特許 7502792 希少微生物の選択的培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-11

(45)【発行日】2024-06-19

(54)【発明の名称】希少微生物の選択的培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20240612BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240612BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 A ZNA

C12N15/63 Z

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021045341

(22)【出願日】2021-03-19

(65)【公開番号】P2022144371

(43)【公開日】2022-10-03

【審査請求日】2023-03-03

(73)【特許権者】

【識別番号】504237050

【氏名又は名称】独立行政法人国立高等専門学校機構

(74)【代理人】

【識別番号】110001427

【氏名又は名称】弁理士法人前田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】木村 善一郎

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－２３０３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００２－５０２２３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Institute for Fermentation, Osaka. Research Communications，2016年，No.30，p.21-38

【文献】化学と生物，2016年，Vol.54, No.1，p.10-16

【文献】Microb. Resour. Syst.，2016年，Vol.32, No.1，p.1-11

【文献】mBio，2018年，Vol.9, Issue 6 ，e01300-18

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

分離対象である希少微生物を含む複数の微生物を集菌する工程と、
前記希少微生物を宿主とするプラスミドを準備する工程と、
前記集菌した複数の微生物に対して前記プラスミドを導入し、前記希少微生物のみに抗生物質耐性を付与する工程と、
前記抗生物質を含む培地で前記希少微生物を選択的に培養する工程と、
を有する、希少微生物の選択的培養方法であって、
前記希少微生物は、環境中の個体数存在比が0.1%以下であることを特徴とする、希少微生物の選択的培養方法。

【請求項2】

前記プラスミドの導入は化学的形質転換法又は物理的形質転換法によるものであることを特徴とする請求項１に記載の希少微生物の選択的培養方法。

【請求項3】

前記物理的形質転換法はエレクトロポレーション法であることを特徴とする請求項２に記載の希少微生物の選択的培養方法。

【請求項4】

前記培養が集積培養の場合、前記抗生物質を含む培地は液体培地であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の希少微生物の選択的培養方法。

【請求項5】

前記培養が分離培養の場合、前記抗生物質を含む培地は寒天培地であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の希少微生物の選択的培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、希少微生物の選択的培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

有用微生物資源の探索においてレアバイオスフィア(rarebiospher:希少微生物圏)に属する微生物の分離培養法確立は重要な課題である。レアバイオスフィアとは極めて多様な種で構成される、環境中に非常に低濃度に存在する菌叢である。環境中で形成される複合微生物系は99.9%以上の種がレアバイオスフィアに属するが、その個体数存在比率はわずか0.1%未満である。その菌種の多様さより、レアバイオスフィアに有用微生物資源の存在する蓋然性は極めて高い。レアバイオスフィアの生態学的意義についてはまだ萌芽的研究段階であり(非特許文献１)、レアバイオスフィアの意義についてはまだ詳しくはわかっていない旨が報告されている(非特許文献２)。

【0003】

存在比率の低い微生物を優先的に培養可能な、既存の培養技術として微生物の基質資化性に基づく集積培養法がある(非特許文献３)。しかしながらこの手法は対象とする微生物の生理的性質が既知である場合のみ適用可能である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Lynch&Neufeld, 2015; Pedr6s Ali6, 2012; Sogin et al., 2006

【文献】平石明, 環境微生物の培養性とその生態学的意義, 日本微生物資源学会誌, 32巻1号, 2016年6月

【文献】Beijerinck, Martinus W.(1901). “Anhaufungsversuche mit Ureumbakterien”. Centralblatt f. Bakteriologie, II 7: 33-61.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、効果的な希少微生物の選択的培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明にかかる希少微生物の選択的培養方法は、分離対象である希少微生物を含む複数の微生物を集菌する工程と、前記希少微生物を宿主とするプラスミドを準備する工程と、前記集菌した複数の微生物に対して前記プラスミドを導入し、前記希少微生物のみに抗生物質耐性を付与する工程と、前記抗生物質を含む培地で前記希少微生物を選択的に培養する工程と、を有することを特徴とする。

【0007】

前記希少微生物は、環境中の個体数存在比が0.1%以下であることが好ましい。

【0008】

前記プラスミドの導入は化学的形質転換法又は物理的形質転換法によるものであることが好ましい。

【0009】

前記物理的形質転換法はエレクトロポレーション法であることが好ましい。

【0010】

前記培養が集積培養の場合、前記抗生物質を含む培地は液体培地であることが好ましい。

【0011】

前記培養が分離培養の場合、前記抗生物質を含む培地は寒天培地であることが好ましい。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、従来はほぼ不可能であった効果的な希少微生物の選択的分離培養方法が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明にかかる方法の概念図であり、微生物に対してプラスミドを導入して抗生物質耐性を付与し、抗生物質を含む培地で希少微生物を選択的に培養する概要を説明する図である。

【図2】微生物の系統図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。

【0015】

本発明にかかる希少微生物の選択的培養方法は、下記工程を有する。

【0016】

(i)分離対象である希少微生物を含む複数の微生物を集菌する工程(集菌工程)
(ii)希少微生物を宿主とするプラスミドを準備する工程(プラスミド準備工程)
(iii)集菌した複数の微生物に対してプラスミドを導入し、希少微生物のみに抗生物質耐性を付与する工程(耐性付与工程)
(iv)抗生物質を含む培地で希少微生物を選択的に培養する工程(培養工程)
本発明はレアバイオスフィアに属する未培養の希少微生物を選択的に培養する。本発明はプラスミド宿主特異性による選択的培養法であるため、HoSPIS(Host Specific Plasmid Induced Screening)法と呼称することが可能である。

【0017】

本発明において、選択的培養の対象となる希少微生物は、環境中の個体数存在比が0.1%以下である微生物であり、好ましくは0.001％以上0.1％以下である微生物である。

【0018】

以下上記の工程について順に説明する。

【0019】

集菌工程では、分離対象である希少微生物を含む複数の微生物を包含するサンプルを準備して集菌する。複数の微生物を包含するサンプルは特に限定されるものではないが好ましくは活性汚泥サンプルである。活性汚泥サンプルには細菌、原生動物、後生動物及び菌類などの微生物が包含されており、細菌には例えばコマモナス(Commamonas)属、ズーグレア(Zoogloea)属、バチルス(Bucillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属など多くの種類が包含される。

【0020】

プラスミド準備工程では、希少微生物を宿主とするプラスミドを準備する。微生物はプラスミドを取り込むことで、そのプラスミドにコードされている抗生物質耐性遺伝子を発現可能である。またプラスミドの発現には宿主特異性が存在する。これはプラスミドの複製開始点がその宿主微生物が有するDNA複製因子に適合することにより複製されることによるものである。

【0021】

プラスミドは特に限定されるものではないが例えばpUC18を用いることが可能である。pUC18は、dideoxy法によるDNAシーケンシングに適したプラスミドベクターで、選択マーカーとしてアンピシリン耐性をもち、M13ファージベクターに比べて大きなDNA断片をクローニングすることができる。lacZ’領域にマルチクローニングサイトを持っており、IPTGとX-Galを含むプレートで、外来DNAの挿入の有無を容易に判別できる。さらに、lacプロモーターを利用した外来遺伝子の発現も可能である。

【0022】

耐性付与工程では、集菌した複数の微生物に対してプラスミドを導入し、希少微生物のみに抗生物質耐性を付与する。即ち図１に示されるように、複合微生物系にプラスミドを導入する。宿主内のDNA複製タンパク質が複製開始点に適合しない場合は、抗生物質耐性が継続的に発現しない。しかし、宿主内のDNA複製タンパク質が複製開始点に適合する場合は、抗生物質耐性が継続的に発現する。

【0023】

プラスミドの導入方法は特に限定されるものではなく、化学的形質転換法、物理的形質転換法、又は、生物学的形質転換法のいずれも可能である。物理的形質転換法としては例えば遺伝子銃による微粒子の導入、直接マイクロインジェクション、レーザー法によるトランスフェクション、又は、エレクトロポレーション法等が挙げられる。物理的形質転換法では好ましくはエレクトロポレーション法である。エレクトロポレーション法は、DNA溶液に懸濁した細胞に電気パルスを印加することによって細胞膜に微小な穴を生じさせ、その際にDNAを細胞内に取り込ませる手法である。化学的形質転換法としては例えばカチオン性脂質媒介性導入法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法による導入、又は、リポフェクション法等を挙げることができる。化学的形質転換法では好ましくはリポフェクション法である。リポフェクション法は、主にカチオン性の人工脂質からなるリポソームを用いるもので、リポソーム法として報告されていたリポソーム内にDNAを封入するものとは異なり、DNAと混ぜることで静電的相互作用により複合体を形成させ、細胞の貪食作用や膜融合によって取り込ませるものである。生物学的形質転換法ではレトロ/レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターによる導入が挙げられる。

【0024】

培養工程では、抗生物質を含む培地で希少微生物を選択的に培養する。即ち図１に示されるように、抗生物質耐性が継続的に発現しない微生物の場合は、抗生物質含有培地で培養が不可能である。しかし、抗生物質耐性が継続的に発現する微生物の場合は、抗生物質含有培地で選択的培養が可能となる。

【0025】

培養工程における培養が集積培養の場合、抗生物質を含む培地は液体培地であることが好ましい。培養工程における培養が分離培養の場合、抗生物質を含む培地は寒天培地であることが好ましい。

【0026】

このようにして本手法は導入するプラスミドの種類により培養対象微生物の選択域を任意的に設定することができる。従ってレアバイオスフィアに属する微生物を培養対象の選択域に設定することで、本領域の未培養微生物種を選択的に培養可能となる。

【0027】

例えば、使用プラスミドの種類により、培養対象微生物の選択域は下記表１及び表２に示されるように定めることが可能である。

【0028】

【表1】

【0029】

【表2】

【実施例】

【0030】

(実施例1)存在比率0.1%未満の希少微生物の選択的培養
本実験は極めて低い存在比率の微生物に対する本手法の適用性を調査するために実施した。微生物の形質転換は純粋培養系でのみ実施されており、複合微生物系での実施例は存在しない。従って複合微生物系においても従来形質転換法が適用可能であるか調査する必要がある。

【0031】

(1)純粋分離されている細菌を濁度(O.D. 600)が等しくなるように菌液を調整した。培養した菌株はBacillus subtilis subs. subtilis NBRC13719株、Corynebacterium striatum NBRC15291株、Staphylococcus epidermidis NBRC100911株、Comamonas terrigena NBRC13299株、Escherichia coli DH5α株を用いた。これらの細菌は全てLB培地で培養可能である。

【0032】

(2)空の1.5mlチューブに濁度調整したBacillus subtilis subs. subtilis NBRC13719株、Corynebacterium striatum NBRC15291株、Staphylococcus epidermidis NBRC100911株、Comamonas terrigena NBRC13299株を300μlずつ加え、混合した。

【0033】

(3)(2)の菌液に濁度調整したEscherichia coli DH5α株を1μlとなるように加え、これを複合微生物系モデルとした。このモデルのE.coli DH5α存在比率は0.1%となるようにした。

【0034】

(4)エレクトロコンピテントセル化に必要なソルビトールバッファ(ソルビトール：1M , 塩化カルシウム：1mM)を用意した。

【0035】

(5)E.coli DH5αのみが発現可能なプラスミドベクター：pUC19(Amp^r)を用意した。pUC19(Amp^r)の配列は配列番号１に示す。pUC19(Amp^r)の配列の中でアンピシリン耐性の配列は配列番号２に示す。pUC19(Amp^r)の配列の中で複製起点の配列は配列番号３に示す。

【0036】

(6)(3)の菌液を2,000g , 5minで集菌し、上清を除去した。

【0037】

(7)ソルビトールバッファを500μl加え、混合した。

【0038】

(8)2,000g , 5minで集菌し、上清を除去した。

【0039】

(9)ソルビトールバッファを200μl加え、混合しこれをエレクトロコンピテントセルとした。

【0040】

(10)エレクトロコンピテントセルに対し0.5μgのpUC19を加え、エレクトロポレーション法によるプラスミド導入を行った。

【0041】

(11)エレクトロポレーション法の条件は1.25kV/cm、25μF、200Ωで実施した。

【0042】

(12)エレクトロポレーション実施後速やかに氷上で冷まし、1分間インキュベートした。

【0043】

(13)SOC培地を加え、1時間回復培養した。

【0044】

(14)(13)をアンピシリン(βラクタム系抗生物質)含有LB培地に塗布し、24時間培養した。

【0045】

(15)培養後に形成されたコロニーは16SrRNA遺伝子系統解析を行い、種を同定した。

【0046】

(実施例1：結果)
抗生物質含有培地から形成されたコロニー15個に対する16SrRNA遺伝子系統解析結果を表３に示す。結果より、解析した全菌株がEscherichia coliに最類縁種であった。従って本手法により存在比率0.1%未満の希少微生物を選択的に培養可能である事が示された。

【0047】

【表3】

【0048】

(実施例2)複合微生物系からの未培養微生物の選択的培養
本実験は複合微生物系サンプルからのEnterobacteriaceae科細菌の選択的培養を目的として実施した。本科に属する細菌は好気性で増殖の速い種が多く、簡易的に培養可能であるため培養対象とした。また、本科にはプラスミドにより形質転換可能な種(e.g. Escherichia coli)が存在することも培養対象とした理由である。

【0049】

(1)活性汚泥サンプルを貧栄養培地(1/10R2A培地)に希釈平板培養法に基づく方法で塗抹した。

【0050】

1/10R2A培地の組成を表４に示す。

【0051】

【表4】

【0052】

(2)7日間培養後、カビがコンタミネーションされていない培地から形成されたコロニーを全て獲得し、滅菌生理食塩水に懸濁した。これを複合微生物系サンプルとした。

【0053】

(3)複合微生物サンプルを集菌し、ペレットの状態にした。

【0054】

(4)以下、(5)～(11)に形質転換方法を示す。

【0055】

(5)25mMのCaCl₂と10%のPEG8000混合溶液：100μlに(3)のペレットを懸濁した。

【0056】

(6)(4)にEscherichia coliを宿主とするプラスミド：pgRNA(Str^r)を1.0μg加えた。pgRNA(Str^r)の配列は配列番号４に示す。pgRNA(Str^r)の配列の中で複製起点の配列は配列番号５に示す。pgRNA(Str^r)の配列の中でストレプトマイシン耐性の配列は配列番号６に示す。

【0057】

(7)氷上で30分間インキュベートした。

【0058】

(8)42℃で30秒間熱処理した。

【0059】

(9)氷上で1分間インキュベートした。

【0060】

(10)SOC培地を500μl加え、30℃で2時間回復培養した。

【0061】

(11)(9)をストレプトマイシン含有LB培地に150μl塗布し、室温で一日培養した。-(I)
(12)また、比較対象系として非形質転換サンプルのストレプトマイシン含有LB培地での培養系-(II)、形質転換サンプルのストレプトマイシン非含有LB培地での培養系-(III)、非形質転換サンプルのストレプトマイシン非含有LB培地での培養系-(IV)を(10)と同時間に培養した。非形質転換サンプルは(4)の状態の複合微生物系サンプルとした。

【0062】

(実施例2：結果)
各系で形成されたコロニーの16SrRNA遺伝子系統解析結果を表５に示す。表５に記す(I)～(IV)の番号は実施例に示す(I)～(IV)に記した培養系と対応させた。結果より、ストレプトマイシン非含有培地での培養系(III),(IV)はBacillus属細菌が優先的に培養されたのに対し、形質転換サンプルのストレプトマイシン含有培地での培養系(I)はEnterobacter属細菌が優先的に培養された。本細菌はEnterobacteriaceae科に属する細菌である。また、非形質転換サンプルのストレプトマイシン含有培地での培養系(II)ではコロニー形成がされなかった。本実験結果より、HoSPiS法により複合微生物系サンプルから存在比率の低いEnterobacter属細菌を選択的に分離培養することができた。

【0063】

【表5】

【0064】

また、分離培養したEnterobacter属細菌に対して本種の遺伝的特性を調査するため、全ゲノムシーケンスを行い、系統解析を行った。全ゲノムシーケンスはMINIONを用いて行った。また系統解析はハウスキーピング遺伝子であるatpD, gyrB, infB, rpoB遺伝子の配列を決定し、系統樹を作成することで行った。また系統樹は近似最尤法より作成した。それと同時に近縁種とのOrthoANI( Average Nucleotide Identity ) の計算も行った。本試験は全ゲノムの相同性を判定する試験である。既往の研究より相同性が95%程度以下であれば新種であると言われている。作成した系統樹を図２に示す。獲得株は図２中にIsolated_Enterobacter _sp._AS-1として示した。図２より最類縁種はEnterobacter chengduensisであることが示された。

【0065】

OrthoANIによって示された類縁種との相同性を以下の表６に示す。ANIも同様にEnterobacter chengduensisが最大値を取り、その数値は94.783%となった。従って、獲得したEnterobacter属細菌は新種であると言える。

【0066】

【表6】

【0067】

以上の結果より、本手法により存在比率の低い未培養のEnterobacter属細菌を分離培養することに成功した。

【0068】

実施例1、2の結果より、本手法によりレアバイオスフィアに属する未培養微生物種の選択的培養が可能であることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0069】

希少微生物の分離培養に利用できる。

【図1】

【図2】

【配列表】

0007502792000001.app