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▶ ハミングバード ダイアグノスティクス ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-06
(45)【発行日】2024-06-14
(54)【発明の名称】ＩＳＯＭＩＲ検出の為の高度なダンベルＰＣＲ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240607BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240607BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6851 Z ZNA
【請求項の数】
25
(21)【出願番号】P 2023521141
(86)(22)【出願日】2022-08-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-23
(86)【国際出願番号】 EP2022072077
(87)【国際公開番号】W WO2023016938
(87)【国際公開日】2023-02-16
【審査請求日】2023-08-01
(31)【優先権主張番号】21190781.1
(32)【優先日】2021-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】523123307
【氏名又は名称】ハミングバード ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホロス，ラスティスラブ
(72)【発明者】
【氏名】スタインクラウス，ブルーノ
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２５１８３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２１／１４８７１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許第０５３９９６７６（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０２０／０２５５８２４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】HONDA, Shozo and KIRINO, Yohei，Nucleic Acids Research，2015年07月13日，Vol. 43, Issue 12，p. e47，DOI: 10.1093/nar/gkv218
【文献】DESINGU, P. A.，Nucleic Acids Research，Vol. 43, Issue 12，2015年07月30日，DOI: 10.1093/nar/gkv218
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ａ６１Ｋ ３５／００－５１／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’から３’の以下の順序で構成される５’アダプターであって、（ｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列であって、該６乃至１５個のデオキシヌクレオチドが標的ＲＮＡの５’－末端配列に逆相補的であり、並びに
（ｉｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステム－ループ構造を形成できるヌクレオチド配列であって、その３’末端の少なくとも２個のヌクレオチドがリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり、
該ステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列が、５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列を含み、及び
該５’位の第１ステム配列及び／又は該３’位の第２ステム配列が２乃至５個のロックドヌクレオチドを含む、
５’アダプター。
【請求項2】
前記ステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列が、互いに逆相補的である前記５’位の第１ステム配列及び前記３’位の第２ステム配列を含む、請求項１に記載の５’アダプター。
【請求項3】
前記５’位の第１ステム配列及び前記３’位の第２ステム配列の夫々が、５乃至１０個のヌクレオチドの長さを有する、請求項２に記載の５’アダプター。
【請求項4】
前記５’位の第１のステム配列及び前記３’位の第２のステム配列が、同じ長さを有する、請求項３に記載の５’アダプター。
【請求項5】
前記標的ＲＮＡが、＜２００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである、請求項１に記載の５’アダプター。
【請求項6】
前記標的ＲＮＡが、１０乃至１００個のリボヌクレオチド長さを有するＲＮＡである、請求項５に記載の５’アダプター。
【請求項7】
５’から３’の以下の順序で構成される３’アダプターであって、（ｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステム－ループ構造を形成することができるヌクレオチド配列であって、該５’－末端ヌクレオチドがリン酸化され、
該ループ及び二本鎖ステムを含むステム－ループ構造を形成することができるヌクレオチド配列が５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列を含み、及び
該５’位の第１ステム配列及び／又は該３’位の第２ステム配列が２乃至５個のロックドヌクレオチドを含み、
並びに
（ｉｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的であり、かつ、該３’末端デオキシヌクレオチドは反転デオキシヌクレオチドである、
３’アダプター。
【請求項8】
前記ステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列が、互いに逆相補的である前記５’位の第１ステム配列及び前記３’位の第２ステム配列を含む、請求項７に記載の３’アダプター。
【請求項9】
前記５’位の第１ステム配列及び前記３’位の第２ステム配列のそれぞれが、５乃至１０個のヌクレオチドの長さを有する、請求項８に記載の３’アダプター。
【請求項10】
前記５’位の第１のステム配列及び前記３’位の第２のステム配列が同じ長さを有する、請求項９に記載の３’アダプター。
【請求項11】
前記反転デオキシヌクレオチドが、反転ｄＴ、ｄＡ、ｄＣ、又はｄＧである、請求項７に記載の３’アダプター。
【請求項12】
前記標的ＲＮＡは、＜２００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである、請求項７に記載の３’アダプター。
【請求項13】
前記標的ＲＮＡが、１０乃至１００個のヌクレオチド長さを有するＲＮＡである、請求項１２に記載の３’アダプター。
【請求項14】
請求項１に記載の５’アダプター、及び請求項７に記載の３’アダプターを含むアダプターの組み合わせ。
【請求項15】
サンプル中の標的ＲＮＡに２つのアダプターをライゲーションする方法であって、以下の工程：（ｉ）サンプル中の変性標的ＲＮＡ、再生された請求項１に記載の５’アダプター、及び再生された請求項７に記載の３’アダプターを含む組成物を提供する工程であって、前記５’アダプター及び前記３’アダプターが標的ＲＮＡにアニーリングされている、工程、及び
（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡリガーゼを使用して、又はそれとともに、該５’アダプター及び該３’アダプターを該標的ＲＮＡにライゲーションし、それによってライゲーション産物を生成する工程
を含む方法。
【請求項16】
（ｉ）前記変性標的ＲＮＡが、標的ＲＮＡを６５℃乃至７５℃で１乃至３分間加熱することによって生成されるか、（ｉｉ）再生された５’アダプターが、７５℃乃至８５℃で１乃至３分間、５’アダプターを変性し、そして４℃まで冷却することにより、５’アダプターを再生することによ
って生成されるか、又は
（ｉｉｉ）再生された３’アダプターが、７５℃乃至８５℃で１乃至３分間、３’アダプターを変性し、そして４℃まで冷却することにより、３’アダプターを再生することによって生成される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記組成物が、前記変性標的ＲＮＡ、再生された請求項１に記載の５’アダプター、及び再生された請求項７に記載の３’アダプターを互いに混合し、これにより、５’アダプター及び３’アダプターを標的ＲＮＡにアニーリングすることによって生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
サンプル中の標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する方法であって、（ｉ）請求項１５に記載の方法を実施する工程、
（ｉｉ）ライゲーション産物を逆転写し、それによって標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得る工程、及び
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを増幅し、それによって標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する工程、
を含む方法。
【請求項19】
前記ライゲーション産物の逆転写が、（ｉｉａ）逆転写用プライマー（ＲＴ－プライマー）をライゲーション産物とアニーリングする工程、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてライゲーション産物を逆転写する工程、
によって実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に、ｃＤＮＡ前増幅の工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
患者の疾患又は症状の診断をするための情報を提供する方法であって、（ｉａ）請求項１８に記載の方法を実施し、それによって前記標的ＲＮＡの存在を決定する工程、
（ｉｉａ）該標的ＲＮＡの存在に基づいて、該患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断するための情報を提供する工程、又は
（ｉｂ）請求項１８に記載の方法を実施し、それによって標的ＲＮＡを定量化する工程、
（ｉｉｂ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉｂ）比較に基づいて、該患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断するための情報を提供する工程、
を含む方法。
【請求項23】
前記疾患が、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症、及び癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
（ｉ）前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の認知症、パーキンソン病（ＰＤ）及びＰＤ関連疾患、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症症（ＳＭＡ）、エイズ認知症複合体、及びアテローム性動脈硬化症、からなる群から選択され、（ｉｉ）前記自己免疫疾患が、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ）、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血及びセリアック病からなる群から選択され、
（ｉｉｉ）前記感染症が、ウイルス感染、細菌感染、及び寄生虫感染からなる群から選択され、又は
（ｉｖ）前記癌が、皮膚癌、上咽頭癌、神経内分泌癌、肺癌、大腸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、肝臓癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、乳癌、腎癌、頭頸部癌、脳腫瘍、リンパ癌、血液癌、扁平上皮癌、喉頭癌、網膜癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、骨癌、リンパ腫、及び白血病からなる群から選択される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
請求項１に記載の５’アダプター、及び請求項７に記載の３’アダプター、又は請求項１４に記載のアダプターの組み合わせ、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションのための配列特異的構造化アダプターを使用し、その後のｃＤＮＡ産生及び定量化を用いる、サンプル中の小さな非コードＲＮＡの検出方法に関する。本発明はさらに、この方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノムの非タンパク質コード領域は広く転写されて、通常の生物学的プロセス及び疾患状態で重要な役割を果たすｍｉＲＮＡなどの小さな非コードＲＮＡを生成する。したがって、ｍｉＲＮＡなどのこれらの小さな非コードＲＮＡの多様性と発現は、診断目的に使用できる。
【0003】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）メソッドは、ｍｉＲＮＡなどの小さな非コードＲＮＡの広大な範囲を検出でき、それゆえ発見目的で主に使用される。しかし、ＮＧＳの使用は、実行ごと及びラボ間の変動性の増加と関連しており、その莫大なコストのために、ほとんどの診断ラボでは対応できない。それにもかかわらず、ＮＧＳは、病気の予測に使用できるｍｉＲＮＡなどの小さな非コードＲＮＡのプロファイルを作成するための強力なツールである。
【0004】
上記の観点から、ｍｉＲＮＡなどの小さな非コードＲＮＡの検出及び定量化のための直交法を開発し、費用対効果の高い方法で幅広いラボで使用できるＮＧＳデータを検証する必要がある。
【0005】
現在、ｍｉＲＮＡの検出及び定量化のための２つの主な方法が使用されている。第一の方法は、ｍｉＲＮＡの３’末端にハイブリダイズするステムループ様プローブを使用し、続いてプローブにハイブリダイズする、ｍｉＲＮＡ特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）反応及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）検出（例えば、従来のｍｉＲＮＡ ＴａｑＭａｎアッセイ）を使用する。第２の方法では、ポリ－Ａテーリング反応が最初に適用され、ｍｉＲＮＡの３’末端にアデニンのストレッチが作成され、続いてオリゴｄ（Ｔ）プライマーを使用したＲＴが行われる。その後、ｍｉＲＮＡ固有のフォワードプライマーが、ｑＰＣＲ反応（例えば、ｍｉＲＣｕｒｙ ＬＮＡ アッセイなど）のための一般的なリバースプライマーと共に使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の方法に共通する問題は、ｍｉＲＮＡ特異的なフォワードプライマーが、ｍｉＲＮＡの５’末端での配列の変化（例えば、付加、欠失、変異）及びｍｉＲＮＡの３’末端の配列の変化（例えば、付加）を識別できないことである。その結果、最終的に処理されたＲＮＡ配列データは、根本的な生物学的状況を正確に反映していない。したがって、ＮＧＳによって発見されたｉｓｏｍｉＲ固有の情報は、現在利用可能なｑＰＣＲ法では忠実に検証できない。３’末端及び５’末端の両方で、ｍｉＲＮＡバリアントが多様であるため、ハイブリダイゼーションに基づく方法は、定義上、関心のある正確なｉｓｏｍｉＲを捕捉して定量化する可能性が低い。
【0007】
したがって、さらに、高速で、信頼性でき、及び正確な方法で、ｍｉＲＮＡだけでなくｉｓｏｍｉＲの検出及び定量化を可能にする方法を開発する必要がある。加えて、この方法は、ｍｉＲＮＡの検出及び定量化だけでなく、高い特異性及び感度を備えたｉｓｏｍｉ
Ｒの検出及び定量化を可能にし、したがって、疾患の診断及び／又は予後を改善するであろう。さらに、任意の病院／臨床又は研究センターで使用するための上記の目的に適したキットを開発する必要性がさらに存在する。
Ｒの検出及び定量化を可能にし、したがって、疾患の診断及び／又は予後を改善するであろう。さらに、任意の病院／臨床又は研究センターで使用するための上記の目的に適したキットを開発する必要性がさらに存在する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、ハイブリダイズした二本鎖ＲＮＡ分子の切れ目（ニック）を特異的に結合する、二本鎖ＲＮＡリガーゼ、特にＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）の能力を利用する、ダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）に基づく方法を開発した。ｉｓｏｍｉＲの５’末端と３’末端の両方に正しくハイブリダイズしたアダプターのみが、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用できるライゲーションされたＲＮＡの形成を可能にする。この方法は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び特定の末端配列を持つ標的ＲＮＡバリアント（例えば、ｉｓｏｍｉＲ）の発現を特異的かつ効率的に決定及び定量化することができる。特異性の第２層は、ＴａｑＭａｎプローブによって導入され、ｃＤＮＡ配列のユーザー定義領域に整列できる。本発明者らによって開発されたダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）に基づく方法は、任意の病院／臨床又は研究センターで使用でき、単純、迅速、信頼性、正確性、及び費用対効果の高い方法で臨床サンプルの分析を可能にする。この方法のおかげで、診断検査の特異性及び感度をさらに改善することができる。上記目的に適したキットも提供する。
【0009】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、５’から３’の以下の順序で含む５’アダプターであって、
（ｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的であり、及び
（ｉｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列であって、その３’末端の少なくとも２個のヌクレオチドがリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり、かつ、ヌクレオチド配列がロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化である、
５’アダプターに関する。
第１の態様において、本発明は、５’から３’の以下の順序で含む５’アダプターであって、
（ｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的であり、及び
（ｉｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列であって、その３’末端の少なくとも２個のヌクレオチドがリボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり、かつ、ヌクレオチド配列がロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化である、
５’アダプターに関する。
【0010】
第２の態様において、本発明は、５’から３’の以下の順序で含む３’アダプターであって、
（ｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列であって、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されており、かつ、ヌクレオチド配列がロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化であり、及び
（ｉｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的であり、かつ、３’末端デオキシヌクレオチドは反転デオキシヌクレオチドである、
３’アダプターに関する。
（ｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列であって、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されており、かつ、ヌクレオチド配列がロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化であり、及び
（ｉｉ）６乃至１５個のデオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的であり、かつ、３’末端デオキシヌクレオチドは反転デオキシヌクレオチドである、
３’アダプターに関する。
【0011】
第３の態様において、本発明は、第１の態様による５’アダプター、及び第２の態様による３’アダプターを含む組み合わせに関する。
【0012】
第４の態様において、本発明は、以下の工程：
（ｉ）サンプル中の変性標的ＲＮＡ、第１の態様による再生５’アダプター、及び第２の態様による再生３’アダプターを含む組成物を提供する工程であって、５’アダプター及び３’アダプターは標的ＲＮＡにアニーリングされている、工程、及び
（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡリガーゼを使用して、又はそれとともに、標的ＲＮＡに５’アダプター及び３’アダプターをライゲーションし、それによってライゲーション産物を生成す
る工程
を含むサンプル中の標的ＲＮＡに２つのアダプターをライゲーションする方法に関する。
（ｉ）サンプル中の変性標的ＲＮＡ、第１の態様による再生５’アダプター、及び第２の態様による再生３’アダプターを含む組成物を提供する工程であって、５’アダプター及び３’アダプターは標的ＲＮＡにアニーリングされている、工程、及び
（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡリガーゼを使用して、又はそれとともに、標的ＲＮＡに５’アダプター及び３’アダプターをライゲーションし、それによってライゲーション産物を生成す
る工程
を含むサンプル中の標的ＲＮＡに２つのアダプターをライゲーションする方法に関する。
【0013】
第５の態様において、本発明は、以下の工程：
（ｉ）第４の態様による方法を実行する工程、
（ｉｉ）ライゲーション産物を逆転写し、それによって標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得る工程、及び
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを増幅し、それによって標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する工程、
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する方法に関する。
（ｉ）第４の態様による方法を実行する工程、
（ｉｉ）ライゲーション産物を逆転写し、それによって標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得る工程、及び
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを増幅し、それによって標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する工程、
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する方法に関する。
【0014】
第６の態様において、本発明は、以下の工程：
（ｉａ）第３及び／又は第４の態様による方法を実施し、それによって標的ＲＮＡの存在を決定する工程、
（ｉｉａ）標的ＲＮＡの存在に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、又は
（ｉｂ）第３及び／又は第４の態様による方法を実施し、それによって標的ＲＮＡを定量化する工程、
（ｉｉｂ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉｂ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
（ｉａ）第３及び／又は第４の態様による方法を実施し、それによって標的ＲＮＡの存在を決定する工程、
（ｉｉａ）標的ＲＮＡの存在に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、又は
（ｉｂ）第３及び／又は第４の態様による方法を実施し、それによって標的ＲＮＡを定量化する工程、
（ｉｉｂ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉｂ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
【0015】
第７の態様において、本発明は、第１の態様による５’アダプター、及び第２の態様による３’アダプター、又は第３の態様による組み合わせを含むキットに関する。
【0016】
この発明の概要は、必ずしも本発明のすべての特徴を記載しているとは限らない。他の実施形態は、以下の詳細な説明を検討することにより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【0017】
発明の詳細な説明
定義
以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
定義
以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0018】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋoｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，（ＣＨ－４０１０ スイス国、バーゼル）に記載されているように定義される。
【0019】
いくつかの文書が、本明細書の本文全体で引用されている。本明細書で引用されている各文書（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列の提出などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明
によりそのような開示に先行する権利を有していないことを認めるものと解釈されるべきではない。そのような組み込まれた参考文献の定義又は教示と、本明細書で引用される定義又は教示との間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先される。
によりそのような開示に先行する権利を有していないことを認めるものと解釈されるべきではない。そのような組み込まれた参考文献の定義又は教示と、本明細書で引用される定義又は教示との間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先される。
【0020】
本発明による用語「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数又は整数群を含むことを意味するが、他の整数又は整数群を排除するものではない。本発明による用語「から本質的になる」は、記載された整数又は整数群を含むことを意味するが、記載された整数に実質的に影響を与える又は変更する修飾又は他の整数を除外する。本発明による用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ
ｏｆ）」などの変形は、述べられた整数又は整数群を含み、他の整数又は整数群を除外することを意味する。
ｏｆ）」などの変形は、述べられた整数又は整数群を含み、他の整数又は整数群を除外することを意味する。
【0021】
本発明を説明する文脈において（特に特許請求の範囲において）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の参照は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。
【0022】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド及びリン酸エステルからなる有機分子を指す。特に、ヌクレオチドは３つのサブユニット分子：核酸塩基、５炭素糖（リボース又はデオキシリボース）、及び１乃至３個のリン酸からなるリン酸基、で構成されている。ＤＮＡの４つの核酸塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、及びチミンであり；ＲＮＡでは、ウラシルがチミンの代わりに使用される。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド酸（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド酸（ＲＮＡ）などの核酸ポリマーの単量体単位として機能する。したがって、ヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの分子ビルディングブロックである。
【0023】
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド」は、リン酸基を有さないヌクレオチドと考えることができるグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドは、核酸塩基（窒素含有塩基とも呼ばれる）及び５－炭素糖（リボース又は２’－デオキシリボース）から単純に構成されるが、ヌクレオチドは、核酸塩基、５炭素糖、及び１つ以上のリン酸基で構成される。ヌクレオシドでは、アノマー炭素はグリコシド結合を介してプリンのＮ９又はピリミジンのＮ１に結合される。
【0024】
用語「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に使用され、限定されないが、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合によって結合された２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、又はヌクレオチド間類似体、及びＨ＋、ＮＨ４
＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などの関連する対イオンを含む、ヌクレオチドモノマーの一本鎖及び二本鎖ポリマーを指す。ヌクレオチド配列又はポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドだけ、リボヌクレオチドだけ、又はそれらのキメラ混合物から構成されて得、ヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチドモノマー単位は、ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の任意のヌクレオチドを含み得る。
【0025】
本明細書で使用される用語「類似体」は、修飾された塩基部分、修飾された糖部分、及び／又は修飾されたリン酸エステル部分を有する合成類似体を含む。リン酸類似体は一般に、リン原子が＋５の酸化状態にあり、酸素原子の１つ又は複数が例えばイオウなどの非酸素部分で置換されているリン酸の類似体を含む。例示的なホスフェート類似体は、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４
＋、Ｎａ＋などの関連する対イオンを含む、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチ
オエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートを含む。例示的な塩基類似体は、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ－５－プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２－チオピリミジンを含む。例示的な糖類似体は、２’－又は３’－位が水素、ヒドロキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、アリルオキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基及びフェノキシ基などのアルコキシ基、アジド基、アミノ基又はアルキルアミノ基、フルオロ基、クロロ基、及びブロモ基である２’位又は３’位の修飾を含む。
オエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートを含む。例示的な塩基類似体は、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、Ｃ－５－プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２－チオピリミジンを含む。例示的な糖類似体は、２’－又は３’－位が水素、ヒドロキシ基、例えば、メトキシ基、エトキシ基、アリルオキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基及びフェノキシ基などのアルコキシ基、アジド基、アミノ基又はアルキルアミノ基、フルオロ基、クロロ基、及びブロモ基である２’位又は３’位の修飾を含む。
【0026】
一実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、本明細書に記載のアダプター内／の一部に存在する。好ましい一実施形態では、修飾リボヌクレオチドは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチドである。
【0027】
本明細書で使用する用語「標的ＲＮＡ」は、検出しようとするリボヌクレオチド配列を指す。標的ＲＮＡは、任意の供給源から得ることができ、任意の数の異なる組成成分を含むことができる。例えば、標的ＲＮＡは、生物、組織、細胞、又は血液などの体液から単離される。例えば、標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡ及び／又はコードＲＮＡを包含する。特に、標的ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は他の成熟低分子ＲＮＡであり、バリアント（変異体）、類似体、及び模倣体を含む。
【0028】
さらに、用語「標的ＲＮＡ」は、標的分子自体、並びにその代用物、例えば、増幅産物（例えば、それに由来するｃＤＮＡ）及び天然配列を指し得ることが理解される。特定の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）分子である。特定の実施形態では、標的ＲＮＡはポリ－Ａテイルを欠いている。特定の実施形態では、標的ＲＮＡは、成熟低分子ＲＮＡ分子、特に非コード低分子ＲＮＡ分子（すなわち、＜２００リボヌクレオチドの長さ、例えば、１０乃至＜２００リボヌクレオチドの長さを有している）である。本明細書に記載の標的ＲＮＡは、ヒト及び動物を含むがこれらに限定されない、任意の数の供給源に由来し得る。これらの供給源には、限定されないが、全血、組織生検、リンパ、骨髄、羊水、毛髪、皮膚、精液、生物兵器剤、肛門分泌物、膣分泌物、汗、唾液、又は口腔スワブが含まれる。しかしながら、様々な環境サンプル（例えば、農業用の水及び土壌）、研究サンプル一般、精製サンプル一般、培養細胞及び溶解細胞もサンプルとして使用することができる。標的ＲＮＡは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ （登録商標）６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ｍｉｒＶａｎａ（商標）ＲＮＡ単離キット（ライフテクノロジーズ社、テキサス州オースティン）などの当技術分野で知られている様々な手順のいずれかを使用してサンプルから単離され得ることが理解される。
【0029】
一実施形態では、標的ＲＮＡは、５’リン酸基部分及び３’ヒドロキシル部分を有する任意の一本鎖（非コード又はコード）ＲＮＡである。好ましい一実施形態では、標的ＲＮＡは、＜２００リボヌクレオチド、例えば１０乃至＜２００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。さらに言及される一実施形態では、標的ＲＮＡは、１０乃至１００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。さらにより好ましい一実施形態では、標的ＲＮＡは、１０乃至５０リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。前記ＲＮＡは、特に非コードＲＮＡ、具体的にはｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。
【0030】
本明細書で使用される用語「ｍｉＲＮＡ」（呼称「マイクロＲＮＡ」も可能である）は、一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、任意の標識及び／又は伸長配列（例えば、ビオチンストレッチ）を含まない、長さが１０乃至５０ヌクレオチド長、例えば、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長の分子であり得る。
【0031】
ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節し、そのＤＮＡから転写される遺伝子によりコードされるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されない（つまり、ｍｉＲＮＡは非コードＲＮＡである）。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、処理された成熟ｍｉＲＮＡ分子よりも長い。ｍｉＲＮＡは最初、一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれるより長い前駆体分子（＞１０００ヌクレオチド長）として転写される。Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、（マイクロプロセッサ複合体の一部として）ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）酵素によって処理されるヘアピン構造を持っている。ドローシャプロセッシングの後、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、わずか６０乃至１００ヌクレオチド長であり、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。この時点で、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、そこでダイサー（Ｄｉｃｅｒ）酵素に遭遇する。ダイサーは、ｍｉＲＮＡを２つに切断し、二本鎖のｍｉＲＮＡストランドを生成する。伝統的に、これらのｍｉＲＮＡアームの１つだけが、遺伝子調節において重要であると考えられていた：アームは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる設計にあり、細胞内でより高い濃度で発生する。これはしばしば「ガイド」鎖と呼ばれ、ｍｉＲと表される。もう一方のアームは「マイナーｍｉＲＮＡ」又は「パッセンジャーｍｉＲＮＡ」と呼ばれ、しばしばｍｉＲ＊と表される。パッセンジャーｍｉＲＮＡは完全に分解されたと考えられていたが、ディープシーケンス研究は、一部のマイナーｍｉＲＮＡが残存し、実際に遺伝子調節において機能的な役割を果たしていることを発見した。これらの開発により、命名規則が変更された。ｍｉＲ／ｍｉＲ＊命名方式の代わりに、ｍｉＲ－５ｐ／ｍｉＲ－３ｐ命名法が採用された。新しいシステムでは、ｍｉＲＮＡの５’アームは常にｍｉＲ－５ｐと表され、３’アームはｍｉＲ－３ｐと表される。現在の命名法は次のとおりである：接頭辞「ｍｉＲ」の後にダッシュと数字が続き、後者は多くの場合、命名順を示す。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６は名前が付けられており、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２より前におそらく発見されている。大文字の「ｍｉＲ－」はｍｉＲＮＡの成熟型（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１６－３ｐ）を指し、大文字のない「ｍｉｒ－」はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－１６）を指し、並びに「ＭＩＲ」はそれらをコードする遺伝子を指す。ただし、これは最近の変更であるため、文献ではしばしば元のｍｉＲ／ｍｉＲ＊名が参照される。処理後、二本鎖のｍｉＲＮＡ鎖はアルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質にロードされ、ＲＩＳＣの前駆体を形成する。この複合体は、二重の巻き戻しを引き起こし、パッセンジャーＲＮＡ鎖は破棄され、成熟した一本鎖ｍｉＲＮＡを運ぶ成熟ＲＩＳＣを残す。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制するため、ＲＩＳＣの一部のままである。これはｍｉＲＮＡ生合成の標準的な経路であるが、他にもいろいろ発見されている。これらには、ドローシャに依存しない経路（ミュートロン（ｍｉｒｔｒｏｎ）経路、ｓｎｏＲＮＡ由来の経路、及びｓｈＲＮＡ由来の経路など）、及びダイサーに依存しない経路（切断のためにＡＧＯに依存するもの、及びｔＲＮａｓｅＺに依存する他のものなど）が含まる。
【0032】
本明細書で使用される用語「ｍｉＲＢａｓｅ」は、有効なｍｉＲＮＡの十分に確立されたレポジトリを指す。ｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、公開されたｍｉＲＮＡ配列及び注釈の検索可能なデータベースである。ｍｉＲＢａｓｅシークエンスデータベースの各項目は、ｍｉＲＮＡ転写産物（データベースでは、ｍｉｒと呼ばれる）の予測されたヘアピン部分を、成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲと呼ばれる）の位置及び配
列の情報と共に表す。ヘアピン配列及び成熟配列の両方が検索及び閲覧可能であり、項目は、名前、キーワード、参考文献及び注釈によって検索できる。すべての配列及び注釈データもダウンロードできる。２０１８年１０月に、ｍｉＲｂａｓｅバージョン２２．１がリリースされた。これが現在のバージョンである。
列の情報と共に表す。ヘアピン配列及び成熟配列の両方が検索及び閲覧可能であり、項目は、名前、キーワード、参考文献及び注釈によって検索できる。すべての配列及び注釈データもダウンロードできる。２０１８年１０月に、ｍｉＲｂａｓｅバージョン２２．１がリリースされた。これが現在のバージョンである。
【0033】
本明細書で使用される用語「ｉｓｏｍｉＲ」（又は「ｍｉＲＮＡアイソフォーム」）は、配列がわずかに異なるｍｉＲＮＡを指し、ここではｍｉＲＮＡの生合成中の切断部位の変化、又はオリゴウリジル化などの生合成が終了した後の成熟ｍｉＲＮＡに影響を与えるプロセスによって生じる。
特に、ドローシャ及びダイサーの不正確な切断又はｍｉＲＮＡのターンオーバーが、長さ及び／又は配列が不均一なｍｉＲＮＡが生じさせる可能性がある。ＩｓｏｍｉＲ（ｍｉＲＮＡアイソフォーム）は３つの主なカテゴリに分類できる：３’ｉｓｏｍｉＲ（３’位での１つ又は複数のヌクレオチドのトリミング又は付加）、５’ｉｓｏｍｉＲ（５’位での１つ又は複数のヌクレオチドのトリミング又は付加）、及び多型ｉｓｏｍｉＲ（配列内のいくつかのヌクレオチドが、野生型成熟ｍｉＲＮＡ配列とは異なる）。ｍｉＲＮＡバリアント又は個々のｉｓｏｍｉＲの発現の増加が、対応する野生型成熟ｍｉＲＮＡの機能の喪失又は弱体化につながるか、又は異なるトランスクリプトームの調節をもたらすと想定できる。最近の研究は、ｉｓｏｍｉＲがおそらく様々な癌、組織、及び細胞型で重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、ｍｉＲＮＡ及びｉｓｏｍｉＲの検出は、根本的な生物学的状況を正確に反映するために、及び正しい診断及び治療の決定を下すために絶対に必要である。
特に、ドローシャ及びダイサーの不正確な切断又はｍｉＲＮＡのターンオーバーが、長さ及び／又は配列が不均一なｍｉＲＮＡが生じさせる可能性がある。ＩｓｏｍｉＲ（ｍｉＲＮＡアイソフォーム）は３つの主なカテゴリに分類できる：３’ｉｓｏｍｉＲ（３’位での１つ又は複数のヌクレオチドのトリミング又は付加）、５’ｉｓｏｍｉＲ（５’位での１つ又は複数のヌクレオチドのトリミング又は付加）、及び多型ｉｓｏｍｉＲ（配列内のいくつかのヌクレオチドが、野生型成熟ｍｉＲＮＡ配列とは異なる）。ｍｉＲＮＡバリアント又は個々のｉｓｏｍｉＲの発現の増加が、対応する野生型成熟ｍｉＲＮＡの機能の喪失又は弱体化につながるか、又は異なるトランスクリプトームの調節をもたらすと想定できる。最近の研究は、ｉｓｏｍｉＲがおそらく様々な癌、組織、及び細胞型で重要な役割を果たしていることを示唆している。したがって、ｍｉＲＮＡ及びｉｓｏｍｉＲの検出は、根本的な生物学的状況を正確に反映するために、及び正しい診断及び治療の決定を下すために絶対に必要である。
【0034】
本明細書で使用されるように、用語「アダプター」は、標的ＲＮＡの５’末端（すなわち「５’アダプター」）又は標的ＲＮＡの３’末端（すなわち「３’アダプター」）にライゲーションすることができるポリヌクレオチドを指す。５’アダプター及び３’アダプターのヌクレオチドは、標準又は天然（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、及びウリジン）、及び非標準ヌクレオチドであり得る。非標準ヌクレオチドの非限定的な例は、イノシン、キサントシン、イソグアノシン、イソシチジン、ジアミノピリミジン及びデオキシウリジンを含む。アダプターは、修飾又は誘導体化されたヌクレオチドを含み得る。リボース又は塩基部分における修飾の非限定的な例は、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基及びチオール基の付加又は除去を含む。特に、２’－Ｏ－メチル及びロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。誘導体化ヌクレオチドの適切な例は、蛍光染料又は消光染料などの染料が共有結合したもの、又はビオチン、ジゴキシゲニン、又は磁性粒子又はミクロスフェアなどの他の分子を伴うものを含む。アダプターはまた、モルホリノ又はペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成ヌクレオチド類似体を含み得る。ホスホジエステル結合又はホスホチオエート結合は、リンカーのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を結合し得る。
【0035】
５’及び３’アダプターの長さは、たとえば、ライゲーション産物の目的の長さ及びアダプターの目的の特性によって異なる。一般に、５’アダプター又は３’アダプターは、１５乃至６０ヌクレオチド長の範囲、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ヌクレオチド長である。
【0036】
本明細書に記載の５’アダプターは、６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列を含み、ここで前記６乃至１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドは
、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的である。さらに、本明細書に記載の３’アダプターは、６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列を含み、ここで前記６乃至１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドは、標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的である。
、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的である。さらに、本明細書に記載の３’アダプターは、６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列を含み、ここで前記６乃至１５個の（ランダム）デオキシヌクレオチドは、標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的である。
【0037】
５’アダプター及び３’アダプターは、例えば変性後／変性時に、線状ポリヌクレオチドとして存在できる。この形態では、５’アダプターと３’アダプターは一本鎖である。この一次構造は二次構造に変換され得る。特に、５’アダプター及び３’アダプターは、さらにステムループ構造を形成できる。したがって、５’アダプター及び３’アダプターも、例えば再生後／再生時に、ステムループ構造を有することもできる。
【0038】
一般に、用語「ステムループ構造」は、一本鎖ＲＮＡで生じることができるパターンを指す。構造は「ヘアピン」又は「ヘアピンループ」としても知られている。これは、同じ鎖の２つの領域（通常、逆方向に読んだ場合にヌクレオチド配列が相補的である）が、塩基対を形成し、対になっていないループで終わる二重らせんを形成する場合に生じる。
【0039】
特に、ステムループ構造を形成できる５’アダプター及び３’アダプターは、互いに逆相補的な５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列を含む。第１ステム配列及び第２ステム配列は、ステムループアダプターの「二本鎖領域」又は「二本鎖ステム」を形成する。
【0040】
一実施形態では、ステムは５乃至２０個、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチド長である。好ましい一実施形態では、ステムは５乃至１０個、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチド長である。
【0041】
プライマーの一部がステムにコードされて得ることに留意すべきである。一般的に、プライマーの一部がステムにコードされる実施形態では、ステムはより長くなり得る。プライマーの一部がステムにコードされていない実施形態では、ステムは短くなり得る。
【0042】
本明細書で使用される用語「ループ」は、ステムループ構造の一本鎖領域を指す。特に、ループは５’位の第１ステム配列と３’位の第２ステム配列の間に位置している。言い換えれば、ループはステムの２つの逆相補鎖の間に位置し、典型的にはループは一本鎖ヌクレオチドを含むが、修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ分子などの他の部分も可能である．一実施形態では、ループ配列は、１０乃至４０個のヌクレオチド、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のヌクレオチドを含む。好ましい一実施形態では、ループ配列は、１２乃至２０個のヌクレオチド、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチドを含む。ループ構造のヌクレオチドは、好ましくはデオキシヌクレオチドであるが、リボヌクレオチドも可能である。
【0043】
プライマーの一部がループ内にコードされ得ることに留意すべきである。一般的に、プライマーがループ内にコードされる実施形態では、ループはより長くなり得る。プライマーがループ内にコードされていない実施形態では、ループはより短くなり得る。
【0044】
さらに、本明細書に記載の５’アダプターは、ステムループ構造の形成後に一本鎖５’突出を形成するように構成された５’末端配列を含むことに留意すべきである。さらに、本明細書に記載の３’アダプターは、ステムループ構造の形成後に一本鎖３’突出を形成
するように構成された３’末端配列を含むことに留意すべきである。
するように構成された３’末端配列を含むことに留意すべきである。
【0045】
アダプター、例えば５’アダプター及び／又は３’アダプターは、１つ又は複数のブロッキングヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される用語「ブロッキングヌクレオチド」は、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド付加を防止又は最小化する化学部分を含むヌクレオチドを指す。例えば、ブロッキング基を末端の３’－ＯＨに追加することにより、ヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるホスホジエステル結合の形成に参加できなくなる。いくつかの非限定的な例は、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカン－ジオール残基、ＰＮＡ、ＬＮＡ、３’－ＯＨ基の代わりに３’－アミノ基を含むヌクレオチド類似体、５’リン酸基の代わりに５’－ＯＨ基を含むヌクレオチド類似体、３’－ＯＨ基を欠くヌクレオチド誘導体、又はビオチンを含む。これらのヌクレオチドは、一般に鎖伸長可能ではない。使用できる非伸長可能なヌクレオチドの他の例は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、リボヌクレオチドで終結するオリゴヌクレオチドは特定のＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないため、リボヌクレオチドは非伸長ヌクレオチドとして機能し得る。リボースは、３’－ヒドロキシが水素以外の官能基、例えばアジド基によって置換されたものを含む３’－デオキシ誘導体を含むように修飾することができる。特定の実施形態では、非伸長性ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮ）、例えば、限定されないが、ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、ジデオキシシトシン（ｄｄＣ）、ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、又はジデオキシウリジン（ｄｄＵ）を含む。
【0046】
特に、アダプター、例えば５’アダプター及び／又は３’アダプターは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。本明細書で使用される用語「ロックド核酸（ＬＮＡ）」は、リボースの２’－Ｏ及び４’－Ｃ原子がメチレン架橋を介して結合された修飾ヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチドを指す。この追加の架橋は、環に通常関連する柔軟性を制限し、本質的に構造を堅固な構造にロックする。これらの核酸類似体はまた、一部の分野では「近づきにくいリボヌクレオチド」として呼ばれる。ＬＮＡヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と混合することができ、事実上、ワトソン・クリック塩基対規則に従ってＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズする。これらの分子の柔軟性のない性質は、ハイブリダイゼーションの安定性を大幅に向上させる。さらに、ＬＮＡを含むポリヌクレオチドは非常に大きな識別力を提供し、これらの分子が正確な一致及び不一致の相補的標的配列をほとんど困難なく区別できる。一実施形態では、５’アダプター及び／又は３’アダプターは、ロックドヌクレオチド、特にリボヌクレオチドを含む。好ましい一実施形態では、５’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、ＬＮＡ強化である。別の好ましい一実施形態では、３’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、ＬＮＡ強化である。
【0047】
３’アダプターは、３’反転デオキシヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される用語「反転デオキシヌクレオチド」は、３’－３’結合を作成するデオキシヌクレオチドを指し、したがって、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ中、アダプターの３’末端からの望ましくないヌクレオチド合成を防ぐ。さらに、３’反転デオキシヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼ切断から配列を保護する。一実施形態では、３’アダプターは、３’反転デオキシヌクレオチドを含む。１つの好ましい実施形態では、３’アダプターは、３’反転デオキシヌクレオチドを含み、ここでデオキシヌクレオチドは、反転ｄＴ、ｄＡ、ｄＣ、又はｄＧである。
【0048】
５’アダプターは、ループ内に、具体的にはループの５’末端に、塩基欠失スペーサーをさらに含み得る。本明細書で使用される用語「塩基欠失スペーサー」は、その後の工程で逆転写の終結を可能にする部分を指す。特に、反応は、５’アダプターのループ領域内
の塩基欠失スペーサーの前のヌクレオチドで終了し、ここで、反応が５’アダプターの最後まで続くのを防ぎ、したがって、その後のＰＣＲ工程を損ない得る、高度に構造化されたｃＤＮＡが生成される。特に、塩基欠失スペーサーは、２’－ジデオキシリボーススペーサーである。より具体的には、塩基欠失スペーサーは、１’２’－ジデオキシリボーススペーサーである。一実施形態では、５’アダプターは、ループ内に、好ましくはループの５’末端に塩基欠失スペーサーを含む。好ましい一実施形態では、５’アダプターは、ループ内に、好ましくはループの５’末端に２’－ジデオキシリボーススペーサーを含む。
の塩基欠失スペーサーの前のヌクレオチドで終了し、ここで、反応が５’アダプターの最後まで続くのを防ぎ、したがって、その後のＰＣＲ工程を損ない得る、高度に構造化されたｃＤＮＡが生成される。特に、塩基欠失スペーサーは、２’－ジデオキシリボーススペーサーである。より具体的には、塩基欠失スペーサーは、１’２’－ジデオキシリボーススペーサーである。一実施形態では、５’アダプターは、ループ内に、好ましくはループの５’末端に塩基欠失スペーサーを含む。好ましい一実施形態では、５’アダプターは、ループ内に、好ましくはループの５’末端に２’－ジデオキシリボーススペーサーを含む。
【0049】
１つのより好ましい実施形態では、５’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列がＬＮＡ強化である５’アダプター、と、３’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列がＬＮＡ強化である３’アダプターとは、組み合わせられている／組み合わせの一部である。さらにより好ましい一実施形態では、５’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列がＬＮＡ強化である５’アダプターと、３’アダプターの５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列がＬＮＡ強化である３’アダプターであって、且つ、３’反転デオキシヌクレオチド、例えば反転ｄＴ、ｄＡ、ｄＣ、又はｄＧを含む３’アダプターとは、組み合わせられている／組み合わせの一部である。
【0050】
更なる本明細書の開示は、サンプル中の標的ＲＮＡにアダプターをライゲーションする方法である。この方法は、アダプター、特に５’及び３’アダプターが標的ＲＮＡにアニーリングされている必要がある。アダプター、特に５’及び３’アダプターが標的ＲＮＡにアニーリングされる前に、標的ＲＮＡが変性される。さらに、アダプター、特に５’及び３’アダプターは変性され、その後再生される。
【0051】
本明細書で使用される用語「アニーリング」は、相補的な配列を有する２つの一本鎖ポリヌクレオチドを加熱及び冷却するプロセスを指す。熱がすべての水素結合を切断し、冷却が新しい結合をシーケンス間に形成させる。この過程で、アダプター、特に５’及び３’アダプターが、標的ＲＮＡに結合し、特徴的なステムループ構造を形成する。特に、５’アダプターは標的ＲＮＡの ５’末端に結合し、３’アダプターは標的ＲＮＡの３’末端に結合する。
【0052】
この点で、本発明の方法では、アダプター、特に５’及び３’アダプターの変性／再生は、標的ＲＮＡの非存在下で別々に行われることに留意すべきである。
【0053】
次に、アダプター、特に５’及び３’アダプターは、二本鎖ＲＮＡリガーゼを使用して、又はそれとともに標的ＲＮＡにライゲーションされ、それによってライゲーション産物が生成される。本明細書で使用される「ライゲーション産物」という用語は、少なくとも１つのアダプター及び標的ＲＮＡを含む（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッド分子を指す。例えば、ライゲーション産物は、５’アダプター及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。ライゲーション産物は、３’アダプター、及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。さらに、生成されるライゲーションは、５’アダプター、３’アダプター、及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。
【0054】
特に、標的ＲＮＡとの５’アダプターのアニーリングは、アダプターの３’末端と標的ＲＮＡの５’末端との間に、ＲＮＡ－ＯＨ－３’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これは、二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションのための効率的な基質である。さらに、標的ＲＮＡとの３’アダプターのアニーリングは、標的ＲＮＡの３’末端とアダプターの５’末端との間にＲＮＡ－ＯＨ－３
’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これも二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションの為の効率的な基質である。
’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これも二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションの為の効率的な基質である。
【0055】
一般に、二本鎖ＲＮＡニック／ＲＮＡ構造をライゲーションできる任意の二本鎖ＲＮＡリガーゼは、この目的に使用し得る。好ましい一実施形態では、二本鎖ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）又はＫｏｄ１リガーゼである。１つのより好ましい実施形態では、二本鎖ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）である。
【0056】
ライゲーション反応の条件は、典型的には、リガーゼがその最適活性レベル近くで機能するように調整される。緩衝剤が、所望のレベルでｐＨを調整及び維持するために、使用され得る。適切な緩衝液の代標的な例は、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、酢酸ナトリウム及びトリス緩衝液を含むが、これらに限定されない。
【0057】
本明細書で使用される用語「伸長反応」は、標的ＲＮＡの３’末端にライゲーションされた３’アダプターが、特に５’から３’方向に伸長されて、標的ＲＮＡに逆相補的な鎖を含む「伸長反応産物」を形成するための伸長反応を指す。本明細書において、伸長反応は「逆転写」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡはｍｉＲＮＡ分子であり、伸長反応は逆転写酵素を含む逆転写反応であり、それによってライゲーション産物のＤＮＡ（特にｃＤＮＡ）コピーが作られる。特定の実施形態では、伸長反応は、逆転写酵素などのポリメラーゼを含む逆転写反応である。
【0058】
本明細書で使用される用語「逆転写酵素」は、逆転写酵素活性を有する任意の酵素を指す。特に、本明細書で使用される用語「逆転写酵素」は、逆転写と呼ばれるプロセスにおいてＲＮＡテンプレートからＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素を指す。逆転写酵素は、ＲＮＡ－依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有している。この活性により、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド二本鎖は、相補的なペアのＤＮＡビルディングブロック（デオキシリボヌクレオチド）を結合することによって、一本鎖ＲＮＡの提示後に最初に構築される。その後、そのＲＮＡ部分は、タンパク質の特別な部分のＲＮａｓｅ Ｈ活性によって大部分は分解される。残りのＤＮＡ一本鎖は、逆転写酵素の追加の固有のＤＮＡ－依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性によって触媒され、ＤＮＡ二本鎖を最終的に完成する。逆転写を開始するために、逆転写酵素は、新しい鎖を合成するための逆転写酵素の開始点として機能するプライマーを必要とする。このプライマーも、ＲＴ－プライマー配列と呼ばれる。ＲＴ－プライマーは、３’アダプター配列に依存する。ＲＴ－プライマーは、前記配列に対して逆相補的である。好ましい一実施形態では、逆転写酵素はマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼである。より好ましい一実施形態では、逆転写酵素はマキシマＨ－ＲＴである。
【0059】
さらに、本明細書に記載されるのは、標的ＲＮＡが検出されるようにライゲーション産物をアッセイする方法である。特に、さらに本明細書に記載されるのは、標的ＲＮＡが検出されるように、標的ＲＮＡのｃＤＮＡ及び３’アダプターを含むライゲーション産物をアッセイするための方法である。アッセイは、サンプル中の標的ＲＮＡの量又はコピーが決定され得るように、定量的であり得る。別法として、アッセイは、サンプル中の標的ＲＮＡの存在又は非存在を決定し得るようにアッセイは定性的であり得るが、そのレベルは測定され得ない、。したがって、アッセイは、サンプル中の標的ＲＮＡの決定と定量化を可能にする。
【0060】
本明細書に記載されるのは、ライゲーション産物をアッセイするための増幅方法である。特に、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施される。ＰＣＲは、リ
アルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣリッチＰＣＲからなる群から選択され得る。標的ＲＮＡを含むライゲーション産物を増幅するために、ライゲーション産物は一般にＤＮＡコピーに変換される。
アルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣリッチＰＣＲからなる群から選択され得る。標的ＲＮＡを含むライゲーション産物を増幅するために、ライゲーション産物は一般にＤＮＡコピーに変換される。
【0061】
本明細書で使用される用語「アンプリコン」及び「増幅産物」という用語は、一般に、増幅反応の産物を指す。アンプリコンは、二本鎖又は一本鎖であり得、二本鎖増幅産物を変性させることによって得られる分離された成分鎖を含み得る。特定の実施形態では、１つの増幅サイクルのアンプリコンは、その後の増幅サイクルでテンプレートとして機能することができる。
【0062】
本明細書で使用される用語「増幅する」は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡ代用物、又はそれらの組み合わせの少なくとも一部が複製される任意の手段を指し、典型的にはテンプレート依存的に、核酸配列を線形又は指数関数的に増幅するための広範囲な技術含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの方法のいずれかが、標的ポリヌクレオチドを増幅するために使用することができる。核酸の標的配列のコピーを増加させるための任意のインビトロ手段が利用できる。これらは、線形、対数、又はその他の増幅方法を含む。例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温手順（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｃｅｄｒｅｓ）（１つ又は複数のＲＮＡポリメラーゼ、鎖置換、プライマー分子の部分的破壊を使用）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ ＲＮＡレプリカーゼシステム、ＲＮＡ転写ベースのシステム（例えば、ＴＡＳ、３ＳＲ）、又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む。
【0063】
本発明の文脈において、標的ＲＮＡのｃＤＮＡが増幅される。
【0064】
本明細書で使用される用語「ダンベルＰＣＲ（ＤＢ－ＰＣＲ）」は、ｍｉＲＮＡなどの特定の個々の低分子ＲＮＡ、及びｉｓｏｍｉＲなどの特定の個々の低分子ＲＮＡバリアントを区別して定量化するための効率的かつ便利な方法を指す。Ｄｂ－ＰＣＲでは、５’－及び３’アダプターが特異的にハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４
ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２））によって標的ＲＮＡの５’末端及び３’末端にそれぞれライゲーションされる。「ダンベルのような」構造を有する得られたライゲーション産物は、例えばＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲによって、その後定量化される。本発明者らは、本明細書に記載のような独自の５’及び３’アダプターの使用、並びに標的ＲＮＡに対するＲｎｌ２ライゲーション及びＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲの高い特異性が、単一ヌクレオチド分解能で標的ＲＮＡの５’及び３’末端配列の両方を保証にし、そのため、Ｄｂ－ＰＣＲはターゲットＲＮＡを特異的に検出するが、対応する末端バリアントを検出しないことを見出した。本明細書に記載のＤｂ－ＰＣＲは、種々の細胞型における様々な低分子ＲＮＡの定量化に広く適用できる。したがって、Ｄｂ－ＰＣＲは、ＲＮＡ末端の不均一性を分析するための非常に必要な簡単な方法を提供する。
ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２））によって標的ＲＮＡの５’末端及び３’末端にそれぞれライゲーションされる。「ダンベルのような」構造を有する得られたライゲーション産物は、例えばＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲによって、その後定量化される。本発明者らは、本明細書に記載のような独自の５’及び３’アダプターの使用、並びに標的ＲＮＡに対するＲｎｌ２ライゲーション及びＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲの高い特異性が、単一ヌクレオチド分解能で標的ＲＮＡの５’及び３’末端配列の両方を保証にし、そのため、Ｄｂ－ＰＣＲはターゲットＲＮＡを特異的に検出するが、対応する末端バリアントを検出しないことを見出した。本明細書に記載のＤｂ－ＰＣＲは、種々の細胞型における様々な低分子ＲＮＡの定量化に広く適用できる。したがって、Ｄｂ－ＰＣＲは、ＲＮＡ末端の不均一性を分析するための非常に必要な簡単な方法を提供する。
【0065】
２つ以上のポリヌクレオチド中の残基は、残基がポリヌクレオチド構造において類似の位置を占めている場合、互いに「対応する」と言われる。２つ以上のポリヌクレオチド中の類似の位置が、核酸配列又は構造的類似性に基づいてポリヌクレオチド配列を整列させることによって決定できることは、当技術分野で周知である。そのようなアライメントツールは、当業者に周知であり、例えばワールド・ワイド・ウェブ、例えば標準設定を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ又はＡｌｉｇｎ、好ましくはＡｌｉｇｎ ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ１０．０、ギャップエクステンド０．５で入手できる。
【0066】
本明細書で使用される用語「疾患」は、個体の身体に影響を与える異常な状態を指す。疾患は、しばしば、特定の症状及び徴候に関連する病状と解釈される。ヒトでは、用語「疾患」は、しばしば、苦しんでいる個人に痛み、機能不全、苦痛、社会的問題、又は死を引き起こす状態、又は個人と接触する人々に同様の問題を引き起こす状態を指すために、より広く使用される。このより広い意味では、傷害、障害、不調、症候群、感染症、逸脱した行動、及び構造と機能の非典型的なバリエーションが含まれることもあるが、他の状況や目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされる場合がある。多くの疾患にかかり生きることは、人生に対する見方や性格を変える可能性があるので、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個人に影響を与える。疾患は、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症、及び癌からなる群から選択される疾患であり得る。
【0067】
本明細書で使用される用語「治療的処置／療法」は、患者の健康状態を改善し、及び／又は寿命を延ばす（増加させる）任意の処置／療法に関する。前記治療／療法は、患者の疾患を排除し、患者の疾患の発症を停止、阻害、又は遅らせ、患者の症状の頻度又は重症度を減少させ、及び／又は現在病気にかかっている又は以前に病気にかかったことがある患者の疾患の再発を減少させ得る。
【0068】
本明細書で使用される用語「サンプル」は、標的ＲＮＡ、特にコーディング及び／又は非コーディング、より具体的には小型非コーディング標的ＲＮＡを含む任意のサンプルを指す。前記サンプルは、患者／被験者の身体に特異的に由来する。前記サンプルは、生物、組織、細胞、又は血液などの体液から単離された標的ＲＮＡ、特に小型非コード標的ＲＮＡを特異的に含む。したがって、サンプルは、特に生物学的サンプルである。
【0069】
本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、生物学的起源を有する任意のサンプルを指し、及び／又は生物学的物質を含む。生物学的サンプルは、体液サンプル（例えば、血液サンプル若しくは尿サンプル）、又は組織サンプル（例えば、組織生検サンプル）であり得る。生物学的サンプルは、混合又はプールし得、例えば、サンプルは血液サンプルと尿サンプルの混合物であり得る。
【0070】
本明細書で使用される用語「体液サンプル」は、標的ＲＮＡを含む任意の液体サンプルを指す。前記サンプルは、患者／被験者の身体に特異的に由来する。前記体液サンプルは、その成分又は画分を含む、尿サンプル、血液サンプル、喀痰サンプル、母乳サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ、ｅａｒｗａｘ）サンプル、胃液サンプル、粘液サンプル、リンパサンプル、内リンパ液サンプル、外リンパ液サンプル、腹水サンプル、胸水サンプル、唾液サンプル、皮脂（ｓｅｂｕｍ、ｓｋｉｎ ｏｉｌ）サンプル、精液サンプル、汗サンプル、涙サンプル、頬スワブ、膣分泌物サンプル、リキッドバイオプシー、又は嘔吐物サンプルであってもよい。用語「体液サンプル」は、体液画分（例えば、血液画分、尿画分又は喀痰画分）も包含する。体液サンプルは、混合又はプールすることができる。したがって、体液サンプルは、血液と尿サンプルの混合物、又は血液と脳脊髄液サンプルの混合物であり得る。
【0071】
本明細書で使用される用語「血液サンプル」は、全血又は血液画分を包含する。好ましくは、血液画分は、血球画分、血漿、及び血清からなる群から選択される。特に、血液画分は、血球画分及び血漿又は血清からなる群から選択される。例えば、血球画分は、赤血球、白血球、及び／又は血小板を包含する。
【0072】
全血サンプルは、採血管によって採取することができる。これは、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、Ｔｅｍｐｕｓ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、ＥＤＴＡチューブ、クエン酸ナトリウムチューブ、ヘパリンチューブ、又はＡＣＤチューブ（クエン酸デキストロース）に収集される。
【0073】
全血サンプルはまた、血液スポット技術（例えば、Ｍｉｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅ）によって収集され得る。この手法は、より少ないサンプル量、典型的にはヒトの場合は４５乃至６０μＬ以下を必要とする。例えば、全血は、針又はランセットで指を刺して患者から採取することができる。したがって、全血サンプルは、血液滴の形態を有し得る。次いで、前記血液滴は、吸収性プローブ（例えば、全血を吸収できるセルロースなどの親水性ポリマー材料）上に置かれる。サンプリングが完了すると、処理のためにラボに転送又は郵送される前に、血液スポットが空気中で乾燥される。血液は乾燥しているため、危険とは見なされない。そのため、取り扱いや輸送の際に、特別な注意は必要ない。分析サイトに到着したら、目的の成分（例えば、ｍｉＲＮＡ）は、乾燥した血液スポットから上清に抽出され、次いでさらに分析される。
【0074】
本明細書で使用される用語「レベル」は、標的ＲＮＡの量（例えば、グラム数、モル数、又はイオン数で測定される）又は濃度（例えば、絶対又は相対濃度、例えば百万当たりの読み取り数（ＲＰＭ）又はＮＧＳ数）を指す。本明細書で使用される用語「レベル」は、尺度化、正規化、又は尺度化及び正規化された量又は値も含む。特に、標的ＲＮＡのレベルは、配列決定、好ましくは次世代配列決定（例えば、ＡＢＩ ＳＯＬＩＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｒｏｃｈｅ ４５４ ＧＳ ＦＬ、ＢＧＩＳＥＱ）、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ又はビーズ）、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、又はハイスループットＲＴ－ＰＣＲ）、ポリメラーゼ伸長、質量分析、フローサイトメトリー（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ）、又はそれらの任意の組み合わせによって決定される。具体的には、標的ＲＮＡのレベルは、前記標的ＲＮＡの発現レベルである。
【0075】
本明細書で使用される用語「患者」は、彼女又は彼が疾患又は症状を患っているかどうかを知ることが望まれる任意の個人を指す。特に、本明細書で使用される用語「患者」は、疾患又は症状を患っていると疑われる個人を指す。患者は、疾患又は症状を患っていると診断されてもよいし、疾患又は症状を患らっていない、すなわち健康であると診断されてもよい。本明細書で使用される用語「患者」は、疾患又は症状を患っている個体も指す。患者は、疾患又は症状について再検査され得、疾患又は症状をまだ患っているか、又は疾患又は症状をもはや患っていない、すなわち健康であると（例えば、治療介入後）診断される場合がある。患者は、ヒト又は動物であり得る。ヒト個体が特に好ましい。
【0076】
本明細書で使用される用語「（対照）対象」という用語は、疾患又は症状を患っていることが知られている、又は疾患又は症状を患っていないことが知られている、すなわち健康な対象を指す。（対照）対象は、ヒト又は動物であり得る。ヒト個体が特に好ましい。
【0077】
本発明の文脈において、用語「部品のキット（要するに：キット）」は、本明細書で特定された構成要素の少なくともいくつかの任意の組み合わせであると理解され、これらは、混合され、空間的に共存させ、機能単位となり、及びさらなる構成要素を含めることができる。
【0078】
本発明の実施形態
ここで、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されていない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示された特徴は、反対に明確に示されない限り、好ましい又は有利であると示された他の特徴と組み合わせることができ得る。
ここで、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されていない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示された特徴は、反対に明確に示されない限り、好ましい又は有利であると示された他の特徴と組み合わせることができ得る。
【0079】
本発明者らは、二本鎖ＲＮＡリガーゼ、特にＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）がハイブリ
ダイズした二本鎖ＲＮＡ分子のニックを特異的に結合する能力を利用する、ダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）に基づく方法を開発した。ｉｓｏｍｉＲの５’及び３’末端の両方に正しくハイブリダイズしたアダプターのみが、ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用できるライゲーションされたＲＮＡの形成を可能にする。この方法は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び特定の末端配列を有する標的ＲＮＡバリアント（例えば、ｉｓｏｍｉＲ）の発現を特異的かつ効率的に決定及び定量化することがでる。特異性の第２層は、ＴａｑＭａｎプローブによって導入され、ｃＤＮＡ配列のユーザー定義領域にアラインできる。本発明者らによって開発されたダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）ベースの方法は、任意の病院／臨床又は研究センターで使用することができ、簡易、迅速、信頼性、正確、且つ費用対効果の高い方法で臨床サンプルの分析を可能にする。この方法により、診断検査の特異性及び感度をさらに改善することができる。上記目的に適したキットも提供される。
ダイズした二本鎖ＲＮＡ分子のニックを特異的に結合する能力を利用する、ダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）に基づく方法を開発した。ｉｓｏｍｉＲの５’及び３’末端の両方に正しくハイブリダイズしたアダプターのみが、ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用できるライゲーションされたＲＮＡの形成を可能にする。この方法は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び特定の末端配列を有する標的ＲＮＡバリアント（例えば、ｉｓｏｍｉＲ）の発現を特異的かつ効率的に決定及び定量化することがでる。特異性の第２層は、ＴａｑＭａｎプローブによって導入され、ｃＤＮＡ配列のユーザー定義領域にアラインできる。本発明者らによって開発されたダンベルＰＣＲ（ＤＢ ＰＣＲ）ベースの方法は、任意の病院／臨床又は研究センターで使用することができ、簡易、迅速、信頼性、正確、且つ費用対効果の高い方法で臨床サンプルの分析を可能にする。この方法により、診断検査の特異性及び感度をさらに改善することができる。上記目的に適したキットも提供される。
【0080】
したがって、第１の態様では、本発明は、５’から３’の以下の順序で構成される５’アダプターであって、
（ｉ）６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的であり、及び
（ｉｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列であって、その３’末端で少なくとも２個、例えば、２、３、又は４個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり、且つ、ヌクレオチド配列は（好ましくは）（ＬＮＡ）強化である、
５’アダプターに関する。
（ｉ）６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的であり、及び
（ｉｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することができるヌクレオチド配列であって、その３’末端で少なくとも２個、例えば、２、３、又は４個のヌクレオチドは、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであり、且つ、ヌクレオチド配列は（好ましくは）（ＬＮＡ）強化である、
５’アダプターに関する。
【0081】
好ましくは、ＬＮＡ強化配列は、２乃至１０個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個、より好ましくは３個のロックドヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチドを含む。
【0082】
特に、５’アダプターのヌクレオチド配列は、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。
【0083】
５’アダプターは、１５乃至６０個、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０個のヌクレオチド長の範囲であり得る。
【0084】
５’アダプターは、例えば変性後／変性時に、線状ポリヌクレオチドとして、特に一本鎖の形で存在し得る。５’アダプターは、標的ＲＮＡの５’末端に結合／ライゲーションできるポリヌクレオチドである。標的ＲＮＡの５’末端に結合／ライゲーションする場合、５’アダプターはステムループ構造を有する。５’アダプターは、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的である、６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含むので、結合／ライゲーションが可能である。標的ＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲｂａｓｅバージョン２２．１に、又はその一部に含まれるｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲである。
【0085】
一実施形態では、ステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列は、互いに逆相補的である５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列を含む。したがって、５’位の第１ステム配列及び３’位の２第２ステム配列は、二本鎖ステムを形成することができる。
【0086】
二本鎖ステムは、５乃至２０個、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチドの長さを有し得る。
【0087】
好ましくは、５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列のそれぞれは、５乃至１０個、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの長さを有する。特に、５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列は、同じ長さ、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの長さを有する。
【0088】
より好ましくは、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、ＬＮＡ強化である。特に、ＬＮＡ強化配列は、２乃至５個、例えば、２、３、４、又は５個、より具体的には３個のロックドヌクレオチド、特にリボヌクレオチドを含む。ロックドリボヌクレオチドの例は、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－アデノシン又はＬＮＡ－シトシンである。さらにより好ましくは、５’位の第１ステム配列はＬＮＡ強化である。特に、ＬＮＡ強化配列は、２乃至５個、例えば、２、３、４、又は５個、より具体的には３個のロックドヌクレオチド、特にリボヌクレオチドを含む。ロックドリボヌクレオチドの例は、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－アデノシン又はＬＮＡ－シトシンである。特に、全て、１個おき、又は２個おきのヌクレオチドが、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列において、ＬＮＡ強化され得る。
【0089】
したがって、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ強化）（の混合物）を含み得るか、又は又は５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列はリボヌクレオチドを含み得る。前記リボヌクレオチドは、ＬＮＡ－強化リボヌクレオチドを含む。
【0090】
さらなる一実施形態では、ステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列は、５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列の間に位置するループ配列を含む。ループ配列は、１０乃至４０個、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０個、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含み、より好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０個、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のデオキシヌクレオチドを含む。
【0091】
好ましい一実施形態では、ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列は、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド、好ましくは２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びロックドリボヌクレオチドである、その３’末端の少なくとも２個のヌクレオチドを除いた、デオキシヌクレオチドを含む。
【0092】
他の一実施形態では、５’末端配列は、ステムループ構造の形成後に一本鎖５’突出を形成するように構成される。
【0093】
好ましい一実施形態では、標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的である６乃至１５個、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドは、Ｇ及びＣを包含するが、連続して４個以下、例えば１、２、３、又は４個以下で包含する。
【0094】
より好ましい一実施形態では、５’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、及び、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である。）を有するが、又はこの配列のバリアントである。
【化1】
【0095】
例えば、全て、１個おき、又は３個おきのヌクレオチドは、上記で指定した下線部分及び／又は二重下線部分でのＬＮＡ強化であり得る。
【0096】
さらにより好ましい一実施形態では、５’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）がＬＮＡ強化である。）を有するか、又はこの配列のバリアントである。
【化2】
【0097】
特に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。上記の５’アダプターバリアントは、配列番号：１に従う配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する配列を有する。このような５’アダプターバリアントは、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであるその３’末端に少なくとも２個のヌクレオチドを依然として含む。さらに、このような５’アダプターバリアントは、依然としてＬＮＡ強化である。さらに、このような５’アダプターバリアントは、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できる。当業者は、５’アダプターバリアントが、ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を依然として形成できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0098】
特定の一実施形態では、上記の５’アダプターは、ループ領域に塩基欠失スペーサー（例えば、塩基欠失１’，２’－ジデオキシリボーススペーサー）を含む。ループ領域に塩基欠失スペーサーを有する５’アダプターは、好ましくは５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である。）を有するか、又はこの配列のバリアントである。
【化3】
【0099】
特に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【0100】
より特定の一実施形態では、ループ領域に塩基欠失スペーサー（例えば、塩基欠失１’，２’－ジデオキシリボーススペーサー）を含む５’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）はＬＮＡ強化である。）を有するか、又はその配列のバリアントである。
【化4】
【0101】
上記の５’アダプターバリアントは、配列番号：２９に従う配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。このような５’アダプターバリアントは、リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチドであるその３’末端に少なくとも２個のヌクレオチドを依然として含んでいる。さらに、このような５’アダプターバリアントは依然としてＬＮＡ強化である。さらに、このような５’アダプターは、依然として塩基欠失スペーサーを含む。さらに、このような５’アダプターバリアントは、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できる。当業者は、５’アダプターバリアントが、ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を依然として形成できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0102】
別の特定の一実施形態では、上記の５’アダプターは、ループ領域に塩基欠失スペーサー（例えば、塩基欠失１’，２’－ジデオキシリボーススペーサー）を含まない。
【0103】
上記の５’アダプターは、可変突出を交換するだけで、任意のＲＮＡ標的（具体的には、任意のＲＮＡ標的の５’末端）に結合できる。特に、５’アダプターの５’末端ヌクレオチド配列中の６乃至１５個、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドは、検出されるべき標的ＲＮＡ（具体的に、標的ＲＮＡの５’末端）に逆相補的であるように選択しさえすればよい。５’アダプターは、特に３’アダプターと組み合わせて使用される。
【0104】
上記の５’アダプターは、変性又は再生された形で存在し得る。
【0105】
別の一実施形態では、標的ＲＮＡは、５’リン酸部分及び３’ヒドロキシル部分を有する任意の一本鎖ＲＮＡである。特に、標的ＲＮＡは、＜２００リボヌクレオチド、例えば１０乃至＜２００のリボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。より具体的には、標的ＲＮＡは、１０乃至１００個のリボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。さらにより具体的には、標的ＲＮＡは、１０乃至５０個のリボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。前記ＲＮＡは、具体的にはｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。
【0106】
第２の態様では、本発明は、５’から３’の以下の順序で含む３’アダプターであって、
（ｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列であって、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されており、ヌクレオチド配列が（好ましくは）ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化であり、及び
（ｉｉ）６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的であり、かつ、３’末端デオキシヌクレオチドは反転デオキシヌクレオチドである、
３’アダプターに関する。
（ｉ）ループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列であって、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されており、ヌクレオチド配列が（好ましくは）ロックドヌクレオチド（ＬＮＡ）強化であり、及び
（ｉｉ）６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド配列であって、前記６乃至１５個のデオキシヌクレオチドは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的であり、かつ、３’末端デオキシヌクレオチドは反転デオキシヌクレオチドである、
３’アダプターに関する。
【0107】
好ましくは、ＬＮＡ強化配列は、２乃至１０個、例えば、２、３、４、５、６、７、８
、９、又は１０個、より好ましくは３個のロックッドヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチドを含む。
、９、又は１０個、より好ましくは３個のロックッドヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチドを含む。
【0108】
特に、３’アダプターのヌクレオチド配列は、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。
【0109】
３’アダプターは、約１５乃至約６０個、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０個のヌクレオチド長の範囲であり得る。
【0110】
３’アダプターは、変性後／変性時に、線状ポリヌクレオチドとして、特に一本鎖の形として存在し得る。３’アダプターは、標的ＲＮＡの３’末端に結合／ライゲーションできるポリヌクレオチドである。標的ＲＮＡの３’末端に結合／ライゲーションした場合、３’アダプターはステムループ構造を有する。３’アダプターは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的である６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドを含むので、結合／ライゲーションは可能である。標的ＲＮＡは、好ましくは、ｍｉＲｂａｓｅバージョン２２．１に含まれるｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲである。
【0111】
一実施形態では、ステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列は、互いに逆相補的である５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列を含む。したがって、５’位の最初のステム配列及び３’位の第２ステム配列は、二本鎖ステムを形成できる。
【0112】
二本鎖ステムは、５乃至２０個、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のヌクレオチドの長さを有し得る。
【0113】
好ましくは、５’位の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列のそれぞれは、５乃至１０個、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの長さを有する。特に、５’位の第一ステム配列及び３’位の第２ステム配列は同じ長さ、例えば５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの長さを有する。
【0114】
より好ましくは、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、ＬＮＡ強化である。特に、ＬＮＡ強化配列は、２乃至５個、例えば、２、３、４、又は５個、より具体的には３個のロックドヌクレオチド、具体的にリボヌクレオチドを含む。ロックドリボヌクレオチドの例は、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－アデノシン又はＬＮＡ－シトシンである。さらにより好ましくは、３’位の第２のステム配列は、ＬＮＡ強化である。特に、ＬＮＡ強化配列は、２乃至５個、例えば、２、３、４、又は５個、より特別には３個のロックドヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチドを含む。ロックドリボヌクレオチドの例は、ＬＮＡ－グアニン、ＬＮＡ－アデノシン又はＬＮＡ－シトシンである。具体的に、全て、１個おき、又は３個おきのヌクレオチドが、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列において、ＬＮＡ強化であり得る。
【0115】
したがって、５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ強化）（の混合物）を含み得、又は５’位の第１ステム配列及び／又は３’位の第２ステム配列は、リボヌクレオチドを含み得る。前記リボヌクレオチドは、ＬＮＡ－強化リボヌクレオチドを含む。
【0116】
さらなる一実施形態では、ステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列は、５’位
の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列との間に位置するループ配列を含む。ループ配列は、１０乃至４０個、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含む。より好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のデオキシヌクレオチドを含む。
の第１ステム配列及び３’位の第２ステム配列との間に位置するループ配列を含む。ループ配列は、１０乃至４０個、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含む。より好ましくは、ループ配列は、１２乃至２０、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のデオキシヌクレオチドを含む。
【0117】
別の一実施形態では、３’末端配列は、ステムループ構造の形成後に一本鎖３’突出を形成するように構成される。
【0118】
好ましい一実施形態では、標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的である
６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドは、Ｇ及びＣを包含するが、連続で４個以下、例えば１、２、３、又は４個以下で包含する。
６乃至１５個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドは、Ｇ及びＣを包含するが、連続で４個以下、例えば１、２、３、又は４個以下で包含する。
【0119】
好ましい一実施形態では、反転デオキシヌクレオチドは、反転ｄＴ、ｄＡ、ｄＣ、又はｄＧである。この点で、３’反転デオキシヌクレオチドが３’－３’結合を作成し、このため例えばＲＴ－ＰＣＲ中、アダプターの３’末端から望ましくないヌクレオチド合成を防止することに留意するべきである。さらに、３’反転デオキシヌクレオチドは、配列を３’エキソヌクレアーゼ切断から保護する。
【0120】
より好ましい一実施形態では、３’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は、標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、及び「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）を有するか、又はこの配列のバリアントである。
【化5】
【0121】
例えば、全て、１個おき、又は３個おきのヌクレオチドは、上記で特定された下線部分及び／又は二重下線部分ではＬＮＡ強化であり得る。
【0122】
さらにより好ましい一実施形態では、３’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端のヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１、２、又は３個）がＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）を有するか、又はこの配列のバリアントである。
【化6】
【0123】
具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【0124】
上記の３’アダプターバリアントは、配列番号：２に従う配列と、少なくとも８０％、
好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。このような３’アダプターバリアントは、依然としてＬＮＡ強化である。さらに、５’末端ヌクレオチドは、そのような３’アダプターバリアントにおいても依然としてリン酸化されている。さらに、３’末端デオキシヌクレオチドは、そのような３’アダプターバリアントにおいても依然として反転デオキシヌクレオチドである。さらに、そのような３’アダプターバリアントは、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することが可能である。当業者は、３’アダプターバリアントが、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。このような３’アダプターバリアントは、依然としてＬＮＡ強化である。さらに、５’末端ヌクレオチドは、そのような３’アダプターバリアントにおいても依然としてリン酸化されている。さらに、３’末端デオキシヌクレオチドは、そのような３’アダプターバリアントにおいても依然として反転デオキシヌクレオチドである。さらに、そのような３’アダプターバリアントは、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成することが可能である。当業者は、３’アダプターバリアントが、依然としてループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0125】
上記の３’アダプターは、可変突出を交換するだけで、任意のＲＮＡ標的（具体的に、任意のＲＮＡ標的の３’末端）に結合できる。特に、３’アダプターの３’末端ヌクレオチド配列中の６乃至１５個、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のデオキシヌクレオチドは、それらが検出する標的ＲＮＡ（具体的に、標的ＲＮＡの３’末端）に逆相補的であるように選択さえすればよい。３’アダプターは、特に５’アダプターと組み合わせて使用される。
【0126】
上記の３’アダプターは、変性又は再生された形で存在し得る。
【0127】
別の実施形態では、標的ＲＮＡは、５’リン酸部分及び３’ヒドロキシル部分を有する任意の一本鎖ＲＮＡである。特に、標的ＲＮＡは、＜２００リボヌクレオチド、例えば１０乃至＜２００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。より特別には、標的ＲＮＡは、１０乃至１００リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。さらにより特別には、標的ＲＮＡは、１０乃至５０リボヌクレオチドの長さを有するＲＮＡである。前記ＲＮＡは、具体的にはｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。
【0128】
第３の態様において、本発明は、第１の態様による５’アダプター、及び第２の態様による３’アダプターを含む組み合わせに関する。
【0129】
第１の態様による５’アダプター及び第２の態様による３’アダプターは、個々に又は一緒に組み合わせて存在し得る。例えば、第１の態様による５’アダプターは（第１の）組成物に含まれ得、第２の態様による３’アダプターは別の／異なる（第２の）組成物に含まれ得る。あるいは、第１の態様による５’アダプター及び第２の態様による３’アダプターは、単一の組成物に含まれ得る。組成物は、水又は緩衝液などの水溶液であり得る。
【0130】
１つの好ましい実施形態では、６乃至１５個のデオキシヌクレオチド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個を含む５’末端ヌクレオチド配列、及び６乃至１５個のデオキシヌクレオチド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個を含む３’末端ヌクレオチド配列の全長は、標的ＲＮＡの長さよりも、少なくとも２個、例えば２、３、４、５、又は６個のヌクレオチド短い。
【0131】
好ましい一実施形態では、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重
下線部の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、並びに
５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプターは、結合している／又は組み合わせの一部である。
【化7】
下線部の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、並びに
５’から３’の以下の配列：
【化8】
【0132】
具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【0133】
より好ましい一実施形態では、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１、２、又は３個）がＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、並びに５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、太字のヌクレオチドの１個又はそれ以上（例えば、１、２、又は３個）はＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプターは、結合している／組み合わせの一部である。
【化9】
【化10】
【0134】
具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【0135】
１つの特定の実施形態では、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、並びに
５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプターは、結合されている／組み合わせの一
部である。
【化11】
５’から３’の以下の配列：
【化12】
部である。
【0136】
より特定の一実施形態では、
５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、太字のヌクレオチドの１つ又は複数（例えば、１、２、又は３個）はＬＮＡ強化である）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、並びに
５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、太字のヌクレオチドの１つ又は複数（例えば、１、２、又は３個）はＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプターは、結合している／組み合わせの一部である。
５’から３’の以下の配列：
【化13】
５’から３’の以下の配列：
【化14】
【0137】
具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【0138】
第４の態様では、
（ｉ）サンプル中の変性標的ＲＮＡ、第１の態様による再生５’アダプター、及び第２の態様による再生３’アダプターを含む組成物であって、５’アダプター及び３’アダプターは、標的ＲＮＡにア
ニールされている、組成物を提供する工程、及び
（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡリガーゼを用いて／と共に５’アダプター及び３’アダプターを標的ＲＮＡにライゲーションし、それによりライゲーション産物を得る工程、
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡに、二つのアダプターをライゲーションする方法に関する。
（ｉ）サンプル中の変性標的ＲＮＡ、第１の態様による再生５’アダプター、及び第２の態様による再生３’アダプターを含む組成物であって、５’アダプター及び３’アダプターは、標的ＲＮＡにア
ニールされている、組成物を提供する工程、及び
（ｉｉ）二本鎖ＲＮＡリガーゼを用いて／と共に５’アダプター及び３’アダプターを標的ＲＮＡにライゲーションし、それによりライゲーション産物を得る工程、
を含む、サンプル中の標的ＲＮＡに、二つのアダプターをライゲーションする方法に関する。
【0139】
標的ＲＮＡへのアダプター、特に５’及び３’アダプターのアニーリングは、標的ＲＮＡが変性した形で存在する必要がある。一実施形態では、変性標的ＲＮＡは、６５℃乃至７５℃、例えば６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５℃、好ましくは７０℃で、１乃至３分、例えば１，２，又は３分、好ましくは２分間、標的ＲＮＡを加熱することによって生成される。
【0140】
例えば、変性標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡを７０℃で２分間加熱することによって生成される。
【0141】
標的ＲＮＡは、変性後直ちに氷上に置くことが好ましい。
【0142】
変性工程のために、標的ＲＮＡには、好ましくは、水溶液（例えば水）、又は緩衝液が与えられる。
【0143】
アダプター、特に５’及び３’アダプターに関しては、それらが、標的ＲＮＡへのアニーリングを可能にするステムループ構造を形成（ｆｒｏｍ）できるように、変性及び再生工程が必要である。アニーリングは、相補的なシーケンスでアダプターを加熱及び冷却す
るプロセスである。熱はすべての水素結合を切断し、及び冷却は新しい結合を配列間に形成することを可能にする。この過程で、アダプター、特に５’及び３’アダプターが変性した標的ＲＮＡに結合し、及びそれらの特徴的なステムループ構造を形成する。特に、５’アダプターは標的ＲＮＡの５’末端に結合し、及び３’アダプターは標的ＲＮＡの３’末端に結合する。アダプター、特に５’及び３’アダプターは、一緒に、即ち一般的な反応容器で変性及び再生されることが好ましい。アダプター、特に５’及び３’アダプターの変性／再生は、別々に及び標的ＲＮＡの非存在下で行われることがさらに好ましい。一実施形態では、再生５’アダプターは、７５℃乃至８５℃、例えば７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５℃、好ましくは８２℃で、１乃至３分間、例えば、１、２、又は３分間、好ましくは２分間、５’アダプターを変性し、そして４℃まで、好ましくは０．１℃／ｓの速度で冷却することで、５’アダプターを再生することで生成される。
るプロセスである。熱はすべての水素結合を切断し、及び冷却は新しい結合を配列間に形成することを可能にする。この過程で、アダプター、特に５’及び３’アダプターが変性した標的ＲＮＡに結合し、及びそれらの特徴的なステムループ構造を形成する。特に、５’アダプターは標的ＲＮＡの５’末端に結合し、及び３’アダプターは標的ＲＮＡの３’末端に結合する。アダプター、特に５’及び３’アダプターは、一緒に、即ち一般的な反応容器で変性及び再生されることが好ましい。アダプター、特に５’及び３’アダプターの変性／再生は、別々に及び標的ＲＮＡの非存在下で行われることがさらに好ましい。一実施形態では、再生５’アダプターは、７５℃乃至８５℃、例えば７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５℃、好ましくは８２℃で、１乃至３分間、例えば、１、２、又は３分間、好ましくは２分間、５’アダプターを変性し、そして４℃まで、好ましくは０．１℃／ｓの速度で冷却することで、５’アダプターを再生することで生成される。
【0144】
例えば、再生５’アダプターは、８２℃で２分間、５’アダプターを変性し、そして４℃まで、好ましくは０．１℃／ｓの速度で冷却することにより再生５’アダプターを再生させることで生成される。
【0145】
追加又は代替の一実施形態では、再生された３’アダプターは、７５℃乃至８５℃、例えば７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５℃で、好ましくは８２℃で、１乃至３分間、例えば１、２、又は３分間、好ましくは２分間、３’アダプターを変性し、そして、４℃まで、好ましくは０．１℃／秒の速度で冷却することで、３’アダプターを再生することにより生成される。
【0146】
例えば、再生３’アダプターは、８２℃で２分間、３’アダプターを変性し、そして４℃まで、好ましくは０．１℃／秒の速度で３’アダプターを冷却することで再生することにより生成される。
【0147】
変性及び再生工程のために、アダプター、特に５’及び３’アダプターは、好ましくは、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む水性緩衝液に与えられる。言い換えれば、アダプター、特に５’及び３’アダプターの変性及び再生は、好ましくは、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む水性緩衝液中で実施される。
【0148】
上記方法の工程（ｉ）で提供される組成物は、具体的には、変性標的ＲＮＡ、第１の態様による再生５’アダプター、及び第２の態様による再生３’アダプターを互いに混合し、それにより５’アダプター及び３’アダプターを標的ＲＮＡにアニーリングすることにより、生成される。したがって、アダプター、特に５’及び３’アダプターは、同時に標的ＲＮＡにアニーリング／ライゲーションされる。さらに、変性標的ＲＮＡは、アニーリング／ライゲーション反応の前に、アダプター、特に５’及び３’アダプターと混合されるのみである。言い換えれば、アダプター、特に５’及び３’アダプターは、アニーリング／ライゲーション反応の前にターゲットＲＮＡと混合されるのみである。これは、リボソーマルＲＮＡなどの豊富なＲＮＡを介してこのプロセスを妨げる可能性のあるＲＮＡ非存在下で、安定なアダプター構造が形成するという利点がある。
【0149】
標的ＲＮＡとの５’アダプターのアニーリングは、特に、アダプターの３’末端及び標的ＲＮＡの５’末端間に、ＲＮＡ－ＯＨ－３’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これは、二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションのための効率的な基質である。
【0150】
さらに、標的ＲＮＡとの３’アダプターのアニーリングは、特に、標的ＲＮＡの３’末
端とアダプターの５’末端の間にＲＮＡ－ＯＨ－３’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これは、二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションのための基質である。
端とアダプターの５’末端の間にＲＮＡ－ＯＨ－３’／５’－Ｐ－ＲＮＡのニックを含む二本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッドを生成する。これは、二本鎖ＲＮＡリガーゼによるライゲーションのための基質である。
【0151】
ライゲーションは通常、ライゲーション緩衝液中で実施される。例となるライゲーション緩衝液は、本特許出願の実施例の項に記載されている。好ましい一実施形態では、ライゲーション緩衝液はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ８０００（５％）、及び／又はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、例えば１ｍＭ ＡＴＰを含む。本発明者らは、ＰＥＧが分子クラウディング剤として機能するようにライゲーション反応に影響を有し、及び／又は増加した濃度がライゲーション反応を促進するようにＡＴＰがライゲーション反応に影響を及ぼすことに気付いた。
【0152】
一実施形態において、ライゲーションは、３６℃乃至３８℃、例えば３６、３７、又は３８℃、好ましくは３７℃で、３０分乃至１．５時間、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５分、１、１．２５、又は１．５時間、好ましくは１時間で、又は１５℃乃至２０℃、例えば１５、１６、１７、１８、１９、又は２０℃、好ましくは１６℃で、３０分乃至２時間、例えば３０、３５、４０、４５、５０、５５分、１、１．２５、１．５、１．７５、又は２時間、好ましくは１又は２時間、及びその後１２℃で一晩実施される。一晩とは、８乃至１２時間の期間、例えば８、９、１０、１１又は１２時間を意味し得る。
【0153】
例えば、ライゲーションは、３７℃で１時間、又は１６℃で１又は２時間、及びその後１２℃で一晩実施される。一晩とは、８時間乃至１２時間の期間、例えば８、９、１０、１１、又は１２時間を意味し得る。
【0154】
二本鎖ＲＮＡリガーゼは、二本鎖ＲＮＡニック／ＲＮＡ構造をライゲーションできる任意のリガーゼであり得る。好ましくは、二本鎖ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）又はＫｏｄ１リガーゼである。
【0155】
この点において、完全にハイブリダイズした分子だけが二本鎖ＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２のための基質を提供することに留意すべきである。また、２個のヌクレオチド又はそれ以上である鎖又はギャップのいずれかの突出の場合、Ｒｎｌ２は、はるかに低い効率で分子をライゲーションする。本明細書に記載のアダプター、特に５’及び３’アダプターは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする６乃至１５個のヌクレオチド突出を有するｄｓＲＮＡ状況を提供する。最後に、標的ＲＮＡ分子の５’リン酸部分も、Ｒｎｌ２による効率的なライゲーションには必要である。
【0156】
二本鎖ＲＮＡリガーゼを使用／と共に標的ＲＮＡにアダプター、特に５’及び３’アダプターをライゲーションすることにより、ライゲーション産物が生成される。ライゲーション産物は、少なくとも１つのアダプター及び標的ＲＮＡを含む（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ハイブリッド分子として説明できる。例えば、ライゲーション産物は、５’アダプター及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。ライゲーション産物は、３’アダプター、及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。さらに、生成されたライゲーションは、５’アダプター、３’アダプター、及びｍｉＲＮＡ又はｉｓｏｍｉＲなどの標的ＲＮＡを含み得る。
【0157】
第五の態様において、本発明は、
（ｉ）第４の態様による方法を実施する工程、
（ｉｉ）ライゲーション産物を逆転写し、それにより標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得る工程、及び
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを増幅し、それにより標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する工程、を含む、サンプル中の標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する方法に関する、
（ｉ）第４の態様による方法を実施する工程、
（ｉｉ）ライゲーション産物を逆転写し、それにより標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得る工程、及び
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡを増幅し、それにより標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する工程、を含む、サンプル中の標的ＲＮＡを決定及び／又は定量化する方法に関する、
【0158】
一実施形態では、ライゲーション産物の逆転写は、
（ｉｉａ）逆転写用プライマー（ＲＴ－プライマー）をライゲーション産物とアニーリングすること、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてライゲーション産物を逆転写すること、
により実施される。
（ｉｉａ）逆転写用プライマー（ＲＴ－プライマー）をライゲーション産物とアニーリングすること、及び
（ｉｉｂ）逆転写酵素（ＲＴ）を用いてライゲーション産物を逆転写すること、
により実施される。
【0159】
好ましい一実施形態では、工程（ｉｉａ）におけるライゲーション産物との逆転写用プライマー（ＲＴプライマー）の前記アニーリングは、６０℃乃至８０℃、例えば６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０℃、好ましくは６５℃又は７５℃で２乃至７分間、例えば２、３、４、５、６、又は７分、好ましくは３又は５分で、実施される
【0160】
例えば、前記アニーリングは、６５℃で２乃至７分間、例えば２、３、４、５、６、又は７分、好ましくは５分で実施される。あるいは、前記アニーリングは、７５℃で２乃至７分間、例えば２、３、４、５、６、又は７分、好ましくは３分で実施される。
【0161】
（追加又は代替の）好ましい一実施形態では、工程（ｉｉｂ）において逆転写酵素（ＲＴ）を使用することによるライゲーション産物の逆転写が、４０℃乃至６５℃、例えば４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４，又は６５℃、好ましくは５０℃、５５℃、５８℃、又は６２℃で、１０乃至４０分間、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０分間、好ましくは１５分又は３０分間で、及び続いて、７５℃乃至９０℃で、例えば７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０℃で、好ましくは８５℃で、２乃至４分間、例えば２、３、又は４分、好ましくは３分、又は６０℃乃至７５℃、例えば６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５℃で、好ましくは６８℃で、１０乃至３０分間、例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０分、好ましくは１５分で実施される。
【0162】
特に、逆転写酵素（ＲＴ）は、マキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼである。
【0163】
例えば、逆転写酵素（ＲＴ）がマキシマＨ－ＲＴである場合、前記逆転写は５５℃で３０分間、続いて８５℃で３分間実施される。
【0164】
又は、前記逆転写は、５０℃、５８℃、又は６２℃で１５分間、続いて８５℃で３分間実施される。
【0165】
例えば、逆転写酵素（ＲＴ）がＴｔｈポリメラーゼである場合、前記逆転写は６８℃で１５分間実施される。
【0166】
逆転写反応では、標的ＲＮＡの３’末端にライゲーションされた３’アダプターが、特に５’から３’方向に伸長され、標的ＲＮＡに逆相補的な鎖を形成する。特に、ライゲーション産物のｃＤＮＡコピーが逆転写反応で生成される。このプロセスでは、逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＴプライマーが必要である。ＲＴ－プライマーは、特に、３’アダプター
のループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列に逆相補的である。したがって、ＲＴ－プライマー配列は、３’アダプター配列に依存する。
のループ及び二本鎖ステムを含むステムループ構造を形成できるヌクレオチド配列に逆相補的である。したがって、ＲＴ－プライマー配列は、３’アダプター配列に依存する。
【0167】
１つの特定の実施形態では、ＲＴプライマーは、５’から３’の以下の配列：ＣＴＣＡＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴ（配列番号：３）
を有するか、又はその配列のバリアントである。したがって、ＲＴ－プライマーは、上記のように、３’アダプター配列の少なくとも一部に逆相補的である。特に、ＲＴ－プライマーは、３’位の第２ステム配列及びループ配列中のヌクレオチドに逆相補的である。上述のように、３’アダプター配列は、好ましくは、以下の５’から３’：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端のヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、（６－１５ｘ）Ｎは標的ＤＮＡの３’末端に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は、３’反転デオキシヌクレオチドを表す）である。具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
を有するか、又はその配列のバリアントである。したがって、ＲＴ－プライマーは、上記のように、３’アダプター配列の少なくとも一部に逆相補的である。特に、ＲＴ－プライマーは、３’位の第２ステム配列及びループ配列中のヌクレオチドに逆相補的である。上述のように、３’アダプター配列は、好ましくは、以下の５’から３’：
【化15】
【0168】
ＲＴ－プライマーバリアントは、配列番号：３による配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。そのようなＲＴ－プライマーバリアントは、依然として３’アダプター配列に結合でき、逆転写酵素（ＲＴ）、例えばマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼによって行われる逆転写を可能にする。当業者は、ＲＴプライマーバリアントが依然として３’アダプター配列に結合でき、及び逆転写を可能にできるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0169】
標的ＲＮＡをアッセイするために、そのｃＤＮＡは増幅される必要がある（上記方法の工程（ｉｉｉ）を参照）。サンプル中の標的ＲＮＡの量又はコピーが決定され得るように、アッセイは定量的であり得る。あるいは、標的ＲＮＡの存在がサンプル中で決定され得るように、アッセイは定性的であり得るが、そのレベルは測定され得ない。したがって、アッセイは、サンプル中の標的ＲＮＡの決定と定量化を可能にする。
【0170】
さらなる（追加又は代替の）好ましい一実施形態では、この方法は、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）との間に、ｃＤＮＡ前増幅の工程をさらに含む。前増幅反応は「単純な」ＰＣＲ反応であり、通常は「単純な」ＰＣＲ装置で行われ、たとえば、蛍光シグナルは検出されず、ＴａｑＭａｎプローブは使用されない。典型的には、低いサイクル数が使用される。
【0171】
前増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼが必要である。ｃＤＮＡの前増幅の工程は、アッセイの感度が増加するという目的に役立つ。特定の一実施形態では、前記ｃＤＮＡ前増幅は、５’から３’の以下の配列：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）を有するフォワードプライマー、又はこの配列のバリアントを用いて、及び５’から３’の以下の配列：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号：５）を有するリバースプライマー又はこの配列のバリアントを用いて実施される。フォワードプライマーは５’アダプターに由来するが、リバースプライマーは３’アダプターに由来する。これらのプライマー設計は、ライゲーション産物のみを前増幅するために、５’及び３’アダプターの両方のライゲーションに完全に依存する前増幅を提供する。
【0172】
この点において、５’から３’の以下の配列：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号：５）を有するリバースプライマーが、上記のように３’アダプター配列の少なくとも１部に逆相補的であることに留意すべきである。特に、リバースプライマーは、３’位の第２ステム配列及びループ配列のヌクレオチドに逆相補的である。上述したように、３’アダプター配列は、好ましくは、以下の５’から３’：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は、５’末端のヌクレオチドがリン酸化されていることを表し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、（６－１５ｘ）Ｎは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）である。具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。
【化16】
【0173】
さらに、５’から３’の以下の配列：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）を有するフォワードプライマーが、代わりに逆転写反応における５’アダプターから生成されるＤＮＡ産物に逆相補的であることに留意するべきである。上記のように、５’アダプター配列は、好ましくは、以下の５’から３’：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である）である。具体的に、ＬＮＡ強化ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。あるいは、５’アダプター配列は、以下の５’から３’：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、下線部分の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１つ又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である。）である。
【化17】
【化18】
【0174】
任意の前増幅法を使用し得る。好ましい一実施形態では、前増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施される。ＰＣＲを用いた前増幅は、以下の様に実施され得る：９５℃で３分間、続いて９５℃で１５秒間及び５８℃で４分間を１２サイクル。続いて、前増幅サンプルを４℃で保持する。
【0175】
前増幅に続いて、又は前増幅の代わりに、増幅反応が実施される。増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼが必要である。
【0176】
特定の一実施形態では、増幅反応は、５’から３’の以下の配列：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）又はこの配列のバリアントを有するフォワードプライマー、及び５’から３’の以下の配列：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号：５）又はこの配列のバリアントを有するリバースプライマーを用いて実施される（上記参照）。
【0177】
任意の増幅方法が使用される。
【0178】
具体的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施される。
【0179】
より具体的には、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）、好ましくはＴａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイフィデリティＰＲ、高速ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、及びＧＣリッチＰＣＲからなる群から選択される。
【0180】
さらにより具体的には、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲは、５’から３’の以下の配列：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）を有するフォワードプライマー、又はこの配列のバリアントを用いて、及び、５’から３’の以下の配列：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号５）を有するリバースプライマー、又はこの配列のバリアントを用いて実施される。フォワードプライマーは、５’アダプターに由来するが、リバースプライマーは、３’アダプターに由来する。これらのプライマー設計は、ライゲーション産物のみを増幅するための、５’及び３’アダプターの両方のライゲーションに完全に依存する増幅を提供する。Ｔａｑ－ｍａｎ ｑＰＣＲを使用する増幅は、以下のように実施され得る：９５℃で２０秒間、続いて９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間を４０サイクル。その後、増幅サンプルは４℃で保持される。
【0181】
さらにより具体的には、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブの存在下で実施される。ＴａｑＭａｎプローブの配列は、ＲＮＡ標的の配列に依存する。ＴａｑＭａｎプローブは、定量的ＰＣＲの特異性を高めるように設計された加水分解プローブである。一般に、ＴａｑＭａｎプローブの原理は、Ｔａｑポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性に依存して、相補的な標的配列へのハイブリダイゼーション及び蛍光色素分子ベースの検出中に二重標識プローブを切断する。他の定量的ＰＣＲ法と同様に、得られた蛍光シグナルは、ＰＣＲの指数関数的段階における生成物の蓄積の定量的測定を可能にする。しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブは、検出の特異性を大幅に向上させる。
【0182】
上記のようなフォワードプライマーバリアントは、配列番号：４による配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。このようなフォワードプライマーバリアントは、依然として逆転写反応で５’アダプターから生成されたＤＮＡ産物に結合できる。言い換えれば、フォワードプライマーバリアントは、少なくとも部分的に、例えば少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドの長さにわたって、５’アダプターと同じ配列を有する必要がある。特に、配列は、５’アダプターのループ領域及び３’位の第２番ステム配列において、例えば少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドの長さにわたって、同一である。当業者は、フォワードプライマーバリアントが、逆転写反応において５’アダプターから生成されたＤＮＡ産物を依然として結合できるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実施例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0183】
さらに、上記のようなリバースプライマーバリアントは、配列番号：５による配列と、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、さらにいっそうより好ましくは９９％、例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有している配列を有する。このようなリバースプライマーバリアントは、依然として３’アダプター配列に結合することができ、ｃＤＮＡの前増幅／増幅を可能にする。当業者は、リバースプライマーバリアントが、依然として３’アダ
プター配列に結合でき、ｃＤＮＡの前増幅／増幅を可能にすることができるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実験例の項は、この点で十分な情報を提供する。
プター配列に結合でき、ｃＤＮＡの前増幅／増幅を可能にすることができるかどうかを容易に評価することができる。たとえば、実験例の項は、この点で十分な情報を提供する。
【0184】
本発明の第４及び／又は第５の態様による方法では、サンプルは好ましくは生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、生物学的起源を有する任意のサンプルであり得る。例えば、生物学的サンプルは、体液サンプル、例えば血液サンプル又は尿サンプル、又は組織サンプル、例えば組織生検サンプルであり得る。生物学的サンプルは、混合又はプールされ得、例えばサンプルは、血液サンプル及び尿サンプルの混合物であり得る。
【0185】
体液サンプルは、成分を含む、尿サンプル、血液サンプル、喀痰サンプル、母乳サンプル、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ、ｅａｒｗａｘ）サンプル、胃液サンプル、粘液サンプル、リンパサンプル、内リンパ液サンプル、外リンパ液サンプル、腹水サンプル、胸水サンプル、唾液サンプル、皮脂（皮脂）サンプル、精液サンプル、汗サンプル、涙液サンプル、口腔スワブ、膣分泌物サンプル、リキッドバイオプシー、もしくは嘔吐サンプル、又はその画分であり得る。用語「体液サンプル」は、体液画分、例えば血液画分、尿画分又は喀痰画分も包含する。体液サンプルは、混合又はプールされ得る。したがって、体液サンプルは、血液及び尿のサンプルの混合物、又は血液及び脳脊髄液のサンプルの混合物であり得る。
【0186】
より好ましくは、生物学的サンプルは、血液サンプルである。さらにより好ましくは、血液サンプルは、全血又は血液画分、好ましくは血球（例えば、赤血球、白血球、及び／又は血小板）、血清、又は血漿である。例えば、血球画分は、赤血球、白血球、及び／又は血小板を包含する。全血サンプルは、採血管によって採取され得る。たとえば、ＰＡＸｇｅｎｅＲＮＡ採血管、Ｔｅｍｐｕｓ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡチューブ、ＥＤＴＡチューブ、クエン酸ナトリウムチューブ、ヘパリンチューブ、又はＡＣＤ－チューブ（クエン酸デキストロース）に収集される。全血サンプルはまた、血液スポット技術、例えばＭｉｔｒａ マイクロサンプリングデバイスを使用、によって収集され得る。この技術は、少量のサンプル量、典型的には人の場合は４５乃至６０μＬ又はそれ以下を必要とする。例えば、全血は、針又はランセットで指を刺して患者から抽出することができる。したがって、全血サンプルは、血液滴の形態を有し得る。次いで、前記血液滴は、吸収性プローブ、例えば全血を吸収できるセルロースなどの親水性ポリマー材料の上に置かれる。サンプリングが完了すると、処理のためにラボに転送又は郵送される前に、血液滴は空気中で乾燥される。血液は乾燥しているため、危険とは見なされない。そのため、取り扱いや輸送の際に特別な留意を払う必要はない。分析サイトに到着したら、目的の成分、たとえばｍｉＲＮＡは、乾燥した血液滴から上清に抽出され、次いでさらに分析される。
【0187】
本発明の第４及び／又は第５の態様による方法では、サンプルは、全ＲＮＡを含むサンプルでもあり得る。 特に、全ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）などの＜２００ヌクレオチド長を有するＲＮＡを含む。具体的には、本発明の第４及び／又は第５の態様による方法で使用されるサンプルは、細胞の全ＲＮＡを含む。 特に、細胞の全ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）などの＜２００ヌクレオチド長を有するＲＮＡを含む。細胞の全ＲＮＡは、血液細胞、例えば赤血球、白血球、及び／又は血小板から得られ得る。
【0188】
第６の態様では、本発明は、
（ｉａ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡの存在又は非存在を決定する工程、及び
（ｉｉａ）標的ＲＮＡの存在又は非存在に基いて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、又は
（ｉｂ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡを定量化
する工程、
（ｉｉｂ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉｂ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
（ｉａ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡの存在又は非存在を決定する工程、及び
（ｉｉａ）標的ＲＮＡの存在又は非存在に基いて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、又は
（ｉｂ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡを定量化
する工程、
（ｉｉｂ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉｂ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
【0189】
したがって、本発明は、
（ｉ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡの存在又は非存在を決定する工程、及び
（ｉｉ）標的ＲＮＡの存在又は非存在に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する
（ｉ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡの存在又は非存在を決定する工程、及び
（ｉｉ）標的ＲＮＡの存在又は非存在に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、
を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する
【0190】
したがって、標的ＲＮＡの存在又は非存在は、疾患又は症状を示す。例えば、標的ＲＮＡが存在又は非存在である場合、患者は疾患又は症状を患っていると診断される。あるいは、標的ＲＮＡが存在又は非存在の場合、患者は疾患又は症状に影響されていないと診断される。
【0191】
あるいは、本発明は、
（ｉ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡを定量化する工程、
（ｉｉ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
（ｉ）第４及び／又は第５の態様による方法を実施し、それにより標的ＲＮＡを定量化する工程、
（ｉｉ）定量化された標的ＲＮＡを参照と比較する工程、及び
（ｉｉｉ）比較に基づいて、患者が疾患又は症状を患っているかどうかを診断する工程、を含む、患者の疾患又は症状を診断する方法に関する。
【0192】
特に、参照は参照標的ＲＮＡである。より特別には、参照は、１人又は複数の健康な（対照）被験者から得られた参照である。さらにより特別には、参照は、１人又は複数の健康な（対照）対象において決定された定量化された参照標的ＲＮＡである。２人以上の健康な（対照）被験者が検査されている場合、参照標的ＲＮＡの量は平均値として示される場合がある。例えば、定量化された標的ＲＮＡが、例えば、１人又は複数の健康な（対照）被験者から得られる、定量化された参照標的ＲＮＡより上又は下にある場合、患者は疾患又は症状を患っていると診断される。あるいは、定量化された標的ＲＮＡが、例えば１人又は複数の健康な（対照）被験者から得られた、定量化された参照標的ＲＮＡより上又は下にある場合、患者は、疾患又は症状に患わっていないと診断される。参照はまた、疾患又は症状を患っている１人又は複数の（対照）被験者から得られた参照であってもよい。
【0193】
好ましい一実施形態では、定量化された標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。別の好ましい一実施形態では、定量化された参照標的ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲ）である。具体的には、標的ＲＮＡ及び参照標的ＲＮＡは同一であり、即ち同じＲＮＡ型（例えば、両ＲＮＡはｍｉＲＮＡである）と同一である。
【0194】
（追加又は代替の）好ましい一実施形態では、疾患は、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染症、及び癌からなる群から選択される。より好ましい一実施形態では、
（ｉ）神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びその他の認知症、パーキンソン病（ＰＤ）及びＰＤ関連疾患、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、エイズ認知症複合体、及びアテローム性動脈硬化からなる群から選択され、
（ｉｉ）自己免疫疾患は、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身
性エリテマトーデス（狼瘡）、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、及びセリアック病からなる群から選択され、
（ｉｉｉ）感染症は、ウイルス感染、好ましくは慢性又は持続性のウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染以下からなる群から選択され、又は
（ｉｖ）癌は、皮膚ガン、上咽頭がん、神経内分泌がん、肺癌、大腸がん、尿路上皮がん、膀胱がん、肝臓がん、卵巣がん、胃癌、食道がん、膵臓癌、腎臓がん、胃癌、食道がん、乳癌、腎がん、頭頸部がん、脳腫瘍、リンパがん、血液がん、扁平上皮がん、喉頭がん、網膜がん、前立腺がん、子宮頸癌、子宮がん、精巣がん、骨がん、リンパ腫、及び白血病からなる群から選択される。
（ｉ）神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）及びその他の認知症、パーキンソン病（ＰＤ）及びＰＤ関連疾患、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、エイズ認知症複合体、及びアテローム性動脈硬化からなる群から選択され、
（ｉｉ）自己免疫疾患は、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身
性エリテマトーデス（狼瘡）、バセドウ病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血、及びセリアック病からなる群から選択され、
（ｉｉｉ）感染症は、ウイルス感染、好ましくは慢性又は持続性のウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染以下からなる群から選択され、又は
（ｉｖ）癌は、皮膚ガン、上咽頭がん、神経内分泌がん、肺癌、大腸がん、尿路上皮がん、膀胱がん、肝臓がん、卵巣がん、胃癌、食道がん、膵臓癌、腎臓がん、胃癌、食道がん、乳癌、腎がん、頭頸部がん、脳腫瘍、リンパがん、血液がん、扁平上皮がん、喉頭がん、網膜がん、前立腺がん、子宮頸癌、子宮がん、精巣がん、骨がん、リンパ腫、及び白血病からなる群から選択される。
【0195】
第７の態様では、本発明は、第１の態様による５’アダプター、及び第２の態様による３’アダプター、又は第３の態様による組み合わせを含むキットに関する。
【0196】
好ましい一実施形態では、キットは、二本鎖ＲＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｒｎｌ２）又はＫｏｄ１リガーゼをさらに含む。この場合、キットは、好ましくは、第４の態様による方法をどのように実施するかについての説明書をさらに含む。この組成物を有するキットは、好ましくは、第４の態様による方法をさらに実施することを可能にする。
【0197】
好ましい（追加又は代替の）一実施形態では、キットは、逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得るために標的ＲＮＡの逆転写を可能にするＲＴプライマー、及び／又はＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及びｃＤＮＡの前増幅及び／又は増幅を可能にするフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーを、さらに含む。
【0198】
この場合、キットは、好ましくは、第５の態様による方法をどのように実施するかについての説明書をさらに含む。この組成物を有するキットは、好ましくは、第５の態様による方法をさらに実施することを可能にする。
【0199】
所望により、キットは、ＴａｑＭａｎプローブをさらに含む。
【0200】
特定のＲＴ、フォワード及び／又はリバースプライマーに関しては、本発明の第５の態様が参照される。
【0201】
さらなる（追加又は代替の）好ましい一実施形態では、キットは参照をさらに含む。この場合、キットは、好ましくは、第６の態様による方法をどのように実施するかについての説明書をさらに含む。この組成物を有するキットは、好ましくはさらに、第６の態様による方法を実施することを可能にする。
【0202】
参照に関しては、本発明の第６の態様が参照される。
【0203】
上記を考慮して、キットは、より好ましい一実施形態において、以下の成分を含む：
（ｉ）第１の態様による５’アダプター及び第２の態様による３’アダプター又は第３の態様による組み合わせ、
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得るために標的ＲＮＡの逆転写を可能にするＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及びｃＤＮＡの前増幅及び／又は増幅を可能にするフォワードプライマー及び／又はリバースプライマー。
（ｉ）第１の態様による５’アダプター及び第２の態様による３’アダプター又は第３の態様による組み合わせ、
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び標的ＲＮＡからｃＤＮＡ産物を得るために標的ＲＮＡの逆転写を可能にするＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及びｃＤＮＡの前増幅及び／又は増幅を可能にするフォワードプライマー及び／又はリバースプライマー。
【0204】
所望により、キットは、ＴａｑＭａｎプローブをさらに含む。
【0205】
キットは、さらにより好ましい一実施形態では、以下の成分を含む：
（ｉ）５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、及び５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す）又はこの配列のバリアントを有する３’アダプター、
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び配列番号：３による配列又はこの配列のバリアントを有するＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及び配列番号：４による配列又はこの配列のバリアントを有するフォワードプライマー及び／又は配列番号：５による配列を又はこの配列のバリアントを有するリバースプライマー。
（ｉ）５’から３’の以下の配列：
【化19】
【化20】
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び配列番号：３による配列又はこの配列のバリアントを有するＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及び配列番号：４による配列又はこの配列のバリアントを有するフォワードプライマー及び／又は配列番号：５による配列を又はこの配列のバリアントを有するリバースプライマー。
【0206】
所望により、キットは、ＴａｑＭａｎプローブをさらに含む。
【0207】
あるいは、上記の５’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、下線部の１つ又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１つ又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプターにより置き換えられる。
【化21】
【0208】
さらにより好ましい一実施形態では、キットは、以下の成分を含む：
（ｉ）５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、太字のヌクレオチドの１つ又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）がＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプター、及び５’から３’の以下の配列：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１個、２個、又は３個）はＬＮＡ強化で
あり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプター
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び配列番号：３による配列又はこの配列のバリアントを有するＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及び配列番号：４による配列又はこの配列のバリアントを有するフォワードプライマー及び／又は配列番号：５による配列又はこの配列のバリアントを有するリバースプライマー。
（ｉ）５’から３’の以下の配列：
【化22】
【化23】
あり、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を示し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）、又はこの配列のバリアントを有する３’アダプター
（ｉｉ）逆転写酵素（ＲＴ）、好ましくはマキシマＨ－ＲＴ又はＴｔｈポリメラーゼ、及び配列番号：３による配列又はこの配列のバリアントを有するＲＴプライマー、及び／又は
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴａｑポリメラーゼ、及び配列番号：４による配列又はこの配列のバリアントを有するフォワードプライマー及び／又は配列番号：５による配列又はこの配列のバリアントを有するリバースプライマー。
【0209】
所望により、キットは、ＴａｑＭａｎプローブをさらに含む。
【0210】
あるいは、上記の５’アダプターは、５’から３’の以下の配列：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、「ｉｄＳｐ」は塩基欠失スペーサーを表し、太字のヌクレオチドの１個又は複数（例えば、１、２、又は３個）はＬＮＡ強化である。）、又はこの配列のバリアントを有する５’アダプターに置き換えられる。
【化24】
【0211】
上記の特定のバリアントに関しては、本発明の第１、第２、第４及び第５の態様が参照される。
【0212】
キットは、
（ｉ）キットの様々な成分用の１つ又は複数の容器、及び／又は
（ｉｉ）データキャリア
をさらに含み得る。
（ｉ）キットの様々な成分用の１つ又は複数の容器、及び／又は
（ｉｉ）データキャリア
をさらに含み得る。
【0213】
前記データキャリアは、例えば情報リーフレットなどのグラフィックデータキャリア、情報シート、バーコード若しくはアクセスコードなどの非電子データキャリア、又は例えばフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップ若しくは別の半導体ベースの電子データキャリアなどの電子データキャリアであり得る。アクセスコードは、例えばインターネット データベース、集中型、または分散型データベースなどのデータベースへのアクセスを許可し得る。アクセスコードもまた、コンピューターにコンピューターユーザーのタスクを実行させるアプリケーションソフトウェア、又はスマートフォン及び他のモバイルデバイスで実行するために設計されたソフトウェアであるモバイルアプリにアクセスを許可し得る。
【0214】
前記データキャリアは、第６の態様の文脈で説明した参照をさらに含み得る。
【0215】
データキャリアがデータベースへのアクセスを可能にするアクセスコードを含む場合、前記参照はこのデータベースに保管される。さらに、データキャリアが、本発明の第４乃至第６の態様の方法をどのように実施するかについての情報又は指示を含み得る。
【0216】
前記キットはまた、本発明の第４乃至第６の態様の方法を実施することを可能にし得る、緩衝剤、試薬及び／又は希釈剤を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい材料を含み得る。具体的に、キットはまた、標的ＲＮＡへの２つのアダプターのアニーリング及びライゲーションを実施するための緩衝液及び成分、標的ＲＮＡの逆転写を実施するための緩衝液及び成分、及び／又は標的ＲＮＡの前増幅及び／又は増幅を実施するための緩衝液
及び成分を含み得る。
及び成分を含み得る。
【0217】
当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の様々な修正及び変形が明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、関連分野の当業者にとって自明である、本発明を実施するための説明された方法の様々な変更は、本発明によってカバーされることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【0218】
以下の図は、本発明を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない。
【0219】
【化25】
【化26】
【化27】
［図２］ 図２は、ｍｉＲ－１００－５ｐの８つのバリアントのテストベッドでの商用アッセイ及びＤＢ ＰＣＲアッセイの結果である。列には使用されたＲＮＡテンプレートがリストされ、行にはそれぞれのアッセイである。描かれている数値は、ＡＢＩ Ｆｌｅｘ６ ｑＰＣＲ装置によって提供されるＣｔ値である。より低いＣｔ値は、より多くのＲＮＡがサンプルで検出されたことを表す。緑色のハイライトは、シグナルが予想されるだけの場所であることを示す。Ａ．ＬＮＡベースのプライマー商用アッセイは、６０ａｍｏｌ（アトモル）のＲＮＡテンプレートで試験された。Ｂ．ステムループプライマーベースの商用アッセイは６０ａｍｏｌのＲＮＡテンプレートで試験された。Ｃ．プライマー－プローブハイブリッドに基づく商用アッセイは、２ｐｍｏｌのＲＮＡテンプレートで試験された。Ｄ．前増幅工程無のＤＢ－ＰＣＲアッセイは、１０ｆｍｏｌのＲＮＡテンプレートでテストされた。
［図３］ 図３は、図２に示すのと同様に行われたが、
６０ａｍｏｌのＲＮＡテンプレートの上で、７サイクルの前増幅で行った、ＤＢ ＰＣＲアッセイ実験の結果である。
［図４］ 図４は、図１及び図２で示された分析のために使用される、標的ＲＮＡ ｍｉＲ－１００－５ｐ及び標的ＲＮＡ ｍｉＲ－１００－５ｐのバリアントの配列である
［図５］ 図５は、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡサンプルにおける、内在性ｍｉＲ－１００－５ｐ ｗｔ（Ａ．）及び３’欠失（Ｂ．）の検出である。反応に追加されたＲＮＡサンプ
ルの量、及び７サイクルの前増幅を有するＤＢ ＰＣＲの得られたＣｔ値が示されている。
［図６］ 図６は、５’及び３’アダプター、逆転写（ＲＴ）プライマー、フォワード及びリバースプライマー、及び実験セットアップで様々なｍｉＲＮＡに使用されるＴａｑＭａｎプローブの概要である。
［図７］ 図７は、ｍｉＲＮＡバリアント、５’アダプター、３’アダプター、及びＴａｑＭａｎプローブの特定の組み合わせである。
【実施例】
【0220】
以下に示す実施例は、例示のみを目的としており、上記の発明を決して限定するものではない。
【0221】
１．材料と方法
まず、必要なステムループ様構造が形成されるように、アダプターは変性及び再生される。ＲＮＡは別々に変性され、アダプターと混合され、Ｒｎｌ２によるライゲーションに使用される。次いで、３’アダプターに整列するＲＴプライマーは、ｃＤＮＡ産生のために使用される。ｃＤＮＡは、前増幅され（例えば、Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅ－ａｍｐ Ｍｉｘを使用）、その後第１鎖のｃＤＮＡの５’末端に整列するリバースプライマー及び第１鎖のｃＤＮＡの３’末端に相補的なフォワードプライマーを用いるｑＰＣＲに使用される。最後に、ＴａｑＭａｎプローブが、ｑＰＣＲで特定のシグナルの検出のために使用される。
まず、必要なステムループ様構造が形成されるように、アダプターは変性及び再生される。ＲＮＡは別々に変性され、アダプターと混合され、Ｒｎｌ２によるライゲーションに使用される。次いで、３’アダプターに整列するＲＴプライマーは、ｃＤＮＡ産生のために使用される。ｃＤＮＡは、前増幅され（例えば、Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅ－ａｍｐ Ｍｉｘを使用）、その後第１鎖のｃＤＮＡの５’末端に整列するリバースプライマー及び第１鎖のｃＤＮＡの３’末端に相補的なフォワードプライマーを用いるｑＰＣＲに使用される。最後に、ＴａｑＭａｎプローブが、ｑＰＣＲで特定のシグナルの検出のために使用される。
【0222】
例示的な５’アダプター（配列番号：６）及び例示的な３’アダプター（配列番号：７）を図１に示す。これらのアダプターは、ｍｉＲ－１００－５ｐ（配列番号：８）を標的とする。
【0223】
プロトコルの詳細：
アダプター、プライマー、及びプローブは、ｍｉＲ－１００－５ｐ及びそのバリアント（図３に記載）を認識でき且つ特異的になるように設計されている。合成ｍｉＲは５’リン酸化型で注文された。アダプター、プローブ、及びプライマーの完全なリストは図６に示される。すべてのオリゴは乾燥状態で注文された。
アダプター、プライマー、及びプローブは、ｍｉＲ－１００－５ｐ及びそのバリアント（図３に記載）を認識でき且つ特異的になるように設計されている。合成ｍｉＲは５’リン酸化型で注文された。アダプター、プローブ、及びプライマーの完全なリストは図６に示される。すべてのオリゴは乾燥状態で注文された。
【0224】
すべてのオリゴは、ヌクレアーゼフリーの水で、１００μＭの濃度に希釈し、－２０℃の暗所で保存した。次に、アダプターを以下のように準備した：
【表1】
【0225】
次に、ＲＮＡを変性により調製した。等モルプールで、ＰＡＸｇｅｎｅ全ＲＮＡの示された量を使用するか、又は合成ｍｉＲ－１００－５ｐ ｗｔ及びバリアントの示された量を使用した。ＲＮＡを７０℃で２分間変性させ、すぐに氷上に置いた。
【0226】
次に、以下の成分を用いてライゲーション反応を調製した。反応物をよく混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。
【表2】
【0227】
次に、以下のプロトコルに示すように、ライゲーションされたＲＮＡを、ＲＴプライマーを使用した逆転写反応に使用した。
【表3】
【0228】
逆転写後、ｃＤＮＡを市販の前増幅マスターミックス（バイオラッド社）を用いた前増幅反応に使用した。その後、前増幅ｃＤＮＡを希釈し、－２０℃で保存した。
【表4】
【0229】
最後に、希釈したｃＤＮＡを使用するｑＰＣＲアッセイを、Ｔａｑｍａｎプローブを含み、使用した。反応は、３８４ウェル形式で、ＡＢＩ Ｆｌｅｘ ６マシンで実行した。
【表5】
【0230】
２．結果
オリジナルのＤＢ ＰＣＲプロトコルを、ライゲーションの面で改善した。その後、図２に示すように、それは利用可能な主要な商用アッセイとの比較に使用された。「改善されたダンベル（ＤＢ）ＰＣＲ」プロトコルが、他のアッセイと比較して優れた特異性を有していることが明確に示された。プロトコルは、「高度なＤＢ ＰＣＲ」を作成するための前増幅工程でさらに最適化された。このようにして、特異性を失うことなく、高感度を達成することができた（図３）。
オリジナルのＤＢ ＰＣＲプロトコルを、ライゲーションの面で改善した。その後、図２に示すように、それは利用可能な主要な商用アッセイとの比較に使用された。「改善されたダンベル（ＤＢ）ＰＣＲ」プロトコルが、他のアッセイと比較して優れた特異性を有していることが明確に示された。プロトコルは、「高度なＤＢ ＰＣＲ」を作成するための前増幅工程でさらに最適化された。このようにして、特異性を失うことなく、高感度を達成することができた（図３）。
【0231】
このアッセイは、臨床サンプル、例えばＰＡＸｇｅｎｅ全血ＲＮＡサンプルなどのＲＮＡの生物学的ソースに使用できることに留意することが重要である。オリジナルのＤＢ ＰＣＲプロトコルは、ヒトＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡサンプル中のｍｉＲ－１００－５ｐを検出できない（データは示していない）。高度なＤＢ ＰＣＲプロトコルは、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡサンプル中のｍｉＲ－１００－５ｐを検出でき（図５）、ｗｔ又は標準形式のｍｉＲ－１００－５ｐ及び３’欠失バリアントを検出できる。
【0232】
【0233】
３．アダプター及びプライマーの配列（５’－＞３’方向）
５’から３’の５’アダプター：
（ここで、「ｒ」はリボヌクレオチドを表し、「（６－１５ｘ）Ｎ」は標的ＲＮＡの５’末端配列に逆相補的な配列を示し、下線部の１個又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部の１個又は複数のヌクレオチドがＬＮＡ強化である。）。ｍｉＲ－１００－５ｐを標的とする例示的な５’アダプターは、配列番号：６によるヌクレオチド配列を有する。
５’から３’の５’アダプター：
【化28】
【0234】
５’から３’の３’アダプター：
（ここで、「／５Ｐｈｏｓ／」は、５’末端ヌクレオチドがリン酸化されていることを示し、下線部分の１個又は複数のヌクレオチド及び／又は二重下線部分の１個又は複数のヌクレオチドはＬＮＡ強化であり、（６－１５ｘ）Ｎは標的ＲＮＡの３’末端配列に逆相補的な配列を指定し、「／３ＩｎｖｄＴ／」は３’反転デオキシヌクレオチドを表す。）。
ｍｉＲ－１００－５ｐを標的とする例示的な３’アダプターは、配列番号：７によるヌクレオチド配列を有する。
【化29】
ｍｉＲ－１００－５ｐを標的とする例示的な３’アダプターは、配列番号：７によるヌクレオチド配列を有する。
【0235】
５’から３’のＲＴプライマー：ＣＴＣＡＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴ（配列番号：３）
５’から３’のフォワードプライマー：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）
５’から３’のリバースプライマー：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号：５）
５’から３’のフォワードプライマー：ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号：４）
５’から３’のリバースプライマー：ＧＴＧＣＧＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＡＣＣ（配列番号：５）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】