特許 7500727 連続的な標識スキームを使用した合成による配列決定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-07

(45)【発行日】2024-06-17

(54)【発明の名称】連続的な標識スキームを使用した合成による配列決定方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/00 20060101AFI20240610BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240610BHJP

   C12Q 1/6874 20180101ALI20240610BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240610BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20240610BHJP

【ＦＩ】

C07H19/00

C12N15/09 Z ZNA

C12Q1/6874 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6876 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022536972

(86)(22)【出願日】2020-12-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-20

(86)【国際出願番号】 EP2020086902

(87)【国際公開番号】W WO2021123074

(87)【国際公開日】2021-06-24

【審査請求日】2022-07-22

(31)【優先権主張番号】62/949,461

(32)【優先日】2019-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】アスティエ，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ベルクマン，フランク

(72)【発明者】

【氏名】ハインドル，ディーター

【審査官】松村 真里

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／１７８３９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００２－３６０２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１６６２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１２９２１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／０５３７１９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２００５－５１１０５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１５８８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５１０４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】WINKLER,Johannes，THER.DELIV.，2013年，Vol.4, No.7，pp.791-809

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ １９／００

Ｃ１２Ｑ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

固体支持体上に配列された複数の標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ｉ） ４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、前記複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸コピー鎖に取り込むこと、ここで、前記４つの異なるヌクレオチドの各々が、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した第１の反応性基を含み、前記４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる第１の反応性基を含むものであり、前記第１の反応性基がオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記第１の反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものであり；
（ｉｉ） ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成すること、ここで、形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体が、前記新生核酸コピー鎖に取り込まれた前記異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来するものであり、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセットの前記順次形成が、以下を含むものである：
ａ． 検出可能な標識を含み、前記新生核酸コピー鎖に取り込まれた前記４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入すること、ここで、前記コンジュゲートが前記第１の反応性基と相補的なオリゴヌクレオチドである第２の反応性基を含むものであり、前記第２の反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものであり；
ｂ． 導入された各コンジュゲートの標識を検出することによって、前記サブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を検出すること；
ｃ． 前記サブセット内の検出された各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の前記固体支持体内の位置を決定すること；および
ｄ． 前記サブセット内の形成された検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々から少なくとも１つの検出可能な標識を切断すること；
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記４つの異なるヌクレオチドが、式（ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＥ）および（ＩＦ）：

【化1】

［式中、
Ｗ^Ａはアデニン核酸塩基であり、Ｗ^Ｇはグアニン核酸塩基であり、Ｗ^Ｃはシトシン核酸塩基であり、Ｗ^Ｒはチミン核酸塩基またはウラシル核酸塩基の１つであり；
Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは、それぞれ異なる第１反応性基であり；
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨであり、ここで、ｚは２～約５の範囲であり；
ＰＧは保護基であり；かつ
各Ｌ^１は、独立して、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、独立して、１つもしくは複数のヘテロ原子で置換されている１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含む］
の構造を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

導入された前記コンジュゲートが、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：

【化2】

［式中、
Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；
Ｌ^２は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり；
Ｚ^２は、第２の反応性基であり；かつ
ｐは、２～約１０００の範囲である］
のいずれか１つの構造を有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

固体支持体上に配列された複数の標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
（ｉ） ４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、前記複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸鎖に取り込むこと、ここで、前記４つの異なるヌクレオチドの各々が、切断可能なリンカーおよび３’－ヒドロキシル保護基を介して核酸塩基に結合した第１の反応性基を含み、前記４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる第１の反応性基を含むものであり、前記第１の反応性基がオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記第１の反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものであり；
（ｉｉ） 前記新生核酸鎖に取り込まれた前記４つの異なるヌクレオチドの各１つを順次標識することであって、前記順次標識が、以下を含むものである：
ａ． 検出可能な標識を含み、前記新生核酸鎖に取り込まれた前記４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入し、１つまたは複数の標識ヌクレオチドを得ること、ここで、前記コンジュゲートが前記第１の反応性基と相補的なオリゴヌクレオチドである第２の反応性基を含むものであり、前記第２の反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものであり；
ｂ． 前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドの標識を検出すること；
ｃ． 検出された前記標識に基づいて、前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドの前記固体支持体内の位置を特定すること；および
ｄ． 前記新生核酸鎖に取り込まれた前記１つまたは複数の標識ヌクレオチドから少なくとも１つの検出可能な標識を切断すること；
を含む、前記方法。

【請求項5】

式（ＩＡ）：

【化3】

［式中、
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり、ここで、ｚは２～約５の範囲の整数であり；
ＰＧは保護基であり；
Ｗは核酸塩基であり；
Ｌ^１は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ
Ｚ^１はオリゴヌクレオチドであり、かつ、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものである］
によって定義される構造を有する化合物またはその塩。

【請求項6】

Ｚ^１がβ－Ｌ－ＬＮＡモノマーを含む、請求項５に記載の化合物またはその塩。

【請求項7】

前記少なくとも１つの切断可能な基が、化学的に切断可能な基、酵素的に切断可能な基、および光切断可能な基からなる群から選択される、請求項５または６に記載の化合物またはその塩。

【請求項8】

前記化合物またはその塩が、式（ＩＢ）：

【化4】

［式中、
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり；ここで、ｚは２～約５の範囲であり；
ＰＧは保護基であり；
Ｗは核酸塩基であり；
Ｑ^１は、１～約２５の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約２５の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分であり；
Ｑ^２は、１～４５の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～４５の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分である；
Ｘ^１は切断可能な基であり；かつ
Ｚ^１はオリゴヌクレオチドであり、かつ、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものである］
の構造を有する、請求項５～７のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。

【請求項9】

Ｑ^１が、Ｃ_１～Ｃ_１０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む、請求項８に記載の化合物またはその塩。

【請求項10】

Ｑ^２が、Ｃ_１～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む、請求項８または９に記載の化合物またはその塩。

【請求項11】

Ｘ^１が、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基およびｐＨ感受性基からなる群から選択される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。

【請求項12】

（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含むヌクレオチドであって、前記反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはベータ－Ｌ－ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含み、
前記ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはベータ－Ｌ－ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号１～２２または２９～５０のいずれかを有する配列を含む、前記ヌクレオチド。

【請求項13】

下記（ｉ）および（ｉｉ）を含むキットであって、
（ｉ）請求項８～１１のいずれか一項に記載の化合物もしくはその塩、または請求項１２に記載のヌクレオチドまたはその塩；および
（ｉｉ）は、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）のいずれかの構造を有するコンジュゲート：

【化5】

［式中、
Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；
Ｌ^２は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり；
Ｚ^２は、Ｚ^１のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドであり；かつ
ｐは２～約１０００の範囲の整数である］。

【請求項14】

式（ＩＣ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＤ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＥ）の１つのヌクレオチドおよび式（ＩＦ）の１つのヌクレオチド：

【化6】

［式中、
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨであり、ここで、ｚは２～約５の範囲であり；
ＰＧは保護基であり；
Ｗ^Ａはアデニン核酸塩基であり；
Ｗ^Ｇはグアニン核酸塩基であり；
Ｗ^Ｃはシトシン核酸塩基であり；
Ｗ^Ｒはチミン核酸塩基またはウラシル核酸塩基のいずれかであり；
Ｌ^１は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ
Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは、それぞれ異なる第１反応性基を含み、前記第１の反応性基がオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記第１反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものである］
を含む、キット。

【請求項15】

（ｉ）式（ＩＡ）：

【化7】

［式中、
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］ｚ－ＯＨであり、ここで、ｚは２～約５の範囲であり；
ＰＧは保護基であり；
Ｗは核酸塩基であり；
Ｌ^１は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されている１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は、１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ
Ｚ^１は、第１の反応性基であり、前記第１の反応性基がオリゴヌクレオチドであり、かつ、前記第１の反応性基がＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものである］
を有するヌクレオチドを、
（ｉｉ）式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：

【化8】

［式中、
Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；
Ｌ^２は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つまたは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり；
Ｚ^２は、前記第１の反応性基Ｚ^１と相補的なオリゴヌクレオチドである第２の反応性基であり、前記第２の反応性基が、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含むものであり；かつ
ｐは２～約１０００の範囲の整数である］
のいずれか１つを有するコンジュゲートと反応させることを含むプロセスによって作製される、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体。

【請求項16】

間接的に結合した複数の新生核酸コピー鎖を含む固体支持体であって、前記複数の新生核酸コピー鎖が各々、式（ＩＡ）：

【化9】

［式中、
Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－オリゴヌクレオチドであり、ここで、
ＰＧは保護基であり；
Ｗは核酸塩基であり；
Ｌ^１は、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であるか、または、１つもしくは複数のヘテロ原子を含み、１～約６０の間の炭素原子を有する、直鎖もしくは分枝鎖の、置換もしくは非置換の、飽和もしくは不飽和の脂肪族部分もしくは芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ
Ｚ^１は、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチドである］
を有する取り込まれたヌクレオチドを含む、固体支持体。

【請求項17】

請求項１６に記載の固体支持体と、磁気ナノ粒子を含むヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成された異なるサブセットを順次検出するのに適した磁気センサアレイとを含む、アセンブリ。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

開示の背景
ＤＮＡの配列決定の重要性は４０年前の開始から劇的に高まっている。これは、生物学と医学のほとんどの分野で重要なテクノロジーとして、またパーソナライズされた精密医療の新しいパラダイムの基盤として認識されている。個人のゲノムとエピゲノムに関する情報は、疾患の傾向、臨床的予後、および治療への反応を明らかにするのに役立つが、医学におけるゲノム配列決定の日常的な適用には、タイムリーで費用効果の高い方法で提供される包括的なデータが必要である。

【0002】

周知の配列決定方法は、Ｒ．Ｔｓｉｅｎ（国際公開第９１／０６６７８号）によって最初に記載されたＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法である。この方法は、その３’－ＯＨ基で保護されている可逆的ターミネーターヌクレオチドを利用する。現在の配列決定システムは、蛍光標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドを利用する。異なる可逆的ターミネーターヌクレオチドの混合物をフローセルに添加すると、ＤＮＡポリメラーゼが、合成されているＤＮＡ鎖に修飾ヌクレオチドを組み込み、鎖が画像化され、次いで取り込まれたヌクレオチドがその３’－ＯＨ基で脱保護され、ヌクレオチド組込みの別のサイクルが可能になる。

【0003】

より具体的には、可逆的終結による配列決定における各サイクルは、以下の３つのステップからなる：（ｉ）フローセルに結合したＤＮＡ鎖への変異型ＤＮＡポリメラーゼによる相補的な可逆的ターミネーターヌクレオチドの組込み、（ｉｉ）異なる可逆的ターミネーターヌクレオチドの４つの塩基に対する異なる蛍光シグナルの検出、および（ｉｉｉ）終結部分および蛍光標識を切断することによる遊離３’－ＯＨ基の回復。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、レーザー励起および画像化によって特定される。このサイクルの反復は、ＤＮＡ鋳型の配列決定をもたらす。

【発明の概要】

【0004】

開示の簡単な概要
本出願人は、検出可能な磁気標識を組み込んだ磁気センサアレイおよび試薬を利用した合成による改善されたＳＢＳ方法を開発した。本出願人は、検出可能な磁気標識を含むそのような磁気センサアレイおよび試薬を使用してＳＢＳを実行することにより、配列決定システムにおける高出力レーザーおよび高分解能光学系の必要性を排除しながら、配列決定スループットが劇的に増加し、配列決定のコストが削減されることを見出した。

【0005】

本開示の一態様は、固体支持体上に配列された複数の標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、（ａ）４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸コピー鎖に組み込むことを含み、４つの異なるヌクレオチドの各々が、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した第１の反応性基を含み、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる第１の反応性基を含み；（ｂ）異なるサブセットのヌクレオチド－コンジュゲート複合体を順次形成することを含み、ここで形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体が、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来し、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセットの順次形成が、（ｉ）検出可能な標識を含み、新生核酸コピー鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入すること；（ｉｉ）導入された各コンジュゲートの標識を検出することによって、サブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を検出すること；（ｉｉｉ）サブセット内の検出された各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の固体支持体内の位置を決定すること；および（ｉｖ）場合により、サブセット内の形成された検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々から少なくとも検出可能な標識を切断することを含む、方法である。

【0006】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのそれぞれの異なる第１の反応性基は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性官能基の対の第１のメンバー、指定結合実体の対の第１のメンバー、第１のオリゴヌクレオチド、およびホスト／ゲスト分子の対の第１のメンバーから独立して選択される。いくつかの実施形態において、導入されたコンジュゲートは、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性官能基の対の第２のメンバー、特定結合実体の対の第２のメンバー、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチド、およびホスト／ゲスト分子の対の第２のメンバーから選択される第２の反応性基を含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の反応性基は、互いにハイブリダイズすることができる第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む。

【0007】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのそれぞれの異なる第１の反応性基は、異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、異なる第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～５８のいずれか１つから選択され得る。いくつかの実施形態において、それぞれの異なる第１のオリゴヌクレオチドは、第１のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２および２９～５０のいずれか１つから選択される配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、導入されたコンジュゲートの第２の反応性基は、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～５８のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチドは、第２のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、３と１２ｍｅｒの間を含む。いくつかの実施形態において、第２のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、５と１０ｍｅｒの間を含む。いくつかの実施形態において、第２のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２および２９～５０のいずれか１つから選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチドは、Ｌ構成のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第２のオリゴヌクレオチドは、β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ジスルフィド基、α－アジドエーテル、ニトロベンジル系基およびフェナシル基からなる群から選択される少なくとも１つの切断可能な基を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体上に存在する複数の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的な新生核酸コピー鎖への異なるヌクレオチドの組込みは、４つの異なるヌクレオチドの混合物を固体支持体に導入することを含む。いくつかの実施形態において、検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の３つの異なるサブセットが形成および検出されるように、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成を３回行う。

【0010】

いくつかの実施形態において、本方法は、複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドから３’－ヒドロキシル保護基の各々を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、３’－ヒドロキシル保護基は、アジドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、４つの異なるヌクレオチドの混合物を固体支持体に導入して、固体支持体上の複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸鎖の各々を伸長することをさらに含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドは、式（ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＥ）および（ＩＦ）：

【化1】

【0012】

［式中、

【0013】

Ｗ^Ａはアデニン核酸塩基であり、Ｗ^Ｇはグアニン核酸塩基であり、Ｗ^Ｃはシトシン核酸塩基であり、Ｗ^Ｒはチミン核酸塩基またはウラシル核酸塩基の１つであり；

【0014】

Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは、それぞれ異なる第１反応性基であり；

【0015】

Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨであり、ここで、ｚは２～約５の範囲であり；

【0016】

ＰＧは保護基であり；かつ

【0017】

各Ｌ^１は、独立して、１と約６０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含む］
の構造を有する。

【0018】

いくつかの実施形態において、ｚは、２である。

【0019】

いくつかの実施形態において、導入された各コンジュゲートの検出可能な標識は、磁気ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、ＦｅＯ、Ｆｅ_３Ｏ_４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔからなる群から選択される物質を含む。いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、磁気センサアレイを使用して検出される。

【0020】

いくつかの実施形態において、導入されたコンジュゲートは、式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）：

【化2】

【0021】

［式中、

【0022】

Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；

【0023】

Ｌ^２は、１と約６０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり；

【0024】

Ｚ^２は、第２の反応性基であり；かつ

【0025】

ｐは、２～約１０００の範囲である］
のいずれか１つの構造を有する。

【0026】

いくつかの実施形態において、Ｌ^２は切断可能な基を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ^２は、ビオチンに由来する部分を含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、本方法は、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの連続的な形成の前に、取り込まれていないヌクレオチドを除去することをさらに含む。

【0028】

本開示の一態様において、固体支持体上に配列された複数の標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって：（ａ）４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸鎖に組み込むことを含み、４つの異なるヌクレオチドの各々が、切断可能なリンカーおよび３’－ヒドロキシル保護基を介して核酸塩基に結合した第１の反応性基を含み、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる第１の反応性基を含み、（ｂ）新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドの各１つを順次標識することを含み、順次標識が、（ｉ）検出可能な標識を含み、新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入して、１つまたは複数の標識ヌクレオチドを提供すること、（ｉｉ）１つまたは複数の標識ヌクレオチドの標識を検出すること；（ｉｉｉ）検出された標識に基づいて、１つまたは複数の標識ヌクレオチドの固体支持体内の位置を特定すること；および（ｉｖ）新生核酸鎖に取り込まれた１つまたは複数の標識ヌクレオチドから少なくとも検出可能な標識を場合により切断することを含む、方法である。

【0029】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なる第１の反応性基は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性官能基の対の第１のメンバー、指定結合実体の対の第１のメンバー、第１のオリゴヌクレオチド、およびホスト／ゲスト分子の対の第１のメンバーからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なる第１の反応性基は、異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、導入されたコンジュゲートの各々は、第１のオリゴヌクレオチドの１つと相補的な第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な第２のオリゴヌクレオチドは、Ｌ構成のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な第２のオリゴヌクレオチドは、β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な第２のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＬＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２および２９～５０のいずれか１つからなる群から選択される配列を有する。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な第２のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＰＮＡモノマーを含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、ジスルフィド基、α－アジドエーテル、ニトロベンジル系基およびフェナシル基からなる群から選択される少なくとも１つの切断可能な基を含む。いくつかの実施形態において、固体支持体上に存在する複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸コピー鎖への異なるヌクレオチドの組込みは、４つの異なるヌクレオチドの混合物を固体支持体に導入することを含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、順次標識は３回行われる。いくつかの実施形態において、順次標識は４回行われる。いくつかの実施形態において、方法は、複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドから３’－ヒドロキシル保護基の各々を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、３’－ヒドロキシル保護基は、アジドメチル基を含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、方法は、４つの異なるヌクレオチドの混合物を固体支持体に導入して、固体支持体上の複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な新生核酸鎖の各々を伸長することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成の前に、取り込まれていないヌクレオチドを除去することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、各順次標識の間の任意の未反応コンジュゲートを除去することをさらに含む。

【0033】

本開示の別の態様は、式（ＩＡ）：

【化3】

【0034】

［式中、

【0035】

Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり；ここで、ｚは２と約５の間の範囲であり；

【0036】

ＰＧは保護基であり；

【0037】

Ｗは核酸塩基であり；

【0038】

Ｌ^１は、１と約６０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ

【0039】

Ｚ^１はオリゴヌクレオチドである］
によって定義される構造を有する化合物またはその塩である。

【0040】

いくつかの実施形態において、ｚは、２である。

【0041】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、ＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、Ｌ－構成モノマー、例えば少なくとも１つのＬ－構成モノマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ構成モノマーはＬ構成ＬＮＡモノマーである。いくつかの実施形態において、Ｌ構成ＬＮＡモノマーはβ－Ｌ－ＬＮＡモノマーである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、４と１２の間のｍｅｒを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５と１０の間のｍｅｒを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または２９～５０のいずれか１つから選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの切断可能な基は、化学的に切断可能な基、酵素的に切断可能な基、および光切断可能な基からなる群から選択される。

【0042】

本開示の他の態様は、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含むヌクレオチドであり、ここで、反応性基は、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはβ－Ｌ－ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドまたはβ－Ｌ－ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または２９～５０のいずれかを有する配列を含む。

【0043】

本開示の別の態様は、式（ＩＣ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＤ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＥ）の１つのヌクレオチド、および式（ＩＦ）の１つのヌクレオチド：

【化4】

【0044】

［式中、

【0045】

Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨであり、ここで、ｚは２～約５の範囲の整数であり；

【0046】

ＰＧは保護基であり；

【0047】

Ｗ^Ａはアデニン核酸塩基であり；

【0048】

Ｗ^Ｇはグアニン核酸塩基であり；

【0049】

Ｗ^Ｃはシトシン核酸塩基であり；

【0050】

Ｗ^Ｒはチミン核酸塩基またはウラシル核酸塩基の１つであり；

【0051】

Ｌ^１は、１と約６０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ

【0052】

Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは、それぞれ異なる第１反応性基を含む］
を含むキットである。

【0053】

いくつかの実施形態において、ｚは、２である。

【0054】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄの第１の反応性基は、独立して、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性官能基の対の第１のメンバー、指定結合実体の対の第１のメンバー、第１のオリゴヌクレオチドおよびホスト／ゲスト分子の対の第１のメンバーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄの第１の反応性基はそれぞれ、異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄの第１の反応性基はそれぞれ、異なるＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄの第１の反応性基はそれぞれ、異なるβ－Ｌ－ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドを含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも３つの異なるコンジュゲートをさらに含み、ここで、少なくとも３つの異なるコンジュゲートの各々は、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄのうちの１つと直交性に反応する異なる第２の反応性基を含む。いくつかの実施形態において、各々異なる第２の反応性基は、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄの第１の反応性基のうちの１つと直交性に反応する。いくつかの実施形態において、各々異なる第２の反応性基は、異なる第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、各々異なる第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態において、各々異なる第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのβ－Ｌ－ＬＮＡモノマーを含む。

【0056】

本開示の他の態様は、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体であり、ここで、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、（ｉ）式（ＩＡ）：

【化5】

【0057】

［式中、

【0058】

Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり；

【0059】

ＰＧは保護基であり；

【0060】

Ｗは核酸塩基であり；

【0061】

Ｌ^１は、１と約６０との間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は、１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ

【0062】

Ｚ^１は、第１の反応性基である］
の構造を有するヌクレオチドを

【0063】

（ｉｉ）式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：

【化6】

【0064】

［式中、

【0065】

Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；

【0066】

Ｌ^２は、１と約６０の間の炭素原子を有し、任意に１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり；

【0067】

Ｚ^２は、第１の反応性基Ｚ^１と直交反応する第２の反応性基であり；かつ

【0068】

ｐは、２～約１０００の範囲の整数である］
のいずれか１つの構造を有するコンジュゲートと反応させることを含むプロセスによって作製される。

【0069】

いくつかの実施形態では、Ｌ^２は、ビオチンまたはビオチンに由来する部分を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＡ）の構造を有する。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、式（ＩＩＢ）の構造を有し、式中、ｐは、２～約１００の範囲である。

【0071】

いくつかの実施形態において、第１の反応性基は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性官能基の対の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、第１の反応性基は、特異的結合実体の対の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、特異的結合実体の対の第１のメンバーはハプテンである。いくつかの実施形態において、第１の反応性基は、ホスト／ゲスト分子の対の第１のメンバーを含む。いくつかの実施形態において、第１の反応性基は、第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ構成ＬＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または２９～５０のいずれか１つを有する配列を含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、第２の反応性基は、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾された第２のオリゴヌクレオチドまたはβ－Ｌ－ＬＮＡ修飾された第２のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾された第２のオリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または２９～５０のいずれか１つを有する配列を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識は蛍光分子を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、磁気ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、磁気ナノ粒子は、強磁気材料を含む。いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、ＦｅＯ、Ｆｅ_３Ｏ_４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔからなる群から選択される物質を含む。

【0074】

本開示の他の態様は、それに間接的に結合した複数の新生核酸コピー鎖を含む固体支持体であり、ここで、複数の新生核酸コピー鎖はそれぞれ、式（ＩＡ）：

【化7】

【0075】

［式中、

【0076】

Ｙは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－オリゴヌクレオチドであり、ここで、

【0077】

ＰＧは保護基であり；

【0078】

Ｗは核酸塩基であり；

【0079】

Ｌ^１は、１と約６０との間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ

【0080】

Ｚ^１は、第１のオリゴヌクレオチドである］
を有する取り込まれたヌクレオチドを含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ構成ＬＮＡモノマーを含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＡ修飾された第１のオリゴヌクレオチドは、３ｍｅｒと１２ｍｅｒの間を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＡ－第１の修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または２９～５０のいずれかを有する配列を含む。

【図面の簡単な説明】

【0082】

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。

【図1A】図１Ａは、本開示の１つの実施形態による配列決定方法を記載するフローチャートを示す。

【図1B】図１Ｂは、本開示の一実施形態による、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成する方法を示すフローチャートを示す。

【図2A】図２Ａは、本開示の一実施形態による配列決定方法を記載するフローチャートを示す。

【図2B】図２Ｂは、本開示の一実施形態による、核酸鎖に取り込まれたヌクレオチドを順次標識する方法を示すフローチャートを示す。

【図3】図３は、本開示の一実施形態による配列決定方法を示すフローチャートを示す。

【図4A】図４Ａは、本開示の１つの実施形態による、本開示の４つの異なるヌクレオチドを４つの異なる核酸鎖に組み込み、次いで４つの異なる取り込まれたヌクレオチドの各々を順次標識する方法を示す。

【図4B】図４Ｂは、本開示の一実施形態による、順次形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体のサブセットが順次検出される方法を示す。

【発明を実施するための形態】

【0083】

詳細な説明
反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

【0084】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

【0085】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数、および必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

【0086】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の共通の米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下」を意味するオープンタームであると解釈され、また、追加の特徴、制限、態様などを排除しないものと解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。同様に、語句：「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、その方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程およびプロセスは、本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付けの工程およびプロセスが変化し得ることを認識するであろう。

【0087】

本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在することができることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）を指すことができるなどである。

【0088】

本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の場所における「一実施形態において」または「実施形態において」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らない。さらにまた、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられることができる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「アナログ」または「誘導体」は、化学および生物学におけるその明白な通常の意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照」化合物）と構造的に類似しているが、例えば、ある原子を異なる元素の原子で置き換える場合、または特定の官能基の存在下で、またはある官能基を別の官能基で置き換える場合、または参照化合物の１つまたは複数のキラル中心の絶対立体化学において、組成が異なる化合物を指す。したがって、アナログは、機能および外観が類似または同等であるが、構造または起源が参照化合物と類似していない化合物である。

【0090】

本明細書で使用される場合、「脂肪族」という用語は、飽和またはモノ－またはポリ不飽和であり得る、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を意味する。不飽和脂肪族基は、１つまたは複数の二重結合および／または三重結合を含む。炭化水素鎖の分枝は、線状鎖ならびに非芳香族環状元素を含み得る。炭化水素鎖は、特に明記しない限り、任意の長さであり、任意の数の分枝を含み得る。主鎖および分枝の両方は、例えば、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｅまたはＳｉなどのヘテロ原子をさらに含み得る。

【0091】

本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル等）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含む。アルキルという用語は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素を置換する酸素、窒素、硫黄またはリン原子をさらに含むことができるアルキル基をさらに含む。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はＣ_１－Ｃ_３０、分枝鎖の場合はＣ_１－Ｃ_３０）。さらに、アルキルという用語は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基としては、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられ得る。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリール（例えば、フェニルメチル（ベンジル））で置換されたアルキルである。「アルキル」という用語には、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の側鎖も含まれる。

【0092】

本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換が類似しているが、少なくとも１つの二重結合を含む不飽和脂肪族基を含む。例えば、「アルケニル」という用語は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。アルケニルという用語は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素を置換する酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルケニル基をさらに含む。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、その骨格中に３０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はＣ_２－Ｃ_３０、分枝鎖の場合はＣ_３－Ｃ_３０）。さらに、アルケニルという用語は、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルケニル部分を指す。そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられ得る。アルケニル基の他の例としては、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－メチル－エテニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－メチル－２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－メチル－ｌ－ブテニル、２－メチル－ｌ－ブテニル、３－メチル－ｌ－ブテニル、１－メチル－２－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、１－メチル－３－ブテニル、２－メチル－３－ブテニル、３－メチル－３－ブテニル、１，１－ジメチル－２－プロペニル、１，２－ジメチル－１－プロペニル、１，２－ジメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－プロペニル、１－エチル－２－プロペニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－メチル－ｌ－ペンテニル、２－メチル－ｌ－ペンテニル、３－メチル－ｌ－ペンテニル、４－メチル－１－ペンテニル、１－メチル－２－ペンテニル、２－メチル－２－ペンテニル、３－メチル－２－ペンテニル、４－メチル－２－ペンテニル、１－メチル－３－ペンテニル、２－メチル－３－ペンテニル、３ーメチル－３－ペンテニル、４－メチル－３－ペンテニル、１－メチル－４－ペンテニル、２－メチル－４－ペンテニル、３－メチル－４－ペンテニル、４－メチル－４－ペンテニル、１，１－ジメチル－２－ブテニル、１，１－ジメチル－３－ブテニル、１，２－ジメチル－１－ブテニル、１，２－ジメチル－２－ブテニル、１，２－ジメチル－３－ブテニル、１，３－ジメチル－１－ブテニル、１，３－ジメチル－２－ブテニル、１，３－ジメチル－３－ブテニル、２，２－ジメチル－３－ブテニル、２，３－ジメチル－１－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－３－ブテニル、３，３－ジメチル－１－ブテニル、３，３－ジメチル－２－ブテニル、１－エチル－１－ブテニル、１－エチル－２－ブテニル、１－エチル－３－ブテニル、２－エチル－１－ブテニル、２－エチル－２－ブテニル、２－エチル－３－ブテニル、１，１，２－トリメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－メチル－２－プロペニル、１－エチル－２－メチル－１－プロペニルおよび１－エチル－２－メチル－２－プロペニル基が挙げられるが、これらに限定されない。複数の二重結合を含有する基としては、限定されないが、ブタ－１，３－ジエニル、ペンタ－１，３－ジエニルまたはペンタ－１，４－ジエニル基が挙げられ得る。

【0093】

本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換が類似しているが、少なくとも１つの三重結合を含む不飽和脂肪族基を含む。例えば、「アルキニル」という用語は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。アルキニルという用語は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素を置換する酸素、窒素、硫黄またはリン原子を含むアルキニル基をさらに含む。特定の実施形態において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、その骨格中に３０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はＣ_２－Ｃ_３０、分枝鎖の場合はＣ_３－Ｃ_３０）。さらに、アルキニルという用語は、「非置換アルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、後者は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置換する置換基を有するアルキニル部分を指す。そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられ得る。複数の三重結合を含有する基としては、限定されないが、ブタ－１，３－ジイニル、ペンタ－１，３－ジイニルまたはペンタ－１，４－ジイニル基が挙げられ得る。

【0094】

本明細書で使用される場合、「芳香族」という用語は、特に明記しない限り、共役二重結合の平面環状炭化水素部分を意味し、これは、単一の環であるか、または複数の縮合または共有結合した環を含み得る。環状炭化水素部分の主鎖は、特に明記しない限り、任意の長さであってもよく、例えばＮ、ＯおよびＳなどの任意の数のヘテロ原子を含んでいてもよい。芳香族基は、Ｏ、Ｓ、Ｎ、ＰまたはＳｉのようなアルキル基またはヘテロ原子で置換されていてもよい。

【0095】

本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語との組合せで、特に明記しない限り、少なくとも１つの炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定した直鎖または分枝鎖、またはそれらの組合せを意味し、窒素および硫黄原子は場合により酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は場合により四級化されてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、またはアルキル基が分子の残部に付加される位置に置かれてもよい。ヘテロアルキルは環化されていない。例として、限定されるものではないが、以下が挙げられる：－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ－ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ－Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ－ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３および－ＣＮ。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３などの、最大２つのヘテロ原子が連続している場合がある。

【0096】

本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを意味する。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは芳香族ではない。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは、例えば、ここに記載の置換基のいずれかでさらに置換することができる。

【0097】

上記の用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「芳香族」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」など）は、示される基の置換形態および非置換形態の両方を含む。その点に関して、基または部分が「置換された」または「置換されていてもよい」（または「有してもよい」または「含んでもよい」）と記載されるときはいつでも、その基は非置換であるか、または示された置換基の１つまたは複数で置換され得る。同様に、基が置換されている場合に「置換または非置換」であると記載される場合、置換基は、示された置換基のうちの１つまたは複数から選択され得る。置換基が示されていない場合、示された「置換されていてもよい」または「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、シアネート、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、保護されたＣ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、エーテル、アミノ（例えば、一置換アミノ基または二置換アミノ基）、およびそれらの保護誘導体から個別にかつ独立して選択される１つまたは複数の基で置換され得ることを意味する。上記の基のいずれも、Ｏ、ＮまたはＳを含む１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。例えば、部分がアルキル基で置換されている場合、そのアルキル基は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択されるヘテロ原子を含み得る（例えば、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３））。

【0098】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、目的の分子（または目的の高度に類似の分子の群）に特異的に結合し、他の分子への結合が実質的に排除されている、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指し、例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組合せ、ならびに任意の脊椎動物（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウス等の哺乳動物）において免疫応答中に産生される類似の分子および抗体断片（例えば、当技術分野で公知のＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片およびＦａｂ断片、組換え抗体断片（例えば、ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、およびトリアボディ（当技術分野で公知の通り）、ならびにラクダ科抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、さらに、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は、重および軽鎖で構成されてもよく、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。合わせて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担う。抗体という用語はまた、インタクトの免疫グロブリン、ならびに当技術分野でよく知られているそれらの変異体および部分を含む。

【0099】

本明細書で使用される場合、「結合（ｃｏｕｐｌｅ）」または「結合する（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」という用語は、ある分子または原子の別の分子または原子への結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（例えば、共有結合）、または連結を指す。

【0100】

本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、適切な温度およびイオン緩衝条件で２つのヌクレオチドの塩基間に好ましい熱力学的安定性および特異的対形成を形成する能力を指す。相補性は、アデニン、チミン（ＲＮＡにおいてはウラシル）、グアニンおよびシトシンの核酸塩基間の異なる相互作用によって達成され、ここで、アデニンはチミンまたはウラシルと対になっており、グアニンはシトシンと対になっている。

【0101】

本明細書で使用される場合、「ヘテロ原子」という用語は、ホウ素（Ｂ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、「複素環」は、１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。他の実施形態において、脂肪族基は、１つまたは複数のヘテロ原子を含むか、または１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい。

【0102】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、それらのヌクレオチド配列と一致する異なる核酸分子間の塩基対合を指す。

【0103】

本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、原子または分子、あるいは原子または分子の集合体であり得る検出可能な部分を指す。標識は、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導性、容量性）のシグネチャを提供することができ、これは検出することができる。

【0104】

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数のサブユニット（天然に存在する、合成の、または修飾核酸塩基）を含み得る。これらの塩基の誘導体は、ＰＣＲシステム、試薬、および消耗品に例示されており（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ １９９６－１９９７，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）、参照により本明細書に全体が組み込まれる。いくつかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、あるいはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドまたは変形体を含むがこれらに限定されない、任意の核酸分子を含むことができる。

【0105】

本明細書で使用される場合、「核酸鋳型」という用語は、ポリメラーゼ触媒複製のためのガイドとして使用することができる核酸またはその一部を指す。核酸分子は、その長さに沿って複数の鋳型を含むことができ、あるいは、本明細書の特定の実施形態では単一の鋳型のみが使用され得る。核酸鋳型はまた、リガーゼ触媒プライマー伸長のためのガイドとして機能し得る。

【0106】

本明細書で使用される場合、「核酸塩基」という用語は、別の核酸塩基と非共有結合的に対を形成することができる複素環部分を指す。「核酸塩基」という用語は、「未修飾核酸塩基」および「修飾核酸塩基」の両方を包含する。「天然に存在する核酸塩基」または「非修飾核酸塩基」（交換可能に使用される）は、その天然に存在する形態に対して修飾されていない核酸塩基を指す。同様に、「修飾核酸塩基」は、天然の核酸塩基からの任意の置換および／または変化を意味する。核酸塩基（または塩基）の修飾または置換は、天然に存在するまたは合成の非修飾の核酸塩基とは構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である。天然の核酸塩基と修飾核酸塩基の両方が水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基の修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはオリゴヌクレオチドに他のいくつかの有益な生物学的特性を与え得る。修飾核酸塩基には、合成および例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）などの天然の核酸塩基が含まれる。５－メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、標的核酸に対する相補的なオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために特に有用である。例えば、５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を約０．６～約１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８参照、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0107】

さらなる修飾核酸塩基としては、限定されないが、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、７－メチルグアニン、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、イソ－Ｃ、イソ－Ｇ、チオＴ、チオＧ、５，６－ジヒドロウラシル、６－メチルアデニン、２－プロピルグアニンおよび他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、例えば５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、５－プロピニル
（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アザウラシル、シトシンおよびチミン、ウラシル－５－イル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３ーデアザアデニン、８－アザ－７－デアザグアニンおよび８－アザ－７－デアザアデニンが挙げられる。さらなる核酸塩基は、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．２，ｎｏ．２，２００７；Ｄｉｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｓｅｍｉ－Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｐｈａｂｅｔ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０，１６１１５－１６１２３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｘ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤＮＡ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１５，１３７，６７３４－６７３７；Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ．ａｌ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２０１８，６，５３；Ｌｉｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｌｉｘ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡ，ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｆｏｕｒ－Ｂａｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆｏｒｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９ Ｖｏｌ．１２７，Ｎｏ．５，２００５，１３９６－１４０２；Ｔｏｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｎｅｗ ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｃｏｒｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６３（２００７）３６０８－３６１４；Ｌａｏｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｔｏ Ａｃｃｅｐｔ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎｓｔａｎｄａｒｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，５２，５２８８－５２９４；Ｋｒｕｅｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ：Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．２００７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；４０（２）：１４１－１５０；Ｓｒｉｖａｔｓａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｉｅｎｏ［３，４－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｓｅｎｓｅｓ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，６，１３３４－１３３８；Ｋｉｍ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ５－Ｃｙａｎｏ－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｏｎｏｒ－Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ－Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｐａｔｔｅｒｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，７７，３６６４－３６６９；およびＮｏｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，７８，８１２３－８１２８に記載されており、その開示は引用によりその全体が本明細書に取り込まれている。

【0108】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたは２’－デオキシリボースなどの糖に共有結合している核酸塩基を指す。

【0109】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、アデノシン５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン５’－二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）アデノシン５’－四リン酸またはその２’－デオキシ誘導体等のリン酸またはポリリン酸に共有結合したヌクレオシドを指す。

【0110】

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを指し、ここで、オリゴマーは、場合により、非ヌクレオチドモノマー単位、および／またはオリゴマーの内部および／または外部位置に結合した他の化学基を含む。オリゴマーは天然または合成であり得、天然に存在するオリゴヌクレオチド、または天然に存在しない（または修飾された）塩基、糖部分、ホスホジエステル－アナログ結合、および／または代替のモノマー単位キラリティーおよび異性体構造を有するヌクレオシドを含むオリゴマーを含み得る（例えば、５’－～２’－結合、Ｌ－ヌクレオシド、α－アノマーヌクレオシド、β－アノマーヌクレオシド、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。

【0111】

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」という用語は、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例としては、核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素またはリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。ポリマーには、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素である逆転写酵素が含まれる場合がある。

【0112】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーまたはオリゴマーである。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のセクションを含み得る。

【0113】

本明細書で使用される場合、「反応性基」または「反応性官能基」という用語は、異なる部分の官能基と化学的に会合、相互作用、ハイブリダイズ、水素結合、または結合することができる官能基を指す。いくつかの実施形態において、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間の「反応」は、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間で共有結合が形成されることを意味し得；または、２つの反応性基または２つの反応性官能基が互いに会合し、互いに相互作用し、互いにハイブリダイズし、互いに水素結合すること等を意味し得る。したがって、いくつかの実施形態において、「反応」は、ハプテンと抗ハプテン抗体との結合、または超分子ホスト分子と結合するゲスト分子等の結合事象を含む。

【0114】

本明細書で使用される場合、「配列」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸中のヌクレオチド（または塩基）の順序を指す。異なる種のヌクレオチドが核酸中に存在する場合、配列は、核酸中のそれぞれの位置におけるヌクレオチド（または塩基）の種の特定を含む。配列は、核酸分子の全部または一部の特性である。この用語は、タンパク質ポリマーのアミノ酸モノマー単位等の他のポリマー中のモノマー単位の順序および位置同一性を説明するために同様に使用することができる。

【0115】

本明細書で使用される場合、「配列決定」という用語は、核酸中の塩基の順序および位置の決定を指す。

【0116】

本明細書で使用される場合、「鋳型核酸」、「標的ポリヌクレオチド分子」および「標的核酸」という用語は互換的に使用することができ、配列情報を得るために場合により配列決定反応によって調べることができる増幅反応の対象である核酸分子を指す。鋳型核酸は、クローン増幅法によって生成され、固体支持体上に固定化され得る、すなわちビーズまたはアレイ上に固定化され得る核酸であり得る。

【0117】

本明細書で提供される見出しは、便宜上のみものであり、開示される実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

【0118】

ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド

【0119】

本開示は、糖、例えば、リボースまたはデオキシリボースおよび核酸塩基を含むヌクレオチド、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド（またはその任意の塩）に関する。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチドは、新生核酸鎖に取り込まれ、それにより、取り込まれたヌクレオチドは、コンジュゲートと反応して、本明細書中に記載の取り込まれたヌクレオチド－コンジュゲート複合体を形成し得る。

【0120】

いくつかの実施形態において、本開示によるヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＡ）：

【化8】

【0121】

［式中、

【0122】

Ｙは、－ＯＨ、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり、ここで、ｚは０または１～５の範囲の整数であり；

【0123】

ＰＧは保護基であり；

【0124】

Ｗは核酸塩基であり；

【0125】

Ｌ^１は、１と約６０との間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり、ただし、Ｌ^１は、１つまたは複数の切断可能な基を含み；かつ

【0126】

Ｚ^１は、反応性基である］
によって定義される構造を有する。

【0127】

いくつかの実施形態において、ｚは、２である。

【0128】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、ワトソン－クリック塩基対形成が依然として行われ得るという条件で、核酸塩基（「Ｗ」）上の任意の位置に結合され得る。いくつかの実施形態では、プリン塩基との関連において、部分Ｌ^１は、７－デアザプリンの７位を介して、８－修飾プリンを介して、Ｎ－６修飾アデニンを介して、またはＮ－２修飾グアニンを介して結合している。いくつかの実施形態において、ピリミジンとの関連において、部分Ｌ^１の結合は、シトシン、チミンまたはウラシル上の５位およびシトシン上のＮ－４位を介する。

【0129】

上記のように、いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約６０との間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約５０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約４０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約３５の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約３０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約２５の間の炭素原子を含む。さらに他の実施形態では、部分Ｌ^１は、約５と約２０の間の炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、部分Ｌ^１は、約５と約１５の間の炭素原子を含む。さらなる実施形態において、部分Ｌ^１は、約１０と約２０の間の炭素原子を含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約５０ｇ／ｍｏｌ～約１０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態において、部分Ｌ^１は、約４０ｇ／ｍｏｌ～約４００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態において、部分Ｌ^１は、約５０ｇ／ｍｏｌ～約３００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態において、部分Ｌ^１は、約５０ｇ／ｍｏｌ～約２５０ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約０．５ｎｍと約７０ｎｍの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約０．５ｎｍと約６０ｎｍの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約０．５ｎｍと約５０ｎｍの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約０．５ｎｍと約４０ｎｍの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、約１ｎｍと約４０ｎｍの間の範囲の長さを有する。

【0131】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約４０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約３０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、１と約２０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。

【0132】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約４０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約３０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約２０の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルケニル基またはヘテロアルケニル基である。

【0133】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約４０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約３０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、２と約２０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含む置換または非置換のアルキニル基またはヘテロアルキニル基である。

【0134】

上記のように、部分Ｌ^１は、切断することができる１つまたは複数の基、例えば、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨで切断可能な基を含む。部分Ｌ^１は切断可能な基を含むが、それが結合している核酸塩基から部分Ｌ^１全体が除去されることを意味するものではない。むしろ、部分Ｌ^１内の切断部位は、切断後に部分Ｌ^１の一部が核酸塩基に結合したままであることを確実にするように部分Ｌ^１内の任意の位置に位置することができる。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーの使用によって、式（ＩＡ）のヌクレオチドまたはヌクレオシドにさらに結合し任意の成分がその後に除去され得ることが確実になる。いくつかの実施形態において、切断可能な基は、酸、塩基、求核剤、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素等への曝露を含む任意の適切な方法によって切断し得る。適切な切断可能な基の非限定的な例としては、ジスルフィド基、α－アジドエーテル、ニトロベンジル系基、およびフェナシル基が挙げられる。適切な切断可能な基の他の非限定的な例は、本明細書にさらに記載されている。利用され得る切断可能な基または切断可能な基のクラスのさらに他の例としては、米国特許第９，６０５，３１０号、第７，４１４，１１６号および第７，０５７，０２６号に記載されているものが挙げられ、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0135】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^１は、一般構造－［リンカー］－［切断可能な基］－［リンカー］－を有し、ここで、各［リンカー］は同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、約１～４５の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約３５の間の炭素原子を有し、１つまたは分枝岐鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約２５の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約２０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約１０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族部分または芳香族部分である。

【0136】

いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約４５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約３５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約２５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約２０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約１０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルケニル基またはヘテロアルケニル基である。いくつかの実施形態において、－［切断可能なリンカー］－は、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨで切断可能な基である。

【0137】

いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約４５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約３５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約２５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約２０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２と約１０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキニル基またはヘテロアルキニル基である。いくつかの実施形態において、－［切断可能なリンカー］－は、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨで切断可能な基である。

【0138】

いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約４５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約３５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約２５の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約２０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約１０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、－［切断可能なリンカー］－は、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨで切断可能な基である。

【0139】

いくつかの実施形態において、反応性基Ｚ^１は、反応性基の対の第１のメンバーである。例えば、本明細書中にさらに記載されるように、Ｚ^１は、第２の反応性基メンバーＺ^２と直交して反応する第１の反応性基メンバー、例えば、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかを有し、本明細書中に記載されるコンジュゲートの反応性基メンバーＺ^２であってもよい。

【0140】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、「クリックケミストリー」反応に関与することができる反応性基を含む。「クリックケミストリー」反応に関与するのに適した適切な反応性官能基（例えば、互いに反応性である官能基の対）の例を以下の表１に示す。一的般に、「クリックケミストリー」は、範囲が広く、化学収率が高く、無害な副生成物を生成し、化学特異的で、単純な反応条件を必要とし、すぐに利用できる出発物質および試薬を使用する、無溶媒であるか温和な溶媒（水など）を使用しているため、生成物の分離が容易であり、単一の反応生成物との反応に有利な大きな熱力学的駆動力を持ち、および／またはアトムエコノミー（ａｔｏｍ ｅｃｏｎｏｍｙ）が高い、モジュラーアプリケーションを持つ反応を促進する。特定の一般的な基準は本質的に主観的なものである可能性があるが、全ての基準を満たす必要はない。

【0141】

「クリックケミストリー」は、ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＭｅｌｄａｌのグループによって独自に定義された化学哲学であり、小さなユニットを結合することによって物質を迅速かつ確実に生成するように調整された化学を説明する。「クリックケミストリー」は、信頼性が高く自律的な有機反応のコレクションに適用されている（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ）．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４－２０２１）。例えば、水中での信頼性の高い分子結合としての銅触媒によるアジド－アルキン［３＋２］環化付加の特定（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６－２５９９）は、生体分子相互作用のいくつかのタイプの調査を補強するために使用されてきた（Ｗａｎｇ，Ｑ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２－３１９３；Ｓｐｅｅｒｓ，Ａ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，４６８６－４６８７；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１１６４－１１１６５；Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１７８２－１１７８３）。さらに、有機合成（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，９５８８－９５８９）、創薬（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ２００３，８，１１２８－１１３７；Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，１０５３－１０５７）、および表面の官能化（Ｍｅｎｇ，Ｊ．－Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４３，１２５５－１２６０；Ｆａｚｉｏ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１４３９７－１４４０２；Ｃｏｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００４，ＡＳＡＰ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｌｕｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ，Ｔ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００４，印刷中）への応用も登場している。

【0142】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、Ｃｕ（Ｉ）触媒アジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）を受けることができる反応性基（例えば、Ｍｅｌｄａｌ ｅｔ．ａｌ．，’’Ｃｕ－Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ａｚｉｄｅ－Ａｌｋｙｎｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ，’’Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２００８，１０８，８，２９５２－３０１５参照）を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、銅を含まない歪み促進アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）を受けることができる反応性基を含む。いくつかの実施形態では、Ｚ^１は、キレート化支援酢酸Ｃｕ（ＩＩ）促進アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を受けることができる反応性基を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、逆要請ディールス－アルダー環化付加反応（例えば、テトラジン歪みアルケンクリックケミストリー）を受けることができる反応性基を含む。

【表1】

表１：反応性官能基対の第１および第２のメンバー。

【0143】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、結合事象に関与することができる反応性基を含む。結合事象の例としては、オリゴヌクレオチドの互いへのハイブリダイゼーション、ハプテンの抗体またはそのバリアントへの結合、およびホスト－ゲスト分子相互作用（すなわち、ホスト分子とゲスト分子との相互作用）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0144】

したがって、いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、特異的結合実体を含む。本明細書で使用される場合、「特異的結合実体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、反応混合物または試料中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^－１大きい、少なくとも１０^４Ｍ^－１大きい、または１０^５Ｍ^－１大きい結合定数を有し得る）。

【0145】

いくつかの実施形態において、特異的結合実体は、タンパク質、例えば、抗体、抗体断片、レクチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）およびプロテインＡである。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ハプテン抗体である。

【0146】

他の実施形態において、特異的結合実態は、ハプテンである。本明細書で使用される場合、「ハプテン」は、抗体と特異的に結合することができるが、典型的には、担体分子との組合せを除いて免疫原性であることが実質的に不可能である小分子である。ハプテンの非限定的な例としては、ピラゾール（例えばニトロピラゾール）；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素（例えば、フェニル尿素）；チオ尿素（例えばフェニルチオ尿素）；ロテノンおよびロテノン誘導体；オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）；およびチアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）；クマリンおよびクマリン誘導体；およびシクロリグナン（例えば、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ハプテンは、ベンゾフランハプテンおよびチアゾールスルホンアミドハプテンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ハプテンは、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド（ＮＰ）、２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド（ＴＳ）、７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（ＤＣＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン、３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド、および２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド（ＢＦ）から選択される。本開示での使用に適した他のハプテンとしては、米国特許第８，８４６，３２０号、第８，６１８，２６５号；第７，６９５，９２９号；第８，４８１，２７０号；および第９，０１７，９５４号に記載のものが挙げられ、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３と約３０の間のヌクレオチド長、すなわち、約３ｍｅｒと約３０ｍｅｒの間である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３～約２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３～約２０ヌクレオチド長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３～約１６ヌクレオチド長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３～約１２ヌクレオチド長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約３～約１０ヌクレオチド長である。さらに他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約４～約６ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは５～６ヌクレオチド長である。適切なオリゴヌクレオチド配列の非限定的な例を以下の表２に示す。

【表2】

表２：オリゴヌクレオチド配列の非限定的な例。

【0148】

いくつかの実施形態において、配列番号１～２２および２９～５０（表２に列挙）はＬＮＡ配列である。他の実施形態において、配列番号２３～２８および５１～５６（表２に列挙）はＤＮＡ配列である。

【0149】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の「鏡像」、「Ｌ構成」または「Ｌ形態」モノマー（例えば、Ｌ－デオキシリボースから構成されるモノマー）を含む。Ｌ形態モノマーから構成されるオリゴヌクレオチドは、天然に存在するβ－Ｄ－構成核酸、例えば配列決定されるＤＮＡ分子、配列決定プライマー等に結合しないと考えられる。β－Ｌ－構成オリゴヌクレオチドは、そのβ－Ｄ－構成オリゴヌクレオチド対応物と同じ物理化学的特徴（例えば、溶解度、二本鎖安定性、対形成選択性）を特徴とする。しかしながら、Ｌ－構成オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ消化に対して安定であり、左手型二本鎖を形成する。追加のタイプのモノマーは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３（２１），８１７４－８１７５；ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｉｓｓｕｅ １３、１９９２年７月１１日、頁３３２５－３３３２に開示されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0150】

他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ塩基を含む。さらに他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の融解温度（Ｔｍ）増強核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、Ｔｍ増強核酸塩基は、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シトシン、７－プロピニル－７－デアザアデニン、７－プロピニル－７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザ－７－ブロモ－グアニン、および７－デアザ－８－アザ－７－ブロモ－２－アミノ－アデニンから選択される。

【0151】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは「ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」である。「ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」は、１つまたは複数のＬＮＡモノマー（「ロック核酸」モノマー）で完全にまたは部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。したがって、「ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」は、全体がＬＮＡモノマーから構成されていてもよく、または「ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」は、１つのＬＮＡモノマー、２つのＬＮＡモノマー等を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ＬＮＡモノマー」という用語は、リボース環が２’－酸素と４’－炭素との間のメチレン結合によって拘束されている、すなわち２’位と４’位との間に共有結合架橋（２’－４’架橋）を含むヌクレオチド等の、配座が制限されたヌクレオチドアナログのクラスを指す。いくつかの実施形態において、ＬＮＡは、天然に存在する核酸に高親和性で結合する、そのベータ－Ｄ－構成で適用される。α－Ｌ－ＬＮＡも記載されており、また、天然に存在する核酸と高い親和性で対を形成する。α－Ｌ－ＬＮＡとは対照的に、β－Ｌ－ＬＮＡは、天然に存在する核酸には結合せず、β－Ｌ－ＤＮＡまたはβ－Ｌ－ＬＮＡのようなβ－Ｌ－構成核酸にのみ結合する。ＬＮＡモノマーは、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，７９４，４９９号、米国特許第７，０３４，１３３号にさらに記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ロック核酸誘導体の合成は、米国特許第８，４９２，３９０号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに他のモノマーは、ＰＣＴ公開番号、国際公開第９８／３９３５２号、同第９９／１４２２６号および同第２０００６６６０４号に開示されており、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0152】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドに１つまたは複数のＬＮＡモノマーを組み込むことにより、二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を上昇させることによって、オリゴヌクレオチドの相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ標的に対する親和性が上昇する。いくつかの実施形態において、二重鎖の熱安定性は、オリゴヌクレオチド中に存在するＬＮＡモノマーあたり、実際の塩基に応じて、約３℃と約８℃の間の範囲で上昇する（Ｄｗａｉｎｅ Ａ．ＢｒａａｓｃｈおよびＤａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（２００１）１－７を参照のこと）。ＤＮＡ／ＬＮＡミクスマーと比較して、全ＬＮＡ二重鎖は非常に安定な二重鎖を形成する。したがって、非常に短い配列を結合対として使用することができる。いくつかの実施形態において、非常に短い配列の使用は、ヌクレオチドにおける修飾を可能な限り小さく保ち、ポリメラーゼによる取り込み効率を最小限に低下させることができるので、有利であると考えられる。さらに、β－Ｌ－ＬＮＡは、Ｄ－構成核酸（例えば、配列決定されるＤＮＡを用いて）を妨害しないというさらなる利点を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、全体がＬＮＡモノマーで構成され、例えば、３～１２のＬＮＡモノマー、４～８のＬＮＡモノマー、または５～６のＬＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｚ^１基は、ＬＮＡモノマーを含み、配列番号１～２２のいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチド配列を含み得る。当業者は、導入された任意のコンジュゲート（本明細書に記載）が、ＬＮＡモノマーを含み、配列番号２９～５０のいずれか一つの配列を有する相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むことを理解するであろう。例えば、ヌクレオチドが配列番号１９を有するオリゴヌクレオチドを含むＺ^１基を含む場合、導入されたコンジュゲートは相補的な配列、すなわち配列番号４７を有する。いくつかの実施形態において、第１および第２のオリゴヌクレオチド配列を交換することができ、すなわち、Ｚ^１基は、ＬＮＡモノマーを含み、配列番号２９～５０のいずれか１つの配列を有するオリゴヌクレオチド配列を含み得、次いで、導入された任意のコンジュゲートは、ＬＮＡモノマーを含み、配列番号１～２２のいずれか１つの配列を有する相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは「ＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」である。「ＰＮＡ修飾オリゴヌクレオチド」は、１つまたは複数のＰＮＡモノマー（「ペプチド核酸」モノマー）で完全にまたは部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。ＰＮＡモノマーは、天然の核酸の糖リン酸骨格が、通常はＮ－（２－アミノ－エチル）－グリシン単位から形成される合成ペプチド骨格によって置換され、アキラルで電荷を帯びていない模倣物をもたらすヌクレオチドアナログのクラスを指す。ＰＮＡは電荷を含まないため、ＰＮＡとＤＮＡとの間の結合ハイブリダイゼーションは、同じ配列についてのＤＮＡとＤＮＡとの間の結合ハイブリダイゼーションよりも強いと考えられる。ＬＮＡ／ＬＮＡ二本鎖と同様に、ＰＮＡ／ＰＮＡ二本鎖は高い二本鎖安定性を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、全体がＰＮＡモノマーで構成され、例えば、３～１２のＰＮＡモノマー、４～８のＰＮＡモノマー、または５～６のＰＮＡモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。例として、オリゴヌクレオチドは、６のＰＮＡモノマーを含み得、配列５’－ｃｔｇｔｃａ－３’（配列番号４）を有し得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のγ－ＰＮＡモノマーで構成される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド中の１または複数のＰＮＡモノマーは、荷電部分（例えばリジン基）等でそのγ炭素において置換されていてもよい。

【0155】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１は、ホスト分子またはゲスト分子（すなわち、ホスト／ゲストシステムの１つのメンバー）のうちの１つを含む。ホスト－ゲストシステムは、やや大きなホスト分子の空洞に嵌合し、引力非共有結合力（例えば、水素結合および／またはファンデルワールス引力）によってそこに保持された小さなゲスト分子を含む。異なる種類のホスト－ゲストシステムは、多様な結合配座および広範囲の結合親和性を示す。

【0156】

いくつかの実施形態において、ホスト分子はククルビット［ｎ］ウリル化合物であり、ゲスト分子は、ククルビット［ｎ］ウリル化合物の空洞内に存在し得る任意の化合物である。いくつかの実施形態において、ククルビット［ｎ］ウリル化合物は、ククルビット［６］ウリル、ククルビット［７］ウリルまたはククルビット［８］ウリルである。他のホスト化合物としては、カリックスアレーン、例えばカリックス［４］アレーンが挙げられる。

【0157】

いくつかの実施形態において、ゲスト分子はアミノアダマンタンである。いくつかの実施形態において、ゲスト分子は、ジカチオン性フェロセン誘導体（例えば、ビス（トリメチルアンモニオメチル）フェロセン）である。他の実施形態において、ゲスト分子はジカチオン性Ｎ－アダマンチルエチレンジアミンである。さらに他の実施形態において、ホスト分子は、β－シクロデキストリン等のシクロデキストリンである。

【0158】

本開示で使用するのに適したさらに他のホスト／ゲスト分子は、米国特許出願公開第２００５／００８００６８号、同第２００９／００７２１９１号、同第２０１０／０２４７４７７号および同第２０１７／００２８３７４号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに他のホスト／ゲスト分子が、Ｒｅｋｈａｒｓｋｙ ｅｔ．ａｌ．，’’Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｏｓｔ－ｇｕｅｓｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｃｈｉｅｖｅｓ ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｙ ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ－ｅｎｔｒｏｐｙ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ，’’ＰＮＡＳ，２００７年１２月２６日、ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．５２，２０７３７－２０７４２；Ｍｏｇｈａｄｄａｍ ｅｔ．ａｌ．，「Ｈｏｓｔ－Ｇｕｅｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌｉｇａｎｄ－ｌｉｋｅ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９年，１３１，１１，４０１２－４０２１；Ｓｏｎｚｉｎｉ ｅｔ．ａｌ．，「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｗｉｔｈｉｎ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｃｕｃｕｒｂｉｔ［８］ｕｒｉｌ Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ」、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｖｏｌ．５５，Ｉｓｓｕｅ ４５、２０１６年１１月；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ．ａｌ．，「Ａ ｓｔｙｒｙｌ ｂａｓｅｄ ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ａ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ」、Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｓｓｕｅ ２８，２０１９年；Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，「Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ｏｆ ｇｕｅｓｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃａｌｉｘ［４］ａｒｅｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．６５，Ｉｓｓｕｅ ３５、２００９年８月、７２５９－７２６７にさらに記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0159】

いくつかの実施形態において、ＰＧは、分子（例えば、式（ＩＡ）のいずれか等の他のヌクレオチド）の取り込みが式（ＩＡ）のヌクレオチドの３’位で反応するのを妨げる任意の保護基であるが、ここで、ＰＧ基は、（例えば、さらなるヌクレオチドの取り込みによって重合が起こることを可能にするために）規定の条件下で除去され得る。適切な保護基の非限定的な例としては、アジドメチル、３’－Ｏ－アリル（３’－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ＝ＣＨ_２）、３’－ニトレート（３’－Ｏ－ＮＯ_２）、３－ジチオメチル（３’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｓ－Ｓ－Ｒ）、３’－Ｏ－シアノエチル（３’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）および３’－Ｏ－シアノエトキシメチル（３’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）が挙げられる。さらなる追加の保護基は、米国特許第５，９９０，３００号；米国特許出願公開第２０１５／０１４０５６１号および同第２００７／０１１７１０４号；およびＰＣＴ公開国際公開２００８／０３７５６８号および国際公開第９１／０６６７８号に開示されており、それらの開示はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。またさらなる保護基は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／６６６７０に開示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／６６６７０には、例えば、式－Ｂ（ＯＲ^１）（ＯＲ^２）を有する保護基が記載されており、式中、Ｒ^１およびＲ^２は、－Ｈ、メチル、またはエチルから独立して選択される。

【0160】

いくつかの実施形態において、本開示によるヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＢ）：

【化9】

【0161】

［式中、

【0162】

Ｙは、－ＯＨ、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）［－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－オリゴヌクレオチドであり、ここで、ｚは０または１～５の範囲の整数であり；

【0163】

ＰＧは保護基であり；

【0164】

Ｗは核酸塩基であり；

【0165】

Ｑ^１は、１～２５の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分であり；

【0166】

Ｑ^２は、１～４５の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり；

【0167】

Ｘ^１は切断可能な基であり；かつ

【0168】

Ｚ^１は、反応性基である］
によって定義される構造を有する。

【0169】

いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_２５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。他の実施形態では、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_８直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。他の実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ４直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。

【0170】

いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_３～Ｃ_４シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６ヘテロシクロアルキル基を含む。

【0171】

いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_２５置換または非置換のアルケニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_１２置換または非置換のアルケニル基を含む。他の実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_６置換または非置換のアルケニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_２５置換または非置換のアルキニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_１２置換または非置換のアルキニル基を含む。他の実施形態において、Ｑ^１は、Ｃ_２～Ｃ_６置換または非置換のアルキニル基を含む。

【0172】

いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_４５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_３５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_２５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。他の実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。さらに他の実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_１５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_１０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。

【0173】

いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_３～Ｃ_６シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_３～Ｃ_４シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６ヘテロシクロアルキル基を含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_２～Ｃ_４５置換または非置換のアルケニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_２～Ｃ_２５置換または非置換のアルケニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_２～Ｃ_４５置換または非置換のアルキニル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^２は、Ｃ_２～Ｃ_２５置換または非置換のアルキニル基を含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、Ｑ^１および／またはＱ^２のいずれかは、独立して、ポリエチレンオキシド部分またはポリプロピレンオキシド部分を含み得る。例えば、Ｑ^１および／またはＱ^２のいずれかは、基－［ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ］_ｓ－を含んでもよく、ここで、ｓは１～約２７の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｓは１～１２の範囲である。例えば、Ｑ^２は、基－［ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ］_ｓ－を含んでもよく、ここで、ｓは、１～約２７の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｓは１～約１２の範囲である。

【0176】

いくつかの実施形態において、Ｑ^１および／またはＱ^２は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７アリール基を含む。他の実施形態において、Ｑ^１および／またはＱ^２のいずれかは、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６アリール基を含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１は、任意の光切断可能、酵素的に切断可能、化学的に切断可能、ｐＨ感受性等の基であり得る。例えば、Ｘ^１は、約２００ｎｍと約４００ｎｍ（ＵＶ）の間または約４００ｎｍと約８００ｎｍ（可視）の間の波長を有する電磁放射線源への曝露時に切断され得る基である。適切な光切断可能な基の例としては、アリールカルボニルメチル基（例えば、４－アセチル－２－ニトロベンジル、ジメチルフェナシル（ＤＭＰ））；２－（アルコキシメチル）－５－メチル－α－クロロアセトフェノン、２，５－ジメチルベンゾイルオキシラン、ベンゾイン基（例えば、３’，５’－ジメトキシベンゾイン（ＤＭＢ））、ｏ－ニトロベンジル基（例えば、１－（２－ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、１－（メトキシメチル）－２－ニトロベンゼン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）、α－カルボキシニトロベンジル（α－ＣＮＢ））；ｏ－ニトロ－２－フェネチルオキシカルボニル基（例えば、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニルおよび２－ニトロ－２－フェネチル誘導体）；ｏ－ニトロアニリド（例えば、アシル化５－ブロモ－７－ニトロインドリン）；クマリン－４－イル－メチル基（例えば、７－メトキシクマリン誘導体）；９－置換キサンテンおよびアリールメチル基（例えば、ｏ－ヒドロキシアリールメチル基）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0178】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１は、約７００ｎｍと約１０００ｎｍの間の波長を有する電磁放射線源に曝露されると切断され得る基である。適切な近赤外光切断可能な基としては、Ｃ_４－ジアルキルアミン置換ヘプタメチンシアニンを含むシアニン基が挙げられる。

【0179】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１は、還元剤を含む異なる化学反応物質によって、またはｐＨの誘導された変化（例えば、約７未満のｐＨにおける基Ｘ^１の切断）によって化学的に切断され得る基である。化学的に切断可能な基の非限定的な例としては、ジスルフィド系基；ジアゾベンゼン基（例えば、２－（２－アルコキシ－４－ヒドロキシ－フェニルアゾ）；安息香酸骨格；エステル結合系基；および酸性感受性基（例えば、ジアルコキシジフェニルシラン基またはアシルヒドラゾン基）が挙げられる。求電子的に切断された基（例えば、ｐ－アルコキシベンジルエステルおよびｐ－アルコキシベンジルアミド）は、プロトンによって切断され、酸に感受性の切断を含むと考えられている。

【0180】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１は、トリプシン切断可能な基およびＶ８プロテアーゼによって切断可能な基を含むがこれらに限定されない、酵素的に切断され得る基である。いくつかの実施形態において、基は、ウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ、ＲＮａｓｅ Ａ、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはＴＥＶ－プロテアーゼの１つによって酵素的に切断され得る。

【0181】

いくつかの実施形態において、基Ｗ、Ｚ^１、Ｑ^１、Ｘ^１、およびＱ^２は、Ｃ－Ｃ結合、アミド結合、エステル結合、尿素結合、ウレタン結合、アミン結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸結合、１，２，３－トリアゾール結合、またはジヒドロピリダジン結合等の化学結合を介して結合される。例として、合成中、Ｑ^１は、Ｘ^１の対応する反応性官能基（例えば、アミン反応性基、カルボン酸反応性基、またはチオール反応性基）へ結合するための第１の反応性官能基（例えば、アミン反応性基、カルボン酸反応性基、またはチオール反応性基）を含み得る。いくつかの実施形態において、アミン反応性基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、酸塩化物、例えば塩化スルホニル、アルデヒド、エポキシドおよびオキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、およびそれらの組合せを含む。適切なチオール反応性官能基としては、ハロアセチルおよびハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、チオール－ジスルフィド交換試薬、例えばピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオールおよびジスルフィド還元剤、ならびにそれらの組合せが挙げられる。カルボキシレート反応性官能基としては、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール化合物、およびカルボジイミドが挙げられる。ヒドロキシル反応性官能基としては、エポキシドおよびオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネートまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、過ヨウ素酸塩酸化化合物、酵素酸化、アルキルハロゲンおよびイソシアネートが挙げられる。アルデヒドおよびケトン反応性官能基としては、ヒドラジン、シッフ塩基、還元的アミノ化生成物、マンニッヒ縮合生成物、およびそれらの組合せが挙げられる。活性水素反応性化合物としては、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合生成物、ヨウ素化反応生成物、およびその組合せが挙げられる。光反応性化学官能基としては、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾホノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体、およびその組合せが挙げられる。

【0182】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかを有するヌクレオチドの非限定的な例を以下に示す。

【化10-1】

【化10-2】

【化10-3】

【0183】

コンジュゲート

【0184】

本開示はまた、式（ＩＡ）および（ＩＢ）のヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（またはその任意の塩）と反応することができるコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：

【化11】

【0185】

［式中、

【0186】

Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；

【0187】

Ｌ^２は、結合または、１～６０の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分であり；

【0188】

Ｚ^２は、反応性基であり；かつ

【0189】

ｐは、２～約１０００の範囲である］
によって定義される構造を有する。

【0190】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＡ）に関して、検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含むコンジュゲートは、単一のＺ^２反応性基のみで、例えば基Ｌ^２を介して官能化される。他の実施形態において、式（ＩＩＢ）に関して、２つ以上のＺ^２反応性基は、単一の検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含む単一のコンジュゲートにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、ｐは、２～約５００の範囲である。他の実施形態において、ｐは２～約２５０の範囲である。さらに他の実施形態において、ｐは２～約１５０の範囲である。さらなる実施形態において、ｐは２～約１００の範囲である。なおさらなる実施形態において、ｐは２～約６０の範囲である。なおさらなる実施形態において、ｐは２～約３０の範囲である。

【0191】

いくつかの実施形態において、Ｚ^２は、反応性基の対の第２のメンバーである。例えば、Ｚ^２は、式（ＩＡ）および（ＩＢ）のいずれかのヌクレオチドの第１の反応性基メンバーＺ^１等の第１の反応性基メンバーＺ^１と特異的に反応する、すなわち直交性に反応する第２の反応性基メンバーであり得る。いくつかの実施形態において、Ｚ^２は、部分Ｚ^１に関して本明細書に記載される反応性基のいずれかから選択される。例えば、Ｚ^１がクリックコンジュゲートの対の第１のメンバーを含む場合、Ｚ^２はクリックコンジュゲートの対の第２のメンバーを含み、ここで、クリックコンジュゲートの対の第２のメンバーはクリックコンジュゲートの対の第１のメンバーと反応性である。他の例として、Ｚ^１が第１のオリゴヌクレオチドを含む場合、Ｚ^２は第２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドと相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。さらに他の例では、Ｚ^１がハプテンを含む場合、Ｚ^２は抗ハプテン抗体を含む。さらなる例において、Ｚ^１がホスト分子を含む場合、Ｚ^２はホスト分子と相互作用することができるゲスト分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^２は、Ｚ^１に関して本明細書に記載される化合物のいずれかから選択される。

【0192】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１と約５０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１と約４０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、２と約３０の間の炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、部分Ｌ^２は、約５と約２０の間の炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、部分Ｌ^２は、約５と約１５の間の炭素原子を含む。さらなる実施形態において、部分Ｌ^２は、約１０と約２０の間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、約２０ｇ／ｍｏｌ～約７５０ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態において、部分Ｌ^２は、約２０ｇ／ｍｏｌ～５００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。さらに他の実施形態において、部分Ｌ^２は、約２０ｇ／ｍｏｌ～２５０ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。

【0193】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、ビオチン（５－［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソ－１，３，３ａ，４，６，６ａ－ヘキサヒドロチエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル］ペンタン酸）またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ^２は、構造：Ｌ^４－Ｌ^５－を有し、ここで、Ｌ^４はビオチンまたはその誘導体であり、Ｌ^５は、１～約５０の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、Ｌ^５は、１～約２０の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族部分である。いくつかの実施形態において、Ｌ^５は、１つまたは複数の切断可能な基を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ^２はビオチンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、Ｌ^２は、少なくとも部分的にビオチンに由来する。いくつかの実施形態において、Ｌ^２は、結合である。

【0194】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１つまたは複数の切断可能な基、例えば、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨにおいて切断可能な基を含んでもよい。部分Ｌ^２が切断可能な基を含む実施形態において、切断可能な基は、部分Ｌ^２内の任意の位置に位置することができる。部分Ｌ^２が切断可能な基を含む実施形態において、切断可能な基は、Ｌ^１またはＸ^１に関して本明細書に記載されるもののいずれか（例えば、ジスルフィドまたはα－アジドエーテル）を含み得る。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１つの切断可能な基を含む。他の実施形態において、部分Ｌ^２は、切断可能な基を含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は存在せず、すなわち、Ｌ^２は結合である。

【0195】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１と約４０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含んでもよい、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１と約３０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含んでもよい、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、１と約２０の間の炭素原子を有し、１つまたは複数の切断可能な基を含んでもよい、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基である。

【0196】

いくつかの実施形態において、部分Ｌ^２は、一般構造－［リンカー］_ｔ－［切断可能な基］_ｕ－［リンカー］_ｖ－を有し、式中、各［リンカー］は、同じであっても異なっていてもよく、式中、ｔ、ｕおよびｖは、独立して、０または１～約５の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｔ、ｕおよびｖは、独立して、０または１～約４の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｔ、ｕおよびｖは、独立して、０または１～約３の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｔ、ｕおよびｖは、独立して、０または１～２の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１～約３０の炭素原子を含んでいてもよく、各［リンカー］は、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、２～約２０の炭素原子を含んでいてもよく、各［リンカー］は、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、３～約１５の炭素原子を含んでいてもよく、各［リンカー］は、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約２０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、各［リンカー］は、独立して、１と約１０の間の炭素原子を有する置換もしくは非置換アルキル基またはヘテロアルキル基である。いくつかの実施形態において、－［切断可能なリンカー］－は、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、および特定のｐＨで切断可能な基を含む。

【0197】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含むコンジュゲートは、検出することができる任意の化学基または分子であり得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含むコンジュゲートは、磁気ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、常磁気、超常磁気または強磁気であり得る磁気材料から形成される。いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、構造が結晶性、多結晶性、または非晶質である強磁気材料から形成される。例えば、磁気ナノ粒子のコアは、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＦｅＯＦｅ_２Ｏ_３、ＮｉＯＦｅ_２Ｏ_３、ＣｕＯＦｅ_２Ｏ_３、ＭｇＯＦｅ_２Ｏ_３、ＭｎＢｉ、ＭｎＳｂ、ＭｎＯＦｅ_２Ｏ_３、Ｙ_３Ｆｅ_５Ｏ_１２、ＣｒＯ_２、ＭｎＡｓ、ＳｍＣｏ、ＦｅＰｔ、またはそれらの組合せ等の材料を含み得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、磁気ナノ粒子は、受動金属と磁気金属との複合材または合金であるコア材料を含む。いくつかの実施形態において、受動金属はＡｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＣｕから選択され、磁気金属はＦｅおよびＣｏから選択される。ナノ粒子コアはまた、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｚｎ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄおよびＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金から形成されてもよい。他の非限定的な磁気ナノ粒子は、米国特許出願公開第２００６／０２３３７１２号および第２００３／００６８１８７号；ＰＣＴ公開番号国際公開第０３／０７３４４４号、同第０２／０９３１４０号および同第０２／３２４０４号；米国特許第６，５３１，３０４号、同第６，５１４，４８１号、同第６，２５４，６６２号、同第８，５５７，６０７号、同第９，６２３，１２６号および同第９，７０７，２９８４号に記載されており、これらの開示は各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0198】

いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、高い磁気異方性を有するものを含み得る。高い磁気異方性を有する磁気ナノ粒子の例としては、Ｆｅ３Ｏ４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドへの化学的結合を促進するために、粒子を合成し、ＳｉＯ２でコーティングすることができる。例えば、Ｍ．Ａｓｌａｍ，Ｌ．Ｆｕ，Ｓ．Ｌｉ，ａｎｄ Ｖ．Ｐ．Ｄｒａｖｉｄ，「Ｓｉｌｉｃａ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＦｅＰｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９０，Ｉｓｓｕｅ ２，２００５年１０月１５日、ｐｐ．４４４－４４９を参照されたい。高い磁気異方性を有する磁気ナノ粒子の例としては、ＦｅＯ、Ｆｅ_３Ｏ_４、ＦｅＰｔ、ＦｅＰｄおよびＣｏＰｔが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドへの化学的結合を促進するために、粒子を合成し、ＳｉＯ_２でコーティングすることができる（例えば、Ｍ．Ａｓｌａｍ，Ｌ．Ｆｕ，Ｓ．Ｌｉ，ａｎｄ Ｖ．Ｐ．Ｄｒａｖｉｄ，「Ｓｉｌｉｃａ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＦｅＰｔ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９０，Ｉｓｓｕｅ ２、２００５年１０月１５日、ｐｐ．４４４－４４９参照、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0199】

いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、１つまたは複数のＬ^２基に（例えば共有結合を介して）直接結合される。他の実施形態において、磁気ナノ粒子は、コンジュゲートに間接的に結合される。例えば、いくつかの実施形態において、磁気ナノ粒子は、複数のアビジンおよび／またはストレプトアビジン分子で官能化された表面を含み得る。いくつかの実施形態において、アビジンおよび／またはストレプトアビジン分子で官能化された磁気ナノ粒子は、ビオチン分子またはビオチン分子の誘導体を含むＬ^２基と反応（例えば非共有結合的に）し得る。

【0200】

いくつかの実施形態において、コンジュゲートに（直接的または間接的に）結合した磁気ナノ粒子は、磁気センサアレイで検出することができる任意の磁気ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態において、コンジュゲートに（直接的または間接的に）結合された磁性ナノ粒子は、複数の磁気センサ（例えば、線形アレイで構成されたもの）を含む磁気センサアレイで検出することができる任意の磁気ナノ粒子を含んでいてもよく、複数の磁気センサの各々は少なくとも１つのアドレス線に結合されている。いくつかの実施形態において、複数の磁気センサの少なくとも１つの特性を検出するために、少なくとも１つのアドレス線に磁場が印加される。いくつかの実施形態において、検出された特性は、検出可能な磁気ナノ粒子（例えば、本明細書中にさらに記載されるように、ヌクレオチド、オリゴ－／ポリヌクレオチドに、またはヌクレオチド－コンジュゲート複合体の一部として結合したもの）の存在を示す。磁気ナノ粒子を含む標識ヌクレオチドおよび／または形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体（それぞれ本明細書に記載）を検出するための適切な磁気センサアレイは、同時係属中の米国仮特許出願第６２／８３３，１３０号に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0201】

いくつかの実施形態において、検出可能な標識「Ｄ」は蛍光分子を含む。フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類縁体）、ローダミン、オキサジン（レゾルフィンを含む）、ＢＯＤＩＰＹ、発光団およびシアニンを含むいくつかの一般的な化学クラスに属する。蛍光分子の追加例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，第１１版に記載されている。他の実施形態では、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、およびテトラピロール誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮおよびＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６ＧおよびＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡは、例えばＰｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）から市販されており、テキサスレッドは、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）から市販されている。いくつかの実施形態において、シアニンファミリーの色素としては、例えば、ＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５およびＣＹ７が挙げられ、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）から市販されている。

【0202】

他の実施形態において、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、ＡｔｔｏおよびＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹ ａｎｄ ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ ｄｙｅｓ（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ およびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣ、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓから入手可能）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。

【0203】

本明細書中に記載されるコンジュゲートに結合される検出可能な標識および標識系のさらに他の種類としては、量子ドット、表面増強ラマン散乱粒子、散乱金属ナノ粒子、ＦＲＥＴシステム、固有蛍光、非蛍光発色団、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識等が挙げられる。そのような検出可能な標識は、当技術分野で一般的に知られており、米国特許第６，３９９，３３５号、第５，８６６，３６６号、第７，４７６，５０３号、および第４，９８１，９７７号にさらに記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。適切な化学発光剤は、米国特許第７，２５６，２９９号および第４，３６３，７５９号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。化学発光剤の他の例は、アクリジニウムエステルである。

【0204】

いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、式（ＩＩＣ）、（ＩＩＤ）または（ＩＩＥ）：

【化12】

【0205】

［式中、

【0206】

Ｄは、検出可能な標識または検出可能な標識を含むコンジュゲートであり；

【0207】

Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、１～３０の炭素原子を有し、１つまたは複数のヘテロ原子で置換されていてもよい、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族部分または芳香族の部分であり；

【0208】

Ｘ^２は切断可能な基であり；

【0209】

Ｚ^２は、反応性基であり；

【0210】

ｎは０または１～３の範囲の整数であり；

【0211】

ｍおよびｏは、それぞれ独立して、０または１であり、

【0212】

ｒは１～３の範囲の整数であり；かつ

【0213】

ｐは２～約１０００の範囲の整数である］
のいずれかによって定義される構造を有する。

【0214】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＣ）および（ＩＩＤ）に関して、検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含むコンジュゲートは、単一のＺ^２反応性基のみで官能化される。他の実施形態において、式（ＩＩＤ）に関して、２つ以上のＺ^２反応性基は、単一の検出可能な標識または検出可能な標識「Ｄ」を含む単一のコンジュゲートにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、ｐは、２～約５００の範囲である。他の実施形態において、ｐは２～約２５０の範囲である。さらに他の実施形態において、ｐは２～約１５０の範囲である。さらなる実施形態において、ｐは２～約１００の範囲である。なおさらなる実施形態において、ｐは２～約６０の範囲である。なおさらなる実施形態において、ｐは２～約３０の範囲である。

【0215】

いくつかの実施形態において、Ｘ^２は、部分Ｘ^１に関して本明細書に記載される切断可能な基のいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、ｎは、０である。他の実施形態において、ｎは１～３の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、１である。

【0216】

いくつかの実施形態では、部分Ｑ^３は、ビオチン（５－［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソ－１，３，３ａ，４，６，６ａ－ヘキサヒドロチエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル］ペンタン酸）またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３はビオチンに由来する。

【0217】

いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立してＣ_１～Ｃ_２５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立してＣ_１～Ｃ_２０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。さらに他の実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_１５直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_１０直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。特定の実施形態において、Ｑ３および／またはＱ４は、二重結合または三重結合を含み得る。

【0218】

なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は独立して、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は独立して、Ｃ_１～Ｃ_６直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基またはヘテロアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は独立して、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分枝鎖の、置換または非置換のアルキル基を含む。なおさらなる実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は独立して、Ｃ_１～Ｃ_４直鎖または分枝鎖のアルキル基を含む。

【0219】

いくつかの実施形態において、Ｑ^３および／またはＱ^４は、独立して、ポリエチレンオキシド部分またはポリプロピレンオキシド部分を含む。例えば、Ｑ^３および／またはＱ^４は、独立して、基－［ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ］_ｓ－を含んでもよく、ここで、ｓは１～約２７の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｓは１～約１２の範囲である。例えば、Ｑ^３および／またはＱ^４は、独立して、基－［ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ］_ｓ－を含んでもよく、ここで、ｓは１～約２７の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、ｓは１～１２の範囲である。

【0220】

いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７アリール基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６アリール基を含む。

【0221】

いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６シクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｑ^３およびＱ^４は、独立して、置換または非置換のＣ_５～Ｃ_６ヘテロシクロアルキル基を含む。

【0222】

当業者は、基Ｄ、Ｚ^２、Ｑ^３、Ｘ^２、およびＱ^４が、Ｃ－Ｃ結合、アミド結合、エステル結合、尿素結合、ウレタン結合、アミン結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸結合、１，２，３－トリアゾール結合、またはジヒドロピリダジン結合等の化学結合を介して結合されることを理解するであろう。例えば、合成中、Ｄは、Ｑ^３の対応する反応性官能基（例えば、アミン反応性基、カルボン酸反応性基、またはチオール反応性基）へ結合するための第１の反応性官能基（例えば、アミン反応性基、カルボン酸反応性基、またはチオール反応性基）を含み得る。結合に適した他の反応性官能基は、本明細書に記載されている（例えば、表１を参照されたい）。

【0223】

式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかを有するコンジュゲートの非限定的な例を以下：

【化13-1】

【化13-2】

に示し、式中、ｎは２～１０００の範囲である。

【0224】

ヌクレオチドとコンジュゲートとの間の直交反応

【0225】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）の適切に官能化されたヌクレオチドは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）の対応する適切に官能化されたコンジュゲートと直交性に反応し得る。本明細書で述べるように、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の異なるヌクレオチドおよび式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）の異なるコンジュゲートは各々、互いに直交性に反応する反応性基（Ｚ^１およびＺ^２）の対を含み得る。例えば、式（ＩＡ）の第１のヌクレオチドは、反応性基の第１の対の第１のメンバーである第１の反応性基を含み得る。同様に、式（ＩＩＡ）の第１のコンジュゲートは、反応性基の第１の対の第２のメンバーである第２の反応性基を含み得る。第１の反応性基の対の第１のメンバーを有する第１のヌクレオチドを、第１の反応性基の対の第２のメンバーを有する第１のコンジュゲートと接触させると、第１の反応性基の対の第１および第２のメンバーは、互いに直交性に反応し得、本明細書にさらに記載されるように、式（ＩＩＩ）を有するもの等の化合物または中間体を提供し得る。

【0226】

当業者は、各々が異なるＺ^１部分を含む式（ＩＡ）の異なるヌクレオチドが開発され得ることを理解するであろう。これに関して、異なるＺ^１部分を有する各々の異なるヌクレオチドは、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）のいずれか１つの適切に官能化されたコンジュゲート、すなわちＺ^１部分と選択的に反応することができるＺ^２部分を有するものと選択的に反応することができる。例えば、第１のヌクレオチドは、第１のＺ^２部分Ｚ^２Ａを有する第１のコンジュゲートと選択的に反応する第１のＺ^１部分Ｚ^１Ａを有していてもよく；第２のヌクレオチドは、第２のＺ^２部分Ｚ^２Ｂを有する第２のコンジュゲートと選択的に反応する第２のＺ^１部分Ｚ^１Ｂを有していてもよく；第３のヌクレオチドは、第３のＺ^２部分Ｚ^２Ｃを有する第３のコンジュゲートと選択的に反応する第３のＺ^１部分Ｚ^１Ｃを有していてもよく；第４のヌクレオチドは、第４のＺ^２部分Ｚ^２Ｄを有する第４のコンジュゲートと選択的に反応する第４のＺ^１部分Ｚ^１Ｄを有し得る。

【0227】

この例にさらに続いて、第１、第２、第３および第４のヌクレオチド（部分Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ、Ｚ^１Ｄを有する）の各々は、異なる核酸塩基、例えばＡ、Ｇ、ＣおよびＴを含み得る。このようにして、以下に示すように、各々が異なる反応性官能基（Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ、Ｚ^１Ｄ）および異なる核酸塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）を含む４つの異なるヌクレオチドを提供することができる：

【0228】

ヌクレオチド１：核酸塩基（Ｗ）＝Ａであり；ここで、Ｚ^１＝Ｚ^１Ａである

【0229】

ヌクレオチド２：核酸塩基（Ｗ）＝Ｇであり；ここで、Ｚ^１＝Ｚ^１Ｂである

【0230】

ヌクレオチド３：核酸塩基（Ｗ）＝Ｃであり；ここで、Ｚ^１＝Ｚ^１Ｃである

【0231】

ヌクレオチド４：核酸塩基（Ｗ）＝Ｔであり；ここで、Ｚ^１＝Ｚ^１Ｄである

【0232】

次いで、この例におけるヌクレオチド１～４の各々を、Ｚ^２Ａ、Ｚ^２Ｂ、Ｚ^２ＣまたはＺ^２Ｄ部分のうちの１つを有する４つの異なるコンジュゲートのうちの１つと独立して選択的に反応させることができる：

【0233】

コンジュゲート１：Ｚ^２＝Ｚ^２Ａであり、ここで、Ｚ^２ＡはＺ^１Ａと反応する反応性基である

【0234】

コンジュゲート２：Ｚ^２＝Ｚ^２Ｂであり、ここで、Ｚ^２ＢはＺ^１Ｂと反応する反応性基である

【0235】

コンジュゲート３：Ｚ^２＝Ｚ^２Ｃであり、ここで、Ｚ^２ＣはＺ^１Ｃと反応する反応性基である

【0236】

コンジュゲート４：Ｚ^２＝Ｚ^２Ｄであり、ここで、Ｚ^２ＤはＺ^１Ｄと反応する反応性基である

【0237】

式（ＩＡ）および（ＩＢ）の異なるヌクレオチドと式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）の適切に官能的なコンジュゲートとの間の直交反応性を、本明細書において配列決定の観点からさらに記載する。

【0238】

キット

【0239】

いくつかの実施形態において、本開示は、各々が異なる核酸塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を有し、各々が異なるＺ^１部分をさらに有する４つの異なるヌクレオチドを含むキットを提供する。本開示はまた、式（ＩＡ）～（ＩＢ）の１つまたは複数のヌクレオチドおよび／または式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの１つまたは複数のコンジュゲートを含むキットを提供する。

【0240】

いくつかの実施形態において、キットは、式（ＩＣ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＤ）の１つのヌクレオチド、式（ＩＥ）の１つのヌクレオチド、および式（ＩＦ）の１つのヌクレオチド：

【化14】

【0241】

［式中、Ｙ、ＰＧおよびＬ^１は本明細書で定義される通りであり；Ｗ^Ａはアデニン核酸塩基であり、Ｗ^Ｇはグアニン核酸塩基であり；Ｗ^Ｃはシトシン核酸塩基であり；Ｗ^Ｒはチミン核酸塩基またはウラシル核酸塩基であり；およびＺ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄは、各々異なる反応性基（本明細書で定義される反応性基のいずれかを含む）を含む］
を含み得る。いくつかの実施形態において、式（ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＥ）および（ＩＦ）のヌクレオチドの各々は、単一の容器またはディスペンサにおいて混合して提供し得る。いくつかの実施形態において、式（ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＥ）および（ＩＦ）のヌクレオチドの各々は、別個の容器または別個のディスペンサにおいて提供し得る。

【0242】

いくつかの実施形態において、キットは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの３つまたは４つの異なるコンジュゲートをさらに含んでいてもよく、異なるコンジュゲートの各々は、部分Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ、およびＺ^１Ｄの１つと直交性に反応する部分Ｚ^２を含む。例えば、キットは、式（ＩＩＦ）、（ＩＩＧ）、（ＩＩＨ）および（ＩＩＩ）：

【化15】

【0243】

［式中、ＤおよびＬ^２は本明細書で定義される通りであり、Ｚ^２Ａ、Ｚ^２Ｂ、Ｚ^２Ｃ _、およびＺ^２Ｄは各々異なる反応性基を含み、Ｚ^２ＡはＺ^１Ａと選択的に反応し_、Ｚ^２ＢはＺ^１Ｂと選択的に反応し、Ｚ^２ＣはＺ^１Ｃと選択的に反応し、Ｚ^２ＤはＺ^１Ｄと選択的に反応する］のコンジュゲートのうち少なくとも３つをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＡ）の異なるコンジュゲートの各々は、別個の容器またはディスペンサ中に提供される。いくつかの実施形態において、キット中の異なるコンジュゲートの各々は、同じ標識を有する。他の実施形態において、キット中の異なるコンジュゲートの各々は、異なる標識を有する。同様に、いくつかの実施形態において、異なるコンジュゲートの各々は、同じＬ^２部分を含む。他の実施形態において、異なるコンジュゲートの各々は、異なるＬ^２部分を有する。「Ｄ」が磁気ナノ粒子である実施形態において、Ｌ^２－Ｚ^２Ａ、Ｌ^２－Ｚ^２Ｂ、Ｌ^２－Ｚ^２Ｃ、Ｌ^２－Ｚ^２Ｄは、式（ＩＩＢ）、（ＩＩＤ）、および（ＩＩＥ）のいずれか１つのように、２回以上存在し得る。

【0244】

ヌクレオチド－コンジュゲート複合体

【0245】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）のヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（またはその塩）を、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの適切なコンジュゲートと反応させて、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体を得ることができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、本明細書にさらに記載されるように、新生核酸鎖内に取り込まれる。例えば、本明細書にさらに記載されるように、式（ＩＩＡ）のコンジュゲートが、新生核酸鎖に取り込まれた式（ＩＡ）のヌクレオチド等の式（ＩＡ）のヌクレオチドと反応すると、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体が形成され得る。一般的に、形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、式（ＩＩＩ）：

【化16】

【0246】

［式中、Ｙ、ＰＧ、Ｗ、Ｌ^１、Ｌ^２およびＤの各々は、本明細書で定義される通りであり、Ｔは、反応性基Ｚ^１（式（ＩＡ）参照）とＺ^２（式（ＩＢ）参照）の間の「反応」の生成物を表す。当業者は、基Ｗ、Ｌ^１、Ｔ、Ｌ^２、およびＤが、Ｃ－Ｃ結合、アミド結合、エステル結合、尿素結合、ウレタン結合、アミン結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸結合、１，２，３－トリアゾール結合、またはジヒドロピリダジン結合などの化学結合を介して互いに結合し得ることを理解するであろう。種々の部分を結合するのに適した他の種類の化学結合が本明細書にさらに記載されている。

【0247】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、（部分Ｌ^１またはＬ^２のいずれかの中にあり得る）少なくとも１つの切断可能な基を含む。他の実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、少なくとも２つの切断可能な基（例えば、Ｌ^１内の１つの切断可能な基およびＬ^２内の他の切断可能な基）を含む。

【0248】

いくつかの実施形態において、反応性基間の「反応」の生成物は、新しい部分を含むか、または２つの分子間の相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、ハイブリダイゼーション）を表す。例えば、Ｔは、２つの反応性官能基（例えば、「クリックケミストリー」反応に関与することができる２つの異なる官能基の反応）の共有結合；ホスト／ゲスト分子間の水素結合および／またはファンデルワールス相互作用（例えば、ククルビット［７］ウリルとアミノアダマンタンとの間の相互作用）；２つの相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（例えば、第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な第２のオリゴヌクレオチドとの間；または、少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む第１のオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な少なくとも１つのＬＮＡモノマーを含む第２のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション）；および／または２つの特異的結合実体間（例えば、ハプテンと抗ハプテン抗体との間）の相互作用の生成物を表し得る。

【0249】

いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、スキーム１（同様に、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、新生核酸内に取り込まれる）に示されるように、ＳＢＳ中に生成される中間体である。（本明細書にさらに記載する）ＳＢＳ技術は一般的に、鋳型鎖に対するヌクレオチドの順次付加による新生核酸鎖の酵素的伸長を伴う。これに関して、スキーム１は、配列決定される核酸鋳型にハイブリダイズした新生核酸鎖等の単一の新生核酸鎖の伸長を示す。ここで、新生核酸は、式（ＩＡ）のヌクレオチド等のヌクレオチドの順次導入および取り込みを通して伸長される。さらに、スキーム１は、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つを有する適切に官能化されたコンジュゲートの導入による式（ＩＩＩ）の２つの異なる検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を示す。

【化17】

スキーム１：式（ＩＩＩ）の異なる検出可能な種の形成を含む、式（Ｉ）のヌクレオチドの新生核酸鎖への順次導入の説明。

【0250】

より具体的には、スキーム１は、新生核酸鎖に結合したヌクレオチド１（第１の核酸塩基「Ｗ^Ａ」を有する式（ＩＡ）の第１のヌクレオチド）を示し、ここでヌクレオチド１は、新生核酸鎖のさらなる伸長を防ぐための保護基（「ＰＧ」）を含む。工程１０において、取り込まれたヌクレオチド１とのみ反応性である式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートが導入され得る。例えば、ヌクレオチド１は、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１の導入されたコンジュゲートのＺ^２Ａ部分とのみ反応性であるＺ^１Ａ部分を含み得る。ヌクレオチド１と式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つのコンジュゲートとの間の反応は、検出可能な標識「Ｄ」を含む第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体２を提供する。第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体２が形成され、検出された後、検出可能な標識「Ｄ」および保護基「ＰＧ」の両方を除去して（工程１１）、取り込まれたヌクレオチド３を得ることができる。

【0251】

例えば、システアミンを使用して、硝酸塩基を含む切断可能な基を化学的に切断することができる。同様に、３’－Ｏ－アリル基は、Ｐｄ触媒脱アリル混合物を使用して脱アリルし得る。他の例として、いくつかの実施形態において、試料に可視、紫外線、または赤外線を照射して、切断可能な基Ｌ^１および／またはＬ^２を光化学的に切断する。切断可能な基が切断されると、基Ｌ^１の断片である基Ｌ^３が残る。いくつかの実施形態において、保護基は、検出可能な標識の切断前、切断後、または切断と同時に、取り込まれたヌクレオチドから除去される（工程１１）。ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）を使用して、Ｌ^１および／またはＬ^２のアジドメチル保護基およびα－アジドエーテル結合を化学的に切断し得る。

【0252】

保護基「ＰＧ」の切断に続いて、他のヌクレオチド４（第２の核酸塩基「Ｗ^Ｇ」を有する式（ＩＡ）の第２のヌクレオチド）を新生核酸鎖に取り込むことができる（工程１２）。いくつかの実施形態において、核酸塩基４は、新生核酸鎖のさらなる伸長を防ぐための保護基（「ＰＧ」）を含む。工程１３において、取り込まれたヌクレオチド４とのみ反応性である式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートが導入され得る。例えば、ヌクレオチド４は、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２の導入されたコンジュゲートのＺ^２Ｂ部分とのみ反応性であるＺ^１Ｂ部分を含み得る。ヌクレオチド４と式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つのコンジュゲートとの間の反応は、検出可能な標識「Ｄ」を含む第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体５を提供する。式（ＩＡ）のヌクレオチドの取り込み、式（ＩＩＩ）のヌクレオチド－コンジュゲート複合体（取り込まれたヌクレオチドに対応するもの等）の形成、および形成された式（ＩＩＩ）のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の検出の工程を繰り返してもよい（工程１４）。

【0253】

ＳＢＳ

【0254】

上述のように、ＳＢＳ技術は、テンプレート鎖分子に対するヌクレオチドの順次付加による新生核酸コピー鎖の酵素的伸長を伴う。いくつかの実施形態において、ＳＢＳは、酵素（例えばポリメラーゼ）によって各新生核酸コピー鎖に単一の塩基のみが付加され得るように、可逆的ターミネータ（例えば、式（ＩＡ）のヌクレオチドの保護基）を含むヌクレオチドを利用する。いくつかの実施形態において、配列決定反応は、固体表面上に広がった非常に多数（例えば数百万）の異なる鋳型核酸分子に対して同時に行われる。いくつかの実施形態において、配列決定される核酸鋳型鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのアナログから構成され得る。いくつかの実施形態では、鋳型核酸の供給源は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または天然供給源由来の他の核酸であり得る。いくつかの実施形態において、そのような供給源に由来する鋳型核酸は、使用前に増幅され得る。配列決定方法および配列決定プロセス中に使用される材料を含むＳＢＳの他の態様は、例えば、ＰＣＴ出願公開番号、国際公開第９１／０６６７８号、同第２００５／０２４０１０号、同第２００６／１２０４３３号、同第２００５／０６５８１４号および同第２００６／０６４１９９号、米国特許第９，６０５，３１０号および第９，４４１，２７２号；米国特許出願公開第２０１９／００２４１６２号明細書に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0255】

上記スキーム１は、式（ＩＩＩ）のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を例示しているが、スキームは、単一の新生鎖に沿って起こる化学、したがって単一の標的ポリヌクレオチドのみの配列決定を例示するものである。しかしながら、当業者は、複数（例えば数百万）の異なる標的（または同じ増幅された標的）ポリヌクレオチドの配列が同時に決定され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、複数のセンサ（例えば、架橋増幅）の各々の中にクローン増幅があり得る。これらの実施形態では、単一のセンサまたは複数のセンサ上に複数の同一の核酸鎖が存在し得る。

【0256】

本開示は、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成が検出されるＳＢＳの方法を提供する。これらの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の連続的に形成された異なるサブセットの検出は、ヌクレオチド組込みの各サイクル中に複数の標的ポリヌクレオチド分子のそれぞれの相補体に取り込まれた異なるヌクレオチドの順次決定を可能にする。したがって、本明細書に記載の方法によって、各反復伸長中にヌクレオチド－コンジュゲート複合体が順次形成され検出されるために、大規模並列配列決定が可能になる。

【0257】

本開示は、標的ポリヌクレオチド分子を配列決定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＢＳの方法であって、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセット（式（ＩＩＩ）のサブセット等）が複数の新生核酸コピー鎖の各反復伸長中に順次形成および検出され、各新生核酸コピー鎖が複数の標的ポリヌクレオチド分子のうちの１つに相補的である、方法を提供する。いくつかの実施形態において、複数の標的ポリヌクレオチド分子は、固体支持体上に配列される。いくつかの実施形態において、固体支持体はフローセルである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、本明細書にさらに記載されるように、新生核酸鎖内に取り込まれる。

【0258】

いくつかの実施形態において、方法は、４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを新生核酸コピー鎖の各々に取り込むことによって各新生核酸コピー鎖を伸長することを最初に含む。いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドの各々は、（ｉ）保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドは、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含む。当業者は、異なる新生核酸鎖が各々独立して、対応する相補的標的ポリヌクレオチド分子の配列に応じて異なるヌクレオチドで伸長され得ることを理解するであろう。

【0259】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の４つの異なるヌクレオチドのプールを導入することによって新生核酸コピー鎖に取り込まれ、４つの異なるヌクレオチドの各々は、異なる核酸塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）および異なるＺ^１部分を含む。他の実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのプールを導入することによってヌクレオチドを取り込み、ここで、第１のヌクレオチドは式（ＩＣ）を有し、第２のヌクレオチドは式（ＩＤ）を有し、第３のヌクレオチドは式（ＩＥ）を有し、および第４のヌクレオチドは式（ＩＦ）を有し、ただし、反応性基Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄはそれぞれ異なる。

【0260】

次に、異なるサブセットのヌクレオチド－コンジュゲート複合体が順次形成される（例えば新生核酸内で形成される）。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の任意の単一サブセット内の各々の形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来する。いくつかの実施形態において、検出可能な標識を含む異なるコンジュゲートを順次導入することによって、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットが順次形成され、ここで、導入された異なるコンジュゲートの各々は、新生核酸コピー鎖内に取り込まれたヌクレオチドの１つのみと直交反応性である。例えば、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの少なくとも３つの異なるコンジュゲートを順次導入してもよく、ここで、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの少なくとも３つの異なるコンジュゲートの各異なるコンジュゲートは、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の４つの取り込まれたヌクレオチドのうちの１つのみと直交して反応する。式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの異なるコンジュゲートの逐次添加および式（ＩＡ）または（ＩＢ）の異なる取り込まれたヌクレオチドとのそれらの直交反応性を考えると、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成および検出は、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドの特定を容易にする。結果として、各々の対応する相補的な標的ポリヌクレオチド分子の配列を決定することができる。当業者は、上記のプロセスが１つまたは複数のサイクル、すなわち新生核酸コピー鎖の１つまたは複数の伸長の間繰り返され得ることを理解するであろう。

【0261】

図１Ａおよび図１Ｂは、複数の標的ポリヌクレオチド分子を含む核酸ライブラリーを配列決定する方法を示す。いくつかの実施形態において、ＳＢＳは、固体支持体上に配列された複数の異なる標的ポリヌクレオチドを用いて実施し得る。例えば、複数の標的ポリヌクレオチドは、リンカー分子を介して固体支持体上に固定化されても、または固体支持体に結合し得る粒子に結合してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＢＳは、配列決定のために複数の異なる標的ポリヌクレオチド分子のライブラリーがロードされたフローセルを利用し得る。例えば、フローセルは、配列決定のための数百万の標的ポリヌクレオチド分子を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸配列決定ライブラリーは、ｇＤＮＡ試料を断片化し、生成された断片の末端にアダプターをライゲーションすることによって調製され得る。次いで、ライブラリーをフローセルにロードし、断片をフローセル表面にハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態において、各結合断片は、架橋増幅によってクローンクラスタに増幅され得る。固体支持体、フローセルおよび配列決定ライブラリーの調製は、米国特許出願公開第２０１０／００１１１７６８号およびＰＣＴ公開国際公開第２０１９／１２６０４０号、同第２０１８／１１９０５３号、および同第２０１８／１１９１０１号にさらに開示されており、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0262】

核酸ライブラリーが調製され、固体支持体上に配列された後、４つの異なるヌクレオチドのうちの１つが、固体支持体上に存在する各々の相補的な新生核酸コピー鎖に取り込まれ（工程１０１）、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々は、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドは、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、式（ＩＡ）の４つの異なるヌクレオチドのプールをフローセルに導入することによって取り込まれ、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々は、異なる核酸塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）および異なるＺ^１部分を含む。いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドは、式（ＩＣ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第２は、式（ＩＤ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第３は、式（ＩＥ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第４は式（ＩＦ）の構造を有し、ただし、反応性基Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは各々異なる。いくつかの実施形態において、反応性基Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄの各々は、異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。

【0263】

各新生核酸コピー鎖が４つの異なるヌクレオチドのうちの１つで伸長された後（工程１０１）、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットが順次形成され（ステップ１０２）、順次形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来する（例えば、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、新生核酸内に取り込まれる）。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成する工程は、３回行われる。他の実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成する工程は、４回行われる。

【0264】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成（工程１０２）は：検出可能な標識を含み、相補的な新生核酸コピー鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入すること（工程１１０）；導入された各コンジュゲートの標識を検出することによって、サブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を検出すること（工程１１１）；サブセット内の各々の検出されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の固体支持体内の位置を決定すること（工程１１２）；サブセット内で形成された検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々から少なくとも検出可能な標識を場合により切断すること（工程１１３）を含む。いくつかの実施形態において、導入された各々のコンジュゲートは、取り込まれたヌクレオチドの１つに結合したオリゴヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む反応性基を含む。

【0265】

当業者は、上記プロセスが、固体支持体上の複数の標的ポリヌクレオチド分子に相補的な新生核酸コピー鎖の単一伸長のためのものであることを理解するであろう。次いで、このプロセスを、固体支持体上の複数の標的ポリヌクレオチド分子に相補的な新生核酸コピー鎖の反復伸長ごとに繰り返すことができる。相補的な新生核酸コピー鎖をさらに伸長し得る前に（すなわち、別のサイクルが実行される前に）、３’－ヒドロキシル保護基を、工程１０１で取り込まれた４つの異なるヌクレオチドから切断しなければならない（工程１０３）。さらに、検出可能な標識がまだ切断されていない場合、検出可能な標識は、次の伸長の前に切断されなければならない。いくつかの実施形態において、検出可能な標識および３’－ヒドロキシル保護基は、同じ試薬を使用して同時に切断される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成および検出は、各反復伸長中に各新生核酸鎖に取り込まれた各ヌクレオチドの決定を容易にする。

【0266】

図２Ａおよび図２Ｂは、固体支持体上に配列された複数の異なる標的ポリヌクレオチド分子等の複数の異なる標的ポリヌクレオチド分子を配列決定する本開示の方法をさらに示し、ここで、方法は、異なる取り込まれたヌクレオチドを、標識を有する異なるコンジュゲートで順次標識することを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体は、配列決定される核酸ライブラリーがロードされたフローセルである。いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのうちの１つが、最初に、固体支持体上に存在する各々の新生核酸コピー鎖に取り込まれ（工程２０１）、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々は、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドは、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の４つの異なるヌクレオチドのプールをフローセルに導入することによって取り込まれ、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々は、異なる核酸塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）および異なるＺ^１部分を含む。

【0267】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドは、式（ＩＣ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第２は、式（ＩＤ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第３は、式（ＩＥ）の構造を有し；４つの異なるヌクレオチドのうちの第４は式（ＩＦ）の構造を有し、ただし、反応性基Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１ＣおよびＺ^１Ｄは各々異なる。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄ基の各々は、異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄ基の各々は、異なるＬＮＡ就職オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ _、およびＺ^１Ｄ基のいずれか１つの異なるＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１～２２または配列番号２９～５０のいずれかの配列を有し、そのベータ－Ｌ－構成で用いられる。

【0268】

続いて、新生核酸鎖の各々に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの少なくとも３つを順次標識する（工程２０２）。いくつかの実施形態において、新生核酸鎖の各々に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの少なくとも３つは、３つの異なるコンジュゲート、例えば式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかを有する３つの異なるコンジュゲートを順次導入することによって順次標識される。いくつかの実施形態において、新生核酸鎖の各々に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの４つは全て、４つの異なるコンジュゲート、例えば式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかを有する４つの異なるコンジュゲートを順次導入することによって順次標識される。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかの各々の異なる導入されたコンジュゲートは、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの１つのみと直交性に反応する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートの各々は、オリゴヌクレオチドを含む反応性部分を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートの各々は、ＬＮＡ－修飾オリゴヌクレオチドを含む反応性部分を有する。いくつかの実施形態において、導入されたコンジュゲートの異なるＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２９～５０または配列番号１～２２のいずれかの配列を有し、ただし、コンジュゲートに対して選択される任意のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド配列は、取り込まれたヌクレオチドのＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド配列の１つに相補的である。

【0269】

例えば、Ｚ^１Ａが配列番号６を有するオリゴヌクレオチドを含む場合、コンジュゲートは配列番号３４を有する相補的オリゴヌクレオチドを含む。他の例として、Ｚ^１Ｂが配列番号１９を有するオリゴヌクレオチドを含む場合、コンジュゲートは配列番号４７を有する相補的オリゴヌクレオチドを含む。例えば、Ｚ^１Ｃが配列番号４を有するオリゴヌクレオチドを含む場合、コンジュゲートは配列番号３２を有する相補的オリゴヌクレオチドを含む。例えば、Ｚ^１Ｄが配列番号３１を有するオリゴヌクレオチドを含む場合、コンジュゲートは配列番号３を有する相補的オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、コンジュゲートの各々は、同じ検出可能な標識（例えば、同じ磁気ナノ粒子）を含む。他の実施形態において、コンジュゲートの少なくとも１つは、他のコンジュゲートに結合した検出可能な標識とは異なる検出可能な標識を含む。

【0270】

このようにして、異なるサブセットのヌクレオチド－コンジュゲート複合体（式（ＩＩＩ）を有するもの等）が標識プロセスによって順次形成され、独立して検出される。異なるコンジュゲートの順次付加および異なる取り込まれたヌクレオチドとのそれらの直交反応性を考えると、異なる取り込まれたヌクレオチドの順次標識によって、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドの固体支持体またはフローセル内の位置の順次決定が可能になる。

【0271】

図２Ｂを参照すると、いくつかの実施形態において、各々の順次標識（工程２０２）は、検出可能な標識を含み、相補的な核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入して、１つまたは複数の標識ヌクレオチドを提供すること（工程２１０）；１つまたは複数の標識ヌクレオチドの標識を検出すること（工程２１１）；検出された標識に基づいて、固体支持体またはフローセル内の１つまたは複数の標識ヌクレオチドの位置を特定すること（工程２１２）；および場合により、１つまたは複数の標識ヌクレオチドから少なくとも検出可能な標識を切断すること（工程２１３）を含む。いくつかの実施形態において、順次標識の工程（工程２０２）は、３つの異なるコンジュゲートを用いて（例えば、検出可能な標識された取り込まれたヌクレオチドの３つの異なるセットを形成するために）３回行われる。他の実施形態において、順次標識の工程（工程２０２）は、４つの異なるコンジュゲートを用いて（例えば、検出可能な標識された取り込まれたヌクレオチドの４つの異なるセットを形成するために）４回行われる。

【0272】

当業者は、上記プロセス（工程２０１および２０２）が、固体支持体上またはフローセル内の複数の標的ポリヌクレオチド分子に相補的な新生核酸コピー鎖の単一伸長のためのものであることを理解するであろう。次いで、このプロセスを、固体支持体上の複数の標的ポリヌクレオチド分子に相補的な新生核酸コピー鎖の反復伸長ごとに繰り返すことができる。相補的な新生核酸コピー鎖をさらに伸長し得る前に（すなわち、別のサイクルが実行される前に）、３’－ヒドロキシル保護基を、工程２０１で取り込まれた４つの異なるヌクレオチドから切断しなければならない（工程２０３）。さらに、まだ切断されていない任意の残存している検出可能な標識は、次の伸長の前に切断されなければならない。いくつかの実施形態において、３’－ヒドロキシル保護基および検出可能な標識は、同じ試薬の導入によって除去される。

【0273】

図３を参照すると、いくつかの実施形態において、本開示は、固体支持体上の複数の異なる標的ポリヌクレオチド分子を配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｉ）４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、複数の標的ポリヌクレオチドの各々の相補的な核酸鎖に取り込むことを含み、ここで、４つの異なるヌクレオチドの各々は、切断可能なリンカーおよび３’－ヒドロキシル保護基を介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含む（工程３０１）。いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドは、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかに示される構造を有する。

【0274】

続いて、方法は、（ｉｉ）検出可能な標識を有する第１のコンジュゲートを導入することによって、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第１を標識することを含み、第１のコンジュゲートは、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第１と直交反応性である（工程３１０）。いくつかの実施形態において、第１のコンジュゲートは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートのいずれかの構造を有する。図３に示すように、４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドはアデニン核酸塩基を含み、したがって、第１のコンジュゲートは取り込まれたアデニンヌクレオチドのみと反応性である。いくつかの実施形態において、第１のコンジュゲートの導入は、検出可能である第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成をもたらす。

【0275】

次に、方法は、（ｉｉｉ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドの標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドが組み込まれている相補的な核酸鎖の固体支持体内の位置を決定することを含む（工程３１１）。次いで、方法は、（ｉｖ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドから検出可能な標識を切断してもよいことを含む（工程３１２）。次いで、このプロセスは、異なる取り込まれたヌクレオチド、例えば工程３０１で取り込まれたヌクレオチドの少なくとも２つ以上について繰り返される。

【0276】

いくつかの実施形態において、方法は、（ｖ）検出可能な標識を有する第２のコンジュゲートを導入することによって、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドを標識することを含み、第２のコンジュゲートは、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドと直交反応性である（工程３２０）。いくつかの実施形態において、第２のコンジュゲートは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートのいずれかの構造を有する。図３に示すように、４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドはグアニン核酸塩基を含み、したがって、第２のコンジュゲートは取り込まれたグアニンヌクレオチドのみと反応性である。いくつかの実施形態において、第２のコンジュゲートの導入は、検出可能である第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成をもたらす。

【0277】

次に、方法は、（ｖｉ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドの標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドが取り込まれている相補的な核酸鎖の固体支持体内の位置を決定することを含む（工程３２１）。次いで、方法は、（ｖｉｉ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドから検出可能な標識を切断してもよいことを含む（工程３２２）。

【0278】

いくつかの実施形態において、方法は、（ｖｉｉｉ）検出可能な標識を有する第３のコンジュゲートを導入することによって、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドを標識することを含み、第３のコンジュゲートは、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドと直交反応性である（工程３３０）。いくつかの実施形態において、第３のコンジュゲートは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートのいずれかの構造を有する。図３に示すように、４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドはシトシン核酸塩基を含み、したがって、第３のコンジュゲートは取り込まれたシトシンヌクレオチドのみと反応性である。いくつかの実施形態において、第３のコンジュゲートの導入は、検出可能である第３のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成をもたらす。

【0279】

次に、方法は、（ｉｘ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドの標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドが取り込まれている相補的な核酸鎖の固体支持体内の位置を決定することを含む（工程３３１）。いくつかの実施形態において、方法は、（ｘ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドから検出可能な標識を切断してもよいこと（工程３３２）をさらに含む。

【0280】

いくつかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドが取り込まれている相補的な核酸鎖の固体支持体内の位置は、推論によって決定される。例えば、第１、第２および第３の取り込まれたヌクレオチドの位置を知ることによって（例えば、上に列挙した工程によって）、第４の取り込まれたヌクレオチドの位置は、まだ検出されていない位置を特定することによって決定し得る。

【0281】

いくつかの実施形態において、方法は、（ｘｉ）検出可能な標識を有する第４のコンジュゲートを導入することによって、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドを標識することを含み、第４のコンジュゲートは、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドと直交反応性である（工程３４０）。いくつかの実施形態において、第４のコンジュゲートは、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれかのコンジュゲートのいずれかの構造を有する。図３に示すように、４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドはチミンまたはウラシル核酸塩基を含み、したがって、第４のコンジュゲートは取り込まれたチミンまたはウラシルヌクレオチドのみと反応性である。いくつかの実施形態において、第４のコンジュゲートの導入は、検出可能である第４のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成をもたらす。いつくかの実施形態において、方法は、（ｘｉｉ）取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドの標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドが取り込まれている相補的な核酸鎖の固体支持体内の位置を決定することを含む（工程３４１）。いくつかの実施形態において、次いで、検出可能な標識を切断してもよい（工程３４２）。

【0282】

いくつかの実施形態において、方法は、取り込まれたヌクレオチドの各々から３’－ヒドロキシル保護基を除去すること（工程３０２）、例えば、工程（ｉ）で取り込まれたヌクレオチドの全てから３’－ヒドロキシル保護基を除去すること（工程３０２参照）をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法はまた、まだ切断されていない残存する任意の検出可能な標識を除去することを含む。他の実施形態において、任意の残存する検出可能な標識は、３’－ヒドロキシル保護基と同時に除去される。いくつかの実施形態において、少なくとも工程（ｉ）～（ｉｘ）が、例えば各サイクルについて繰り返される。他の実施形態において、少なくとも工程（ｉ）～（ｘ）が、例えば各サイクルについて繰り返される。他の実施形態において、工程（ｉ）～（ｘｉｉ）が繰り返される。

【0283】

図４Ａは、核酸コピー鎖の伸長中に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドの順次特定を示す。特に、図４Ａは、核酸コピー鎖伸長中に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの少なくとも３つの順次標識および検出を示す。いくつかの実施形態において、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドのうちの少なくとも３つの順次標識は、少なくとも３つの異なるヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を提供し、ここで、各々の異なる形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、異なる取り込まれたヌクレオチドに由来する。

【0284】

いくつかの実施形態において、図４ＡのパネルＡを参照すると、４つの異なるヌクレオチドのプール（式（ＩＡ）のもの等）が最初にフローセルに添加される。パネルＡに示されるように、これらの４つの異なるヌクレオチドの各々は、４つの異なる新生核酸鎖（標識された「鎖１」、「鎖２」、「鎖３」および「鎖４」）の１つに取り込まれる。パネルＡにさらに示されるように、４つの取り込まれたヌクレオチドの各々は、導入されたコンジュゲート（式（ＩＩＡ）を有するもの等）の異なるＺ^２部分（Ｚ^２Ａ、Ｚ^２Ｂ、Ｚ^２Ｃ、Ｚ^２Ｄ）と直交性に「反応」することができる異なるＺ^１部分（Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ、Ｚ^１Ｄ）を含む。さらに、４つの異なる取り込まれたヌクレオチドの各々は、異なる核酸塩基、ここではＡ、Ｇ、ＣおよびＴを含む。この特定の例では、ヌクレオチドのＺ^１Ａ部分がコンジュゲートのＺ^２Ａ部分と反応性であり；ヌクレオチドのＺ^１Ｂ部分がコンジュゲートのＺ^２Ｂ部分と反応性であり；ヌクレオチドのＺ^１Ｃ部分がコンジュゲートのＺ^２Ｃ部分と反応性であり；ヌクレオチドのＺ^１Ｄ部分がコンジュゲートのＺ^２Ｄ部分と反応性であると仮定する。

【0285】

続いて、この例ではＺ^２Ｂ部分を含む第１のコンジュゲートである第１のコンジュゲート（式（ＩＩＡ）の第１のコンジュゲート等）をフローセルに導入し得る。第１のコンジュゲートのＺ^２Ｂ部分が、鎖２に取り込まれた第１のヌクレオチドのＺ^１Ｂ部分のみと反応性であることを考えると、鎖２に取り込まれた第１のヌクレオチドのみが標識される（図４ＡのパネルＢの「星」を参照されたい）。言い換えれば、検出可能な第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体が形成され、ここで、第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、グアニン核酸塩基およびＺ^１Ｂ部分を有する第１の取り込まれたヌクレオチドに対応する。次いで、この第１の標識ヌクレオチド（または第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体）を検出して、鎖２に取り込まれたヌクレオチドの決定が可能になり得る。いくつかの実施形態において、第１の取り込まれたヌクレオチドが標識された（または第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体が形成された）後、検出可能な標識は、最初に取り込まれたヌクレオチド（または第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体）から切断されてもよい。

【0286】

次いで、伸長中に取り込まれた他のヌクレオチドの少なくとも２つが順次標識されるように、このプロセスを繰り返す。この例ではＺ^２Ｄ部分を含む第２のコンジュゲートである第２のコンジュゲート（式（ＩＩＡ）の第２のコンジュゲート等）をフローセルに導入し得る。第２のコンジュゲートのＺ^２Ｄ部分が、鎖４に取り込まれた第２のヌクレオチドのＺ^１Ｄ部分のみと反応性であることを考えると、鎖４に取り込まれた第２のヌクレオチドのみが標識される（図４ＡのパネルＣの「星」を参照されたい）。言い換えれば、検出可能な第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体が形成され、ここで、第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、チミン核酸塩基およびＺ^１Ｄ部分を有する式（ＩＡ）の取り込まれたヌクレオチドに対応する。次いで、この第２の標識ヌクレオチド（または第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体）を検出して、鎖４に取り込まれたヌクレオチドの決定が可能になり得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、第２の取り込まれたヌクレオチドの標識が検出された後で、第２の取り込まれたヌクレオチドから切断されてもよい。

【0287】

いくつかの実施形態において、この例ではＺ^２Ｃ部分を含む第３のコンジュゲートである第３のコンジュゲート（式（ＩＩＡ）の第３のコンジュゲート等）をフローセルに導入し得る。第３のコンジュゲートのＺ^２Ｃ部分が、鎖３に取り込まれた第３のヌクレオチドのＺ^１Ｃ部分のみと反応性であることを考えると、鎖３に取り込まれた第３のヌクレオチドのみが標識される（図４ＡのパネルＤの「星」を参照されたい）。言い換えれば、検出可能な第３のヌクレオチド－コンジュゲート複合体が形成され、ここで、第３のヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、シトシン核酸塩基およびＺ^１Ｃ部分を有する第３の取り込まれたヌクレオチドに対応する。次いで、この第３の標識ヌクレオチドを検出して、鎖３に取り込まれたヌクレオチドの決定が可能になり得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、第３の取り込まれたヌクレオチドの標識が検出された後で、第３の取り込まれたヌクレオチドから切断されてもよい。いくつかの実施形態において、プロセスは、鎖１に取り込まれた第４のヌクレオチを標識し、検出するために４回に行われるド（「星」が、取り込まれたアデニンヌクレオチドの標識を示す、図４ＡのパネルＥを参照されたい）。他の実施形態において、鎖１に取り込まれたヌクレオチドは、推論によって検出され得る。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、各検出後に切断されず、むしろ、３’－ヒドロキシル保護基が除去されると同時に、次の伸長の前に切断される。

【0288】

各新生核酸コピー鎖中の取り込まれたヌクレオチドの全てが特定されると、各新生核酸コピー鎖がさらに伸長され得るように、式（ＩＡ）の取り込まれたヌクレオチドのいずれかに存在する３’－ヒドロキシル保護基を除去することができる。３’－ヒドロキシル保護基の全ての除去に続いて、４つの異なるヌクレオチドのプールをその後に添加し、新生核酸コピー鎖の各々をさらに伸長することができる。再び、４つの添加されたヌクレオチドの各々は、異なる核酸塩基および式（ＩＩＡ）を有する導入されたコンジュゲートの異なるＺ^２部分（Ｚ^２Ａ、Ｚ^２Ｂ、Ｚ^２Ｃ、Ｚ^２Ｄ）と直交性に「反応」することができる異なるＺ^１部分（Ｚ^１Ａ、Ｚ^１Ｂ、Ｚ^１Ｃ、Ｚ^１Ｄ）を含む。図４ＡのパネルＦは、４つの核酸コピー鎖の第２の伸長、特に４つの核酸コピー鎖への異なるヌクレオチドの取り込みを示す。この例では、鎖１および２に取り込まれた式（ＩＡ）のヌクレオチドは両方とも同じであるが、鎖３および４に取り込まれた式（ＩＡ）のヌクレオチドは共に異なる。続いて、式（ＩＩＡ）の異なるコンジュゲートを、（例えば、上記と同じ順序で）順次添加してもよい。このプロセスは、複数の核酸コピー鎖伸長サイクルにわたって繰り返し得る。

【0289】

本開示のＳＢＳ方法を、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体（式（ＩＩＩ）を有するヌクレオチド－コンジュゲート複合体等）の異なるサブセットの順次形成および検出を示す図４Ｂを参照してさらに説明する。図４Ａは、４つの異なる新生核酸鎖への異なる取り込まれたヌクレオチド（式（ＩＡ）のもの等）の順次標識および検出を示すが、Ｂはこの概念を拡張し、並列配列決定における本開示の有用性を示す。特に、図４Ｂは、式（ＩＡ）の異なる取り込まれたヌクレオチドを有する核酸コピー鎖の異なる集団が順次標識および検出され得るような、式（ＩＩＡ）の異なるコンジュゲートの順次導入を示す。

【0290】

図４ＢのパネルＡを参照すると、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの４つの異なるヌクレオチドのプールが混合物中でフローセル４００に導入され、式（ＩＡ）の４つの異なるヌクレオチドの各々が異なる核酸塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）および異なる部分Ｚ^１を有すると仮定する。ここで、フローセル４００に提供される式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの４つの異なるヌクレオチドの各々は、個々の新生核酸鎖の各々に第１の塩基として独立して取り込まれる。この例における式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの４つの異なるヌクレオチドの取り込みは、各々の個々の新生核酸鎖の第１の伸長を表す。

【0291】

次いで、第１の伸長に続いて、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートがフローセル４００に添加され、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートは、新生核酸に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドのみと反応性である部分Ｚ^２を含む。例えば、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートは、Ｚ^１Ｂ部分を有する式（ＩＡ）の取り込まれたヌクレオチドとのみ反応性であるＺ^２Ｂ部分を含み得る。式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートの導入は、式（ＩＩＩ）の検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第１のサブセット（例えば、新生核酸内に取り込まれたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第１のサブセット）の形成をもたらす。式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第１のコンジュゲートの直交反応性を考えると、検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第１のサブセット中に形成された検出可能な第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々は、新生核酸鎖に取り込まれた式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかのヌクレオチドの１つのみに由来する。ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第１のサブセット内の１つまたは複数の形成された第１のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドが取り込まれたフローセル４００内の核酸コピー鎖の位置を決定することができる（それぞれ、パネルＡの「Ｘ」によって表す）。いくつかの実施形態において、第１のサブセットにおいて形成された第１の検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の検出可能な標識は、切断され得る（これらのヌクレオチドはもはや検出できず、したがって図４ＢのパネルＢの「－」によって表される）。次いで、このプロセスを繰り返すことができ、例えば、さらに２回繰り返すか、またはさらに３回繰り返すことができる。

【0292】

例えば、次いで、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートをフローセル４００に添加し、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートは、新生核酸に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドのみと反応性である部分Ｚ^２を含む。例えば、式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートは、Ｚ^１Ｄ部分を有する式（ＩＡ）の取り込まれたヌクレオチドとのみ反応性であるＺ^２Ｄ部分を含み得る。式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートの導入は、式（ＩＩＩ）の検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第２のサブセットの形成をもたらす。式（ＩＩＡ）～（ＩＩＥ）のいずれか１つの第２のコンジュゲートの直交反応性を考えると、検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第２のサブセット中に形成された検出可能な第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々は、新生核酸鎖に取り込まれた式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかのヌクレオチドの１つのみに由来する。ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第２のサブセット内の１つまたは複数の形成された第２のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の標識を検出することによって、４つの異なるヌクレオチドのうちの第２のヌクレオチドが取り込まれたフローセル４００内の核酸コピー鎖の位置を決定することができる（それぞれ、パネルＢの「Ｘ」によって表す）。いくつかの実施形態において、第２のサブセットにおいて形成された第２の検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の検出可能な標識は、切断され得る（これらのヌクレオチドはもはや検出できず、したがって図４ＢのパネルＣの「－」によって表される）。

【0293】

図４ＢのパネルＣおよびＤを参照すると、いくつかの実施形態において、（新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドに由来する）ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第３のサブセットおよび（新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドに由来する）ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第４のサブセットが順次形成および検出され得るように、上に列挙した工程の３回目が実施され、場合により４回目が実施される。新生核酸コピー鎖に取り込まれた４つ全ての塩基の位置が検出されると、残存している検出可能な標識が除去される。さらに、次いで、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの４つの異なる取り込まれたヌクレオチドの各々の３’－ヒドロキシル保護基を除去して、フローセル４００内の個々の新生核酸の各々の第２の伸長を促進し得る。

【0294】

他の実施形態において、（新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第３のヌクレオチドに由来する）ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の第３のサブセットのみが検出され得るように、上に列挙したプロセスを３回目のみ実施する。この特定の実施形態において、新生核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの第４のヌクレオチドは、推論によって決定し得る。例えば、フローセル４００内の新生核酸コピー鎖内に取り込まれた第１、第２および第３のヌクレオチドに対応する検出された標識の位置を知ることによって、新生核酸コピー鎖内に取り込まれた第４のヌクレオチドの位置は、標識が検出されなかった位置を特定することによって決定し得る。

【0295】

いくつかの実施形態において、複数の標的ポリヌクレオチド分子を配列決定する方法は：（ａ）流体チャンバ内の近位壁に核酸鎖を結合させること；（ｂ）１回または複数回の添加で、（ｉ）伸長可能プライマー、および（ｉｉ）核酸ポリメラーゼの複数の分子を、流体チャンバに添加すること；（ｃ）４つの異なるヌクレオチドを流体チャンバに添加し、４つの異なるヌクレオチドの各々が、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含むこと；（ｄ）複数の標的ポリヌクレオチド分子を配列決定することを含み、ここで複数の標的ポリヌクレオチド分子の配列決定は、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成することを含み、形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体は、流体チャンバに導入された異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来し、複数の標的ポリヌクレオチド分子の各々に相補的な新生核酸コピー鎖に組み込まれている。

【0296】

いくつかの実施形態において、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットの順次形成は：検出可能な標識を含み、相補的な新生核酸コピー鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入すること；導入された各コンジュゲートの標識を検出することによって、サブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を検出すること；サブセット内の各々の検出されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の固体支持体内の位置を決定すること；サブセット内で形成された検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々から少なくとも検出可能な標識を切断してもよいことを含む。

【0297】

適切なポリメラーゼのいくつかの例としては、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＢファミリー（Ｂ型）ポリメラーゼが挙げられる。

【0298】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。耐熱性核酸ポリメラーゼのとしては、サーマスアクアティカスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマスフラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ポリメラーゼ；ＴＭＡ－２５およびＴＭＡ－３０ポリメラーゼ等のサーモトガマリティマポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス種９°Ｎ（ならびにバリアントＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ）、ピュロコックスフリオスス（Ｐｆｕ）、ピュロコックスウォエセイ（ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）、テルモトガマリティマ（Ｔｍａ）およびテルモコッカスリトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（ＴｌｉまたはＶｅｎｔ）、ならびにそれらの変異体等が挙げられる。

【0299】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、検出可能な５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。５’から３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片；Ｎ末端２３５アミノ酸を欠くサーマスアクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（「Ｓｔｏｆｆｅｌ断片」）が挙げられる、米国特許第５，６１６，４９４号参照のこと。他の例としては、５’－３’ヌクレアーゼ活性を担うドメインを排除または不活性化するのに十分な欠失（例えば、Ｎ末端欠失）、変異または修飾を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。例えば、米国特許第５，７９５，７６２号を参照されたい。

【0300】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、検出可能な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔａｑポリメラーゼおよびその誘導体、ならびにプルーフリーディングドメインの天然に存在するまたは操作された欠失を有する任意のＢファミリー（Ｂ型）ポリメラーゼが挙げられる。

【0301】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、３’修飾ヌクレオチド等のヌクレオチドアナログの取り込みを可能にするかまたは増強するように修飾または操作されている；例えば、米国特許第１０，１５０，４５４号、同第９，６７７，０５７号、および同第９，２７３，３５２号を参照されたい。

【0302】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、５’－リン酸修飾ヌクレオチド等のヌクレオチドアナログの取り込みを可能にするかまたは増強するように修飾または操作されている；例えば、米国特許第１０，１６７，４５５号および第８，９９９，６７６号を参照されたい。いくつかの実施形態において、そのようなポリメラーゼは、ｐｈｉ２９由来ポリメラーゼである；例えば、米国特許第８，２５７，９５４号および同第８，４２０，３６６号を参照されたい。いくつかの実施形態において、そのようなポリメラーゼは、ｐｈｉＣＰＶ４由来のポリメラーゼである；例えば、米国特許出願公開第２０１８０２４５１４７号を参照されたい。

【0303】

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、所望の修飾ヌクレオチドを首尾よく取り込むために、または所望の精度および加工性でヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを取り込むために選択によって修飾または操作される。そのような修飾ポリメラーゼを選択する方法は、当技術分野で公知であり；例えば、「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題する米国特許出願公開第２０１８０３１２９０４号を参照されたい。

【0304】

ヌクレオチドおよびコンジュゲートの合成

【0305】

以下に記載されるのは、本明細書中に記載されるヌクレオチドおよびコンジュゲートの合成の例である。

【0306】

実施例１－５’－チオール修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成：

【0307】

５’－チオール修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、標準の自動固相ＤＮＡ合成手順を使用し、ホスホラミダイト化学を利用して、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡシンセサイザーで２×１μｍｏｌスケールの合成で合成した。Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ ＰＳ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２６－５０４０）およびβ－Ｌ－ＬＮＡホスホラミダイトならびにチオール修飾剤Ｃ６ Ｓ－Ｓ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔ．ｎｏ．１０－１９３６）を構成要素として使用した。β－Ｌ－ＬＮＡホスホラミダイトは、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１４，２４，２６９９－２７０２；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９８，５４，３６０７－３６３０；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００２，６，８０２－８０８）に従ってβ－Ｄ－ＬＮＡホスホラミダイトと同様に合成したが、Ｄ－グルコースの代わりにＬ－グルコースから出発し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。全てのホスホロアミダイトは、ＤＮＡグレードのアセトニトリルに０．１Ｍの濃度で適用された。延長した結合時間（１８０秒）、延長した酸化（４５秒）、脱トリチル化時間（８５秒）での標準ＤＮＡサイクル、ならびに標準合成試薬および溶媒を使用した。オリゴヌクレオチドをＤＭＴｏｎで合成した。標準的な切断プログラムを、濃アンモニアによる支持体からのＬＮＡオリゴヌクレオチドの切断のために利用し、残留保護基も、濃アンモニアによる処理（５６℃で８時間）によって切断した。粗製５’－ジスルフィド修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを蒸発させ、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリル勾配を使用したＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ－１、７μｍ、２５０×２１．５ｍｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，、部品番号７９３５２））によって精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ １０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ６、部品番号１３２６３８）によって脱塩し、濃縮した。その後、ジスルフィドをリン酸緩衝液中で、１００ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．３～８．５によって室温にて３０分間切断した。次いで、５’－チオール修飾オリゴヌクレオチドを水に対する透析（ＭＷＣＯ１０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ６、部品番号１３２６３８）によって脱塩し、定量し、凍結乾燥させた。

【0308】

収量は、２００～４００ｎｍｏｌの範囲であった。

【0309】

５’－チオール修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリルの勾配を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。典型的な純度は、９０％超だった。５’－チオール修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの同一性は、ＬＣ－ＭＳ分析によって確認した。

【0310】

５’－ＨＳ－ヘキシル－β－ＬＮＡ（ＴＡＴＣＧＣ）－３’（配列番号１９）

【0311】

５’－ＨＳ－ヘキシル－β－ＬＮＡ（ＴＣＴＴＣＣ）－３’（配列番号６）

【0312】

５’－ＨＳ－ヘキシル－β－ＬＮＡ（ＣＴＧＴＣＡ）－３’（配列番号４）

【0313】

５’－ＨＳ－ヘキシル－β－ＬＮＡ（ＡＣＣＡＡＣ）－３’（配列番号３１）

【0314】

実施例２－５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成

【0315】

５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、標準の自動固相ＤＮＡ合成手順を使用し、ホスホラミダイト化学を利用して、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡシンセサイザーで２×１μｍｏｌスケールの合成で合成した。Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ ＰＳ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２６－５０４０）およびβ－Ｌ－ＬＮＡホスホラミダイト（２０１９年６月７日に出願された「Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ａｌｌ－ＬＮＡ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題する欧州特許出願第１９１７９０４６．８号を参照されたい、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびにスペーサーホスホラミダイト１８（Ｓｐ１８）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０－１９１８）および５’－アミノ修飾剤Ｃ６ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０－１９０６）を構成要素として使用した。全てのホスホロアミダイトは、ＤＮＡグレードのアセトニトリルに０．１Ｍの濃度で適用された。延長された結合時間（２４０秒）および延長された酸化（４５秒）を有する標準的なＤＮＡサイクル、ならびに標準的な合成試薬および溶媒を、ＭＭＴｏｎで合成された５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの構築に使用した。標準的な切断プログラムを、濃アンモニアによる支持体からのＬＮＡオリゴヌクレオチドの切断のために利用し、残留保護基も、濃アンモニアによる処理（５６°Ｃで８時間）によって切断させた。粗製５’－修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを蒸発させ、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリル勾配を使用したＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ－１、１２～２０μｍ、２５０×３０ｍｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，、部品番号７９３５２））によって精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ １０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ６、部品番号．１３２６３８）によって脱塩し、それによってＭＭＴｏｎ精製オリゴヌクレオチドのＭＭＴ基も切断した。最後に、５’－アミノ修飾オリゴヌクレオチドを定量し、凍結乾燥した。

【0316】

典型的な収率：約３００～４００ｎｍｏｌ。

【0317】

５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリルの勾配を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。典型的な純度は、９０％超だった。

【0318】

５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの同一性は、ＬＣ－ＭＳ分析によって確認した。

【0319】

５’－Ｈ_２Ｎ－ヘキシル－Ｓｐ １８－β－ＬＮＡ（ＧＣＧＡＴＡ）－３’（配列番号４７）

【0320】

５’－Ｈ_２Ｎ－ヘキシル－Ｓｐ １８－β－ＬＮＡ（ＧＧＡＡＧＡ）－３’（配列番号３４）

【0321】

５’－Ｈ_２Ｎ－ヘキシル－Ｓｐ１８－β－ＬＮＡ（ＴＧＡＣＡＧ）－３’（配列番号３２）

【0322】

５’－Ｈ_２Ｎ－ヘキシル－Ｓｐ１８－β－ＬＮＡ（ＧＴＴＧＧＴ）－３’（配列番号３）

【0323】

実施例３－ヌクレオチドの合成

【0324】

本明細書には、本開示のヌクレオチドを合成する方法が例示され、記載される。

【化18-1】

【化18-2】

【化18-3】

【化18-4】

【化18-5】

【0325】

リンカー分子１は、米国特許出願公開第２０１７／０２４０９６１号に記載の手順に従って合成したが、ＰＥＧ１２ジアミンの代わりに３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン－１，１４－ジアミン（ＣＡＳ６８９６０－９７－４、例えばＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ製（ＦＤ１６４９７９））を使用した点が異なっていた。

【0326】

国際公開第２００４／０１８４９７号に記載の手順に従って、ウラシルおよびシトシンの５位ならびに７－デアザ－アデニンおよび７－デアザグアニンの７位の３－アミノプロパ－１－イニル基によって修飾された３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオシド三リン酸（化合物４～７）を合成した。プロパルギル修飾－３’－アジドメチル－ｄＮＴＰ（化合物４～７）はまた、ＭｙＣｈｅｍ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌ．から購入することもできる。

【0327】

リンカー分子３の合成：

【0328】

リンカー分子１（１ｍｍｏｌ、５３４ｍｇ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）およびＮ－メチルモルホリン（１．２ｍｌ）に溶解した。この溶液に、マレイミド－ＰＥＧ２－スクシンイミジルエステル２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ７４６２２３）（１．１ｍｍｏｌ（４６８ｍｇ））のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の溶液をゆっくり添加し、次いで、周囲温度で１６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣を１Ｍ ＨＣｌの添加によって酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し、粗製生成物（０．８ｇ）を次の工程に使用した。

【0329】

ヌクレオチドリンカーコンジュゲート８～１１の合成：

【0330】

無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中のリンカー分子３（１１．３ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（３．４ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（１．６ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。ＴＬＣは完全な変換を示した。この溶液を直接使用して、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液ｐＨ８．７（０．３ｍｌ）中のヌクレオチド４～７（１３μｍｏｌ）と結合させた。反応混合物を周囲温度で３時間撹拌し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、ヌクレオチドリンカーコンジュゲート８～１１を得た。典型的な収率は６～８μｍｏｌであった。

【0331】

ヌクレオチドβ－Ｌ－ＬＮＡコンジュゲート１６～１９の合成：

【0332】

ヌクレオチドリンカーコンジュゲート８～１１（２４０ｎｍｏｌ）および５’－チオール修飾β－Ｌ－ＬＮＡ（１２～１５）（２００ｎｍｏｌ）をそれぞれ２ｍｌのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７）に溶解し、混合した。周囲温度で１０分後、反応が完了した（ＲＰ－ＨＰＬＣによって制御）。次いで、反応混合物を水に対して透析し（ＭＷＣＯ１０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ６、部品番号１３２６３８）、濃縮し、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリル勾配を用いてＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ、１９×２５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｐ／Ｎ １８６００４０２１）によって精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ１０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ６、部品番号１３２６３８）によって脱塩し、定量化し、凍結乾燥させた。

【0333】

収量は、約１２０～１６０ｎｍｏｌの範囲であった。

【0334】

ヌクレオチドβ－Ｌ－ＬＮＡコンジュゲート１６～１９を、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリル勾配を使用するＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ １８ｅ、メルク、部品番号１．０２１２９．０００１）によって分析した。典型的な純度は、９５％超だった。ヌクレオチドβ－Ｌ－ＬＮＡコンジュゲート１６～１９の同一性をＬＣ－ＭＳ分析によって確認した。

【0335】

実施例４－コンジュゲートの合成

【0336】

本明細書には、本開示のコンジュゲートを合成する方法が例示され、記載される。

【化19】

【0337】

カルボキシル鉄酸化物ナノ粒子（５～３０ｎｍの直径、例えば、Ｏｃｅａｎ ＮａｎｏＴｅｃｈ製）を、ＥＤＣ／スルホ－ＮＨＳを使用して活性化し、続いて異なる比率を使用して５’－アミノ修飾β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドにコンジュゲートし、低いオリゴヌクレオチドローディング（２４～２７）を有する磁気ナノ粒子を得た。

【0338】

０．２ｍＬの再懸濁（ＤＩ水）磁気ナノ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬマイクロ遠心管に分注し、次いで０．２ｍＬの活性化緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０）を添加した。その後、０．０１ｍＬのスルホ－ＮＨＳ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ ＤＩ水）および０．０１ｍＬのＥＤＣ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ ＤＩ水）を添加した。懸濁液を室温で１５分間連続的に混合した。次いで、未反応のＥＤＣ／スルホ－ＮＨＳをＮＡＰ－１０カラム（ＧＥ １７－０８５４－０２）によって分離した。１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（ナノ粒子１ｍｇ当たり５ｎｍｏｌ以下）中の５’－アミノ修飾オリゴヌクレオチドを、カラムから溶出した磁気ナノ粒子に添加し、連続的に混合しながら室温で２．５時間反応させた。その後、０．１ｍＬのクエンチバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を磁気ナノ粒子懸濁液に添加し、連続混合しながら室温で３０分間反応させた。次いで、非コンジュゲートオリゴヌクレオチドを磁気分離によって除去した。磁気ナノ粒子を保存緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。陰イオン交換ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動を使用して、異なる化学量論を有する磁気ナノ粒子を分離し、オリゴヌクレオチドで単官能化された磁気ナノ粒子を単離することができる。

【0339】

オリゴヌクレオチドが多重コンジュゲートしている場合：

【化20】

【0340】

実施例５

【0341】

Ｚ^１を含むヌクレオチドまたはオリゴ－／ポリヌクレオチドをＺ^２を含むコンジュゲート（過剰のコンジュゲート、例えば１ｐＭ～１ｍＭ、好ましくは０．１μＭ～２５μＭ（チップ上のセンサおよび適用された過剰量に依存））と反応させるための反応条件：

【0342】

室温でのインキュベーション時間１０秒～６００秒、好ましくは１０秒～６０秒

【0343】

１）反応性基：オリゴヌクレオチド

【0344】

コンジュゲートを、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭ（一価）および／または０～１０ｍＭ二価イオン（Ｍｇ２＋）を含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）を添加してもよい。

【0345】

２）反応性基：ハプテン／抗体

【0346】

コンジュゲートを、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭを含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ））を添加してもよい。

【0347】

３）反応性基：ホスト／ゲスト

【0348】

コンジュゲートを、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８に適用し；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭを含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ））を添加してもよい。

【0349】

４）クリック

【0350】

４ａ）ＣｕＡＡＣ

【0351】

コンジュゲート体を、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭおよびクリック試薬（０、２５ｍＭ硫酸銅（ＩＩ）、１．２５ｍＭ ＴＨＰＴＡリガンド、５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、５ｍＭアミノグアニジン））を含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）を添加してもよい。

【0352】

４ｂ）銅フリークリック

【0353】

コンジュゲートを、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８に適用し；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭを含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ））を添加してもよい。

【0354】

４ｃ）ＴＣＯ／テトラジンクリック（逆要請ディールス－アルダー環化付加反応）

【0355】

コンジュゲートを、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウム（好ましいｐＨ６～８に適用し；好ましい塩濃度１０～１００ｍＭを含有する緩衝溶液に適用し；界面活性剤、例えばポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ））を添加してもよい。

【0356】

実施例６－５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成

【0357】

５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、標準の自動固相ＤＮＡ合成手順を使用し、ホスホラミダイト化学を利用して、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡシンセサイザーで２×１μｍｏｌスケールの合成で合成した。Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ ＰＳ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号２６－５０４０）およびβ－Ｌ－ＬＮＡホスホラミダイト（２０１９年６月７日に出願された「Ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ａｌｌ－ＬＮＡ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題する欧州特許出願第１９１７９０４６．８号を参照されたい、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびにスペーサーホスホラミダイト１８（Ｓｐ１８）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０－１９１８）および５’－ビオチンホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０－５９５０）を構成要素として使用した。全てのホスホロアミダイトは、ＤＮＡグレードのアセトニトリルに０．１Ｍの濃度で適用された。延長された結合時間（２４０秒）および延長された酸化（４５秒）を有する標準的なＤＮＡサイクル、ならびに標準的な合成試薬および溶媒を、ＤＭＴｏｆｆで合成された５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの構築に使用した。標準的な切断プログラムを、濃アンモニアによる支持体からのＬＮＡオリゴヌクレオチドの切断のために利用し、残留保護基も、濃アンモニアによる処理（５６°Ｃで８時間）によって切断させた。粗製５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを蒸発させ、０，１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリル勾配を使用したＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ－１、１２～２０μｍ、２５０×３０ｍｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，、部品番号７９３５２））によって精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ１０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ６、部品番号１３２６３８）によって脱塩した。最後に、５’－ビオチン化オリゴヌクレオチドを定量し、凍結乾燥した。

【0358】

典型的な収量は、約２００～約４００ｎｍｏｌの範囲であった。

【0359】

５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリル勾配を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ，部品番号１．０２１２９．０００１）により分析した。典型的な純度は、９０％超だった。

【0360】

５’－ビオチン化β－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドの同一性は、ＬＣ－ＭＳ分析によって確認した。

【0361】

５’－ビオチン－Ｓｐ １８－β－ＬＮＡ（ＧＣＧＡＴＡ）－３’（配列番号４７）

【0362】

５’－ビオチン－Ｓｐ １８－β－ＬＮＡ（ＧＧＡＡＧＡ）－３’（配列番号３４）

【0363】

５’－ビオチン－Ｓｐ １８－β－ＬＮＡ（ＴＧＡＧＴＧ）－３’（配列番号５７）

【0364】

５’－ビオチン－Ｓｐ１８－β－ＬＮＡ（ＧＴＴＧＧＴ）－３’（配列番号３）

【0365】

実施例７－ストレプトアビジンコートナノ粒子（ＮＰ １０ｎｍ；ＮＰ２０ｎｍ）と異なるビオチン化Ｌ－ＬＮＡとのコンジュゲーション

【0366】

【表3】

【0367】

装置：

【0368】

１．５ ｍＬ ＬＢ－エッペンドルフバイアル

【0369】

Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ５００）製のＳｐｉｎｆｉｌｔｅｒシステム：１０Ｋ ＭＷＣＯ、フィルタ体積１００μＬ、体積上清約５００μＬ

【0370】

遠心分離：エッペンドルフ５４１５Ｄ；１３ ２００ｒｐｍ／１６ １００ｒｃｆ最大

【0371】

遠心分離：エッペンドルフ５４１７Ｒ；２５ ０００ｒｃｆ最大、温度：（２１℃）

【0372】

サーモシェーカー

【0373】

ボルテックス

【0374】

実験：

【0375】

以下に示すように、それぞれ８つの試料（２ＮＰ×４ Ｌ－ＬＮＡ）を用いて３つの異なる実験を行った：

【0376】

（Ａ）０．５ｍｇ ＮＰ；精製：遠心分離：エッペンドルフ５４１７Ｒ；２５，０００ｒｃｆ最大、（２１－∞Ｃ）

【0377】

（Ｂ）０．１ｍｇ ＮＰ；精製：スピンフィルタ１０ Ｋ、０．５ｍＬ、遠心分離：エッペンドルフ５４１５Ｄ、８０００ｒｐｍ

【0378】

（Ｃ）０．３ｍｇ ＮＰ；精製：スピンフィルタ１０ Ｋ、０．５ｍＬ、遠心分離：エッペンドルフ５４１７Ｒ，５０００ ｒｃｆ

【0379】

実験（Ａ）

【0380】

０．５ｍｇ（５００μＬ）のナノ粒子を１．５ｍＬ ＬＢ－エッペンドルフバイアルに移した（表２参照）。

【0381】

緩衝液交換：上清が無色になるまで試料を遠心分離し（１５分（ＮＰ ２０）；６０分（ＮＰ１０）、２５ ０００ｒｃｆ）、上清（１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％ ＮａＮ３、０．０１％ ＢＳＡ）を除去し、５００μＬの反応緩衝液ＫＰ緩衝液（ｐＨ７．４）を添加し、試料をボルテックスによって再懸濁し、再び遠心分離し、ＫＰ緩衝液を除去し、最後に５０μＬのＫＰ緩衝液を添加した（ｃＮＰ＝１０ ｍｇ／ｍＬ）。

【0382】

ストレプトアビジンナノ粒子のビオチン結合容量に応じて（以後本明細書中ではＮＰ１０およびＮＰ２０については「ＢｉＫＡ」）（ＫＰ緩衝液ｐＨ７．４中１００ｎｍｏｌ／ｍＬ）、４０倍過剰のそれぞれのＬ－ＬＮＡをナノ粒子懸濁液に添加し、それぞれ０．９および１．７ｍｇ／ｍＬの反応濃度を得た。

【0383】

コンジュゲーションは、サーモシェーカーを使用して行った：１時間、２１∞Ｃ，１０００ｒｐｍ

【0384】

精製：遊離Ｌ－ＬＮＡを除去するために、上清が無色になるまで試料を遠心分離し（１５分（ＮＰ２０）；６０分（ＮＰ１０）、２５０００ｒｃｆ）、上清を除去し、５００μＬのＫＰ緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した。この洗浄手順を２回繰り返した。

【0385】

最後に、ナノ粒子ペレットを５０μＬのＫＰ緩衝液ｐＨ７．４（ｃ＝１０ｍｇ／ｍＬ）に再懸濁した。

【0386】

実験（Ｂ）および（Ｃ）

【0387】

膜を濡らすためのスピンフィルタの前処理：２回５００μＬのＫＰ緩衝液ｐＨ７．４を使用した遠心分離

【0388】

実験（Ｂ）のために、０．１ｍｇ（１００μＬ）のナノ粒子をスピンフィルタに移した。

【0389】

実験（Ｃ）のために、０．３ｍｇ（３００μＬ）のナノ粒子をスピンフィルタに移した。

【0390】

緩衝液交換：５００μＬの反応緩衝液ＫＰ緩衝液ｐＨ７．４をスピンフィルタに添加し、遠心分離し（３分；８０００ｒｐｍ（ＮＰ１０、ＮＰ２０））、この手順を２回繰り返した。

【0391】

フィルタ中のＮＰ懸濁液を、１００～２００μＬのＫＰ緩衝液ｐＨ７．４を使用して１．５ｍＬ ＬＢ－エッペンドルフバイアルに移した。

【0392】

ＮＰ１０およびＮＰ２０に対するＢｉＫＡに応じて、４０倍過剰のそれぞれのＬ－ＬＮＡをナノ粒子懸濁液に添加し（Ｂ：１００ｎｍｏｌ／ｍＬ；Ｃ：ＫＰ緩衝液ｐＨ７．４中２５０ｎｍｏｌ／ｍＬ）、実験Ｂについてはそれぞれ０．５および０．７ｍｇ／ｍＬの反応濃度をもたらし、実験Ｃについては０．９および１．２ｍｇ／ｍＬの反応濃度をもたらした。

【0393】

コンジュゲーションは、サーモシェーカーを使用して行った：１時間、２１℃、１０００ｒｐｍ

【0394】

精製：遊離Ｌ－ＬＮＡを除去するために、スピンフィルタシステム（５～１０分、８０００ｒｐｍ）を使用して、試料を５００μＬのＫＰ緩衝液ｐＨ７．４で３～６回洗浄した。各遠心分離工程の後、ピペッティングによってＮＰをフィルタ内に再懸濁した。濾液を回収して、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法（２６０ｎｍ）によってＬ－ＬＮＡ量／洗浄有効性を確認した。

【0395】

最後に、ナノ粒子ペレットを約１００μＬのＫＰ緩衝液ｐＨ７．４（ｃ＝１ｍｇ／ｍＬ）に再懸濁した。

【0396】

結果

【0397】

ＤＬＳ

【0398】

反応系列Ａの試料をＤＬＳ測定（水中の５μＬ ＮＰ懸濁液）によって分析した。

【表4】

【0399】

試料１、３、５、７（ＮＰ１０）のＤＬＳ測定は、ＬＮＡコート粒子について約２０～約４０ｎｍのサイズ分布を示した。これらの直径は前駆体粒子（１０ｎｍのカルボキシル粒子およびストレプトアビジン粒子）と同様であった。

【0400】

コンジュゲーションＬ－ＬＮＡ（２７００ｇ／ｍｏｌ）によるサイズの検出可能な増加は観察されなかった

【0401】

試料２、４、６、８（ＮＰ２０）のＤＬＳ測定は、ほとんど測定できなかった。これは、ＮＰ２０コンジュゲートの凝集の問題に起因する可能性があった。

【0402】

両方のストレプトアビジンコート粒子（ＮＰ１０およびＮＰ２０）は、異なる材料特性を示した。

【0403】

遠心分離プロセス（スピンフィルタありおよびなし）の適用は、ＮＰ２０粒子の凝集をもたらす。ＮＰ２０粒子がフィルタ膜に付着したと考えられる。両方の事実は、Ｌ－ＬＮＡとのコンジュゲーション反応においてＮＰ２０試料の収率の低下をもたらす。これは、ＮＰ１０試料対ＮＰ２０試料の褐色がかった色強度を比較することによって観察することができた。

【0404】

ビオチンフルオレセインを用いたＢｉＫＡアッセイ

【0405】

ＮＰ１０：ＢｉＫＡ ３０３０～３０６０ｐｍｏｌ／ｍｇ（約３、０ｎｍｏｌ／ｍｇ）

【0406】

ＮＰ２０：ＢｉＫＡ １０．４００－１１．５００ｐｍｏｌ／ｍｇ（約１０．４～１１．５ｎｍｏｌ／ｍｇ）

【0407】

予想外にも、ＮＰ２０粒子はＮＰ１０粒子よりも約３～約４倍高いＢｉＫａを示した。

【0408】

実験において経験的に決定されたＮＰ１０およびＮＰ２０のＢｉＫａは、以下のように決定された：

【0409】

ＮＰ１０：２．５ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ

【0410】

ＮＰ２０：１．２５ ｎｍｏｌ／ｍｇビーズ

【0411】

ＮＰ１０については、ほぼ完全に一致する（２．５ｎｍｏｌ／ｍｇ対３．０ｎｍｏｌ／ｍｇ）。

【0412】

ＮＰ２０については、実験的に決定されたＢｉｋａは約１０倍高い（１．２５ｎｍｏｌ／ｍｇ対１１ｎｍｏｌ／ｍｇ）。

【0413】

それにもかかわらず、全ての実験で使用された４０倍過剰のＬ－ＬＮＡは、１００％ローディングを生成するのに十分でなければならず、これはビオチン－フルオレセインアッセイ（９０～１００％ Ｌ－ＬＮＡローディング）によって確認することができた。

【0414】

追加の実施形態

【0415】

固体支持体上に配列された複数の標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、４つの異なるヌクレオチドのうちの１つを、複数の標的ポリヌクレオチドの各々に相補的な核酸コピー鎖に取り込むことであって、４つの異なるヌクレオチドの各々が、（ｉ）３’－ヒドロキシル保護基、および（ｉｉ）切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した反応性基を含み、４つの異なるヌクレオチドの各々の異なるヌクレオチドが、異なる核酸塩基および異なる反応性基を含む、新生核酸コピー鎖に取り込むことと；新生核酸鎖のヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成することであって、形成されたヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体が、新生核酸コピー鎖に取り込まれた異なるヌクレオチドのうちの１つのみに由来し、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々の異なるサブセットの順次形成が、検出可能な標識を含み、相補的な核酸鎖に取り込まれた４つの異なるヌクレオチドのうちの１つのみと直交反応性であるコンジュゲートを導入することと；導入された各コンジュゲートの標識を検出することによって、サブセット内の各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の形成を検出することと；サブセット内の検出された各ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の固体支持体内の位置を決定することとサブセット内の形成された検出可能なヌクレオチド－コンジュゲート複合体の各々から少なくとも検出可能な標識を切断することとを含む、ヌクレオチド－コンジュゲート複合体の異なるサブセットを順次形成することとを含む、方法。

【0416】

本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように変更されることができる。

【0417】

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組合せ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【配列表】

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