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特許7501879ＰＨＦ６を標的にするヒストンＨ２Ｂエピジェネティクスス調節剤スクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-10
(45)【発行日】2024-06-18
(54)【発明の名称】ＰＨＦ６を標的にするヒストンＨ２Ｂエピジェネティクスス調節剤スクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20240611BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240611BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240611BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240611BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240611BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240611BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240611BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
A61P35/02
A61K45/00
G01N33/68
G01N33/15 Z
C12Q1/02 ZNA
C12N15/09
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022563022
(86)(22)【出願日】2021-07-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(86)【国際出願番号】 KR2021009223
(87)【国際公開番号】W WO2022025502
(87)【国際公開日】2022-02-03
【審査請求日】2022-10-17
(31)【優先権主張番号】10-2020-0095058
(32)【優先日】2020-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】509329800
【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(73)【特許権者】
【識別番号】515131404
【氏名又は名称】アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＪＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(73)【特許権者】
【識別番号】517428355
【氏名又は名称】カンウォン ナショナル ユニバーシティ－インダストリー コーポレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100170900
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 渉
(72)【発明者】
【氏名】ベク ソンヒ
(72)【発明者】
【氏名】オ ソンリョン
(72)【発明者】
【氏名】ブ ギョンジン
(72)【発明者】
【氏名】パク デチャン
(72)【発明者】
【氏名】イ ジミン
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０８３１９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１２６３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１９２１１１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Jiawen Wang，Flow-enhanced priming of hESCs through H2B acetylation and chromatin decondensation，Stem Cell Research & Therapy，2019年11月27日，10:349，pp.1-16，https://doi.org/10.1186/s13287-019-1454-z
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｇ０１Ｎ３３／５０
Ｇ０１Ｎ３３／５３
Ｇ０１Ｎ３３／６８
Ｃ１２Ｑ １／２５
Ｃ１２Ｎ ９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＨＦ６（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ６）タンパク質及び１２番目リシン残基がアセチル化で修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質を発現する真核細胞を提供する段階；前記真核細胞を前記ＰＨＦ６の前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃの認識を調節すると期待される試験物質の存在中で接触する段階；
前記アセチル化で修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化（Ｈ２ＢＫ１２０－ｕｂ）を測定する段階；及び
測定の結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して、前記試験物質で処理された細胞で前記アセチル化で修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化水準に変化がある場合、前記試験物質をＰＨＦ６活性調節候補物質として選別する段階；を含む、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項2】
前記ＰＨＦ６タンパク質及び前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃは、ヒトを除いた動物モデルとして提供されるものである、請求項１に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項3】
前記真核細胞は、ヒトを除いた動物の胚性幹細胞である、請求項１に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項4】
前記ＰＨＦ６タンパク質は、ＰＨＤ１及びＰＨＤ２ドメインを含み、前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃは、前記ＰＨＤ２ドメインによって認識されて、前記Ｈ２ＢＫ１２０のユビキチン化は、前記ＰＨＤ１によるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項5】
前記エピジェネティクス調節剤は、白血病治療剤で開発されるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項6】
ＰＨＦ６のＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂタンパク質を発現する真核細胞を提供する段階；前記真核細胞と前記ヒストン２Ｂタンパク質の結合を促進させると期待される物質の存在中で前記タンパク質を接触する段階；
前記ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化水準を測定する段階；及び
測定の結果、試験物質と処理されなかった対照群と比較して、処理された場合、ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化が増加した場合、前記試験物質をＰＨＦ６活性調節候補物質として選別する段階；を含む、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項7】
前記ＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂタンパク質は、ヒトを除いた動物モデルとして提供されるものである、請求項６に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項8】
前記真核細胞は、ヒトを除いた動物の胚性幹細胞である、請求項６に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【請求項9】
前記エピジェネティクス調節剤は、白血病治療剤で開発されるものである、請求項６～８のいずれか一項に記載のＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願はＰＨＦ６のヒストンＨ２Ｂエピジェネティクス調節を究明した分子機構に基づいた薬物スクリーニング技術に関連した分野である。
【背景技術】
【0002】
ヒストン修飾（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、細胞のクロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）変化を引き起こすことによって、遺伝子発現を調節する重要な生物学的現象の中の一つである。クロマチンには、大きくＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の４種類のヒストンタンパク質に結合されており、各ヒストンタンパク質のＮ－末端には、アセチル化のような様々な修飾が存在すると知られている。このような修飾は、特定遺伝子発現を活性化したり抑制するが、これをエピジェネティクス調節という。このようなヒストンの修飾に関与するエピジェネティクス調節タンパク質／遺伝子は、機能的にライター（ｗｒｉｔｅｒ）、イレーザー（ｅｒａｓｅｒ）、そしてリーダー（ｒｅａｄｅｒ）に分類される。
【0003】
このうちリーダーは、ヒストンの修飾を認知する機能を有したタンパク質で、その重要性浮上しているが、これはライターやイレーザーとは異なり、互いに異なる種類のヒストン修飾間の相互作用（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）現象を理解するのに最も核心となる因子であるからである。
【0004】
このようなヒストン修飾間相互作用は、生体内遺伝子の発現が精巧に調節されなければならない複雑系を理解するのに必須概念である。また、これたのヒストン修飾間相互作用が壊れる場合、癌をはじめとする様々な病気を引き起こすようになるとの報告があるが、知られているヒストン修飾の種類に比べてこれらの間の相互作用は多くは知られていない（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ），１７，１０５１－１０７８；Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２２，１４０２－１４０５．）。
【0005】
国際公開第２０１３－１３８２３７号は、急性白血病の治療、診断または予後用方法及び組成物に関し、ＰＨＦ６を白血病予後と関連した判断のためのマーカーの一つで開示している。ヒストンタンパク質問エピジェネティクス調節機構に基づいた標的の発掘が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本願では白血病及びＢＦＬ症候群のような遺伝病疾患で核心突然変異遺伝子として知られているＰＨＦ６によるヒストンＨ２Ｂのエピジェネティクス調節機構に基づいた薬物スクリーニング方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一様態で本願は、ＰＨＦ６（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ６）タンパク質及び１２番目リシン残基がアセチル化で修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質を提供する段階；前記ＰＨＦ６タンパク質及びＨ２ＢＫ１２－Ａｃタンパク質を前記ＰＨＦ６の前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃの認識を調節すると期待される試験物質の存在中で接触する段階；前記ヒストンタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化（Ｈ２ＢＫ１２０－ｕｂ）を測定する段階；及び前記測定の結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して、前記試験物質で処理された細胞で前記ヒストンタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化水準に変化がある場合、前記試験物質を前記ＰＨＦ６活性調節候補物質として選別する段階を含む、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法を提供する。
【0008】
本願に係る方法で水準の変化は、処理されなかった対照群と比較して増加または減少を意味し、Ｈ２ＢＫ１２０－ｕｂの増加または減少に影響を与えることができる物質は、ヒストンエピジェネティクス調節剤として有用に使われることができる。当業者ならば具体的な目的に応じて減少または増加を選択することができるはずである。
【0009】
本願の方法により選別、開発されたエピジェネティクス調節剤は白血病治療用に開発されることができる。
【0010】
本願の方法で、ＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂは、ヒトを含む哺乳類由来のものが使われて、当業者ならば実験条件などを考慮して適切なものを選択することができるはずである。一実現例ではヒト由来のものが使われる。
【0011】
一実現例で、本願に係る方法は、本願の方法に使われるタンパク質を（過）発現する真核細胞、例えばヒトを除いた動物の胚性幹細胞またはヒトを除いた動物モデルで実行されることができる。
【0012】
本願に係るＰＨＦ６によるヒストン２Ｂタンパク質問エピジェネティクス調節は、ＰＨＦ６タンパク質のＰＨＤ１及びＰＨＤ２ドメインが関与して、前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃは、前記ＰＨＤ２ドメインによって認識されて、前記Ｈ２ＢＫ１２０のユビキチン化は、前記ＰＨＤ１によるものである。
【0013】
そこで他の様態で本願は、ＰＨＦ６のＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異（点、欠失、置換などの突然変異による機能喪失突然変異）されたＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂタンパク質を提供する段階；前記ＰＨＤ１ドメインまたは前記ＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質と前記ヒストン２Ｂタンパク質の結合を促進させると期待される物質の存在中前記タンパク質を接触する段階；前記ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化水準を測定する段階；及び前記測定の結果、試験物質と処理されなかった対照群と比較して、処理された場合、ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化が増加した場合、前記試験物質を前記ＰＨＦ６活性調節候補物質として選別する段階を含む、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法を提供する。
【0014】
一実現例で、前記ＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂタンパク質は、真核細胞またはヒトを除いた動物モデルとして提供されることができる。
【0015】
一実現例で前記真核細胞は、ヒトを除いた動物の胚性幹細胞である。
【発明の効果】
【0016】
本願は従来独立的であると知らされた転写調節に関与する二つのヒストン修飾、即ちＨ２ＢＫ１２（ヒストン２Ｂ、１２番目リシン残基）のアセチル化及びＨ２ＢＫ１２０（ヒストン２Ｂ、１２０番目リシン残基）に対するユビキチン化がＰＨＦ６によって機能単位で作動するのを究明した。このような機構に基づいて開発されたＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス機能を調節することができる物質は、ＰＨＦ６の問題に起因する様々な疾患の治療剤の開発に効果的に使用できる。
【0017】
本願の方法によって選別、開発されたエピジェネティクス調節剤は、白血病治療用に開発されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】Ｐｈｆ６欠乏で胚性幹細胞の胚盤胞分化段階で欠陥が発生する。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子システムを使ったＰｈｆ６遺伝子ノックアウト（ＫＯ）作製の概略図。Ｐｈｆ６遺伝子に対するガイドＲＮＡ配列及び変更された配列が表示されている。（Ｂ）Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でのＰＨＦ６欠乏及びｓｈＲＮＡによるＰｈｆ６ノックダウンを示す免疫ブロット分析。陽性対照群としてＮａｎｏｇ、及びローディング対照群としてβ－ａｃｔｉｎ。（Ｃ）Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞の成長曲線とＷＴ胚性幹細胞の成長曲線、及びｓｈＰｈｆ６の成長率曲線とｓｈＮＳの成長曲線。（Ｄ）ＷＴ、Ｐｈｆ６ ＫＯ、ｓｈＮＳ及びｓｈＰｈｆ６胚性幹細胞でＡＰ染色によって測定された分化能の比較。イメージは１００倍拡大率で撮影された。（Ｅ）ＤＯＸ処理で誘導された胚盤胞系統リプログラミング及びＲＡ処理で誘導された神経外胚葉分化の間のＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４の間のＤＥＧ分析の概略図。（Ｆ）ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４との間の上位５０％遺伝子（ｎ＝７，３８９）の比較発現。カットオフ（（Ｐｈｆ６ ＫＯ対ＷＴ）｜＝３のフォルド変化）を赤色点線で示した。Ｐｈｆ６ ＫＯで有意に下向き調節された遺伝子は、赤点（ｎ＝１５）で、上向き調節された遺伝子は青点（ｎ＝１）で示した。（Ｇ）ＤＯＸ処理とＲＡ処理との間の化学的依存性誘導遺伝子の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析。発現差が３倍以上大きい遺伝子は、化学的処理による有意に上向き調節された遺伝子として選択された。遺伝子オントロジーの有意味性＝ｌｏｇ１０（調整されたＰ－値＝０．１）。（Ｈ）薬物処理で発現が増加した遺伝子群でＰｈｆ６依存的に発現された遺伝子のＧＯ分析。遺伝子オントロジーの有意味性＝ｌｏｇ１０（調整されたＰ－値＝０．０５）。
【図2】ＲＮＡ－ｓｅｑ分析結果、ＰＨＦ６は、胚盤胞分化遺伝子の転写活性因子である。（Ａ）ＤＯＸ処理有無に応じだＷＴ及びＰｆｈ６ ＫＯ胚性幹細胞で発現した遺伝子のｋ－平均群集ヒートマップ（ｎ＝１，７７５、ｋ＝６）。遺伝子は、発現類似性に基づいて六つのクラスターに分類された。（Ｂ）ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞に対するＤＯＸ反応の差。ＤＯＸ反応は、胚性幹細胞でＤＯＸ処理による遺伝子の平均ｚ－点数差を使って計算した。（Ｃ）クラスター１遺伝子のＺ－点数セントロイド。中間値は赤色で強調表示した。（Ｄ）クラスター１遺伝子群のオントロジー（ＧＯ）分析による機能分析。胎盤発達がクラスター１で最も有意味な生物学的機能である。（Ｅ）ＤＥＧの代表的な遺伝子セット分析（ＧＳＥＡ）。胚芽胎盤の発達及び栄養亜細胞巨大細胞分化に関与する遺伝子セットは、有意味性を示した。（Ｃ）の中間値を遺伝子発現のパターン分析の基準に使った。（Ｆ）ＷＴと比較してＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で下向き調節された胚盤胞分化遺伝子群。色棒は各比較で発現変化値のｌｏｇ２値を示す。ＧＳＥＡから抽出された遺伝子が選択された。（Ｇ）ＤＯＸ処理の有無によるＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣで胚盤胞遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。各遺伝子のｍＲＮＡ水準は、Ｇａｐｄｈに対する相対的な値に決定されて、ＷＴ－ＤＯＸに基づいて相対的に比較された。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図3】ＰＨＦ６は、胚盤胞系統決定のために胚盤胞マーカー遺伝子の発現を活性化する。（Ａ）胚芽体（ＥＢ）分化７日目にＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ ＥＢの形態学的特徴。各ＥＢを成長させて個別的に観察した。倍率Ｘ１０。外部細胞層の平均面積（ｍｍ２）をＷＴ（ｎ＝１１、左側）とＰｈｆ６ ＫＯ（ｎ＝９、右側） ＥＢとの間で比較した。統計的有意性はＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ－Ｃ）ＷＴ ＥＢの外部細胞層でＣＤＸ２及びＰＨＦ６の免疫染色。倍率Ｘ１００（Ｂ）及びＸ２００（Ｃ）。（Ｄ）ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ ＥＢ分化の間胚盤胞系統マーカー遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ ＥＢをＬＩＦなしに維持して各々表示された日にサンプリングした。各遺伝子のｍＲＮＡ水準は、Ｇａｐｄｈまたはｂ－ａｃｔｉｎに対する相対的な値として決定されてＷＴ０日を基準に相対的に比較された。統計的有意性はＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図4】ＰＨＦ６は、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃを認知してＨ２ＢＫ１２０の単一ユビキチン化を調節する。（Ａ）ＧＳＴまたはＧＳＴ－ＰＨＦ６タンパク質を使ったヒストンタンパク質のＦａｒ ｗｅｓｔｅｒｎ分析。ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞から得たヒストン抽出物に対して分析を行った。ヒストン抽出物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相の大きさに応じてＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ及びＨ４に分離した。（Ｂ）ＧＳＴ－ＰＨＦ６に最も高い親和力を示す上位五つのヒストン修飾。スクリーニングは、ヒストンペプチドアレイキットを使って行われた。（Ｃ）上位五つの修飾されたヒストンペプチド候補に対するＧＳＴ－ＰＨＦ６の認知能力を確認。ヒストンペプチドプルダウン分析を行った。（Ｄ）多様な種でＰＨＦ６の一番目の拡張ＰＨＤドメイン（ｅＰＨＤ１）及び２番目の拡張ＰＨＤドメイン（ｅＰＨＤ２）のアミノ酸配列。赤色と表示されたアミノ酸は、ｅＰＨＤ２で負に荷電されたアミノ酸が集まっている領域を示す。アミノ酸整列は、ＣｌｕｓｔａｌＸで行った。（Ｅ）試験管内ペプチド結合分析をＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴまたはＥ２２３Ｓ突然変異で行った。（Ｆ）陰性対照群としてＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ２２３Ｓ突然変異（左側軸）及びＧＳＴ （右側軸）を有するＨ２Ｂペプチド（１－２０）（非修飾及びＫ１２Ａｃ）のＭＳＴ結合曲線。誤差棒は三つの独立的な実験の標準偏差を示す。測定されたＫＤ値は各結合曲線に対して表示された。＊Ｎ．Ｂ．バインディングがないことを示す。（Ｇ）ＤＯＸ処理でＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で各々の表記された抗体を使って免疫ブロット分析を行った。（Ｈ）ＤＯＸ処理後ｐ３００またはＣＢＰをｓｉＲＮＡでノックダウン後表記された抗体を使って免疫ブロット分析を行った。（Ｉ）Ｈ２Ｂ Ｋ１２Ｒ／Ｋ１２０Ｒ突然変異を利用したＫ１２ＡｃとＫ１２０ｕｂの相関関係比較。これらのＨ２Ｂ ＷＴ及び各突然変異を含有する単一ヌクレオソームを抽出するためにＭＮａｓｅ酵素を使って、これらの単一ヌクレオソームのヒストン修飾状態を免疫ブロット分析で確認した。（Ｊ）ＤＯＸ処理でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯとの間の免疫ブロットによったＲＮＦ２０及びＲＮＦ４０タンパク質水準。（Ｋ）共同免疫沈殿分析を行ってＤＯＸ処理有無に応じた胚性幹細胞でＰＨＦ６とＵＳＦ４４、ＲＮＦ２０またはＲＮＦ４０との相互作用を確認。（Ｌ）ＤＯＸ処理の有無に応じてＰｈｆ６、Ｒｎｆ２０及びＲｎｆ４０のノックダウンの間のＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準の免疫ブロット。（Ｍ）ＤＯＸ処理を使ったＰｈｆ６、Ｒｎｆ２０及びＲｎｆ４０ノックダウン胚性幹細胞でＣｄｘ２及びＧａｔａ２のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。各遺伝子のｍＲＮＡ水準は、Ｇａｐｄｈに対する相対的な値に決定さて、ｓｈＮＳ＋ＤＯＸに基づいて相対的に比較された。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｎ）ＤＯＸ処理と共にＰｈｆ６、Ｒｎｆ２０及びＲｎｆ４０ノックダウンＥＳＣでＨ２ＢＫ１２０ｕｂ抗体を使ってＣｄｘ２及びＧａｔａ２のプロモーターに対してＣＨＩＰ分析を行った。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図5】ＰＨＦ６は、Ｋ１２０のヒストンＨ２Ｂに対するアセチル化－依存的Ｅ３ユビキチンリガーゼである。（Ａ）試験管内のユビキチン化分析のフローチャート。（Ｂ）Ｈ２Ｂ ＷＴまたはＫ１２Ｒ突然変異が含まれた単一ヌクレオソームを使った試験管内のユビキチン化分析。単一ヌクレオソームは、ＤＯＸ処理したＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４から抽出した。（Ｃ）ＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ、Ｃ８２ＡまたはＥ２２３Ｓ突然変異と共にＨ２Ｂ－Ｆｌａｇ ＷＴが含まれた単一ヌクレオソームに対する試験管内ユビキチン化分析。（Ｄ）ＤＯＸ処理によるＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４でのＰＨＦ６ ＷＴ、Ｃ８２ＡまたはＥ２２３Ｓ突然変異の発現水準。（Ｅ）ＰＨＦ６の一番目の拡張ＰＨＤの概略図。黒色文字は亜鉛捕獲のためのＰＨＤコアアミノ酸である；赤色文字は鐘間保存されたＥ３リガーゼ活性に必要な新しい残基候補である。（Ｆ）ＰＨＦ６突然変異を利用した試験管内のユビキチン化分析。（Ｇ）Ｈｉｓ－ＵＢＣＨ３のＧＳＴ、ＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異を利用した試験管内ＧＳＴ－プルダウン分析。（Ｈ）ＰＨＦ６で各ドメインの機能概略図。
【図6】ＰＨＦ６によるＨ２Ｂでのアセチル化－ユビキチン化連結は、胚盤胞遺伝子発現に重要である。（Ａ）ＰＨＦ６と結合した単一ヌクレオソームを確認するためのＨ２ＢＫ１２Ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ１抗体を使ったＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰ分析の免疫ブロット。Ｆｌａｇ抗体を使って染色質の免疫沈殿を行った。Ｆｌａｇ－ＰＨＦ６ ＷＴ、Ｍ１２５Ａ及びＥ２２３Ｓは、Ｐｈｘ６ ＫＯ胚性幹細胞において２日間ＤＯＸ処理で過発現された。ＩＰ：ＩｇＧ及びＩＰ：Ｆｌａｇで各抗体のブロッティングは、同じ露出状態で比較した。１％ Ｉｎｐｕｔが使われた。（Ｂ）ｐＬＶＸ－ＰＨＦ６ ＷＴ及び突然変異の過発現後、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ及びＰＨＦ６水準の免疫ブロット分析。（Ｃ）ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯでＩｇＧ、ＰＨＦ６、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ２ＢＫ１２Ａｃ抗体を使ってＰｈｆ６依存的に発現した遺伝子であるＣｄｘ２及びＧａｔａ２のプロモーターに対してＣｈＩＰ分析。統計的有意性はＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｄ）ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯでＩｇＧ、ＰＨＦ６、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ２ＢＫ１２Ａｃ抗体を使ってＤＯＸ処理によってＰｈｆ６非依存的発現遺伝子であるＭｓｘ２のプロモーターに対するＣＨＩＰ分析。統計的有意性はＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｅ－Ｆ）Ｐｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣでレンチウィルス感染によるｐＬＶＸ－ＰＨＦ６ ＷＴまたはＭＴｓ安定細胞の生成。ＤＯＸ処理によるＰｈｆ６ ＷＴまたはＭＴの安定した構造のＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣのヒストンＨ２ＢＫ１２０ｕｂ及びＰＨＦ６水準の免疫ブロット分析（Ｅ）。ＤＯＸ処理によるＰｈｆ６ ＷＴまたは突然変異をＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で持続発現させた後、胚盤胞マーカー遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析（Ｆ）。各遺伝子のｍＲＮＡ水準は、Ｇａｐｄｈに対する相対的な値に決定されてＰｈｆ６ ＷＴ安定細胞に基づいて比較された。統計的有意性はＡＮＯＶＡテストによって計算された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図7】胚盤胞遺伝子の発現に対するＰＨＦ６の機能に対する模式図である。図式モデルは、ＰＨＦ６が胚盤胞リプログラミングの間、胚盤胞遺伝子の転写活性因子として機能することを示している。ＰＨＦ６は、２番目の拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識して、胚盤胞遺伝子のプロモーター上の一番目の拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２０残基をユビキチン化する（上）。しかし、ＰＨＦ６が欠乏した時、胚盤胞遺伝子のプロモーター上のＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準は増加しないため、胚盤胞遺伝子の転写活性化の失敗につながるのを示す（下）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本願は、ＰＨＦ６（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ６）が従来に独立的であると知らされた転写調節に関与する二つのヒストン修飾、即ちＨ２ＢＫ１２（ヒストン２Ｂ、１２番目リシン残基）のアセチル化及びＨ２ＢＫ１２０（ヒストン２Ｂ、１２０番目リシン残基）のユビキチン化を一つの機能単位で作動するようにするエピジェネティクス調節子との発見に基づいたものである。
【0020】
そこで、一様態で本願は、ＰＨＦ６タンパク質及び１２番目リシン残基がアセチル化された修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質を提供する段階；前記タンパク質を前記ＰＨＦ６の前記Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃの認識を調節すると期待される試験物質の存在中で接触する段階；前記Ｈ２Ｂの１２０番目リシン残基のユビキチン化（Ｈ２ＢＫ１２０－ｕｂ）を測定する段階；及び前記測定の結果、前記試験物質で処理されなかった対照群と比較して、前記試験物質で処理された細胞で前記Ｈ２Ｂの１２０番目リシン残基のユビキチン化水準に変化がある場合、前記試験物質を前記ＰＨＦ６活性調節候補物質として選別する段階を含む、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法に関するものである。
【0021】
ＰＨＦ（ＰＨＤ ｆｉｎｇｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）６は、後述するように二つの拡張されたＰＨＤドメインを有するタンパク質としてその構造が知られている。ＰＨＦ６は、白血病で最も多く研究されたが、多くの白血病報告で、ＰＨＦ６の突然変異が知られており（Ｖａｎ Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＨＦ６ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，４２，３３８－３４２．；Ｖａｎ Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） ＰＨＦ６ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２５，１３０－１３４．）。この突然変異によるＰＨＦ６のヒストン修飾認知機能及び転写調節機能が壊れたのが、白血病を誘発する主な原因の中の一つと知られている（Ｍｅａｃｈａｍ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｐｈｆ６ ａｓ ａ ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２９，４８３－４８８．）。またＰＨＦ６の突然変異は、Ｂｏｒｊｅｓｏｎ－Ｆｏｒｓｓｍａｎ－Ｌｅｈｍａｎｎ（ＢＦＬ）症候群でも多く知られている（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｂｏｒｊｅｓｏｎ－Ｆｏｒｓｓｍａｎ－Ｌｅｈｍａｎｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅ ｎｏｖｏ ＰＨＦ６ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｆｅｍａｌｅ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，４３，２３８－２４３．；Ｂｅｒｌａｎｄ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＨＦ６ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ Ｍａｙ Ｃａｕｓｅ Ｂｏｒｊｅｓｏｎ－Ｆｏｒｓｓｍａｎ－Ｌｅｈｍａｎｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ Ｆｅｍａｌｅｓ．Ｍｏｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｏｌ，１，２９４－３００．；Ｚｗｅｉｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａ ｎｅｗ ｆａｃｅ ｏｆ Ｂｏｒｊｅｓｏｎ－Ｆｏｒｓｓｍａｎ－Ｌｅｈｍａｎｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ？Ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＨＦ６ ｉｎ ｓｅｖｅｎ ｆｅｍａｌｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，５０，８３８－８４７．）。ＰＨＦ６は、転写調節因子としての機能は知られているが、このようなヒストン修飾を認知するのかに対する分子的機構については明らかになっていない。
【0022】
本願では、ＰＨＦ６がＨ２ＢＫ１２アセチル化－Ｈ２ＢＫ１２０ユビキチン化相互作用の核心機能を行うことを究明した。具体的に、ＰＨＦ６に含まれたＰＨＤ２及び１と呼ばれる二つのリーダー（ｒｅａｄｅｒ）ドメインが各々Ｈ２ＢＫ１２アセチル化認識及びＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化に関与することを究明した（図７等参照）。
【0023】
エピジェネクティンｒｅａｄｅｒであるＰＨＤ（Ｐｌａｎｔ Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）ドメインは、従来ヒストンＨ３のＫ４ｍｅ２／３を認知する機能が最も多く知られているドメインで、亜鉛カチオンを二つキャプチャーする構造を有することによってｒｅａｄｅｒでの機能を取得すると知られている。しかし、ＰＨＤドメインは、他のドメインに比べて遺伝子毎に多様性が大きい方に属するが、ＰＨＤドメインがさらに半分があって、亜鉛カチオンを三つキャプチャーする場合も知られていて、一つのＰＨＤドメインがすぐに連結されて亜鉛カチオンを四つキャプチャーするケースも知られている。本願で機能が究明されたＰＨＦ６は、ＰＨＤの半分がさらに付いている二つの拡張されたＰＨＤ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ＰＨＤ）ドメインを含む。このようなＰＨＦ６配列及びこれに含まれた配列自体は、公知されたもので、例えばヒト及びマウスＰＨＦ６に対する情報は次のようなＩＤで探すことができる：ヒトＰＨＦ６ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８４２９５；マウスＰＨＦ６ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７０９９８ ＤＢ（ＮＣＢＩデータベース）。本願で、ヒトＰＨＦ６タンパク質配列は、配列番号１の配列と表示される。前記配列番号１の配列でＰＨＤ１ドメインは、１４から１３２までであり、ＰＨＤ２は２０９から３３０である。タンパク質配列が知らされると、これをコートする遺伝子配列は当業者なら容易に決定することができるはすである。一実現例で、ヒトＰＨＦ６遺伝子配列は、配列番号２と表示される。
【0024】
一般的に、ヒストンタンパク質は、真核細胞でＤＮＡをパッキングしてヌクレオソームという構造的ユニットを作る塩基性タンパク質である。ヒストンにはＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の５種類のファミリーがあって、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４は、ヌクレオソームのコアを構成して、Ｈ１／Ｈ５リンカーヒストンである。コアヒストンは、ダイマーとして存在する。本願に係るＰＨＦ６ ＰＨＤ２ドメインは、Ｈ２Ｂのアセチル化された１２番目残基を認識する。ＰＨＦ６のＰＨＤ１ドメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼであってＨ２Ｂの１２０番目リシン残基をユビキチン化させる。ユビキチンは、７６個のアミノ酸からなるタンパク質で、ユビキチンが結合されたヒストンに巻かれたクロマチンでは遺伝子転写が促進される。
【0025】
ヒト及びマウスのＨ２Ｂ ＮＣＢＩの遺伝子ＩＤは、各々：８３４７及び６８０２４である。Ｈ２Ｂタンパク質及び遺伝子配列は、ＮＣＢＩに次のように公知されている：Ｈ２Ｂのヒトタンパク質配列：ＮＰ＿００１３６８９１８．１、Ｈ２Ｂのヒト遺伝子配列：ＮＭ＿００１３８１９８９．１；マウスタンパク質配列：ＮＰ＿００１２７７３０９．１、遺伝子配列：ＮＭ＿００１２９０３８０．１．
【0026】
本願に係る方法で、候補物質を選別するために、ＰＨＦ６タンパク質及び１２番目残基がアセチル化された修飾されたヒストン２Ｂ（Ｈ２ＢＫ１２－Ａｃ）タンパク質は、分離されたタンパク質または前記タンパク質を発現する細胞または動物モデルとして提供されることができる。
【0027】
一実現例で、前記タンパク質は、真核細胞から分離／精製されて使われることができる。分離されたヒストンタンパク質は、真核細胞でタンパク質合成後、生成される翻訳後修飾（ＰＴＭ）でヒストンタンパク質のＮ－末端部位にアセチル化を含む。本願では、Ｈ２Ｂの１２番目リシン残基がアセチル化されたタンパク質である。必要な場合、原核細胞から分離されて使われることができる。この場合、分離されたタンパク質は、必要に応じてアセチル化酵素を利用してイン・ビトロでアセチル化されることもできる（Ｄａｖｉｄ Ｋｕｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５；１３１（３）：２５３－２６０．）。
【0028】
他の実現例では、真核細胞が使われることができる。前記真核細胞は、確立された真核細胞または動物の胚性幹細胞が使われることができる。
【0029】
一実現例で、本願に係る方法に使われる細胞は、ヒトまたはマウスを含む哺乳類由来の細胞でＰＨＦ６を過発現する真核細胞である。例えば、真核細胞はＺＨＢＴｃ４（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、Ｅ１４Ｔｇ２Ａ．４ （ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）、またはＨｅｌａ（ｃｅｒｖｉｘ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）等が使われることができ、前記細胞株は市中で購入できる。特定細胞株で特定遺伝子を過発現する方法は、公知されたもので、例えばヒトＰＨＦ６タンパク質をコートするプラスミドを目的する細胞株に伝達移入して使うことができる。しかし、細胞株はこれに制限されず、本願に係る目的を達成できる様々な細胞が使われることができる。
【0030】
本願に係る方法は、試験物質で処理されたタンパク質または細胞で前記ヒストンタンパク質のユビキチン化程度を測定する段階を含む。ヒストンＨ２Ｂのユビキチン化を測定する方法は公知されていて、例えば本願実施例に記載されたものを参照することができる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ ８：１４７９９ （２０１７））。前記測定する段階で、前記試験物質で処理されたタンパク質または細胞で、処理されなかった細胞と比較して、前記ヒストン２Ｂのユビキチン化水準に変化がある場合、前記試験物質をヒストンエピジェネティクス調節剤候補物質として選別することができる。
【0031】
他の実現例で、本願に係る方法に使われる細胞は、動物モデル、例えばマウスの一部である。本願に係る方法でマウスが使われる。
【0032】
本願に係る方法に使われる細胞は、このような細胞を含むオルガノイドまたはヒトを除いた動物モデルとして提供されることができる。このような動物モデルは、本願実施例または当業界公知された方法を利用して製造されることができる。本願でオルガノイドとは、実際の臓器の微細構造を示す３次元環境のイン・ビトロで産生されたミニ臓器である。これは、自己回復及び分化能を有する細胞が３次元培養環境で作られる。オルガノイドを製造する方法は、公示（Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｂｉｓｏ）されたものを参考することができる。
【0033】
本願は、ＰＨＦ６が既に独立的であると知らされた転写調節に関与する二つのヒストン修飾、即ちＨ２ＢＫ１２ ヒストン２Ｂ、１２番目リシン残基）のアセチル化及びＨ２ＢＫ１２０（ヒストン２Ｂ、１２０番目リシン残基）のユビキチン化をＰＨＤ１及びＰＨＤ２のドメインを介して機能単位で作動させて、ＰＨＤ２のＨ２ＢＫ１２－Ａｃ認識がＨ２ＢＫ１２０－Ｕｂに先行しなければならないとの発見に基づいたものである。特に本願では、白血病で発見されるＰＨＦ６の突然変異がＰＨＤ２ドメインのＨ２ＢＫ１２－Ａｃ認識部位に存在するのを明らかにして、Ｈ２ＢＫ１２０のユビキチン化に影響を与えることを究明した。そこで、ＰＨＤ２ドメインと独立的にＰＨＦ６がＰＨＤ１ドメインを介してＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を促進／増加／向上させることができる物質は、ＰＨＦ６の特にＰＨＤ２突然変異による白血病の治療剤として開発されることができる。
【0034】
そこで他の様態で本願は、ＰＨＦ６のＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質及びヒストン２Ｂタンパク質を提供する段階；前記タンパク質を前記ＰＨＤ１ドメインまたは前記ＰＨＦ６タンパク質に含まれたＰＨＤ１ドメインと前記ヒストン２Ｂタンパク質との結合を促進させると期待される物質の存在中で接触する段階；前記ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目リシン残基のユビキチン化水準を測定する段階；及び前記測定の結果、試験物質と処理されなかった対照群と比較して、処理された場合、ヒストン２Ｂタンパク質の１２０番目のユビキチン化が増加した場合、ＰＨＦ６によるヒストンエピジェネティクス調節剤スクリーニング方法に関するものである。
【0035】
ＰＨＦ６のＰＨＤ１ドメイン；またはＰＨＤ２ドメインが全部または一部欠失または突然変異されたＰＨＦ６タンパク質は、本願実施例及び本願に開示されたヒト遺伝子及びタンパク質配列を根拠に遺伝的方法によって当業者なら製造できるはずである。ＰＨＤ２ドメイン突然変異は、機能喪失突然変異を意味するが、特にＨ２ＢＫ１２Ａｃ認識に重要なグルタミン酸豊富モチーフ（図４参照）が欠失または置換などにより他のアミノ酸に突然変異されたものである。
【0036】
前記方法に使われるタンパク質は、前記タンパク質を発現する真核細胞、動物モデルまたはオルガノイド形態で提供されることができ、これに対しては、先述したものを参照することができる。
【0037】
また、前記方法に使われるユビキチン化測定方法も先述したものを参照することができる。
【0038】
本願に係る方法に使われる試験物質は、本願で究明されたＰＨＦ６のＨ２ＢＫ１２－Ａｃの認識を調節して、これと連結されたＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化の調節を持ってくると期待される物質、例えば低分子量化合物、高分子量化合物、化合物の混合物（例えば、天然抽出物または細胞または組織培養物）、または、バイオ医薬品（例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、ＲＮＡｚｙｍｅ及びＤＮＡｚｙｍｅ）または糖及び脂質などを含むが、これに限定しない。
【0039】
本願に係る一実現例では、低分子化合物が試験物質として使われることができる。前記試験物質は、合成または天然化合物のライブラリーから得ることができて、このような化合物のライブラリーを得る方法は、当業界に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能で、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能である。試験物質は、当業界に公知された様々な組み合わせライブラリー方法によって得ることができて、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが要求される合成ライブラリー方法、「１－ビーズ１－化合物」ライブラリー方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を利用する合成ライブラリー方法によって得ることができる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４等に開示されている。例えば、薬物のスクリーニング目的のためには、化合物は低分子量の治療効果を有するものが使われることができる。例えば、重量が４００Ｄａ、６００Ｄａまたは８００Ｄａのような約１０００Ｄａ内外の化合物が使われることができる。目的に応じてこのような化合物は、化合物ライブラリーの一部を構成することができ、ライブラリーを構成する化合物の数字も数十個から数百万個まで多様である。このような化合物ライブラリーは、ペプチド、ペプトイド及びその他環状または線状のオリゴマー性化合物、及び鋳型を基本とする低分子化合物、例えばベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、カーボサイクル及びポリサイクル化合物（例えば、ナフタリン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、カーボハイドレート及びアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル及びへテロサイクル（例えば、トリアジン、インドール、チアゾリジンなど）を含むことものであってもよいが、これは単に例示的であって、これに限定されない。
【0040】
また、例えばバイオロジックスがスクリーニングに使われることができる。バイオロジックスは、細胞またはバイオ分子を称するもので、バイオ分子とは、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生体内及び生体外で細胞システムなどを利用して産生された物質を称するものである。バイオ分子を単独でまたは他のバイオ分子または細胞と組み合わせで提供されることができる。バイオ分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗体、または、その他血漿で発見されるタンパク質または生物学的有機物質を含むものである。
【0041】
一実現例で、本願に係る方法で候補物質を選別することができる増加または減少は、当業者なら本願に開示された結果及び当業者の常識を考慮して適切に選択することができて、例えばこれに制限しないが試験物質と接触しなかった対照群と比較して、試験物質の存在下で約１０％以上増加または減少、約２０％以上増加または減少、約３０％以上増加または減少、約４０％以上増加または減少、約５０％以上増加または減少、約６０％以上増加または減少、約７０％以上増加または減少、約８０％以上増加または減少、約８０％以上増加または減少、約１００％増加または減少、またはその間の範囲を含む試験物質を候補物質として選別することができるが、前記を超える範囲を除くのではない。
【0042】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されるだけであって、本発明が下記の実施例に限定されるのではない。
【0043】
実施例
実験材料及び方法
細胞培養及び試薬条件付きでＯｃｔ４欠乏を誘導することができる（ＺＨＢＴｃ４）マウス胚性幹細胞ラインは既に知られている。細胞培養は簡略に、初１～２継代でマウス胚芽繊維亜細胞が敷かれている状態で維持した。この状態で安定化後、０．１％ゼラチンがコーティングされた培養皿を使って胚性幹細胞を培養した。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１５％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．０５５ｍＭβ－メルカプトエタノール（ｂ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２ ｍＭＬ－グルタミン酸（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（ＧＩＢＣＯ）、そして１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）が添加されて、３７℃の加湿インキュベーターで培養した。すべての細胞株は、定期的にマイコプラズマ汚染に対してテストされた。ＺＨＢＴｃ４の胚盤胞分化リプログラミングのために、０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（ＤＯＸ）（＃Ｄ３０７２，ＳＩＧＭＡ）を２日間処理した。ＺＨＢＴｃ４の神経外胚葉分化のために、１０ｍｇ／ｍｌトランス－レチノイン酸（ＲＡ）（＃Ｒ２６２５，ＳＩＧＭＡ）を４日間ＬＩＦなしで処理した。マウス胚性幹細胞でのＤＮＡ トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って行われた。ＣＢＰ及びｐ３００のノックダウンに対するｓｉＲＮＡ配列は、ｔｔｐ：／／ｇｅｓｔｅｌａｎｄ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡ＿ｓｃａｌｅｓで設計した。ＲＮＦ２０のノックダウンに対するｓｉＲＮＡ配列は、前に報告された通りに使われた。実験に使われた抗体の情報は次のとおりである。：Ｎｏｖｕｓ社の抗－ＰＨＦ６（＃６８２６２）；Ａｂｃａｍ社の抗－ナノグ（ａｂ２１６２４）、抗－Ｈ３（ａｂ１７９１）、抗－Ｈ２Ｂ（ａｂ１７９０）、抗－Ｈ４（ａｂ１０１５８）、抗－Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０）、抗－Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（ａｂ８８９５）、抗－Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（ａｂ６００２）、抗－Ｈ３Ｋ２７Ａｃ（ａｂ４７２９）、抗－Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（ａｂ８８９８）、抗－Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ（ａｂ１９５４９４）、抗－ＲＮＦ４０（ａｂ１９１３０９）及び抗－Ｃｄｘ２（ａｂ１５７５２４）；Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社の抗－ＵＳＰ４４（ｓｃ－３７７２０３）、抗－ｐ３００（ｓｃ－５８４）、抗－ＣＢＰ（ｓｃ－１２１１）、抗－Ｏｃｔ４（ｓｃ－５２７９）、抗－ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－２５７７８）及び抗－ＧＳＴ（ｓｃ－４５９）；Ｂｅｔｈｌｙ社の抗－ＲＮＦ２０（Ａ３００－７１４Ａ）；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社の抗－Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ（＃３９６２３）；シグマ社の抗－Ｆｌａｇ（＃Ｆ３１６５）及び抗－β－ａｃｔｉｎ（＃Ａ１９７８）；Ａｂｍ社の抗－Ｈｉｓ（＃Ｇ０２０）。
実験材料及び方法
細胞培養及び試薬条件付きでＯｃｔ４欠乏を誘導することができる（ＺＨＢＴｃ４）マウス胚性幹細胞ラインは既に知られている。細胞培養は簡略に、初１～２継代でマウス胚芽繊維亜細胞が敷かれている状態で維持した。この状態で安定化後、０．１％ゼラチンがコーティングされた培養皿を使って胚性幹細胞を培養した。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１５％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．０５５ｍＭβ－メルカプトエタノール（ｂ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２ ｍＭＬ－グルタミン酸（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（ＧＩＢＣＯ）、そして１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）が添加されて、３７℃の加湿インキュベーターで培養した。すべての細胞株は、定期的にマイコプラズマ汚染に対してテストされた。ＺＨＢＴｃ４の胚盤胞分化リプログラミングのために、０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン（ＤＯＸ）（＃Ｄ３０７２，ＳＩＧＭＡ）を２日間処理した。ＺＨＢＴｃ４の神経外胚葉分化のために、１０ｍｇ／ｍｌトランス－レチノイン酸（ＲＡ）（＃Ｒ２６２５，ＳＩＧＭＡ）を４日間ＬＩＦなしで処理した。マウス胚性幹細胞でのＤＮＡ トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って行われた。ＣＢＰ及びｐ３００のノックダウンに対するｓｉＲＮＡ配列は、ｔｔｐ：／／ｇｅｓｔｅｌａｎｄ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡ＿ｓｃａｌｅｓで設計した。ＲＮＦ２０のノックダウンに対するｓｉＲＮＡ配列は、前に報告された通りに使われた。実験に使われた抗体の情報は次のとおりである。：Ｎｏｖｕｓ社の抗－ＰＨＦ６（＃６８２６２）；Ａｂｃａｍ社の抗－ナノグ（ａｂ２１６２４）、抗－Ｈ３（ａｂ１７９１）、抗－Ｈ２Ｂ（ａｂ１７９０）、抗－Ｈ４（ａｂ１０１５８）、抗－Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０）、抗－Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（ａｂ８８９５）、抗－Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（ａｂ６００２）、抗－Ｈ３Ｋ２７Ａｃ（ａｂ４７２９）、抗－Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（ａｂ８８９８）、抗－Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ（ａｂ１９５４９４）、抗－ＲＮＦ４０（ａｂ１９１３０９）及び抗－Ｃｄｘ２（ａｂ１５７５２４）；Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社の抗－ＵＳＰ４４（ｓｃ－３７７２０３）、抗－ｐ３００（ｓｃ－５８４）、抗－ＣＢＰ（ｓｃ－１２１１）、抗－Ｏｃｔ４（ｓｃ－５２７９）、抗－ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－２５７７８）及び抗－ＧＳＴ（ｓｃ－４５９）；Ｂｅｔｈｌｙ社の抗－ＲＮＦ２０（Ａ３００－７１４Ａ）；Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社の抗－Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ（＃３９６２３）；シグマ社の抗－Ｆｌａｇ（＃Ｆ３１６５）及び抗－β－ａｃｔｉｎ（＃Ａ１９７８）；Ａｂｍ社の抗－Ｈｉｓ（＃Ｇ０２０）。
【0044】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ｓｈＲＮＡノックダウン細胞を作製するために、レンチウィルスｓｈＲＮＡをウイルスパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。細胞が６０～７０％程度育った状態であるトランスフェクション１日後、新しい培地に取り替えてウイルス収集のために２４時間の間維持した。ウイルス収集後、培地をろ過して４Ｘ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ収集器（＃６３１２３２、ＴＡＫＡＲＡ）と混合して、４℃で一晩中インキュベーション下した。以後収集したウイルスをポリブレンと混ぜて細胞に感染させた。ｓｈＲＮＡ配列は次のとおりである：
ｓｈＰｈｆ６ｆｗｄ
５’－ＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＴＴＴＴＧ－３’
ｒｅｖ
５’－ＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣ－３’．
ｓｈＲｎｆ２０
ｆｗｄ
５’－ＣＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧ－３’
ｒｅｖ
５’－ＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧ－３’．
ｓｈＲｎｆ４０
ｆｗｄ
５’－ＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧ－３’
ｒｅｖ
５’－ＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＧＴＧＧＴＣ－３’。
ｓｈＰｈｆ６ｆｗｄ
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ｒｅｖ
５’－ＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣ－３’．
ｓｈＲｎｆ２０
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５’－ＣＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧ－３’
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５’－ＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＣＧＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧ－３’．
ｓｈＲｎｆ４０
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５’－ＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＧＡＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧ－３’
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【0045】
Ｐｈｆ６ Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ（ＫＯ）マウスＥＳＣ生成
Ｐｈｆ６ ＫＯマウス胚性幹細胞作製は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使った。Ｐｈｆ６標的化のために、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）デザインをＧＰＰ ｓｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＣＲＩＳＰＲｋｏ）から行った。選択したｓｇＲＮＡをｐＲＧＥＮ－Ｕ６ベクターにクローニングしてＺＨＢＴｃ４にトランスフェクションした。ピューロマイシン処理による単一コロニー選択後、Ｐｈｆ６ ＫＯコロニーを収得して、免疫ブロッティングで確認した後、サンガーシーケンシングによってフレームシフト突然変異を確認した。
Ｐｈｆ６ ＫＯマウス胚性幹細胞作製は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使った。Ｐｈｆ６標的化のために、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）デザインをＧＰＰ ｓｇＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＣＲＩＳＰＲｋｏ）から行った。選択したｓｇＲＮＡをｐＲＧＥＮ－Ｕ６ベクターにクローニングしてＺＨＢＴｃ４にトランスフェクションした。ピューロマイシン処理による単一コロニー選択後、Ｐｈｆ６ ＫＯコロニーを収得して、免疫ブロッティングで確認した後、サンガーシーケンシングによってフレームシフト突然変異を確認した。
【0046】
胚芽体（ＥＢ）形成
ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞をハンギングドロップ方法によって１０００個の細胞／滴で開始した。滴状態で２日間維持した後、各滴はコーティングされなかった滅菌カパーガラス及び丸い底の９６ウェルプレートに移して培養した。培地は、毎日添加あるいは取り替えて、プレート移動は、ＥＢに対する物理的影響を最小化するために最小で固定された。すべてのＥＢは、ＬＩＦがない培地を使って培養された。
ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞をハンギングドロップ方法によって１０００個の細胞／滴で開始した。滴状態で２日間維持した後、各滴はコーティングされなかった滅菌カパーガラス及び丸い底の９６ウェルプレートに移して培養した。培地は、毎日添加あるいは取り替えて、プレート移動は、ＥＢに対する物理的影響を最小化するために最小で固定された。すべてのＥＢは、ＬＩＦがない培地を使って培養された。
【0047】
アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）染色
ＡＰ染色のために、野生型（ＷＴ）及びＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４を１２ウェルプレートで０．１％ゼラチンコーティングされたカパーガラス上で培養した。ウェル当たり１０４個の細胞が初めにまかれた。２日後、ＡＰ染色は、アルカリ性フォスファターゼ検出キット（＃ＳＣＲ００４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って行われた。提供されたプロトコルにより染色を行った。簡略に、各細胞を１－２％の間４％パラホルムアルデヒドで固定させて、室温で溶液（ナフトール／ファーストレッドバイオレットミックス）と１５－２０分の間反応させた。反応後溶液を洗い落としてイメージスライドを作った。
ＡＰ染色のために、野生型（ＷＴ）及びＰｈｆ６ ＫＯ ＺＨＢＴｃ４を１２ウェルプレートで０．１％ゼラチンコーティングされたカパーガラス上で培養した。ウェル当たり１０４個の細胞が初めにまかれた。２日後、ＡＰ染色は、アルカリ性フォスファターゼ検出キット（＃ＳＣＲ００４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って行われた。提供されたプロトコルにより染色を行った。簡略に、各細胞を１－２％の間４％パラホルムアルデヒドで固定させて、室温で溶液（ナフトール／ファーストレッドバイオレットミックス）と１５－２０分の間反応させた。反応後溶液を洗い落としてイメージスライドを作った。
【0048】
生きている細胞イメージング
ＺＨＢＴｃ４幹細胞及び胚芽体の成長を追跡するために、ＪｕＬＩ Ｓｔａｇｅリアルタイム細胞履歴記録器（ＮａｎｏＥｎＴｅＫ）が使われた。胚性幹細胞成長を追跡するために、１０４細胞を０．１％ゼラチンコーティングされた１２ウェル培養皿に撒いて、１２時間毎に細胞が育った程度を記録した。記録が完了した後、細胞成長曲線は、ＪｕＬＩによって提供されたソフトによって分析された。胚芽体形成の場合、各々の滴を９６ウェル丸い形プレートの各々のウェルに移動させて１２時間毎に細胞形態を記録した。そうした後、提供されたソフトでイメージを撮影した。胚芽体コアの他に細胞領域を計算するために、ＩｍａｇｅＪプログラムを使って７日に撮影したイメージで領域の大きさを計算した。
ＺＨＢＴｃ４幹細胞及び胚芽体の成長を追跡するために、ＪｕＬＩ Ｓｔａｇｅリアルタイム細胞履歴記録器（ＮａｎｏＥｎＴｅＫ）が使われた。胚性幹細胞成長を追跡するために、１０４細胞を０．１％ゼラチンコーティングされた１２ウェル培養皿に撒いて、１２時間毎に細胞が育った程度を記録した。記録が完了した後、細胞成長曲線は、ＪｕＬＩによって提供されたソフトによって分析された。胚芽体形成の場合、各々の滴を９６ウェル丸い形プレートの各々のウェルに移動させて１２時間毎に細胞形態を記録した。そうした後、提供されたソフトでイメージを撮影した。胚芽体コアの他に細胞領域を計算するために、ＩｍａｇｅＪプログラムを使って７日に撮影したイメージで領域の大きさを計算した。
【0049】
免疫細胞化学染色法
免疫蛍光撮影のための胚芽体を実験前にカバースリップで成長させた（カバースリップ当たり一つの胚芽体）。胚芽体をＰＢＳに混ぜた２％パラホルムアルデヒドで１０分の間固定させた後、室温においてＤＰＢＳで２回洗浄した。固定細胞を室温で５分の間ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）中０．５％トリトンＸ－１００で透過化させた。０．１％ ＰＢＳ－Ｔ中１０％ ＦＢＳで３０分の間ブロッキングを行った。染色のために、細胞を室温で４時間の間１次抗体と共にインキュベーションして、０．１％ ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄して、蛍光標識された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間の間インキュベーションした。細胞を洗浄してＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）と共にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって固定した。蛍光は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で撮影した。
免疫蛍光撮影のための胚芽体を実験前にカバースリップで成長させた（カバースリップ当たり一つの胚芽体）。胚芽体をＰＢＳに混ぜた２％パラホルムアルデヒドで１０分の間固定させた後、室温においてＤＰＢＳで２回洗浄した。固定細胞を室温で５分の間ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）中０．５％トリトンＸ－１００で透過化させた。０．１％ ＰＢＳ－Ｔ中１０％ ＦＢＳで３０分の間ブロッキングを行った。染色のために、細胞を室温で４時間の間１次抗体と共にインキュベーションして、０．１％ ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄して、蛍光標識された２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間の間インキュベーションした。細胞を洗浄してＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）と共にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｈ－１２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって固定した。蛍光は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で撮影した。
【0050】
細胞融解（Ｌｙｓｉｓ）
融解前細胞は冷たいＰＢＳで簡単にすすいだ。プロテアーゼ抑制剤が添加された溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ ＮＰ－４０）に細胞を溶解した後、ブランソンソニファイア４５０を使って超音波処理で細胞を溶解した（出力４、１０～１２パルス）。溶解物はブラッドフォード方法で定量してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
融解前細胞は冷たいＰＢＳで簡単にすすいだ。プロテアーゼ抑制剤が添加された溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ ＮＰ－４０）に細胞を溶解した後、ブランソンソニファイア４５０を使って超音波処理で細胞を溶解した（出力４、１０～１２パルス）。溶解物はブラッドフォード方法で定量してＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0051】
Ｆａｒ ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング
大腸菌でＧＳＴビーズを使ってＧＳＴ－ＰＨＦ６タンパク質を精製した。ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞からヒストン抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。大きさに応じてＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ及びＨ４順にヒストンオクタマーを分離した後、精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６タンパク質０．１ｍｇ／ｍｌを緩衝溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１０％グリセロール、０．１％ツイン－２０、５０ｍＭ ＺｎＣｌ２、２％脱脂粉乳及び１ｍＭ ＤＴＴ）でヒストン抽出物と共に反応させた。ヒストンが分離されたメンブレイン上にＧＳＴ－ＰＨＦ６の結合後、抗－ＧＳＴ抗体を使って免疫ブロット分析を行った。
大腸菌でＧＳＴビーズを使ってＧＳＴ－ＰＨＦ６タンパク質を精製した。ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞からヒストン抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。大きさに応じてＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ及びＨ４順にヒストンオクタマーを分離した後、精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６タンパク質０．１ｍｇ／ｍｌを緩衝溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１０％グリセロール、０．１％ツイン－２０、５０ｍＭ ＺｎＣｌ２、２％脱脂粉乳及び１ｍＭ ＤＴＴ）でヒストン抽出物と共に反応させた。ヒストンが分離されたメンブレイン上にＧＳＴ－ＰＨＦ６の結合後、抗－ＧＳＴ抗体を使って免疫ブロット分析を行った。
【0052】
試験管内ヒストンペプチドプルダウン分析
分析緩衝液（２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．０５％ ＮＰ－４０、及び５０ｍＭ ＺｎＣｌ２）で０．３μｇのＧＳＴ精製したタンパク質と０．５μｇのビオチン化されたヒストンペプチドを一晩インキュベーションした。続いて、５０％スラリーのストレプトアビジンビーズを添加して１時間の間追加でインキュベーションした。この後、洗浄で非特異的相互作用を除去した後、ビーズをサンプリング緩衝液で沸騰させてペプチド－タンパク質相互作用を免疫ブロッティングによって検出した。ヒストンＨ３修飾に対するビオチン化されたヒストンペプチドはＢｏｓｔｏｎ ＢｉｏＣｈｅｍｓから購入して、ヒストンＨ２Ｂ修飾についてはＪＰＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
分析緩衝液（２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．０５％ ＮＰ－４０、及び５０ｍＭ ＺｎＣｌ２）で０．３μｇのＧＳＴ精製したタンパク質と０．５μｇのビオチン化されたヒストンペプチドを一晩インキュベーションした。続いて、５０％スラリーのストレプトアビジンビーズを添加して１時間の間追加でインキュベーションした。この後、洗浄で非特異的相互作用を除去した後、ビーズをサンプリング緩衝液で沸騰させてペプチド－タンパク質相互作用を免疫ブロッティングによって検出した。ヒストンＨ３修飾に対するビオチン化されたヒストンペプチドはＢｏｓｔｏｎ ＢｉｏＣｈｅｍｓから購入して、ヒストンＨ２Ｂ修飾についてはＪＰＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【0053】
試験管内ヒストンペプチド結合アレイ
ヒストンペプチド結合アレイキットは、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ（＃１３００５）から購入した。提供されたプロトコルにより次の分析が進行された。簡単に、４℃で一晩中５％牛乳が混ざったＴＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％ツイン－２０）でキットをブロッキングした。以後、キットを室温で１時間の間結合緩衝剤（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．１ｍＭ ＤＴＴ）中０．３μｇの溶離されたＧＳＴ－ＰＨＦ６と共に培養した。続いて、ＧＳＴ １次抗体及び２次抗体をキットで室温で１時間の間順次インキュベーションした。各段階の間にＴＴＢＳで３回洗浄作業を進めた。
ヒストンペプチド結合アレイキットは、ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ（＃１３００５）から購入した。提供されたプロトコルにより次の分析が進行された。簡単に、４℃で一晩中５％牛乳が混ざったＴＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０５％ツイン－２０）でキットをブロッキングした。以後、キットを室温で１時間の間結合緩衝剤（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び０．１ｍＭ ＤＴＴ）中０．３μｇの溶離されたＧＳＴ－ＰＨＦ６と共に培養した。続いて、ＧＳＴ １次抗体及び２次抗体をキットで室温で１時間の間順次インキュベーションした。各段階の間にＴＴＢＳで３回洗浄作業を進めた。
【0054】
タンパク質発現及び精製
ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ２２３Ｓ突然変異体（ＭＴ）は、ロゼッタ（ＤＥ３）大腸菌細胞でＧＳＴ融合タンパク質として発現した。０．２５ｍＭイソプロフィール１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に誘導した後、２０℃で一晩中成長させた後、細胞を収穫して、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が補充されたホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中エマルシーフレックスＣ３（アバスチン）を使って溶解させた。１５分の間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液をグルタチオンアガロースカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にローディングした。平衡緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］及び３００ｍＭ ＮａＣｌ）でカラム洗浄した後、各タンパク質を溶離緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ還元グルタチオン）で溶離させた。各々のＧＳＴ－ＰＨＦ６（ＷＴ及びＥ２２３Ｓ）をゲルろ過緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のサイズ排除カラムであるＨｉＴｒａｐ ＳＰカチオン交換カラムで精製した。対照実験のために、ＧＳＴはＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）大腸菌細胞で発現されて、ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムの代わりにＨｉＴｒａｐ Ｑアニオン交換カラムを使うことを除いては前述したのと類似するように精製された。
ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ２２３Ｓ突然変異体（ＭＴ）は、ロゼッタ（ＤＥ３）大腸菌細胞でＧＳＴ融合タンパク質として発現した。０．２５ｍＭイソプロフィール１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）に誘導した後、２０℃で一晩中成長させた後、細胞を収穫して、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が補充されたホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中エマルシーフレックスＣ３（アバスチン）を使って溶解させた。１５分の間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液をグルタチオンアガロースカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にローディングした。平衡緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］及び３００ｍＭ ＮａＣｌ）でカラム洗浄した後、各タンパク質を溶離緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ還元グルタチオン）で溶離させた。各々のＧＳＴ－ＰＨＦ６（ＷＴ及びＥ２２３Ｓ）をゲルろ過緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のサイズ排除カラムであるＨｉＴｒａｐ ＳＰカチオン交換カラムで精製した。対照実験のために、ＧＳＴはＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）大腸菌細胞で発現されて、ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムの代わりにＨｉＴｒａｐ Ｑアニオン交換カラムを使うことを除いては前述したのと類似するように精製された。
【0055】
ＭＳＴ（ＭｉｃｒｏＳｃａｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）測定
結合性測定は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５ｐｉｃｏで行われた。Ｈ２Ｂペプチド（１－２０）ＷＴ及びＫ１２Ａｃ修飾を有するペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから購入して、各々のＧＳＴ－ＰＨＦ６（ＷＴ及びＥ２２３Ｓ ＭＴ）及びＧＳＴは、染料ＮＴ－６４７（Ｃｙ５）（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）で標識された。標識されたＧＳＴ及びＧＳＴ－ＰＨＦ６は、～９０ｎＭの濃度で使われた。各々のＨ２ＢペプチドをＭＳＴ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイン－２０及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で～８８０ｍＭから２６ｎＭに希釈して、標識されたタンパク質と共に１０分の間室温で培養した。ＭＳＴ測定は、４０％ ＭＳＴ電力及び２５％ ＬＥＤ電力（ＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ）または１２％ ＬＥＤ電力（ＧＳＴ－ＰＨＦ６ Ｅ２２３Ｓ及びＧＳＴ）において２２℃で行われた。各データセットは、ＭＯを使って分析された（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
結合性測定は、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５ｐｉｃｏで行われた。Ｈ２Ｂペプチド（１－２０）ＷＴ及びＫ１２Ａｃ修飾を有するペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから購入して、各々のＧＳＴ－ＰＨＦ６（ＷＴ及びＥ２２３Ｓ ＭＴ）及びＧＳＴは、染料ＮＴ－６４７（Ｃｙ５）（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）で標識された。標識されたＧＳＴ及びＧＳＴ－ＰＨＦ６は、～９０ｎＭの濃度で使われた。各々のＨ２ＢペプチドをＭＳＴ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイン－２０及び０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で～８８０ｍＭから２６ｎＭに希釈して、標識されたタンパク質と共に１０分の間室温で培養した。ＭＳＴ測定は、４０％ ＭＳＴ電力及び２５％ ＬＥＤ電力（ＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ）または１２％ ＬＥＤ電力（ＧＳＴ－ＰＨＦ６ Ｅ２２３Ｓ及びＧＳＴ）において２２℃で行われた。各データセットは、ＭＯを使って分析された（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【0056】
試験管内のユビキチン化分析
基質の場合、Ｈ２Ｂ－Ｆｌａｇ ＷＴ／Ｋ１２ＲをＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞に形質感染させて、モノヌクレオソームを含有するＨ２Ｂ－ＦｌａｇをＭＮａｓｅ消化によって精製した。精製後、これらのヌクレオソームをＥ１、Ｅ２、Ｅ３酵素、ユビキチン、５０ｍＭ ＺｎＣｌ２及び１０ｘ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＤＴＴ）と５０μｌで混合した。続いて３７℃で１時間の間インキュベーションした。反応を停止させるために、サンプリング緩衝液を添加して、サンプルを１００℃で１０分の間沸騰させた。Ｅ１、Ｅ２（ＵＢＣＨ３、ＵＢＣＨ６）及びユビキチンは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｓから購入した。精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ／突然変異は、Ｅ３リガーゼと見なされた。
基質の場合、Ｈ２Ｂ－Ｆｌａｇ ＷＴ／Ｋ１２ＲをＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞に形質感染させて、モノヌクレオソームを含有するＨ２Ｂ－ＦｌａｇをＭＮａｓｅ消化によって精製した。精製後、これらのヌクレオソームをＥ１、Ｅ２、Ｅ３酵素、ユビキチン、５０ｍＭ ＺｎＣｌ２及び１０ｘ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＤＴＴ）と５０μｌで混合した。続いて３７℃で１時間の間インキュベーションした。反応を停止させるために、サンプリング緩衝液を添加して、サンプルを１００℃で１０分の間沸騰させた。Ｅ１、Ｅ２（ＵＢＣＨ３、ＵＢＣＨ６）及びユビキチンは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｓから購入した。精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴ／突然変異は、Ｅ３リガーゼと見なされた。
【0057】
試験管内ＧＳＴ－プルダウン分析
Ｅ２及びＥ３関係として、ＰＨＦ６とＵＣＢＨ３間の相互作用を確認するために、試験管内ユビキチン化分析によってＨｉｓ－ＵＢＣＨ３をユビキチン化した。ＵＢＣＨ３－ユビキチンコンジュゲーションのために、５０ｎｇのＥ１、０．５μｇのＨｉｓ－ＵＢＣＨ３及びユビキチンをユビキチン化分析緩衝液と共に３７℃で１時間の間培養した。次に、１μｇのユビキチン接合されたＨｉｓ－ＵＢＣＨ３を１ｍｌ体積のプルダウン検定緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ ＮＰ－４０及びプロテアーゼ抑制剤）でビーズ結合されたＧＳＴ単独またはＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異と共に４℃で一晩中培養した。反応後、同じ緩衝液でビーズを４回洗浄して、サンプリング緩衝液でビーズを沸騰させた。
Ｅ２及びＥ３関係として、ＰＨＦ６とＵＣＢＨ３間の相互作用を確認するために、試験管内ユビキチン化分析によってＨｉｓ－ＵＢＣＨ３をユビキチン化した。ＵＢＣＨ３－ユビキチンコンジュゲーションのために、５０ｎｇのＥ１、０．５μｇのＨｉｓ－ＵＢＣＨ３及びユビキチンをユビキチン化分析緩衝液と共に３７℃で１時間の間培養した。次に、１μｇのユビキチン接合されたＨｉｓ－ＵＢＣＨ３を１ｍｌ体積のプルダウン検定緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ ＮＰ－４０及びプロテアーゼ抑制剤）でビーズ結合されたＧＳＴ単独またはＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異と共に４℃で一晩中培養した。反応後、同じ緩衝液でビーズを４回洗浄して、サンプリング緩衝液でビーズを沸騰させた。
【0058】
ＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及びＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰ分析
ＣｈＩＰ分析は、基本的に報告された通り行われた。ＣｈＩＰ分析のために、細胞を室温で１５分の間１％ホルムアルデヒドによって架橋させた。核ペレットをＲＩＰＡ緩衝液で超音波処理した。ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰの場合、核ペレットをＭＮａｓｅ溶解緩衝液に溶解させて超音波処理の代わりに３７℃で１０分の間ＭＮａｓｅと反応させた。逆架橋は６５℃で一晩中行われた。ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰサンプルの逆架橋及び免疫ブロッティングのために、免疫沈殿されたビーズを２Ｘサンプリング緩衝液と混合して１００℃で４５分の間沸騰させた。精製カラム（＃２８１０５、ＱＩＡＧＥＮ）によってＤＮＡを単離した。溶離されたＤＮＡはｑＲＴ－ＰＣＲによって検出された。すべての反応を３回行った。この研究に使用されたＣｈＩＰ－ｑＲＴ－ＰＣＲプライマーは次の表１のとおりである。
ＣｈＩＰ分析は、基本的に報告された通り行われた。ＣｈＩＰ分析のために、細胞を室温で１５分の間１％ホルムアルデヒドによって架橋させた。核ペレットをＲＩＰＡ緩衝液で超音波処理した。ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰの場合、核ペレットをＭＮａｓｅ溶解緩衝液に溶解させて超音波処理の代わりに３７℃で１０分の間ＭＮａｓｅと反応させた。逆架橋は６５℃で一晩中行われた。ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰサンプルの逆架橋及び免疫ブロッティングのために、免疫沈殿されたビーズを２Ｘサンプリング緩衝液と混合して１００℃で４５分の間沸騰させた。精製カラム（＃２８１０５、ＱＩＡＧＥＮ）によってＤＮＡを単離した。溶離されたＤＮＡはｑＲＴ－ＰＣＲによって検出された。すべての反応を３回行った。この研究に使用されたＣｈＩＰ－ｑＲＴ－ＰＣＲプライマーは次の表１のとおりである。
【0059】
【表1】
【0060】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って抽出して、Ｍ－ＭＬＶ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使って１～２μｇの総ＲＮＡで逆転写を行った。ｍＲＮＡの量は、ＳＹＢＲ ＴＯＰｒｅａｌ ｑＰＣＲ ２Ｘ ＰｒｅＭｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を有するＡＢＩプリズム７５００システムまたはＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４によって検出された。ｍＲＮＡの量は、ｄｄＣｔ方法を使って計算してＧａｐｄｈ及びβ－ａｃｔｉｎを対照群として使用した。すべての反応を３回行った。この研究に使用されたｑＲＴ－ＰＣＲプライマーは表１のとおりである。
総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って抽出して、Ｍ－ＭＬＶ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使って１～２μｇの総ＲＮＡで逆転写を行った。ｍＲＮＡの量は、ＳＹＢＲ ＴＯＰｒｅａｌ ｑＰＣＲ ２Ｘ ＰｒｅＭｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を有するＡＢＩプリズム７５００システムまたはＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４によって検出された。ｍＲＮＡの量は、ｄｄＣｔ方法を使って計算してＧａｐｄｈ及びβ－ａｃｔｉｎを対照群として使用した。すべての反応を３回行った。この研究に使用されたｑＲＴ－ＰＣＲプライマーは表１のとおりである。
【0061】
ＲＮＡシーケンシング分析
総ＲＮＡは、ＤＯＸ処理有無により各々ＷＴ及びＰｈｆ６欠乏細胞から抽出された。その後、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑプロトコルに従って、鎖ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを準備した。ＨｉＳｅｑプラットホームで生データを生成した後、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖ０．３６）によって品質が低いアダプタ及びべースを除去するために読み取りを事前処理した。次にＳＴＡＲ（ｖ２．５．３）を使って読み取り値を整列して、ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）をＲＳＥＭ（ｖ１．３．０）で計算した。遺伝子当たり読み取り回数を使って、正常状態、ＤＯＸ処理及びＲＡ処理でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯのすべての可能な６種類対別比較のために、ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．１８．１）で差別的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）を確認した。Ｒ－（ｖ３．４．３）で４セットのＤＥＧの結合に対してｋ－平均群集化を行った。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）の場合、表現型ラベルは２：２：５０：１０＝ＷＴ－ＤＯＸ：ＫＯ－ＤＯＸ：ＷＴ＋ＤＯＸ：ＫＯ＋ＤＯＸと定義されて、遺伝子当たりピアソン相関係数は、順位のために使われた。その後、分子シグネチャデータベース（ＭＳｉｇＤＢ）ｖ６．２の遺伝子セットに対して濃縮点数を計算した。各クラスターに対するＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ細胞間のＤＯＸ反応性の差を分析するために、まず各サンプルに対して各クラスターにある遺伝子のｚ－点数平均を求めた。その後、各々のＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞でＤＯＸの存在または不在に応じた平均値の差を計算して、これはＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞のＤＯＸ反応性と見なされた。最終的に、クラスターによるＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞間のＤＯＸ反応性の差は計算されて、クラスター当たりＰＨＦ６の存在または不在に応じてＤＯＸ反応性であるものと見なされた。
応答差＝｜（Σ（＋ＤＯＸｚ－点数）－ＷＴ（／ＤＯＸｚ－点数）ＷＴ）／ｎ－（Σ（＋ＤＯＸｚ－点数）－Σ（－ＤＯＸｚ－点数）ＫＯ）／ｎ｜
総ＲＮＡは、ＤＯＸ処理有無により各々ＷＴ及びＰｈｆ６欠乏細胞から抽出された。その後、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑプロトコルに従って、鎖ｍＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを準備した。ＨｉＳｅｑプラットホームで生データを生成した後、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖ０．３６）によって品質が低いアダプタ及びべースを除去するために読み取りを事前処理した。次にＳＴＡＲ（ｖ２．５．３）を使って読み取り値を整列して、ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）をＲＳＥＭ（ｖ１．３．０）で計算した。遺伝子当たり読み取り回数を使って、正常状態、ＤＯＸ処理及びＲＡ処理でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯのすべての可能な６種類対別比較のために、ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．１８．１）で差別的に発現された遺伝子（ＤＥＧ）を確認した。Ｒ－（ｖ３．４．３）で４セットのＤＥＧの結合に対してｋ－平均群集化を行った。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）の場合、表現型ラベルは２：２：５０：１０＝ＷＴ－ＤＯＸ：ＫＯ－ＤＯＸ：ＷＴ＋ＤＯＸ：ＫＯ＋ＤＯＸと定義されて、遺伝子当たりピアソン相関係数は、順位のために使われた。その後、分子シグネチャデータベース（ＭＳｉｇＤＢ）ｖ６．２の遺伝子セットに対して濃縮点数を計算した。各クラスターに対するＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ細胞間のＤＯＸ反応性の差を分析するために、まず各サンプルに対して各クラスターにある遺伝子のｚ－点数平均を求めた。その後、各々のＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞でＤＯＸの存在または不在に応じた平均値の差を計算して、これはＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞のＤＯＸ反応性と見なされた。最終的に、クラスターによるＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ細胞間のＤＯＸ反応性の差は計算されて、クラスター当たりＰＨＦ６の存在または不在に応じてＤＯＸ反応性であるものと見なされた。
応答差＝｜（Σ（＋ＤＯＸｚ－点数）－ＷＴ（／ＤＯＸｚ－点数）ＷＴ）／ｎ－（Σ（＋ＤＯＸｚ－点数）－Σ（－ＤＯＸｚ－点数）ＫＯ）／ｎ｜
【0062】
統計分析
すべての実験は３回独立的に行われた。値は平均±ＳＥＭで表示された。ＡＮＯＶＡテストを使って有意性を分析した。０．０５未満のＰ－値は統計的に有意であると見なされた。
すべての実験は３回独立的に行われた。値は平均±ＳＥＭで表示された。ＡＮＯＶＡテストを使って有意性を分析した。０．０５未満のＰ－値は統計的に有意であると見なされた。
【0063】
実施例１．Ｐｈｆ６欠乏による胚盤胞分化及びリプログラミングの問題究明
哺乳動物の初期発達段階で、ＰＨＦ６の潜在的な機能を確認するために、本発明者等はＰｈｆ６欠乏胚性幹細胞（Ｐｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣｓ）を作り、Ｐｈｆ６の欠乏が胚性幹細胞の多能性及び分化に影響を及ぼすか否かを調べた（図１Ａ）。本発明者等はＺＨＢＴｃ４マウス胚性幹細胞ラインを使ったが、これはテトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理によってＯｃｔ４が欠乏するように設計されている幹細胞である。胚性幹細胞は、Ｏｃｔ４の発現抑制後、初期胚盤胞系統でリプログラミングされることが知られている。従って、ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞システムは、試験管内で初期段階胚芽の全体系統を確認することができる利点がある。免疫ブロット分析によって本発明者等は、Ｐｈｆ６欠乏ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞ライン（以下Ｐｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣ）でＰＨＦ６の発現が完全に消えたことを確認した（図１Ｂ）。また、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ－ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）でＰｈｆ６の発現を抑制した時にも、ＺＨＢＴｃ４でＰＨＦ６発現が相当に減少されたのを確認した（図１Ｂ）。
哺乳動物の初期発達段階で、ＰＨＦ６の潜在的な機能を確認するために、本発明者等はＰｈｆ６欠乏胚性幹細胞（Ｐｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣｓ）を作り、Ｐｈｆ６の欠乏が胚性幹細胞の多能性及び分化に影響を及ぼすか否かを調べた（図１Ａ）。本発明者等はＺＨＢＴｃ４マウス胚性幹細胞ラインを使ったが、これはテトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理によってＯｃｔ４が欠乏するように設計されている幹細胞である。胚性幹細胞は、Ｏｃｔ４の発現抑制後、初期胚盤胞系統でリプログラミングされることが知られている。従って、ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞システムは、試験管内で初期段階胚芽の全体系統を確認することができる利点がある。免疫ブロット分析によって本発明者等は、Ｐｈｆ６欠乏ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞ライン（以下Ｐｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣ）でＰＨＦ６の発現が完全に消えたことを確認した（図１Ｂ）。また、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ－ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）でＰｈｆ６の発現を抑制した時にも、ＺＨＢＴｃ４でＰＨＦ６発現が相当に減少されたのを確認した（図１Ｂ）。
【0064】
本発明者等は、この野生型（ＷＴ）とＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞を比較して、ＰＨＦ６が自己回復及び多能性のような胚性幹細胞の主な特性に影響を及ぼすか否かを確認した。その結果、ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞の細胞成長率は、互いに大きく異ならないことを確認した（図１Ｃ）。また、胚性幹細胞の多能性に対するＰＨＦ６の影響を調べるために、アルカリ性フォスファターゼ（ＡＰ）活性を染色して測定した結果、二つの間のＡＰ染色に差がないことを確認した（図１Ｄ）。このような結果は、Ｐｈｆ６をｓｈＲＮＡノックダウンでもＰｈｆ６ ＫＯと同じ結果が出るのを確認した（図１Ｃ及びＤ）。次に、ｍＲＮＡ－シーケンシングによる差別発現遺伝子（ＤＥＧ）分析を行うことによって、ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞間の遺伝体の発現程度を比較した（図１Ｅ）。その結果、単にいくつかの遺伝子の発現がＰＨＦ６によって影響を受けたが、胚性幹細胞で発現程度が上位５０％に属する遺伝子の全体的な発現には影響を及ぼさないことを発見した（図１Ｆ）。また、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４を含むいくつかの胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現もＰｈｆ６欠乏によって影響を受けなかった（図１Ｆ）。これにより本発明者等はＰＨＦ６が胚性幹細胞の機能維持には影響を及ぼさないことを確認した。
【0065】
次に、ＰＨＦ６が分化段階で系統特異的な遺伝子発現に影響を及ぼすのか確認するために、本発明者等は胚性幹細胞を初期胚盤胞段階でリプログラムするＤＯＸを処理したり神経外胚葉で分化させるレチノイン酸（ＲＡ）を処理した後、ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣ間の遺伝子発現プロファイルを比較した（図１Ｅ）。まず、ＤＯＸまたはＲＡ処理によって相当上向き調節された遺伝子に対する遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。ＧＯ分析の結果、ＺＨＢＴｃ４胚性幹細胞は、ＤＯＸ処理によって胎盤発達に進む胚盤胞系統でリプログラミングして、ＲＡ処理による神経系発達に進む神経外胚葉系統でのＥＳＣの分化がよく誘導されたことを確認した（図１Ｇ）。次に、ＤＯＸまたはＲＡ処理下でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯを比較して、ＤＥＧを分析した結果、予想した通り異なる分化状態の間では単にいくつかの遺伝子のみ共有するのを確認した。ＧＯ分析結果、興味深いことにＤＯＸ処理下でＰｈｆ６欠乏によって発現が低くなった遺伝子群には、胎盤発達に関連した遺伝子が多く属した一方、ＲＡ処理下でＰｈｆ６欠乏によって発現に影響を受けた遺伝子群には神経分化に知らされた遺伝子が殆ど属しないことを確認した（図１Ｈ）。これにより、ＰＨＦ６が系統特異的方式で機能して、特に胚盤胞系統の分化段階に重要な遺伝子の発現に役割をすることを確認することができた。
【0066】
実施例２．ＰＨＦ６は胚盤胞分化マーカー遺伝子の転写活性因子であることを究明
胚性幹細胞の胚盤胞細胞でのリプログラミングの間ＰＨＦ６の機能を詳しく識別するために、本発明者等はＤＯＸ処理有無に応じたＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣｓの間ＤＥＧに対するｋ－平均クラスタリング（ｋ＝６）を行った（図２Ａ）。その後、各クラスターでＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞との間のＤＯＸ反応の差を測定した結果、クラスター１がＷＴとＰｈｆ６ ＫＯと間のＤＯＸ反応の差が最も大きいことを確認することができた（図２Ｂ）。この結果は、クラスター１内で遺伝子発現の調節がＰＨＦ６に大きく依存することを示唆する。クラスター１内の遺伝子発現の様子を確認した結果、胚性幹細胞状態（－ＤＯＸ）でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯとの間に殆どまたは全く差を見せなかったが、胚盤胞細胞でのリプログラミング状態（＋ＤＯＸ）で発現が相当増加して、この増加した発現がＰｈｆ６ ＫＯで相当減少した遺伝子が集まったクラスターであることを確認することができた（図２Ｃ）。また、ＤＯＸ処理をより発現が抑制される遺伝子のクラスター（クラスター２及び４）に対するＷＴとＰｈｆ６ ＫＯの差を確認して結果、これらのクラスターの遺伝子発現の差は、クラスター１に比べて高くないことを確認することができた（図２Ｂ）。クラスター１に属した遺伝子の生物学的機能をＧＯ分析によって確認した結果、予想した通り胚盤胞分化から派生する胎盤発生が最も有意味な生物学的機能と確認された（図２Ｄ）。この結果は、ＰＨＦ６が胚盤胞細胞リプログラミングの間転写活性因子として機能することを示す。
胚性幹細胞の胚盤胞細胞でのリプログラミングの間ＰＨＦ６の機能を詳しく識別するために、本発明者等はＤＯＸ処理有無に応じたＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣｓの間ＤＥＧに対するｋ－平均クラスタリング（ｋ＝６）を行った（図２Ａ）。その後、各クラスターでＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞との間のＤＯＸ反応の差を測定した結果、クラスター１がＷＴとＰｈｆ６ ＫＯと間のＤＯＸ反応の差が最も大きいことを確認することができた（図２Ｂ）。この結果は、クラスター１内で遺伝子発現の調節がＰＨＦ６に大きく依存することを示唆する。クラスター１内の遺伝子発現の様子を確認した結果、胚性幹細胞状態（－ＤＯＸ）でＷＴとＰｈｆ６ ＫＯとの間に殆どまたは全く差を見せなかったが、胚盤胞細胞でのリプログラミング状態（＋ＤＯＸ）で発現が相当増加して、この増加した発現がＰｈｆ６ ＫＯで相当減少した遺伝子が集まったクラスターであることを確認することができた（図２Ｃ）。また、ＤＯＸ処理をより発現が抑制される遺伝子のクラスター（クラスター２及び４）に対するＷＴとＰｈｆ６ ＫＯの差を確認して結果、これらのクラスターの遺伝子発現の差は、クラスター１に比べて高くないことを確認することができた（図２Ｂ）。クラスター１に属した遺伝子の生物学的機能をＧＯ分析によって確認した結果、予想した通り胚盤胞分化から派生する胎盤発生が最も有意味な生物学的機能と確認された（図２Ｄ）。この結果は、ＰＨＦ６が胚盤胞細胞リプログラミングの間転写活性因子として機能することを示す。
【0067】
実施例３．ＰＨＦ６は胚盤胞系統決定のための初期胚盤胞系統決定遺伝子の発現を活性化させることを究明
ＰＨＦ６が胚盤胞系統決定に対する遺伝子の発現に重要な役割をするのを確認したため、本発明者等は実際にＰＨＦ６が全体分化状態で胚盤胞分化に重要な役割をするか確認した。これのために胚芽体（ＥＢ）形成方法を活用してＰｈｆ６ ＫＯ及びＷＴ胚性幹細胞から抽出したＥＢを比較して、分化過程でＰＨＦ６の役割を確認した。胚芽体形成実験は、本来胚性幹細胞を三つの系統（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化させる方法であるが、近年このような胚芽体を付着させて分化させながら三つの胚葉に分化するＥＢコアだけでなく、胚芽体系統に分化する外部細胞層を生成できることが報告された。この方法を使って確認した結果、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で形成した胚芽体が、ＷＴ胚芽体とは異なって外部細胞層の形成に失敗することを確認した（図３Ａ）。また、この胚芽体を胚芽体分化のマーカー遺伝子であるＣＤＸ２と共に免疫染色をした結果、ＷＴ胚芽体の外部細胞層でＣＤＸ２が高く発現することを確認することによって、この外部細胞層が胚芽体系統に分化していく細胞層であることを確認した（図３Ｂ）。興味深いことに、ＰＨＦ６は外部細胞層でＣＤＸ２と共に発現するのを確認することができた（図３Ｃ）。また、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚芽体での分化の間、Ｃｄｘ２、Ｐｌａｃ１、Ａｓｃｌ２及びＧａｔａ２を含む胚盤胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ水準を確認した結果、ＷＴ胚盤胞に比べて相当低く発現するのを確認することができた（図３Ｄ）。これによりＰＨＦ６が胚盤胞分化でのマーカー遺伝子の転写活性化に決定的な役割をするのを確認することができた。
ＰＨＦ６が胚盤胞系統決定に対する遺伝子の発現に重要な役割をするのを確認したため、本発明者等は実際にＰＨＦ６が全体分化状態で胚盤胞分化に重要な役割をするか確認した。これのために胚芽体（ＥＢ）形成方法を活用してＰｈｆ６ ＫＯ及びＷＴ胚性幹細胞から抽出したＥＢを比較して、分化過程でＰＨＦ６の役割を確認した。胚芽体形成実験は、本来胚性幹細胞を三つの系統（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化させる方法であるが、近年このような胚芽体を付着させて分化させながら三つの胚葉に分化するＥＢコアだけでなく、胚芽体系統に分化する外部細胞層を生成できることが報告された。この方法を使って確認した結果、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で形成した胚芽体が、ＷＴ胚芽体とは異なって外部細胞層の形成に失敗することを確認した（図３Ａ）。また、この胚芽体を胚芽体分化のマーカー遺伝子であるＣＤＸ２と共に免疫染色をした結果、ＷＴ胚芽体の外部細胞層でＣＤＸ２が高く発現することを確認することによって、この外部細胞層が胚芽体系統に分化していく細胞層であることを確認した（図３Ｂ）。興味深いことに、ＰＨＦ６は外部細胞層でＣＤＸ２と共に発現するのを確認することができた（図３Ｃ）。また、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚芽体での分化の間、Ｃｄｘ２、Ｐｌａｃ１、Ａｓｃｌ２及びＧａｔａ２を含む胚盤胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ水準を確認した結果、ＷＴ胚盤胞に比べて相当低く発現するのを確認することができた（図３Ｄ）。これによりＰＨＦ６が胚盤胞分化でのマーカー遺伝子の転写活性化に決定的な役割をするのを確認することができた。
【0068】
実施例４．ＰＨＦ６はＨ２ＢＫ１２Ａｃ認識によってＨ２ＢＫ１２０ｕｂレベルを調節するエピジネティク調節因子であることを究明
次に、本発明者等はＰＨＦ６がどのようなヒストン修飾を認識して、このような転写調節因子としての機能を有するかを確認した。まずＰＨＦ６が４種類のヒストン中どのようなヒストンの修飾を認知するのか確認するために、ＺＨＢＴｃ４ ＥＳＣからヒストンを抽出した後、ＧＳＴ－ＰＨＦ６組換えタンパク質と共にＦａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ実験技法によってＰＨＦ６が直接認知するヒストンを確認した。その結果、ＧＳＴ－ＰＨＦ６組換えタンパク質が、ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３を選択的に認知することを発見した（図４Ａ）。次に、ＰＨＦ６によって認識されるＨ２Ｂ及びＨ３の特定修飾を確認するために、ヒストンペプチド配列キットを使ってスクリーニングを進めた。以前のＦａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ実験結果と一致するように、スクリーニング結果、ＰＨＦ６がいくつかの種類のヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の修飾が入っているペプチドに特異的に結合することを確認した。これを分析した結果、上位五つのヒストン修飾は、Ｈ２ＢＫ１５Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ、Ｈ３Ｒ２６ｍｅ２ａ及びＨ３Ｋ２７ｍｅ２であった（図４Ｂ）。これらを独立的に確認するために、各々のＨ２ＢまたはＨ３修飾に対してペプチド結合分析実験を行って、その結果ＰＨＦ６が試験管内でＨ２ＢＫ１２Ａｃに特異的に結合することを確認した（図４Ｃ）。
次に、本発明者等はＰＨＦ６がどのようなヒストン修飾を認識して、このような転写調節因子としての機能を有するかを確認した。まずＰＨＦ６が４種類のヒストン中どのようなヒストンの修飾を認知するのか確認するために、ＺＨＢＴｃ４ ＥＳＣからヒストンを抽出した後、ＧＳＴ－ＰＨＦ６組換えタンパク質と共にＦａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ実験技法によってＰＨＦ６が直接認知するヒストンを確認した。その結果、ＧＳＴ－ＰＨＦ６組換えタンパク質が、ヒストンＨ２Ｂ及びＨ３を選択的に認知することを発見した（図４Ａ）。次に、ＰＨＦ６によって認識されるＨ２Ｂ及びＨ３の特定修飾を確認するために、ヒストンペプチド配列キットを使ってスクリーニングを進めた。以前のＦａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ実験結果と一致するように、スクリーニング結果、ＰＨＦ６がいくつかの種類のヒストンＨ２Ｂ及びＨ３の修飾が入っているペプチドに特異的に結合することを確認した。これを分析した結果、上位五つのヒストン修飾は、Ｈ２ＢＫ１５Ａｃ、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ、Ｈ３Ｒ２６ｍｅ２ａ及びＨ３Ｋ２７ｍｅ２であった（図４Ｂ）。これらを独立的に確認するために、各々のＨ２ＢまたはＨ３修飾に対してペプチド結合分析実験を行って、その結果ＰＨＦ６が試験管内でＨ２ＢＫ１２Ａｃに特異的に結合することを確認した（図４Ｃ）。
【0069】
ＰＨＦ６は、二つの拡張ＰＨＤドメインを有しているので、どちらの拡張ＰＨＤによってＨ２ＢＫ１２Ａｃを読み取るＰＨＦ６の能力が付与されるか否かを明確にするために、ＰＨＦ６の二つの拡張ＰＨＤのアミノ酸配列を比較した。興味深いことに、２回目拡張ＰＨＤドメインだけ特異的に負に荷電されたアミノ酸が集まっている部位が存在するのを確認した（図４Ｄ）。既に報告されたＰＨＤドメインによるアセチル化認識の場合、負に荷電されたアミノ酸のカルボニル酸素がアセチル化のアセチルアミドと相互作用することによって認知機能に重要であるとの報告がある。また、報告されたＰＨＦ６の拡張ＰＨＤ２の結晶構造を確認した結果、負電荷を有する四つのグルタミン酸（Ｅ２１９、Ｅ２２０、Ｅ２２１及びＥ２２３）がアセチル化された基質認識モチーフを形成する主な残基としての可能性を確認することができた。これを確認するために、タンパク質の構造には影響を及ぼさないながら電荷をなくすグルタミン酸→セリン置換突然変異を使った結果、ＰＨＦ６の２２３番グルタミン酸残基をセリンに置き換えた突然変異（Ｅ２２３Ｓ）は、Ｈ２ＢＫ１２アセチル化認識が壊れるのを確認した（図４Ｅ）。また、ＭＳＴ分析を使った結合親和度測定は、ＧＳＴ－ＰＨＦ６ ＷＴがＨ２Ｂ ＷＴペプチドよりもＨ２ＢＫ１２アセチルペプチドに対して～５倍高い親和力を有する一方、ＧＳＴ－ＰＨＦ６ Ｅ２２３Ｓは、ＷＴ及びＫ１２Ａｃペプチドの両方に共に低い親和度で結合するのを確認した（図４Ｆ）。これらのデータは、ＰＨＦ６の２回目拡張ＰＨＤドメインでグルタミン酸モチーフがＨ２ＢＫ１２Ａｃ認識に決定的な役割をするのを示す。
【0070】
従来の癌研究で、Ｈ２ＢＫ１２アセチル化は、転写活性化マーカーで知られていた。このために、本発明者等はＰＨＦ６のアセチル認知機能が系統特異的遺伝子の発現を調節するのに重要であるとの仮設を立てた。ＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＨ２ＢＫ１２０ｕｂ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３及びＨ２ＢＫ１２Ａｃを含む様々なヒストン修飾を調べた。その中でも、Ｈ２Ｂ １２０番残基のユビキチン化（Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ）のレベルがＤＯＸ処理時ＷＴ ＥＳＣのものに比べてＰｈｆ６ ＫＯで相当減少しているのを確認した（図４Ｇ）。Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化の顕著な減少は、Ｈ２ＢＫ１２０ユビキチン化とＨ２ＢＫ１２アセチル化との間の潜在的な相互作用をうかがい知ることができる。これを確認するために、本発明者等はヒストンＨ２ＢＫ１２アセチル化をはじめとする様々なアセチル化のアセチル化酵素であるＣＢＰ／ｐ３００をＤＯＸを処理したＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でｓｉＲＮＡによってノックダウンして、ｐ３００またはＣＢＰのノックダウンがＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化に影響を及ぼすのか確認した。興味深いことに、ｐ３００またはＣＢＰのノックダウンは、ＤＯＸ処理状態でＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化及びＨ２ＢＫ１２アセチル化の両方ともに減少する結果を誘発し、これはＨ２ＢＫ１２０ｕｂとＨ２ＢＫ１２Ａｃとの間の相互作用があることを暗示する（図４Ｈ）。より直接的に二つのヒストン修飾間の相互作用を確認するために、本発明者等はＨ２Ｂのリシン１２番残基をアルギニンに置き換えたＨ２ＢＫ１２Ｒ突然変異と、リシン１２０番残基をアルギニンに置き換えたＨ２ＢＫ１２０Ｒ突然変異を使って、各々のヒストン修飾が起きない突然変異で相対ヒストン修飾がどのように変わるかを確認した。その結果、アセチル化欠乏突然変異（Ｈ２ＢＫ１２Ｒ）は、Ｈ２Ｂ ＷＴと比較してＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化が顕著な減少したのを確認した一方、Ｈ２ＢＫ１２０Ｒユビキチン化欠乏突然変異は、Ｈ２ＢＫ１２アセチル化に影響を及ぼさないことを確認することができた（図４Ｉ）。これにより本発明者等はＰＨＦ６が先行Ｈ２ＢＫ１２アセチル化認識によってＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を調節することを確認することができた。
【0071】
ＰＨＤを有するタンパク質は、典型的にヒストン修飾状態の変更のために、他の酵素を動員するリンカータンパク質として作用する。従って、本発明者等はＰＨＦ６がＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化に知らされたＥ３ユビキチンリガーゼまたは脱ユビキチナーゼを募集してＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を調節する可能性を確認した。ＲＮＦ２０／４０は、胚性幹細胞が神経外胚葉に分化する間、Ｈ２ＢＫ１２０ユビキチン化に対するＥ３リガーゼとして知られており、ＵＳＰ４４はこれに対する脱ユビキチナーゼとして機能すると知られている。まず本発明者等は、ＲＮＦ２０／４０及びＵＳＰ４４発現水準を調べて、これらの酵素の発現がＰＨＦ６によって調節されるかを確認したが、これらの中でいずれもＷＴ ＥＳＣに比べてＰｈｆ６ ＫＯ ＥＳＣで発現水準が有意味に変わらないことを確認した（図４Ｊ）。また、共同免疫沈殿分析により物理的結合があるか確認した結果、ＰＨＦ６はこれらの中のいずれのタンパク質とも結合しないことを確認することができた（図４Ｋ）。このデータは、ＰＨＦ６がＲＮＦ２０／４０及びＵＳＰ４４と独立的にＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を調節することを暗示する。さらに、Ｈ２ＢＫ１２０ユビキチン化の調節のためのＰＨＦ６の機能が、ＲＮＦ２０／４０のＥ３リガーゼ機能と独立的であるか否かを追加で証明するために、ＤＯＸ処理の有無でＰｈｆ６、Ｒｎｆ２０及びＲｎｆ４０のノックダウンに応じだＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を比較した。その結果、Ｐｈｆ６でないＲｎｆ２０／４０のノックダウンは、ＤＯＸ処理がない時にもＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化を減少させることを確認することができた（図４Ｌ）。しかし、Ｐｈｆ６のノックダウンは、ＤＯＸ処理時にだけＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化の減少を招いた（図４Ｌ）。より重要には、Ｐｈｆ６のノックダウンは、Ｃｄｘ２及びＧａｔａ２を含む胚盤胞分化マーカー遺伝子の発現を特異的に減少させる一方、Ｒｎｆ２０及びＲｎｆ４０のノックダウンは、ＤＯＸ処理時Ｃｄｘ２及びＧａｔａ２の発現に影響を及ぼさないことを確認した（図４Ｍ）。また、クロマチン免疫沈殿分析結果、Ｐｈｆ６のノックダウンによってはＣｄｘ２及びＧａｔａ２のプロモーターでＨ２ＢＫ１２０ユビキチン化が減少するが、ＲＮＦ２０／４０ノックダウンでは影響を受けないことを確認することができた（図４Ｎ）。これらのデータは、ＰＨＦ６が胚盤胞分化遺伝子の転写活性化のために、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ水準を特異的に調節して、これは既に知らされたＥ３リガーゼとは関係ないことを示す。
【0072】
実施例５．ＰＨＦ６はヒストンＨ２Ｂタンパク質の１２０番目リシン（Ｈ２ＢＫ１２０）に対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することを究明
従来の報告でＰＨＤドメイン自体がＥ３リガーゼ活性を有する場合が報告された。ＰＨＦ６は、２回目拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識して、Ｈ２ＢでＫ１２ＡｃとＫ１２０ｕｂとの間にＰＨＦ６依存性が存在するため、ＰＨＦ６がＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２０ｕｂに対するＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有するか否かを調べた。まず、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅを使って、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＨ２ＢＫ１２Ｒアセチル化欠乏突然変異及びＨ２Ｂ ＷＴが入っているモノヌクレオソームを溶離させた。続いて、精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６と溶離されたモノヌクレオソームを混合して試験管内のユビキチン化分析実験を行った（図５Ａ）。その結果、Ｅ２リガーゼパートナーとしてＵＢＣＨ６でないＵＢＣＨ３が作動した時、ＰＨＦ６がＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することを発見した（図５Ｂ）。この時、ＰＨＦ６は、Ｈ２ＢＫ１２Ｒアセチル化突然変異には、Ｈ２ＢＫ１２０をユビキチンすることができないことを確認することによって、ＰＨＦ６が先行Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ認識によってＨ２ＢＫ１２０ｕｂに対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することを追加で確認した。次に、この時、ＰＨＦ６の最初の拡張ＰＨＤドメインが、ＰＨＦ６のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有するかを確認した。試験管内ユビキチン化分析により、ＰＨＦ６ ＷＴはＨ２ＢＫ１２０をユビキチン化するが、Ｃ８２Ａ（亜鉛イオン捕捉を妨げることによって一番目の拡張ＰＨＤドメインの機能的活性が壊れた突然変異）またはＥ２２３Ｓ（２番目の拡張ＰＨＤドメインのＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識できない突然変異）で、二つ共Ｈ２ＢＫ１２０をユビキチン化できないことを確認した（図５Ｃ）。この結果は、ＰＨＦ６が２番目の拡張ＰＨＤを介してＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識して、続いて一番目の拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２０残基をユビキチン化することを暗示する。
従来の報告でＰＨＤドメイン自体がＥ３リガーゼ活性を有する場合が報告された。ＰＨＦ６は、２回目拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識して、Ｈ２ＢでＫ１２ＡｃとＫ１２０ｕｂとの間にＰＨＦ６依存性が存在するため、ＰＨＦ６がＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２０ｕｂに対するＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有するか否かを調べた。まず、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅを使って、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＨ２ＢＫ１２Ｒアセチル化欠乏突然変異及びＨ２Ｂ ＷＴが入っているモノヌクレオソームを溶離させた。続いて、精製されたＧＳＴ－ＰＨＦ６と溶離されたモノヌクレオソームを混合して試験管内のユビキチン化分析実験を行った（図５Ａ）。その結果、Ｅ２リガーゼパートナーとしてＵＢＣＨ６でないＵＢＣＨ３が作動した時、ＰＨＦ６がＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することを発見した（図５Ｂ）。この時、ＰＨＦ６は、Ｈ２ＢＫ１２Ｒアセチル化突然変異には、Ｈ２ＢＫ１２０をユビキチンすることができないことを確認することによって、ＰＨＦ６が先行Ｈ２ＢＫ１２Ａｃ認識によってＨ２ＢＫ１２０ｕｂに対するＥ３ユビキチンリガーゼとして機能することを追加で確認した。次に、この時、ＰＨＦ６の最初の拡張ＰＨＤドメインが、ＰＨＦ６のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有するかを確認した。試験管内ユビキチン化分析により、ＰＨＦ６ ＷＴはＨ２ＢＫ１２０をユビキチン化するが、Ｃ８２Ａ（亜鉛イオン捕捉を妨げることによって一番目の拡張ＰＨＤドメインの機能的活性が壊れた突然変異）またはＥ２２３Ｓ（２番目の拡張ＰＨＤドメインのＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識できない突然変異）で、二つ共Ｈ２ＢＫ１２０をユビキチン化できないことを確認した（図５Ｃ）。この結果は、ＰＨＦ６が２番目の拡張ＰＨＤを介してＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識して、続いて一番目の拡張ＰＨＤドメインを介してＨ２ＢＫ１２０残基をユビキチン化することを暗示する。
【0073】
次に胚性幹細胞の胚盤胞細胞でのリプログラミング段階でＰＨＦ６のＥ３ユビキチンリガーゼとしての機能を確認するために、本発明者等はＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＰＨＦ６ ＷＴ、Ｃ８２ＡまたはＥ２２３Ｓ突然変異を再び発現させた。しかし予想外に、Ｃ８２Ａ突然変異の発現水準が、細胞内では顕著に減少するのを観察した（図５Ｄ）。従来のＢＦｌ症候群でのＰＨＦ６突然変異に対する研究で、ＰＨＦ６の一番目のコアＰＨＤドメインの突然変異（Ｃ４５Ｙ及びＣ９９Ｆ）は、ＰＨＦ６のタンパク質安定性を減少させることが報告された。従って、本発明者等はタンパク質安定性に影響を与えないながらＰＨＦ６のＥ３リガーゼ活性が壊れる一番目の拡張ＰＨＤドメインの他の主なアミノ酸残基を探した。ＰＨＤドメインと類似する構造であってＥ３リガーゼ活性を有すると知られるＲＩＮＧドメインに対する以前の研究で、亜鉛カチオンをキャプチャーするコア残基（システインあるいはヒスチジン）の近くにある疏水性アミノ酸残基が、Ｅ３リガーゼ活性に重要であることが知られていたため、本発明者等はＰＨＦ６の一番目の拡張ＰＨＤドメイン内でこのような疏水性アミノ酸残基がＰＨＦ６のＥ３リガーゼ活性を発揮するのに重要であるか否かを調べた（図５Ｅ）。これのために、一番目の拡張ＰＨＤドメインで鐘間保存された疏水性残基を探して、これらに対する突然変異を作製して試験管内のユビキチン化分析を行った。興味深いことに、１２５番メチオニン残基（Ｍ１２５）及び１２９番アルギニン残基（Ｒ１２９）に対する突然変異は、ＰＨＦ６のＥ３リガーゼ活性が消えることを確認した（図５Ｆ）。また、ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ２２３Ｓ突然変異は、二つ共ＵＢＣＨ３ Ｅ２酵素に結合する能力を維持する一方、Ｍ１２５Ａ及びＲ１２９Ａ突然変異は、ＵＢＣＨ３に結合できないことを確認して、このような結果は、ＰＨＦ６の一番目のＰＨＤドメインがＥ３リガーゼ活性を有するドメインであることを示唆する（図５Ｇ）。このような研究結果を基に、本発明者等は、ＰＨＦ６がＨ２ＢＫ１２ＡｃとＨ２ＢＫ１２０ｕｂを連結するＥ３ユビキチンリガーゼの役割をするという、従来に認識できなかった調節分子基盤を提示する（図５Ｈ）。
【0074】
実施例６．ＰＨＦ６はＨ２ＢＫ１２０のユビキチン化によって胚盤胞系統マーカー遺伝子の発現に及ぼす影響を究明
ＰＨＦ６の２番目の拡張ＰＨＤドメインは、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃの認識を担当して、ＰＨＦ６の一番目の拡張ＰＨＤドメインは、Ｅ３リガーゼ活性を発揮するため、ＤＯＸ処理をした胚性幹細胞の胚盤胞分化への分化過程で、ＰＨＦ６のこのような活性を追加で確認した。まず、ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰ分析を行って、Ｅ２２３残基がＰＨＦ６のＨ２ＢＫ１２Ａｃ認識に重要であることを確認した。実際に、ＰＨＦ６ Ｅ２２３Ｓ突然変異は、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃが含まれたモノヌクレオソームに対する結合が相当減少した一方、ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ３リガーゼ突然変異Ｍ１２５Ａは、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃが含まれたモノヌクレオソーム結合能力を維持することを確認した（図６Ａ）。また、ＰＨＦ６ ＷＴが、エンハンサーのマーカーであるＨ３Ｋ４ｍｅ１が含まれたモノヌクレオソームとは結合できないことを発見した。このような結果は、ＰＨＦ６がＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識することによって標的遺伝子のプロモーター領域で機能をすることを示唆する。次に、ＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異をＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞に発現させた後、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂの変化を確認した。その結果、ＰＨＦ６ ＷＴを発現させた時は、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ水準が再び回復するのを確認したが、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃを認識することはできない突然変異であるＥ２２３ＳまたはＥ３リガーゼ活性がない突然変異であるＭ１２５ＡやＲ１２９Ａの発現は、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ水準が回復されないことを確認した（図６Ｂ）。次に、ＤＯＸ処理有無に応じだＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＣｄｘ２及びＧａｔａ２のプロモーターに対してＣｈＩＰ分析を行った。その結果、ＤＯＸ処理は、ＷＴ胚性幹細胞で、このような遺伝子のプロモーターでＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準と共にＰＨＦ６の募集が増加するのを確認したが、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞では、この増加が見られないことを確認した（図６Ｃ）。また、Ｐｈｆ６と有無と関係なく発現する遺伝子であるＭｓｘ２のプロモーターに対するＣｈＩＰ分析では、ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞との間にＰＨＦ６募集及びＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準の有意味な変化が現れないことを確認した（図６Ｄ）。これに加えて、プロモーター領域でＨ２ＢＫ１２０ｕｂに続いて現れるＨ３Ｋ４ｍｅ３の水準も確認した。予想した通り、Ｃｄｘ２及びＧａｔａ２プロモーターでのＨ３Ｋ４ｍｅ３水準は、ＤＯＸ処理に依存してＨ２ＢＫ１２０ｕｂ及びＰｈｆ６増加に応じて共に増加するのを確認した（図６Ｃ）。しかし、ＰＨＦ６と関係がない遺伝子であるＭｓｘ２のプロモーターでは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３水準もＰＨＦ６の有無と関係がなく増加するのを確認した（図６Ｄ）。次に、本発明者等はｌｅｎｔｉ－ｖｉｒｕｓ方法によって、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異を持続的に発現する細胞株を作製して、ここでＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異が発現するＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で胚盤胞分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ水準を比較した（図６Ｅ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって遺伝子の発現を確認した結果、ＰＨＦ６突然変異を発現した胚性幹細胞はＰＨＦ６ ＷＴが発現するＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞と比較した時、Ｃｄｘ２、Ａｓｃｌ２、Ｗｎｔ７ｂ、Ｆｇｆｒ２及びＰｌａｃ１を含む胚盤胞分化マーカー遺伝子の発現が有意に低くなっていることを確認した（図６Ｆ）。
ＰＨＦ６の２番目の拡張ＰＨＤドメインは、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃの認識を担当して、ＰＨＦ６の一番目の拡張ＰＨＤドメインは、Ｅ３リガーゼ活性を発揮するため、ＤＯＸ処理をした胚性幹細胞の胚盤胞分化への分化過程で、ＰＨＦ６のこのような活性を追加で確認した。まず、ＭＮａｓｅ－ＣｈＩＰ分析を行って、Ｅ２２３残基がＰＨＦ６のＨ２ＢＫ１２Ａｃ認識に重要であることを確認した。実際に、ＰＨＦ６ Ｅ２２３Ｓ突然変異は、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃが含まれたモノヌクレオソームに対する結合が相当減少した一方、ＰＨＦ６ ＷＴ及びＥ３リガーゼ突然変異Ｍ１２５Ａは、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃが含まれたモノヌクレオソーム結合能力を維持することを確認した（図６Ａ）。また、ＰＨＦ６ ＷＴが、エンハンサーのマーカーであるＨ３Ｋ４ｍｅ１が含まれたモノヌクレオソームとは結合できないことを発見した。このような結果は、ＰＨＦ６がＨ２ＢＫ１２Ａｃを認識することによって標的遺伝子のプロモーター領域で機能をすることを示唆する。次に、ＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異をＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞に発現させた後、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂの変化を確認した。その結果、ＰＨＦ６ ＷＴを発現させた時は、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ水準が再び回復するのを確認したが、Ｈ２ＢＫ１２Ａｃを認識することはできない突然変異であるＥ２２３ＳまたはＥ３リガーゼ活性がない突然変異であるＭ１２５ＡやＲ１２９Ａの発現は、Ｈ２ＢＫ１２０ｕｂ水準が回復されないことを確認した（図６Ｂ）。次に、ＤＯＸ処理有無に応じだＷＴ及びＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＣｄｘ２及びＧａｔａ２のプロモーターに対してＣｈＩＰ分析を行った。その結果、ＤＯＸ処理は、ＷＴ胚性幹細胞で、このような遺伝子のプロモーターでＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準と共にＰＨＦ６の募集が増加するのを確認したが、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞では、この増加が見られないことを確認した（図６Ｃ）。また、Ｐｈｆ６と有無と関係なく発現する遺伝子であるＭｓｘ２のプロモーターに対するＣｈＩＰ分析では、ＷＴとＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞との間にＰＨＦ６募集及びＨ２ＢＫ１２０ｕｂ水準の有意味な変化が現れないことを確認した（図６Ｄ）。これに加えて、プロモーター領域でＨ２ＢＫ１２０ｕｂに続いて現れるＨ３Ｋ４ｍｅ３の水準も確認した。予想した通り、Ｃｄｘ２及びＧａｔａ２プロモーターでのＨ３Ｋ４ｍｅ３水準は、ＤＯＸ処理に依存してＨ２ＢＫ１２０ｕｂ及びＰｈｆ６増加に応じて共に増加するのを確認した（図６Ｃ）。しかし、ＰＨＦ６と関係がない遺伝子であるＭｓｘ２のプロモーターでは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３水準もＰＨＦ６の有無と関係がなく増加するのを確認した（図６Ｄ）。次に、本発明者等はｌｅｎｔｉ－ｖｉｒｕｓ方法によって、Ｐｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞でＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異を持続的に発現する細胞株を作製して、ここでＰＨＦ６ ＷＴまたは突然変異が発現するＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞で胚盤胞分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ水準を比較した（図６Ｅ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって遺伝子の発現を確認した結果、ＰＨＦ６突然変異を発現した胚性幹細胞はＰＨＦ６ ＷＴが発現するＰｈｆ６ ＫＯ胚性幹細胞と比較した時、Ｃｄｘ２、Ａｓｃｌ２、Ｗｎｔ７ｂ、Ｆｇｆｒ２及びＰｌａｃ１を含む胚盤胞分化マーカー遺伝子の発現が有意に低くなっていることを確認した（図６Ｆ）。
【0075】
以上で本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲は、これに限定されず下記の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。
【0076】
本発明で使われるすべての技術用語は、別に定義されない以上、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するのと同じような意味で使われる。本明細書で参考文献として記載されるすべての刊行物の内容本発明に受け入れられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】