録した。
【0079】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４５００で撮影した。
【0080】
Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＱＥ６５００で７８５ｎｍのラマンスペクトルを得た。
【0081】
公称１４０ｎｍの金コロイド粒子は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングのために、サンプルをＥＡＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送ることによってサイズ分類した。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）で分析した。数平均粒子サイズが公称直径の±９ｎｍ以内である場合、バッチは公称１４０ｎｍであると考えられ、その際、数平均粒子サイズは、ＴＥＭ顕微鏡写真で２３０個の個々の粒子を測定することによって決定した。個々の粒子を記述するために選択されるサイズ関連の特性は、「円等価」（ＣＥ）直径であり、これは、粒子の正投影と同じ面積を有する円の直径に対応する。
【0082】
４０、６０、９０ｎｍのナノ粒子バッチの金ナノ粒子の直径ｄ（ｎｍ）は、方程式：
［式中、λｓｐｒは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ６５０ ＵＶ Ｖｉｓでコロイドサンプルから得られた吸光度プロットの表面プラズモン共鳴ピーク位置である］
を使用して、Ｈａｉｓｓ及び共同研究者の方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、４２１５～４２２１）によって計算した。表面プラズモン共鳴ピーク位置が公称直径の±９ｎｍ以内の直径と相関している場合、バッチは、公称４０ｎｍ、６０ｎｍ、又は９０ｎｍであると考えられた。
【数1】
［式中、λｓｐｒは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ６５０ ＵＶ Ｖｉｓでコロイドサンプルから得られた吸光度プロットの表面プラズモン共鳴ピーク位置である］
を使用して、Ｈａｉｓｓ及び共同研究者の方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７、７９、４２１５～４２２１）によって計算した。表面プラズモン共鳴ピーク位置が公称直径の±９ｎｍ以内の直径と相関している場合、バッチは、公称４０ｎｍ、６０ｎｍ、又は９０ｎｍであると考えられた。
【0083】
Ｉ． Ａｕコロイド原液（Ｓ１～Ｓ４）の調製
表１に示されるＡｕナノ粒子サイズ（ｎｍ）、Ａｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）、及びｐＨ値を特徴とする金コロイド原液（Ｓ１～Ｓ４）を以下のように製造した：
Ｉ．１ ４０ｎｍの金コロイド原液（Ｓ１）の調製
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（１００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７４．３ｇ）及び２３．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（１５５．６ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０６３重量％の溶液としての８００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨ値を有する４０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ１）を用意した。
表１に示されるＡｕナノ粒子サイズ（ｎｍ）、Ａｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）、及びｐＨ値を特徴とする金コロイド原液（Ｓ１～Ｓ４）を以下のように製造した：
Ｉ．１ ４０ｎｍの金コロイド原液（Ｓ１）の調製
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（１００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７４．３ｇ）及び２３．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（１５５．６ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０６３重量％の溶液としての８００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨ値を有する４０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ１）を用意した。
【0084】
Ｉ．２ ６０ｎｍの金コロイド原液（Ｓ２）の調製
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７３．３ｇ）及び１７．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（２１７．１ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０５２重量％の溶液としての８００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出した。バッチを１７ＭΩの水で１６０Ｌに希釈し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する６０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ２）を得た。
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７３．３ｇ）及び１７．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（２１７．１ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０５２重量％の溶液としての８００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出した。バッチを１７ＭΩの水で１６０Ｌに希釈し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する６０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ２）を得た。
【0085】
Ｉ．３ ９０ｎｍの金コロイド原液（Ｓ３）の調製
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７３．３ｇ）及び１７．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（２１７．１ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０１重量％の溶液としての９００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出した。バッチを１７ＭΩの水で１６０Ｌに希釈し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する９０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ３）を得た。
ジャケット付きの完全に洗浄された１００Ｌガラス反応器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ）で、７９．５Ｌの１７ＭΩの水を３．５±０．５℃に冷却した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２００ｇ）を、４００ｒｐｍでインペラによって撹拌しながら添加した。３０重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１７３．３ｇ）及び１７．５重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（２１７．１ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。１０秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０１重量％の溶液としての９００μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。これらの試薬を２分間反応させ、次いで、きれいなドラムに排出した。バッチを１７ＭΩの水で１６０Ｌに希釈し、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する９０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ３）を得た。
【0086】
Ｉ．４ １４０ｎｍの金コロイド原液（Ｓ４）の調製
２Ｌのガラス製水差し内で、１．５Ｌの１７ＭΩの水を室温で撹拌した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２．５ｇ）を、撹拌しながら添加した。３０．７重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１５．３７ｇ）及び１６．７重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（８．３７ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。５秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０１重量％の溶液としての２５μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。さらに１５分間撹拌して、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する１４０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ４）を用意した。
２Ｌのガラス製水差し内で、１．５Ｌの１７ＭΩの水を室温で撹拌した。２０重量％の水溶液としてのテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸三水和物（２．５ｇ）を、撹拌しながら添加した。３０．７重量％の水溶液としてのクエン酸ナトリウム三塩基二水和物（１５．３７ｇ）及び１６．７重量％の水溶液としての塩酸ヒドロキシルアミン（８．３７ｇ）を組み合わせて、反応器に添加した。５秒後に、０．０１Ｎ水酸化ナトリウム中の０．０１重量％の溶液としての２５μＬの水素化ホウ素ナトリウムを反応器に注入した。さらに１５分間撹拌して、０．２５ｍｇＡｕ／ｍＬの金濃度及び約２．４のｐＨを有する１４０ｎｍのＡｕコロイド原液（Ｓ４）を用意した。
【0087】
【表1】
【0088】
ＩＩ． 第１のコロイドの調製（Ａ１～Ａ９）（製造方法のステップａ））
第１のコロイド（Ａ１～Ａ９）を、Ａｕコロイド溶液Ｓ１、Ｓ２、及びＳ４から出発して得た。必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＡ１及びＡ７）Ａｕコロイド原液を脱イオン水で希釈して、それによって、表２に示されるＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を得た。さらに、必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＡ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ９）そのまま又は希釈後のＡｕコロイド原液を、第１のコロイドのｐＨ値を表２に示されるｐＨ値に調整するように、０．１ｍＭのＮａＯＨ水溶液又は０．１ｍＭのＨＣｌ水溶液で処理する。
第１のコロイド（Ａ１～Ａ９）を、Ａｕコロイド溶液Ｓ１、Ｓ２、及びＳ４から出発して得た。必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＡ１及びＡ７）Ａｕコロイド原液を脱イオン水で希釈して、それによって、表２に示されるＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を得た。さらに、必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＡ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ９）そのまま又は希釈後のＡｕコロイド原液を、第１のコロイドのｐＨ値を表２に示されるｐＨ値に調整するように、０．１ｍＭのＮａＯＨ水溶液又は０．１ｍＭのＨＣｌ水溶液で処理する。
【0089】
【表2】
【0090】
安定した第１のコロイド、すなわち、凝集が起こらないコロイドのみが、本発明による製造方法で使用するのに適している。第１のコロイドＡ１～Ａ９は、安定しており、すなわち、ピンクから紫への色の変化の視覚的検出によっては、Ａｕナノ粒子の凝集は識別できなかった。さらに、図４で証明されているように、ゼータ電位値が以下の項目ＩＶに記載されているように測定して－２５ｍＶ以下であることを特徴とする様々なＡｕコロイドが安定している。したがって、そのようなＡｕコロイドは、本発明による製造方法における第１のコロイドとしても有用である。
【0091】
ＩＩＩ． Ａｕナノ粒子とＡｕナノ粒子の表面に吸着したラマン活性レポーター分子とを含有する第２のコロイドの調製（Ｄ１～Ｄ１１）（製造方法のステップｂ））
表３に示されるＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）及びｐＨ値を特徴とするＡｕコロイド（Ｂ１～Ｂ８）をＡｕコロイド原液Ｓ１～Ｓ３から調製した。調製には、必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＢ１及びＢ５）Ａｕコロイド原液を、示されたＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を得るように脱イオン水で希釈することと、そのまま又は希釈後のＡｕコロイド原液に１ＭのＮａＯＨ水溶液を添加することによってｐＨ値を調整することとが伴う。
表３に示されるＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）及びｐＨ値を特徴とするＡｕコロイド（Ｂ１～Ｂ８）をＡｕコロイド原液Ｓ１～Ｓ３から調製した。調製には、必要に応じて、（例えば、ＡｕコロイドＢ１及びＢ５）Ａｕコロイド原液を、示されたＡｕ濃度（ｍｇ／ｍＬ）を得るように脱イオン水で希釈することと、そのまま又は希釈後のＡｕコロイド原液に１ＭのＮａＯＨ水溶液を添加することによってｐＨ値を調整することとが伴う。
【0092】
【表3】
【0093】
ラマン活性レポーター分子である１，４－ビス（（Ｅ）－２－（ピリジン－４－イル）ビニル）ベンゼンを以下のように合成した：
撹拌棒を有する５０ｍＬの丸底フラスコに、テレフタルアルデヒド（３．４４ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）、４－メチルピリジン（９．５７ｇ、１０３ｍｍｏｌ）、及び無水酢酸（２５ｍＬ）を充填した。アルデヒドが存在しなくなるまで混合物を還流した（４時間、ＴＬＣで確認）。反応物を室温に冷却し、反応物を１００ｍＬの氷水に注ぐことによってクエンチした。低温混合物を、６ＮのＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨ７に中和し、得られた褐色の沈殿物を濾過し、水で洗浄し、風乾した。ジクロロメタンで抽出し、続いて、溶媒を濃縮乾固すると、粗生成物が得られ、この粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン：５／９５）で精製すると、標的ラマン活性レポーター分子０．８７５ｇが黄色の固体として得られた（１２％）。
撹拌棒を有する５０ｍＬの丸底フラスコに、テレフタルアルデヒド（３．４４ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）、４－メチルピリジン（９．５７ｇ、１０３ｍｍｏｌ）、及び無水酢酸（２５ｍＬ）を充填した。アルデヒドが存在しなくなるまで混合物を還流した（４時間、ＴＬＣで確認）。反応物を室温に冷却し、反応物を１００ｍＬの氷水に注ぐことによってクエンチした。低温混合物を、６ＮのＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨ７に中和し、得られた褐色の沈殿物を濾過し、水で洗浄し、風乾した。ジクロロメタンで抽出し、続いて、溶媒を濃縮乾固すると、粗生成物が得られ、この粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン：５／９５）で精製すると、標的ラマン活性レポーター分子０．８７５ｇが黄色の固体として得られた（１２％）。
【0094】
表面にラマン活性レポーター分子が吸着したＡｕナノ粒子を含有する第２のコロイド（Ｄ１～Ｄ１１）を、エタノール中の０．１ｍＭのラマン活性レポーター分子溶液のある容量を２０ｍＬのＡｕコロイド（Ｂ１～Ｂ５、Ｂ９）又は３ＬのＡｕコロイド（Ｂ８）に添加し、続いて、得られた混合物を室温で３０分間（第２のコロイドＤ１～Ｄ７、Ｄ９～Ｄ１１）／１時間（第２のコロイドＤ８）撹拌することによって調製した。表４に、第２のコロイドＤ１～Ｄ１１の調製に使用したラマン活性レポーター分子とエタノール中のラマン活性レポーター分子溶液の容量との概要を示す。
【0095】
【表4】
【0096】
（Ｅ）－１，２－ジ（ピリジン－４－イル）エテンがＣｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍによって予測されるような正味電荷を有しない最低ｐＨ値未満のｐＨ値を有する２０ｍＬのＡｕコロイドＢ６及びＢ７を、エタノール中の０．１ｍＭの（Ｅ）－１，２－ジ（ピリジン－４－イル）エテン溶液７５０μＬで処理し、続いて、得られた混合物を室温で３０分間撹拌すると、撹拌中のピンクから紫への混合物の色の変化の視覚的検出によって示されるように、不安定なコロイドが得られた。不安定なコロイドは、本発明による製造方法では使用することができない。第２のコロイドの安定性を確実にするためには、すなわち、該コロイドに含有されるＡｕナノ粒子の凝集を回避するためには、該コロイドの調製及び貯蔵中に、ζ電位値が－２５ｍＶ以下であり、ｐＨ値が、Ａｕナノ粒子に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が例えばＣｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍで予測され得る正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高いことが重要である。この意味合いで、第２のコロイドの調製に使用されるＡｕコロイド（Ｂ１～Ｂ５、Ｂ８、Ｂ９）のｐＨ値は、ラマン活性レポーター分子での処理前に、Ａｕコロイド（Ｂ１～Ｂ５、Ｂ８、Ｂ９）に含有されるＡｕナノ粒子に吸着させるべきラマン活性レポーター分子が例えばＣｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍで予測され得る正味電荷を有しない最低ｐＨ値より高い値に調整される。
【0097】
ＩＶ． 第１及び第２のコロイドの安定性。小さなサイズの凝集体の集団が大きいＳＥＲＳタグを提供する本発明による製造方法での使用に適するためには、第１及び第２のコロイドは安定でなければならず、すなわち、該コロイドの調製及び貯蔵中に、ナノ粒子のナノ粒子凝集は回避される必要がある。これは、該コロイドのζ電位値を－２５ｍＶ以下の値で維持することによって確実にすることができる。図４及び表５に示されるように、本発明によるＳＥＲＳタグの製造方法では、様々なＡｕコロイドを第１及び第２のコロイドとして使用することができる。
【0098】
第１のコロイドＡ２、並びに第２のコロイドＤ２、Ｄ５及びＤ６のζ電位を、室温で０．０５ｍｇＡｕ／ｍＬの濃度でｐＨの関数として測定した。これらの結果を表５に報告し、図４にプロットする。
【0099】
ζ電位の測定は、１ｍＬの折り畳まれたキャピラリーセルを有するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳで行った。２５℃の水の物理的特性及び金は、機器に事前にロードされている。第１のコロイドＡ２、並びに第２のコロイドＤ２、Ｄ５及びＤ６は、それぞれ脱イオン水で０．０５ｍｇＡｕ／ｍＬの濃度に希釈した。
【0100】
本発明によるＳＥＲＳタグ合成に使用されるｐＨ付近での第１のコロイドＡ２、並びに第２のコロイドＤ２、Ｄ５及びＤ６のζ電位値は、表５の２列目に報告されている。コロイドが不安定になるｐＨでの第１のコロイドＡ２、並びに第２のコロイドＤ２、Ｄ５及びＤ６のζ電位値は、表５の３列目に報告されている。コロイドの不安定性は、ピンクから紫へのコロイドの色の変化の視覚的検出によって決定した。
【0101】
【表5】
【0102】
Ｖ． 第１のコロイドと第２のコロイドとの組み合わせ、凝集の誘発、及び凝集の停止（製造方法のステップｃ）、ｄ）、及びｅ））
Ｖ．１ 同じサイズを有するＡｕナノ粒子を含有するＳＥＲＳタグ（実施例Ｅ１～Ｅ８、Ｅ１２～Ｅ１４）
Ｖ．１．ａ バッチ凝集（実施例Ｅ１～Ｅ７、Ｅ１２～Ｅ１４）
第２のコロイド（Ｄ１～Ｄ６、Ｄ９～Ｄ１１、２０ｍＬ）を８０ｍＬの第１のコロイド（Ａ１～Ａ５、Ａ９）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。コロイドを組み合わせてから３０秒後に、１２５μＬの一定分量をサンプリングし、水で１ｍＬに希釈し、それによって、凝集を停止した。この希釈（約５．７２＊１０９個のＡｕナノ粒子／ｍＬに対応する１２．５μｇＡｕ／ｍＬ）で凝集が終わり、７８５ｎｍのレーザー励起と、１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入したＱＥ６５０００分光計とを使用して、ＳＥＲＳシグナルを測定した。上記のように製造されたＳＥＲＳタグで実施されたＳＥＲＳシグナル測定の結果を表６に示す。
Ｖ．１ 同じサイズを有するＡｕナノ粒子を含有するＳＥＲＳタグ（実施例Ｅ１～Ｅ８、Ｅ１２～Ｅ１４）
Ｖ．１．ａ バッチ凝集（実施例Ｅ１～Ｅ７、Ｅ１２～Ｅ１４）
第２のコロイド（Ｄ１～Ｄ６、Ｄ９～Ｄ１１、２０ｍＬ）を８０ｍＬの第１のコロイド（Ａ１～Ａ５、Ａ９）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。コロイドを組み合わせてから３０秒後に、１２５μＬの一定分量をサンプリングし、水で１ｍＬに希釈し、それによって、凝集を停止した。この希釈（約５．７２＊１０９個のＡｕナノ粒子／ｍＬに対応する１２．５μｇＡｕ／ｍＬ）で凝集が終わり、７８５ｎｍのレーザー励起と、１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入したＱＥ６５０００分光計とを使用して、ＳＥＲＳシグナルを測定した。上記のように製造されたＳＥＲＳタグで実施されたＳＥＲＳシグナル測定の結果を表６に示す。
【0103】
本明細書で特許請求されている本発明の方法による実施例Ｅ１～Ｅ７、及びＥ１２～Ｅ１４、並びに比較例Ｃ１～Ｃ３によって証明されるように、第１のコロイドの粒子及び第２のコロイドの粒子の選択的凝集は、１．８などの低いｐＨ値や、Ｃｈｅｍｉｃａｌｉｚｅ．ｃｏｍで予測されるようにラマン活性レポーター分子が０～０．３の正味電荷を有する最低ｐＨ値より高いｐＨ値では起こらない。
【0104】
【表6】
【0105】
Ｖ．１．ｂ 連続フローシステム凝集（実施例Ｅ８）
本発明による製造方法で使用される連続フロー反応器の概略図を図１ｂに示す。加圧タンク（１１１ｂ）は第２のコロイドを保持しており、第２の加圧タンク（１１２ｂ）は第１のコロイドを保持している。大気に開放されている容器（１１４ｂ）は、ＳＥＲＳタグを収集するために使用され、凝集反応を停止するための濃縮ポリマー溶液を含んでいる。公称内径８ｍｍのコールパルマー（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）（登録商標）サイエンティフィックエキスパート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｘｐｅｒｔｓ）管からの透明なフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）がコロイド輸送に使用される。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１１ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１２ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。７ｍのＦＥＰ管を使用して、Ｔ接合部（１１３ｂ）を収集容器（１１４ｂ）に接続した。Ｔ接合部（１１３ｂ）と収集容器（１１４ｂ）との間の管のこの部分は、凝集が起こる部分である。
本発明による製造方法で使用される連続フロー反応器の概略図を図１ｂに示す。加圧タンク（１１１ｂ）は第２のコロイドを保持しており、第２の加圧タンク（１１２ｂ）は第１のコロイドを保持している。大気に開放されている容器（１１４ｂ）は、ＳＥＲＳタグを収集するために使用され、凝集反応を停止するための濃縮ポリマー溶液を含んでいる。公称内径８ｍｍのコールパルマー（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）（登録商標）サイエンティフィックエキスパート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｘｐｅｒｔｓ）管からの透明なフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）がコロイド輸送に使用される。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１１ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１２ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。７ｍのＦＥＰ管を使用して、Ｔ接合部（１１３ｂ）を収集容器（１１４ｂ）に接続した。Ｔ接合部（１１３ｂ）と収集容器（１１４ｂ）との間の管のこの部分は、凝集が起こる部分である。
【0106】
上記のコロイドＡ８（１２Ｌ）及びＤ８（３Ｌ）を、それぞれタンク１１２ｂ及び１１１ｂに配置した。第２のコロイド（Ｄ８）を含むタンク（１１１ｂ）を、コロイド流量が０．６６Ｌ／分になるように加圧した。第１のコロイド（Ａ８）を含むタンク（１１２ｂ）を、コロイド流量が２．６５Ｌ／分になるように加圧した。Ｔ接合部で組み合わさった後に、第１のコロイドＡ８のナノ粒子の数と第２のコロイドＤ８のナノ粒子の数との比が約４：１であることを特徴とする組み合わされたコロイドは、約４．８のｐＨ値と、１．１ｍ／ｓの直線速度をもたらす３．３１Ｌ／分の凝集管の流量とを有する。ＳＥＲＳ測定は、励起７８５ｎｍでＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＱＥ６５０００分光計に光ファイバーケーブルで接続されたプローブを用いて、凝集管長さを下に１ｍのマーキングで、透明なＦＥＰ管を介して行った。管の端部のマーキングにおける測定値が、管の開口部でサンプリングされて水で１ｍＬに希釈（１２．５μｇＡｕ／ｍＬ）された５０μＬの一定分量から得られた値と等しくなるように、すなわち、凝集が水での希釈によって停止されて、７８５ｎｍのレーザー励起と１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＱＥ６５０００分光計とを使用して測定されるサンプルと等しくなるように、積分時間を短縮した。ＳＥＲＳ測定の結果は、実線で結ばれた菱形として図５にプロットされている。チューブの端部で採取されて１２．５μｇＡｕ／ｍＬで測定されたサンプルからのＳＥＲＳシグナル強度は、１１０４４カウント毎秒［±５００］であった。
【0107】
Ｖ．２ 第１のコロイド及び第２のコロイドは、異なるサイズのＡｕナノ粒子を含有する（実施例Ｅ９～Ｅ１１）
Ｖ．２．ａ バッチ凝集（実施例Ｅ９及びＥ１０）
実施例Ｅ９
第２のコロイド（Ｄ７、３０ｍＬ）を第１のコロイド（Ａ１、５５ｍＬ）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比は、約６．３：１である。約２．９のｐＨで３０秒間混合した後に、ポリマー溶液を添加することによって凝集を停止し、得られた凝集体を米国特許第８４９７１３１号に記載されている方法に従ってさらにシリカコーティングして、標的ＳＥＲＳタグを用意した。ＳＥＲＳタグの約２μＬの一定分量をシリカウェーハ片に滴下し、乾燥させた。サンプルをＨｉｔａｃｈｉ Ｓ－４５００電界放出ＳＥＭで画像化し、図３ａに示した。７８５ｎｍのレーザー励起と、１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入したＱＥ６５０００分光計とを使用して、ＳＥＲＳシグナルを測定した。１２．５μｇＡｕ／ｍＬで測定されたＳＥＲＳシグナル強度は、１８３７７カウント毎秒［±５００］であった。
Ｖ．２．ａ バッチ凝集（実施例Ｅ９及びＥ１０）
実施例Ｅ９
第２のコロイド（Ｄ７、３０ｍＬ）を第１のコロイド（Ａ１、５５ｍＬ）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比は、約６．３：１である。約２．９のｐＨで３０秒間混合した後に、ポリマー溶液を添加することによって凝集を停止し、得られた凝集体を米国特許第８４９７１３１号に記載されている方法に従ってさらにシリカコーティングして、標的ＳＥＲＳタグを用意した。ＳＥＲＳタグの約２μＬの一定分量をシリカウェーハ片に滴下し、乾燥させた。サンプルをＨｉｔａｃｈｉ Ｓ－４５００電界放出ＳＥＭで画像化し、図３ａに示した。７８５ｎｍのレーザー励起と、１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入したＱＥ６５０００分光計とを使用して、ＳＥＲＳシグナルを測定した。１２．５μｇＡｕ／ｍＬで測定されたＳＥＲＳシグナル強度は、１８３７７カウント毎秒［±５００］であった。
【0108】
実施例Ｅ１０
第２のコロイド（Ｄ７、２０ｍＬ）を第１のコロイド（Ａ７、２００ｍＬ）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比は、約２．６５：１である。
第２のコロイド（Ｄ７、２０ｍＬ）を第１のコロイド（Ａ７、２００ｍＬ）に素早く注ぎ、マグネチックスターラーバーを有する混合リザーバ内で混合物を撹拌した。第１のコロイドのナノ粒子の数と第２のコロイドのナノ粒子の数との比は、約２．６５：１である。
【0109】
約２．９のｐＨで３０秒間混合した後に、ポリマー溶液を添加することによって凝集を停止し、得られた凝集体を米国特許第８４９７１３１号に記載されている方法に従ってシリカコーティングして、標的ＳＥＲＳタグを用意した。ＳＥＲＳタグの約２μＬの一定分量をシリカウェーハ片に滴下し、乾燥させた。サンプルをＨｉｔａｃｈｉ Ｓ－４５００電界放出ＳＥＭで画像化し、図３ｂに示す。
【0110】
Ｖ．２．ｂ フローシステム凝集（実施例Ｅ１１）
本発明による製造方法で使用される連続フロー反応器の概略図を図１ｂに示す。加圧タンク（１１１ｂ）は第２のコロイドを保持しており、第２の加圧タンク（１１２ｂ）は第１のコロイドを保持している。大気に開放されている容器（収集リザーバ、１１４ｂ）を使用して、ＳＥＲＳタグを収集し、凝集を停止する。公称内径８ｍｍのコールパルマー（登録商標）サイエンティフィックエキスパート管からのフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）がコロイド輸送に使用される。３０ｃｍの透明なＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１１ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１２ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。７ｍのＦＥＰ管を使用して、Ｔ接合部（１１３ｂ）を収集容器（１１４ｂ）に接続した。Ｔ接合部（１１３ｂ）と収集容器（１１４ｂ）との間の管のこの部分は、凝集が起こった部分である。
本発明による製造方法で使用される連続フロー反応器の概略図を図１ｂに示す。加圧タンク（１１１ｂ）は第２のコロイドを保持しており、第２の加圧タンク（１１２ｂ）は第１のコロイドを保持している。大気に開放されている容器（収集リザーバ、１１４ｂ）を使用して、ＳＥＲＳタグを収集し、凝集を停止する。公称内径８ｍｍのコールパルマー（登録商標）サイエンティフィックエキスパート管からのフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）がコロイド輸送に使用される。３０ｃｍの透明なＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１１ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。３０ｃｍのＦＥＰ管を使用して、加圧タンク（１１２ｂ）をＴ接合部（１１３ｂ）に接続した。７ｍのＦＥＰ管を使用して、Ｔ接合部（１１３ｂ）を収集容器（１１４ｂ）に接続した。Ｔ接合部（１１３ｂ）と収集容器（１１４ｂ）との間の管のこの部分は、凝集が起こった部分である。
【0111】
上記のコロイドＡ６（１２Ｌ）及びＤ８（３Ｌ）を、それぞれタンク１１２ｂ及び１１１ｂに配置する。第２のコロイド（Ｄ８）を含むタンク（１１１ｂ）を、コロイド流量が０．６６Ｌ／分になるように加圧した。第１のコロイド（Ａ６）を含むタンク（１１２ｂ）を、活性コロイド流量が２．６５Ｌ／分になるように加圧した。Ｔ接合部で組み合わさった後に、第１のコロイドＡ６のナノ粒子の数と第２のコロイドＤ８のナノ粒子の数との比が約１．２：１であることを特徴とする組み合わされたコロイドは、約４．８のｐＨと、１．１ｍ／ｓの直線速度をもたらす３．３１Ｌ／分の凝集管の流量とを有する。ＳＥＲＳ測定は、励起７８５ｎｍでＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＱＥ６５０００分光計に光ファイバーケーブルで接続されたプローブを用いて、凝集管長さを下に１ｍのマーキングで、透明なＦＥＰ管を介して行った。管の端部のマーキングにおける測定値が、管の開口部でサンプリングされて、水で１ｍＬに希釈（１２．５μｇＡｕ／ｍＬ）（ステップｅ２）されて、７８５ｎｍのレーザー励起と１秒の積分時間に設定されたＯｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＱＥ６５０００分光計とを使用して測定された５０μＬの一定分量から得られた値と等しくなるように、積分時間を短縮した。これらの測定結果は、点線で結ばれた円として図５にプロットされている。チューブの端部で採取されて１２．５μｇＡｕ／ｍＬで測定されたサンプルからのＳＥＲＳシグナル強度は、２８３０３カウント毎秒［±５００］であった。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
