(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-10
(45)【発行日】2024-06-18
(54)【発明の名称】ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別
(51)【国際特許分類】
G01N 15/1429 20240101AFI20240611BHJP
G01N 15/14 20240101ALI20240611BHJP
G01N 15/1434 20240101ALI20240611BHJP
G01N 15/149 20240101ALI20240611BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240611BHJP
【ＦＩ】
G01N15/1429 300
G01N15/14 C
G01N15/1434 100
G01N15/149
G01N21/64 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022063562
(22)【出願日】2022-04-06
(62)【分割の表示】P 2018568176の分割
【原出願日】2017-03-17
(65)【公開番号】P2022095825
(43)【公開日】2022-06-28
【審査請求日】2022-04-20
(31)【優先権主張番号】62/309,806
(32)【優先日】2016-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】595117091
【氏名又は名称】ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＣＴＯＮ， ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100114557
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 英仁
(74)【代理人】
【識別番号】100078868
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 登夫
(72)【発明者】
【氏名】ディーボルト，エリック
(72)【発明者】
【氏名】オースレイ，キーガン
(72)【発明者】
【氏名】リン，ジョナサン
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００８／０２１３９１５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５０４５９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２３３７０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－１５２５９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０６０１６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０１８０８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許第０５４８５５３０（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２７６３８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１０－１９０６５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５３７０２１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １５／１４２９
Ｇ０１Ｎ １５／１４
Ｇ０１Ｎ １５／１４３４
Ｇ０１Ｎ １５／１４９
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
フローサイトメトリーシステム内の粒子を選別する方法であって、フローサイトメトリーシステムを粒子が通過する際に前記粒子を照射して前記粒子から蛍光放射線を誘発することと、
前記粒子からの前記蛍光放射線を検出して時間蛍光データを生成することと、
前記時間蛍光データを処理して、前記粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることと、
前記粒子の少なくとも１つの特性の推定値に基づいて、前記粒子に関する選別決定を行うことと、
行われた選別決定に基づいて粒子を選別することと
を有する、方法。
【請求項2】
前記時間蛍光データを処理することは、前記時間蛍光データに関連するうなり周波数を分析して、前記粒子の推定値を生成すること、
時間蛍光波形を生成し、前記時間蛍光波形に対応する蛍光シグナルの共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記時間蛍光波形の少なくとも１つに適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成し、その後、前記時間蛍光波形を点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成し、前記フィルタリングされた波形を積分して積分値を得て、前記積分値を所定の閾値と比較して、前記共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記時間蛍光波形の少なくとも１つに適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成し、その後、前記時間蛍光波形の点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成し、前記乗算波形を積分して積分値を得て、バックグラウンド値を前記積分値から減算し、得られた値を、強度によってスケーリングして、最終値を生成し、前記最終値を予め定められた閾値と比較して、前記共局在化の尺度を得ること、または
前記時間蛍光データのフーリエ変換を得て、前記粒子からの蛍光放射線を誘発するために高周波と異なるフーリエ変換の周波数を決定し、異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を得て、前記合計を所定の閾値と比較して選別決定を行うこと
の一つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記時間蛍光データを処理することが、前記時間蛍光データに基づいて蛍光画像を生成することなく実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの特性は、前記粒子の内部成分と関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つの特性は、前記粒子の寸法サイズ、２つの異なる次元に沿った前記粒子のサイズの比、前記粒子と関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、前記蛍光放射線の尖度、前記蛍光放射線の空間的分布の尺度、前記粒子の位置または方向の尺度、前記粒子の離心率の尺度、基準粒子に対する前記粒子の類似性の尺度、前記粒子の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、前記粒子が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
１００マイクロ秒未満である潜時にて前記粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記潜時は約２０マイクロ秒未満である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記粒子を照射することは、ビームレットが前記粒子内の少なくとも２つの空間位置を照射するように、少なくとも２つのビームレットを含む光学的放射線ビームに前記粒子を暴露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも２つの空間位置が部分的に重複している、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記粒子を少なくとも２つの蛍光マーカーで染色することをさらに有し、各マーカーが、照射に応答して蛍光放射線を放射するように構成される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記マーカーから発散される蛍光シグナルを収集及び数値化して、各々が前記マーカーの１つに相当する時間蛍光波形を生成することをさらに有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記時間蛍光データを処理することは、蛍光データを操作して、前記粒子のサイズの推定値を得て、推定された粒子のサイズに基づいて選別決定を行うこと、または
２つの異なる次元に沿った粒子サイズの比を得て、前記比を利用して選別決定を行うこと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記粒子の横方向サイズの推定値は、検出された時間蛍光データを２乗すること、２乗された蛍光データにバンドパスフィルタを適用すること、フィルタリングされたデータを積分すること、及び、フィルタリングされたデータを所定の閾値と比較することによって得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
粒子を選別するためのシステムであって、高周波変調された光学的放射線で粒子を照射するための照射システムと、
照射に応答して前記粒子から発せられる蛍光放射線を検出して時間蛍光データを生成するための検出システムと、
前記時間蛍光データを受信し、このデータを処理して前記粒子に関する選別決定に到達するために前記検出システムと通信する分析モジュールと、
前記粒子をその流路から分別して選別決定に基づいて容器を分離し得るアクチュエータと
を備える、システム。
【請求項15】
前記分析モジュールは、格納された指示を有するメモリを備えており、前記分析モジュールにより前記指示が実行された場合に、前記指示は前記分析モジュールに前記時間蛍光データを、前記時間蛍光データに関連するうなり周波数を分析して、前記粒子の推定値を生成すること、
時間蛍光波形を生成し、前記時間蛍光波形に対応する蛍光シグナルの共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記時間蛍光波形の少なくとも１つに適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成し、その後、前記時間蛍光波形を点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成し、前記フィルタリングされた波形を積分して積分値を得て、前記積分値を所定の閾値と比較して、前記共局在化の尺度を得ること、
時間蛍光波形を生成し、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを前記時間蛍光波形の少なくとも１つに適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成し、その後、前記時間蛍光波形の点ごとの乗算により結果の乗算波形を生成し、前記乗算波形を積分して積分値を得て、バックグラウンド値を前記積分値から減算し、得られた値を、強度によってスケーリングして、最終値を生成し、前記最終値を予め定められた閾値と比較して、前記共局在化の尺度を得ること、または
前記時間蛍光データのフーリエ変換を得て、前記粒子からの蛍光放射線を誘発するために高周波と異なるフーリエ変換の周波数を決定し、異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を得て、前記合計を所定の閾値と比較して選別決定を行うこと
の一つ以上により処理させる、請求項１４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、例えば、試料の蛍光分析を介してフローサイトメーターを通って流れる粒子の特性を決定するためのデバイス及び方法に関し、より詳細には、粒子を選別する、例えば、それらの特性に基づくフローサイトメーターにおいて、例えば、細胞を選別をするためのデバイス及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
亜集団の単離または異種集団からの単細胞の単離でさえ、現代生物学及び生物医学において様々な応用を有する。細胞亜集団を分離するためのいくつかの従来技術には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー捕捉顕微解剖、及びＤＥＰアレイ選別が挙げられる。これらの技術は、細胞選別用途において慣用的に用いられているが、多くの欠点が存在する。例えば、細胞生物学の全領域にわたって広く使用されているＦＡＣＳは、細胞内分解能がなく、したがって、細胞パラメーターの平均にのみ基づいて選別決定を行う。さらに、イメージングセルに基づく従来の選別方法は、選別決定を行う際の潜時が高いことに起因して、一般的にハイスループットセル分離の適応では使用することができない。
【0003】
したがって、例えばフローサイトメトリーシステムにおいて、細胞を選別するための改良された方法及びシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
１つの態様では、粒子の特性を決定する方法が開示されており、この方法は、粒子が、高周波変調された光学ビームを用いてフローサイトメトリーシステムを通って流れるにつれて粒子を照射し、粒子から少なくとも１つの放射性応答を誘発することと、この粒子から放射する放射性応答を検出して、この放射性応答に関連する時間波形データを生成することと、この波形データを処理して、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることとを有する。いくつかの実施形態では、処理ステップは、波形データに基づいて粒子の画像を生成することなく実行される。いくつかの実施形態では、放射性応答は、蛍光放射線または散乱放射線のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、処理ステップは、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることに関連する潜時が約１００マイクロ秒以下、例えば、約２０マイクロ秒以下であるように十分に高速である。
【0005】
いくつかの実施形態では、高周波変調光学ビームは、少なくとも高周波によって互いに分離された少なくとも２つの光周波数を含む。このような実施形態では、処理ステップは、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を決定するために、この放射性応答で検出された少なくとも１つの高周波に関連する少なくとも１つのうなり周波数を分析することを含んでいてもよい。
【0006】
この方法は、粒子の様々な異なる特性の推定値を決定するために使用してもよい。一例として、粒子の特性は、粒子の寸法サイズ、２つの異なる寸法に沿った粒子のサイズの比、粒子と関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、放射性応答の尖度、粒子から発される蛍光放射線の空間分布の尺度、粒子の位置または方向の尺度、粒子の離心率、基準粒子に対する粒子の類似性の尺度、粒子の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、粒子が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のうちの少なくとも１つであってもよい。
【0007】
関連する態様では、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を使用して、その粒子に関する選別決定に到達し得る。
【0008】
関連する態様では、粒子の１つ以上の特性を決定する方法が開示されており、この方法は、粒子が、高周波によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を有する放射線を有するフローサイトメトリーシステムを流れにつれて、この粒子から蛍光放射線を誘発して粒子を照射することと、粒子からの蛍光放射線を検出して、時間蛍光データを生成することと、この時間蛍光データを処理して、この粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることとを有する。いくつかの実施形態では、処理ステップは、時間蛍光データに基づいて蛍光画像を生成することなく実行される。いくつかの実施形態では、処理ステップは、時間蛍光データを変調する１つ以上のうなり周波数を分析して、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることを含み得る。いくつかの実施形態では、処理ステップは、粒子の少なくとも１つの特性の上記推定値を得ることに関連する潜時が約１００マイクロ秒未満、例えば約２０マイクロ秒未満となるように、十分に高速である。
【0009】
いくつかの実施形態では、決定された特性は、粒子の内部構成要素と関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、決定された特性は、粒子の寸法サイズ、２つの異なる寸法に沿った粒子のサイズの比、粒子に関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、蛍光放射線の尖度、蛍光放射線の空間的分布の尺度、粒子の位置または方向の尺度、粒子の離心率の尺度、基準粒子に対する粒子の類似性の尺度、粒子の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、粒子が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のいずれであってもよい。
【0010】
いくつかの実施形態では、粒子を照射するステップは、ビームレットが、粒子内の少なくとも２つの空間的位置を照射するように、２つの光周波数のうちの１つを各々が有する少なくとも２つのビームレットを含む光学的放射線ビームに粒子を暴露することを含む。いくつかの実施形態では、２つの照射された空間的位置は部分的に重なっている。
【0011】
いくつかの実施形態では、この粒子は、少なくとも２つの蛍光マーカーで染色してもよく、ここで各マーカーを、光周波数のうちの１つを有する放射による照射に応答して蛍光放射線を発するように構成する。そのような実施形態では、この方法は、マーカーの１つにそれぞれ対応する時間蛍光波形を生成するために、これらのマーカーから発する蛍光シグナルを収集し、デジタル化することをさらに含み得る。蛍光波形を処理して、蛍光シグナルの共局在化の尺度を得てもよい。一例として、蛍光波形の処理は、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを少なくとも１つの波形に適用して、少なくとも１つのフィルタされた波形を生成し、続いて、波形の点ごとの乗算を行って、少なくとも１つの乗算波形を生成することと、その乗算波形を積分して、積分値を得ることと、その積分値を所定の閾値と比較して、共局在化の尺度を得ることとを含み得る。いくつかの実施形態では、共局在化の尺度の決定は、波形の少なくとも１つにハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを適用して少なくとも１つのフィルタされた波形を生成した後に、波形の点ごとの乗算を行い、得られた乗算波形を生成することと、その乗算波形を積分して、積分値を得ることと、その積分値からバックグラウンド値を減算することと、その結果値を強度でスケーリングして最終値を生成することと、その最終値を所定の閾値と比較して共局在化の測定値を得ることとを含み得る。
【0012】
この方法のいくつかの実施形態において、処理するステップは、フローサイトメトリーシステムにおける粒子流の方向に実質的に垂直な方向に沿った粒子の横方向サイズの推定値を得ることを含む。
【0013】
この方法のいくつかの実施形態では、蛍光波形を用いて、波形を２乗すること、２乗波形にバンドパスフィルタを適用すること、フィルタリングされた波形を積分すること、その積分値を所定の閾値と比較することによって粒子の横方向サイズの推定値を得る。
【0014】
いくつかの実施形態では、フローサイトメーターにおける粒子流の方向に平行な方向の粒子サイズの推定値は、照射ステップに応答して粒子から発する蛍光放射線のパルスの持続時間に基づいて得てもよい。
【0015】
いくつかの実施形態では、粒子流の方向と垂直な方向及び平行な方向における粒子のサイズの推定値を使用して、粒子のアスペクト比の推定値を得てもよい。
【0016】
この方法は、様々な異なる粒子に適用してもよい。一例として、この粒子は、細胞、小生物（例えば、線虫のｃ．ｅｌｅｇａｎ）、ビーズ、微小粒子、ナノ粒子、ウイルス粒子、細菌、エキソソーム、または医薬品のいずれであってもよい。いくつかの実施形態において、粒子は、哺乳動物細胞、例えば、罹患細胞であってもよい。
【0017】
関連する態様では、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を使用して、以下により詳細に説明するように、その粒子に関する選別決定に到達してもよい。
【0018】
関連する態様では、粒子の特性を決定する方法が開示されており、この方法は、高周波変調された光学ビームで粒子を照射して粒子から蛍光及び散乱放射線のいずれかを誘発すること、粒子から発する蛍光または散乱放射線を検出して、時間蛍光または散乱波形データを生成すること、ならびに、この蛍光及び散乱データのいずれかを処理して、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることを有する。いくつかの実施形態では、処理ステップは、時間蛍光または散乱波形データに基づいて粒子の画像を生成することなく形成してもよい。いくつかのこのような実施形態では、処理ステップは、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることに関連する潜時が約１００マイクロ秒未満、例えば約２０マイクロ秒未満となるように、十分に速い。
【0019】
この方法のいくつかの実施形態では、粒子の特性は、粒子の寸法サイズ、２つの異なる寸法に沿った粒子のサイズの比、粒子と関連した２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、粒子に関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、蛍光放射線の尖度、蛍光放射線の空間分布の尺度、粒子の位置または方向の尺度、粒子の離心率の尺度、基準粒子に対する粒子の類似性の尺度、粒子の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、粒子が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のうちの少なくとも１つを含み得る。
【0020】
いくつかの実施形態では、粒子から発せられた蛍光放射線及び散乱放射線の両方を検出して、蛍光及び散乱波形データを生成してもよい。この蛍光波形データを使用して、上記粒子流の方向に実質的に垂直な方向で粒子の横方向のサイズの推定値を得てもよく、上記散乱波形データを使用して上記フローサイトメトリーシステム内の粒子流の方向に平行な方向における上記粒子のサイズの推定値を得てもよい。
【0021】
いくつかの実施形態では、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を用いて、粒子がフローサイトメーターを通って流れるにつれその粒子に対する選別決定に到達し得る。
【0022】
関連の態様では、コンピュータ支援フローサイトメトリーを実施するための方法が開示され、この方法は、フローサイトメーターに複数の粒子を含む試料を導入すること、及び、１つ以上のフローサイトメーター測定値から、複数の粒子の少なくとも１つの粒子特性の推定値を得ることを有しており、ここで、この推定値を得るステップは、高周波、例えば、約５０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの範囲の高周波によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を有する放射線で、粒子をその粒子がフローサイトメーターを通過するにつれて照射して、粒子からの放射性応答を誘発すること、及び、粒子からの放射性応答を検出してこの応答に関連する時間波形データを生成することを含んでいる。この方法はさらに、この時間波形データを処理して、この時間波形データを変調する１つ以上のうなり周波数を分析することによって、上述した特性のような、少なくとも１つの粒子特性の値を得ることと、コンピュータプロセッサを介して、粒子特性の値を所定の範囲内に有する１つ以上の上記粒子を示すゲートを特定することとを含み得る。例として、この放射性応答は、蛍光、及び散乱放射線または透過放射線のいずれであってもよい。
【0023】
一態様では、フローサイトメトリーシステムにおいて細胞を選別する方法が開示され、この方法は、高周波によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を有する放射線で細胞を照射して細胞から蛍光放射線を誘発することと、蛍光放射線を検出して、時間蛍光データを生成することと、この時間蛍光データを処理してこの細胞に関する選別決定に達することとを有する。いくつかの実施形態では、選別決定は、蛍光データに基づいて細胞の画像（すなわち、ピクセルごとの画像）を生成することなく行い得る。言い換えれば、蛍光データは、ピクセルごとの蛍光強度マップを生成することを可能にする画像データを含んでもよいが、この方法は、そのようなマップを生成することなく、選別決定に到達する。場合によっては、約１００マイクロ秒未満の潜時で選別の決定を行ってもよい。いくつかの実施形態では、細胞を選別するこの方法は、細胞より下の解像度を有してもよく、例えば、選別決定は、細胞の構成要素の特性に基づいてもよい。３つ以上の周波数シフト光周波数が使用されるいくつかの実施形態では、単一の高周波シフトが、光周波数を分離するために使用されるが、他のこのような実施形態では、複数の異なるシフトが使用される。
【0024】
処理ステップは、蛍光データを変調する１つ以上のうなり周波数を分析して選別決定に達するステップを含み得る。うなり周波数は、高周波シフトされた光周波数の周波数間の差に相当し得る。例えば、光学ビームが照射された細胞で干渉し、高周波によって分離された２つの光周波数を有する２つのビームレットを含む場合、うなり周波数は、光周波数間の差に相当する。うなり周波数は、典型的には、約１ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの周波数範囲にある。
【0025】
いくつかの実施形態では、処理ステップは、蛍光データを操作して細胞の特性の推定値を得ること、及びその推定値に基づいて選別決定を行うことを含み得る。細胞の様々な異なる特性を使用してもよい。例えば、細胞の特性は、細胞成分の特徴及び／または細胞もしくはその成分が励起放射線に応答する様式に関連し得る。一例として、細胞特性は、核のサイズなど、細胞の内部細胞小器官と関連する場合がある。使用され得る細胞特性のいくつかの例としては、限定するものではないが、細胞のサイズ、異なる寸法に沿った細胞のサイズの比、細胞に関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、細胞の核に対する細胞の細胞質のサイズの比、細胞から放射される蛍光放射線の尖度、蛍光放射線の空間分布の尺度、細胞の位置及び／または向きの尺度、細胞の離心率の尺度、基準細胞に対する細胞の類似性の尺度、細胞の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、細胞が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度が挙げられる。本教示は、列挙された特性に限定されず、細胞の任意の適切な特性に関連して利用され得ることを理解すべきである。
【0026】
いくつかの実施形態では、処理ステップは、選別判定に到達することに関連する潜時が約１００マイクロ秒未満、例えば約１０マイクロ秒～約１００マイクロ秒の範囲、または約２０マイクロ秒～約８０マイクロ秒、または約３０マイクロ秒～約５０マイクロ秒の範囲であるように、十分に速い。
【0027】
いくつかの実施形態では、光学ビームは、細胞内の複数の空間位置のそれぞれが照射される光周波数が、高周波シフトされた光周波数のうちの異なる周波数に対応するように構成される。一例として、いくつかの実施形態では、光学ビームは、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する複数の角度的または空間的に分離されたビームレットを含んでもよい。
【0028】
いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも２つの蛍光マーカーで染色してもよく、この光学的放射線は、それらのマーカーから蛍光放射線を誘発するように構成される。蛍光放射線は、マーカーの１つにそれぞれ対応する時間蛍光波形（すなわち、時間の関数としての蛍光強度を示す波形）を生成するために収集され、デジタル化され得る。処理ステップは、蛍光マーカーに対応する蛍光シグナルの共局在の尺度を得るために波形上で操作すること、及び、共局在化推定に基づいて選別決定を行うことを含む。具体的には、この方法は、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成するために、ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを、少なくとも１つの波形に適用することと、その後に、波形を点ごとに乗算を行って、結果の乗算波形を生成することと、この乗算波形を積分して積分値を得ることと、この積分値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ることとを有し得る。いくつかの実施形態では、共局在の尺度の決定は、波形の少なくとも１つにハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成し、その後に波形を点ごとに乗算して、得られた乗算波形を生成することと、乗算波形を積分して、積分値を得ることと、この積分値からバックグラウンド値を減算して、得られた値を強度でスケーリングして最終値を生成することと、この最終値を所定の閾値と比較して共局在化の尺度を得ることを含み得る。共局在化の尺度は、細胞に関する選別決定に到達するために使用してもよい。
【0029】
いくつかの実施形態では、処理ステップは、蛍光データを操作して細胞のサイズの推定値を得ること、及び、推定された細胞サイズに基づいて選別決定を行うことを含む。一例として、蛍光データを分析して、フローサイトメトリーシステムにおける細胞の流れの方向（すなわち、細胞の流れの方向と実質的に平行な方向に沿った方向）の細胞サイズの推定値、または細胞の横方向のサイズ（例えば、細胞の流れの方向と直交する方向）を得てもよい。いくつかのこのような実施形態では、細胞の流れ方向の細胞サイズは、細胞によって放射された蛍光放射線のパルスの持続時間に基づいて推定され得る。さらに、検出された蛍光データを２乗すること、２乗された蛍光データにバンドパスフィルタを適用すること、フィルタリングされたデータを積分すること、このフィルタリングされたデータと所定の閾値とを比較することによって、細胞の横方向サイズの推定値を得てもよい。場合によっては、処理ステップは、蛍光データを操作して、２つの異なる次元に沿った細胞サイズの比を得ることと、その比を利用して選別決定を行うこととを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、一方は細胞の膜に結合し、もう一方は細胞の核に結合する、２つの蛍光マーカーで、細胞を標識する。細胞に適用される光学的放射線は、両方のマーカーからの蛍光を誘発するように構成される。両方のマーカーによって放射された蛍光シグナルは、２つの異なるチャネルで検出され、分析されて核の比に対する細胞質のサイズの比の推定値が得られる。その細胞に関する選別決定は、その比率に基づいて行われる。
【0031】
いくつかの実施形態では、この方法は、蛍光データのフーリエ変換を得ること、及び、細胞から蛍光放射線を誘発するために使用される光学的放射線を変調するために使用される高周波とは異なる変換において周波数を決定することを含む。これらの異なる周波数でのフーリエ変換値の合計を得て、予め定められた閾値と比較して選別決定を行ってもよい。一例として、異なる周波数は、光学的放射線を変調するために使用される周波数間の１つ以上の周波数であってもよい。
【0032】
関連する態様では、フローサイトメトリーシステムにおいて細胞を選別する方法が開示されており、この方法は、１つ以上の高周波によって互いにシフトされた２つ以上の光周波数を有する放射線で細胞を照射して細胞から蛍光放射線を誘発すること、この蛍光放射線を検出して時間蛍光データを生成すること、及び、約１００マイクロ秒以下の潜時を有する細胞に関する選別決定に達するように時間蛍光データを処理することを有する。例として、選別の決定は、約１０マイクロ秒～約１００マイクロ秒の範囲、または約２０マイクロ秒～約８０マイクロ秒の範囲、または約３０マイクロ秒～約５０マイクロ秒の範囲の潜時で行ってもよい。
【0033】
この方法において、処理ステップは、蛍光データを操作して細胞の少なくとも１つの特性の推定値を得て、その推定値に基づいて選別決定を行うことを含んでいてもよい。さらに、この処理ステップは、光学的放射線の光周波数の干渉に関連する１つ以上のうなり周波数で蛍光データの変調を分析して、選別決定に達するようにすることを含み得る。
【0034】
別の態様では、フローサイトメトリーシステムで細胞を選別する方法が開示されており、この方法は、各々が少なくとも１つのフルオロフォアと会合している複数の細胞を、１秒あたり約１０００個を超える速度で一度に光学的問い合わせ領域に導入して、各々の細胞を、高周波変調された光学的放射線で照射して、フルオロフォア（複数可）から蛍光放射線を誘発することを有する。各細胞について、細胞から放射された蛍光放射線を検出して時間－周波数波形を生成し、その波形を処理して細胞に関する選別決定に達する。この方法は、その選別決定に基づいて、細胞を複数の容器のうちの１つに導くことをさらに有し得る。
【0035】
別の態様では、粒子（例えば、細胞などの生物学的粒子）を選別する方法が開示され、この方法は、粒子から蛍光及び散乱放射線のいずれかを誘発するために、粒子を高周波変調された光学ビームで照射することと、粒子から発する蛍光または散乱（または透過）放射を検出して蛍光または散乱（または透過）波形データを生成することと、蛍光及び散乱（または透過）データのいずれかを処理して、データに基づいて粒子の画像（すなわち、ピクセルごとの蛍光または散乱（または透過）強度マップ）を計算することなく、粒子に関する選別決定を行うこととを有する。光学ビームは、例えば、レーザービームであってもよい。さらに、光学ビームは、いくつかの実施形態では、約３００ＴＨｚ～約１０００ＴＨｚの範囲の光周波数を有してもよい。一例として、いくつかの実施形態では、光学ビームの高周波変調は、約５０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの範囲の高周波、例えば約１００ＭＨｚ～約２００ＭＨｚの範囲の周波数でビームを変調することによって達成してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、高周波変調光学ビームは、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する複数の角度的または空間的に分離されたビームレットを含んでもよい。この方法において、処理ステップは、蛍光または散乱放射線のいずれかで検出された１つ以上のうなり周波数を分析して選別決定に達することを含み得る。うなり周波数は、粒子（例えば、細胞）を照射する光学的放射線の光周波数に対応し得る。
【0036】
関連する態様では、粒子の特性を決定するためのシステムが開示されており、このシステムは、粒子を高周波変調された光学的放射線で照射するための照射システムと、照射に応答して粒子から発する蛍光及び散乱放射線のいずれかを検出して、蛍光または散乱データを生成する検出システムと、蛍光及び散乱データを受信し、このデータを処理してこの粒子の少なくとも１つの特性の推定値を計算するために検出システムと通信する分析モジュールとを備える。いくつかの実施形態では、分析モジュールは、蛍光または散乱データに基づいて粒子の画像を形成することなく、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を算出し得る。一例として、粒子の少なくとも１つの特性は、粒子の寸法サイズ、２つの異なる寸法に沿った粒子のサイズの比、この粒子と関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、この粒子から放射される蛍光放射線の尖度、蛍光放射線の空間分布の尺度、粒子の位置または方向の尺度、粒子の離心率の尺度、基準粒子に対する粒子の類似性の尺度、粒子の１つ以上の空間フーリエ成分の組み合わせ、粒子が照射放射線の焦点内に存在する程度の尺度のうちのいずれを含んでもよい。
【0037】
このシステムを用いて、様々な異なる粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得てもよい。一例として、粒子は、細胞、微小胞、細胞断片、リポソーム、ビーズ、及び微生物のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、この粒子は細胞であり、決定された特性は、細胞の細胞質と核とのサイズの比である。
【0038】
このシステムのいくつかの実施形態では、照射システムは、少なくとも１つの高周波によって互いに分離された光周波数を有する複数の角度的または空間的に分離されたビームレットを含む光学ビームを含んでもよい。このようないくつかの実施形態では、照射システムは、レーザービームを生成するための光源と、レーザービームを受け取る単一の音響光学偏向器（ＡＯＤ）と、ＡＯＤに対して複数のＲＦを印加して受け取られたレーザービームを複数の角度分離ビームレットに回折させるための高周波（ＲＦ）コム発生器とを備える。
【0039】
別の態様では、粒子（例えば生物学的粒子）を選別するためのシステムが開示されており、これは、粒子に高周波変調放射線を照射するための照射システムと、照射に応答して粒子から発する蛍光及び散乱（または透過）放射線のいずれかを検出して、蛍光または散乱データ（または透過データ）を生成するための検出システムと、蛍光及び／または散乱（または透過）データを受信して、このデータを処理して蛍光及び／または散乱（または透過）データに基づいて粒子の画像を形成することなく粒子に関する選別決定に到達するために検出システムと通信する分析モジュールと、必要に応じて粒子をそれらの流路から迂回させて、選別決定に基づく容器を分離し得るアクチュエータとを備える。いくつかの実施形態では、高周波変調された放射線は、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する、複数の角度的にまたは空間的に分離されたビームレットから構成される光学ビームの形態であってもよい。
【0040】
以下で簡単に説明する関連する図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって本発明の様々な態様がさらに理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】本発明の一実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図2】ビームの伝播方向に垂直な平面内のガウスビームの概略的な例示的なプロファイル、及び、トップハットビーム整形器を通り、ビーム整形器の出力ビームを集束させる、Ａに示されたガウスビームを通過させることによって得られる概略的なトップハットビームプロファイルである。
【図3】例示的なトップハットビーム整形器の構成要素を概略的に示す。
【図4】複数のＲＦコムビームの断面ビームプロファイルを概略的に示す。
【図7】仮想フルオロフォアの例示的なエネルギーレベルを概略的に示す。
【図9A】本教示のある実施形態による検出システムを概略的に示し、このシステムは、蛍光放射線の伝送のための光ファイバーを備える。
【図9B】蛍光放射線が自由空間を伝播して複数の光検出器に到達する、本教示の実施形態による別の検出システムを概略的に示す。
【図9C】本教示のいくつかの実施形態で使用するための明視野画像生成アーム及び暗視野画像生成アームを概略的に示す。
【図9D】明視野画像を生成するための検出アームと、試料から散乱された励起放射線及び試料によって放射される蛍光放射線の検出の能力を組み込む検出アームとを備える、本教示のいくつかの実施形態で使用する検出システムを概略的に示す。
【図10】本発明によるシステムの一実施形態における光検出器によって生成された蛍光シグナルが、増幅器によって増幅され得、この増幅されたシグナルが分析モジュールによって分析されて分析中の試料の蛍光画像を構築し得ることを概略的に示す。
【図11A】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のプロファイルされたＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態による方法の様々なステップを示す。
【図11B】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のプロファイルされたＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態による方法の様々なステップを示す。
【図12】本発明のある実施形態による分析モジュールの例示的なハードウェア実行の選択された構成要素を概略的に示す。
【図13A】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態による別の方法における様々なステップを示す。
【図13B】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態による別の方法における様々なステップを示す。
【図14A】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態によるさらに別の方法における様々なステップを示す。
【図14B】複数のＲＦコムビーム及びトップハット形のＬＯビームから構成される複合ビームで試料を照射することによって得られる蛍光シグナルの分析のための、本発明の実施形態によるさらに別の方法における様々なステップを示す。
【図15A】単一励起周波数でのトップハット形ビームによる試料の照射を概略的に示す。
【図15B】蛍光寿命測定及び蛍光寿命画像化を可能にする、本教示の実施形態によるシステムの概略図である。
【図16A】フローサイトメトリーシステムを通って流れる粒子の少なくとも１つの特性の推定値を決定するための様々なステップを示すフローチャートである。
【図16B】フローサイトメトリーシステムを通って流れる粒子の少なくとも１つの特性の推定値を決定するための実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図16AA】１つ以上の粒子特性の値に基づいてフローサイトメトリーシステムにおいて粒子をゲーティングする実施形態による方法の様々なステップを示すフローチャートである。
【図16C】２つ以上の異なる周波数チャネルにおいて粒子、例えば、細胞から放射された蛍光放射線の共局在化に基づいて選別決定を行うための実施形態における様々なステップを示すフローチャートである。
【図18】Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと標識された４つの細胞の蛍光画像を示しており（Ａ）、これには緑色色素及び赤色色素で細胞をマーキングして得られた緑色及び赤色蛍光画像、ならびに明視野、暗視野画像を含み、Ａに示された細胞の測定された緑色蛍光時間領域シグナル（Ｂ）及びＡに示された細胞の測定された赤色蛍光時間領域シグナル（Ｃ）を示し、各細胞について、Ｂ及びＣに示される正規化された赤色及び緑色の蛍光波形を乗算すること、ならびに得られた波形をローパスフィルタに通過させることによって得られる共局在化時間領域波形（Ｄ）を示す。
【図19】細胞Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれについての積分されたフィルタリングされたシグナルの値を示す（この図の破線は、選別閾値を表す）。
【図20】本発明の一実施形態による細胞サイズに基づく細胞選別の様々なステップを示すフローチャートである。
【図21】複数の高周波変調ビームレットを含む仮説ビームによって照射される仮想細胞を概略的に示し、Ａに示された照射された細胞から得られた仮想蛍光波形、及び蛍光波形を２乗して得られる波形を概略的に示す。
【図22】細胞のアスペクト比に基づいて細胞を選別する方法の様々なステップを示すフローチャートである。
【図23A】細胞の核と細胞の細胞質とのサイズ比率を推定する方法の様々なステップを示すフローチャートである。
【図23B】細胞の核と細胞の細胞質とのサイズの推定された比に基づいて細胞を選別する方法の様々なステップを示すフローチャートである。
【図24A】細胞から放射される蛍光放射線の細胞粒度を推定する方法における様々なステップを示すフローチャートである。
【図24B】細胞から放射される蛍光放射線の細胞粒度を推定することに基づいて細胞を選別する方法の様々なステップを示すフローチャートである。
【図26】細胞を選別するための本教示を組み込む選別システムを概略的に示す。
【図28】特性または粒子を決定し、その特性を使用してある実施形態による選別決定を行うための例示的な方法における様々なステップを示すフローチャートである。
【図29】複数の細胞についての垂直及び水平の２次中心モーメントの散布図である。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本教示は、一般に、フローサイトメーターにおける細胞などの粒子の１つ以上の特性を決定し、いくつかの実施形態において粒子を分類するためにそれらの特性を使用するための方法及びシステムに関する。以下に説明する実施形態では、これらの方法は、それらの実行のためにコンピュータプロセッサを使用する。本教示を記載するために以下で使用される様々な用語は、他に記載されていない限り、当該分野において通常の意味を有する。例えば、「フルオロフォア」という用語は、本明細書では、当該技術分野における慣習的な意味と一致して用いられ、励起放射線による照射に応答して放射線を放射し得る蛍光性化合物を指す。
【0043】
「サイトメトリー」及び「フローサイトメトリー」という用語はまた、当該技術分野におけるそれらの慣習的な意味と一致して使用される。特に、「サイトメトリー」という用語は、細胞を同定及び／または選別するかまたはそうでなくとも分析する技術を指し得る。「フローサイトメトリー」という用語は、流体フロー中に存在する細胞を、蛍光マーカーで標識し、放射励起を介して蛍光マーカーを検出するなどして、同定及び／または選別するか、またはそうでなくとも分析し得るサイトメトリー技術を指してもよい。本明細書で使用される「約」及び「実質的に」という用語は、数値を含む特性に関して１０％または５％の最大変動を示す。
【0044】
細胞などの粒子の特性を決定し、その粒子を選別するための本発明の教示は、様々な異なる方法で実施され得る。選別決定を行うために使用される蛍光及び／または散乱データは、様々なシステムを使用することによって得てもよい。いくつかの実施形態では、粒子は、複数の高周波シフトビームレットを有する光学ビームによって照射され、粒子からの蛍光が収集され、選別決定を行うために本教示に従って分析される。本教示が組み込まれ得る粒子から蛍光データを誘発するためのこのようなシステムのいくつかの例を以下に記載し、続いて、本教示による粒子を選別するための方法及びシステムの詳細な説明を記載する。
【0045】
一例として、図１は、粒子を選別するための本教示を組み込み得るサイトメトリーを行うためのシステム１０を概略的に示す。システム１０は、３つの作動モードで作動し得る。以下でより詳細に説明するように、１つの作動モードでは、その各々が、例えばレーザービームの中心周波数をシフトすることによって得ることができる、複数の励起周波数で同時に研究中の試料を照射し得る。より具体的には、基準レーザービーム（本明細書では局部発振器ビームとも呼ばれる）を複数の高周波シフトレーザービームと混合することによって生成されるレーザービームによって、複数の試料位置を同時に照射してもよく、その結果、各々の試料位置は、基準ビーム及び高周波シフトビームのうちの１つによって照射されて、もし存在するならば、その位置で目的のフルオロフォアを励起する。いくつかの実施形態では、基準ビーム自体が、レーザービームの高周波シフトを介して生成され得る。したがって、試料の各空間位置は、基準ビームの周波数と高周波シフトされたビームの周波数との間の差に対応する異なるうなり周波数で「タグ付け」され得る。言い換えれば、フルオロフォアによって発せられた蛍光放射線は、うなり周波数を空間的にエンコードする。蛍光発光を検出してもよく、その周波数成分を分析して試料の蛍光画像を構築してもよい。
【0046】
別の作動モードでは、複数の励起周波数のレーザービームによってある時間間隔にわたって試料を連続的に照射してもよい。いくつかのこのような実施形態では、励起周波数は、レーザービームを受け取る、音響光学偏向器（ＡＯＤ）に時変駆動シグナルを印加することによって得てもよい。多くの実施形態では、レーザービームは、数百テラヘルツ（ＴＨｚ）の範囲、例えば、約３００ＴＨｚ～約１０００ＴＨｚの範囲の周波数を有する。ＡＯＤに印加される駆動シグナルは、典型的には、高周波範囲、例えば、約１０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの範囲内にある。ＡＯＤを通るレーザービームの通過は、それぞれ異なる回折次数に対応する、複数の回折ビームを生成する。０次回折ビームは、入力レーザービームの周波数に対して周波数シフトを示さないが、高次回折ビームは、駆動シグナルまたはその複数の周波数に対応する入力レーザービームの周波数に対して周波数シフトを示す。いくつかの実施形態では、駆動シグナルによってシフトされた入力レーザービームの周波数に対応する周波数を有する一次回折ビームは、分析中の試料中に存在する場合には、目的のフルオロフォアを励起するための励起ビームとして使用される。駆動シグナルが時間とともに変化するにつれ、１次回折ビームの周波数及び角度シフトもまた変化し、それにより異なる位置で異なる励起周波数で試料の照射を可能にする。照射された各位置からの蛍光発光（もしあれば）を収集し、分析して試料の蛍光画像を構築してもよい。
【0047】
さらに別の作動モードでは、システム１０を作動させて、単一の励起周波数（例えば、高周波によってレーザービームの中央周波数をシフトすることによって、生成され得る）によって、試料の複数の位置を同時に照射してもよい。例えば、試料の水平範囲は、単一の励起周波数によるレーザービームで照射してもよい。検出された蛍光放射線を使用して、試料、例えば細胞／粒子の蛍光含有量を分析してもよい。
【0048】
このように、システム１０の利点の１つは、以下で述べられる中でもとりわけ、様々な機器を使用することも、異なる作動モードの間で切り替える際にシステムに対してなんら機械的改変を行うことも必要なく、異なるモードで蛍光放射線データを得る際に、有意な可塑性を提供することである。
【0049】
特定の実施形態では、システムは、１つ以上の光源を備える。ある場合には、光源は、狭帯域光源、例としては、限定するものではないが、狭波長ＬＥＤ、レーザー、または１つ以上の光学バンドパスフィルタ、回折格子、モノクロメーターまたはそれらの任意の組合せに結合された広帯域光源が挙げられ、複合されて、照射光の狭帯域を生成する。場合によっては、光源は、単一波長レーザー、例えば、単一波長ダイオードレーザー（例えば、４８８ｎｍレーザー）である。いくつかの実施形態では、本発明のシステムは、単一の光源（例えば、レーザー）を含む。他の実施形態では、本発明のシステムは、２つ以上の異なる光源、例えば、３つ以上の異なる光源、例えば、４つ以上の異なる光源を含み、これには、５つ以上の異なる光源を備える。例えば、システムは、第１の波長を出力する第１の光源（例えば、レーザー）と、第２の波長を出力する第２の光源とを備えてもよい。他の実施形態では、システムは、第１の波長を出力する第１の光源と、第２の波長を出力する第２の光源と、第３の波長を出力する第３の光源とを備える。
【0050】
各光源は、３００ｎｍ～１０００ｎｍ、例えば３５０ｎｍ～９５０ｎｍ、例えば４００ｎｍ～９００ｎｍ、及び例としては４５０ｎｍ～８５０ｎｍにおよぶ波長を有し得る。特定の実施形態では、光源は、１つ以上のフルオロフォアの吸収極大に対応する波長を有する（後述する）。例えば、光源は、２８０～３１０ｎｍ、３０５～３２５ｎｍ、３２０～３５０ｎｍ、３４０～３７５ｎｍ、３７０～４２５ｎｍ、４００～４５０ｎｍ、４４０～５００ｎｍ、４７５～５５０ｎｍ、５２５～６２５ｎｍ、６２５～６７５ｎｍ、及び６５０～７５０ｎｍのうちの１つ以上の範囲である波長を有する光を出力し得る。特定の実施形態では、各光源は、３４８ｎｍ、３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４０７ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４０ｎｍ及び６５２ｎｍから選択される波長を有する光を出力する。
【0051】
システム１０は、レーザービーム１４を生成するレーザー放射源１２を備える。一例として、レーザービームは、約３００ｎｍ～約１０００ｎｍの範囲の真空波長に相当する、約１０００ＴＨｚ～約３００ＴＨｚの範囲の周波数を有してもよい。レーザービーム（例えば、ガウスレーザービームが使用される場合のビームウエスト）のビーム径は、例えば、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲であってもよい。一般性を失うことなく、この実施形態では、レーザー１２は、約１ｍｍのビーム直径を有する４８８ｎｍの波長の放射線を放射する。
【0052】
レーザービームの周波数は、システムが意図される特定のアプリケーション（複数可）に基づいて選択され得る。具体的には、以下により詳細に説明するように、レーザー周波数は、例えば、放射線の吸収を介して、目的のフルオロフォアの電子遷移を励起して、フルオロフォアに低い周波数で蛍光放射線を放射させるために適している場合がある。種々のレーザー源を用いてもよい。このようなレーザー源のいくつかの例としては、限定されるものではないが、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ４８８－ＳＦ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ Ｕ．Ｓ．Ａ．のＣｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．が市販）、Ｇｅｎｅｓｉｓ ＭＸ－４８８－１０００－ＳＴＭ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．）、ＯＢＩＳ ４０５－ＬＸ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）、Ｓｔａｄｕｓ ４０５－２５０（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ Ｕ．ＳＡ．のＶｏｒｔｒａｎ Ｌａｓｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．が市販）、及びＬＱＣ－６６０－１１０（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ Ｕ．Ｓ．Ａ．）が挙げられる。一般性を失うことなく、本実施形態では、レーザービームは、その伝搬方向に垂直な平面内でガウス強度プロファイルを有すると仮定される。
【0053】
ミラー１６は、レーザー放射ビーム１４を受け取り、反射を介して音響光学偏向器（ＡＯＤ）１８に向ける。この実施形態では、ＡＯＤ１８は、ビーム１４の伝播方向に対して垂直な軸に対しＡＯＤの回転を可能にする、調整可能なポストホルダーマウント（Ａ）上に取り付けられる。コントローラ２１の制御下で作動するダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）２０は、１つ以上の駆動シグナルをＡＯＤ１８に印加し得る。一例として、いくつかの実施形態では、これらの駆動シグナルは、約５０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの周波数範囲に及んでもよい。例えば、ＡＯＤに印加される駆動シグナルは、約５５ＭＨｚ～約２５５ＭＨｚ、例えば、約６０ＭＨｚ～約２００ＭＨｚ、例えば、約６５ＭＨｚ～約１７５ＭＨｚ、例えば、約７０ＭＨｚ～約１５０ＭＨｚ、及び例としては約７５ＭＨｚ～約１２５ＭＨｚという範囲にわたる場合がある。いくつかの実施形態では、駆動シグナルは、約０．１ＭＨｚ～約４ＭＨｚの範囲の周波数によって互いに分離されてもよい。例えば、駆動シグナルは、約０．２ＭＨｚ～約３．９ＭＨｚ、例えば、約０．３ＭＨｚ～約３．８ＭＨｚ、例えば、約０．４ＭＨｚ～約３．７ＭＨｚ、例えば、約０．５ＭＨｚ～約３．６ＭＨｚ、及び例としては、約１ＭＨｚ～約３．５ＭＨｚという周波数によってお互いから隔てられる場合がある。この実施形態では、電子電力増幅器２０１は、ＤＤＳ２０によって生成された高周波シグナルをＡＯＤ１８への印加のために増幅する。
【0054】
試料が複数の励起周波数で同時に照射される作動モードでは、ＲＦコム発生器２０は、複数のＲＦ駆動シグナルを同時にＡＯＤ１８に印加する。一例として、同時に印加されるＲＦ駆動シグナルの数は、約２０～約２００の範囲にあってもよい。レーザービームと駆動シグナルとの相互作用は、レーザー１２によって生じるレーザービームの周波数に対する駆動シグナルの１つに相当する周波数シフトを各々が有する角度的に分離された複数のレーザービームの生成を生じる。いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、ＡＯＤにおいて、圧電トランスデューサは、水晶振動子などの水晶圧電素子中に高周波のフォノンを発生し得、このような高周波フォノンによるレーザービームの光学光子の散乱は、周波数シフトされたレーザービームの生成を生じる可能性がある。これらの周波数シフトされたビーム２２の１つは、本明細書では「局部発振器」（ＬＯ）ビームと呼ばれ、残りの周波数シフトされたビーム２４は、本明細書では「ＲＦコムビーム」と呼ばれる。周波数シフトされたビームの角度分離は、例えば、約１ミリラジアン～約１００ミリラジアンの範囲であり得る。例えば、周波数シフトビームの角度分離は、２ミリラジアン～約９５ミリラジアン、例えば３ミリラジアン～約９０ミリラジアン、例えば、４ミリラジアン～約８５ミリラジアン、例えば５ミリラジアン～約８０ミリラジアン、及び例としては、１０ミリラジアン～約７５ミリラジアンの範囲であり得る。
【0055】
ＬＯビーム及びＲＦコムビームは、この実施例では約５０ｍｍの焦点距離を有する正レンズであるレンズ２６を通過する。レンズ２６を通過した後、ＬＯレーザービームは、ＬＯビームを異なる方向（この実施形態ではＬＯビームの元の伝搬方向と実質的に直交する方向）に方向転換する、ミラー２８によって遮断される。ミラー２８は、ＲＦコムビームに対して、これらのビームがミラー２８を回避し、レンズ３０（この実施形態では２００ｍｍの焦点距離を有する）に伝播するように配置される。このようにして、ＬＯビーム及びＲＦコムビームは、異なる伝播方向に向けられる。上述したようにピックオフミラー２８を使用することにより、単一のＡＯＤを利用して、ＬＯビームとＲＦコムビームとの両方を生成すること、以下に説明する方法でそれらを組み合わせて試料を照射するための励起ビームを生成することが可能になる。複数のＡＯＤ（例えば、ＬＯビームを生成するためのものとＲＦコムビームを生成するものとの２つのＡＯＤ）を用いるのではなく、単一のＡＯＤを使用することにより、システムの設計が単純化され、さらに、以下により詳細に述べるように、複数の別個の作動モードでシステムを効果的に使用することが可能になる。
【0056】
いくつかの実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルは、ＲＦコムビームと再結合する前に変更される。例えば、ＬＯビームのビームプロファイルは、空間次元、ビーム形状、強度、ビームの空間分布、またはそれらの任意の組み合わせにおいて調整（増大または減少）され得る。特定の実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルの空間寸法が変更される。例えば、ビームプロファイルは、流動ストリームの長手方向軸に直交する軸に沿ったような、１つ以上の次元でビームプロファイルを引き延ばすように調整され得る。これらの実施形態による一例では、ビームプロファイルの（例えば、１つ以上の次元における）空間的な寸法は、１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば、２５％以上、例えば、５０％以上、例えば、７５％以上、例えば、９０％以上まで、例えば、１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、３倍以上、例としては、５倍以上まで大きくされてもよい。これらの実施形態による別の例では、ビームプロファイルの（例えば、１つ以上の次元における）空間的寸法は、１％以上、例えば、２％以上、例えば、３％以上、例えば、５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば、５０％以上、例えば、７５％以上、例えば、９０％以上まで、例えば、１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、３倍以上、例としては、５倍以上まで小さくされてもよい。
【0057】
他の実施形態では、ＬＯビームのビーム形状が変更される。例えば、ビーム形状は、ビームプロファイルを１つ以上の次元で引き延ばすように変更してもよい。場合によっては、ＬＯビームのビーム形状は、ＬＯビームの伝播方向に垂直な平面内で伸張される。特定の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形ビームプロファイルから、流動ストリームの長手方向軸に直交する軸において細長い楕円形ビームプロファイルに変更される。他の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形ビームプロファイルから、流動ストリームの長手方向軸に直交する軸に長い寸法を有する矩形ビームプロファイルに変化される。さらに他の実施形態では、ＬＯビームの強度が変更される。例えば、ＬＯビームの強度は、例えば、１％以上、例えば、２％以上、例えば、３％以上、例えば、５％以上、例えば１０％以上、例えば、２５％以上、例えば、５０％以上、例えば、７５％以上、例えば、９０％以上まで、例えば、１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、３倍以上、例としては５倍以上まで増大されてもよい。特定の実施形態では、ＬＯビームの強度は、ＲＦコムビームの強度に一致するように変更される。例えば、ＬＯビームは、１０％以下、例えば９％以下、例えば８％以下、例えば７％以下、例えば、６％以下、例えば５％以下、例えば４％以下、例えば３％以下、例えば２％以下、例えば１％以下、例えば、０．００１％以下までＲＦコムビームの強度から異なる強度、及び例としては、ＬＯビームの強度が０．００１％以下までＲＦコムビームの強度と異なる強度を有してもよい。場合によっては、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの強度は同一である。
【0058】
さらに他の実施形態では、ビームプロファイルの空間分布も変更してもよい。例えば、ＬＯビームは、ＬＯビームの強度がもはや１つ以上の次元においてガウス型ではなくなるように変更されてもよい。例えば、ＬＯビームは、流動ストリームの長手方向軸に平行である第１の軸に沿ったガウス分布、及び、流動ストリームの長手方向軸に直交する第２の軸に沿った非ガウス分布を有するように変更されてもよい。
【0059】
ＬＯビームのビームプロファイルを修正するために、任意のビーム整形プロトコルを使用してもよく、これには、限定されるものではないが、屈折及び回折ビーム整形プロトコルが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＬＯビームはトップハットビーム整形器によって修正される。
【0060】
この実施形態では、ＬＯビームは別の正レンズ３２（この実施形態では約２００ｍｍの焦点距離を有する）に伝搬する。レンズ２６及びレンズ３２の組み合わせは、ＬＯビームを拡大してコリメートし、トップハットビーム整形器３４の後部開口を適切に満たす。より具体的には、ＬＯビーム２２は、レンズ３２を通過し、ミラー３３及び３５によって、トップハットビーム整形器３４に反射される。
【0061】
トップハットビーム整形器３４は、トップハット強度プロファイルの形成を可能にするために、ガウスＬＯビームの位相面を整形する。より具体的には、トップハットビーム整形器を出るＬＯレーザービーム２２’は、ビームスプリッタ４４によって反射され、レンズ４６（この実施形態では１００ｍｍの焦点距離を有する）によって中間像面４８上に集束される。中間像面４８上のレーザービームは、ビームの伝播方向に垂直な平面内で水平方向に沿ってトップハット強度プロファイルを有する。ＡＯＤ１８と同様に、この実施形態では、ビームスプリッタ４４は、調整可能なポストホルダーマウント（Ｂ）に取り付けられている。この実施形態では、トップハットビーム整形器は、放射線の偏光がビームのトップハット方向に沿って（この実施形態では水平方向に沿って）実質的に均一であるトップハットビームプロファイルを生成する。
【0062】
説明のために、図２Ａは、トップハットビーム整形器に入るときのＬＯレーザービームのガウス強度プロファイルを概略的に示す。図２Ｂに模式的に示すように、中間像面４８上では、ＬＯレーザービームは、水平方向（この図では紙面に垂直な方向）に伸び、かつこのプロファイルを通って伸びる各水平線、例えば、水平線Ａに沿って実質的に一定であるが、ガウス分布に従って垂直に変化する。
【0063】
様々なトップハットビーム整形器を使用してもよい。例えば、非球面または回折光学素子を有する屈折光学素子は、レンズによって集束された後に、レンズの焦点面にトップハットプロファイルパターンを生成する、適切な空間位相面を有するビームを生成するために使用され得る。このようなトップハットビーム整形器には複数の形状因子が存在し、本教示の様々な実施形態において、試料に適切なＬＯビーム形状を生成するために、このアプローチの様々な実行が利用可能である。例えば、「Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ａ ｌａｓｅｒ ｂｅａｍ ｔｏ ａ ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ ｆｌａｔ－ｔｏｐ ｂｅａｍ」と題する米国特許第６，２９５，１６８号と、「Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ ｆｌａｔ－ｔｏｐ ｂｅａｍ ｓｈａｐｅｒ」と題する米国特許第７，４００，４５７号（両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる）は、本教示のいくつかの実施形態によるシステムにおいてフラットトップビーム整形器として使用され得るビーム成形システムを開示している。説明のために、図３は、米国特許第７，４００，４５７号（異なる参照番号を付す）の図１の再現であり、２つの直交して配置された円柱状レンズ３０２及び３０４を備える、四角または矩形ビームを提供するためのビーム成形システム３００を模式的に示す。第１の円柱状レンズ３０２は、Ｘ軸に沿って入射ビームＡを整形するためのものであり、第２の円柱状レンズ３０４は、Ｙ軸に沿って入射ビームＡを整形するためのものである。２つの交差した円柱状レンズは、Ｘ軸に沿ってフラットトップのプロファイルを有する、結果として生じる矩形レーザービームＢを提供するように適合される。円柱状レンズ３０２の入力面３０２ａは、表面の中心が小さく、レンズの両方のＸ先端に向かって滑らかに増大する可変の曲率半径を有する凸状の円柱面である。第２の円柱状レンズ３０４は、第１の円柱状レンズと同様であるが、ビームをＹ軸に沿って整形するように、レンズ３０２に対して直交して配置される。レンズ３０２及び３０４の入力面３０２ａ／３０４ａ及び出力面３０２ｂ／３０４ｂのプロファイルは、入射ビームＡのＸ及びＹプロファイルと、得られた矩形ビームＢの所望の強度プロファイルとの関数として独立して選択され得る（例えば、この特許の第５欄及び第６欄を参照のこと）。
【0064】
使用可能な市販のトップハットビーム整形器の例としては、例えば、Ｏｓｅｌａ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｌａｃｈｉｎｅ，Ｃａｎａｄａによって市販されているＤＴＨ－１Ｄ－０．４６ｄｅｇ－４ｍｍが挙げられる。
【0065】
以下により詳細に述べられるように、水平方向に沿ってＬＯビームを伸張するためのビーム整形器の使用によって、多くの利点が得られる。例えば、ＬＯビームとＲＦコムビームとの組み合わせが、試料位置の全体にわたってＬＯビーム及びＲＦコムビームの強度を一致させ、これにより、高い変調深度を有する蛍光シグナルの強度振幅変調を生成するために、実質的に同様の照射強度で複数の試料位置を照射することが確実になり得る。このような強度のマッチングが存在しない場合、画像化システムは、小さな視野を有する場合があり、ＡＯＤを駆動する周波数（ピクセル）の全てを利用することはできない場合がある。蛍光シグナルの変調深度は、試料の蛍光画像を再構成するシステムの能力において重要な役割を果たすので、全ピクセルにおける励起うなり周波数の一様に高い変調深度は、システムの作動にとって特に有利である。さらに、ＲＦコムビームを生成するためにＡＯＤに印加される電気シグナルの振幅は、それらの強度が、ＲＦコムビームとＬＯビームが重なり合うすべての空間的位置を横切るＬＯビームのビーム強度に等しくなるように、ＲＦコムビームを等化するために（例えば、コントローラ２１を用いて）ダイレクトデジタルシンセサイザの出力を制御することによって調整してもよい。この特徴によって、蛍光放射線の強度振幅変調が高い変調深度を保証するという利点が得られる。
【0066】
再び図１を参照すれば、ＲＦコムビーム２４は、レンズ２６及び３０の組み合わせを介して、中間像面３８上に画像化される。さらに具体的には、ＲＦコムビーム２４は、レンズ２６を通過し、ミラー２８を回避してレンズ３０（ミラー４０及び４２を介して中間像面３８にＲＦコムビームを導く）に到達する。
【0067】
図４は、中間像面３８における例示的な数のＲＦコムビームの分布を概略的に示している（一般性を失うことなく、ＲＦコムビームの数は、説明のために６になるように選択される（ＲＦ１、．．．、ＲＦ６と標識）が、他の数字も使用してもよい）。図４に示すように、中間像面３８において、ＲＦコムビーム２４は、水平方向に沿って互いに空間的に分離されている。他の実施形態では、ＲＦコムビーム２４のうちの２つ以上が部分的に重なる場合がある。したがって、レンズ２６及び３０の組み合わせは、角度的に分離されたＲＦコムビームを、水平方向に広がる一セットの空間的に分離されたビームに変換する。
【0068】
再び図１を参照して、上述したように、ビームスプリッタ４４は、トップハットビーム整形器３４から出るレーザービーム２２’を受け取り、そのビームをレンズ４６に反射し、次にビームを中間像面４８に集束させる。ここでは、ＬＯビームがトップハットビームプロファイルを示す。ビームスプリッタはまた、中間像面３８からＲＦコムビーム２４を受け取り、そこを通過するＲＦコムビームの通過を可能にする。レンズ４６は、ＲＦコムビーム２４を中間像面４８上に集束させて、トップハットビームプロファイルを有するＬＯビームと結合して、複合ビーム４９を生成する。
【0069】
説明のために、図５は、その伝搬軸に垂直な平面内の複合ビーム４９の１つの例示的なプロファイルを概略的に示す。複合されたビームの強度プロファイルは、トップハットＬＯビーム（正方形によって概略的に示される）の強度プロファイルと、ＲＦコムビーム２４（それぞれが円のうちの１つによって概略的に示される）の強度プロファイルとの重ね合わせとして生成される。以下でより詳細に説明するように、ＬＯビームとＲＦコムビームのこの重ね合わせは、水平の区域に沿って、その水平区域に沿った１つの空間位置にそれぞれ対応する複数のうなり周波数を提供する。試料の水平範囲を照射する際に、試料の位置から放射された蛍光放射線は、振幅変調を介して、その位置を照射する放射線に関連するうなり周波数をエンコードする。
【0070】
再び図１を参照し、この実施形態では調整可能なポストホルダーマウントＣに取り付けられた、正レンズ５０（この実施形態では２００ｍｍレンズ）及び対物レンズ５２は、フローセル５４を通じて流れる試料に対して中間像面４８で画像を中継するためのテレスコープを形成する。この実施形態では、ミラー５６は、複合ビーム４９をレンズ５０に反射し、ダイクロイックミラー５８が、レンズ５０を通過した後に複合された光学ビームを対物レンズ５２に向かって反射する。
【0071】
図６に模式的に示すように、複合ビーム４９は、フローセル５４を通って流れる試料６２の複数の空間的位置６０を同時に照射する。したがって、各々の位置６０は、ＲＦコムビームの１つとトップハット形状のＬＯレーザービームの一部との重複によって照射される。これらの空間的位置では、放射線は、存在する場合には試料中の目的のフルオロフォアを励起する。より具体的には、この実施形態では、ＬＯビーム及びＲＦコムビームは、複数の試料位置６０において、例えば、励起された電子状態へのその電子遷移を引き起こすことによってフルオロフォアを同時に励起する。
【0072】
いくつかの実施形態では、試料は、複数の細胞が同調される流動流体を含んでもよい。場合によっては、細胞を１つ以上の蛍光マーカー（フルオロフォア）で標識してもよい。蛍光マーカーのいくつかの例としては、限定するものではないが、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ））で標識された抗体、核酸染色剤（例えば、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ＳＹＴ０１６、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ））、細胞膜染色剤（例えば、ＦＭＩ－４３）、及び細胞機能色素（例えばＦｌｕｏ－４、Ｉｎｄｏ－１）が挙げられる。他の場合には、細胞内に存在する内因性フルオロフォアを用いて、細胞から蛍光放射線を誘発してもよい。以下でより詳細に説明するように、このような外因性または内因性のフルオロフォアは、照射放射線に応答して電子励起を受け、蛍光放射線を（典型的には励起周波数より低い周波数で）放射し、これが収集されて分析される。
【0073】
説明のために、いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、図７は、基底電子状態Ａに対応する仮想エネルギー準位、ならびにフルオロフォアの２つの電子励起電子状態Ｂ及びＣを示す。フルオロフォアは、放射エネルギーの吸収を介してその基底電子状態（Ａ）から励起電子状態（Ｂ）に励起され得る。次いで、フルオロフォアは、例えば、フルオロフォアの振動モードによって媒介される無放射遷移を介して、より低い励起状態Ｂに緩和し得る。フルオロフォアは、光学遷移を介して下部電子状態Ｃから基底状態にさらに緩和し得、それにより励起周波数より低い周波数で蛍光放射線を放射する。この仮説的な例は、説明の目的でのみ提供され、蛍光放射線が放射され得る唯一の機構を示すものではないことが理解されるべきである。
【0074】
多くの場合、フルオロフォアは、基底状態から励起された電子状態に励起される周波数範囲にわたって電磁放射線を吸収し得る。説明のために、図８は、図７と関連して説明される仮想フルオロフォアの吸収曲線を示す。本教示による実施形態の一実施では、ＬＯ周波数は、目的のフルオロフォアのピーク吸収に対応する周波数と一致するように選択してもよい。高周波シフトされたビームは、それらのそれぞれのうなり周波数によってピーク吸収から分離された周波数を有し得る。典型的には、これらの周波数分離は、励起周波数の劣化を回避するためにフルオロフォアの吸収帯域幅と比較して小さい。一例として及び単なる例示として、破線Ａ及びＢは、ＬＯビーム及びＲＦコムビームの１つの周波数を模式的に示す（説明を簡単にするために図は縮尺どおりには描かれていない）。ＬＯレーザービームと描かれたＲＦコムビームの１つとの両方による試料の空間的位置の同時照射は、ＬＯ及びＲＦコムビーム間の周波数の差に対応するうなり周波数で振幅変調を示す蛍光放射線をもたらす。
【0075】
再び説明のために、いかなる特定の理論にも限定されないが、ＬＯビームとＲＦコムビームの１つとの同時照射を介してフルオロフォアに印加される電場は、以下のように数学的に定義され得る。
Ｅｃｏｍ＝ＥＲＦｅｊ（ω０＋ωＲＦ）＋ＥＬＯｅｊ（ω０＋ωＬＯ） 式（１）
ここで、
Ｅｃｏｍは、複合されたビームの電場を示し、
ＥＲＦは、ＲＦコムビームの１つに関連する電場の振幅を示し、
ＥＬＯは、ＬＯビームに関連する電場の振幅を示し、
φ０は、レーザー１２によって生成されたレーザービームの周波数を示し、
φＲＦは、ＲＦコムビームに関連する周波数シフトを示し、そして
φＬＯは、ＬＯビームに関連する周波数シフトを示す。
Ｅｃｏｍ＝ＥＲＦｅｊ（ω０＋ωＲＦ）＋ＥＬＯｅｊ（ω０＋ωＬＯ） 式（１）
ここで、
Ｅｃｏｍは、複合されたビームの電場を示し、
ＥＲＦは、ＲＦコムビームの１つに関連する電場の振幅を示し、
ＥＬＯは、ＬＯビームに関連する電場の振幅を示し、
φ０は、レーザー１２によって生成されたレーザービームの周波数を示し、
φＲＦは、ＲＦコムビームに関連する周波数シフトを示し、そして
φＬＯは、ＬＯビームに関連する周波数シフトを示す。
【0076】
ＬＯ及びＲＦコムビームの電場の重ね合わせに応答して放射される蛍光放射線の強度は、（ωＲＦ－ωＬＯ）に相当するうなり周波数で変調を示す。したがって、ＬＯビームとＲＦコムビームの１つとの重ね合わせによって照射された試料の各空間位置から発せられる蛍光放射線は、ＬＯビームに関連する高周波シフトと、その空間的位置を照射するＲＦコムビームに関連する高周波シフトとの間の差に対応するうなり周波数で変調を示す。
【0077】
蛍光発光のプロセスは、有限の時間（一般的な有機フルオロフォアに対しては通常１～１０ナノ秒）を必要とするので、励起うなり周波数が高すぎる場合、放射された蛍光は高い変調深度を示さない。したがって、多くの実施形態では、励起うなり周波数は、１／τｆよりかなり小さくなるように選択され、ここで、τｆは、フルオロフォアの特徴的な蛍光寿命である。いくつかの例では、励起うなり周波数は、１％以上、例えば、２％以上、例えば、３％以上、例えば、５％以上、例えば、１０％、例えば、２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上まで、例えば１．５倍以上、例えば、２倍以上、例えば、３倍以上まで、例としては、これには５倍以上まで１／τｆより小さくてもよい。例えば、励起うなり周波数は、０．０１ＭＨｚ以上、例えば、０．０５ＭＨｚ以上、例えば０．１ＭＨｚ以上、例えば０．５ＭＨｚ以上、例えば１ＭＨｚ以上、例えば、５ＭＨｚ以上、例えば、１０ＭＨｚ以上、例えば、２５ＭＨｚ以上、例えば、５０ＭＨｚ以上、例えば、１００ＭＨｚ以上、例えば、２５０ＭＨｚ以上、例えば、５００ＭＨｚ以上まで、及び例としては、７５０ＭＨｚ以上まで１／τｆより小さくなってもよい。いくつかの実施形態では、光検出器は、照射された試料からの光（例えば、蛍光などの発光）を検出するように構成される。いくつかの実施形態では、光検出器は、１つ以上の検出器、例えば、２つ以上の検出器、例えば、３つ以上の検出器、例えば、４つ以上の検出器、例えば、５つ以上の検出器、例えば、６つ以上の検出器、例えば、７つ以上の検出器、及び例としては、８つ以上の検出器を含んでもよい。任意の光検出プロトコルが用いられてもよく、これらに限定されるものではないが、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）、象限フォトダイオード、イメージセンサ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増感型電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、光子計数器、ボロメータ、焦電検出器、フォトレジスター、光電池、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタ、量子ドット光伝導体またはフォトダイオード、及びそれらの組み合わせ、とりわけ、光検出器が挙げられる。いくつかの実施形態では、目的の光検出器は、３５０ｎｍ～１２００ｎｍの範囲の光、例えば４５０ｎｍ～１１５０ｎｍ、例えば５００ｎｍ～１１００ｎｍ、例えば５５０ｎｍ～１０５０ｎｍ、例えば、５００ｎｍ～１０００ｎｍ、及び例としては４００ｎｍ～８００ｎｍの範囲の光を検出するように構成される。特定の実施形態では、光検出器は、３９５ｎｍ、４２１ｎｍ、４４５ｎｍ、４４８ｎｍ、４５２ｎｍ、４７８ｎｍ、４８０ｎｍ、４８５ｎｍ、４９１ｎｍ、４９６ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１９ｎｍ、５２０ｎｍ、５６３ｎｍ、５７０ｎｍ、５７８ｎｍ、６０２ｎｍ、６１２ｎｍ、６５０ｎｍ、６６１ｎｍ、６６７ｎｍ、６６８ｎｍ、６７８ｎｍ、６９５ｎｍ、７０２ｎｍ、７１１ｎｍ、７１９ｎｍ、７３７ｎｍ、７８５ｎｍ、７８６ｎｍ、または８０５ｎｍなど、発光の最大発光で光を検出するように構成される。
【0078】
いくつかの実施形態では、試料によって放射された蛍光放射線は、様々な異なる方法で、例えば励起ビームの伝播方向に垂直な光路に沿って収集してもよい。他の実施形態では、蛍光放射線はエピ方向で検出される。
【0079】
再び図１を参照すれば、この実施形態では、照射された試料中に存在する１つ以上の蛍光団によって発せられた蛍光放射線は、対物レンズ５２を通過し、ダイクロイックミラー５８を透過して光検出器６４に到達する。さらに具体的には、この実施形態では、レンズ６５は、ダイクロイックミラー５８を透過した蛍光放射線をスリット開口部６６上に集束させる。スリットを透過する蛍光放射線は、蛍光発光フィルタ６８を通過して光検出器６４に達する。光検出器６４の前に配置された、スリット開口部６６（または以下で述べられる他の実施形態では光学フィルタ）は、試料の特定の面から放射された蛍光放射線の通過を実質的に可能にし、一方で、面外蛍光発光は阻止する。さらに、蛍光発光フィルタ６８、例えば、通過帯域フィルタは、蛍光放射線の光検出器６４への通過を可能にし、一方で他の周波数での放射線の通過を実質的に阻止する。
【0080】
光検出器６４は、うなり周波数の全範囲からシグナルを検出して送信するために十分なＲＦ帯域幅を有する。適切な光検出器のいくつかの例としては、とりわけ、限定するものではないが、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、ＰＩＮフォトダイオード、及びハイブリッド光検出器が挙げられる。一例として、いくつかの実施形態では、Ｈａｍａｍａｔｓｕ（浜松）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが市販している光電子増倍管（例えば、Ｒ３８９６、Ｒ１０６９９、Ｈ１１４６２）を使用してもよい。光検出器は、受信した蛍光放射線の検出に応答してシグナル、例えばこの実施形態ではアナログシグナルを生成する。
【0081】
別の例として、図９Ａを参照して、ＬＯビームと空間的に分離されたＲＦコムビームとの同時照射に応答して試料から放射された蛍光放射線は、対物レンズ５２及びダイクロイックミラー５８を通過し、レンズ１００を介してマルチモード光ファイバー１０２（近位端部１０２ａから遠位端部１０２ｂに伸びる）に結合される。より具体的には、光ファイバー１０２の近位端１０２ａは、レンズ１００の焦点面の近傍に配置され、蛍光放射線を受け取る。光ファイバーの遠位端１０２ｂに結合されたアウトカップリングレンズ１０４は、光ファイバーを出る放射線をコリメートする。
【0082】
多くの場合、試料を照射する励起放射線は、励起周波数が試料中の複数のフルオロフォアの吸収スペクトル内に入るように、十分広い放射線吸収スペクトルを有し得る複数のフルオロフォア（例えば、有機フルオロフォア）を励起する。したがって、各フルオロフォアは、異なる周波数で蛍光放射線を発する。一般性を失うことなく、かつ説明の目的で、この実施形態では、検出システムは、４つの光電子増倍管１０６、１０８、１１０、１１２を含み、そのそれぞれが、照射された試料中の励起放射線によって励起される、４つのフルオロフォアのうちの１つによって放射される蛍光放射線に対応するコリメートされた放射線の一部を受け取る。より具体的には、ダイクロイックミラー１１４は、第１の周波数でフルオロフォアの１つによって放射された蛍光放射線を光電子増倍管１０６に反射し、一方で、他の周波数での蛍光放射線は通過させる。別のダイクロイックミラー１１６は、異なる第２の周波数で異なるフルオロフォアによって放射された蛍光放射線を光電子増倍管１０８に反射し、一方で、第３の周波数でさらに別のフルオロフォアによって放射された蛍光を含む残りの放射線を、第３のダイクロイックミラー１１８に到達することを可能にし、このダイクロイックミラー１１８が、その蛍光放射線を光電子増倍管１１０に反射する。ダイクロイックミラー１１８は、第４の放射線周波数で第４のフルオロフォアによって放射された蛍光放射線を含む残りの放射線を通過させて光電子増倍管１１２に到達させる。
【0083】
４つの蛍光周波数のうちの１つを各々が中心とする複数のバンドパスフィルタ１２０、１２２、１２４、１２６が、光電子増倍管１０６、１０８、１１０、１１２の前にそれぞれ配置されている。各光電子増倍管によって検出されたシグナルは、後述するように分析されて、それぞれの蛍光周波数で蛍光画像を生成する。いくつかの実施形態では、複数の光検出器を用いるのではなく、単一の光電子増倍管、例えば、単一の光電子増倍管を使用して、蛍光放射線、例えば単一のフルオロフォアからの放射に対応する蛍光周波数を検出してもよい。
【0084】
いくつかの実施形態では、試料がフローセルを流れるにつれて、試料の異なる水平行が照射され、各水平行に関連する蛍光放射線が光電子増倍管１０６、１０８、１１０及び１１２などの１つ以上の光検出器によって検出される。
【0085】
図９Ｂは、図９Ａに関連して上述したものと同様の検出システムを、この検出システムが、光ファイバーを用いるのではなく、ダイクロイックミラー５８を通過した複数のフルオロフォアからの蛍光発光を含む蛍光放射線が、自由空間を伝播して光電子増倍管１０６、１０８、１１２に到達することを除いて、概略的に示す。さらに具体的には、レンズ１００は、レンズ１００と１０４との間に配置された開口部１２６上に蛍光放射線を集束し、ここでこの開口部は、焦点を外れた放射線を拒絶し得る。レンズ１０４は、開口部を通過する放射線をコリメートし、ここでこのコリメートされた放射線は、図９Ａに関連して上述した方法で光電子増倍管の中に分配される。
【0086】
いくつかの実施形態では、システム１０は、励起放射線を用いて試料の（試料の不在下でのフローセルの）暗視野画像及び明視野画像を提供するように構成してもよい。一例として、図９Ｃは、試料の暗視野画像及び明視野画像をそれぞれ検出するための２つの検出アーム２００及び２０２を含むシステム１０の実施形態を概略的に示す。
【0087】
より具体的には、検出アーム２００は、フローセルを通って流れる試料によって散乱される励起放射線の一部を受け取るように、励起放射線の伝搬に対して垂直に配置される。検出アーム２００は、試料によって散乱された励起放射線の少なくとも一部を、レンズ２０４によって光電子増倍管２０８に入射された立体角に集合的に向ける２つのレンズ２０４及び２０６を備える。より具体的には、レンズ２０４は、受け取った散乱放射線をコリメートし、レンズ２０６は、このコリメートされた散乱放射線を、光電子増倍管２０８上に収束させる。この実施形態では、適切なバンドパスフィルタ２１０が、光電子増倍管２０８の前に配置され、所望の周波数を有する放射線が光電子増倍管２０８に通過することを可能にし、一方で望ましくない周波数の放射線は遮断する。光電子増倍管２０８の出力は、当該技術分野で公知の方法で、例えば暗視野画像を生成するために以下に説明するような分析モジュールによって、処理され得る。
【0088】
検出アーム２０２は、ここでは２つのレンズ２１２及び２１４を備え、このレンズ２１２は、フローセルを出る励起放射線を順方向（実質的にフローセル５４に入る励起放射線の伝搬方向に沿って）コリメートし、レンズ２１４は、このコリメートされた放射線を、光検出器２１６上に集束させる。光検出器の前に配置された適切なフィルタ２１８、例えば、バンドパスフィルタは、他の放射線周波数を実質的に遮断しながら、光検出器２１６への励起周波数の伝送を可能にする。光検出器２１６の出力は、フローセルの明視野画像を生成するために当該技術分野で公知の方法で処理してもよい。
【0089】
したがって、検出アーム２００は、セルを通って流れる流体によって散乱された励起放射線を検出し、検出アーム２０２は、フローセルを透過する励起放射線を検出する。流体がフローセルを通って流れていないとき、光電子増倍管２０８によって検出されるシグナルは低く、光検出器２１６によって検出されるシグナルは、フローセルを通過する励起放射線の散乱がほとんどなく、したがって、大部分の励起放射線が、ある場合には全ての励起放射線がフローセルを透過する。対照的に、フローセルを通る流体試料の流れは、光電子増倍管２０８によって生成されたシグナルを、試料による励起放射線の一部の散乱に起因して増大させ、光検出器２１６によって生成されたシグナルは、フローセルを透過する励起放射線のレベルが低下するにつれて低下する。
【0090】
さらなる例として、及び図９Ｄを参照して、本教示によるシステムの一実施形態では、励起放射線の伝搬方向と実質的に直交する方向にフローセル５４に対して配置された検出アーム２２０ａは、試料中の複数のフルオロフォアによって放射される蛍光放射線、ならびに試料によって散乱される励起放射の両方を検出するための光検出器を備える。より具体的には、検出アーム２２０は、蛍光放射線、ならびに集束されていない放射線を拒絶する開口部２２６上に散乱励起放射線を導くレンズ２２２及び２２４を備える。レンズ２２８は、開口部を通過する放射線をコリメートする。ダイクロイックミラー２３０は、暗視野画像を検出するために、励起光周波数の放射線の一部を光電子増倍管２３２に反射させ、一方で、蛍光放射線は通過させる。光電子増倍管２３２の前に配置された適切なフィルタ２３２ａ、例えばバンドパスフィルタは、励起周波数の放射線を光電子増倍管２３２に通過させ、不要な放射周波数を阻止する。別のダイクロイックミラー２３４は、第１の周波数のフルオロフォアによって放射された蛍光放射線を、光電子増倍管２３６に反射し、一方で、他のフルオロフォアによって放射される蛍光放射線の他の周波数での通過を可能にする。別のダイクロイックミラー２３８は、第２の周波数の別のフルオロフォアによって発せられた蛍光放射線を光電子増倍管２４０上に反射し、一方で、光電子増倍管２４２によって検出される第３の周波数でさらに別のフルオロフォアから放射される蛍光放射線の通過を可能にする。前述の実施形態と同様に、複数のフィルタ２３６ａ、２４０ａ、及び２４２ａが、光電子増倍管２３６、２４０、及び２４２の前にそれぞれ配置され、所望の周波数の放射を透過させ、一方で望ましくない放射周波数は実質的に阻止する。
【0091】
引き続き図９Ｄを参照すると、本教示によるシステムのこの実施形態は、例えば、図９Ｃに関連して述べられた方法で明視野画像を生成するための別の検出アーム２２０ｂをさらに備える。より具体的には、検出アーム２０２は、励起放射線の明視野画像を生成するために光を光検出器２１６に集束する２つのレンズ２１２及び２１４を備える。フィルタ２１８、例えばバンドパスフィルタが、光検出器２１６の前に配置されて、励起放射を検出器に通過させ、一方で不要な放射周波数を排除する。
【0092】
再び図１及び図１０を参照すれば、この実施形態では、トランスインピーダンス増幅器７０を、光検出器６４の出力（または図９Ａ～９Ｄに関連して説明した光検出器のそれぞれ）に結合して光検出器によって生成されたシグナルを増幅してもよい。データ分析ユニット７２（本明細書ではまた、分析モジュールまたは分析器とも呼ばれる）は、増幅されたシグナルを受け取り、そのシグナルを分析して試料の蛍光画像を生成する。データ分析ユニット７２は、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアで実施され得る。例えば、検出された蛍光データを分析するための方法は、プロセッサの制御下でアクセスされる分析モジュールのｒｅａｄ－ｏｎｌｙ－ｍｅｍｏｒｙ（読出し専用メモリ）（ＲＯＭ）ユニットに記録され、受信された蛍光シグナルを分析し得る。
【0093】
以下でより詳細に説明されるように、分析方法は、時変光検出器の出力の周波数成分を決定し、それらの周波数成分に基づいて試料の蛍光画像を構築する。光検出器の出力の周波数成分を決定するために様々な方法を用いてもよい。そのような適切な方法のいくつかの例としては、限定するものではないが、フーリエ変換、ロックイン検出、フィルタリング、Ｉ／Ｑ復調、ホモダイン検出、及びヘテロダイン検出が挙げられる。
【0094】
一例として、図１１Ａ及び１１Ｂは、試料の蛍光画像を生成するために分析モジュール７２によって実行され得る例示的な分析ステップを示す。ステップ（１）において、アナログ増幅シグナルをデジタル化してデジタル化された蛍光データを生成する。ステップ（２）において、デジタル化されたデータの適切な部分（長さ）を分析のために選択する。例えば、試料の照射された行（ここではフレームとも呼ばれる）に対応する蛍光データを、分析のために選択してもよい。あるいは、データフレームの一部を分析のために選択してもよい。
【0095】
ステップ（３）では、選択されたデータのフーリエ変換が行われる。一例として、いくつかの実施形態では、データの周波数成分を決定するために、データの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が実行される。いくつかのそのような実施形態では、ＦＦＴのビンは、データ取得のために選択された周波数に相当し得る。例えば、２５６ＭＨｚのサンプリングレートの場合、２５６個の試料は、互いに１ＭＨｚ、例えばＤＣ～１２８ＭＨｚまで互いに分離されている周波数ビンを生成し得る。ＦＦＴ分析は、放射された蛍光発光が振幅変調を示すうなり周波数に相当する周波数を提供する。
【0096】
引き続き図１１Ａ及び図１１Ｂを参照すれば、この実施形態では、ステップ（４）において、ＦＦＴデータに存在する各周波数成分の振幅の尺度は、その周波数成分の実数成分と虚数成分との２乗和の平方根を得ることによって計算する。各周波数成分は、試料の特定の位置から蛍光放射線を誘発するために使用されるうなり周波数の１つに相当するので、周波数成分の振幅の尺度によって、試料の水平行に沿ったその周波数成分に関連する位置のピクセル値を得てもよい。このようにして、試料の水平行の画像のピクセル値を決定してもよい。試料がフローセルを垂直方向に流れるにつれて、試料の各水平行について得られた蛍光データに対して上記のステップを繰り返してもよい。ピクセル値を用いて蛍光画像を構築してもよい（ステップ５）。
【0097】
上述したように、分析モジュール７２は、本技術分野において公知の技術を用いて、そして本教示に従って、ハードウェア、ファームウェア及び／またはソフトウェアで実施し得る。一例として、図１２は、増幅器７０から増幅された蛍光シグナルを受信し、そのシグナルをデジタル化してデジタル化された蛍光データを生成するためのアナログ／デジタル変換器７４を備える、分析器７２の例示的な実施を概略的に示す。分析モジュールはさらに、計算及び論理演算の実行を含む、分析モジュールの作動を制御するための中央処理装置（ＣＰＵ）７６を備える。分析モジュールはまた、ＲＯＭ（読出し専用メモリ）７８、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）８０及び永久メモリ８２を備える。通信バス８４は、ＣＰＵ７６と他の構成要素との間の通信を含む、分析モジュールの様々な構成要素間の通信を容易にする。メモリモジュールは、蛍光データ及び分析結果を分析するための命令を記憶するために使用してもよい。一例として、いくつかの実施形態では、データ分析のための命令、例えば、図１１Ａ及び図１１Ｂに関連して上述したステップを実行するための命令がＲＯＭ７８に記録され得る。ＣＰＵは、ＲＯＭ７８に記憶された命令を使用して、ＲＡＭ８０に記憶されたデジタル化された蛍光データを操作して、試料の蛍光画像（例えば、１次元または２次元画像）を生成し得る。ＣＰＵは、永久メモリ８２、例えばデータベース中に蛍光画像を記録し得る。図１２に模式的に示すように、分析モジュールは、受信したデータ（例えば、蛍光データ）からピクセル強度及び他の量の計算を実行するためのグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）７６’を必要に応じて備えてもよい。
【0098】
いくつかの実施形態では、光検出器によって生成された出力シグナルの周波数復調は、ロックイン検出技術を使用して達成され得る。一例として、図１３Ａ及び図１３Ｂを参照すると、このような実施形態の１つでは、増幅された蛍光シグナルがデジタル化され（ステップ１）、このデジタル化された蛍光シグナルのいくつかのコピーが生成され（ステップ２）、ここでデジタル化されたコピーの数（Ｎ）は、ＲＦコムビームと関連した蛍光の数に相当する。シグナルの各デジタル化されたコピーは、ＲＦコムビームとＬＯビームの１つの周波数との間の相違に等しいうなり周波数に相当する周波数を有する正弦波及び余弦波と乗算されて、複数の中間シグナルが生成される（ステップ２）。各々の中間シグナルは、ＲＦコム周波数の間に間隔がある周波数の半分に等しい帯域幅を有するローパスフィルタを通過される（ステップ３）。
【0099】
ＲＦコム周波数の１つに相当する各うなり周波数について（換言すれば、照射された試料の空間的位置に相当する各周波数について）、その周波数に相当する２つのフィルタリングされた中間シグナルの２乗和の平方根は、ＬＯビーム及びその周波数を有するＲＦコムビームによって照射された試料位置に対応する画像ピクセルの振幅の尺度として得られる（ステップ４）。いくつかの実施形態では、同じうなり周波数に相当する（すなわち、同じ試料位置に相当する）複数の蛍光データのシグナルを、上述した方式で処理してもよく、ピクセル値を平均して平均ピクセル値を得てもよい。
【0100】
上記のステップは、試料がフローセルを垂直方向に流れていくにつれ、試料の各水平行について得られた蛍光データについて繰返してもよい。ピクセル値を使用し蛍光画像を構築してもよい（ステップ５）。
【0101】
上記のロックイン検出方法は、ソフトウェア、ファームウェア及び／またはハードウェアで実施してもよい。例としては、一実施形態において、上記のロックイン検出方法は、特に６種を超える周波数が使用される場合、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を使用して実行してもよい。いくつかの実施形態では、Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄが市販するＨＦ２Ｌ－ＭＦ多周波数幅器のような多周波数ロックイン増幅器を使用してもよい。
【0102】
さらなる例として、いくつかの実施形態では、検出された蛍光シグナルの周波数復調は、バンドパスフィルタに基づく画像復調技術を使用することによって達成され得る。図１４Ａ及び図１４Ｂを参照すれば、このような周波数復調方法の一実施形態では、光検出器６４及び増幅器７０によって提供される蛍光シグナルをデジタル化して（ステップ１）、このデジタル化したシグナルの数個のコピーを生成し（ステップ２）、このデジタル化されたコピーの数（Ｎ）は、ＲＦコムビームに関連する周波数の数に相当する。デジタル化された蛍光シグナルの各コピーは、そのシグナルをＲＦコムビームの１つに関連するうなり周波数（すなわち、試料の特定の位置に関連するうなり周波数）を中心とするバンドパスフィルタに通すことによってフィルタリングされる（ステップ３）。より具体的には、各バンドパスフィルタは、Ｎ個のうなり周波数のうちの１つの中心に位置し、隣り合ううなり周波数間の周波数間隔の半分に等しい帯域幅を有する。
【0103】
各うなり周波数における包絡線検出器を用いて、各水平線について、その周波数に相当する各ピクセルの振幅を推定する（ステップ４）。場合によっては、そのピクセルに関連する試料位置に相当する複数の蛍光シグナルを処理することによって得られたピクセルに相当する複数のピクセル値が平均化され、平均ピクセル値が得られる。上述したステップは、試料がフローセルを垂直方向に流れるにつれて試料の各水平行について得られる蛍光データについて繰り返してもよい。ピクセル値は、試料の１次元または２次元の蛍光画像を構築するために使用してもよい（ステップ５）。
【0104】
分析モジュールは、明視野及び暗視野の画像データを受信及び処理するように構成してもよい。例えば、図９Ｃ及び図１０を参照すると、分析モジュール７２は、光検出器２０８及び２１８から暗視野画像データ及び明視野画像データを受け取って、暗視野画像及び明視野画像を生成するようにさらに構成してもよい。例えば、図１２を参照すると、暗視野及び明視野画像を生成するための命令は、例えば、当該技術分野で公知の方法で、永久メモリ８２に記憶してもよい。プロセッサ７６は、これらの命令を使用して、受け取った暗視野画像及び明視野画像のデータを処理して、画像を生成し得る。分析モジュールはまた、例えば、蛍光画像と、明視野画像及び暗視野画像の一方または両方とを重ね合わせることによって複合画像を生成するように構成してもよい。
【0105】
上述したシステム１０のような、本教示によるシステムによって生成された蛍光画像、ならびに明視野及び暗視野画像は、様々な異なる方法で使用してもよい。例えば、蛍光画像を統合して、従来のフローサイトメーターによって生成されたデータに匹敵する値を生成してもよい。この蛍光画像はまた、その画像を生じる蛍光プローブの位置を決定するために分析されてもよい（例えば、プローブが核であるか、細胞質であるか、細胞小器官に局在するか、または細胞膜の外側であるかを決定し得る）。さらに、いくつかの用途では、そのすべてが同じ細胞から得られた異なる蛍光バンドを検出することによって得られる複数の蛍光画像を使用して、細胞内の複数の蛍光プローブの共局在の程度を決定してもよい。さらに、とりわけ、細胞形態、細胞シグナル伝達、内在化、細胞－細胞相互作用、細胞死、細胞周期、及びスポット計数（例えば、ＦＩＳＨ）の分析が、多色蛍光、明視野及び暗視野画像を使用して、可能である。
【0106】
上述したように、システム１０は、少なくとも３つの異なるモードで作動されてもよい。上述した１つのモードでは、ＬＯビーム及び複数のＲＦコムビームが、試料の一部（例えば、水平範囲に沿って配置された位置）を同時に照射し、この照射された場所から放射された蛍光放射線を検出して分析し、試料の蛍光画像を構築する。別の作動モードでは、複数のＲＦ駆動シグナルを同時にＡＯＤに印加するのではなく、駆動シグナルを含む周波数傾斜を、ＡＯＤに印加して、レーザービームの周波数を、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）まで時間とともに変化させる。周波数傾斜の各駆動周波数に対して、レーザービームの周波数は、その駆動周波数だけシフトされ、その試料は周波数シフトされたレーザービームによって照射され、試料から蛍光放射線を誘発する。言い換えれば、このモードでは、このシステムは、中心レーザー周波数からシフトされる複数の周波数を有する時間間隔にわたって試料を連続的に照射することによって、この試料からの蛍光放射線を得るように作動される。ＡＯＤによって生成された周波数シフトには、同一の光路を使用してビームが試料を横切って高速で走査されるような角度偏向が伴う。
【0107】
より具体的には、この作動モードでは、ＲＦ周波数シンセサイザ１０を使用して、ＡＯＤ１８に印加される駆動シグナルを、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）まで傾斜させる。一例として、駆動シグナルが傾斜される周波数範囲は、約５０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚであってもよい。いくつかの実施形態では、駆動シグナルは、約１００ＭＨｚ～約１５０ＭＨｚまで上昇する。この実施形態では、例えば、高速を達成するために、駆動周波数を時間の経過とともに連続的に変更する。他の実施形態では、駆動周波数は、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）まで離散的なステップで変更されてもよい。
【0108】
駆動周波数は、周波数シフトされたビームがミラー２８をかわして、レンズ２６、レンズ３０、ミラー４０／４２、ビームスプリッタ４４、レンズ４６、ミラー５６、レンズ５０、ミラー５８及び対物レンズ５２によって規定される光路に沿って伝播して、試料ホルダーを通って流れる試料の一部を照射するように選択する。ランプ速度は、試料がビームを横切って流れる際に放射される蛍光放射線に基づいて生成される蛍光画像の垂直方向のぼけを改善し、好ましくは防止するように十分に速いことが好ましい。これは、例えば、傾斜速度を試料の流速と一致させることによって達成され得る。試料のレーザースポットサイズは、適切な速度を推定するために使用されてもよい。一例として、１マイクロメートルのレーザースポットサイズの場合、画像のぼけを避けるために、１秒あたり０．１メートルの試料流速に対して１ラインについての走査時間は１０マイクロ秒以下でなければならない。
【0109】
励起放射線による照射に応答して試料から放射された蛍光放射線は、上述した方法で収集され検出される。具体的には、図１０を参照して、蛍光放射線は光検出器６４によって検出される。検出された蛍光は、増幅器７０によって増幅され、増幅されたシグナルは分析モジュール７２によって分析されて、試料の蛍光画像を再構成する。画像の再構成は、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）までの走査期間内の特定の時間に水平ピクセル位置を割り当てることによって行われる。上記の作動モードのようにピクセル値を得るために周波数成分の振幅を分析するのとは対照的に、この作動モードで使用される復調のアプローチは、検出された蛍光シグナルの時間領域値のみを用いて画像のピクセルに値を割り当てる。試料の２次元蛍光画像を得るために、試料が垂直方向に流れるときに、このプロセスを繰り返してもよい。
【0110】
試料によって放射された蛍光放射線は、もしあれば、光検出器６４によって収集される。図１０を参照すれば、検出された蛍光放射線は、増幅器７０によって増幅される。分析モジュール７２は、増幅されたシグナルを受信する。この作動モードでは、分析モジュールは、蛍光シグナルを分析して、試料、例えば細胞／粒子の蛍光含量を決定する。この作動モードでは、試料を励起するビームは１つしかないので、試料を励起することに応答したうなり周波数は生成されない。したがって、蛍光シグナルの周波数領域に画像情報は存在しない。むしろ、検出された蛍光シグナルは、時間領域においてエンコードされた画像情報を有する。この作動モードでは、検出された蛍光シグナルの時間値を水平ピクセル座標として、及び蛍光シグナルのデジタル化された電圧値をピクセル値（輝度）として使用して、デジタル的に画像を再構成してもよい。ＡＯＤに印加される駆動周波数の各走査は、画像の１水平線（行）を生成する。画像再構成は、試料が照射領域（点）を通過する際に連続走査によって達成される。
【0111】
さらに別の作動モードでは、システム１０を作動させて、例えば、レーザービームの中心周波数を高周波によってシフトすることによって生成され得る、単一の励起周波数によって試料の複数の位置を同時に照射してもよい。より具体的には、再び図１を参照して、このような作動モードでは、単一の駆動高周波をＡＯＤ１８に印加して、ＡＯＤ１８に入射するレーザービームに対してシフトされた周波数を有するレーザービームを生成してもよい。さらに、周波数シフトされたレーザービームは、高周波レーザービームが、レンズ３２ならびにミラー３３及び３５を介して、トップハットビーム整形器３４に向かってミラー２８によって遮蔽されて反射されるように、ＡＯＤに入射するレーザービームに対する角度シフトを示す。トップハットビーム整形器を出るビームは、ビームスプリッタ４４によって反射され、レンズ４６によって中間像面４８上に集束される。この面では、図１５Ａに示すように、レーザービーム１０００は、水平方向に沿って延伸プロファイルを示す。
【0112】
水平方向に伸張されたレーザービームは、ミラー５６によって正レンズ５０に反射される。正レンズ５０を通過した後、レーザービームは、ミラー５８によって対物レンズ５２に反射される。上述したように、正レンズ５０及び対物レンズ５２は、トップハット形のレーザービームを、中間像面４８から、フローセル５４を通って流れる試料上に中継するテレスコープを形成する。
【0113】
水平に伸張されたレーザービームは、試料の水平範囲を照射して、試料中に存在する場合には目的のフルオロフォアをその水平方向に沿って励起する。したがって、この作動モードでは、試料の複数の水平位置が異なる励起周波数で照射される第１の作動モードとは異なり、試料の複数の水平位置が同じ励起周波数で照射される。この作動モードでは、ユーザが流れる細胞または粒子の画像を得ることが可能にならない。しかし、この作動モードでは、画像が必要でない場合には、より高いシグナル対ノイズ比のデータを得るために有用であり得る、他の２つの作動モードよりも高い光パワーを典型的には試料に印加してもよい。この作動モードは、システムに機械的な変更を加える必要なしに、音響光学偏向器を駆動する電気シグナルを単に変更することによってアクセス可能である。
【0114】
したがって、システム１０は、試料から蛍光放射線を誘発するために、３つの異なる作動モードで作動させてもよい。
【0115】
いくつかの実施形態では、蛍光寿命測定は、例えば、高周波シフトされた及び局部発振器ビームのそれぞれのビートの位相を、それぞれの高周波成分の位相と、検出された蛍光シグナル中で比較することによって、試料上の各空間位置で実行してもよい。一例として、図１５Ｂは、このような蛍光寿命測定（図１に示される特定の構成要素は、簡略化のためにこの図には示されていない）を可能にする、上述したシステム１０の修正版であるシステム１０’を示す。具体的には、ビームスプリッタ４４に入射するＲＦコムビームの一部は、ビームスプリッタによって、収束レンズ４００上に反射される（この実施形態では例示として、レンズ４００は、２００ｍｍの焦点距離を有するが、他の焦点距離も利用されてもよい）。レンズ４００は、ＲＦコムビームのその部分を、励起ビームを検出するフォトダイオード４０２に集束させる。フォトダイオード４０２の出力は、分析モジュール７２によって受け取ってもよい（図１０を参照のこと）。分析モジュールは、例えば、上述した復調技術の１つを使用して、励起ビームの周波数逆多重化を提供し、励起ビーム内の各高周波成分の位相を決定し得る。これは、検出された蛍光シグナル中の各高周波成分に対して、その高周波成分の位相を比較し得る基準位相を提供し得る。例えば、励起シグナルのＦＦＴの実数成分及び虚数成分、またはロックイン型復調のＩ成分及びＱ成分を用いてもよい。あるいは、試料／フローセルの明視野画像を検出する検出器の出力を使用して、蛍光うなり周波数の位相を比較し得る基準位相を得てもよい。
【0116】
より具体的には、分析モジュール７２は、例えば上述したように、検出された蛍光シグナルの周波数逆多重化を提供し得る。当業者には理解されるように、蛍光シグナルの各うなり周波数について、空間的に分解された蛍光寿命測定値及び蛍光寿命画像を得るために、高周波成分の位相を励起ビームのそれぞれの基準位相と比較してもよい。
【0117】
特定の実施形態において、本発明のシステムは、流動ストリーム中の試料によって放射された光を検出するための上述した光学的構成を使用するフローサイトメトリーシステムを備える。特定の実施形態では、本発明のシステムは、その開示が、全体として参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第３，９６０，４４９号；同第４，３４７，９３５号；同第４，６６７，８３０号；同第４，７０４，８９１号；同第４，７７０，９９２号；同第５，０３０，００２号；同第５，０４０，８９０号；同第５，０４７，３２１号；同第５，２４５，３１８号；同第５，３１７，１６２号；同第５，４６４，５８１号；同第５，４８３，４６９号；同第５，６０２，０３９号；同第５，６２０，８４２号；同第５，６２７，０４０号；同第５，６４３，７９６号；同第５，７００，６９２号；同第６，３７２，５０６号；同第６，８０９，８０４号；同第６，８１３，０１７号；同第６，８２１，７４０号；同第７，１２９，５０５号；同第７，２０１，８７５号；同第７，５４４，３２６号；同第８，１４０，３００号；同第８，２３３，１４６号；同第８，７５３，５７３号；同第８，９７５，５９５号；同第９，０９２，０３４号；同第９，０９５，４９４号；及び同第９，０９７，６４０号に記載されたフローサイトメーターの１つ以上の構成要素を備えるフローサイトメトリーシステムである。
【0118】
上述したように、いくつかの実施形態では、本発明のシステムは、フローサイトメーターの流動ストリームのような流動ストリームとして流れる試料中の粒子（例えば、細胞）を画像化するように構成される。流動ストリーム中の粒子の流速は、０．００００１ｍ／ｓ以上、例えば０．００００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０００１ｍ／ｓ以上、例えば、０．０００５ｍ／ｓ以上、例えば０．００１ｍ／ｓ以上、例えば、０．００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０１ｍ／ｓ以上、例えば、０．０５ｍ／ｓ以上、例えば、０．１ｍ／ｓ以上、例えば０．５ｍ／ｓ以上、例えば、１ｍ／ｓ以上、例えば２ｍ／ｓ以上、例えば３ｍ／ｓ以上、例えば４ｍ／ｓ以上、例えば５ｍ／ｓ以上、例えば６ｍ／ｓ以上、例えば７ｍ／ｓ以上、例えば８ｍ／ｓ以上、例えば９ｍ／ｓ以上、例えば１０ｍ／ｓ以上、例えば１５ｍ／ｓ以上、及び例としては２５ｍ／ｓ以上であってもよい。例えば、流動ストリームのサイズ（例えば、流動ノズル開口部）に依存して、流動ストリームは、０．００１μＬ／分以上、例えば０．００５μＬ／分以上、例えば、０．０１μＬ／分以上、例えば、０．０５μＬ／分以上、例えば、０．１μＬ／分以上、例えば０．５μＬ／分以上、例えば１μＬ／分以上、例えば５μＬ／分以上、例えば１０μＬ／分以上、例えば２５μＬ／分以上、例えば５０μＬ／分以上、例えば１００μＬ／分以上、例えば２５０μＬ／分、及び例としては、５００μＬ／分以上という本発明のシステムにおける流速を有してもよい。
【0119】
いくつかの態様では、粒子、例えば細胞の１つ以上の特性の推定値を提供するための方法及びシステムが開示される。一例として、図１６Ａは、粒子の１つ以上の特性を決定するための本教示の実施形態による１つの例示的な方法における様々なステップを示すフローチャートを提示する。粒子がフローサイトメトリーシステムを通って流れ、粒子からの少なくとも１つの放射性応答を誘発する（ステップ１）につれて、粒子は、高周波変調光学ビームで照射される。一例として、高周波変調光学ビームは、高周波によって互いからシフトされた光周波数を有する少なくとも２つのビームレットを含んでもよい。いくつかの実施形態では、高周波シフトは、約１０ＭＨｚ～約２５０ＭＨｚの範囲内であってもよい。例えば、高周波シフトは、約５５ＭＨｚ～約２２５ＭＨｚの範囲、例えば約６０ＭＨｚ～約２００ＭＨｚ、例えば約６５ＭＨｚ～約１７５ＭＨｚ、例えば７０ＭＨｚ～約１５０ＭＨｚ、及び例としては、約７５ＭＨｚ～約１２５ＭＨｚの範囲であってもよい。一例として、いくつかの実施形態では、高周波変調された光学ビームは、音響光学偏向器（ＡＯＤ）にレーザービームを導入し、１つ以上の高周波で１つ以上の駆動シグナルをＡＯＤに印加して、例えば、上述した方式で、上記の高周波によって互いに対してシフトされた光周波数を有する複数の角度的に分離されたビームレットを生成することによって生成してもよい。
【0120】
いくつかの実施形態では、高周波変調光学ビームによる粒子の照射に応答して粒子から誘発される放射性応答は、蛍光及び／または散乱放射線のいずれであってもよい。
【0121】
引き続き図１６Ａのフローチャートを参照すれば、粒子から放射される放射性応答が検出され得（ステップ２）、この放射性応答に関連する時間波形データが生成され得る（ステップ３）。上述したような様々な放射線検出モダリティ及び検出器を用いて、誘発された放射線応答を検出してもよい。いくつかの実施形態では、生成された波形は、蛍光であっても、及び／または散乱波形データであってもよい。波形データは、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得るために処理してもよい。多くの実施形態では、波形データに基づいて粒子の画像を生成することなく、波形データのこのような処理を実行して、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得てもよい。いくつかの実施形態では、処理ステップは、時間波形データを変調する１つ以上のうなり周波数を分析して、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることを含む。いくつかの実施形態では、処理ステップは、粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得ることに関連する潜時が約１００マイクロ秒未満となるように十分に速く実行される。
【0122】
いくつかの実施形態では、上記の方法を使用して、とりわけ粒子の寸法サイズ、２つの異なる寸法に沿った粒子のサイズの比、粒子に関連する２つ以上のマーカーによって放射される蛍光放射線の共局在化、または放射性応答の尖度（例えば、粒子によって放射された蛍光放射線の尖度の程度）のうちのいずれかの推定値を得てもよい。
【0123】
上記の方法を使用して、様々な異なる粒子の１つ以上の特性の推定値を得てもよい。一例として、粒子は、細胞、小生物（例えば、線虫のｃ．ｅｌｅｇａｎ）、ビーズ、微粒子、ナノ粒子、ウイルス粒子、細菌、エキソソーム、または医薬品のいずれであってもよい。
【0124】
図１６Ｂは、細胞などの粒子の少なくとも１つの特性を推定するための、ある実施形態によるシステム３０００を概略的に示す。例示的なシステム３０００は、フローサイトメトリーシステムのセルを通って流れる１つ以上の粒子を高周波変調された光学レーザービームで照射するための照射システム３００２を備える。検出器３００４は、その照射に応答して粒子、例えば、蛍光及び／または散乱放射線の放射性応答を検出し、放射性応答を示す１つ以上のシグナルを生成し得る。分析器３００６は、検出器からシグナル（複数可）を受け取り、時間波形データを生成し、その波形データに対して作用して、粒子の１つ以上の特性の推定値を導出し得る。
【0125】
分析器３００６は、細胞などの粒子の１つ以上の特性の推定値を得るために、波形データを分析するためのさまざまな異なる方法を使用し得る。一例として、いくつかの実施形態では、粒子は、少なくとも２つの蛍光マーカーで染色してもよく、ここで各マーカーは、高周波変調された光学的放射線による照射に応答して蛍光放射線を放射するように構成される。蛍光放射線を検出し、デジタル化して、マーカーの１つに各々が相当する蛍光波形を生成してもよい。分析器を、蛍光波形に対して作用して、マーカーから発する蛍光放射線の共局在化の尺度を得てもよい。具体的には、分析器は、波形の少なくとも１つにハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成して、その後、波形の点ごとの乗算を行って、結果の乗算波形を生成して、この乗算波形を積分して積分値を得て、その積分値を所定の閾値と比較して、共局在化の尺度を得てもよい。別の例として、いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーシステムにおける粒子流の方向に垂直または平行な方向に沿った粒子のサイズの推定値を得てもよい。例えば、いくつかのそのような実施形態では、粒子流の方向に垂直な方向の粒子サイズの推定値は、高周波変調された光学ビームによる照射に応答して粒子によって放射される蛍光放射線に相当する蛍光波形を２乗すること、バンドパスフィルタを２乗された波形に加えること、フィルタリングされた波形を積分すること、及び積分値を所定の閾値と比較することによって得てもよい。さらに、いくつかの実施形態では、分析器は、散乱データを使用して、粒子の流れの方向に平行した方向での粒子のサイズの推定値を得てもよい。
【0126】
以下で説明するように、フローサイトメトリーシステムを通って流れる粒子の１つ以上の推定された特性を用いて、その粒子に関する選別決定、すなわち、その粒子を選別するか否かに到達し得る。波形データを操作して粒子の少なくとも１つの特性の推定値を得るために使用され得る処理方法のいくつかの例は、フローサイトメーターを通って流れる細胞の特性の推定値を使用して、それらの細胞に関する選別決定に到達するという状況で以下に述べられる。このような処理方法は、細胞以外の粒子の特性の推定値を得るために使用してもよく、さらに、推定された特性は、選別目的のために使用され得ないことが理解されるべきである。
【0127】
関連態様では、粒子の１つ以上の特性に基づいてフローサイトメーターを流れる細胞などの粒子の集団の自動ゲーティング（例えば、コンピュータ支援ゲーティング）のための方法が開示される。一例として、そのような方法は、所定の範囲内にある粒子のサイズに基づいて、フローサイトメーターを流れる複数の粒子のサブセットをゲーティングし得る。例えば、図１６ＡＡのフローチャートを参照すれば、このような方法は、複数の粒子を含む試料をフローサイトメーターに導入すること（ステップ１）と、１つ以上のフローサイトメーター測定値から複数の粒子の少なくとも１つの粒子特性の推定値を得ること（ステップ２）とを含み得る。少なくとも１つの粒子特性を得るステップは、高周波によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を有する放射線を用いてフローサイトメーターを通って流れる際に粒子を照射して、その粒子から放射性応答を誘発することと、この粒子からの放射性応答を検出して、この応答に関連する時間波形データを生成することと、上記時間波形データを処理して、上記時間波形データを変調する１つ以上のうなり周波数を分析することによって上記少なくとも１つの粒子特性の値を得ることとを含み得る。この方法は、コンピュータプロセッサを介して、所定の範囲内にある粒子特性の値を有する１つ以上の粒子を示すゲートを特定することをさらに含み得る。一例として、所定の範囲内の寸法サイズ（例えば、横サイズ）を有する粒子をゲーティングしてもよい。
【0128】
図１６Ｂに示すシステムのようなシステムを用いて、上記のゲーティング方法を実施してもよい。例えば、分析器３００６は、複数の粒子の少なくとも１つの特性の推定値を、例えば、高周波変調光学ビームによる照射に応答してそれらの粒子によって放射される蛍光放射線における１つ以上のうなり周波数の分析に基づいて決定するように、及び粒子の特性の推定が、その粒子に関するゲーティング決定に到達するために、所定の範囲内にあるか否かを決定するように（例えば、決定された特性が予め定義された範囲内にある場合には、粒子は、ゲーティングされる）プログラムされ得る。いくつかの実施形態では、本教示に基づいて修正された「Ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｍｏｄｅｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇａｔｉｎｇ（混合モデル密度ゲーティングにおける近傍閾値）」と題する米国特許第８，９９０，０４７号の教示を使用して、フローサイトメーターを通って流れる粒子をゲーティングしてもよい。米国特許第８，９９０，０４７号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0129】
いくつかの態様では、高周波変調された光学的放射線、例えば、１つ以上の高周波によって互いに分離された２つ以上の光周波数を含む光学的放射線ビームを介して、これらの細胞の問い合わせに基づいて細胞を選別する方法及びシステムが開示される。いくつかの実施形態では、光学ビームは、複数の角度的にまたは空間的に分離されたビームレット（その各々は、互いに対する高周波シフトを有する）を含んでもよい。場合によっては、このようなビームの使用は、異なる高周波シフトされた光周波数で粒子（例えば、細胞）内の異なる位置を照射することを可能にする。以下でより詳細に説明するように、このような方法は、検出されたシグナル（複数可）に基づいて蛍光画像を計算する必要なしに、光学ビームによる照射に応答して細胞によって生成された時変シグナルを用いることによって選別決定を提供し得る。本教示による方法の様々な実施形態は、（例えば、フローサイトメトリーシステムにおける）細胞の選別の文脈において以下に述べられるが、本明細書に記載の方法はまた、他種の粒子、例えば、小生物（例えば、線虫、ｃ．ｅｌｅｇａｎ）、ビーズ、微粒子、ナノ粒子、ウイルス粒子、細菌、エキソソーム、または医薬品を選別するためにも用いられてもよい。いくつかの実施形態では、本教示を使用して選別され得る粒子は、約５０ナノメートル～約１ミリメートルの範囲、例えば、約１００ナノメートル～約１マイクロメートルの範囲のサイズ（例えば、最大サイズ）を有し得る。
【0130】
さらに、多くの実施形態では、本明細書で論じる選別方法を使用して、例えば、細胞または他の粒子を、高い粒子処理量で作動する選別装置を用いて選別し得るように、低い潜時で選別決定を提供し得る（例えば、１秒あたり１０００回を超える選別操作を実行してもよい）。一例として、本明細書に記載の方法を使用して、約１００マイクロ秒以下、例えば、約１０マイクロ秒～約１００マイクロ秒の範囲、または約２０マイクロ秒～約８０マイクロ秒の範囲、または約３０マイクロ秒～約７０マイクロ秒の範囲、または５０マイクロ秒の潜時で選別決定を行ってもよい。本明細書では、「潜時」という用語は、粒子（例えば、細胞）を問い合わせ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）放射線で照射して、その粒子の特性及び／またはその粒子に関する選別決定に達するまでの時間経過を示すために使用される。
【0131】
一例として、図１６Ｃのフローチャートは、粒子から発せられる二つ以上のフルオロフォア（例えば、外因性及び／または内因性フルオロフォア）に対応する蛍光シグナルの共局在化の程度に基づいて、粒子（例えば、細胞）を選別するための実施形態による方法を示す。一般性を失うことなく、粒子とは以下の説明では細胞とみなされる。ステップ（１）では、１つ以上の高周波によって互いに分離される２つ以上の光周波数を含む光学的放射線ビームによる照射を介して、細胞が光学的に問い合わされる。ある場合には、光学ビームは、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する複数の角度的または空間的に分離されたビームレットを含んでもよい。そのようなビームの使用によって、１つ以上の高周波によって互いからシフトされる、異なる光周波数で細胞内の異なる位置を照射することが可能になる。光周波数は、細胞と会合すると予想される２つ以上のフルオロフォアを励起するように選択され得る。例えば、フルオロフォアは、例えば、染色剤によって細胞がタグ付けされている蛍光色素分子であってもよい。一例として、いくつかの実施形態では、放射ビームの光周波数は、約３００ＴＨｚ～約１０００ＴＨｚの範囲内であり、光周波数間の高周波分離は、例えば、約５０ＭＨｚ約２５０ＭＨｚまでであってもよい。
【0132】
次いで、励起された細胞から発する蛍光放射線を２つ（またはそれ以上）の別々の蛍光チャネルに集めてもよく、その各々はフルオロフォアの１つによって放射される蛍光放射線に相当する（ステップ２）。これは、例えば、図９Ａに関連して上述された検出器構成を用いることによって達成され得る。各チャネルの収集された蛍光放射線は、デジタル化され（ステップ３）、シグナル値（蛍光強度）の時系列として表されてもよい。この実施形態及び他の実施形態では、蛍光放射線に存在するうなり周波数をエンコードし得るシグナル値のそのような時系列は、時間－周波数波形と呼ばれる。２つ以上の蛍光チャネルに相当するデジタル化された時間－周波数波形は、時間的に同期され（ステップ４）、正規化される（ステップ５）。この正規化は、例えば、各波形をその最大値で除算し、その波形に倍率を掛けることによって達成され得る。
【0133】
ハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタを、少なくとも１つの波形に適用して、少なくとも１つのフィルタリングされた波形を生成してもよい（ステップ６）。いくつかの実施形態では、約１ＭＨｚ未満の周波数の通過を可能にし、かつより高い周波数を実質的に遮断するローパスフィルタが適用される。適切なローパスフィルタのいくつかの例としては、限定するものではないが、時間領域有限インパルス応答（ＦＩＲ）フィルタまたはフーリエ領域フィルタが挙げられる。
【0134】
次いで、波形を点ごとに乗算して乗算波形を得てもよく、この乗算波形を積分して積分値を得てもよい（ステップ７）。例として、図１７は、１つの蛍光チャネルで検出されたフィルタリングされた正規化された時系列デジタル化蛍光シグナルを表すアレイ１７００と、このアレイ１７００と時間的に同期している別の蛍光チャネルで検出されたフィルタリングされた正規化時系列デジタル化蛍光シグナル（簡略化のために、この例示的な実施例では、蛍光チャネルの数は２つに選択され、アレイ要素の数は１０に選択され、蛍光チャネルの数は２より大きくてもよく、アレイ要素の数は１０を超えることが理解されるべきである）に相当するアレイ１７０１とを示す。このデータは、本明細書では、時間－周波数波形と呼ばれる。得られたアレイ１７０２は、アレイ１７００及び１７０１内のデータを点ごとに乗算することによって得られる。
【0135】
各チャネルからの時間蛍光シグナルは、光学的放射線ビームの高周波分離光周波数の干渉に相当するうなり周波数を含む。このように、それぞれのデジタル化されたデータの乗算は、それらの周波数の和及び差を示すであろう。２つ以上の蛍光チャネルのシグナルが、励起された細胞内の実質的に類似の空間的位置に由来する場合、それらのシグナルを乗算することによって得られる結果としての時間領域データは、励起された細胞から発する異なる蛍光チャネルにおけるシグナルの共局在化の程度に基づいてＤＣまたはＤＣに近い周波数成分を含むであろう。
【0136】
ステップ（８）では、積分結果を、所定の閾値と比較して、問い合わされた細胞が、選別のための基準を満たす細胞として認定される蛍光シグナルの十分な共局在を示すか否かを決定する。例えば、積分された結果が所定の閾値に等しいかまたはそれを超える場合、その細胞は選別のために選択される。そうでなければ、その細胞は選別に関して選択されない。
【0137】
上記の共局在化方法のさらなる説明として、図１８Ａは、Ａ及びＢ細胞が抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたヒト白血球であり、細胞Ｃ及びＤがＣａｌｃｅｉｎ ＡＭで染色されたＨｅＬａ細胞である、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと表示された４つの細胞の蛍光画像を示す。これらの画像セットは、上記の染色剤で染色された細胞からの蛍光を検出することによって得られた２色の蛍光画像、ならびに明視野及び暗視野画像を含む。図１８Ｂは、測定された緑色（ＦＩＴＣ）蛍光時間領域シグナルを示し、図１８Ｃは、２０ＭＨｚ～６０ＭＨｚの範囲の周波数で光学的放射線のビートによるこれらの細胞の照射に応答して、細胞Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから得られた測定された赤（ヨウ化プロピジウム）蛍光時間領域シグナルを示す。図１８Ｄは、各細胞について、正規化された赤色及び緑色蛍光波形を乗算し、得られた波形をローパスフィルタ（フーリエドメインローパスフィルタ）に通してフィルタリングされたシグナルを生成することにより、共局在化時間領域波形を得る。
【0138】
図１９は、細胞Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのそれぞれについての積分されたフィルタリングされたシグナルの値を示す。この図の破線は、選別閾値を表す。細胞Ａ及びＢの積分シグナルは、選別閾値より下であるが、細胞Ｃ及びＤの積分シグナルは、選別閾値を上回っている。このようにして、細胞Ｃ及びＤについては正の選別判定が採用され（すなわち、細胞Ｃ及びＤが選別用に選択される）、細胞Ａ及びＢには負の選別判定が採用される。
【0139】
蛍光共局在化に基づく上記の選別方法は、例えば転座分析のための様々な用途に使用され得る。
【0140】
別の態様では、細胞サイズの推定値に基づいてフローサイトメトリーシステムで細胞を選別する方法が提供され、ここで、細胞サイズの推定値は、細胞によって発せられた蛍光放射線の分析によって得られる。例えば、この方法は、細胞から発する蛍光パルスの持続時間を利用して、流れの方向に沿った細胞の寸法を推定し、かつ蛍光シグナルの２乗を、ローパスフィルタを通過させて細胞の横方向寸法（例えば、細胞の流れの方向に直交する細胞の寸法）の推定値に基づいて選別決定を実行することによって得られるローパスフィルタリングされたシグナルに含まれるパワーを分析する。
【0141】
より具体的には、図１９を参照すれば、一実施形態では、１つ以上の高周波によって互いに分離される２つ以上の光周波数を含む光学的放射線ビームによる照射によって、細胞が光学的に問い合わされる（ステップ１）。前の実施形態と同様に、光学ビームは、例えば、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する、複数の角度的にまたは空間的に分離されたビームレットを含んでもよい。光周波数は、細胞に関連する１つ以上の外因性及び／または内因性フルオロフォアを励起するように選択してもよい。細胞は光学的放射線ビームを通過し、ビームによる励起に応答して蛍光を放射する。一般性を失うことなく、この実施形態では、細胞は照射ビームを通って垂直方向に流れると仮定され、放射された蛍光は、細胞の流れ方向に実質的に直交する横方向（水平方向）で検出される。
【0142】
次いで、細胞から発せられた蛍光シグナルが検出され、デジタル化されて時間－周波数波形が生成される（ステップ２）。次に、検出された蛍光放射線を分析して、以下に説明されるように、細胞サイズを推定してもよい。いくつかの実施形態では、細胞から放射される光散乱パルスの持続時間を使用して、流れの方向に沿って細胞サイズを推定してもよい。
【0143】
細胞から発する蛍光パルスの持続時間は、問い合わす光学的放射線ビーム内の細胞の滞留時間に関係し、これが次に、流れ方向に平行な方向のビームの寸法に関連し、流れの方向の細胞サイズ及び細胞の流速に関する。細胞を照射するビームが直径（Ｈ）を有し、細胞の流速がＶであり、細胞が流れの方向にサイズＤ（例えば、直径）を有するならば、サイズＤは、以下の関係式で近似され得る。
Ｄ＝Ｖ×Ｔ－２×Ｈ 式（２）
ここで、Ｔは、検出された光パルス幅である。したがって、ステップ（３）では、フローの方向の細胞サイズは、例えば上記の関係を使用して、細胞から発せられる蛍光または光散乱パルスの持続時間に基づいて推定される。
Ｄ＝Ｖ×Ｔ－２×Ｈ 式（２）
ここで、Ｔは、検出された光パルス幅である。したがって、ステップ（３）では、フローの方向の細胞サイズは、例えば上記の関係を使用して、細胞から発せられる蛍光または光散乱パルスの持続時間に基づいて推定される。
【0144】
引き続き図２０のフローチャートを参照すれば、細胞の横方向のサイズを推定するために、デジタル化された蛍光データを２乗し（ステップ４）、バンドパスフィルタを２乗蛍光データに適用する（ステップ５）。次いで、フィルタリングされたデータを積分した、積分されたパルス電力の尺度を得る（ステップ６）。積分されたパルス電力は、細胞の横方向のサイズの尺度を提供し得る。より具体的には、バンドパスフィルタの帯域内に入る差周波数（２乗演算の結果として生じる）に存在する電力に基づいて、積分パルス電力は、細胞の横方向サイズの尺度を提供し得る。
【0145】
ステップ（７）では、フロー方向の細胞サイズの推定値及び／またはフィルタリングされたデータに関連する積分されたパルス電力を用いて、細胞に関する選別決定を行ってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、流れの方向の推定された細胞サイズを第１の閾値と比較してもよく、積分されたパルス電力を第２の閾値と比較して選別判定を行ってもよい。一例として、場合によっては、フロー方向の推定細胞サイズと積算されたパルス電力の両方がそれぞれの閾値を超える場合、正の選別判定が行われる（すなわち、細胞が選択される）。あるいは、選別の決定は、流れ方向の細胞サイズまたは積分されたパルス電力の推定値にのみ依存し得る。以下でさらに説明するように、場合によっては、推定された垂直及び水平の細胞サイズの比を用いて、選別決定を行ってもよい。
【0146】
細胞の横方向サイズの推定値に基づいて選別決定を行うことのさらなる例示として、図２１Ａは、１ＭＨｚだけ互いに分離された１５ＭＨｚ～２５ＭＨｚに及ぶ高周波変調を有する複数の高周波変調ビームレットを含む仮説ビームによって照射される仮説細胞を概略的に示す。破線は、照射の方向に直交する平面内の照射された細胞の断面図を概略的に示す。細胞から収集され、デジタル化された蛍光放射線は、図２１Ｂに概略的に示されるように、デジタル化された蛍光値の時系列アレイ２１００の形態であってもよい（このアレイは、ここでは説明目的のためにのみ示しており、実際の蛍光波形に存在し得るアレイ要素の数を制限するものではない）。波形２１００を２乗して、波形２１０１を得る。次いで、バンドパスフィルタを、２乗された蛍光波形２１０１に適用し、ここでは、フィルタは、２つの周波数ｆ1 及びｆ2 （ここで、ｆ2 ＞ｆ1 ）の間に選択された変調周波数が通過することを可能にするが、一方では、ｆ1 よりも低く、ｆ2 よりも大きい変調周波数を実質的に遮断する。例として、バンドパスフィルタは、ＦＩＲバンドパスフィルタであってもよいが、当該技術分野で知られている他の適切なフィルタをまた使用してもよい。フィルタリングされたデータは、ｆ1 とｆ2 との間の変調周波数で、検出された蛍光パルスに存在するパワーを示す。次に、フィルタリングされたデータを積分して、ｆ1 とｆ2 との間の周波数における全パルス電力の尺度を得る。次いで、この積分された結果を、閾値と比較して選別決定を行ってもよい。例えば、細胞の横方向のサイズは、積分結果が所定の閾値よりも小さいという事実に基づいて、ある値よりも小さいと推定され得る。
【0147】
この例では、細胞サイズは、約１８ＭＨｚ～約２１ＭＨｚの範囲の高周波変調を有する光学的放射線による細胞の照射をもたらす。したがって、蛍光データの２乗における最大変調周波数と最小変調周波数との間の差は、約６ＭＨｚである。約１０ＭＨｚ～約１５ＭＨｚの範囲の蛍光データの２乗における差異の周波数をもたらす、より大きいサイズの細胞の検出が望ましい場合、１０ＭＨｚ未満及び１５ＭＨｚを超える周波数に対して識別するバンドパスフィルタは、蛍光データの２乗に適用される。この例では、このようなバンドパスフィルタを蛍光データの２乗に適用すると、所望の横方向サイズを有する細胞の存在を示すために十分に大きなシグナルが得られない。なぜなら、蛍光データの２乗における差異変調周波数は、１０ＭＨｚ未満であるからである。
【0148】
細胞サイズに基づく上記の選別方法は、様々な異なる用途、例えば循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のサイズによる単離を有し得る。
【0149】
別の態様では、細胞のアスペクト比に基づいて細胞を選別する方法が開示される。例えば、図２２ローチャートを参照すると、光学的問い合わせ領域を通過する細胞が放射線で励起され、細胞によって放射された蛍光放射線が収集され、デジタル化され（ステップ１）、デジタル化された時間－周波数波形が生成される。次いで、デジタル化された蛍光データは、垂直方向（流れの方向に沿った）細胞サイズを評価するため（ステップ２）及び水平方向（流れの方向に直交する方向に沿った）細胞サイズを評価するため（ステップ３）に、上述した方式で分析される。より具体的には、細胞の垂直サイズは、細胞によって放射された蛍光または光散乱（または光透過）パルスの時間幅を使用して推定されてもよく（ステップ２）、細胞の水平サイズは、例えば、蛍光データの２乗にバンドパスフィルタを適用することに基づいて、上述した方法（ステップ３）を用いて推定されてもよい。ステップ（４）では、細胞の垂直及び水平サイズの推定値の比が決定され、その細胞に関して選別決定を行うために所定の閾値と比較される。例えば、場合によっては、比率が閾値を超える場合、その細胞に関して正の選別決定を行ってもよい。
【0150】
細胞のアスペクト比に基づく上記の選別方法は、例えば、細胞周期分析、ＤＮＡ分析などに用いてもよい。
【0151】
別の態様では、細胞質のサイズに対する細胞の核のサイズの比を決定する方法が開示される。いくつかの実施形態では、このような比率を使用して選別決定を行ってもよい。図２３Ａのフローチャートを参照して、１つのこのような実施形態では、細胞を、２つの蛍光マーカーで標識（例えば、染色）し、その１つは細胞の膜（細胞質の境界）上に存在し、もう１つは細胞膜を透過して細胞質に入り、及び細胞の核を染色する（例えば、細胞の内部機構を介して）（ステップ１）。細胞膜に結合する蛍光マーカーのいくつかの例としては、抗ＣＤ４５－ＦＩＴＣまたは抗ＥｐＣＡＭ－ＰＥのような、膜タンパク質に結合するフルオロフォアでタグ付けされた任意の抗体が挙げられる。蛍光マーカーを細胞膜に結合させるために用いられ得る他の一般的な表面タンパク質としては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などが挙げられる。適切な核蛍光染色剤のいくつかの例としては、限定するものではないが、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＴ０１６、７－ＡＡＤ、及びＤＡＰＩが挙げられる。
【0152】
次に、細胞に放射線を照射して両方のタイプの蛍光マーカーを励起し（ステップ２）、放射された蛍光を、細胞膜から及びその核からの蛍光発光に対応する２つのチャネルで検出及びデジタル化する（ステップ３）。細胞膜に相当する蛍光データは、例えば、上述したように用いて、細胞質のサイズの推定値を得、核に相当する蛍光データを用いて核サイズの推定値を得る（ステップ４）。例えば、各チャネルにおける蛍光または光散乱パルスの幅は、１つの次元に沿って（すなわち、流れの方向に沿って）細胞のサイズを推定するために、例えば上述されるように使用してもよい。さらに、細胞質または核の横方向のサイズは、上記の方法で各チャネルの蛍光データの２乗にバンドパスフィルタを適用することによって推定され得る。このバンドパスフィルタリングされたデータを積分した結果により、ある値を提供して、所定の閾値と比較し、閾値より大きいか小さい細胞を選別する。さらに、２次元の細胞のサイズ推定値は、例えば、垂直及び水平サイズ推定値の平方和の平方根を求めて、全細胞サイズの推定値に基づいて選別決定に達することによって組み合わせてもよい。
【0153】
ステップ（５）では、細胞質及び核のサイズ推定値の比、例えば、垂直方向もしくは水平方向のサイズの比、または組み合わせたサイズの比が得られる。
【0154】
図２３Ｂのフローチャートを参照すれば、いくつかの実施形態では、例えば、上述した手法で決定し、図２３Ｂのフローチャートのステップ（１）～（５）で表され得る、細胞質のサイズに対する細胞の核のサイズの比を使用して、選別決定を行ってもよい。例えば、その比を所定の閾値と比較して選別決定を行ってもよい（ステップ６）。一例として、比率が閾値を超える場合、肯定的な選別決定が行われる（すなわち、細胞が選択される）。
【0155】
一例として、核－細胞質サイズ比に基づく上記の選別方法は、循環する腫瘍細胞の分類に使用してもよい。
【0156】
別の態様では、いくつかの実施形態では、細胞を選別するために使用され得る、細胞から放射された蛍光放射線の細胞尖度を推定する方法が開示される。言い換えれば、細胞からの放射された蛍光放射線が、中心を放射するという拡散細胞内分布から発するものとして特徴づけられ得るか、または細胞内に拡散的に分布していない放射中心から発するものとして特徴付けられ得るかに基づいて選別決定を行ってもよい。
【0157】
より具体的には、図２４Ａに示すフローチャートを参照して、一実施形態では、１つ以上の外因性蛍光マーカー及び／または内因性蛍光マーカーを有する細胞を、１つ以上の高周波によって互いに分離された２つ以上の光周波数を有する光学的放射線で照射して、マーカー（複数可）から蛍光放射線を誘発する（ステップ１）。前述の実施形態と同様に、場合によっては、光学ビームは、それぞれが別のビームに対して高周波シフトを有する、複数の角度的または空間的に分離されたビームレットを含み得る。一例として、図２５を参照すれば、図示される例示的な実施形態では、光学的放射線ビームは、１０ＭＨｚ（ｆ1 ）から１５ＭＨｚ（ｆ5 ）に及び得る０．５ＭＨｚで分解された変調周波数ｆ1 、ｆ2 、ｆ3 、ｆ4 、ｆ5 を含んでもよい。以下でより詳細に説明するように、放射された蛍光放射線の尖度は、放射された蛍光放射線が光学ビームを変調するために使用される変調周波数以外（例えば、この実施形態では、ｆ1 、ｆ2 、ｆ3 、ｆ4 、ｆ5 以外）の変調周波数を示す程度によって推定され得る。光学ビームを変調するために使用される周波数間の周波数であり得る他の周波数は、本明細書では、「オフピクセル周波数」と呼ばれる。言い換えれば、オフピクセル周波数への蛍光パワーの「漏れ」は、放射された蛍光の尖度の指標であり、漏出が多いほど放射された蛍光の尖度が大きくなる。
【0158】
再び図２４Ａのフローチャートを参照すれば、蛍光放射線を収集し、デジタル化して時間－周波数波形を生成してもよい（ステップ２）。ステップ（３）では、波形全体のフーリエ変換、例えば高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が得られる。続いて、生成されたＦＦＴを、例えば、時間領域の波形をその最大値で除算し、次いで、波形を所望の定数で再スケーリングすることによって、細胞間比較用の固定値に正規化する（ステップ４）。ＦＦＴの「オフピクセル」ビン（すなわち、照射の光学的放射線に存在する変調周波数間の周波数に相当するビン）の合計が決定される（ステップ５）。その合計は、オフピクセル周波数への蛍光出力の「漏れ」の程度を示し、したがって放射された蛍光放射線の尖度の尺度を示す。
【0159】
図２４Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、上述した方式で決定され、かつ図２４Ｂのフローチャートのステップ（１）～（５）に示された、放射された蛍光放射線の尖度の尺度を、細胞を選別するために用いてもよい。特に、ステップ（６）において、ＦＦＴの「オフピクセル」ビンの合計は、オフピクセル周波数に対する蛍光出力の「漏れ」の程度を示し、予め定められた閾値と比較して、選別の決定をしてもよい。例えば、蛍光尖度が比較的高い細胞を分類することが望まれるとき、その合計が閾値よりも大きい場合は、細胞を選別する（選択する）。あるいは、拡散蛍光を示す細胞を選別することが望ましいとき、合計が閾値よりも小さい場合は、細胞を選別する。
【0160】
放射された蛍光放射線の分析に基づく細胞のそのような選別は、スポット計数、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、細胞内輸送及び局在化、ならびに液滴に基づく単細胞分析などの様々な用途で使用され得る。
【0161】
粒子（例えば、フローサイトメトリーシステムを流れる細胞）についての選別決定を行うための上記の方法は、様々な方法で実施され得る。一例として、図２６は、選別決定を行うために本教示を用い得る、細胞を選別するための例示的なシステム２６００を概略的に示している。システム２６００は、複数の細胞が懸濁された懸濁液を貯留する容器２６０１を備えてもよい。細胞懸濁容器２６０１は、入口２６０２を介して、例えばステンレス鋼などの剛性の金属で形成され得る、試料導管２６０３に流体的に連結される。試料導管２６０３は、その遠位端にノズル２６０５を含む、小さな直径を有する下部円柱部２６０４ｃに、テーパ部２６０４ｂを介して、延在する上部円柱部２６０４ａを備える容器２６０４内に配置される。容器２６０４は、シース流体源２６０６に流体的に連結される。音響振動子２６０８（例えば、圧電駆動器）がノズルに連結され、発生器２６１０によって励起されたときにノズルを振動させるように構成される。例えば、振動周波数は約６０ｋＨｚであってもよいが、他の振動周波数も使用してもよい。
【0162】
使用時には、容器２６０１に貯蔵された懸濁流体は、入口２６０２から導管２６０３に導入される。導管２６０３を出る細胞を含む流体の細い流れは、シース液によって引っ張られ、ノズル２６０５に運ばれる。ノズルの振動運動は、ノズルを通る流れを複数の液滴Ｄ（それぞれの液滴Ｄは、単細胞粒子を含む）に分割するための当該技術分野で公知の方法で構成されてもよい。細胞の少なくともいくつかは、励起放射線による照射に応答して蛍光放射線を放射し得る、１つ以上の内因性及び／または外因性フルオロフォアと会合している。広範囲のフルオロフォアを使用してもよい。場合によっては、フルオロフォアは、細胞上の標的（例えば、受容体）を認識する抗体に結合してもよい。ある場合には、フルオロフォアは、細胞膜または別の細胞構造、例えば細胞の核に対する親和性を有する化学物質に結合し得る。さらに、場合によっては、細胞を異なるフルオロフォアの組み合わせで標識してもよい。
【0163】
引き続き図２６を参照すると、各細胞が問い合わせ領域２６１２を通過するにつれ、細胞は、照射システム２６１６によって生成されたレーザービーム２６１４によって照射され、細胞に関連する１つ以上のフルオロフォアから蛍光放射線を誘発する。上述したように、レーザービームは、１つ以上の高周波によって互いに対してシフトされる複数の光周波数を含んでもよい。一例として、光学ビームは、互いに対して高周波シフトを有する複数の角度的または空間的に分離されたビームレットの形態であってもよい。細胞から放射された蛍光放射線は、１つ以上の光検出器を備え得る検出システム２６１８によって検出してもよい。検出された蛍光を、上述した方法で分析モジュール２６２０によって分析して、その細胞に関する選別決定を行ってもよい。
【0164】
一例として、検出システムの照射は、例えば、図１～１２と関連して、上述したものであってもよい。しかし、粒子を選別するための本教示の実施は、特定の照射及び検出システムの使用に限定されないことを理解すべきである。むしろ、それらのシステムによって選別決定を行うための上記の方法で使用するために必要なデータ（例えば、蛍光データ及び／または散乱データ）が得られる限り、様々な異なるシステムを使用してもよい。
【0165】
再び図２６を参照して、システム２６００は、さらに、充電回路２６２３によって電圧を加えられ、今度は分析モジュール２６２０の制御下である、充電カラー２６２２を備える。充電カラーは、正または負の電荷を、細胞の液滴に対して、その液滴が充電カラーを通過するにつれて付与し得る。あるいは、充電カラーは、細胞液滴に電荷を与えることなく細胞液滴を通過させ得る。
【0166】
より具体的には、分析モジュール２６２０は、上記の教示を使用して、細胞に関する選別決定を行ってもよい。その決定に基づいて、分析モジュールは、細胞液滴を帯電させる必要があるか否かを決定し得、もし必要であれば、どの電荷極性を細胞に付与すべきかを決定し得る。次いで、分析モジュールは、カラー２６２２を介して、必要な電荷を細胞液滴に付与するように、充電回路２６２３を制御し得る。次いで、細胞は、カラー２６２２の下流に配置される一対の偏向板２６２４の間のギャップを通過する。電源２６２５は、電圧を板２６２４の少なくとも１つに印加して、プレート間に電場を確立する。この電場は、細胞コレクタ２６２６のチューブ２６２６ｂ及び２６２６ｃによってそれぞれ収集し得るように、異なる方向に沿って、負及び正の細胞液滴の経路を偏向してもよい。カラー２６２２によって電気的に帯電されていない細胞は、偏向されず、細胞コレクタのチューブ２６２６ａによって捕捉される。
【0167】
分析／制御モジュール２６２０のような本明細書で説明される分析／制御モジュールは、当該技術分野で公知の技術を用いて、そして本発明の教示に従って、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアにおいて様々な異なる方法で実施してもよい。一例として、図２７は、検出システム２６１８から蛍光シグナル（複数可）を受け取り、そのシグナル（複数可）をデジタル化して、デジタル化された蛍光データを生成するためのアナログ／デジタル変換器２７０２を備える、分析／制御モジュール２６２０の例示的な実行２７００を概略的に示す。分析／制御モジュール２７００は、さらに、本教示に従って蛍光データを処理して、問い合わせ中の細胞に関する選別決定に達するための本教示による蛍光データを処理するためのプロセッサ２７０４を備えてもよい。分析／制御モジュール２７００はまた、ＲＯＭ（読み取り専用メモリ）２７０６、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）２７０８及び永久メモリ２７１０を備えてもよい。通信バス２７１２は、分析モジュールの様々な構成要素間の通信を容易にする。メモリモジュールは、蛍光シグナル（複数可）及び分析結果を分析するための命令を記憶するために使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、蛍光データを分析して本教示に従って選別決定に達するための命令をＲＯＭ２７０６に記憶してもよい。プロセッサ２７０４は、これらの命令を使用して、ＲＡＭ２７０８に記憶されたデジタル化された蛍光データを操作して、選別決定の判定を行ってもよい。いくつかの実施形態では、プロセッサは、本教示に従って命令を実行して、蛍光データ上で作動して選別決定に達するように構成されたＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）として実施してもよい。この実施形態では、分析／制御モジュール２７００は、問い合わせ中の細胞に適切な電荷を付与するように、選別決定に基づいて充電回路に適切なシグナルを送るための通信／制御モジュール２７１４をさらに備えてもよい。
【0168】
上述したように、本教示による方法は、細胞のピクセルごとの蛍光画像を形成する必要なく、粒子（例えば、細胞）の選別決定に達するように時間蛍光データに作用する。これにより、例えば、約１００マイクロ秒未満のような低い潜時を有する細胞を選別することが可能となり、今度は、細胞を高い割合で選別することが可能になる。例えば、本教示による選別方法によって、細胞を、１秒あたり１０００細胞を超える速度、例えば１秒あたり約１０００～約１００，０００細胞の範囲で選別することが可能になる。
【0169】
上述したように、特定の照射または検出技術に限定されるものではないが、いくつかの実施形態では、本教示による細胞選別方法は、周波数領域多重化を使用して、例えば、２つの周波数オフセットされたベースのビームを叩くことによって生成された固有の高周波で各々「タグ付けされた」ピクセルの行を励起する流動フローサイトメトリーシステムで効率的に用いられ得る。周波数領域多重化を使用して、画像の単一行の数百のピクセルからの蛍光（または散乱）放射線を、例えば、各蛍光色または散乱方向の単一光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて検出して読み出してもよい。画像の行内の各ピクセルの励起は、固有のうなり周波数で変調されるので、ピクセルレートは、システムの全ＲＦ帯域幅に比例し、１００ＭＨｚを超えるピクセルレートでショットノイズ制限された感度を提供し得る。上述したように、本教示による選別方法は、時間周波数フォーマットでエンコードされた画像データを使用して、画像を実際に計算することなく選別決定を行い得る。
【0170】
さらに、上記システムは、応答照射において粒子から発する散乱放射線に基づいて粒子（例えば、細胞）を選別するために使用してもよい。散乱された放射線は、例えば上述した方法で検出され、分析されて、選別決定に達し得る。
【0171】
さらなる例として、米国特許、「Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ」と題する米国特許第３，３８０，５８４号、「Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」と題する米国特許第９，０３４，２５９号及び「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」と題する米国特許第７，４１７，７３４号（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、本明細書に開示される選別方法及びシステムを実施するために、本教示に従って改変し得る選別システムに関する情報を提供する。
【0172】
さらなる解明として、付属書Ａは、本教示の様々な態様に関する追加情報を提供する。
【0173】
当業者であれば、本教示の範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってもよいことを理解するであろう。特に、上述された実施形態の様々な特徴、構造、または特性は、適切な方法で組み合わせてもよい。例えば、一実施形態に関連して説明した検出システムを別の実施形態で使用してもよい。
【0174】
付属書Ａ
上述したように、いくつかの実施形態では、高周波振幅変調を伴う２つ以上のビームレットは、空間的に異なる位置で試料を照射する。試料と各ビームレットとの間の相互作用は、各々がビームレットの対応する高周波で振幅変調される散乱、透過、及び蛍光発光シグナルのうち少なくとも１つを生成し得る。収集されたシグナルは、各変調されたビームレットからの寄与の合計として表してもよい。
Ｓ（ｔ）＝ΣｉＰｉ（ｔ）・（１＋Ａｍｃｏｓ（ωｉｔ＋φｉ）） 式（３）
式中、Ｓ（ｔ）は、収集されたシグナルを表し、Ｐｉ（ｔ）は、ｉ番目のビームレットに関連する時間依存の散乱、透過、または蛍光発光シグナルを表し、Ａｍはビームレットの変調深度を表し、ｗｉ及びφｉは、それぞれ、ビームレットの高周波変調の角周波数及び相を表す。粒子の画像提示は、各ビームレットを画像の異なる列に割り当て、時間の各モーメントを画像の異なる行に割り当てることによって導出し得る。この画像提示は、フーリエ変換を介して収集されたシグナルに接続される。
Ｉｍ（ｘ，ｙ）＝Ｒ・Ｗ・Ｆ・Ｓ（ｔ） 式（４）
ここで、Ｆは短時間フーリエ変換を実現する行列であり、Ｗはフーリエ成分を画像ピクセルにマッピングする行列であり、かつＲは、フィルタリング、バックグラウンド減算、及びビネット補正などの任意の所望の線形画像領域後処理を実行する行列である。粒子の任意の線形特徴は、画像上の行列乗算によって表され得る。したがって、任意の所望の線形特徴を計算する行列Ｍに関して、特徴は、直接、すなわち、画像を最初に計算する必要なしに、以下を介して収集されたシグナルから、算出され得る。
Ｍ・Ｉｍ（ｘ，ｙ）＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ・Ｓ（ｔ）＝Ｑ・Ｓ（ｔ） 式（５）
Ｑ＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ 式（６）
式中、Ｑは、現在の粒子表現から所望の線形特徴への変換を表す行列である。したがって、任意の線形特徴は、行列Ｑを最初に計算することによって、例えば、前処理ステップにおいてオフラインで、次に式（５）に示すように、例えば、オンラインで、ドット積を実行することによって計算して、所望の特徴を抽出し得る。多くの実施形態では、すべての特徴について、この特徴へのバックグラウンドシグナルの寄与も差し引くことが望ましい。このプロセスは次のように要約してもよい。
計算する：Ｑ＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ
計算する：Ｑｂｋｇ＝Ｍ・Ｒ・Ｗｂｋｇ・Ｆ
データを収集しながら、
ある粒子が検出される場合、
計算する：Ｄ＝Ｑ・Ｓ（ｔ）
その他：
計算する：Ｄｂｋｇ（ｉ）＝Ｑｂｋｇ・Ｓ（ｔ）
計算する：Ｄｂｋｇ＝平均（Ｄｂｋｇ（ｉ））
収率：Ｄ－Ｄｂｋｇ
上述したように、いくつかの実施形態では、高周波振幅変調を伴う２つ以上のビームレットは、空間的に異なる位置で試料を照射する。試料と各ビームレットとの間の相互作用は、各々がビームレットの対応する高周波で振幅変調される散乱、透過、及び蛍光発光シグナルのうち少なくとも１つを生成し得る。収集されたシグナルは、各変調されたビームレットからの寄与の合計として表してもよい。
Ｓ（ｔ）＝ΣｉＰｉ（ｔ）・（１＋Ａｍｃｏｓ（ωｉｔ＋φｉ）） 式（３）
式中、Ｓ（ｔ）は、収集されたシグナルを表し、Ｐｉ（ｔ）は、ｉ番目のビームレットに関連する時間依存の散乱、透過、または蛍光発光シグナルを表し、Ａｍはビームレットの変調深度を表し、ｗｉ及びφｉは、それぞれ、ビームレットの高周波変調の角周波数及び相を表す。粒子の画像提示は、各ビームレットを画像の異なる列に割り当て、時間の各モーメントを画像の異なる行に割り当てることによって導出し得る。この画像提示は、フーリエ変換を介して収集されたシグナルに接続される。
Ｉｍ（ｘ，ｙ）＝Ｒ・Ｗ・Ｆ・Ｓ（ｔ） 式（４）
ここで、Ｆは短時間フーリエ変換を実現する行列であり、Ｗはフーリエ成分を画像ピクセルにマッピングする行列であり、かつＲは、フィルタリング、バックグラウンド減算、及びビネット補正などの任意の所望の線形画像領域後処理を実行する行列である。粒子の任意の線形特徴は、画像上の行列乗算によって表され得る。したがって、任意の所望の線形特徴を計算する行列Ｍに関して、特徴は、直接、すなわち、画像を最初に計算する必要なしに、以下を介して収集されたシグナルから、算出され得る。
Ｍ・Ｉｍ（ｘ，ｙ）＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ・Ｓ（ｔ）＝Ｑ・Ｓ（ｔ） 式（５）
Ｑ＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ 式（６）
式中、Ｑは、現在の粒子表現から所望の線形特徴への変換を表す行列である。したがって、任意の線形特徴は、行列Ｑを最初に計算することによって、例えば、前処理ステップにおいてオフラインで、次に式（５）に示すように、例えば、オンラインで、ドット積を実行することによって計算して、所望の特徴を抽出し得る。多くの実施形態では、すべての特徴について、この特徴へのバックグラウンドシグナルの寄与も差し引くことが望ましい。このプロセスは次のように要約してもよい。
計算する：Ｑ＝Ｍ・Ｒ・Ｗ・Ｆ
計算する：Ｑｂｋｇ＝Ｍ・Ｒ・Ｗｂｋｇ・Ｆ
データを収集しながら、
ある粒子が検出される場合、
計算する：Ｄ＝Ｑ・Ｓ（ｔ）
その他：
計算する：Ｄｂｋｇ（ｉ）＝Ｑｂｋｇ・Ｓ（ｔ）
計算する：Ｄｂｋｇ＝平均（Ｄｂｋｇ（ｉ））
収率：Ｄ－Ｄｂｋｇ
【0175】
上述したように、いくつかの実施形態では、粒子の１つ以上の計算された特徴を用いて、その粒子に関する選別決定を行ってもよい。別のさらなる例として、図２８は、このような選別方法の各種ステップを示すフローチャートを示す。最初のステップ（１）では、上記のＱ及びＱｂｋｇ行列は、所望の粒子の特徴（特性）に基づいて計算してもよい。続いて、例えば、高周波変調された光学的放射線で照射されたフローサイトメーターのフローセルからの散乱、透過または放射された光シグナルを収集し、デジタル化してもよい（ステップ２）。シグナルは、閾値交差と比較して、そのシグナルが粒子由来であるか否か、すなわち粒子が存在するか否かを決定してもよい（ステップ３）。粒子が存在すると判定された場合、各デジタル化された試料シグナルにＱを乗算し（ステップ４）、その結果を単一の値に積分する（ステップ５）。粒子の所望の特徴（特性）の推定値を得るために、積分値からバックグラウンドシグナルを差し引く（ステップ６）。選別決定は、特徴の推定値を閾値と比較することによって行ってもよい（ステップ７）。引き続き図２８のフローチャートを参照して、粒子が存在しない場合に得られた１つ以上のデジタル化されたシグナルにＱ＿ｂｋｇを乗算してもよく（ステップ８）、いくつかのバックグラウンド測定値を平均してステップ（６）で使用されるバックグラウンド推定値を得てもよい。
【0176】
いくつかの実施形態では、受信されたシグナルの様々なモーメントを使用して、散乱、透過、または放射された放射線の空間分布に関する情報を得てもよい。画像モーメントは、いくつかの任意のパワーに対してとった、任意の原点からの距離に応じたピクセルの加重和を表すクラス線形画像特徴である。
【0177】
【数1】
【0178】
各画像モーメントは、散乱光、透過光または放射光の空間分布に関する異なる情報をエンコードする。高次モーメントは、原点からの距離に応じてピクセルを重み付けし、各モーメントはシグナルの分布について異なる情報を提供する。様々な実施形態において、これらの特徴の全ては、適切なＱを事前計算することによって測定シグナルＳ（ｔ）から直接的に計算してもよい。
【0179】
空間フーリエ成分は、以下のように定義されるＭと同じ方法で計算され得る。
Ｍ（ｕ，ｖ）＝ｅｘｐ（－ｊ２π（ｕｘ＋ｖｙ）） 式（８）
Ｍ（ｕ，ｖ）＝ｅｘｐ（－ｊ２π（ｕｘ＋ｖｙ）） 式（８）
【0180】
所望の成分を実験の前に選択してもよく、別々のＱをそれぞれについて事前に計算してもよい。例えば、粒子が照射放射線の焦点にあるか否かを判定するために、フーリエ成分を使用してもよい。
【0181】
いくつかの画像特徴は、特徴抽出の前にデータ上の非線形変換を含む。そのような特徴のサブセットに関しては、それらを線形特徴の非線形の組み合わせとして表すことが可能である。そのような特徴を計算するには、前のセクションのように複数の特徴を最初に並列で計算し、その結果を非線形の方法で組み合わせることを含み得る。画像モーメントの非線形の組み合わせによって表現し得る多くの有用な画像特徴が存在する。例えば、ピクセルの質量中心は、１次モーメントと０次モーメントの比によって計算され得る。
【0182】
【数2】
【0183】
いくつかの他の粒子特性をこのように表してもよい。非網羅的なリストは、以下の表１にある。
【0184】
【表1】
【0185】
いくつかの実施形態では、中央の２次モーメントを用いてダブレットを識別してもよい。散乱光シグナルまたは透過光シグナルにおける二次モーメントが高い粒子は、より大きなシグナル分布を示す。一例として、図２９は、複数の血球の水平及び垂直の中心モーメントに対応する散布図を示す。
【0186】
共局在化及び類似性
いくつかの実施形態では、粒子と基準との間の類似性は、共局在化と同じ方法で計算され得る。共局在化の場合、２つの波形は、同じ粒子を検査する異なる検出器に相当する。類似の場合、２つの波形は、２つの異なる粒子を検査する同じ検出器に相当する。粒子と基準との間の類似性を検出するための例示的なアルゴリズムを以下に要約する。
いくつかの実施形態では、粒子と基準との間の類似性は、共局在化と同じ方法で計算され得る。共局在化の場合、２つの波形は、同じ粒子を検査する異なる検出器に相当する。類似の場合、２つの波形は、２つの異なる粒子を検査する同じ検出器に相当する。粒子と基準との間の類似性を検出するための例示的なアルゴリズムを以下に要約する。
【0187】
Ｒが、基準粒子に相当する波形を表すなら、Ｆｉｌｔは、変調された周波数のみを通過させるハイパスフィルタまたはバンドパスフィルタであり、Ｎは、基準粒子の画像提示におけるピクセルの数である。したがって、アルゴリズムには以下が含まれる。
【0188】
【数3】
【0189】
Ｒ’＝Ｆｉｌｔ（Ｒ）を計算し、
【0190】
Ｒ２＝｜｜Ｒ’｜｜２を計算し、
【0191】
研究中の粒子に相当する各入力波形Ｓについて、
【0192】
【数4】
【0193】
Ｓ’＝Ｆｉｌｔ（Ｓ）を計算し、
Ｄ＝Ｓ’・Ｒ’を計算し、
Ｓ２＝｜｜Ｓ’｜｜２を計算する。
Ｄ＝Ｓ’・Ｒ’を計算し、
Ｓ２＝｜｜Ｓ’｜｜２を計算する。
【0194】
【数5】
【0195】
（関連出願）
本出願は、２０１６年３月１７日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別）」と題する仮出願番号６２／３０９，８０６の優先権を主張する。
本出願は、２０１６年３月１７日に出願され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ハイスループット蛍光フローサイトメーターを用いる細胞選別）」と題する仮出願番号６２／３０９，８０６の優先権を主張する。
【0196】
（政府の権利）
本発明は、国立科学財団、助成金番号ＮＳＦ １４４７３８１によって資金提供されている。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立科学財団、助成金番号ＮＳＦ １４４７３８１によって資金提供されている。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16AA】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
