特許 7500100 バイポラリス・ヤマダイ菌株、そのスクリーニング・同定方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-07

(45)【発行日】2024-06-17

(54)【発明の名称】バイポラリス・ヤマダイ菌株、そのスクリーニング・同定方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A01N 63/30 20200101AFI20240610BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20240610BHJP

   A01P 13/00 20060101ALI20240610BHJP

【ＦＩ】

A01N63/30

C12N1/14 A ZNA

A01P13/00

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022562574

(86)(22)【出願日】2021-04-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-26

(86)【国際出願番号】 CN2021087342

(87)【国際公開番号】W WO2021208989

(87)【国際公開日】2021-10-21

【審査請求日】2022-12-13

(31)【優先権主張番号】202010303803.X

(32)【優先日】2020-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 17778

(73)【特許権者】

【識別番号】507255592

【氏名又は名称】南京▲農業▼大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】強 ▲勝▼

(72)【発明者】

【氏名】譚 敏

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】特開平０５－２８４９６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－２６９２９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００－２６９２９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７４１８９００（ＣＮ，Ａ）

【文献】Fungal Diversity，2019年，doi:10.1007/s13225-019-00434-5

【文献】Mycosphere，2017年，Vol.8 No.9，p.1555-1573

【文献】Acta phytopathologica sinica，2019年，Vol.49 No.5，p.711-714

【文献】日植病報，2016年，82，160-165

【文献】BioControl，2006年，vol.51，p.259-275

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

Ａ０１Ｎ ６３／３０

Ａ０１Ｐ １３／００

Ａ０１Ｍ ２１／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣＮｏ．１７７７８であるバイポラリス・ヤマダイ菌株の生物的除草剤としての使用であって、
濃度が１０ ^２ 個以上／１ｍｌの前記バイポラリス・ヤマダイ菌株の分生子を作物畑にある対象雑草に接種すること、
前記作物畑の作物はイネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬及び果樹のうちの少なくとも１種を含むこと、
前記作物が苗期にあるときに使用することにより、対象雑草の防除効果が７０％以上あること、
を特徴とする生物的除草剤としての使用。

【請求項2】

前記対象雑草はイネ科雑草、カヤツリグサ科雑草及び広葉雑草のうちの少なくとも１種を含み、前記イネ科雑草はイヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソ及び前記アシボソの近縁属植物のうちの少なくとも１種を含み、前記カヤツリグサ科雑草はタマガヤツリ、コシロガヤツリ及びクグガヤツリのうちの少なくとも１種を含み、前記広葉雑草はカナムグラ、クサネム、シロザ及びコアカザのうちの少なくとも１種を含む請求項１に記載の生物的除草剤としての使用。

【請求項3】

前記アシボソの近縁属植物はミクロステギウム・ノドサム、オオササガヤ、ササガヤ及びカリヤスのうちの少なくとも１種を含む請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記野菜はチンゲンサイ、ハクサイ、大根、ヘチマ、ナス及び唐辛子のうちの少なくとも１種を含み、前記生薬はエゴマ、アリタソウ及びコウライカキドオシのうちの少なくとも１種を含み、前記果樹はヤマモモを含む請求項３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は農業植物保護、農作物雑草防除用の微生物の技術分野に関し、具体的には、バイポラリス・ヤマダイ菌株Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ．） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ （ＨＸＤＣ－１－２）、そのスクリーニング・同定方法及びその使用に関する。

【0002】

本願は２０２０年４月１７日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２０１０３０３８０３Ｘ、出願の名称が「バイポラリス・ヤマダイ菌株、そのスクリーニング・同定方法及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全内容は引用により本願に組み込まれている。

【背景技術】

【0003】

草害は作物の減産を招く最も主要な要因の１つであり、世界の農業に年間９５０億ドルの損失をもたらしている。中国の農地の草害面積は約７８８０万ヘクタールで、毎年２３５億人民元の雑草防除費用を投入していても、食糧、綿、油の損失は１４６０万トンに達し、直接的な経済損失は千億人民元近くに達している。イヌビエ、カラスムギ、スズメノテッポウ、オニメヒシバ、アゼガヤ、メヒシバ、エノコログサ、アカザ、コナギは農地の１０種類の重要な害草であり、その中でイネ科のものが８０％を占めている。人間が農業生産活動を開始するようになって以来、防除を試みる努力は絶えず、１９５０年代の初期に、化学除草剤はその使いやすさ、効果の速さなどの特徴から急速に発展した。化学除草剤が広く使用されるに伴い、それによるマイナスの影響も日増しに明らかになってきた。化学除草剤の大量施用は環境汚染の危機をもたらしている。長期残効性除草剤の使用は残毒や薬害を引き起こした。これが次の作物の減産、さらには土地の劣化につながっている。世界では、すでに１００種類以上の化学除草剤が３０か国以上で使用不可になったり、登録が取り消されたりしている。また、薬剤耐性雑草個体群も出現している。

【0004】

生物的除草剤とは、人工制御下で人工培養・繁殖した大容量の生物製剤を使用して雑草を除去するものを指す。２つの顕著な特徴がある。一つは人工で大量培養することにより大量の生物接種物を得ることであり、もう一つは大量に適用して、迅速な感染を達成し、短時間で雑草を殺滅することである。１９８１年、ＤｅＶｉｎｅは米国で最初の生物的除草剤として登録された。ＤｅＶｉｎｅはアメリカのフロリダ州に生まれたフィトフトラ・パルミボラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｌｍｉｖｏｒａ）の病原菌株の厚膜胞子懸濁剤であり、雑草ストラングルヴァイン（Ｍｏｒｒｅｎｉａ ｏｄｏｒａｔａ）の防除に用いられ、防除効果は９０％に達し、残効期間は２年に達し、フロリダ州のミカン園に広く使用されている。その後、Ｃｏｌｌｅｇｏは登録され、実用化された。遺伝子工学と細胞融合技術の介入により、自然界に存在する優れた除草遺伝子（例えば強い病原性と毒素産生など）の組み換えが可能になり、生物的除草剤の品種を改良し、防除効果を高め、宿主の特異性を改良する可能性が提供された。現在商業化されている生物的除草剤には、８０年代に開発されたもの以外、９０年代末に発売されたＣａｍｐｅｒｉｃｏとＢｉｏｃｈｏｎがあり、これらの除草剤は対応する対象雑草を制御する上で重要な役割を果たし、場合によって唯一の選択肢でさえある。すでに研究されている候補の生物的防除用真菌は、次のようないくつかの属に比較的集中している。コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）１８種類、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）１３種類、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ） １２種類、サーコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）８種類、パカシニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、スクレロティニア属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、エンチロマ属（Ｅｎｔｙｌｏｍａ）、アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ）。現在、主にコレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ） （ＵＳ３，８４９，１０４とＵＳ３，９９９，９７３）；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ） （ＵＳ４，４１９，１２０）；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ） （ＵＳ４，３９０，３６０）；アスコキタ属（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｓｐｅｃｉｅｓ） （ＵＳ４，９１５，７２４）及びスクレロティニア属（Ｓｅｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ） （ＣＡＯＺ，２９２，２３３）；スクリアロウシィアム属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ） （ＳＣ６４）などが現在作物生産に用いられ、特許されている。現在、中国の国内や国外では、コクリオボラス属としてエノコログサコクリオボラス、トウモロコシコクリオボラス及びキビコクリオボラスを生物的除草剤として使用する特許があるが、バイポラリス・ヤマダイが出願されておらず、また、生物的防除のために作物畑にあるイネ科雑草、芝生雑草やアシボソ及びその近縁種にバイポラリス・ヤマダイを適用することも報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願で開示された各例示的な実施例の目的は、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの作物畑の雑草（イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソなどのイネ科雑草、タマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリなどの一年生ハマスゲ、及びカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザなどの広葉雑草を含む）に対して、バイポラリス・ヤマダイ菌株、そのスクリーニング・同定方法及びその使用を提供することである。該菌株は生物的除草に用いられ、除草効率が高く、環境にやさしく、残留がなく、コストが低く、汚染がなく、農作物に対して安全性が高く、除草効果が高いという利点がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本願は、バイポラリス・ヤマダイ菌株、そのスクリーニング・同定方法及びその使用を開示し、採用する技術的手段は以下の通りである。

【0007】

バイポラリス・ヤマダイ菌株であって、前記菌株はバイポラリス・ヤマダイ菌株ＨＸＤＣ－１－２であり、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７７７８である。

【0008】

一実施例では、前記菌株で形成されるコロニーは、直径範囲が５０～６０ｍｍであり、前記コロニーは、表面が灰黒色、裏面が黒褐色であり、水溶性色素を含まず、分生子柄を含み、オリーブ色又は黄褐色であり、単生又は少数群生し、先端の色が浅く、湾曲形状をしており、幅範囲が４．５～９．５μｍであり、
分生子をさらに含み、前記分生子は、黄褐色から濃褐色であり、紡錘形又は棒形をしており、また直線状や僅かな湾曲状であり、中央部がやや広く、両端がやや狭く、前記分生子の基底細胞は鈍い円形をしており、前記基底細胞は、表面が滑らかであり、６～９個の偽隔壁を持ち、表面の面積が５４．５～９２．５×１２．５～１７．５μｍである。

【0009】

本願で開示された各例示的な実施例は、
前記菌株を２８℃の暗いインキュベータに入れて４日間培養し、真菌ｇＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを抽出し、ｒＤＮＡ ＩＴＳ配列、ＧＰＤＨ配列及びＥＦ１α配列をそれぞれＰＣＲ増幅して産物を得て、前記ＰＣＲ増幅用のユニバーサルプライマーをそれぞれＩＴＳ４、ＩＴＳ５、ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＥＦ１－９８３Ｆ及びＥＦ１－２２１８Ｒとし、
ＩＴＳ４：５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’、
ＩＴＳ５：５’－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３’、
ＧＰＤ１：５’－ＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧ－３’、
ＧＰＤ２：５’－ＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＧＣ－３’、
ＥＦ１－９８３Ｆ：５’－ＧＣＹＣＣＹＧＧＨＣＡＹＣＧＴＧＡＹＴＴＹＡＴ－３’、及び
ＥＦ１－２２１８Ｒ：５’－ＡＴＧＡＣＡＣＣＲＡＣＲＧＣＲＡＣＲＧＴＹＴＧ－３’であるステップ１）と、
アガロースゲル電気泳動によってステップ１）で得られた前記ＰＣＲ増幅の前記産物を回収し、前記産物をｐＭＤ１９ベクターに連結して、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、次に、ブルー・ホワイトセレクションによって白色コロニーを選択し、振蕩培養して菌液を得るステップ２）と、
ステップ２）で得られた前記菌液をシーケンシングしてシーケンシング結果を取得し、前記シーケンシング結果をＧｅｎｂａｎｋにおいて核酸データベースのＩＴＳ、ＧＰＤＨ及びＥＦ１αの関連配列と相同性について比較するステップ３）と、
前記ＰＣＲ増幅、前記シーケンシング及び前記比較をした後、ＥＦ１α増幅配列がそれぞれＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株ＡＣＣＣ３６３３４、ＣＢＳ１２７０８７とは相同性が９９％以上であり、ＩＴＳ増幅配列がＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株ＣＰＣ２８８０７とは相同性が９９％以上であり、又はＧＰＤＨ増幅配列がＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株ＣＰＣ２８８０７とは相同性が９９ ％以上である場合、前記菌株がバイポラリス・ヤマダイ菌株であると判定するステップ４）と、を含むバイポラリス・ヤマダイ菌株のスクリーニング・同定方法を提供する。

【0010】

前記分子マーカーをプライマーとして検出してもよい。検出の結果、上記分子マーカー配列がＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株ＣＰＣ２８８０７とは相同性が９９％である場合、該菌株であると判定することができる。

【0011】

一実施例では、前記ＩＴＳ増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、前記ＧＰＤＨ増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、前記ＥＦ１α増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。しかし、本願の分子マーカーはこれらに限定されるものではない。

【0012】

バイポラリス・ヤマダイ菌株の生物的除草剤としての使用。

【0013】

バイポラリス・ヤマダイ菌株の生物的除草剤としての使用であって、濃度が１０^２個以上／１ｍｌの前記バイポラリス・ヤマダイ菌株の分生子を作物畑にある対象雑草に接種する。

【0014】

一実施例では、前記対象雑草は、イネ科雑草、カヤツリグサ科雑草及び広葉雑草のうちの少なくとも１種を含み、前記イネ科雑草は、イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソ及び前記アシボソの近縁属植物のうちの少なくとも１種を含む。前記カヤツリグサ科雑草はタマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリのうちの少なくとも１種を含んでもよい。前記広葉雑草はカナムグラ、クサネム、シロザ及びコアカザのうちの少なくとも１種を含んでもよい。しかし、本願では、雑草の種類はこれらに限定されるものではない。

【0015】

一実施例では、前記アシボソ近縁属植物はミクロステギウム・ノドサム（Ｍｉｃｒｏｓｔｅｇｉｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）、オオササガヤ、ササガヤ、カリヤスを含んでもよい。

【0016】

一実施例では、前記作物畑の作物は、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、花卉、生薬及び果樹のうちの少なくとも１種を含んでもよい。ただし、本願では、作物の種類はこれらに限定されるものではない。

【0017】

一実施例では、前記野菜は、チンゲンサイ、ハクサイ、大根、ヘチマ、ナス及び唐辛子のうちの少なくとも１種を含んでもよい。前記生薬はエゴマ、アリタソウ及びコウライカキドオシのうちの少なくとも１種を含んでもよい。前記果樹はヤマモモを含んでもよい。ただし、本願では、野菜、生薬及び果樹作物の種類はこれらに限定されるものではない。

【発明の効果】

【0018】

本願の各例示的な実施例は以下の利点及び有益な効果を有する。
１、バイポラリス・ヤマダイアシボソ分化型菌剤は、生物的除草に用いると、作物とイネ科雑草を安全に選別することができる。本願の除草剤は、環境にやさしく、雑草の薬剤耐性の発生や薬剤耐性の発展を抑制することができ、安全食品や有機農業の普及に有利であり、しかも、コストが低く、汚染がなく、農作物に対して安全である。試験対象とする３０科１０３種類の作物や経済植物のうち、３３種類はバイポラリス・ヤマダイに対して感受性であり、１５種類は僅かに感受性であり、５種類は非感受性であり、感受性のある植物のほとんどはイネ科であり、マメ科、アブラナ科、ゴマ科などのような他の科の植物、イネ科の一部などの植物は感受性が低い。このため、該菌株は、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの作物の畑に用いられて、イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソなどのイネ科雑草、タマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリなどの一年生ハマスゲ、及びカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザなどの広葉雑草のような農地雑草を防除することができる。
２、本願のバイポラリス・ヤマダイ菌株の生物的除草における使用は、生きている生物自体を利用してスクリーニング・同定を行うことであり、該生物は自然環境から直接収集して、対象作物畑及びこの環境に生えている対象雑草の天然病原菌である。この生物が環境に既存するものであるので、その使用によるエコリスクがない。さらに、該菌株は、特異性が強く、作物や対象以外の植物に対して安全性が高く、環境に残留することによる危害がない。前記菌株の菌体が死亡すると迅速に腐敗して分解し、しかも、分解産物が全てリサイクル可能な有機物であるので、汚染をもたらすことはない。このため、前記菌株は環境に対して安全であり、安全な農産物や有機農産物の生産に用いることができる。
３、該菌株は、特に苗期の植物体に対しては、対象雑草の防除効果が７０％以上、さらに８０％以上に達し得る。
４、試験した結果、バイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２はほとんどの作物に安全であり、綿、小麦や大麦に対しては低い感受性があり、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹の作物畑に安全に使用でき、上記畑の雑草（イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソなどのイネ科雑草、タマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリなどの一年生ハマスゲ、及びカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザなどのような広葉雑草を含む）を防除することができる。これによっても、バイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２はアシボソ及びイネ科雑草を防除し得る生物的除草剤であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＨＸＤＣ－１－２バイポラリス・ヤマダイ菌株のコロニーの形態図である。

【図2】ＨＸＤＣ－１－２バイポラリス・ヤマダイ菌株の分生子の形態である。

【図3】ＨＸＤＣ－１－２バイポラリス・ヤマダイ菌株のゲル電気泳動図であり、ここで１、２はＥＦ１α配列、３、４はＩＴＳ配列、５、６はＧＰＤＨ配列である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

上記したように、全世界で１８８種類の雑草の３２４個の生物型が１９種類の化学除草剤に耐性を持っていることが発見され、その結果、化学除草剤の薬効が低下し、使用量が増加し、コストも上昇し、さらに汚染が深刻化する。その結果、除草剤品種は単一になるため、薬剤耐性進化のリスクは上昇する。

【0021】

本発明者らは、以上の欠陥のため、市場では広域スペクトル、高効率、低毒性の新規除草剤の研究開発及び生物的除草を発展する技術的需要が向上することを発見した。そのため、環境にやさしい除草剤、特に化学除草剤の代わりに生物的除草剤を発展することはこの矛盾を解決する重要な手段である。さらに、新しい化学除草剤１種あたり１億ドルの開発コストに対し、生物的除草剤の開発コストは数十倍、さらには百倍も低い。世界の多くの国が実施している農業の持続可能な発展戦略はこの技術の発展を推進しており、そのため、生物的除草剤の研究開発はこれらのイネ科雑草に対抗する新しい手段となっている。しかし、現在、これらのイネ科雑草を対象とする有効な生物的除草剤は少ない。

【0022】

以下、図面及び実施例を参照して本願についてさらに詳細に説明する。

【0023】

バイポラリス・ヤマダイ菌株Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ （ＨＸＤＣ－１－２）（寄託機関：中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタ；住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号；寄託日：２０１９年５月１０日；寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７７７８）は、真菌界（Ｆｕｎｇｉ）、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ピレオスポラ亜綱（Ｐｌｅｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）、プレオスポラ目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ Ｌｕｔｔｒｅｌｌ ｅｘ Ｂａｒｒ）、プレオスポラ科（Ｐｌｅｓｐｏｒａｃｅａｅ Ｎｉｔｓｃｈｋｅ）、コクリオボラス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ）［無性段階：コクリオボラス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ Ｓｈｏｅｍａｒｋｅ）］のバイポラリス・ヤマダイ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）である。該菌株はジャガイモブドウ糖培地で迅速に成長し、２８℃の暗い条件で５日間培養すると、コロニーの直径が５０～６０ｍｍになり、このコロニーは灰黒色であり、裏面が黒褐色であり、水溶性色素を含まない。例えば、図１には、バイポラリス・ヤマダイ５日間培養後のコロニーの形態図が示されている。分生子柄はオリーブ色又は黄褐色であり、単生又は少数群生し、先端の色が浅く、ひざまずくように湾曲し、幅が４．５～９．５μｍである。分生子は黄褐色から濃褐色であり、略紡錘形又は逆棒形をしており、また、直線状や僅かな湾曲状であり、中央部がやや広く、両端がやや狭く、基底細胞は鈍い円形をしており、滑らかであり、６～９個（多くの場合７～８個）の偽隔壁を持ち、５４．５～９２．５×１２．５～１７．５μｍ（平均では６９．５×１４．７μｍ）である。図２はバイポラリス・ヤマダイの高倍率顕微鏡下の分生子の形態図である。

【実施例1】

【0024】

本願に係る新規菌株は、次の手段により得られるものであり、本発明者らは、中国の安徽省、福建省、広東省、広西省、貴州省、河南省、湖北省、湖南省、江蘇省、江西省、四川省、山東省、台湾、雲南省、チベットや浙江省などの省において、森林の縁部、草原、広野、湿地、作物畑の縁部、溝、生け垣、峡谷や農地のアシボソの発病状況を調査し、発病したアシボソの葉を採集し、植物体の発病症状と関連情報を記録し、実験室に持ち帰ってアシボソの寄生真菌を分離、研究し、厳密にコッホの原則（Ｋｏｃｈ'ｓ Ｐｏｓｔｕｌａｔｅ）に基づいて病原性を検証した。

【0025】

まず、バイポラリス・ヤマダイ菌株（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ．） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ） ＨＸＤＣ－１－２が自然条件で発生した胞子のアシボソにおける病原症状は以下の通りである。アシボソの罹病植物体の葉にはいずれも大きさの異なる病斑が見られ、発病初期には、植物の葉の表面に濃い茶色や黒色の病斑、円形（直径０．２５～０．４０ｃｍ）や楕円形（幅０．２５～０．３ｃｍ×長さ０．４～０．５ｃｍ）の病斑が出現し、葉縁に黄色や緑色のハローがあり、葉先や葉縁部分が黄化する。発病中期には、病斑は次第に拡大し、病葉の縁部は枯れて茶色っぽくなり、僅かにカールし、一部の葉の中心は黄色から茶色になる。その後、病斑は一面に連なって茶色や黒色を呈し、葉は枯れたりカールしたりし、結局、葉全体が死滅に至る。

【0026】

病葉の病健境界で組織小片を切り出し、７５％アルコールと１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で表面消毒を行った。これらの組織小片をＰＤＡ培地に接種し、２８℃の暗い条件下で２日間培養し、分離した菌株を精製培養した。観察された菌糸の生長状況や胞子の産生状況もこれまでと類似しており、これはアシボソの強病原菌であった。これを傾斜培地に保存し、４℃で用意しておく。

【0027】

光学顕微鏡下で分生子、分生子柄の形態を検察し、顕微鏡写真により分生子の大きさを測定した。『中国真菌志』、『真菌同定マニュアル』に記載の形態学的特徴に基づいて病原同定を行った。同定したところ、菌株ＨＸＤＣ－１－２の形態学的特徴は『中国真菌志』第３０巻におけるバイポラリス・ヤマダイ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ．） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）の説明とほぼ一致するので、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅであると同定した。上記の説明は以下の通りである。分生子柄は黄褐色で、単生又は群生し、分岐することもあり、先端の色が浅く、ひざまずくように湾曲し、幅が４．５～９．５μｍである。分生子は黄褐色から濃褐色であり、略紡錘形をし、又は逆棒形をすることもあり、また、直線状や僅かな湾曲状であり、中央部が広く、基底細胞は鈍い円形をしており、滑らかであり、６～９個（多くの場合７～８個）の偽隔壁を持ち、５４．５～９２．５×１２．５～１７．５μｍ（平均には６９．５×１４．７μｍ）であり、臍部が明らかで、僅かに突出している。

【0028】

真菌ｇＤＮＡ抽出キット（ＢＩＯＭＩＧＡ）を用いて病原真菌ＤＮＡを抽出し、ｒＤＮＡ ＩＴＳ配列、ＧＰＤＨ配列及びＥＦ１αをそれぞれＰＣＲ増幅した（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）。そのユニバーサルプライマーは、それぞれＩＴＳ４（５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’）、ＩＴＳ５（５’－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３’）、ＧＰＤ１（５’－ＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＣＡＴＴＧ－３’）、ＧＰＤ２（５’－ＧＣＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＴＧＣ－３’）、ＥＦ１－９８３Ｆ（５’－ＧＣＹＣＣＹＧＧＨＣＡＹＣＧＴＧＡＹＴＴＹＡＴ－３’）、ＥＦ１－２２１８Ｒ（５’－ＡＴＧＡＣＡＣＣＲＡＣＲＧＣＲＡＣＲＧＴＹＴＧ－３’）である。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により回収し、ｐＭＤ１９ベクターに連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ブルー・ホワイトセレクションによって白色コロニーを選択して、振蕩培養した。ＰＣＲ増幅を行って、電気泳動及びゲル分析装置によって検出し、図３に示されるように、２％アガロースゲルに単一の明るいバンドが現れ、図においては、１、２はＥＦ１α増幅配列であり、目的バンドの大きさは約８００ｂｐであり、３、４はＩＴＳ増幅配列であり、目的バンドの大きさは約５００ｂｐであり、５、６はＧＰＤＨ増幅配列であり、目的バンドの大きさは約５００ｂｐである。菌液のシーケンシングを上海生工公司に委託し、測定した結果をＧｅｎｂａｎｋの核酸データベースのＥＦ１α、ＩＴＳ及びＧＰＤＨの関連配列と相同性について比較した（Ｂｌａｓｔソフトウェア分析）。増幅、シーケンシング及び比較をした結果、ＥＦ１α増幅配列はそれぞれＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株（ＡＣＣＣ３６３３４、ＣＢＳ１２７０８７）とは相同性が９９％であり、ＩＴＳ増幅配列はＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株（ＣＰＣ２８８０７）とは相同性が９９％であり、ＧＰＤＨ増幅配列はＢｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ基準株（ＣＰＣ２８８０７）とは相同性が９９％以上であり、菌株はバイポラリス・ヤマダイであると判定する。ＩＴＳ増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、ＧＰＤＨ増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、ＥＦ１α増幅配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される。

【0029】

バイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２を純粋培養して生じた胞子のアシボソにおける病原症状は以下の通りである。葉の表面に明らかな濃い茶色や黒色の病斑が現れ、円形や楕円形で、一部の葉の先端や葉の縁部に黄化が現れ、時間の経過に伴い、病斑は次第に拡大し、色は深くなり、深刻な場合、葉の病斑は密に繋がっており、葉の先端は枯死し、接種後期には、葉の大部分は黄化又は枯死し、葉はカールする。病葉部から病原菌を再分離すると、病斑の表面の胞子は散布したバイポラリス・ヤマダイの胞子と一致し、コッホの原則に合致した。

【0030】

以上の実験条件での発病症状は自然の病症に似ている。

【0031】

本願のバイポラリス・ヤマダイ菌株ＨＸＤＣ－１－２はアシボソから分離されたものであるが、イネ科雑草に対して広いスペクトルの病原力がある。同じように、そのもう一つの利点として、周辺の作物に影響を与えずに、多くの一年生や多年生のイネ科雑草を効果的に殺滅することである。このことから、バイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２は化学除草剤である芳香族フェノキシプロピオン酸類除草剤と同等の特異性を有しながら、環境に対して安全である。

【0032】

その特徴に基づいて、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、クロイボタケ綱（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ピレオスポラ亜綱（Ｐｌｅｏｓｐｏｒｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ）、プレオスポラ目（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ Ｌｕｔｔｒｅｌｌ ｅｘ Ｂａｒｒ）、プレオスポラ科（Ｐｌｅｓｐｏｒａｃｅａｅ Ｎｉｔｓｃｈｋｅ）、コクリオボラス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ）［無性段階：コクリオボラス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ Ｓｈｏｅｍａｒｋｅ）］、バイポラリス・ヤマダイ（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｙａｍａｄａｅ （Ｙ．Ｎｉｓｉｋ．） Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）であると同定する。該分化型菌株は主にアシボソ及びその近縁種、及びイネ科雑草を感染し、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの主要作物に対して高度免疫がある。試験対象とする３０科１０３種類の作物や経済植物のうち、３３種類はバイポラリス・ヤマダイに対して感受性があり、１５種類はわずかに感受性であり、５種類は非感受性であり、感受性のある植物のほとんどはイネ科であり、マメ科、アブラナ科、ゴマ科などの他の科の植物、イネ科の一部などの植物は感受性が低い。このため、該菌株は、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの作物の畑に用いられて、イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソなどのイネ科雑草、タマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリなどの一年生ハマスゲ、及びカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザなどのような広葉雑草を含む農地雑草を防除するために用いられることができる。

【実施例2】

【0033】

本願のバイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２は生物的除草に用いられ、具体的な使用方法は、菌種を以下の培地に接種し、分生子を誘導生成した後、畑や雑草が生えている農地に散布し、使用量を１０^２～１０^６個／ｍＬとすることである。

【0034】

該バイポラリス・ヤマダイＨＸＤＣ－１－２の培養方法：バイポラリス・ヤマダイを暗い条件下で約４日間成長させた。培養皿を無菌条件下でブラックライト又は紫外線ランプ（２４ ｈ）下に置いて照射し、培地は照射中に胞子を生成する。
ＰＤＡ培地 ジャガイモブドウ糖寒天培地
ジャガイモ ２００ ｇ
ブドウ糖 ２０ ｇ
寒天 ２０ ｇ
水 １ Ｌ

【0035】

現在、中国の国内や国外では、アシボソに対する真菌除草剤の開示はまだされていない。これについての研究は、アシボソ及びイネ科雑草を防除するための良好な手段を提供する。本願の除草組成物は、他の適切な化学除草剤と併用することができ、これにより、低化学除草剤の使用量を減らし、環境汚染を低減させる。

【0036】

必要に応じて、本願の除草組成物は界面活性剤、安定化剤などの助剤を使用してもよく、界面活性剤は例えばトウェイン２０、トウェイン８０などであり、安定化剤は酸化防止剤などを使用することができる。

【実施例3】

【0037】

罹病アシボソの葉を野外で採集し、植物体の発病症状を記録し、顕微鏡で検査した。アシボソエキス寒天培地を用いて病原真菌を分離した。顕微鏡下で菌株の単胞子を選択し、ＰＤＡ培地にそれぞれ接種し、暗い条件下、２８℃で培養した。病原真菌を純粋培養したコロニーの特徴を観察し、コロニーの直径を測定した。また、直径５ｍｍの各円形コロニーをＰＤＡプレートの中央に接種し、４日後、各コロニーの直径を測定した。

【0038】

【表1】

注：Ｄ１は単胞子５日間後に形成されたコロニー直径、Ｄ２は５ｍｍ円形コロニー４日間後に形成されたコロニー直径である。

【実施例4】

【0039】

貴州省貴陽市で自然発生したアシボソ病害植物体から病原真菌を採集して分離し、その病原性について実験を行った。異なる濃度の各種病原真菌胞子懸濁液（ここで、界面活性剤はトウェイン２０、トウェイン８０、安定剤は酸化防止剤）をそれぞれ自然条件でアシボソに散布し、各真菌の病原特性を観察した。

【0040】

【表2】

注：１０^５、１０^４はそれぞれ散布させた胞子懸濁液の濃度が１０^５、１０^４ 個胞子／１ｍｌ（下同）を表す。
小文字は０．０５であって有意レベル、大文字は０．０１であって有意レベル（下同）。

【0041】

表２から分かるように、バイポラリス・ヤマダイ菌株ＨＸＤＣ－１－２の病原率は他の菌株よりも高い。

【実施例5】

【0042】

ＨＸＤＣ－１－２菌株をＰＤＡ培地で４日間培養し、２８℃でブラックライト下に置いて照射し、無菌水を用いて胞子懸濁液を調製した（実施例４参照）。また、９ｃｍの鉢にアシボソ幼苗を育て、３～４葉期まで成長させ、手持ち噴霧器を用いて胞子懸濁液を散布させ、２８℃で４８ｈ保湿し、湿度を８０％に維持した。１週間処理すると、該草は全て枯死した。

【実施例6】

【0043】

試験植物（表３、４参照）の種子を直径９ｃｍの鉢に播種した。４群の重複を設置し、温度２８℃の温室にて飼育した。試験植物が３～４葉期になると接種し（実施例４、５参照）、１鉢あたり５～１０株保留した。各試験植物のＨＸＤＣ－１－２菌株に対する感受性を測定した。安全性試験の結果、ＨＸＤＣ－１－２菌株は、モロコシ及びササゲに対して病原性があり、イネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの作物のいずれにも病原性がない。殺草スペクトル試験の結果、ＨＸＤＣ－１－２菌株は、イネ科雑草としてイヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソ、ミクロステギウム・ノドサム、ササガヤ、オオササガヤ、カヤツリグサ科雑草としてタマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリ、及び広葉雑草としてカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザに高い病原性がある。さらに、オニメヒシバ、メヒシバ、タマガヤツリなどに対して中等レベルの病原性がある。このため、ＨＸＤＣ－１－２菌株はイネ、トウモロコシ、大豆、落花生、ゴマ、粟、ソラマメ、エンドウ、アブラナ、野菜、草花、生薬、果樹などの作物畑に用いられて、イヌビエ、エノコログサ、オニメヒシバ、メヒシバ、アゼガヤ、イトアゼガヤ、カラスムギ、スズメノテッポウ、セイバンモロコシ、アシボソなどのイネ科雑草、タマガヤツリ、コシロガヤツリ、クグガヤツリなどの一年生ハマスゲ、及びカナムグラ、クサネム、シロザ、コアカザなどの広葉雑草を防除することができる。

【表3】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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