特許 7502418 白血病の発生素因の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-10

(45)【発行日】2024-06-18

(54)【発明の名称】白血病の発生素因の検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240611BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20240611BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240611BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20240611BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240611BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6827 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6886 Z

C12N15/13 ZNA

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022515764

(86)(22)【出願日】2019-09-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-19

(86)【国際出願番号】 EP2019074120

(87)【国際公開番号】W WO2021047764

(87)【国際公開日】2021-03-18

【審査請求日】2022-08-17

(73)【特許権者】

【識別番号】520002209

【氏名又は名称】アー・ファウ・アー ライフサイエンス ゲー・エム・ベー・ハー

【氏名又は名称原語表記】ＡＶＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏｒｓｉｎｇｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ ３０， ７９１８９ Ｂａｄ Ｋｒｏｚｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ハッサン ユマー

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】STAMATOPOULOS et al.，Clinical Cancer Research，2018年，Vol. 24, No. 20，p.5048-5057，DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0133

【文献】IMGT/LIGM [online], Accession No. X71966，https://www.imgt.org/ligmdb/view?id=X71966, 2013.01.18 uploaded [retrieved on 2023.07.10]，Definition: H.sapiens germline IGLV3S2 gene for immunoglobulin lambda variable region subgroup III

【文献】HADZIDIMITRIOU et al.，Blood，2009年，Vol. 113, No. 2，p.403-411，DOI: 10.1182/blood-2008-07-166868

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の遺伝的な発症リスクを決定する方法であって、ヒトのＤＮＡサンプルにおいて、配列番号１によるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の存在の有無の判定を含み、前記ＤＮＡ配列の存在は、ＣＬＬの素因を示す、方法。

【請求項2】

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の遺伝的な発症リスクを決定する方法であって、ヒトのＤＮＡサンプルにおいて、以下のアミノ酸：Ｙ４９、Ｄ５０、Ｓ５１およびＤ５２を有する配列番号１によるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の存在の有無の判定を含み、前記ＤＮＡ配列の存在は、ＣＬＬの素因を示す、方法。

【請求項3】

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の遺伝的な発症リスクを決定する方法であって、ヒトのＤＮＡサンプルにおいて、以下のアミノ酸：Ｋ１６、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｓ５１およびＤ５２を有する配列番号１によるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の存在の有無の判定を含み、前記ＤＮＡ配列の存在は、ＣＬＬの素因を示す、方法。

【請求項4】

前記ＤＮＡ配列を、シーケンシングによって決定する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＮＡ配列を、ＰＣＲによって決定する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

前記ＤＮＡ配列を、レポータープローブによって決定する、請求項５記載の方法。

【請求項7】

対立遺伝子ＩＧＶＬ３－２１＊０１がホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判定する、請求項６記載の方法。

【請求項8】

前記ＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーションによって決定する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

悪性Ｂ細胞性新生物は、一般的に造血系またはリンパ系の悪性疾患を指す。これには、例えば白血病などの病状も含まれ、広い意味で癌に分類される。白血病は、白血球の前駆細胞のうち、白血病細胞とも呼ばれる機能しない細胞の形成が強く亢進することが特徴である。これらの細胞は骨髄に広がり、そこで通常の造血を置換し、通常、末梢血にも大量に蓄積される。肝臓、脾臓、リンパ節などの臓器に浸潤し、その機能を低下させる。造血障害により正常な血液成分が減少し、酸素運搬機能を持つ赤血球の不足、止血機能を持つ血小板の不足、成熟した機能白血球の不足により、貧血が生じ得る。

【0002】

病気の経過によって、急性白血病と慢性白血病に区別される。急性白血病は、治療せずに放置すると数週間から数ヶ月で死に至る命にかかわる病気である。一方、慢性白血病は、通常数年かけて進行し、初期にはほとんど症状がないことが多い。

【0003】

白血病の最も重要な形態は、以下のものである：
・急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
・慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
・急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）
・慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）

【0004】

ＣＬＬ疾患の家族性クラスタリングは知られているが、非常にまれなため、リスクファクターの遺伝的相関はない（Cerhan JR, Slager SL：Familial predisposition and risk factors for lymphoma; Blood 125:2265-2273, 2015; DOI:10.1182/blood-2015-04-537498）。

【0005】

このように、先行技術では、本疾患の遺伝的要素が知られているにもかかわらず、ＣＬＬの発症リスクに関する遺伝マーカーは存在しない。

【0006】

本発明の課題は、ＣＬＬの遺伝的な発症リスクを決定する方法を提供することである。

【0007】

この課題に対する解決策は、ＣＬＬにつながる体細胞突然変異は、ＩＧＶＬ３－２１遺伝子のうちある１つの対立遺伝子においてのみＢＣＲの自律的活性化をもたらし、したがってこの疾患を引き起こすが、他の２つの既知の対立遺伝子ではそうではないという知見にある。したがって、この対立遺伝子が検出されれば、ＣＬＬ発症のリスク上昇を判定することが可能となる。

【0008】

しかし、最近の研究では、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の軽鎖の特定の配列が、いわゆる自律活性型のＣＬＬに特に多いことが判明している（(IGVL3-21) Stamatopoulos, Basile, et al., “The light chain IGLV3-21 defines a new poor prognostic subgroup in Chronic Lymphocytic Leukemia：results of a multicenter study” Clinical Cancer Research (2018)：clincanres-0133）。この場合、この軽鎖に変異が存在し（Ｒ１１０）、これがＢＣＲの永久活性化につながる（Minici, Claudia, et al., “Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia”, Nature Communications 8 (2017)：15746）。この変異は、健康な被検者でも、Ｂ細胞以外の患者でも、ゲノム解析で期待される頻度で見つかっていない。実際には、その変異が見つかることはほとんどない。しかし、ＣＬＬ患者では、ＣＬＬ細胞に約１０～１５％の予期せぬ頻度で発生し、他の体細胞や非悪性Ｂ細胞には発生しない。この変異（Ｒ１１０）はＢＣＲの二量体化を可能にし、これにより受容体の自律的な活性化が生じる（すなわち、架橋によってこれらの受容体を二量体化するリガンドはもはや必要ではない）。ＩＧＶＬ３－２１には、０１、０２、０３と名付けられた３つの対立遺伝子が存在することが知られている。意外なことに、ＣＬＬ患者では対立遺伝子０１が過剰に発現している。

【0009】

対立遺伝子のＤＮＡ配列は当業者に知られており、例えば、ＩＭＧＴ（www.imgt.org）において、以下のアクセッション番号で確認することが可能である。

【0010】

ＩＧＶＬ３－２１＊０１：Ｘ７１９６６
ＩＧＶＬ３－２１＊０２：Ｄ９７００７
ＩＧＶＬ３－２１＊０３：Ｍ９４１１５

【0011】

この対立遺伝子０１は、以下のアミノ酸配列をコードしている：
配列番号０１：
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨ

【0012】

ここで、変異型ＢＣＲのみが自律的に活性化すること、また受容体の自己活性化には変異Ｒ１１０が必要であることが判明した。しかし、この変異は、対立遺伝子０１においてのみ自律的な活性化をもたらす。この変異によって、ある軽鎖上の残基Ｋ１６およびＲ１１０が、第２のＢＣＲの隣接する軽鎖上の残基Ｄ５０およびＤ５２と相互作用する。その際、Ｄ５０およびＤ５２は、Ｙ４９Ｄ５０Ｓ５１Ｄ５２として存在する必要がある。Ｒ１１０変異を遺伝子操作によって野生型変異体Ｇ１１０に変換すると、自律的な活性化は起こらなくなる（Minici et al. 2017）。したがって、対立遺伝子ＶＧＬＶ３－２１＊０１はＣＬＬ発症のリスクファクターである。（体細胞）突然変異頻度の増加は、ＢＣＲの発生および成熟の際に起こる遺伝子再配列によって説明される。したがって、リスクアレルを持つ人はＣＬＬを発症するリスクが高くなる。つまり、ＶＬ３－２１の対立遺伝子０１を持つ人は、特にＢＣＲのこの変異エピトープに対する抗体が利用できるので、定期的に予防的検査を行うことで病気のリスクを大幅に減らすことができるのである。このような予防的検査は、例えば、ＢＣＲのＲ１１０変異に結合する抗体により行うことができる。このような抗体およびその使用は、ＥＰ１８１６２６６６．４に記載されている。このような検査は、フローサイトメトリーにより少量の血液から安価に行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、血液から、または血液からの細胞分画から得られたＤＮＡやｍＲＮＡ中の変異を検出することも可能である。

【0013】

ＶＬ３－２１のゲノム上の存在の検出は、シーケンシング（例えば、全ゲノムシーケンシング、ＰＣＲなどの方法）によりＤＮＡから直接行うことができる。ＶＬ２－２１－０１がホモ接合かヘテロ接合かの解析は、この場合には必要ないが、対照として（他のＶＬ３－２１対立遺伝子を検出することにより）行うことができる。ゲノム解析サービスを提供している企業が存在する（例えば、２３ａｎｄｍｅ）。このような企業が提供するサービスも、本明細書で説明する本発明の範囲に包含されるであろう。対立遺伝子をＰＣＲで検出する場合、リスク対立遺伝子を検出するリアルタイムＰＣＲ解析用のプローブを１つ使用し、かつまたは他の対立遺伝子を検出するプローブを複数使用することが可能である。１つのプローブで対立遺伝子＊０２および＊０３を検出することができる。したがって、対立遺伝子＊０１が陽性検出で、対立遺伝子＊０２および＊０３が陰性検出であれば、ホモ接合性のリスク対立遺伝子が検出されたことになる。対立遺伝子＊０１および他の１つの対立遺伝子が陽性検出であれば、ヘテロ接合体が検出されたことになる。リアルタイムＰＣＲなどＤＮＡプローブを用いる方法に適したプローブおよびその使用は当業者に知られている（Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ、ＦＲＥＴプローブ、Ｌｉｇｈｔ－Ｃｙｃｌｅｒプローブなど、https://de.wikipedia.org/wiki/Real_Time_Quantitative_PCR）。対立遺伝子検出のための他の分子生物学的手法は、当業者にはよく知られており、例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、ＮＡＳＢＡなどがある。

【0014】

リスク対立遺伝子ＶＬ３－２１＊０１が被検者で見つかった場合、一次的予防措置を取ることが考えられる。このような措置は、病気の発生を回避するためのものである。例えば、不要な放射線（電離放射線）を浴びないことや、バランスのとれた食事などが挙げられる。

【0015】

スクリーニングおよび予防的検査からなる二次的予防措置としては、例えば、リンパ球数を調べる定期的な血液検査や、変異した細胞を見つけるための抗体ベースの分析などが考えられる。

【0016】

以下、実施例を参照しながら本発明をより詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】サブセット－２特異的抗体を用いた解析の一例を示す図。

【0018】

実施例１：
ＩＧＬＶ３－２１＊０１検出のためのリアルタイムＰＣＲ
ＩＧＬＶ３－２１の対立遺伝子を検出するには、対立遺伝子の遺伝的差異を検出するリアルタイムＰＣＲアッセイで十分である。これには、ＩＧＬＶ３－２１遺伝子の１２９－１５７領域を含むプローブが適している：
ＩＧＬＶ３－２１＊０１プローブ：ＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣ（配列番号０２）
ＩＧＬＶ３－２１＊０２／０３プローブ：ＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣ（配列番号０３）
ＩＧＬＶ３－２１ ＦＷ４７：ＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴ（配列番号０４）
ＩＧＬＶ３－２１ ＲＷ１９８：ＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＣ（配列番号０５）

【0019】

ここで、プローブは、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャーで修飾されている。ＩＧＬＶ３－２１＊０１プローブはＦＡＭ色素で、ＩＧＬＶ３－２１＊０２／０３プローブはＴＡＭＲＡ色素で標識されている。クエンチャーは、色素に合わせて選択される（ＦＡＭはＢＨＱ－１、ＴＡＭＲＡはＢＨＱ－２）。これらの修飾ＤＮＡプローブは、色素／クエンチャーとともにウルムのbiomers.netから購入できる。

【0020】

検出には、（例えば、血液、唾液、その他の組織などから）抽出したゲノムＤＮＡを、プライマーおよびプローブを用いて分析する。

【0021】

正確な手順は当業者に知られているが、完全性を期すため、一実施形態を挙げる。

【0022】

ａ）標準プロトコル：
二重蒸留水（２５μｌ添加）
２０％グリセロール：８％
１０ｘＴａｑＭａｎバッファーＡ：１ｘ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２溶液：５．０ｍＭ
ｄＡＴＰ：２００μＭ
ｄＣＴＰ：２００μＭ
ｄＧＴＰ：２００μＭ
ｄＵＴＰ：４００μＭ
プライマー１：２００ｎＭ
プライマー２：２００ｎＭ
プローブ対立遺伝子１：１００ｎＭ
プローブ対立遺伝子２／３：１００ｎＭ
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（５Ｕ／ｍｌ）：１．２５Ｕ
ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ：０．２５Ｕ
ＤＮＡ：約１０，０００の開始コピー
ＰＣＲプログラム
ＵＮＧ消化：５０℃で２分
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ活性化：９５℃で１０分
４０サイクル：９５℃で１５秒、６０℃で１分

【0023】

評価を個々のカラーチャネルのＣＴ値に基づいて行い、その際、３２未満（＜３２）のＣＴ値は、対立遺伝子に対する陽性シグナルと解釈する。使用するゲノムＤＮＡのコピー数が少ない場合、ＣＴ値の限界が低くなる可能性がある。

【0024】

実施例２：
自律活性型ＩＧＬＶ３－２１＊０１ Ｒ１１０のＦＡＣＳテスト
患者から少量の末梢血液を採取した。分析のため、１００μｌの血液を反応管に移し、２ｍｌのＰＢＳ－ＢＳＡバッファー液を満たした。その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５８０４により１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。上澄み液を廃棄し、沈殿物をよく混ぜた。その後、抗体を添加した。以下の表面パラメータ：１）ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、２）ＣＤ５－ＰＥ、３）ＣＬＬサブセット－２特異抗体（ＡＰＣ）に対して染色した後、バッチを室温、暗所で１５分間インキュベートした。その後、溶解を開始し、赤血球を溶解させた。前述のように、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡバッファー液で２回洗浄し、細胞を５００μｌの０．１％ＰＢＳ－ＢＳＡバッファー液中に取り出して再懸濁させた。細胞を、フローサイトメーターで測定するまで２～８℃の暗所で保存した。

【0025】

ＦＡＣＳでの解析は、ＢＤＣａｌｉｂｕｒで行った。個々のレーザーパラメータおよび検出パラメータの設定は、装置メーカーの指示に従って行い、当業者に十分に周知である。次いで、解析の生データを、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏで評価した。まず、リンパ球集団を選択し、ＦＳＣ／ＳＳＣブロットで標識した。この選択では、次にＣＤ１９陽性Ｂ細胞に焦点を当て、サブセット－２特異的抗体の結合について分析した。図１は、このようなサブセット－２特異的抗体を用いた解析の一例である。第一段階では、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞をさらなる解析のために選択した（左図）。これらをその後、特異的抗体の結合について分析した（右図）。

【図1】

【配列表】

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