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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-10
(45)【発行日】2024-06-18
(54)【発明の名称】検体中の注目成分の測定または同定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240611BHJP
H01J 49/04 20060101ALI20240611BHJP
H01J 49/16 20060101ALI20240611BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 G
H01J49/04 450
H01J49/16 500
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2022560497
(86)(22)【出願日】2021-04-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-17
(86)【国際出願番号】 JP2021014418
(87)【国際公開番号】W WO2021201295
(87)【国際公開日】2021-10-07
【審査請求日】2022-12-06
(31)【優先権主張番号】63/004,703
(32)【優先日】2020-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522390504
【氏名又は名称】ジェーピー サイエンティフィック リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＪＰ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＬＩＭＩＴＥＤ
(73)【特許権者】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(74)【代理人】
【識別番号】100179969
【弁理士】
【氏名又は名称】駒井 慎二
(72)【発明者】
【氏名】パウリシン、ビー、ヤヌス
(72)【発明者】
【氏名】シルクマラ、ミラン
(72)【発明者】
【氏名】シン、ヴァルーン
(72)【発明者】
【氏名】荒尾 洋平
(72)【発明者】
【氏名】藤戸 由佳
(72)【発明者】
【氏名】西村 雅之
(72)【発明者】
【氏名】小倉 泰郎
【審査官】赤木 貴則
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１８８２８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５２５６８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０２５５２６１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／０４７３９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０４１３４６０６（ＣＮ，Ａ）
【文献】DENG, Jiewei ，Biocompatible Surface-Coated Probe for in Vivo, in Situ, and Microscale Lipidomics of Small Biological Organisms and Cells Using Mass Spectrometry，analytical chemistry，2018年，Volume 90，Pages 6936-6944，DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01218
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２７／６２
Ｈ０１Ｊ ４９／０４
Ｈ０１Ｊ ４９／１６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析法により、検体中の目的成分を同定する方法であり、前記方法は、（１）検体にプローブを浸漬することにより、検体から目的成分を吸着させるための抽出相に目的成分を吸着させ、前記プローブの少なくとも一部が抽出相でコーティングされていること、（２）前記検体から前記プローブを取り外すこと、（３）前記抽出相に溶媒を付着させること、（４）前記抽出相から前記プローブに付着した溶媒に目的の成分を脱離すること、（５）電離源上で前記プローブに電圧を印加することにより前記プローブに付着した前記溶媒中に脱着した目的成分を大気圧でエレクトロスプレーし、前記プローブからエアロゾル化しイオン化した液滴を噴霧すること、および（６）前記エアロゾル化しイオン化した液滴中に存在する目的の低分子成分を同定すること、を含み、
前記溶媒を付着させるステップは、プローブを溶媒に浸漬し、プローブを溶媒から除去することによって、溶媒を抽出相に付着させることを含む。
【請求項2】
溶媒を付着させるステップが、抽出相に溶媒を噴霧することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
付着させるステップを繰り返すことにより、抽出相およびプローブの少なくとも一方に付着している溶媒中に、目的成分を溶出させる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
付着させるステップの前に、抽出相およびプローブを洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
洗浄するステップが、抽出相およびプローブの少なくとも一方を、水性溶媒、有機溶媒およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つで洗浄することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
洗浄するステップは、大きな分子量の干渉を除去するために、プローブを水で洗浄することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
洗浄するステップは、スプレーを介して抽出相およびプローブを洗浄することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
溶媒が、水性溶媒、有機溶媒およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
溶媒に基づく水溶液の存在率が３０から７０重量％である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
溶媒が有機溶媒からなることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項11】
有機溶媒がアルコールであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
アルコールがイソプロパノールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
溶媒がさらに酸性化合物を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
エレクトロスプレーイングするステップの後に、プローブを溶媒に浸すことをさらに含み、エレクトロスプレーイングするステップと浸すステップは繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
抽出相が、置換または非置換のポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ジビニルベンゼン）またはポリピロールからなることを特徴とする、請求項１による方法。
【請求項16】
抽出相が置換または非置換のポリ（ジビニルベンゼン）からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項17】
検体が生体系である、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
被検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、該質量分析装置は、以下の構成を有することを特徴とする質量分析装置。検体から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
中に溶剤を入れておく容器ユニット、
前記プロ－ブに電圧を印加する電圧発生部と、
上下方向に延びて配置された前記導電性プローブと、前記導電性プローブの下方に配置された容器ユニットとの少なくとも一方を上下方向に移動させて、前記導電性プローブを容器ユニット内の溶剤に浸漬させるとともに、前記導電性プローブを溶剤ユニットから取り出す変位装置と、
前記変位装置により溶媒を前記導電性プローブに付着させ、抽出相に吸着した抽出対象成分を前記導電性プローブに付着した溶媒に脱着させた後、電圧発生部により前記導電性プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下で前記導電性プローブに付着した溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化する。
【請求項19】
前記抽出相および前記プローブの少なくとも一方を洗浄する噴霧手段をさらに備える、請求項１８に記載の質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連アプリケーションへのクロスリファレンス
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月３日に出願された米国仮出願第６３／００４、７０３号からの優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年４月３日に出願された米国仮出願第６３／００４、７０３号からの優先権を主張する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0002】
（１）固相マイクロ抽出プローブエレクトロスプレーイオン化の開発と応用、２０２０年１２月２１日発行。
（２）少量の生体流体中の乱用薬物のスクリーニングと定量化のための固相マイクロ抽出 プローブエレクトロスプレーイオン化装置、２０２１年３月１８日発行。
（２）少量の生体流体中の乱用薬物のスクリーニングと定量化のための固相マイクロ抽出 プローブエレクトロスプレーイオン化装置、２０２１年３月１８日発行。
【0003】
本発明は、質量分析による検体物質の分析方法およびその方法に用いる質量分析装置に関する。より具体的には、本発明は、プローブエレクトロスプレーイオン化法を用いた質量分析により検体中の目的成分を同定する方法、およびプローブエレクトロスプレーイオン化法を採用したイオン源を含む質量分析装置に関するものである。
【背景技術】
【0004】
質量分析装置において試料中の目的成分をイオン化する手法として、従来から様々な方法が提案され、実用化されている。例えば、大気中でイオン化を行うイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（大気圧ＭＡＬＤＩ法）が知られている。
【0005】
生体試料のように複雑なマトリックスを持つ試料では、試料中の目的成分を前処理なしにイオン化すると、目的成分をイオン化する際にマトリックスによって信号強度のイオンサプレッションやエンハンスが起こる。その結果、検体中の目的成分の存在や濃度を正確に測定することができない。
【0006】
このため、イオン化法としてＥＳＩ法を採用する場合、通常は質量分析の前に、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ＩＣＰなどで目的成分をマトリックスから分離している。
イオン化法として大気圧ＭＡＬＤＩ法を採用する場合、生体試料などの検体を所定の温度まで冷却して乾燥させた後、検体の表面に特定のマトリックスを塗布して、目的成分のイオン化効率を向上させるような前処理を行うことが一般的である。
イオン化法として大気圧ＭＡＬＤＩ法を採用する場合、生体試料などの検体を所定の温度まで冷却して乾燥させた後、検体の表面に特定のマトリックスを塗布して、目的成分のイオン化効率を向上させるような前処理を行うことが一般的である。
【0007】
このように、イオン化法として一般的に用いられるＥＳＩ法や大気圧ＭＡＬＤＩ法では、目的成分を精度良く検出し、その濃度等を測定するために、マトリックス成分を分離する工程（目的成分の抽出）や目的成分のイオン化効率を高めるための前処理が必要である。その結果、分析時間が長くなり、分析者が行う手順も複雑になる。
【0008】
また、アミノグリコシド系抗菌剤やカテコラミンのような高極性化合物は、分子間相互作用により高沸点となる。このような高極性化合物は、ＧＣ－ＭＳによる測定が困難であり、主にＬＣ－ＭＳやＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定が行われている。しかし、高極性化合物は、一般的に移動相として用いられる有機溶媒に溶解せず、逆相クロマトグラフィーで保持することが困難である。このため、高極性化合物を分析する場合は、高極性化合物が溶出する水系移動相を用いた親水性相互作用クロマトグラフィーを行うことが必要である。しかし、親水性相互作用クロマトグラフィーでは、カラム調整、平衡化、移動相ｐＨ調整などの分析条件の設定が煩雑であり、分析者の負担が大きい。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、前記のような課題を解決するためになされたものである。本発明の主な目的は、ＬＣ／ＭＳやＧＣ／ＭＳではほとんど測定されない高極性化合物などの検体中の目的成分を、ＥＳＩ法や大気圧ＭＡＬＤＩ法などの一般的なイオン化法に必要な分離工程や前処理工程を行わずに、高い定量精度で同定する方法を提供することにある。さらに、本発明の他の主な目的は、この分析方法を実施するように構成された分析装置を提供することである。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の対象成分の特定方法に関するものである。
プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析法により、検体中の目的成分を同定する方法であり、前記方法は、
（１）検体にプローブを浸漬することにより、検体から目的成分を吸着させるための抽出相に目的成分を吸着させ、前記プローブの少なくとも一部が抽出相でコーティングされていること。
（２）前記試料から前記プローブを取り外すこと。
（３）前記抽出相に溶媒を付着させること。
（４）前記抽出相から前記プローブに付着した溶媒に目的の成分を脱着すること。
（５）電離源上で前記プローブに電圧を印加することにより前記プローブに付着した前記溶媒中に脱着した目的成分を大気圧でエレクトロスプレーし、前記プローブからエアロゾル化しイオン化した液滴を噴霧すること。および
（６）前記エアロゾル化しイオン化した液滴中に存在する目的の低分子成分を同定すること。
を含む。
プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析法により、検体中の目的成分を同定する方法であり、前記方法は、
（１）検体にプローブを浸漬することにより、検体から目的成分を吸着させるための抽出相に目的成分を吸着させ、前記プローブの少なくとも一部が抽出相でコーティングされていること。
（２）前記試料から前記プローブを取り外すこと。
（３）前記抽出相に溶媒を付着させること。
（４）前記抽出相から前記プローブに付着した溶媒に目的の成分を脱着すること。
（５）電離源上で前記プローブに電圧を印加することにより前記プローブに付着した前記溶媒中に脱着した目的成分を大気圧でエレクトロスプレーし、前記プローブからエアロゾル化しイオン化した液滴を噴霧すること。および
（６）前記エアロゾル化しイオン化した液滴中に存在する目的の低分子成分を同定すること。
を含む。
【0011】
さらに、本発明は、以下の対象部品特定装置に関するものである。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
中に溶剤を入れておく容器ユニット、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
前記プローブを前記容器ユニット内の溶剤に浸漬させるとともに、前記プローブを前記溶剤ユニットから取り出すために、上下方向に延びて配置された前記プローブと、前記プロ－ブの下方に配置された前記容器ユニットとの少なくとも一方を上下方向に移動させる変位装置、
前記変位部により溶媒を前記プローブに付着させた後、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した溶媒に脱着させ、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加してエレクトロスプレー現象を利用し、大気圧下で前記プローブに付着した前記溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化すること、
を含む。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
溶媒をプローブに噴霧する噴霧手段、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
溶媒は噴霧手段により前記プローブに付着させた後、抽出相に吸着した存在する抽出対象成分を前記プローブに付着した溶媒に脱着させ、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下でプローブに付着した溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化させること、
を含む。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
中に溶剤を入れておく容器ユニット、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
前記プローブを前記容器ユニット内の溶剤に浸漬させるとともに、前記プローブを前記溶剤ユニットから取り出すために、上下方向に延びて配置された前記プローブと、前記プロ－ブの下方に配置された前記容器ユニットとの少なくとも一方を上下方向に移動させる変位装置、
前記変位部により溶媒を前記プローブに付着させた後、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した溶媒に脱着させ、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加してエレクトロスプレー現象を利用し、大気圧下で前記プローブに付着した前記溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化すること、
を含む。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
溶媒をプローブに噴霧する噴霧手段、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
溶媒は噴霧手段により前記プローブに付着させた後、抽出相に吸着した存在する抽出対象成分を前記プローブに付着した溶媒に脱着させ、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下でプローブに付着した溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化させること、
を含む。
【0012】
本発明の方法によれば、ＥＳＩ法やＭＡＬＤＩ法とは異なり、ある程度の時間を要する分離工程や分析者の行う手順を煩雑にする前処理を行うことなく、検体中の目的成分の検出や濃度測定を行うことができる。その結果、分析時間を短縮することができ、分析者の負担を大幅に軽減することができる。
さらに、適切な抽出相を選択することで、検体中の目的成分、例えば、従来のＧＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳではほとんど測定できない高極性化合物を高濃度で抽出し、目的成分の分析を高い定量精度で行うことができる。
さらに、適切な抽出相を選択することで、検体中の目的成分、例えば、従来のＧＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳではほとんど測定できない高極性化合物を高濃度で抽出し、目的成分の分析を高い定量精度で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の例示的な実施形態の方法は、検体中の目的成分を抽出する固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）技術を適用したＰＥＳＩ法により、目的成分を同定する方法である。より具体的には、本発明の方法は、ＰＥＳＩ法用プローブが抽出相ポリマーでコーティングされている状態で分析を行う方法である。
【0015】
目的成分を含む検体としては、例えば、尿、血液、組織片などの生体試料、野菜や果物などの食品、各種工業製品などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、目的成分としては、組織片に含まれる細菌やウイルスなどの病原体、食品に含まれる栄養成分や残留農薬成分、工業製品に含まれる各種添加物や揮発性物質などが挙げられる。対象成分は、ＰＥＳＩ法によりイオン化される物質であれば、特に限定されるものではない。
【0016】
従来のＥＳＩ法や大気圧ＭＡＬＤＩ法では、レーザー光のビ－ム径を数１０μｍ以下にすることは原理的に困難である。また、アブレーションが広範囲にわたるため、５０μｍ程度の空間分解能が限界である。そのため、１μｍ以下の分解能を得ることは非常に困難である。近年、分解能を向上させる方法として、前記のＥＳＩを利用したイオン化法としてプローブエレクトロスプレーイオン化法（ＰＥＳＩ）が開発されている（例えば、ＷＯ２０１０／０４７３９９、特開２０１４－４４１１０、日本国特許第４８６２１６７号）。
この方法は、前記ＷＯ２０１０／０４７３９９に記載されているように、導電性プローブの先端を、目的成分を含む試料に接触させて試料を補足し、試料補足後、プローブ先端部に溶媒を供給しながらエレクトロスプレー実施用高電圧をかけ、プローブ先端部で試料中の分子をイオン化させる方法である。この方法は、最近注目されている。
この方法は、前記ＷＯ２０１０／０４７３９９に記載されているように、導電性プローブの先端を、目的成分を含む試料に接触させて試料を補足し、試料補足後、プローブ先端部に溶媒を供給しながらエレクトロスプレー実施用高電圧をかけ、プローブ先端部で試料中の分子をイオン化させる方法である。この方法は、最近注目されている。
【0017】
本発明の例示的な実施形態の識別方法は、プローブを被検体に浸漬して被検体から目的成分を吸着させる抽出相に目的成分を吸着させる工程を含み、プローブは少なくとも一部が抽出相で被覆されている（以下、ステップ（１）とする）。
【0018】
被検体内に浸漬されるプローブ１は、図１に示すように、例えば、少なくとも一部が抽出相２で被覆されている。プローブの先端端から１から４ｍｍの部分がコーティングされていてもよく、より好ましくは、プローブの先端から２ｍｍ程度の部分がコーティングされていてもよい。さらに、コーティングとしての抽出相の厚さは、２から５０μｍの範囲であってもよく、より好ましくは約３から１０μｍの範囲であり、さらに好ましくは約６．５μｍである。
【0019】
前記プローブを被覆するための抽出相ポリマーとしては、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリピロール、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリアクリレート、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ジビニルベンゼン）、ポリピロール、フッ化炭素、炭素ナノチューブ、黒鉛質窒化炭素、窒化ほう素、金属有機フレームワーク、多孔性芳香族骨格等が挙げられる。
これらのポリマーは、使用目的に応じて、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。これらのポリマーのうち、置換または無置換のポリ（ジビニルベンゼン）がより好ましい。しかし、抽出相ポリマーはこれに限定されるものではなく、吸着性粒子のマトリックス適合性コーティングバインダーとして抽出相への高分子の吸着を防止するように設計されたものである。そして、抽出相ポリマーは、プローブに付着する溶媒に対する耐性に基づいて設計されてもよい。そして、抽出相はポリマーに限らず、フルオロカーボン、カーボンナノチューブ、グラファイトカーボンナイトライド、ボロンナイトライド、有機金属骨格、多孔性芳香族骨格であっても良い。
これらのポリマーは、使用目的に応じて、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。これらのポリマーのうち、置換または無置換のポリ（ジビニルベンゼン）がより好ましい。しかし、抽出相ポリマーはこれに限定されるものではなく、吸着性粒子のマトリックス適合性コーティングバインダーとして抽出相への高分子の吸着を防止するように設計されたものである。そして、抽出相ポリマーは、プローブに付着する溶媒に対する耐性に基づいて設計されてもよい。そして、抽出相はポリマーに限らず、フルオロカーボン、カーボンナノチューブ、グラファイトカーボンナイトライド、ボロンナイトライド、有機金属骨格、多孔性芳香族骨格であっても良い。
【0020】
あるいは、抽出相ポリマーは、ポリマーと固相マイクロ抽出（以下、「ＳＰＭＥ」と称することがある）に用いる粒子との混合物であってもよい。ＳＰＭＥを用いる場合、粒子径は、後述するエレクトロスプレーイングを考慮すると、５μｍ以下が好ましく、より好ましくは０．５μｍから３μｍの範囲、さらに好ましくは１μｍである。ＳＰＭＥに用いる粒子はこれに限定されるものではなく、抽出相には、標的分子を吸着するポリマーや、固体細孔を有するポリマー、非標的成分を吸着しないサイズの固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）粒子を用いることも可能である。非標的成分の例としては、標的成分よりも粒径の大きい高分子成分が挙げられる。
【0021】
抽出相ポリマーの乾燥温度は、使用する抽出相ポリマーにもよるが、使用する抽出相ポリマーが十分に固化するような温度であり、例えば、８０℃から１００℃である。さらに、乾燥時間も、使用する抽出相ポリマーが十分に固化するような時間であればよく、例えば、１０秒から３０秒程度である。
【0022】
抽出相ポリマーを含む懸濁液にプローブ先端部領域を浸漬するステップ、懸濁液からプローブを取り出すステップ、プローブに付着した抽出相ポリマーを乾燥するステップをこの順に、プローブを被覆する抽出相の厚さが所望の厚さに達するまで繰り返す。このようにして、所望の厚みを有する抽出相で被覆されたプローブを製造することができる。なお、抽出相の厚みは、前述のとおりである。
【0023】
前記抽出相は、選択的空洞であるバイオアフィニティ剤をさらに含んでもよい。バイオアフィニティ剤は、選択的キャビティ、分子認識部位、分子インプリントポリマーおよび固定化抗体からなる群から選択されることが好ましい。
【0024】
前記の方法で作製し、抽出相を塗布したプローブを検体中に浸漬することで、検体中の目的成分を抽出相に吸着させることができる。
次に、プローブを被検体から引き抜くステップ（以下、ステップ（２）とする）により、図２に示すように、抽出相に目的成分３が吸着される。
次に、プローブを被検体から引き抜くステップ（以下、ステップ（２）とする）により、図２に示すように、抽出相に目的成分３が吸着される。
【0025】
その後、抽出相に溶媒を付着させるステップ（以下、ステップ（３）とする）により、プローブ上の抽出相に溶媒を付着させる。溶媒をプローブおよび／または抽出相に導入する方法としては、プローブを溶媒に浸漬し、溶媒からプローブを取り出す方法がある。また、溶媒をプローブおよび／または抽出相に導入する方法としては、溶媒をプローブおよび／または抽出相に噴霧する方法がある。特に極性化合物の場合、プローブを溶媒に浸すと溶媒への分析対象物の脱離が起こる可能性があるので、溶媒をプローブ、または抽出相に吹き付けることで、溶媒への浸漬と溶媒への分析対象物の脱離を避けることができる。
【0026】
抽出相から溶媒に目的成分を脱離させるステップ（以下、ステップ（４）とする）により、前記ステップ（３）によりプローブに付着した溶媒は、抽出相に吸着した目的成分を抽出する。このステップにより、抽出相に吸着した目的成分は、プローブに吸着した溶媒に移動する。
【0027】
前記ステップ（４）は、必ずしもステップ（３）の後でなくてもよく、ステップ（３）と同時であってもよい。また、必要に応じて、ステップ（３）を繰り返してもよい。ステップ（３）を繰り返す場合、ステップ（４）は、最初のステップ（３）と同時でも、繰り返しの途中でも、ステップ（３）の繰り返しの終了後でもよい。
【0028】
前記ステップ（３）で用いる溶媒は、目的とする成分に応じて選択する。通常、溶媒としては、水、または炭素数５から８程度のアルカン、炭素数１から８程度のアルコール、炭素数４から１０程度のエーテル、炭素数３から１０程度のケトン、炭素数２から６程度のカルボン酸、炭素数３から８程度のエステル等の有機溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族化合物が例示される。有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノールなどが挙げられる。酸の場合、有機溶媒としては、例えば、蟻酸、酢酸などが挙げられる。ただし、有機溶媒は、これらの物質に限定されない。有機溶媒は、一般的なＬＣ／ＭＳで移動相として用いられる有機溶媒であってもよいし、そのような移動相に酸を添加したものであってもよい。
有機溶媒は、水を含んでいてもよく、例えば、３０から７０質量％の水を含む有機溶媒が挙げられる。
有機溶媒は、水を含んでいてもよく、例えば、３０から７０質量％の水を含む有機溶媒が挙げられる。
【0029】
取り扱い性の観点から、前記のうち好ましい溶媒は、水、炭素数約５から８のアルカン、炭素数約１から８のアルコール、炭素数約４から１０のエーテル、または炭素数約２から６のカルボン酸であり、炭素数約２から６のアルコールまたは炭素数約２から４のカルボン酸がより好ましい溶媒である。揮発性の観点からは、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールがより好ましい。
【0030】
前記ステップ（４）によりプローブに付着した溶媒中に移動した抽出相に付着した目的成分に対して、大気圧下のイオン化源上でプローブに付着した溶媒中に脱離した目的成分をプローブに電圧を印加してプローブからエアゾール状にイオン化した液滴を噴霧するエレクトロスプレーを行う（以下、ステップ（５）する）。ステップ（５）でイオン化された目的成分を含む液滴を同定する（以下、ステップ（６）とする）。イオン化された目的成分を含む液滴は、例えば、質量分析装置により同定される。同定は、定性のみでもよいし、定性と定量の両方を含んでもよい。
【0031】
前記プローブは、前記ステップ（５）の後、再度、前記溶媒に浸漬し、ステップ（５）を行ってもよい。すなわち、ステップ（５）により、プローブに付着した溶媒中に脱離した目的成分のエレクトロスプレーを一旦行った後、プローブの抽出相に残っている目的成分を溶媒中に溶出させるようにプローブを溶媒中に浸漬し、再度ステップ（５）を行う。このようにすることで、ステップ（６）での同定を効率よく、かつ良好な精度で行うことができる。
【0032】
本発明の例示的実施形態に係る分析方法および／またはプローブは、前記ステップ（１）から（６）に加えて、ステップ（１）の後に、分析精度を向上させるために、検体に含まれる目的成分以外の不純物や異物を洗浄する観点から、抽出相および／またはプローブを水溶液、有機溶剤およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一つで洗浄するステップ（以下「洗浄ステップ」と記載する場合がある）を含んでもよい。洗浄工程に用いる水系溶媒および有機系溶媒は、前記した溶媒と同様である。そして、洗浄するステップは、プローブの表面に付着した分子量の大きな干渉物を除去するために、プローブを水中で洗浄することを含む。脂肪分の多いマトリックスや脂肪分を多く含むサンプル（例：牛乳、アボカド）の場合は、アセトン－水混合溶媒を使用することができる。また、洗浄には、スプレーによる抽出相、またはプローブの洗浄を含む。洗浄は、前記の方法に限定されるものではなく、洗浄の方法、洗浄時間（通常１秒以下）は、妨害物質の除去、プローブや抽出相から分析対象物質を脱離させないことを考慮して最適化することができる。
【0033】
本発明の例示的な実施形態の解析方法は、前記ステップ（１）から（６）を含む。通常、ステップ（１）から（６）は、この順序で行われる。ただし、検体中の目的成分の量を考慮し、分析結果を見ながら、ステップ（１）から（６）を繰り返してもよい。（１）から（６）を繰り返す場合、分析結果が蓄積されるため、分析精度が向上し、より少ない試料量で正確な分析が可能となる。
【0034】
本発明の例示的な実施形態の識別方法は、以下の装置によって実施される。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であり、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
中に溶剤を入れておく容器ユニット、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
上下方向に延びて配置された前記プローブと、前記プローブの下方に配置された前記容器ユニットとの少なくとも一方を上下方向に移動させて、前記プローブを前記容器ユニット内の溶剤に浸漬させるとともに、前記プローブを前記溶剤ユニットから取り出す変位装置、
を有し、
前記変位部により前記溶媒を前記プローブに付着させ、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した前記溶媒に脱着させた後、電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下で前記プローブに付着した溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化する。
前記装置は、本発明の例示的な実施形態の識別方法の好ましい態様の１つを実施するものであり、プローブへの溶媒の導入および／または抽出相は、プローブを溶媒に浸漬することによって行われ、前記ステップ（３）においてプローブを溶媒から除去するために行われるものである。
検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であり、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
中に溶剤を入れておく容器ユニット、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
上下方向に延びて配置された前記プローブと、前記プローブの下方に配置された前記容器ユニットとの少なくとも一方を上下方向に移動させて、前記プローブを前記容器ユニット内の溶剤に浸漬させるとともに、前記プローブを前記溶剤ユニットから取り出す変位装置、
を有し、
前記変位部により前記溶媒を前記プローブに付着させ、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した前記溶媒に脱着させた後、電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下で前記プローブに付着した溶媒に脱着した抽出対象成分をイオン化する。
前記装置は、本発明の例示的な実施形態の識別方法の好ましい態様の１つを実施するものであり、プローブへの溶媒の導入および／または抽出相は、プローブを溶媒に浸漬することによって行われ、前記ステップ（３）においてプローブを溶媒から除去するために行われるものである。
【0035】
また、本発明の例示的な実施形態の識別方法は、以下の装置によって実施される。
被検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
前記プローブに霧状の溶媒を供給するように構成されたインジェクター、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
を有し、
前記プローブに前記溶媒を付着させ、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した前記溶媒に脱離させた後、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下で前記プローブに付着した前記溶媒に脱離した抽出対象成分をイオン化する。
前記装置は、前記ステップ（３）において、プロ－ブおよび／または抽出相への溶媒の導入が、プローブへの溶媒の噴霧によって行われる、本発明の識別方法の他の好ましい実施態様を実施するものである。
被検体中の目的成分を同定するための質量分析装置であって、
前記質量分析装置は、
試料から目的成分を吸着するための抽出相で少なくとも部分的にコーティングされた導電性プローブ、
前記プローブに霧状の溶媒を供給するように構成されたインジェクター、
前記プローブに電圧を印加する電圧発生部、
を有し、
前記プローブに前記溶媒を付着させ、前記抽出相に吸着した抽出対象成分を前記プローブに付着した前記溶媒に脱離させた後、前記電圧発生部により前記プローブに電圧を印加し、エレクトロスプレー現象を利用して大気圧下で前記プローブに付着した前記溶媒に脱離した抽出対象成分をイオン化する。
前記装置は、前記ステップ（３）において、プロ－ブおよび／または抽出相への溶媒の導入が、プローブへの溶媒の噴霧によって行われる、本発明の識別方法の他の好ましい実施態様を実施するものである。
【0036】
以上のように、導電性プローブは、抽出相が部分的に塗布されたプローブであり、被検体中の目的成分を抽出するものである。抽出相は前記の通りであり、製造方法も前記の通りである。
【0037】
容器ユニットは内部に前記溶媒を保持し、前記プローブおよび／または抽出相へ溶媒の吸着を実行するために、前記プローブは溶媒をプローブに吸着させる目的で容器ユニット内に挿入される。
【0038】
電圧発生部は、プローブに電圧を印加するように構成された装置であり、前記ステップ（５）において、エレクトロスプレーイングを実行する。電圧発生部により、目的成分を含む液滴がイオン化される。
【0039】
変位装置は、前記したように、プローブおよび／または抽出相に溶媒を導入するためにプローブに溶媒を吸着させ、抽出相に吸着された目的成分を溶媒中に抽出する際に使用するものである。変位部は、上下方向（図１の矢印の方向）に延びて配置されたプローブまたはプローブの下方に配置された容器ユニットの少なくとも一方を上下方向に移動させるものである。
なお、変位装置は、プローブと容器ユニットの両方を移動させてもよい。プローブまたは容器ユニットの少なくとも一方を移動させることにより、プローブを容器内の溶媒に浸漬させることができ、プローブを容器内の溶媒から引き抜くことができる。
一方、プローブに霧状の溶媒を供給するように構成されたインジェクターは、ステップ（３）でプローブおよび／または抽出相に溶媒を導入する。
なお、変位装置は、プローブと容器ユニットの両方を移動させてもよい。プローブまたは容器ユニットの少なくとも一方を移動させることにより、プローブを容器内の溶媒に浸漬させることができ、プローブを容器内の溶媒から引き抜くことができる。
一方、プローブに霧状の溶媒を供給するように構成されたインジェクターは、ステップ（３）でプローブおよび／または抽出相に溶媒を導入する。
【0040】
前記構成により、電圧発生部は、前記ステップ（３）を経てプローブに付着した溶媒に抽出された目的成分に大気圧下で電圧を印加し、エレクトロスプレー現象により目的成分をイオン化させる。イオン化された液滴は、質量分析装置によって同定される。使用する質量分析装置は、タンデム型であってもよい。
【0041】
前記構成の質量分析装置を用いれば、ＥＳＩ法やＭＡＬＤＩ法とは異なり、ある程度の時間を要する分離工程や分析者にとって煩雑な前処理を行うことなく、検体中の目的成分の検出や濃度測定を好適に行うことができる。また、検体中の目的成分、例えば一般的なＧＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳでは測定が困難な高極性化合物についても、高い定量精度で分析することが可能である。
【0042】
次に、本発明の例示的な実施形態について、例を参照しながら詳細に説明するが、本発明の範囲はかかる例によって限定されるものではない。
【0043】
［例１］
＜プローブの塗布方式＞
プローブの塗布時に使用するスラリーの調整方法は以下の通りである。
ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中７％（重量／体積）混合物を調整し、これをコーティングバインダーとする。続いて、親水性－親油性バランス粒子（ＨＬＢ）（粒径：１μｍ）９．２％、コーティングバインダー（ＰＡＮ）８７．９％、グリセロール２．８％の組成を有するスラリーを調製した。負に帯電したポリアクリロニトリルは、高分子（タンパク質など）の結合を最小限に抑え、低分子である目的成分の抽出相への選択的な透過を可能にする。
＜プローブの塗布方式＞
プローブの塗布時に使用するスラリーの調整方法は以下の通りである。
ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中７％（重量／体積）混合物を調整し、これをコーティングバインダーとする。続いて、親水性－親油性バランス粒子（ＨＬＢ）（粒径：１μｍ）９．２％、コーティングバインダー（ＰＡＮ）８７．９％、グリセロール２．８％の組成を有するスラリーを調製した。負に帯電したポリアクリロニトリルは、高分子（タンパク質など）の結合を最小限に抑え、低分子である目的成分の抽出相への選択的な透過を可能にする。
【0044】
前記スラリーに用いるＨＬＢ粒子は、以下の方法で調整した。
ジビニルベンゼンとＮ－ビニルピロリドンモノマーを用いてＨＬＢ粒子を調製した。最終粒子に存在する官能基の量を元素分析で測定したところ、合成方法と意図する用途に応じて、１グラムあたり２００から７００ｍ２の範囲の表面積を持つケトン基を持つＮ－ビニルピロリドンが２０から２５％存在することがわかった。ＰＥＳＩ用途では、表面積２００ｍ２／ｇ、Ｎ－ビニルピロリドン２０％のＨＬＢ粒子を使用した。所望の粒子径を有するＨＬＢ粒子を形成する方法としては、例えば、膜分離、遠心分離、超音波分離などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ジビニルベンゼンとＮ－ビニルピロリドンモノマーを用いてＨＬＢ粒子を調製した。最終粒子に存在する官能基の量を元素分析で測定したところ、合成方法と意図する用途に応じて、１グラムあたり２００から７００ｍ２の範囲の表面積を持つケトン基を持つＮ－ビニルピロリドンが２０から２５％存在することがわかった。ＰＥＳＩ用途では、表面積２００ｍ２／ｇ、Ｎ－ビニルピロリドン２０％のＨＬＢ粒子を使用した。所望の粒子径を有するＨＬＢ粒子を形成する方法としては、例えば、膜分離、遠心分離、超音波分離などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
さらに、プローブについては、前記の方法で調整したスラリーを塗布する前工程において、以下のようにエッチングを行った。
ＰＥＳＩプローブを希釈したＨＣｌ（７．４％）に浸し、ウォーターバスソニケーターの上に１５分間放置した。次に、プローブを水に浸し、ウォーターバスソニケーターの上に２０分間置いた。続いて、プローブをＭｅＯＨに浸し、ウォーターバスソニケーターに２０分間置いた。その直後、プローブを熱で乾燥させた。
ＰＥＳＩプローブを希釈したＨＣｌ（７．４％）に浸し、ウォーターバスソニケーターの上に１５分間放置した。次に、プローブを水に浸し、ウォーターバスソニケーターの上に２０分間置いた。続いて、プローブをＭｅＯＨに浸し、ウォーターバスソニケーターに２０分間置いた。その直後、プローブを熱で乾燥させた。
【0046】
エッチングされたプローブに調整スラリーを塗布する際の具体的な手順は以下の通りである。
１）ＰＥＳＩプローブの先端が塗工液の表面にわずかに触れるように位置決めする。ディップコーターモーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＭＴＳ５０／Ｍ－Ｚ８Ｅ、５０ｍｍ））を使用し、ＰＥＳＩプローブの位置がコーティングスラリーの表面にわずかに触れるように調整する。プローブの先端が塗布スラリー表面にわずかに触れているかどうかは、２つの電極間の回路が完成するとノイズが発生するセンサーを取り付けた２つの電極で確認した。電極はワニ口クリップで、片方のクリップをＰＥＳＩプローブに、もう片方のクリップを治療用針に取り付けてスラリーに浸漬した。
２）ＰＥＳＩプローブを１、２、４ｍｍのいずれかに浸漬し、以下のパラメータを設定した。
速度＝２．４ｍｍ／ｓ、加速度＝１．５ｍｍ／ｓ２、ｊｏｇ Ｓｔｅｐ＝０．５ｍｍ
３）プローブを一旦前記の規定距離まで下降させた後、直ちにコーティングスラリーの上方１８ｍｍまで上昇させた。ＰＥＳＩプローブの上昇に使用したパラメータは、ＰＥＳＩプローブの浸漬に使用したパラメータと同じである。
４）ＰＥＳＩプローブをコーティングスラリーから上昇させた後、直ちに９０℃のオーブンに２０秒間放置した。
５）所望のコーティング厚さ（この場合、プローブのコーティング部分の直径はおよそ１５０μｍ（コーティング厚さ≒６．５μｍ））を満たすまで前記ステップ２から４を繰り返した（通常、所望のコーティング厚さとそのコーティング厚さを得るために必要なコーティング回数は一定である）。
１）ＰＥＳＩプローブの先端が塗工液の表面にわずかに触れるように位置決めする。ディップコーターモーター（Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＭＴＳ５０／Ｍ－Ｚ８Ｅ、５０ｍｍ））を使用し、ＰＥＳＩプローブの位置がコーティングスラリーの表面にわずかに触れるように調整する。プローブの先端が塗布スラリー表面にわずかに触れているかどうかは、２つの電極間の回路が完成するとノイズが発生するセンサーを取り付けた２つの電極で確認した。電極はワニ口クリップで、片方のクリップをＰＥＳＩプローブに、もう片方のクリップを治療用針に取り付けてスラリーに浸漬した。
２）ＰＥＳＩプローブを１、２、４ｍｍのいずれかに浸漬し、以下のパラメータを設定した。
速度＝２．４ｍｍ／ｓ、加速度＝１．５ｍｍ／ｓ２、ｊｏｇ Ｓｔｅｐ＝０．５ｍｍ
３）プローブを一旦前記の規定距離まで下降させた後、直ちにコーティングスラリーの上方１８ｍｍまで上昇させた。ＰＥＳＩプローブの上昇に使用したパラメータは、ＰＥＳＩプローブの浸漬に使用したパラメータと同じである。
４）ＰＥＳＩプローブをコーティングスラリーから上昇させた後、直ちに９０℃のオーブンに２０秒間放置した。
５）所望のコーティング厚さ（この場合、プローブのコーティング部分の直径はおよそ１５０μｍ（コーティング厚さ≒６．５μｍ））を満たすまで前記ステップ２から４を繰り返した（通常、所望のコーティング厚さとそのコーティング厚さを得るために必要なコーティング回数は一定である）。
【0047】
次に、本開発による解析方法のステップの一例について説明する。
＜解析条件＞
１．試料の種類
検体の種類：血漿（乱用薬物（以下、ＤｏＡと略す）
対象成分ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、フェンタニル、ロラゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパム、プロプラノロール
２．解析ステップとパラメータ
１）試料を抽出相ポリマーに吸着させるステップ（ステップ（１））
サンプル３０μＬ、１８±２°Ｃに設定
吸着時間：６０分
２）プローブに溶媒を付着させるステップ（ステップ（２）、（３））
溶媒の構成：イソプロパノールと水（１：１の割合）および０．１％ギ酸
プローブが溶媒に付着する回数：７３
プローブストップ位置（プローブストップ初期位置からの距離）：－４４ｍｍ
溶媒位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－４６ｍｍ
試料を抽出相に付着させる時間：５０／ＭＳ
プローブ駆動速度：２５０ｍｍ／ｓ
プローブドライブの加速度：１Ｇ
サイクル：１２．０４Ｈｚ
３．プローブへの電圧印加ステップ（ステップ（６））。
プローブに印加される電圧の大きさ：２．３ｋＶ
イオン化の繰り返しの回数：７３
イオン化時間（プローブに電圧を印加する時間）：２００／ＭＳ
イオン化位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－３７ｍｍ
溶媒位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－４６ｍｍ
プローブ駆動速度：２５０ｍｍ／ｓ
プローブドライブの加速度：０．６３Ｇ
サイクル：２．４８Ｈｚ
＜解析条件＞
１．試料の種類
検体の種類：血漿（乱用薬物（以下、ＤｏＡと略す）
対象成分ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、フェンタニル、ロラゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパム、プロプラノロール
２．解析ステップとパラメータ
１）試料を抽出相ポリマーに吸着させるステップ（ステップ（１））
サンプル３０μＬ、１８±２°Ｃに設定
吸着時間：６０分
２）プローブに溶媒を付着させるステップ（ステップ（２）、（３））
溶媒の構成：イソプロパノールと水（１：１の割合）および０．１％ギ酸
プローブが溶媒に付着する回数：７３
プローブストップ位置（プローブストップ初期位置からの距離）：－４４ｍｍ
溶媒位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－４６ｍｍ
試料を抽出相に付着させる時間：５０／ＭＳ
プローブ駆動速度：２５０ｍｍ／ｓ
プローブドライブの加速度：１Ｇ
サイクル：１２．０４Ｈｚ
３．プローブへの電圧印加ステップ（ステップ（６））。
プローブに印加される電圧の大きさ：２．３ｋＶ
イオン化の繰り返しの回数：７３
イオン化時間（プローブに電圧を印加する時間）：２００／ＭＳ
イオン化位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－３７ｍｍ
溶媒位置（プローブ初期停止位置からの距離）：－４６ｍｍ
プローブ駆動速度：２５０ｍｍ／ｓ
プローブドライブの加速度：０．６３Ｇ
サイクル：２．４８Ｈｚ
【0048】
４．質量分析
質量分析計：タンデム質量分析計
定量的な測定方法：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
ＭＲＭパラメータ
表１：質量分析計のパラメータ
表２：その他の質量分析パラメータ
質量分析計：タンデム質量分析計
定量的な測定方法：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
ＭＲＭパラメータ
表１：質量分析計のパラメータ
表２：その他の質量分析パラメータ
【0049】
【表1】
【0050】
【表2】
【0051】
分析は、例えば以下のようなステップで行った。
１．血漿濃度が１、５、１０、２５、５０、７５および１００ｎｇ／ｍＬの試料を試料容器に添加した。
２．これらのサンプル容器には、さらに１０ｎｇ／ｍＬの内部標準物質が添加した。
３．これらの試料容器に入れた試料を４℃の冷蔵庫で１日保管し、血漿蛋白を適宜結合させた。
４．これらの試料容器に入った試料を冷蔵庫から取り出し、室温に温度調整を行った。
５．洗浄液（体積比でメタノール（以下、「ＭｅＯＨ」という）／アセトニトリル（以下、「ＡＣＮ」という）／イソプロパノール（以下、「ＩＰＡ」という）＝２／１／１）で１５分間洗浄した後、前記方法でコーティングしたプローブをコンディショニング液（体積比でＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／１）で１５分間インキュベートした。
６．各試料容器にプローブを挿入し、室温で１時間放置することで、プローブを覆う抽出相（ＨＬＢ粒子）に試料物質が吸着された。
７．抽出相領域を含むプローブをＨ２Ｏで約３秒間洗浄した。
８．ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ＝１／１（体積比）＋０．１質量％のギ酸を添加した溶媒１０μＬを容器内に収容し、質量分析計の溶媒位置に配置した。その後、プローブをプローブ停止位置から溶媒位置へ移動させ、溶媒をプローブに付着させた。５０ｍｓ経過後、プローブをプローブ停止位置まで移動させた。このような処理を７３回繰り返し、所望の量の溶媒をプローブに付着させることができた。
９．抽出相に付着した各試料物質がプローブに付着した溶媒から脱離した後、プローブに２．３ｋＶの電圧を２００ｍｓ印加し、溶媒中に溶出した各試料物質をイオン化した。その後、プローブを溶媒の位置に移動させ、プローブに溶媒を付着させた。その後、プローブを溶媒の位置に移動し、溶媒をプローブに付着させ、再びイオン化位置に移動し、電圧を印加した。このようにして、各血漿試料をイオン化した。このような処理を７３回繰り返した。
１０．質量分析計により、前記表１および表２に記載のパラメータにより、２．４８Ｈｚの周期で質量分析を行った。
１．血漿濃度が１、５、１０、２５、５０、７５および１００ｎｇ／ｍＬの試料を試料容器に添加した。
２．これらのサンプル容器には、さらに１０ｎｇ／ｍＬの内部標準物質が添加した。
３．これらの試料容器に入れた試料を４℃の冷蔵庫で１日保管し、血漿蛋白を適宜結合させた。
４．これらの試料容器に入った試料を冷蔵庫から取り出し、室温に温度調整を行った。
５．洗浄液（体積比でメタノール（以下、「ＭｅＯＨ」という）／アセトニトリル（以下、「ＡＣＮ」という）／イソプロパノール（以下、「ＩＰＡ」という）＝２／１／１）で１５分間洗浄した後、前記方法でコーティングしたプローブをコンディショニング液（体積比でＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／１）で１５分間インキュベートした。
６．各試料容器にプローブを挿入し、室温で１時間放置することで、プローブを覆う抽出相（ＨＬＢ粒子）に試料物質が吸着された。
７．抽出相領域を含むプローブをＨ２Ｏで約３秒間洗浄した。
８．ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ＝１／１（体積比）＋０．１質量％のギ酸を添加した溶媒１０μＬを容器内に収容し、質量分析計の溶媒位置に配置した。その後、プローブをプローブ停止位置から溶媒位置へ移動させ、溶媒をプローブに付着させた。５０ｍｓ経過後、プローブをプローブ停止位置まで移動させた。このような処理を７３回繰り返し、所望の量の溶媒をプローブに付着させることができた。
９．抽出相に付着した各試料物質がプローブに付着した溶媒から脱離した後、プローブに２．３ｋＶの電圧を２００ｍｓ印加し、溶媒中に溶出した各試料物質をイオン化した。その後、プローブを溶媒の位置に移動させ、プローブに溶媒を付着させた。その後、プローブを溶媒の位置に移動し、溶媒をプローブに付着させ、再びイオン化位置に移動し、電圧を印加した。このようにして、各血漿試料をイオン化した。このような処理を７３回繰り返した。
１０．質量分析計により、前記表１および表２に記載のパラメータにより、２．４８Ｈｚの周期で質量分析を行った。
【0052】
＜分析結果＞
１から１００ｎｇ／ｍＬの範囲となるように検体物質を添加した３０μＬの血漿を抽出し、補正した標準曲線を作製した。フェンタニルおよびノルジアゼパムの定量限界（ＬＬＯＱ）は１ｎｇ／ｍＬであった。また、ブプレノルフィン、コデイン、ロラゼパム、ジアゼパムおよびプロプラノロールのＬＬＯＱは５ｎｇ／ｍＬ、オキサゼパムのＬＬＯＱは１０ｎｇ／ｍＬであった。
ＱＣ値のロラゼパム３０ｎｇ／ｍＬ以外の化合物では、日内精度は８０から１２０％の範囲であった。ＱＣレベルのロラゼパム３０ｎｇ／ｍＬの日内精度は１２２％であった。
さらに、すべての化合物の日内精度が１５％未満であり、ＱＣレベルのロラゼパム（１６％）とＱＣレベルのオキサゼパム（２７％）の９０ｎｇ／ｍＬ以外の化合物の日内精度は１５％未満であった．
１から１００ｎｇ／ｍＬの範囲となるように検体物質を添加した３０μＬの血漿を抽出し、補正した標準曲線を作製した。フェンタニルおよびノルジアゼパムの定量限界（ＬＬＯＱ）は１ｎｇ／ｍＬであった。また、ブプレノルフィン、コデイン、ロラゼパム、ジアゼパムおよびプロプラノロールのＬＬＯＱは５ｎｇ／ｍＬ、オキサゼパムのＬＬＯＱは１０ｎｇ／ｍＬであった。
ＱＣ値のロラゼパム３０ｎｇ／ｍＬ以外の化合物では、日内精度は８０から１２０％の範囲であった。ＱＣレベルのロラゼパム３０ｎｇ／ｍＬの日内精度は１２２％であった。
さらに、すべての化合物の日内精度が１５％未満であり、ＱＣレベルのロラゼパム（１６％）とＱＣレベルのオキサゼパム（２７％）の９０ｎｇ／ｍＬ以外の化合物の日内精度は１５％未満であった．
【0053】
図３は、前記の方法と従来のＰＥＳＩ法を用いて同一条件下で血漿を分析した比較結果である。
従来のＰＥＳＩ法は、以下のステップで実施した。
１．血漿３０μＬにＭｅＯＨ２７０μＬを加え、ボルテックスする。
２．卓上型遠心分離機を用い、１４、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
３．上清を取り、水とギ酸で希釈し、５０％ＭｅＯＨと０．１％ギ酸にする。
４．ＤＰｉＭＳ－８０６０のソースにプローブを入れ、その後サンプルプレートに１０μＬのサンプルを入れた。
また、前記方法における分析対象物のピーク面積の計上は、従来のＰＥＳＩ法の約５００倍である。このことから、前記方法は、従来のＰＥＳＩ法よりもさらに測定感度が向上していることが推察される。
従来のＰＥＳＩ法は、以下のステップで実施した。
１．血漿３０μＬにＭｅＯＨ２７０μＬを加え、ボルテックスする。
２．卓上型遠心分離機を用い、１４、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
３．上清を取り、水とギ酸で希釈し、５０％ＭｅＯＨと０．１％ギ酸にする。
４．ＤＰｉＭＳ－８０６０のソースにプローブを入れ、その後サンプルプレートに１０μＬのサンプルを入れた。
また、前記方法における分析対象物のピーク面積の計上は、従来のＰＥＳＩ法の約５００倍である。このことから、前記方法は、従来のＰＥＳＩ法よりもさらに測定感度が向上していることが推察される。
【0054】
前記の方法により、例えば、ある程度の時間を要する分離工程や、分析者にとって煩雑な工程を要する前処理を行うことなく、検体中の目的成分の検出や濃度測定が行われる。その結果、分析時間を短縮することができ、分析者の負担を大幅に改善することができる。
さらに、高極性化合物など検体中の目的成分に対して、適切な抽出相ポリマーを選択することで、高い定量精度で分析することができる。
さらに、抽出相がコーティングされたプローブを製造し、前記のＰＥＳＩに用いるので、前記の方法を好適に実施することができる。
さらに、高極性化合物など検体中の目的成分に対して、適切な抽出相ポリマーを選択することで、高い定量精度で分析することができる。
さらに、抽出相がコーティングされたプローブを製造し、前記のＰＥＳＩに用いるので、前記の方法を好適に実施することができる。
【0055】
［例２］
例２では、高分子材料でコーティングされた市販のＰＥＳＩプローブとＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェースを用いたＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの適用を行った。プローブの開発は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の乱用薬物を用いて試験され、その後、少量の血漿中の乱用薬物を検出するためのものが開発された。
例２では、高分子材料でコーティングされた市販のＰＥＳＩプローブとＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェースを用いたＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの適用を行った。プローブの開発は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の乱用薬物を用いて試験され、その後、少量の血漿中の乱用薬物を検出するためのものが開発された。
【0056】
ＬＣ－ＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）および水（Ｈ２Ｏ）を使用した。ＦＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、リン酸ナトリウム二塩基、塩酸、ＨＰＬＣグレードのＭｅＯＨはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。次の化学物質は、特に１．３μｍ ＨＬＢ粒子の合成のためにＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ジビニルベンゼン、Ｎ－ビニルピロリドン、および２、２－アゾビス（イソブチロニトリル）、分析標準物質とその重水素化アナログはＣｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲｏｕｎｄＲｏｃｋ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、フェンタニル、ロラゼパム、ノルジアゼパム、プロプラノロール、ブプレノルフィン－ｄ４、コデイン－ｄ３、ジアゼパム－ｄ５、フェンタニル－ｄ５、ロラゼパム－ｄ４、ノルジアゼパム－ｄ５、プロプラノロール－ｄ７、標準物質の重水素化アナログは、該当する場合、ＩＳ補正に使用した。ただし、オキサゼパムは例外で、ノルジアゼパム－ｄ５が内標準物質として使用された。抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを使用した凍結、プールされた性別、非フィルターのヒト血漿は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。
【0057】
メタノール標準液は、以下の表２．１に示す分析物のマスタースタンダードから調製し、ＰＢＳまたは血漿のサンプルに最大１％の有機標準液のみがスパイクされるような濃度で調製した。これは、コーティングされたプローブと試料の間の平衡定数に測定上影響を与えるマトリックスの変化を防ぐためである。
【0058】
ＰＥＳＩプローブのディップコーティングには、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のモーター付き自作ステージ（ＭＴＳ５０／Ｍ－Ｚ８Ｅ、５０ｍｍ）を使用した。
【0059】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－３０ＡＤ 液体クロマトグラフィーシステム付きのＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０ トリプル四重極質量分析計を使用して実施した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験で分析物を定量するために使用した選択した反応モニタリング遷移の詳細情報は、表２．１に記載した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法に関するその他の実験条件は、表２．２および表２．３に記載した。
オートサンプラーは４°Ｃに保温され、ＰＢＳまたは血漿抽出試料をそれぞれ３μＬまたは６μＬ注入するために使用した。分離には、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から直接購入したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ＰＦＰカラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ粒子サイズ）を使用した。カラムオーブンは３５°Ｃに保温し、流速は３００μＬ／ｍｉｎで使用した。移動相Ａは水、移動相ＢはＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ、７／３）で、両移動相とも０．１％のギ酸を含んでいた。グラジエントは１０％Ｂで１．０分、７．０分まで１００％Ｂに直線的に傾斜させ、９．０分まで１００％Ｂで保持した。９．２分に１０％Ｂに戻し、１１．０分まで再平衡化した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験で分析物を定量するために使用した選択した反応モニタリング遷移の詳細情報は、表２．１に記載した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法に関するその他の実験条件は、表２．２および表２．３に記載した。
オートサンプラーは４°Ｃに保温され、ＰＢＳまたは血漿抽出試料をそれぞれ３μＬまたは６μＬ注入するために使用した。分離には、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から直接購入したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ＰＦＰカラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ粒子サイズ）を使用した。カラムオーブンは３５°Ｃに保温し、流速は３００μＬ／ｍｉｎで使用した。移動相Ａは水、移動相ＢはＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ、７／３）で、両移動相とも０．１％のギ酸を含んでいた。グラジエントは１０％Ｂで１．０分、７．０分まで１００％Ｂに直線的に傾斜させ、９．０分まで１００％Ｂで保持した。９．２分に１０％Ｂに戻し、１１．０分まで再平衡化した。
【0060】
【表2.1】
【0061】
【表2.2】
【0062】
【表2.3】
【0063】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェース（京都、日本）と、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０（京都、日本）トリプル四重極質量分析計を用いて実施した。装置の詳細および最適化されたＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェースとＭＳ／ＭＳパラメータは、表２．１、表２．４、および表２．５に記載した。サンプル位置での停留時間は５０ｍｓ、イオン化位置での停留時間は２００ｍｓであった。プローブがイオン化位置にあるとき、２．３ｋＶのインターフェース電圧を印加した。１試料あたりの総取得時間は０．５６分とした。
【0064】
【表2.4】
【0065】
【表2.5】
【0066】
ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中７％（重量／体積）溶液を調製し、これをコーティングバインダーとした。次に、１．３μｍＨＬＢ粒子９．２％、コーティングバインダー８７．９％、グリセロ－ル２．８％の組成のスラリーを調製した。ＰＥＳＩプローブを希塩酸（７．４％）中で１５分間超音波処理し、エッチングした。その後、水中で２０分間超音波処理を行い、さらにＬＣグレードのＭｅＯＨで２０分間超音波処理を行った。エッチングされたプローブは、１２５°Ｃの対流式オーブン中で乾燥され、エッチングと同じ日にコーティングされた。エッチングされたＰＥＳＩプローブは、自社製のステージを使用してＨＬＢ－ＰＡＮスラリーをディップコーティングした。プローブの先端は２ｍｍの長さでコーティングされ、９０°Ｃの対流式オーブンで乾燥させた。このコーティング工程は、コーティングの厚みが６．５μｍになるまで繰り返された。コーティングされたＰＳＥＩプローブを抽出に使用する前に、ＭｅＯＨ／ＡＣＮ／ＩＰＡ（ｖ／ｖ／ｖ ２／１／１）混合液で１５分間洗浄し、次にＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）で１５分間コンディショニングした。
【0067】
例２で行ったすべての実験では、サンプルとして１０ｎｇ ｍＬ－１の標準物質をスパイクしたＰＢＳの３００μＬの一部溶液を使用した。抽出と脱離の間に、プローブをＨ２Ｏで３秒間洗浄し、空気乾燥させた。また、すべての実験で、その後のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のための脱着液として５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）を使用した。抽出と脱着はすべて静置し、室温で行った。
【0068】
ＰＢＳ中のコーティングされたＰＥＳＩプローブのＥＴＰは、以下の抽出時間で３回行った。１０分、３０分、６０分、９０分、１２０分。抽出の後、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄し、３０分間脱着した。
【0069】
ＰＢＳ中のコーティングされたＰＥＳＩプローブの脱着時間プロファイル（ＤＴＰ）は、最適な抽出時間を用いて抽出することで構築された。その後、以下の脱着時間帯で３回テストした。１０分、３０分、４５分、６０分、７５分。その後、２回目の脱着を１回目の直後に新しい脱着溶媒で７５分間実施した。２回目の脱着は、分析物のキャリーオーバーを評価するために使用された。
【0070】
プローブ内再現性は、最適化された抽出・脱離条件を用いて、コーティングされたＰＥＳＩプローブの抽出と脱離を５サイクル行うことで試験した。プローブ間再現性は、プローブ内再現性試験で得られたプローブを抽出と脱着サイクルでグループ化することにより求めた。
【0071】
例２では、サンプルとして１０ｎｇｍＬ－１の標準品をスパイクした３００μＬＰＢＳを用いて、室温で９０分間の静置抽出を行った。抽出後、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄し、コーティングされたＰＥＳＩプローブを空気乾燥させた。
【0072】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの脱着液は、乾燥抽出したプローブをＤＰｉＭＳ－８０６０のインターフェースに設置し、脱着液１０μＬをサンプルプレートに塗布することで最適化した。最後に、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを行った。テストした脱着溶液は、水と０．１％ギ酸を含む有機溶媒の比率を変化させた。使用した有機溶媒はＡＣＮ、ＩＰＡおよびＭｅＯＨである。
【0073】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによるコーティングＰＥＳＩプローブの枯渇をテストするために、コーティングＰＥＳＩプローブの抽出、洗浄、乾燥後に、以下の３つの異なるシナリオを使用した。
１）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために５０μＬＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着された。
２）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、最適化された脱着溶媒１０μＬを使用してＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに用いた。その後、コーティングしたＰＥＳＩプローブを５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
３）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、最適な脱着溶媒を使用してＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに２回連続で使用された。その後、５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
１）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために５０μＬＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着された。
２）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、最適化された脱着溶媒１０μＬを使用してＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに用いた。その後、コーティングしたＰＥＳＩプローブを５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
３）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、最適な脱着溶媒を使用してＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに２回連続で使用された。その後、５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）に３０分間静置脱着し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0074】
血漿に分析物をスパイクした全ての試料は、血漿と十分に結合させるため、４℃の冷蔵庫で一晩培養した。
【0075】
コーティングされたＰＥＳＩプローブの抽出時間プロファイルは、１０ｎｇｍＬ－１の標準物質をスパイクした３０μＬ血漿の一部溶液を用いて、以下の時点の静的抽出を実施した。１０分、３０分、４５分、６０分、７５分および９０分。抽出後、３秒間洗浄し、５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）で３０分間静置脱着し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0076】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて、血漿３０μＬを１０ｎｇｍＬ－１の内部標準物質で抽出し、以下の濃度の標準物質で検量線を得た。１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１。精度と正確性は、以下の濃度の標準物質を血漿に添加した３種類のＱＣレベルで測定された。３、３０および９０ｎｇｍＬ－１。キャリブレーションレベルおよびＱＣレベルごとに５つの複製を使用した。
【0077】
最初の主要な目的は、ＰＥＳＩプローブのコーティングの再現性を調査することであった。プローブ内外の再現性を調べる前に、ＦＴＰとＤＴＰを実施し、十分なシグナルが得られることと、分析物のキャリーオーバーが最小限に抑えられることを確認した。最初のＦＴＰでは、攪拌を試みたが、再現性が低かったため、静的抽出と脱離を行った。これは、コーティングされたＰＥＳＩプローブがサンプルや脱離溶媒に接触するのを制御できないためと考えられる。１０ｎｇｍＬ－１の標準物質を添加したＰＢＳから、１０～１２０分の範囲で静置抽出を行い、ＦＴＰを測定した。
ＦＴＰは図４に示されており、この結果に基づいて、化合物が平衡に達していないにもかかわらず、最適な抽出時間として９０分が選択された。９０分の静置抽出は、高感度を達成しつつ、プローブ間およびプローブ内の再現性を実用的な時間枠で実現するために、連続５回の抽出と脱着サイクルを完了できる最適な時間として使用された。ＤＴＰは、スパイクされたＰＢＳを９０分間静置抽出した後、以下の時間帯、１０分、３０分、４５分、６０分および７５分に脱離することにより測定した。分析物のキャリーオーバーを評価するために、２回目の静的脱離を行った。脱着時間プロファイル実験の結果、すべての分析物が１０分で定量的に脱着されることがわかった。しかし、キャリーオーバー試験では、プロプラノロールとブプレノルフィンがそれぞれ５．０％と５．３％と比較的高いキャリーオーバー率を示した以外は、すべての化合物が３．５％以下のキャリーオーバー率であることが示された。したがって、すべての化合物のキャリーオーバーが３．２％以下となる、３０分の脱着時間が最適な脱着時間であると判断された。
図４は、ＰＢＳ中の乱用薬物の抽出時間プロファイルである。（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルディアゼパム、（Ｇ）オキサゼパム、および（Ｈ）プロプラノロールが含まれている。３００μＬ ＰＢＳ（標準物質１０ｎｇｍＬ－１をスパイク、Ｎ＝３）に対して、以下の時点、１０分、３０分、６０分、９０分および１２０分の抽出を静的に実施した。脱着は、５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（４／１ ｖ／ｖ）を用いて６０分間静置して行った。分析は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで行った。
ＦＴＰは図４に示されており、この結果に基づいて、化合物が平衡に達していないにもかかわらず、最適な抽出時間として９０分が選択された。９０分の静置抽出は、高感度を達成しつつ、プローブ間およびプローブ内の再現性を実用的な時間枠で実現するために、連続５回の抽出と脱着サイクルを完了できる最適な時間として使用された。ＤＴＰは、スパイクされたＰＢＳを９０分間静置抽出した後、以下の時間帯、１０分、３０分、４５分、６０分および７５分に脱離することにより測定した。分析物のキャリーオーバーを評価するために、２回目の静的脱離を行った。脱着時間プロファイル実験の結果、すべての分析物が１０分で定量的に脱着されることがわかった。しかし、キャリーオーバー試験では、プロプラノロールとブプレノルフィンがそれぞれ５．０％と５．３％と比較的高いキャリーオーバー率を示した以外は、すべての化合物が３．５％以下のキャリーオーバー率であることが示された。したがって、すべての化合物のキャリーオーバーが３．２％以下となる、３０分の脱着時間が最適な脱着時間であると判断された。
図４は、ＰＢＳ中の乱用薬物の抽出時間プロファイルである。（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルディアゼパム、（Ｇ）オキサゼパム、および（Ｈ）プロプラノロールが含まれている。３００μＬ ＰＢＳ（標準物質１０ｎｇｍＬ－１をスパイク、Ｎ＝３）に対して、以下の時点、１０分、３０分、６０分、９０分および１２０分の抽出を静的に実施した。脱着は、５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（４／１ ｖ／ｖ）を用いて６０分間静置して行った。分析は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで行った。
【0078】
プローブ内再現性は、抽出時間９０分、脱着時間３０分で、連続５回の抽出と脱着サイクルで実施した。プローブ内再現性は、コーティングされたプローブの安定性とプローブの再利用性を観察するために使用された。表２．６に示すように、プローブ内再現性は良好であった。プローブ内再現性の良さは、相対標準偏差（ＲＳＤ）が１０％以下の場合が３４件、１０～１５％の場合が４件、１５～２０％の場合が２件であったことから実証された。プローブ間再現性は、プローブ内再現性の結果を抽出と脱着サイクルでグループ化することにより求めた。プローブ間再現性の結果は、表２．７に示すように、エッチングおよびコーティングプロセスの良好な再現性を示している。良好なプローブ間再現性は、ＲＳＤが１０％以下の場合が２６件、１０～１５％の場合が１１件、１５～２０％の場合が６件、ＲＳＤが２１％の場合が１件であることで示された。類似装置であるＳＰＭＥミニチップと比較した場合、プローブ間およびプローブ内の再現性は、当該文献値と同等またはそれ以下であった。Ｖａｓｉｌｊｅｖｉｃらは、２００ｎｇｍＬ－１のジアゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパムおよびロラゼパムを用いて、５回の抽出と脱着サイクルのＲＳＤを評価し、ＳＰＭＥミニチップのチップ内再現性を評価した。ＳＰＭＥ－ｍｉｎｉチップでは、前記化合物の２．１ＲＳＤ２０回のうち、１０％以下だったのは７回だけであった。一方、コーティングされたＰＥＳＩプローブでは、化合物のＲＳＤは２０個中１８個が１０％以下であった。ＳＰＭＥミニチップのチップ間再現性テストでは、ジアゼパム、ロラゼパム、ノルジアゼパムおよびオキサゼパム間の最小ＲＳＤは１８％であったが、コーティングされたＰＥＳＩプローブでは、前記化合物のＲＳＤは１６％と最も高い値であった。
【0079】
【表2.6】
【0080】
【表2.7】
【0081】
前記のＦＴＰによるＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの抽出条件を最適化した上で、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの脱着溶媒を最適化した。以下、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ３／２）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ２／３）、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、およびＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）の脱着溶媒をテストした。前記のすべての溶媒には、改質剤として０．１％ＦＡを添加した。
図５は、これらの実験の結果を正規化した面積カウントを用いて示している。面積カウントは、特定の化合物のすべての脱離溶媒の面積カウントを、最も高い平均面積カウントを与えた脱離溶媒で割ることによって正規化された。ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、およびＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）のデータは図５に含まれていない。
これらのデータポイントは、これらの脱着溶媒を使用した場合のスプレーイベントの発生に一貫性がないため、除外された。脱着溶媒ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ１／１）＋０．１％ＦＡは、８種類の化合物すべてで最高の面積カウントを得たため、最適な脱着溶媒として選択された。
ＣＢＳのようなＳＰＭＥベースのアンビエント質量分析技術とは異なり、使用される有機溶媒はＭｅＯＨと比較してＩＰＡであった。ピックアンドスプレー方式でコーティングされたＰＥＳＩプローブに適用される脱着溶媒の量は、脱着溶媒の表面張力と粘性に大きく影響される。表面張力と粘度の増加は、ＰＥＳＩプローブ表面に吸着保持される試料の量の増加と正の相関がある。また、脱着溶媒は、ＳＰＭＥＰＥＳＩプローブのコーティングを十分に濡らし、コーティングから脱着溶媒への分析物の移行を十分に行えるものでなければならない。
図５は、これらの実験の結果を正規化した面積カウントを用いて示している。面積カウントは、特定の化合物のすべての脱離溶媒の面積カウントを、最も高い平均面積カウントを与えた脱離溶媒で割ることによって正規化された。ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、およびＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）のデータは図５に含まれていない。
これらのデータポイントは、これらの脱着溶媒を使用した場合のスプレーイベントの発生に一貫性がないため、除外された。脱着溶媒ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ１／１）＋０．１％ＦＡは、８種類の化合物すべてで最高の面積カウントを得たため、最適な脱着溶媒として選択された。
ＣＢＳのようなＳＰＭＥベースのアンビエント質量分析技術とは異なり、使用される有機溶媒はＭｅＯＨと比較してＩＰＡであった。ピックアンドスプレー方式でコーティングされたＰＥＳＩプローブに適用される脱着溶媒の量は、脱着溶媒の表面張力と粘性に大きく影響される。表面張力と粘度の増加は、ＰＥＳＩプローブ表面に吸着保持される試料の量の増加と正の相関がある。また、脱着溶媒は、ＳＰＭＥＰＥＳＩプローブのコーティングを十分に濡らし、コーティングから脱着溶媒への分析物の移行を十分に行えるものでなければならない。
【0082】
図６には、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳとＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳのエレクトロスプレーパターンの違いを示したものである。コーティングされていないＰＥＳＩプローブの場合、シグナルの高さはほぼ一定である（図６Ｃ）。サンプルプレートにスパイクされた分析物をサンプリングしたときのコーティングされたＰＥＳＩプローブのシグナル高さは、コーティングされていないＰＥＳＩプローブと同様に、９秒台までシグナル高さの増加を示し、その後、シグナル高さは一定である（図６Ｂ）。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの実行中、スパイクされたＰＢＳを抽出すると、シグナルの高さが減少する（図６Ａ）。図６のＡにおけるこの減少の仮説は、コーティングされたＰＥＳＩプローブ上に抽出された分析物の著しい枯渇がＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ中に起こったというものである。
【0083】
図６は、フェンタニル（ｍ／ｚ ３３７．２）の選択イオンモニタリングによるピーク高さを示している。
（Ａ）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをスパイクした３００μＬのＰＢＳを９０分間静的抽出し、その後、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄した。次に、コーティングされたプローブは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによってＰＥＳＩサンプルプレートに適用された１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ｖ／ｖ）＋０．１％ＦＡを用いて脱離した。
（Ｂ）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにおいて１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋０．１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをサンプルプレートに適用した１％のＦＡをスパイク；および（Ｃ）１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをスパイクした０．１％のＦＡをサンプルプレートに塗布しＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに未改造ＰＥＳＩプローブが使用された。
（Ａ）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをスパイクした３００μＬのＰＢＳを９０分間静的抽出し、その後、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄した。次に、コーティングされたプローブは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによってＰＥＳＩサンプルプレートに適用された１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ｖ／ｖ）＋０．１％ＦＡを用いて脱離した。
（Ｂ）コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにおいて１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋０．１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをサンプルプレートに適用した１％のＦＡをスパイク；および（Ｃ）１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋１０ｎｇｍＬ－１フェンタニルをスパイクした０．１％のＦＡをサンプルプレートに塗布しＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに未改造ＰＥＳＩプローブが使用された。
【0084】
抽出したコーティングＰＥＳＩプローブがＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで著しく脱着されるかどうかというこの仮説を、スパイクしたＰＢＳサンプルの抽出と、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのための直接脱着、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ１回の実行とＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの脱着、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ２回連続実行とＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの脱着という３種類のシナリオのいずれかによってテストした。この実験の結果は、表２．８で脱離率として示されている。
脱離率は、ＳＰＭＥ－ＭＳ／ＭＳ実験を行わずにＬＣ－ＭＳ／ＭＳのために直接脱着したコーティングされたプローブによって与えられた面積カウントに対する相対値で表される（式１）。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実行で、与えられた化合物の少なくとも４５％の脱離が確認された。興味深いことに、２回の連続したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実行は、１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験と比較して、より大きな脱離率を示さない。脱離率は比較的似ている。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験を通して、シグナルの高さが急激に減少しているのは、実験の進行に伴いコーティング上の分析物が減少したためであると思われる。これは、表２．９にも示されており、２回目の連続したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランにおける面積カウントの減少が、式２によって計算された最初のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランの面積カウントに対して表されている。すべての分析対象物は、２回目のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランで面積カウントが少なくとも７７％減少していることがわかる。このことは、１回コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳおよびそれに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるスクリーニングおよび確認分析に用いることができないことを意味している。
脱離率は、ＳＰＭＥ－ＭＳ／ＭＳ実験を行わずにＬＣ－ＭＳ／ＭＳのために直接脱着したコーティングされたプローブによって与えられた面積カウントに対する相対値で表される（式１）。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実行で、与えられた化合物の少なくとも４５％の脱離が確認された。興味深いことに、２回の連続したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実行は、１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験と比較して、より大きな脱離率を示さない。脱離率は比較的似ている。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験を通して、シグナルの高さが急激に減少しているのは、実験の進行に伴いコーティング上の分析物が減少したためであると思われる。これは、表２．９にも示されており、２回目の連続したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランにおける面積カウントの減少が、式２によって計算された最初のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランの面積カウントに対して表されている。すべての分析対象物は、２回目のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランで面積カウントが少なくとも７７％減少していることがわかる。このことは、１回コーティングされたＰＥＳＩプローブは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳおよびそれに続くＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるスクリーニングおよび確認分析に用いることができないことを意味している。
【0085】
【表2.8】
【式１】
【0086】
【0087】
【表2.9】
【式２】
【0088】
【0089】
図６のＡで示したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの信号の形状は、１回のピックおよびスプレーでは分析物の完全な脱着ができないためである。コーティングから脱着溶媒への分析物の脱着は分配プロセスであり、平衡状態において以下の式が適用される。
【式３】
【0090】
【式４】
【0091】
【0092】
式３から、コーティングされたＰＥＳＩプローブから脱着する分析物の割合、Ｅｌｕ、は、コーティング体積、Ｖｆ、が一定のコーティングＰＥＳＩプローブを使用した場合、脱離溶媒体積、Ｖｅ、によって大きく規定される。この式から、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、コーティング体積に比べて脱離溶媒の体積が比較的大きいため、ほぼすべての分析対象物が脱離溶媒に脱着されることになる。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの場合、１回のピックアンドスプレーで脱着されるのはごく一部の成分のみである（式４）。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで吸着した脱離溶媒の量は、おそらくＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで吸着したサンプルの量と同じ範囲であり、ＰＬレンジである。このことは、コーティングされたＰＥＳＩプローブの各ピック＆スプレーが、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳでの連続使用とその後のＬＣ－ＭＳ／ＭＳランでのシグナルの両方について観察可能なシグナルを有することを説明する。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳのためのわずか数回のピックアンドスプレーサイクルにおけるピーク面積およびピ－ク高さの減少は、式４で記述されるように、ピックアンドスプレーサイクル間でピックした脱離量が一定であれば、コーティングされたＰＥＳＩプローブ上に残る分析物のモルに関連づけることができる。その後の脱着は、コーティングされたＰＥＳＩプローブに残留する分析物のモル数が少なくなるため、脱離溶媒中の分析物濃度、Ｃｅ、も減少することになる。
【0093】
次に、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを少量の血漿中の乱用薬物の定量に適用した。血漿を使用する目的は、複雑なマトリックスから分析物を定量することである。マトリックスの成分は分析物と結合し、たとえ適量の抽出であってもイオンサプレッションを引き起こす可能性がある。３０μＬのスパイク血漿のＦＴＰを実施したところ、ほとんどの化合物がこの時点で平衡に達したため、図７に示すように最適時間６０分以内に結果が得られた。
図７は、少量の（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルジアゼパム、（Ｇ）オキサゼパムおよび（Ｈ）プロプラノロールの血漿サンプルからの乱用薬物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる抽出時間プロファイルを示したものである。
図７は、少量の（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルジアゼパム、（Ｇ）オキサゼパムおよび（Ｈ）プロプラノロールの血漿サンプルからの乱用薬物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる抽出時間プロファイルを示したものである。
【0094】
その後、１レベルあたり５反復の７種類の検量線が構築された。構築された検量線は、１／ｘの係数で重み付けされた。表２．１０に最良適合直線の係数を、表２．１１に必要なその他の数値を示す。
図８は８種類の乱用薬物の検量線である。日内および日間の精度および正確さは、低、中、高（３、３０、９０ｎｇｍＬ－１）の３つのレベルを用いて、各レベルに５回繰り返し測定して評価した。
図８は、血漿の少量サンプル、（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルジアゼパム、（Ｇ）オキサゼパムおよび（Ｈ）プロプラノロール、から乱用薬物を抽出し、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで分析した検量線である。検量線は直線性を示し、Ｒ２はすべて０．９８００以上、Ｒ２は０．９９００以上を示す検量線が６本あった。乱用薬物のＬＯＱは、Ｓ／Ｎ比が１０以上の最も低い検量点を決定することで算出した。ノルジアゼパムとフェンタニルのＬＯＱは１ｎｇｍＬ－１であった。ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、ロラゼパム、プロプラノロールのＬＯＱは５ｎｇｍＬ－１であった。オキサゼパムのＬＯＱは１０ｎｇｍＬ－１であった。それぞれのＬＯＱを超える濃度では、すべての化合物で日内予測値が１５％未満であった。
日間精度はそれぞれ１６％および２７％であった中濃度のロラゼパムと高濃度のオキサゼパムを除き、すべての化合物で１５％以下であった。また、ＬＯＱ以上の濃度では、中程度のロラゼパムが１２２％であった以外は、すべての化合物で８０～１２０％の精度が得られた。
図８は８種類の乱用薬物の検量線である。日内および日間の精度および正確さは、低、中、高（３、３０、９０ｎｇｍＬ－１）の３つのレベルを用いて、各レベルに５回繰り返し測定して評価した。
図８は、血漿の少量サンプル、（Ａ）ブプレノルフィン、（Ｂ）コデイン、（Ｃ）ジアゼパム、（Ｄ）フェンタニル、（Ｅ）ロラゼパム、（Ｆ）ノルジアゼパム、（Ｇ）オキサゼパムおよび（Ｈ）プロプラノロール、から乱用薬物を抽出し、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで分析した検量線である。検量線は直線性を示し、Ｒ２はすべて０．９８００以上、Ｒ２は０．９９００以上を示す検量線が６本あった。乱用薬物のＬＯＱは、Ｓ／Ｎ比が１０以上の最も低い検量点を決定することで算出した。ノルジアゼパムとフェンタニルのＬＯＱは１ｎｇｍＬ－１であった。ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、ロラゼパム、プロプラノロールのＬＯＱは５ｎｇｍＬ－１であった。オキサゼパムのＬＯＱは１０ｎｇｍＬ－１であった。それぞれのＬＯＱを超える濃度では、すべての化合物で日内予測値が１５％未満であった。
日間精度はそれぞれ１６％および２７％であった中濃度のロラゼパムと高濃度のオキサゼパムを除き、すべての化合物で１５％以下であった。また、ＬＯＱ以上の濃度では、中程度のロラゼパムが１２２％であった以外は、すべての化合物で８０～１２０％の精度が得られた。
【0095】
【表2.10】
【0096】
【表2.11】
【0097】
例２では、最初の調査として、どの脱離溶媒が最良のシグナルを与えるか、またこれらに影響を与える要因を検討した。第２の調査は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳが抽出されたプロ－ブを枯渇させることを証明し、イオンクロマトグラムが減衰曲線の形状に類似する理由を探究することであった。３つ目の調査は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを使用して検量線を作成できるかどうかを証明することであった。
その後、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは、前処理工程を追加することなく少量の血漿から乱用薬物を分析することに使用できた。Ｒ２値で測定した直線性は、８種類の乱用薬物のうち６種類で０．９９００を超え、残りの２種類では０．９８００を超えるＲ２値が観察された。フェンタニルおよびノルジアゼパムのＬＯＱは１ｎｇｍＬ－１であり、ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、ロラゼパムおよびプロプラノロールのＬＯＱは５ｎｇｍＬ－１であり、オキサゼパムのＬＯＱは１０ｎｇｍＬ－１であった。
その後、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは、前処理工程を追加することなく少量の血漿から乱用薬物を分析することに使用できた。Ｒ２値で測定した直線性は、８種類の乱用薬物のうち６種類で０．９９００を超え、残りの２種類では０．９８００を超えるＲ２値が観察された。フェンタニルおよびノルジアゼパムのＬＯＱは１ｎｇｍＬ－１であり、ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、ロラゼパムおよびプロプラノロールのＬＯＱは５ｎｇｍＬ－１であり、オキサゼパムのＬＯＱは１０ｎｇｍＬ－１であった。
【0098】
［例３］
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより、遊離濃度またはＰＰＢが得られる。この技術を使用する根拠は２つある。第一の理由は、例えばＣＢＳのような他のＳＰＭＥベースのＡＩ／ＭＳ技術では、薬物とマトリックスの間の均衡を乱すような、より大きな抽出相を使用するためである。ほとんどのＳＰＭＥベースのＡＩＭＳ技術では、ごくわずかな量の治療薬を抽出するために必要なサンプル量（回収率１％未満）は、一般に臨床例では実用的でない。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの場合、コーティングは比較的小さいため、これまでの研究結果によれば、サンプルから標的薬剤が枯渇する可能性は低くなる。次に、ナノＥＳＩエミッターを使用して小さなＳＰＭＥファイバーを直接／ＭＳに結合させることは、目詰まりの可能性がある。一方、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは目詰まりの心配がない。ＡＩＭＳによるＰＰＢの測定は、本論文の執筆中であり、まだ論文として報告されていない。
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳにより、遊離濃度またはＰＰＢが得られる。この技術を使用する根拠は２つある。第一の理由は、例えばＣＢＳのような他のＳＰＭＥベースのＡＩ／ＭＳ技術では、薬物とマトリックスの間の均衡を乱すような、より大きな抽出相を使用するためである。ほとんどのＳＰＭＥベースのＡＩＭＳ技術では、ごくわずかな量の治療薬を抽出するために必要なサンプル量（回収率１％未満）は、一般に臨床例では実用的でない。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの場合、コーティングは比較的小さいため、これまでの研究結果によれば、サンプルから標的薬剤が枯渇する可能性は低くなる。次に、ナノＥＳＩエミッターを使用して小さなＳＰＭＥファイバーを直接／ＭＳに結合させることは、目詰まりの可能性がある。一方、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは目詰まりの心配がない。ＡＩＭＳによるＰＰＢの測定は、本論文の執筆中であり、まだ論文として報告されていない。
【0099】
ＬＣ－ＭＳグレードのＡＣＮ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨ、Ｈ２ＯはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）から直接購入した。ＦＡ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、リン酸ナトリウム二塩基、塩酸、ＨＰＬＣグレードのＭｅＯＨはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。次の化学物質は、特に１．３μｍＨＬＢ粒子の合成のためにＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した、ジビニルベンゼン、Ｎ－ビニルピロリドン、および２、２－アゾビス（イソブチロニトリル）である。ジアゼパムおよびジアゼパム－ｄ６は、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲｏｕｎｄＲｏｃｋ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを用いた凍結プール性、非濾過ヒト血漿は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。
【0100】
ジアゼパムおよびジアゼパム－ｄ６の原液からメタノ－ル系の作業標準液を調製した。血漿およびＰＢＳサンプルは、有機ワーキングスタンダードを１％以上添加しないようにスパイクした。これは、コーティングされたプローブとサンプル間の平衡定数または分析対象物の血漿タンパク質結合のいずれにも測定上影響を与える可能性のあるマトリックスの変化が生じないようにするためである。ワーキングスタンダードは－８０°Ｃで保管した。すべての血漿検体に分析物を添加した後、血漿と十分に結合させるために４°Ｃで最低１２時間培養した。
【0101】
ＰＥＳＩプローブのディップコーティングには、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のモーター付き内製ステージ（ＭＴＳ５０／Ｍ－Ｚ８Ｅ、５０ｍｍ）を使用した。静置抽出の際に温度を３７°Ｃに維持する場合は、ＶＷＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈａｋｅ Ｔｏｕｃｈベンチトップ攪拌機を使用した。抽出前に、血漿またはＰＢＳを３７°Ｃに加温し、ベンチトップ型攪拌機で攪拌しない状態で３０分放置した。
【0102】
例３のＬＣ－ＭＳ／ＭＳの装置および方法は、例２と同様である。唯一の変更は、ジアゼパムおよびジアゼパム－ｄ６のトランジションのみを使用したことである。ＰＥＳＩプローブのコーティング手順については、前記の例２を参照されたい。
【0103】
ＰＢＳまたは血漿中のコーティングされたＰＥＳＩプローブのＦＴＰは、１０ｎｇｍＬ－１のジアゼパムをスパイクした１．５ｍＬの一部溶液を３７°Ｃに保持し、以下の時点の静置抽出を３回行い測定した。１０分、３０分、４５分、６０分、７５分および９０分。抽出後、プローブをＨ２Ｏで３秒間洗浄し、５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）で３０分間静的脱着した。その後、抽出物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。ＰＰＢは、以下の式で算出した。
【式５】
【0104】
【0105】
１．５ｍＬのＰＢＳに濃度、０．０５、０．１、０．２５、１、５、１０および２５ｎｇｍＬ－１のジアゼパムを添加し、３７°Ｃで６０分間の静置抽出を行い、ＩＳ補正と１／ｘの重み付けをした検量線を作成した（Ｎ＝５）。２５ｎｇｍＬ－１のジアゼパムを添加した１．５ｍＬの血漿（Ｎ＝５）も前記抽出条件で分析した。抽出後、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄した後、風乾した。乾燥したプローブは、１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）＋０．１％ＦＡを用いてＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに使用された。ＰＢＳ抽出物から構築した検量線を用いて、式５により血漿試料からのジアゼパムの遊離濃度を算出した。
【0106】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる実験を開始する前に、コーティングされたＰＥＳＩプローブによるヒト血漿中のジアゼパムのＰＰＢ測定能力をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって評価した。図９に示すように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験からＰＢＳと血漿のＦＴＰが構築された。図９のＡから、３７°ＣにおけるＰＢＳからのジアゼパムの静置抽出の平衡時間は約６０分であった。図９のＢから、３７°Ｃにおける血漿からのジアゼパムの静置抽出の平衡時間は約３０分であった。ＰＢＳおよび血漿からのジアゼパムの回収率は、装置検量線を用いて算出した６０分時点のコーティングＰＥＳＩプローブによる抽出量ｎｇを、サンプルに添加したジアゼパムのｎｇで割ることにより算出した。６０分後のＰＢＳおよび血漿からのジアゼパムの回収率は、それぞれ０．９０％および０．０１５％であった。これは、サンプルの枯渇を防ぐために推奨される回収限界の１％を下回っている。サンプルからの分析対象物の枯渇は、マトリックス中の分析対象物の遊離濃度と結合濃度の間の「真の」平衡状態を変化させる可能性がある。これは、新しい平衡が実際の遊離濃度とＰＰＢを反映しないため、最終的にＰＰＢの不正確な決定につながる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で得られたジアゼパムのＰＰＢは、時点６０分、７５分、９０分においてそれぞれ９８．４±０．５％、９８．２±０．２％、９８．４±０．２％であった。これは、機器校正から算出した抽出ジアゼパム濃度を用いて、式３により算出したものである。文献値と比較すると、ヒト血漿中のＰＰＢは９７～９９％と報告されており、ほぼ一致している。
このことから、コーティングされたＰＥＳＩプローブによるＰＰＢ測定が可能であることがＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより確認された。したがって、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによるＰＰＢ実験が可能である。
このことから、コーティングされたＰＥＳＩプローブによるＰＰＢ測定が可能であることがＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより確認された。したがって、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによるＰＰＢ実験が可能である。
【0107】
スパイクしたＰＢＳをジアゼパムで抽出し、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳで作成した検量線（図１０）を用いて、同じ抽出時間で先の例２で算出したＰＰＢ９８．４±０．５％と同程度の９９．３±０．２％を算出した。検量線は、Ｒ２０．９９４７、ＲＳＤ＜１４％に基づく高い直線性を有していた。ＰＰＢの算出に使用した血漿とＰＢＳからのジアゼパムの濃度は、図１０からの線形回帰を用いて算出した。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによるジアゼパムのＰＰＢ算出値は、文献値９７～９９％の範囲内であった。
【0108】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳで生成されたＰＰＢ値はそれぞれ９９．３±０．２％と９８．４±０．５％であり、報告文献値との一致度は９７～９９％である。したがってＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳはＰＰＢを正確に算出し、ジアゼパムの遊離濃度を決定する有効なツールであることが証明された。したがって、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは、ＰＰＢを正確に算出し、ジアゼパムの遊離濃度を決定するための有効なツールであることが実証された。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法と比較して、遊離濃度を決定でき、スループットが高く、ワークフロー時間が短いＡＩＭＳワークフローを実施できることは、総濃度の決定に依存する現在の治療薬モニタリング手法に代わる魅力的な選択肢となる。
【0109】
［例４］
例４では、タンパク質合成を阻害する広域抗生物質の一種であるアミノグリコシドを用いて、プローブのテストを行った。アミノグリコシドは一般に、図１１に示すように、少なくとも２つのアミノ糖をグリコシド結合を介してアミノシクリトール環で連結していることが特徴である。これらの化合物は非常に親水性が高く、水溶性も高いため、最初に臨床的に使用された抗生物質の一つである。
しかし、蝸牛毒性、腎毒性、耳毒性、前庭毒性を有することから、毒性の低い抗生物質へと処方がシフトしていった。しかし、近年、多剤耐性菌の増加やアミノグリコシド系抗生物質の用法・用量に関する理解から、臨床での処方が増加する傾向にある。アミノグリコシド系抗菌薬は、臨床で使用される際には毒性副作用の軽減に役立つ一方、家畜用の動物用医薬品として広く使用されている。動物用医薬品は、現代の農業において、感染症の治療や感染予防のために使用されている。アミノグリコシドは動物用医薬品として誤用された場合、食品中に残留していることがある。このような残留レベルにもかかわらず、アミノ配糖体の毒性は人体へのリスクを有している可能性がある。アミノ配糖体の動物用医薬品としての誤用を規制するため、各国は理事会指令９６／２３／ＥＣなどの規制のような、各国はこれらの化合物の使用を規制している。
例４では、タンパク質合成を阻害する広域抗生物質の一種であるアミノグリコシドを用いて、プローブのテストを行った。アミノグリコシドは一般に、図１１に示すように、少なくとも２つのアミノ糖をグリコシド結合を介してアミノシクリトール環で連結していることが特徴である。これらの化合物は非常に親水性が高く、水溶性も高いため、最初に臨床的に使用された抗生物質の一つである。
しかし、蝸牛毒性、腎毒性、耳毒性、前庭毒性を有することから、毒性の低い抗生物質へと処方がシフトしていった。しかし、近年、多剤耐性菌の増加やアミノグリコシド系抗生物質の用法・用量に関する理解から、臨床での処方が増加する傾向にある。アミノグリコシド系抗菌薬は、臨床で使用される際には毒性副作用の軽減に役立つ一方、家畜用の動物用医薬品として広く使用されている。動物用医薬品は、現代の農業において、感染症の治療や感染予防のために使用されている。アミノグリコシドは動物用医薬品として誤用された場合、食品中に残留していることがある。このような残留レベルにもかかわらず、アミノ配糖体の毒性は人体へのリスクを有している可能性がある。アミノ配糖体の動物用医薬品としての誤用を規制するため、各国は理事会指令９６／２３／ＥＣなどの規制のような、各国はこれらの化合物の使用を規制している。
【0110】
アミノ配糖体は代謝されない物質であるため、生物はその相当量を環境中に排泄している。病院や製薬会社からの排出、下水処理場での不完全な除去などの別の源もあり、農業や養殖業での広範囲な乱用など、環境中に相当量のアミノグリコシドを放出されている。水生環境、特に飲料水中に存在することは潜在的なリスクであると考えられている。様々な種類の水試料の品質の確保を確実とするために、水環境および排水中のアミノ配糖体の存在をモニタリングすることが重要視されている。水環境、特に排水中のアミノ配糖体の残存量をモニタリングすることで、アミノ配糖体の使用状況や細菌のアミノ配糖体耐性の上昇をよりよく理解することができる。一方、アミノ配糖体は親水性で水溶性のため、水環境中のモニタリングは困難な仕事である。臨床検体、食品、水の３分野すべてにおいて、アミノグリコシドの検出、モニタリングおよび定量が、目的に応じた分析法の開発を促している。
【0111】
アミノグリコシド系化合物の分析法は、その特性の組み合わせから、定性および定量的なモニタリングを行うことが困難である。発色団や蛍光団がないため、誘導体化処理を行わないとＵＶや蛍光のような検出器の使用が困難である。アミノ配糖体が持つ複数のアミノ基とヒドロキシル基は、高い親水性の原因となり、多座配糖体法への組み込みを難しくしている。
このことは、Ｄｅｓｍａｒｃｈｅｌｉｅｒらによって発表された一連の論文で強調されており、アミノグリコシドの定量には、他の動物用医薬品とは全く異なるサンプル調製と適切なスクリーニングのためのＬＣメソッドが必要であることが示されている。複数のアミノグリコシドをＬＣ－ＭＳで測定する場合、分離にはイオンペアリングまたは親水性相互作用液体クロマトグラフ（ＨＩＬＩＣ）を使用する傾向がある。
イオンペア試薬の欠点は、ＬＣ－ＭＳからの除去が困難であること、通常揮発しないこと、イオンサプレッションを引き起こすこと、イオン源を封じ込めることなどが挙げられる。ＨＩＬＩＣカラムの欠点は、特にアミノグリコシドの適切な分離のためには、ＦＡに加えて高濃度の塩が必要とされる双性イオンカラムの使用に起因する。このような欠点には、塩の沈殿につながる高濃度の塩の使用、アミノグリコシドの溶解度を低下させる高い有機溶媒比率、および長い平衡化時間などがある。
アミノ配糖体分析の場合、イオンペアリングとＨＩＬＩＣの両方の欠点は、全体としてＬＣ－ＭＳシステムのメンテナンスの増加と操作可能な時間の減少につながる。これらの問題を克服するために、ＡＩＭＳはアミノグリコシドの存在を判定するためのスクリーニングツールとして使用することができる。
クロマトグラフィーを使用せず、ワークフロー時間が短いため、高濃度の塩やイオンペア試薬を使用せず、ＬＣ－ＭＳを用いたスクリーニング法よりも経済的な方法である。適切な感度を得るために、サンプル前処理として分析対象物の予備濃縮と抽出が行われる。
このことは、Ｄｅｓｍａｒｃｈｅｌｉｅｒらによって発表された一連の論文で強調されており、アミノグリコシドの定量には、他の動物用医薬品とは全く異なるサンプル調製と適切なスクリーニングのためのＬＣメソッドが必要であることが示されている。複数のアミノグリコシドをＬＣ－ＭＳで測定する場合、分離にはイオンペアリングまたは親水性相互作用液体クロマトグラフ（ＨＩＬＩＣ）を使用する傾向がある。
イオンペア試薬の欠点は、ＬＣ－ＭＳからの除去が困難であること、通常揮発しないこと、イオンサプレッションを引き起こすこと、イオン源を封じ込めることなどが挙げられる。ＨＩＬＩＣカラムの欠点は、特にアミノグリコシドの適切な分離のためには、ＦＡに加えて高濃度の塩が必要とされる双性イオンカラムの使用に起因する。このような欠点には、塩の沈殿につながる高濃度の塩の使用、アミノグリコシドの溶解度を低下させる高い有機溶媒比率、および長い平衡化時間などがある。
アミノ配糖体分析の場合、イオンペアリングとＨＩＬＩＣの両方の欠点は、全体としてＬＣ－ＭＳシステムのメンテナンスの増加と操作可能な時間の減少につながる。これらの問題を克服するために、ＡＩＭＳはアミノグリコシドの存在を判定するためのスクリーニングツールとして使用することができる。
クロマトグラフィーを使用せず、ワークフロー時間が短いため、高濃度の塩やイオンペア試薬を使用せず、ＬＣ－ＭＳを用いたスクリーニング法よりも経済的な方法である。適切な感度を得るために、サンプル前処理として分析対象物の予備濃縮と抽出が行われる。
【0112】
例４では、水中のアミノグリコシドを定性的にスクリーニングするために、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを開発した。ＳＰＭＥ技術によるアミノグリコシドの検出は、まばらである。アミノグリコシドは親水性であるため、特殊なコーティングが必要である。本研究では、ＰＥＳＩプローブのコーティングに窒素リッチな有機ポリマーを用い、水中のアミノグリコシドのスクリーニングのために様々なパラメータを最適化した。
【0113】
ＬＣ－ＭＳグレードの化学物質はＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｃｅｔｏｎｅ、ＡＣＮ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、試薬グレードのジメチルスフォキシド（ＤＭＳＯ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。酢酸、ＦＡ、塩酸、ＬＣグレードＭｅＯＨ、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ＰＥＳＩプローブおよびサンプルプレートは、株式会社島津製作所（京都、日本）より寄贈された。
【0114】
以下の固体標準物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から直接購入した。アミカシン、アプラマイシン硫酸塩、ジヒドロストレプトマイシン硫酸塩、ハイグロマイシンＢ、ゲンタマイシン硫酸塩、カナマイシンＡ硫酸、シソマイシン硫酸、スペクトロマイシン硫酸、ストレプトマイシン硫酸、およびトブラマイシン、固体標準物質の単体マスターストックは、遊離塩基濃度が２ｍｇｍＬ－１となるように水に溶解して作製した。マスターストックは－２０°Ｃで保存した。このマスタ－ストックを連続的に希釈し、１００μｇｍＬ－１のアミノグリコシドのワーキングストックを作製した。なお、アミノグリコシドを含む標準品および試料は、ガラスとの吸着によるアミノグリコシドの損失を防ぐため、すべてポリプロピレン製の容器に保管した。
【0115】
酢酸緩衝液は、酢酸ナトリウム１．８ｇと酢酸４．６ｍＬを５００ｍＬのＨ２Ｏで混合して調製した。酢酸バッファーのｐＨは、所望のｐＨに達するまで酢酸を追加で滴下してｐＨ４に調整した。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６）は、２．４ｇの第二リン酸カリウムと１１．８ｇの第一リン酸カリウムを５００ｍＬのＨ２Ｏ中で混合することによって調製された。このリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６）に、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを前記ｐＨになるまで滴下してｐＨを６に調整した。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７）は、５００ｍＬのＨ２Ｏに、二塩基性リン酸カリウム９．４ｇおよび一塩基性リン酸カリウム６．３ｇを混合することにより調製した。このリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７）に、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを当該ｐＨになるまで滴下してｐＨを７に調整した。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８）は、リン酸二カリウム１６．３ｇとリン酸一カリウム０．８９ｇを５００ｍＬのＨ２Ｏ中で混合することにより調製した。このリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８）に、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを前記ｐＨになるまで滴下してｐＨを８まで調整した。炭酸ナトリウム緩衝液は、炭酸水素ナトリウム３．９ｇと炭酸ナトリウム５．７ｇを５００ｍＬのＨ２Ｏに混ぜて調製した。炭酸ナトリウムバッファーは、１．０Ｍ水酸化ナトリウムを前記ｐＨに達するまで滴下してｐＨ１０に調整した。
【0116】
例４のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの装置および方法は、例２と同様である。唯一の変更は、表２．１の代わりに、以下のＭＳ変換表４．１を使用したことである。
【0117】
【表4.1】
【0118】
また、ＰＥＳＩプローブのコーティング手順については、例２を参照のこと。例２で詳細に説明した方法から２つの変更を行った。第一に、合成した１．３μｍＨＬＢ粒子の代わりに、窒素リッチポリマー材料を使用した。第二に、コーティング工程は、６．５μｍのコーティング厚さと２ｍｍの長さの代わりに、１１．５μｍの半径と３ｍｍの長さを持つコーティング厚さが達成されるまで繰り返された。
【0119】
すべてのスクリーニング条件の最適化において、修正後の最終サンプル７５０μＬを３回の９０分の静置抽出に使用した。抽出後、プローブは室温で乾燥させた。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは、ｐＨ調整とマトリックス修飾実験のために、１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ、１／１）＋０．１％ＦＡを脱着溶媒として使用した。水試料のｐＨは、ギ酸またはＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンと同様に、緩衝塩を用いてｐＨ４、６、７、８および１０に調整した。ｐＨを変更した水試料中のアミノグリコシドの濃度は、３００ｎｇｍＬ－１であった。マトリックス修飾実験では、最初に、水にアミノグリコシドを３００ｎｇｍＬ－１含むようにスパイクした。スパイクされた水は、アセトン、ＡＣＮ、ＤＭＳＯ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨなどの有機溶媒と混合され、最終サンプルはスパイクされた水と溶媒を体積比で５０／５０の割合で含むようにした。さらに、３００ｎｇｍＬ－１のアミノグリコシドを添加した水試料を、ＤＭＳＯ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨと異なる容量比（１／３、１／１、３／１）で添加し、マトリックス改質実験を行った。
【0120】
脱着溶媒の最適化実験では、ＩＰＡをスパイク水に、最終的なサンプルが３／１ ＩＰＡ／ｓｐｉｋｅｄ ｗａｔｅｒ（ｖ／ｖ）となるように修飾した。抽出後、異なる組成のＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（（ｖ／ｖ、４／１）、（ｖ／ｖ、７／３）、（ｖ／ｖ、３／２）、（ｖ／ｖ、１／１）全て０．１％ＦＡ含有）をコーティングしたＰＥＳＩプローブから分析物を脱離する脱離溶媒としてテストした。
【0121】
洗浄の検討では、脱着溶媒の最適化と同じマトリックス変更を行い、水を水洗溶媒として使用した。洗浄は抽出後すぐに３秒間行った。脱着には、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析用に最適化された脱着溶媒を使用した。
【0122】
抽出試料のｐＨはＳＰＭＥメソッド開発において、特に水系試料から抽出する場合に重要なファクターとなる。その理由は、ＳＰＭＥプロセス中に未分離または中性の分析物のみが抽出されるからである。したがって、コーティングされたプローブの抽出効率が最も高いｐＨは、中性のアミノグリコシドの割合を最も多く確保し、結果として最も高い感度を得ることができる。アミノグリコシドを添加した水性試料のｐＨは４から１０の範囲で調整した。
【0123】
０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４）、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６）、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７）、０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８）および０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝１０）を用いて、ｐＨ調整実験を行った。これらの緩衝液にアミノグリコシドを３００ｎｇｍＬ－１でスパイクした。９０分の抽出の後、シグナルが得られなかったため、結果は含まれていない。この結果は、緩衝液からアミノグリコシドが抽出されなかったことを意味すると思われる。この原因は、緩衝液の金属イオンがアミノ配糖体のアミノ基や水酸基とキレートを形成しているためと考えられる。そのため、抽出相と相互作用するアミノグリコシドの活性官能基が阻害され、分析対象物が抽出されず、その結果、分析対象物の反応も見られないと考えられる。前記の実験と関連文献は、異なる塩濃度の添加は、水性媒体中のアミノグリコシドの抽出効率にとって有害であると結論付けており、これは文献と一致する。従って、塩の効果を確認するための実験は行わなかった。
【0124】
無機緩衝塩はアミノグリコシドの抽出に有害であることが証明されているので、試料のｐＨを所望のレベルに調整するために、有機酸または塩基を用いてさらなるｐＨ実験を実施した。スパイクした水性試料のｐＨは、ＦＡまたはＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを適宜用いて４、６、７、８および１０に調整した。調整したｐＨ値で９０分間静置抽出を行ったところ、アミノグリコシド類で有意な反応が得られた。このことから、ｐＨ最適化実験の失敗で使用した緩衝液の無機塩による有害な影響が確認された。
図１２は、試料のｐＨを変化させた場合の結果を、個々の化合物に対して最も高い応答を示した条件で規格化し、表したものである。その結果、すべてのアミノグリコシド化合物の応答は、ｐＨ４からｐＨ６まで増加し、その後、ｐＨ７と８でアプラマイシンを除いて応答がわずかに増加することが示された。ｐＨ７から８付近では、ほとんどのアミノグリコシドがそのアミノ基のＰＫａ値に近いかそれ以上である。従って、それぞれの中性種の個体数は多くなる。２つの顕著な例外は、ジヒドロストレプトマイシンとストレプトマイシンである。これら２つのアミノグリコシドは、ｐＨをさらにｐＨ１０まで上げると、５倍になった。一方、他のアミノグリコシドはすべて、ｐＨ８から１０に移行すると反応が鈍くなる。これは、水酸基が脱プロトン化し、中性種が減少したためと考えられる。ジヒドロストレプトマイシンおよびストレプトマイシンのアミノ基のＰＫａ値は、他のアミノグリコシドに比べ高い傾向にある。ジヒドロストレプトマイシンおよびストレプトマイシンを除くすべてのアミノグリコシドの適切な抽出となるために、反応に基づいて、６から８の間のｐＨ範囲が許容可能である。残念ながら、ジヒドロストレプトマイシンとストレプトマイシンのｐＨを最適化すると、他のすべてのアミノグリコシドの反応が劇的に低下するため、これは受け入れられない。
図１２は、試料のｐＨを変化させた場合の結果を、個々の化合物に対して最も高い応答を示した条件で規格化し、表したものである。その結果、すべてのアミノグリコシド化合物の応答は、ｐＨ４からｐＨ６まで増加し、その後、ｐＨ７と８でアプラマイシンを除いて応答がわずかに増加することが示された。ｐＨ７から８付近では、ほとんどのアミノグリコシドがそのアミノ基のＰＫａ値に近いかそれ以上である。従って、それぞれの中性種の個体数は多くなる。２つの顕著な例外は、ジヒドロストレプトマイシンとストレプトマイシンである。これら２つのアミノグリコシドは、ｐＨをさらにｐＨ１０まで上げると、５倍になった。一方、他のアミノグリコシドはすべて、ｐＨ８から１０に移行すると反応が鈍くなる。これは、水酸基が脱プロトン化し、中性種が減少したためと考えられる。ジヒドロストレプトマイシンおよびストレプトマイシンのアミノ基のＰＫａ値は、他のアミノグリコシドに比べ高い傾向にある。ジヒドロストレプトマイシンおよびストレプトマイシンを除くすべてのアミノグリコシドの適切な抽出となるために、反応に基づいて、６から８の間のｐＨ範囲が許容可能である。残念ながら、ジヒドロストレプトマイシンとストレプトマイシンのｐＨを最適化すると、他のすべてのアミノグリコシドの反応が劇的に低下するため、これは受け入れられない。
【0125】
ｐＨ実験の結果から、水性試料からすべてのアミノグリコシドに対する適切な感度を得るためには、ｐＨ調整だけでは不十分であることが示唆された。アミノグリコシドに対する反応を高めるためには、追加のパラメ－タが必要である。そこで、抽出効率を上げるために５０％ＡＣＮで試料を修飾したＷａｎｇらに基づき、有機修飾剤を導入してスパイクされた水性マトリックスを修飾した。
【0126】
水系マトリックスでは、水の極性および溶媒和効果はアミノグリコシドの全体的な抽出効率にマイナスの影響を与えることになる。そこで、これら２つの要因の影響を同時に調べ、これらの影響を克服するために、異なる水混和性有機溶媒を修飾剤として使用した。等量のアセトン、ＡＣＮ、ＩＰＡ、ＭｅＯＨおよびＤＭＳＯを、３００ｎｇｍＬ－１のアミノグリコシドを添加した等量の水と混合した。これらの水修飾マトリックスの抽出効率は、修飾されていないスパイク水マトリックスと比較した。その結果を図１３に示す。最終濃度が１５０ｎｇｍＬ－１であるにもかかわらず、修飾水マトリックスは、最終濃度が３００ｎｇｍＬ－１である非修飾水マトリックスと同等以上の応答を示す傾向がある。
【0127】
図１３は、（Ａ）ＡＣＮ＆ＭｅＯＨ、（Ｂ）ＩＰＡ＆ＭｅＯＨ、（Ｃ）アセトン＆ＤＭＳＯ、（Ｄ）アセトン＆ＭｅＯＨのマトリックス修飾を調べたものである。図１３の（Ａ）から明らかなように、いずれも極性溶媒であるＡＣＮとＭｅＯＨは、対象となるすべての分析物に対して、装置応答を著しく増大させた。これは、両有機修飾剤が水性試料の極性と溶媒和効果を低下させ（Ｈ２Ｏの極性は１０．２）、最終的に抽出効率を高めたことに起因していると考えられる。ある程度、ＭｅＯＨは修飾剤としてＡＣＮよりも良い反応を示す。アミノグリコシド濃度が１５０ｎｇｍＬ－１のＭｅＯＨ修飾サンプルの反応は、アミノグリコシド濃度が３００ｎｇｍＬ－１の未修飾水性マトリックスと同等である。このことは、ＭｅＯＨが水の極性を下げるか、プロトン性溶媒であるＭｅＯＨが水素結合によって分析対象物と水分子の間の溶媒和のかごを壊す能力を持つことによって、抽出効率が向上していることを示している。
【0128】
極性と溶媒和の影響をより厳密に調べるために、別のプロトン性溶媒であるＩＰＡを修飾剤の候補として評価した。図１３の（Ｂ）では、ＩＰＡとＭｅＯＨを修飾剤として使用した場合の反応を比較した。ＩＰＡとＭｅＯＨの極性指数はそれぞれ３．９と５．１である。ＩＰＡを修飾剤とした場合、ＭｅＯＨと比較して分析対象物の応答が増大する。プロトン性溶媒であるため、どちらの修飾剤も溶媒和カゴを壊す能力は似ているが、ＩＰＡの極性が低いとアミノグリコシドのマトリックスへの親和性が低くなる。その結果、ＩＰＡで修飾した試料の方が高い抽出効率を示した。
【0129】
修飾剤の役割をさらに理解するために、アセトンとＤＭＳＯのような非プロトン溶媒を用いた。両溶媒は構造的に似ているが、主な違いはＤＭＳＯの硫黄がアセトンの炭素に置換されていることで、極性が異なっている。ＤＭＳＯの極性指数は７．２、アセトンの極性指数は５．１である。図１３の（Ｃ）の分析対象物の反応は、ＤＭＳＯを修飾剤に用いた場合、アセトンに比べて全般的に大きく増加することがわかった。ＤＭＳＯは、極性指数からすると、アセトンと同じ程度に試料の極性を下げることはできない。その代わり、ＤＭＳＯは水素結合の切断や溶媒和／水和球の溶媒としてよく知られている。この結果は、ＤＭＳＯが抽出効率を高めるのは、極性を下げるのではなく、主に水和球を壊すためである可能性を示している。
【0130】
以上の実験結果から、水からのアミノグリコシドの抽出には、極性と溶媒和／水和の両方が大きく影響することが示唆された。このことは、図１３の（Ｄ）でアセトンやＭｅＯＨを修飾剤として使用した場合の分析物の反応を比較することでさらに証明された。どちらの溶媒も極性指数は５．１である。しかし、ＭｅＯＨで修飾した試料は、極性を下げる効果は同じであるにもかかわらず、アセトンで修飾した試料よりも高い応答を示す傾向がある。
【0131】
以上の結果と考察から、溶媒和と極性の両方が影響因子であり、水性試料からのアミノグリコシドの抽出に同時に影響を与えていることが明らかとなった。したがって、適切なマトリックス修飾剤を選択することは、アッセイの性能を向上させるために非常に重要である。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによるアミノグリコシドのスクリーニングに最適な修飾剤の組成を得るために、さらなる最適化を行った。これらの実験では、スパイク水サンプルの修飾に使用するＤＭＳＯ、ＩＰＡ、およびＭｅＯＨの異なる割合の反応および、スパイク水サンプルに対する修飾溶媒の割合が水からのアミノグリコシドの抽出にどのようにプラスまたはマイナスに影響するかをより理解する検討を行った。
【0132】
図１４は、（Ａ）アミカシン、（Ｂ）アプラマイシン、（Ｃ）ジヒドロストレプトマイシン、（Ｄ）ハイグロマイシンＢ、（Ｅ）ゲンタマイシンＣ１、（Ｆ）ゲンタマイシンＣ１Ａ、（Ｇ）ゲンタマイシンＣ２、（Ｈ）カナマイシンＡ、（Ｉ）シソマイシン、（Ｊ）スペクトノマイシン、（Ｋ）ストレプトマイシンおよび（Ｌ）トブラマイシンについての、アミノグリコシド抽出を促進するための、水の拡張マトリックス修飾を示します。図１４から、有機修飾剤の量もアミノグリコシドの抽出に大きな影響を与えることがわかる。有機修飾剤の量が増えるにつれて、分析対象物の応答が大きくなる傾向がある。水試料を３当量の有機溶媒で修飾した場合、修飾していない水試料（３００ｎｇｍＬ－１）と比較して、分析対象物の濃度が１／４であるにもかかわらず、分析対象物の応答が高くなる傾向がある。図１４の結果に基づいて、極性の低下とアミノグリコシド周りの溶媒和球の破壊を考慮し、他の有機溶媒よりもＩＰＡが適切な修飾剤として選択された。３当量のＩＰＡを修飾剤として使用すると、この決定に大きく影響したアミノ配糖体の反応が最も低いジヒドロストレプトマイシン、ストレプトマイシン、およびスペクトリノマイシンで最良の結果が得られた。ＤＭＳＯは、ＭＳシステムと互換性がなく、高沸点溶媒であるため、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳに使用する前に長い乾燥時間がかかるため、排除した。
【0133】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳでは、コーティングからの分析対象物の最適な脱着、ピッキングプロセスによるサンプルプレートからコーティングされたＰＥＳＩプローブへの脱着溶媒の量、ＥＳＩプロセスとの相性などのバランスを考慮した脱着溶媒の最適化が重要な要素となる。
【0134】
図１５の結果から、最適な脱着溶媒はＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ３／２）＋０．１％ＦＡと決定した。この脱着溶媒は、特に低い反応を示す傾向があったアミノグリコシド類では全体的に最も良い反応を示した。抽出マトリックスがＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ３／１）で構成されていることから、ＦＡは脱着に極めて重要な役割を担っていることがわかる。脱着のメカニズムは、アミノグリコシドのアミノ基をプロトン化し、コーティングと分析対象物の間の相互作用を破壊する酸性の脱着溶媒に依存する。
【0135】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって与えられる脱着イオン化反応の洗浄の影響を、洗浄溶媒として水を用いて検討した。この調査は、アミノグリコシドが水洗工程後にコーティングに残留するかどうかを確認するためにこの検討を行った。その結果を図１６に示す。この結果から、水洗いを行った場合、水洗いを行わない場合と比較して、信号の大きな減少は見られないことがわかった。このことから、コーティングされたＰＥＳＩプローブのコーティングにアミノ配糖体が強く結合していることが確認された。
【0136】
本研究では、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いたアミノグリコシドの抽出と脱着条件の違いなどの定性的なスクリーニングパラメータを検討した。その結果、ｐＨ６－８、無塩、有機修飾剤としてのＩＰＡの添加が最適な反応を与えることが判明した。また、最適な脱着溶媒はＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ３／２）＋０．１％ＦＡであることが判明した。これらのパラメータに基づき、水中にスパイクされた１２種類のアミノグリコシドをスクリーニングすることができた。
【0137】
［例５］
例５では、ＬＣ－ＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）はＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カナダ、ミシサ－ガ）から、ギ酸（ＦＡ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩酸、ＨＰＬＣグレードのＭｅＯＨはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから、それぞれ購入した。また、１．３μｍの親水性－親油性粒子（ＨＬＢ）の合成のために、ジビニルベンゼン、Ｎ－ビニルピロリドン、２、２－アゾビス（イソブチロニトリル）を購入した。以下の分析標準物質およびその重水素化類似体をＣｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲｏｕｎｄＲｏｃｋ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、フェンタニル、ロラゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパム、プロプラノロール、ブプレノルフィン－ｄ４、コデイン－ｄ３、ジアゼパム－ｄ５、フェンタニル－ｄ５、ロラゼパム－ｄ４、ノルジアゼパム－ｄ５、およびプロプラノロール－ｄ７。重水素化された類似化合物は、必要に応じて内部標準の補正に使用した。唯一の例外はオキサゼパムで、ノルジアゼパム－ｄ５は必要に応じて使用された。抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを使用した凍結プ－ル性非濾過ヒト血漿をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。ＰＥＳＩプローブとサンプルプレートは、株式会社島津製作所（京都、日本）から寄贈された。
例５では、ＬＣ－ＭＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）はＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カナダ、ミシサ－ガ）から、ギ酸（ＦＡ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩酸、ＨＰＬＣグレードのＭｅＯＨはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから、それぞれ購入した。また、１．３μｍの親水性－親油性粒子（ＨＬＢ）の合成のために、ジビニルベンゼン、Ｎ－ビニルピロリドン、２、２－アゾビス（イソブチロニトリル）を購入した。以下の分析標準物質およびその重水素化類似体をＣｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＲｏｕｎｄＲｏｃｋ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、フェンタニル、ロラゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパム、プロプラノロール、ブプレノルフィン－ｄ４、コデイン－ｄ３、ジアゼパム－ｄ５、フェンタニル－ｄ５、ロラゼパム－ｄ４、ノルジアゼパム－ｄ５、およびプロプラノロール－ｄ７。重水素化された類似化合物は、必要に応じて内部標準の補正に使用した。唯一の例外はオキサゼパムで、ノルジアゼパム－ｄ５は必要に応じて使用された。抗凝固剤としてＫ２ＥＤＴＡを使用した凍結プ－ル性非濾過ヒト血漿をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。ＰＥＳＩプローブとサンプルプレートは、株式会社島津製作所（京都、日本）から寄贈された。
【0138】
ＨＬＢ合成とＰＢＳ調製を行った。ＰＥＳＩプローブのディップコートには、Ｔｈｏｒｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のモーター付き自作ステージ（ＭＴＳ５０／Ｍ－Ｚ８Ｅ、５０ｍｍ）を使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験はＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０（京都、日本）トリプル四重極質量分析計で行い、液体クロマトグラフィーにはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－３０ＡＤポンプ（京都、日本）と、分離にはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ＰＦＰカラム（２．１×１００ｍｍ、粒子径１．７μｍ）（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよびＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験に使用した分析対象物およびトランジションに関する情報は、表Ｓ１に記載されている。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実験条件に関する詳細な情報は、表Ｓ２および表Ｓ３に記載されている。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験は、ＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェース（京都、日本）を有するＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０（京都、日本）トリプル四重極質量分析計で実施された。ＳＰＭＥ－ＭＳ／ＭＳ実験条件に関するさらなる情報は、表Ｓ４および表Ｓ５で見ることができる。
【0139】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－３０ＡＤポンプ（京都、日本）およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０（京都、日本）トリプル四重極質量分析計を使用して実施された。装置に関する詳細な情報、最適化されたＬＣおよびＭＳ／ＭＳパラメ－タは、以下の表Ｓ１からＳ３に記載されている。
【0140】
【表S1】
【0141】
【表S2】
【0142】
【表S3】
【0143】
【表S4】
【0144】
【表S5】
【0145】
同じプローブを用いて二連続のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験間でのシグナルの減少。静置状態で３００μＬのＰＢＳ（標準液の１０ｎｇ／ｍＬでスパイク）から９０分間抽出したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブを用い、１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋０．１％ＦＡの一部溶液を用いて二連続のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを行った。
【0146】
【表S6】
【0147】
オートサンプラーは４°Ｃに保温され、ＰＢＳまたは血漿抽出試料がそれぞれ３μＬまたは６μＬ注入されるようプログラムされていた。分離にはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＫｉｎｅｔｅｘ ＰＦＰカラム（２．１×１００ｍｍ、粒子径１．７μｍ）を使用した。カラムオーブン温度は３５°Ｃ、流速は３００μＬ／ｍｉｎとした。移動相Ａは水、移動相ＢはＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ、７／３）で、両相とも０．１％ギ酸を含んでいる。グラジエントは１０％Ｂで１．０分、その後７．０分まで直線的に１００％Ｂまで上昇させ、９．０分まで保持した。その後、９．２分で１０％Ｂに戻し、１１．０分まで再平衡化させた。
【0148】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＤＰｉＭＳ－８０６０ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（京都、日本）およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ ８０６０ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（京都、日本）を用いて実施した。装置に関する詳細情報、最適化されたＤＰｉＭＳ－８０６０インターフェースとＭＳ／ＭＳパラメータは表Ｓ１、Ｓ４、Ｓ５に記載されている。サンプル位置での停留時間は５０ｍｓ、イオン化位置での停留時間は２００ｍｓであった。プローブがイオン化位置にあるとき、２．３ｋＶのインターフェース電圧が印加された。
【0149】
７％（重量／体積）のポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と混合し、コーティングバインダーを作製した。次に、１．３μｍＨＬＢ粒子９．２重量％、コーティングバインダー８７．９重量％、グリセロール２．８重量％からなるスラリーを調製した。このＰＥＳＩプローブを希塩酸（７．４％）中で１５分間超音波処理した後、ＰＥＳＩプローブを希塩酸（７．４％）中で１５分間超音波処理し、エッチングした。その後、水中で２０分、ＭｅＯＨ中でさらに２０分超音波処理した。超音波処理後、エッチングされたプローブをオーブンで乾燥させ、自社製のステージを用いて１μｍのＨＬＢ／ＰＡＮスラリーを２ｍｍの長さまでディップコーティングした。ディップコーティング後、プローブは９０°ＣのＧＣオーブンで乾燥させた。
このディップコーティングプロセスはプローブのエッチングと同日に行われ、コーティング厚さの半径が６．５μｍになるまで繰り返された。したがって、本実験で使用したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのコーティングは、長さ２ｍｍ、厚さ６．５μｍであった。抽出を行う前に、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブをＭｅＯＨ／ＡＣＮ／ＩＰＡ（ｖ／ｖ／ｖ ２／１／１）の混合溶媒で１５分間洗浄し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）の混合溶媒で１５分間コンディショニングを行った。
このディップコーティングプロセスはプローブのエッチングと同日に行われ、コーティング厚さの半径が６．５μｍになるまで繰り返された。したがって、本実験で使用したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのコーティングは、長さ２ｍｍ、厚さ６．５μｍであった。抽出を行う前に、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブをＭｅＯＨ／ＡＣＮ／ＩＰＡ（ｖ／ｖ／ｖ ２／１／１）の混合溶媒で１５分間洗浄し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）の混合溶媒で１５分間コンディショニングを行った。
【0150】
１０、３０、６０、９０、１２０分で静置抽出された標準物質１０ｎｇｍＬ－１を添加した３００μＬＰＢＳの一部溶液を使用して、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブ用の抽出時間プロファイルを構築した。抽出の後、３秒間の洗浄と５０μＬＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）での３０分間の静的脱着が行われた。
【0151】
９０分で静置抽出した１０ｎｇ／ｍＬの標準物質を添加した３００μＬＰＢＳの一部溶液を使用して、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブの脱着時間プロファイルを構築し、Ｈ２Ｏで３秒間洗浄し、５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）で１０、３０、４５、６０および７５分に静置脱着させた。最初の脱着後のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブ上の分析物のキャリーオーバーを評価するために、すぐに別の５０μＬＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）で７５分間２度目の脱着を行った。
【0152】
プローブ内再現性は、１０ｎｇｍＬ－１の標準物質を添加した３００μＬのＰＢＳの一部溶液を用いて、抽出と脱着を５サイクル行うことを試験した。プローブ間再現性は、プローブ内再現性試験で得られたプローブを抽出と脱離のサイクルに基づいてグループ化することによって決定された。
【0153】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ試験で使用した脱着液は、１０ｎｇｍＬ－１の標準液をスパイクした３００μＬ ＰＢＳの一部溶液を９０分間抽出し、その後Ｈ２Ｏで３秒間洗浄して最適化したものである。洗浄後、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブをＤＰｉＭＳ－８０６０のインターフェースに設置し、１０μＬの脱着溶液をサンプルプレートに塗布した。最後に、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランを実施した。テストした脱着液は、水と０．１％ギ酸を含む有機溶媒の比率を変化させた。これらの最適化試験で使用された有機溶媒は、ＡＣＮ、ＩＰＡ、およびＭｅＯＨである。
【0154】
分析物を添加した血漿サンプルは、分析物と血漿が十分に結合するように、４°Ｃの冷蔵庫で一晩インキュベートした。１０、３０、４５、６０、７５、９０分で静置抽出した標準物質１０ｎｇｍＬ－１を添加した３０μＬ血漿の一部溶液を使用して、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブ用の抽出時間プロファイルを構築した。抽出後、３秒間洗浄し、５０μＬ ＭｅＯＨ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ ４／１）で３０分間静置脱着し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0155】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて血漿３０μＬを抽出し、１０ｎｇｍＬ－１の内部標準物質と１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１の濃度の標準物質を用いて検量線を構築した。精度と正確性は、３、３０、および９０ｎｇｍＬ－１の濃度の標準物質を添加した血漿からなる３種類のＱＣレベルを使用して測定された。各キャリブレーションおよびＱＣレベルに５つの複製が使用された。
【0156】
１０ｎｇｍＬ－１の標準物質を添加したＰＢＳから、１０から１２０分の範囲で静置抽出を行い、抽出時間プロファイルを決定した（図４）。その結果、９０分が最適抽出時間であることがわかった。この時点では化合物は平衡に達しなかったが、９０分の抽出時間により高感度が得られ、プローブ間およびプローブ内の再現性を評価するために、連続５サイクルの抽出と脱離を完了させることができるようになった。攪拌の使用は抽出時間の短縮につながるが、実験の複雑さを増すため、この作業では考慮されなかった。脱着時間プロファイルは、スパイクしたＰＢＳを９０分間静置抽出し、その後１０、３０、４５、６０、７５分間脱着することで決定された。その後、分析物のキャリーオーバーを評価するために、２回目の静的脱着工程を実施した。脱着時間プロファイル実験の結果、すべての分析物が１０分で定量的に脱着された。しかし、キャリーオーバー試験では、プロプラノロールとブプレノルフィンがそれぞれ５．０と５．３％と比較的高いキャリーオーバー率を示した以外は、すべての化合物が３．５％以下のキャリーオーバー率であることが示された。したがって、この時点ですべての化合物のキャリーオーバーが３．２％以下であったことから、３０分を最適な脱着時間として選択した。
【0157】
プローブ内の再現性は、プローブの安定性と再利用性を評価するために、抽出時間９０分、脱着時間３０分の抽出と脱着サイクルを連続５回行うことで測定した。その結果、ＲＳＤが１０％以下のものが３４件、１０～１５％のものが４件、１５～２０％のものが２件と、プローブ内の再現性は良好であった（表５．１）。
表５．１では、２ｍｍ厚のＰＥＳＩプローブのプローブ内再現性を、５種類のプローブを用いて５回の抽出と脱着サイクルを行うことで測定している。抽出は３００μＬのＰＢＳ（表Ｓ１の１０ｎｇｍＬ－１の標準物質をスパイク）で９０分間行い、脱着は５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（１／１ ｖ／ｖ）で３０分間実施した。プローブ内再現性は、同一プローブのクロマトグラムから得られた面積カウント間のＲＳＤで評価した。
プローブ間再現性は、プローブ内再現性試験中の各抽出－脱離サイクルの各プローブの結果を比較することにより決定した。プローブ間再現性の結果、ＲＳＤが１０％以下のものが２６件、１０～１５％のものが１１件、１５～２０％のものが６件、２１％のものが１件となり、エッチングおよびコーティング工程での再現性が高いことがわかった（表５．２）。
表５．２では、表１の生データから得られた２ｍｍコーティングＰＥＳＩプローブのプローブ間再現性を示している。生データは、プローブごとではなく、抽出－脱着サイクルごとにグループ化した。抽出は３００μＬのＰＢＳ（表Ｓ１の１０ｎｇｍＬ－１の標準物質でスパイク）で９０分間行い、脱着は５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（１／１ ｖ／ｖ）で３０分間行われた。プローブ間の再現性は、同じ抽出と脱着サイクルのクロマトグラムから得られた面積カウント間のＲＳＤで評価した。
表５．１では、２ｍｍ厚のＰＥＳＩプローブのプローブ内再現性を、５種類のプローブを用いて５回の抽出と脱着サイクルを行うことで測定している。抽出は３００μＬのＰＢＳ（表Ｓ１の１０ｎｇｍＬ－１の標準物質をスパイク）で９０分間行い、脱着は５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（１／１ ｖ／ｖ）で３０分間実施した。プローブ内再現性は、同一プローブのクロマトグラムから得られた面積カウント間のＲＳＤで評価した。
プローブ間再現性は、プローブ内再現性試験中の各抽出－脱離サイクルの各プローブの結果を比較することにより決定した。プローブ間再現性の結果、ＲＳＤが１０％以下のものが２６件、１０～１５％のものが１１件、１５～２０％のものが６件、２１％のものが１件となり、エッチングおよびコーティング工程での再現性が高いことがわかった（表５．２）。
表５．２では、表１の生データから得られた２ｍｍコーティングＰＥＳＩプローブのプローブ間再現性を示している。生データは、プローブごとではなく、抽出－脱着サイクルごとにグループ化した。抽出は３００μＬのＰＢＳ（表Ｓ１の１０ｎｇｍＬ－１の標準物質でスパイク）で９０分間行い、脱着は５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（１／１ ｖ／ｖ）で３０分間行われた。プローブ間の再現性は、同じ抽出と脱着サイクルのクロマトグラムから得られた面積カウント間のＲＳＤで評価した。
【0158】
【表5.1】
【0159】
【表5.2】
【0160】
注目すべきは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのチップ内およびチップ間再現性の結果が、文献に見られるＳＰＭＥミニチップの値と同等かそれ以下であったことである。例えば、Ｖａｓｉｌｊｅｖｉｃらは、２００ｎｇｍＬ－１のジアゼパム、ノルジアゼパム、オキサゼパム、ロラゼパムを用いて５回の抽出と脱着サイクルのＲＳＤを評価し、ＳＰＭＥミニチップのチップ内における再現性を評価した。その結果、これらの化合物のＲＳＤは２０回中７回のみ１０％であった。一方、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブでは、これらの化合物のＲＳＤは２０回中１８回が１０％以下であった。チップ間再現性に関しては、ｄｉａｚｅＰａｍ、ｌｏｒａｚｅＰａｍ、ＮｏｒｄｉａｚｅＰａｍおよびｏｘａｚｅＰａｍのＲＳＤはＳＰＭＥｍｉｎｉチップで１８％、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブで１６％と最も高い値を示した．
【0161】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの最適な抽出条件が明らかになったので、次に脱着溶媒を最適化する必要があった。このため、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ３／２）．ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ２／３）、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）の脱着液をテストした。なお、前記の溶媒には、いずれも改質剤として０．１％ＦＡが添加されている。
図５は、これらの実験の結果を、ある化合物の全脱離溶媒の面積カウントを、最も高い平均面積カウントを得た脱離溶媒で割った規格化面積カウントで示したものである。図５には、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）のデータは、これらの脱離溶剤を用いた場合のスプレーイベントの発生に一貫性がないため、含まれていない。
ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）＋０．１％ＦＡは、８種類の化合物の中で最も高い面積カウントが得られるため、最適な脱着溶媒として選択された。ＣＢＳなどの他のＳＰＭＥベースのアンビエント質量分析技術とは異なり、提案するＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ法では、有機溶媒としてＭｅＯＨではなくＩＰＡを使用している。ピックアンドスプレーを繰り返す方法でＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブ上に塗布する脱着溶媒の量は、脱着溶媒の表面張力と粘度に大きく影響されるが、溶媒は通常、低ＰＬ容量である。吉村らの研究では、表面張力や粘度の上昇と、ＰＥＳＩプローブ表面に吸着保持される試料量の増加との間に正の相関があることを発見した。また、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのコーティングから脱着溶媒への十分な分析対象物の移動を可能にするために、脱着溶媒はコーティングを十分に濡らすことができなければならない。
図５は、これらの実験の結果を、ある化合物の全脱離溶媒の面積カウントを、最も高い平均面積カウントを得た脱離溶媒で割った規格化面積カウントで示したものである。図５には、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ７／３）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ ９／１）のデータは、これらの脱離溶剤を用いた場合のスプレーイベントの発生に一貫性がないため、含まれていない。
ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ １／１）＋０．１％ＦＡは、８種類の化合物の中で最も高い面積カウントが得られるため、最適な脱着溶媒として選択された。ＣＢＳなどの他のＳＰＭＥベースのアンビエント質量分析技術とは異なり、提案するＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ法では、有機溶媒としてＭｅＯＨではなくＩＰＡを使用している。ピックアンドスプレーを繰り返す方法でＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブ上に塗布する脱着溶媒の量は、脱着溶媒の表面張力と粘度に大きく影響されるが、溶媒は通常、低ＰＬ容量である。吉村らの研究では、表面張力や粘度の上昇と、ＰＥＳＩプローブ表面に吸着保持される試料量の増加との間に正の相関があることを発見した。また、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのコーティングから脱着溶媒への十分な分析対象物の移動を可能にするために、脱着溶媒はコーティングを十分に濡らすことができなければならない。
【0162】
図６は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩとコーティングなしＰＥＳＩのエレクトロスプレーパターンの違いを示している。図６のＣに示すように、スパイクしたＩＰＡ／Ｈ２Ｏ混合物の濃度が実験中比較的一定であったため、コーティングされていないＰＥＳＩプローブのシグナル高さはほぼ一定であった。一方、コーティングされたＰＥＳＩプローブを用いて、サンプルプレートに分注しスパイクされたＩＰＡ／Ｈ２Ｏ混合物をピックアンドスプレーすると、０．５ミリオンレベルまでシグナル高さが増加し、その後は一定となった（図６のＢ）。この最初のシグナル高さの増加は、スパイクされたＩＰＡ／Ｈ２Ｏ混合液から繰り返し抽出されることによるコーティング中の分析対象物の濃度レベルの上昇に関連している。一方、図６のＡにおけるシグナルの高さは、スパイクしたＰＢＳから抽出した分析物を含むコーティングされたＰＥＳＩプローブのもので、図５のＢとＣにおける最大のシグナル高さよりも１０倍以上高く始まり、その後ランを通して減少している。図６のＢとＣのスパイクされたサンプル溶媒は、図６のＡに相当する抽出時に干渉物（すなわち塩）が除去されているため、干渉物を持っていないことを強調する必要がある。この減少は、１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験中に、コーティングされたプローブ上に抽出された分析対象物が著しく脱離した結果であると仮定した。この仮説を検証するため、スパイクしたＰＢＳサンプルから、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用にプローブを直接脱着するか、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験にプロ－ブを使用した後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用に脱着するか、２つの条件のいずれかで抽出を実施した。
表５．３は、この実験の結果を枯渇率で表したものである。表５．３では、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験中にＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブによって失われた分析物の割合を決定するために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ脱着実験が実施された。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブを用いて、３００μＬのＰＢＳから９０分間静的条件下で抽出を行い（１０ｎｇ／ｍＬの標準物質を添加）、続いて５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（４／１ ｖ／ｖ）に３０分間静的脱離を行った。この抽出ステップを同じプローブセットで繰り返し、１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋０．１％ＦＡを用いてＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを行った。その後、プローブは新鮮な脱着液で再度静置脱着した。
表５．３は、この実験の結果を枯渇率で表したものである。表５．３では、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ実験中にＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブによって失われた分析物の割合を決定するために、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ脱着実験が実施された。ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブを用いて、３００μＬのＰＢＳから９０分間静的条件下で抽出を行い（１０ｎｇ／ｍＬの標準物質を添加）、続いて５０μＬのＭｅＯＨ／ＡＣＮ（４／１ ｖ／ｖ）に３０分間静的脱離を行った。この抽出ステップを同じプローブセットで繰り返し、１０μＬのＩＰＡ／Ｈ２Ｏ（１／１ ｖ／ｖ）＋０．１％ＦＡを用いてＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを行った。その後、プローブは新鮮な脱着液で再度静置脱着した。
【0163】
脱着率は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのために直接脱着されたコーティングされたプローブによって与えられた面積カウントとの相対値で表される。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳラン（６０ピック）で、所定の化合物の少なくとも４５％の脱離が認められた。１回のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランでシグナルの高さが急激に低下するのは、ランの進行に伴いコーティング中の分析対象物の濃度が低下するためであると思われる。この現象は、２回目のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランにおける面積カウントの減少を、１回目のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランにおける面積カウントに対して表した表Ｓ６に示されている。見てわかるように、すべての分析物の面積カウントは、２回目のＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳランで少なくとも７７％減少している。ＰＬ量が少ないことを考慮すると、この場合の濃縮係数を規定する溶媒／抽出相係数が高いため、脱着液は分析物の濃度が高いことになる。このことは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによるスクリーニングとＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる確認分析に、この実験で使用したＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブのいずれかを適用することができないことも示唆している。
【0164】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの信号形状は、１回のピックアンドスプレーでは分析物の完全な脱着ができないことを明確に示している（図６Ａ）。
【0165】
次に、少量の血漿中の乱用薬物の定量にＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを適用した。血漿を選択したのは、マトリックス成分が分析対象物と結合し、イオンサプレッションを引き起こす可能性のある複雑なマトリックス中の分析対象物を定量するＳＰＭＥ－ＰＥＳＩの能力を実証するためであった。３０μＬのスパイク血漿の抽出時間プロファイルは、すべての分析物について約６０分の平衡化時間を使用して作成された（図１７）。
図１７は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いた乱用薬物の検量線である。３０μＬの血漿からの抽出は、静的条件下で６０分間行われた。１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１のスパイク濃度で補正した検量線を作成した（Ｎ＝５）。ＬＬＯＱ以下の濃度はプロットされなかった。その結果、抽出時間として最も感度が高くなる６０分を選択した。続いて、７種類の検量線と１種類の検量線につき５レプリケートからなる検量線が作成された。構築された検量線は、１／ｘの係数で重み付けされた。
表５．４にベストフィットの直線の係数を、表５．５にその他のメリットの数値を示す。表５．５では、低濃度には３ｎｇ／ｍＬの標準液を、中濃度には３０ｎｇ／Ｌの標準液を、高濃度には９０ｎｇｍＬ－１の標準液をそれぞれ添加した。すべての３つのレベルには１０ｎｇ／ｍＬの内部標準物質も添加された。各レベルは５回複製され、日間評価では１日５回、３日間複製されたものが使用された。精度および正確さの評価には、内部標準によって補正されたデータを使用した。
図１８は、８種類の乱用薬物の検量線である。日内および日間の精度および確度は、低、中、高（３、３０、９０ｎｇｍＬ－１）の３段階で評価し、各段階とも５回繰り返し測定した。図１８は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いた乱用薬物の検量線を示している。３０μＬの血漿から６０分間の静置抽出を行った。１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１のスパイク濃度で補正した検量線を作成した（Ｎ＝５）。ＬＬＯＱ以下の濃度はプロットされなかった。
図１７は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いた乱用薬物の検量線である。３０μＬの血漿からの抽出は、静的条件下で６０分間行われた。１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１のスパイク濃度で補正した検量線を作成した（Ｎ＝５）。ＬＬＯＱ以下の濃度はプロットされなかった。その結果、抽出時間として最も感度が高くなる６０分を選択した。続いて、７種類の検量線と１種類の検量線につき５レプリケートからなる検量線が作成された。構築された検量線は、１／ｘの係数で重み付けされた。
表５．４にベストフィットの直線の係数を、表５．５にその他のメリットの数値を示す。表５．５では、低濃度には３ｎｇ／ｍＬの標準液を、中濃度には３０ｎｇ／Ｌの標準液を、高濃度には９０ｎｇｍＬ－１の標準液をそれぞれ添加した。すべての３つのレベルには１０ｎｇ／ｍＬの内部標準物質も添加された。各レベルは５回複製され、日間評価では１日５回、３日間複製されたものが使用された。精度および正確さの評価には、内部標準によって補正されたデータを使用した。
図１８は、８種類の乱用薬物の検量線である。日内および日間の精度および確度は、低、中、高（３、３０、９０ｎｇｍＬ－１）の３段階で評価し、各段階とも５回繰り返し測定した。図１８は、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いた乱用薬物の検量線を示している。３０μＬの血漿から６０分間の静置抽出を行った。１、５、１０、２５、５０、７５、１００ｎｇｍＬ－１のスパイク濃度で補正した検量線を作成した（Ｎ＝５）。ＬＬＯＱ以下の濃度はプロットされなかった。
【0166】
検量線は直線性を示し、Ｒ２はすべての曲線で０．９８以上、６本の曲線で０．９９以上であった。ノルジアゼパムとフェンタニルの定量限界（ＬＯＱ）は１ｎｇｍＬ－１、ブプレノルフィン、コデイン、ジアゼパム、ロラゼパム、プロプラノロールのＬＯＱは５ｎｇｍＬ－１、オキサゼパムのＬＯＱは１０ｎｇｍＬ－１であった。日内精度は、それぞれのＬＯＱを超える濃度のすべての化合物で１５％以下であった。同様に日間精度は、ロラゼパムの中間レベルとオキサゼパムの高濃度を除いて、すべての化合物で１５％以下であり、それぞれ１６％および２７％であった。また、ＬＯＱ以上の濃度では、１２２％であった中程度のロラゼパムを除き、すべての化合物で日内精度が８０～１２０％であった。同様に日間精度も、ＬＯＱ以上の濃度では、中間のロラゼパムを除いて８０～１２０％であり、１４７％であった。図６のＡとＢの最大信号を比較すると、同じレベルでスパイクした噴霧脱離溶媒と比較して、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩはフェンタニルに対して１０以上の増強係数を得ていることがわかる。強調すべきは、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ実験の脱着溶媒は、抽出手順中に除去されるため、干渉を持たないということである。ＰＥＳＩで干渉を除去するという同じ目標を達成するためには、適切なサンプル調製ステップが必要であり、これは手順に追加のステップを追加することになる。
【0167】
【表5.3】
【0168】
【表5.4】
【0169】
【表5.5】
【0170】
ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩは、最小限の侵襲性が要求される臨床アプリケーションや、極めて少量のサンプルしか収集できないアプリケーションに最適なツールである。また、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩは小型であるため、従来の試料調製技術では標的分析物が希釈されてしまい、結果が不十分であるようなアプリケーション（例えば、ｉｎ－ｓｉｔｕ分析、植物や動物の単一細胞分析など）において、試料量が限られ、前濃縮ができない場合に最適なツールである。さらに、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳは抽出したサンプルを迅速に測定できるため、マルチウェルパラレル抽出を用いた出生前ハイスループット・スクリーニングなどの分野でも魅力的な技術となり得る。さらに、ＳＰＭＥ－ＰＥＳＩプローブの寸法が小さいため、少量のサンプルからの非消耗性抽出が可能になり、分析物の遊離濃度および結合定数を不可逆的結合の場合にも決定できる可能性がある。コーティングの体積が小さい（厚さ約６．５ミクロン）ため、抽出相／サンプルマトリックス分布定数（Ｋｆｓ）に対応するマイクロ抽出濃度が最大に近くなる。さらに、実質的な枯渇が起こらない場合、微量のＰＬ容量の脱着溶媒を適用することで、コーティング／脱着溶媒分配定数（Ｋｆｅ）に達する可能性のあるさらなる濃縮を可能にすることができる。したがって、全体の濃縮係数はＫｓｆ＊Ｋｆｅ．となり、少量の試料と抽出相しか存在しないにもかかわらず、非常に高い測定感度を実現することができる。
【0171】
特徴の特定の組み合わせが特許請求の範囲および／または明細書に開示されているとしても、これらの組み合わせは、可能な実施形態の開示を制限することを意図していない。実際、これらの特徴の多くは、特許請求の範囲に具体的に記載されていない方法および／または本明細書に開示されていない方法で組み合わされることができる。以下に記載される各従属請求項は、１つの請求項にのみ直接依存し得るが、可能な実施形態の開示は、請求項セット内の他のすべての請求項との組み合わせで各従属請求項を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
