特許 7502813 汎用型の臨床における異体ＤＮＴ細胞の複数回再注入用の効率的体外増幅方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-11

(45)【発行日】2024-06-19

(54)【発明の名称】汎用型の臨床における異体ＤＮＴ細胞の複数回再注入用の効率的体外増幅方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20240612BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20240612BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20240612BHJP

   A61P 31/00 20060101ALN20240612BHJP

   A61P 37/06 20060101ALN20240612BHJP

   A61P 37/08 20060101ALN20240612BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20240612BHJP

   A61K 35/17 20150101ALN20240612BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N5/02

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/06

A61P37/08

A61P37/02

A61K35/17

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022564067

(86)(22)【出願日】2021-04-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-31

(86)【国際出願番号】 CN2021087312

(87)【国際公開番号】W WO2021213236

(87)【国際公開日】2021-10-28

【審査請求日】2022-12-14

(31)【優先権主張番号】202010313732.1

(32)【優先日】2020-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522410019

【氏名又は名称】瑞創生物技術有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＲＵＩＣＨＵＡＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨ． ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ８０３－８０６，Ｋｅｃｈｕａｎｇ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ａ，Ｋｅｑｉａｏ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐａｒｋ，Ｋｅｑｉａｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈａｏｘｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１２０３０，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】楊 黎明

(72)【発明者】

【氏名】相 志強

(72)【発明者】

【氏名】孫 清華

【審査官】藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４１０９６５３（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０２０／００４６７６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１０３５７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００７１９８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／００９８０９５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Journal of Experimental and Clinical Cancer Research，2019年，Vol.38, No.123，pp.1-14

【文献】The Journal of Immunology，2006年，Vol.177，pp.6920-6929

【文献】Journal for ImmunoTherapy of Cancer，2019年，Vol.7, No.17，pp.1-14

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

汎用型ＤＮＴ細胞体外増幅方法であって、
（ｉ） あらかじめ提供された末梢血の開始サンプルＩにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去することにより、サンプルＩＩを得る工程、
（ｉｉ） ＤＮＴ細胞生長に適する培地を含有し、固定されたＴ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩを培養することにより、サンプルＩＩＩを得る工程、
（ｉｉｉ） ＤＮＴ細胞生長に適する培地を含有し、濃度が３０－８０ ｎｇ／ｍＬの可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩＩを培養することにより、サンプルＩＶを得る工程、
（ｉｖ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、濃度が２５ ｎｇ／ｍＬの可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＶを培養することにより、所要量の汎用型ＤＮＴ細胞としてサンプルＶを得る工程、ならびに
（ｖ） ＤＮＴ細胞の保存に適し、ヒト血清アルブミンを含有する溶液系において、サンプルＶを収集することにより、臨床において使用される汎用型ＤＮＴ細胞としてＤＮＴ細胞製剤を得る工程を含み、
ここで、前記工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の培養系には、いずれも３００－７００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２が含有され、そしていずれも組み換えヒトインターロイキン－４およびＡＢ血清が含有されておらず、
前記Ｔ細胞分裂促進因子は、ＣＤ３と結合する抗体であり、
前記サンプルＩＩは、凍結保存後に再生しない、そのままの細胞溶液であることを特徴とする体外増幅方法。

【請求項2】

前記工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の培養系には、いずれも５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２が含有されることを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【請求項3】

前記工程（ｉｉｉ）の前記培地は、濃度が４０－６０ ｎｇ／ｍＬの可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含むことを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【請求項4】

前記工程（ｉｉｉ）の前記培地は、濃度が５０ ｎｇ／ｍＬの可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含むことを特徴とする請求項３に記載の体外増幅方法。

【請求項5】

前記工程（ｉｉ）～（ｉｖ）の培養系には、さらに、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるサイトカインが含まれていることを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【請求項6】

前記工程（ｉｉ）では、培養系における増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度は１×１０^６～４×１０^６ 細胞／ｍＬであることを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【請求項7】

工程（ｉｉｉ）では、さらに、ＤＮＴ細胞の表現型および生存率を検出することを含むことを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【請求項8】

工程（ｖ）では、
（ｖａ）遠心でサンプルＶにおけるＤＮＴ細胞を収集する工程、
（ｖｂ）２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水でＤＮＴ細胞を洗浄する工程、ならびに
（ｖｃ）２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水でＤＮＴ細胞を濃度が１×１０^８細胞／ｍＬになるように調整する工程を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の体外増幅方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、汎用型の臨床における異体ＤＮＴ細胞の複数回再注入用の効率的体外増幅方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫細胞治療は、顕著な治療効果を有する、新しい腫瘍治療手段で、免疫による抗癌の新規な治療方法である。生物技術および生物製剤で患者や健常者のドナーの体内から採集された免疫細胞を体外で培養および増幅した後、患者の体内に戻す方法で、生体の自己免疫機能を活性化、増強することによって、腫瘍治療する目的を果たす。

【0003】

免疫細胞治療は、癌、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、重度のアレルギー性疾患を含む、多くの人類を脅かす重病の重要な治療手段で、重度のウイルス感染でさえ、免疫細胞治療が成功した症例がある。

【0004】

現在、免疫細胞治療は、自家免疫細胞を採取して体外で培養して増幅した後、再注入する場合が多い。複数回の再注入治療が必要な場合、数回にわたってヒト末梢血における免疫細胞を採取して培養・増幅を行わなければ、臨床における再注入の要求を満たすことができない。病状が重篤なため、治療が必要な患者は培養に十分な免疫細胞を提供できないことが多く、そして患者は病気の体質や様々な薬物投与による治療のため、免疫細胞の体外における培養・増幅が非常に困難で、培養できないこともある。

【0005】

そのため、本分野では、健常者のドナーから免疫細胞を獲得し、かつ複数回の再注入に使用することができる汎用型免疫細胞体外増幅方法が必要で、それによって臨床治療における使用が便利になって複数回の採取と複数回の再注入が臨床にもたらす不便がなくなり、同時に腫瘍患者の末梢血の低品質、そして腫瘍細胞が存在するリスクが解消される。

【発明の概要】

【0006】

本発明の目的は、斬新な汎用型の臨床における異体ＤＮＴ細胞の複数回再注入用の効率的体外増幅方法を提供することである。

【0007】

本発明の第一の側面では、汎用型ＤＮＴ細胞体外増幅方法であって、
（ｉ） ドナーからの末梢血の開始サンプルＩを提供する工程、
（ｉｉ） 開始サンプルにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去することにより、サンプルＩＩを得る工程、
（ｉｉｉ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、固定されたＴ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩを培養することにより、サンプルＩＩＩを得る工程、
（ｉｖ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、濃度が３０－８０ ｎｇ／ｍＬ（好ましくは４０－６０ ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ）の可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩＩを培養することにより、サンプルＩＶを得る工程、
（ｖ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、濃度が１５－４０ ｎｇ／ｍＬ（好ましくは２０－３０ ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５ ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくはサブ工程（ｖａ）における前記Ｔ細胞分裂促進因子の添加量の１／２）の可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＶを培養することにより、所要量の汎用型ＤＮＴ細胞としてサンプルＶを得る工程、ならびに
（ｖｉ） ＤＮＴ細胞の保存に適し、ヒト血清アルブミンを含有する溶液系において、サンプルＶを収集することにより、臨床において使用される汎用型ＤＮＴ細胞としてＤＮＴ細胞製剤を得る工程を含み、
ここで、前記工程（ｉｉｉ）～（ｖ）の培養系には、いずれも２００－１０００ ＩＵ／ｍＬ（好ましくは３００－７００ ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５００ ＩＵ／ｍＬ）の組み換えヒトインターロイキン－２が含有され、そしていずれも組み換えヒトインターロイキン－４およびＡＢ血清が含有されていないことを特徴とする方法を提供する。

【0008】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉ）では、前記のドナーは健常者のドナーである。

【0009】

もう一つの好適な例において、前記サンプルＩの量は１０－３００ ｍｌ、好ましくは２０－２００ ｍｌである。

【0010】

もう一つの好適な例において、前記サンプルＩＩは、凍結保存後に再生させた細胞溶液である。

【0011】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉ）は、開始サンプルにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去することにより、サンプルＩＩａ（濃縮されたＤＮＴ細胞）を得ること、遠心でサンプルＩＩａ（濃縮されたＤＮＴ細胞）を収集した後、凍結保存液で再懸濁させ、プログラム制御で降温させた後、液体窒素において保存し、サンプルＩＩｂ（濃縮・凍結保存されたＤＮＴ細胞）とすること、サンプルＩＩｂを凍結保存した後、３７℃で解凍し、培地で１回洗浄し、さらに培地で再懸濁させ、サンプルＩＩｃ（濃縮・凍結保存・再生されたＤＮＴ細胞）とすることを含む。

【0012】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）～（ｖ）の培養系では、培養条件は３７℃、５％ ＣＯ_２である。

【0013】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）～（ｖ）の培養系には、さらに、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるサイトカインが含まれている。

【0014】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）の前に、さらに、０．９％生理食塩水でサンプルＩＩを洗浄する工程（ｉｉａ）を含む。

【0015】

もう一つの好適な例において、前記Ｔ細胞分裂促進因子は、ＣＤ３と結合する抗体、レクチン、ＤＮＴ細胞が増幅するように刺激できる化合物、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0016】

もう一つの好適な例において、レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、インゲンマメレクチン（ＰＨＡ）、ダイズレクチン（ＳＢＡ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0017】

もう一つの好適な例において、前記ＤＮＴ細胞が増幅するように刺激できる化合物は、ＩＰＰ、パミドロネート（Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0018】

もう一つの好適な例において、前記Ｔ細胞分裂促進因子は、ＣＤ３と結合する抗体である。

【0019】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）における培養系は培養瓶、好ましくはＴ２５培養フラスコにある。

【0020】

もう一つの好適な例において、前記固定されたＴ細胞分裂促進因子とは、培養瓶またはマイクロプレートにコーティングされたＴ細胞分裂促進因子のことである。

【0021】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）では、培養系における増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度は１×１０^６～４×１０^６ 細胞／ｍＬである。

【0022】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）の培養時間は２４－７２時間、好ましくは３６－６０時間、より好ましくは４８時間である。

【0023】

もう一つの好適な例において、工程（ｉｉｉ）では、前記培地に１５％－２５％（好ましく１８％－２２％、より好ましく２０％）の前記ドナーの血漿が添加してある。

【0024】

もう一つの好適な例において、工程（ｉｉｉ）は、サブ工程（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）および（ｉｉｉｃ）に分かれ、前記サブ工程（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）および（ｉｉｉｃ）はサンプルＩＩＩにおけるＤＮＴ細胞に対する３回の増幅である。

【0025】

もう一つの好適な例において、前記サブ工程（ｉｉｉａ）では、培養系における増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度は１×１０^６～４×１０^６ 細胞／ｍＬである。

【0026】

もう一つの好適な例において、前記サブ工程（ｉｉｉａ）および（ｉｉｉｂ）では、培養系における増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度はそれぞれ独立に０．５×１０^６～１×１０^６ 細胞／ｍＬである。

【0027】

もう一つの好適な例において、前記サブ工程（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）および（ｉｉｉｃ）の培養時間はそれぞれ独立に２４－７２時間、好ましくは３６－６０時間、より好ましくは４８時間である。

【0028】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｉｉ）の培養時間は９６－１９２時間、好ましくは１２０－１６８時間、より好ましくは１４４時間である。

【0029】

もう一つの好適な例において、工程（ｉｖ）では、２－５回（好ましくは３－４回、より好ましくは３回）のＤＮＴ細胞の増幅を含み、各増幅で、増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度はそれぞれ独立に１×１０^６～３×１０^６ 細胞／ｍＬで、かつ各増幅の培養時間は２４－７２時間、好ましくは３６－６０時間、より好ましくは４８時間である。

【0030】

もう一つの好適な例において、工程（ｉｖ）では、さらに、ＤＮＴ細胞の表現型および生存率を検出することを含む。

【0031】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｉｖ）の培養時間は７２－１６８時間、好ましくは９６－１４４時間、より好ましくは１２０時間である。

【0032】

もう一つの好適な例において、工程（ｖ）では、２－４回（好ましくは２回）のＤＮＴ細胞の増幅を含み、各増幅で、増幅されるＤＮＴ細胞の初期濃度はそれぞれ独立に１×１０^６～３×１０^６ 細胞／ｍＬで、かつ各増幅の培養時間は２４－７２時間、好ましくは３６時間である。

【0033】

もう一つの好適な例において、工程（ｖ）では、さらに、ＤＮＴ細胞の表現型および生存率を検出することを含む。

【0034】

もう一つの好適な例において、前記工程（ｖ）の培養時間は４８－９６時間、好ましくは７２時間である。

【0035】

もう一つの好適な例において、工程（ｖｉ）では、
（ｖｉａ）遠心でサンプルＶにおけるＤＮＴ細胞を収集する工程、
（ｖｉｂ）２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水（または「溶媒」）でＤＮＴ細胞を洗浄する工程、ならびに
（ｖｉｃ）２．５％ヒト血清アルブミン含有生理食塩水（または「溶媒」）でＤＮＴ細胞を濃度が１×１０^８細胞／ｍＬになるように調整する工程を含む。

【0036】

本発明の第二の側面では、有効量の本発明の第一の側面に記載の方法によって得られるＤＮＴ細胞の使用であって、薬物組成物または製剤の製造に使用され、前記薬物組成物または製剤は
（ａ） 腫瘍の予防および／または治療、
（ｂ） 感染性疾患の予防および／または治療、
（ｃ） 自己免疫性疾患の予防および／または治療、
（ｄ） アレルギー反応の予防および／または治療、
（ｅ） 移植片対宿主病の予防および／または治療、ならびに／あるいは
（ｆ） 免疫応答の調節
に用いられる使用を提供する。

【0037】

もう一つの好適な例において、前記腫瘍は前記ＤＮＴ細胞と異体の腫瘍である。

【0038】

もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0039】

もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0040】

もう一つの好適な例において、前記固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、メラノーマ、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳膠細胞腫、頭頚部癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0041】

もう一つの好適な例において、前記自己免疫性疾患は、糖尿病、関節炎、多発性硬化、エリテマトーデス、炎症性腸疾患、皮膚炎、脳膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球接着不全症、リウマチ熱、ライター症候群、全身性進行性硬化、原発性胆汁性肝硬変、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性病症、抗原抗体複合体を介する疾患、自己免疫溶血性貧血、リンパ腫性甲状腺腫、中毒性びまん性甲状腺腫、習慣性自然流産、レイノー症候群、糸球体性腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、組織特異性自己免疫、変性自己免疫遅延型過敏反応、ＡＩＤＳの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、アジソン病、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

【0042】

もう一つの好適な例において、前記アレルギー反応は、花粉熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アメリカツタウルシおよびキヅタ、室内ヤケヒョウヒダニ、蜂花粉、堅果、甲殻類動物、ペニシリンに対するアレルギー反応、またはこれらの組み合わせを含む。

【0043】

本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載の方法によって得られるＤＮＴ細胞の使用であって、
（ａ） 腫瘍の予防および／または治療、
（ｂ） 感染性疾患の予防および／または治療、
（ｃ） 自己免疫性疾患の予防および／または治療、
（ｄ） アレルギー反応の予防および／または治療、
（ｅ） 移植片対宿主病の予防および／または治療、ならびに／あるいは
（ｆ） 免疫応答の調節
に用いられることを特徴とする使用を提供する。

【0044】

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】応用例１－４と比較例１および２の細胞生長曲線を示すが、具体的に、応用例と比較例の細胞をそれぞれ培養の１日目、７日目、１４日目および１７日目にサンプリングして細胞総数を検出し、細胞総数を比較した変化の結果である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明者は、幅広く深く研究し、大量のプロセス最適化実験を行ったところ、初めて、ドナーから末梢血を一括に採取して臨床において異体ＤＮＴ細胞を複数回で再注入する、実用型の効率的体外増幅方法を開発した。具体的に、本発明では、ＤＮＴ細胞の培地の配合および培養のプロセスを最適化し、現在のＤＮＴ細胞の体外増幅方法と比べ、本発明の方法では、別途にＩＬ－４を添加する必要がなく、そして連続培養の過程において段階的にＴ細胞活性化剤（ここで、抗ヒトＣＤ３抗体）の使用量を減らすことで、高純度の汎用型ＤＮＴ細胞を獲得し、最終製品における不純物の含有量を大幅に減少させることができる。

【0047】

結果から、本発明の方法は、ヒト末梢血から新鮮なサンプルを採取してＤＮＴ細胞を濃縮する効率的な体外増幅にも、上記ＤＮＴ細胞を凍結保存しておき、後で再生して体外で効率的にＤＮＴ細胞を増幅するのにも使用可能であることがわかる。本発明のプロセスによって増幅して得られるＤＮＴ細胞は数が多く、そしてそのうちのＤＮＴ細胞の特徴的表面マーカーとしてＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^－ Ｔ細胞の純度が高い（＞８５％）。ＤＮＴ細胞は腫瘍殺傷活性がＴ細胞受容体に依存しないため、同一のドナーから製造されるＤＮＴ細胞は異なる患者の臨床治療における使用に提供することができる。

【0048】

これに基づき、本発明を完成させた。

【0049】

用語
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるように、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有する。出願全体において、ほかの定義が記述されている。

【0050】

本明細書で用いられるように、用語「約」とは当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内にある値または組成で、それによって部分的にどのように値または組成を計量または測定するかというのが決まる。

【0051】

本明細書で用いられるように、用語「投与」、「施用」とは、当業者に既知の様々な方法および送達システムの任意の一つによって本発明の製品を物理的に被験者に導入することで、静脈内、筋肉内、皮下、腹膜内、脊髄またはほかの胃腸外の投与経路、たとえば注射または輸注によるものを含むが、入れ替えて使用することができる。

【0052】

本発明の体外増幅方法
本発明において、汎用型ＤＮＴ細胞体外大量増幅方法であって、
（ｉ） ドナーからの末梢血の開始サンプルＩを提供する工程、
（ｉｉ） 開始サンプルにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去することにより、サンプルＩＩを得る工程、
（ｉｉｉ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、固定されたＴ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩを培養することにより、サンプルＩＩＩを得る工程、
（ｉｖ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、濃度が３０－８０ ｎｇ／ｍＬ（好ましくは４０－６０ ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ）の可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＩＩを培養することにより、サンプルＩＶを得る工程、
（ｖ） ＤＮＴ細胞の生長に適する培地を含有し、濃度が１５－４０ ｎｇ／ｍＬ（好ましくは２０－３０ ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２５ ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくはサブ工程（ｖａ）における前記Ｔ細胞分裂促進因子の添加量の１／２）の可溶性Ｔ細胞分裂促進因子を含む培養系において、サンプルＩＶを培養することにより、所要量の汎用型ＤＮＴ細胞としてサンプルＶを得る工程、ならびに
（ｖｉ） ＤＮＴ細胞の保存に適し、ヒト血清アルブミンを含有する溶液系において、サンプルＶを収集することにより、臨床において使用される汎用型ＤＮＴ細胞としてＤＮＴ細胞製剤を得る工程を含み、
ここで、前記工程（ｉｉｉ）～（ｖ）の培養系には、いずれも２００－１０００ ＩＵ／ｍＬ（好ましくは３００－７００ ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは５００ ＩＵ／ｍＬ）の組み換えヒトインターロイキン－２が含有され、そしていずれも組み換えヒトインターロイキン－４およびＡＢ血清が含有されていない方法を提供する。

【0053】

本明細書で用いられるように、用語「二重陰性Ｔ細胞」および「ＤＮＴ細胞とは、Ｔリンパ球のサブグループで、その細胞表面にＣＤ３分子が発現されるが、ＣＤ４、ＣＤ８分子およびＣＤ１６／ＣＤ５６分子が欠けている細胞であるが、入れ替えて使用することができる。ここで、ＣＤ４はヘルパーＴ細胞の特徴的表面分子で、ＣＤ８は細胞傷害性Ｔ細胞の特徴的表面分子で、ＣＤ１６／ＣＤ５６はＮＫ細胞の特徴的表面分子である。ＤＮＴ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するが、αβまたはγδ ＴＣＲでもよい。本発明の方法によって増幅されるＤＮＴ細胞のサブグループは、αβ^＋とγδ^＋ Ｔ細胞の混合物を含んでもよい。一つの好適な実施様態において、ＤＮＴ細胞は、ヒト末梢血由来の細胞である。

【0054】

開始サンプルは、二重陰性Ｔ細胞またはその前駆体を含有する任意の生物学的サンプル由来のものでもよい。このようなサンプルは、新鮮か、冷蔵保存の血液、骨髄、リンパ組織、胸腺、肝臓、脾臓、リンパ節組織、腫瘍組織、胎児組織細胞およびその分別または濃縮された画分を含むが、これらに限られず、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）由来のものでもよい。

【0055】

一つの好適な実施形態において、開始サンプルは血液、好ましくはヒト血液、より好ましくはヒト末梢血である。

【0056】

開始サンプルの培養または分別前に、開始サンプルは基本的にＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞が除去されている。「基本的」とは、これらの細胞のうちの大半が除去されていることであるが、これらの細胞のうちの一部が残っていることもある。

【0057】

本分野で既知の技術によってサンプルにおけるこれらの細胞の種類を除去することができる。具体的に、開始サンプルに、除去されるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞と結合するが、二重陰性Ｔ細胞と結合しない抗体を添加することができる。一つの好適な実施形態において、サンプルに特異的にＣＤ４およびＣＤ８のマーカーと結合する抗体を添加する。

【0058】

もう一つの好適な実施形態において、サンプルに特異的にＣＤ４およびＣＤ８と結合する磁気ビーズを添加する。

【0059】

一旦開始サンプルからＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞が除去されると、本発明の方法はすぐに続けてもよく、当該サンプルを凍結して保存し、後の使用に備えてもよいが、低温冷蔵庫または設備（－８０℃以下）または液体窒素でもよい。そのため、ＤＮＴ細胞が必要な場合、ＤＮＴ細胞の体外増幅は、その時点の凍結サンプルから開始してもよい。

【0060】

本発明の一つの実施形態において、健常者のドナーから一括に末梢血（１００－４００ ｍｌ）を採取し、体外でＤＮＴ細胞を濃縮させた後、すぐに凍結保存し、臨床再注入プランに従って当該濃縮されたＤＮＴ細胞を再生させ、本発明の体外増幅に使用する方法を提供する。

【0061】

好ましくは、前記の本発明の方法の工程（ｉｉ）は、開始サンプルにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去することにより、サンプルＩＩａ（濃縮されたＤＮＴ細胞）を得ること、サンプルＩＩａをそのまま本発明の体外増幅方法によって培養するか、液体窒素で凍結保存した後、再生して培養すること、サンプルＩＩａ（濃縮されたＤＮＴ細胞）を遠心で収集した後、凍結保存液で再懸濁させ、プログラム制御で降温させた後、液体窒素において保存し、サンプルＩＩｂ（濃縮・凍結保存されたＤＮＴ細胞）とすること、サンプルＩＩｂを凍結保存した後、臨床の要求によって再生して培養すること、３７℃で解凍した後、培地で１回洗浄し、さらに培地で再懸濁させ、サンプルＩＩｃ（濃縮・凍結保存・再生されたＤＮＴ細胞）とすることを含んでもよい。

【0062】

培地において基本的にＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞が除去されたサンプルを培養し、前記培地は固定されたＴ細胞分裂促進因子およびＤＮＴ細胞が生長するように刺激できる試薬を含む。

【0063】

固定されたＴ細胞分裂促進因子は、ＣＤ３またはＴ細胞受容体と結合する抗体およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）やインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）を含むレクチンを含むが、これらに限定されない二重陰性Ｔ細胞を刺激できる任意の試薬、あるいはＩＰＰ、パミドロネート（Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）およびゾレドロネート（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）を含むが、これらに限定されないＤＮＴ細胞が増幅するように刺激できる化合物でもよい。好ましくは、Ｔ細胞分裂促進因子は、ＣＤ３の抗体、たとえば、ＯＫＴ３である。

【0064】

本分野で既知の技術でＴ細胞分裂促進因子を固定することができる。好ましくは、Ｔ細胞分裂促進因子は固相支持体にコーティングされ、前記固相支持体はマイクロプレート、シャーレ、培養バッグ、または培養瓶を含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｔ細胞分裂促進因子は、固定された抗ＣＤ３抗体で、より好ましくは、マイクロプレートに固定されたものである。

【0065】

ＤＮＴ細胞が生長するように刺激できる試薬は、任意の適切な試薬でもよく、好ましくはサイトカイン、たとえば、インターロイキンである。好ましくは、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）またはこれらのうちの２種または２種以上の混合物を含む。

【0066】

なお、本発明において、増幅培養に使用される培地に、ＩＬ－４が含まれず、かつＡＢ血清が含まれない。

【0067】

試薬の濃度は、二重陰性細胞の増幅の促進に適するものである。好ましくは、サイトカインの投与範囲は、約２００ ＩＵ／ｍＬ～１０００ ＩＵ／ｍＬである。特に好適な実施形態において、ＩＬ－２の培地における濃度は５００ ＩＵ／ｍＬである。

【0068】

培地は、Ｔ細胞の培養に適する任意の培地でもよく、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｘ－ＶＩＶＯＩ０およびＸ－ＶＩＶＯＩ５、ならびに任意のほかの市販の無動物血清培地をふくんでもよいが、これらに限定されない。培地は、抗生物質を含むほかの適切な試薬を含有することが好ましい。

【0069】

一つの実施形態において、ＤＮＴ細胞が生長するように刺激できる試薬および固定されたＴ細胞分裂促進因子で培養するとき、細胞はＤＣ細胞と共培養するか、抗原およびサイトカインで刺激してもよい。抗腫瘍ＤＮＴ細胞の製造において、不活性化された腫瘍細胞あるいは腫瘍特異的または腫瘍関連の抗原、ペプチドまたはネオアンチゲン（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ）を使用してもよい。

【0070】

細胞は、工程（ｉｉ）－（ｖ）のうちのいずれかで範囲が約２－８日の一定の時間で培養することが好ましい。好ましくは、各工程は、約３－７日、より好ましくは４－６日行われる。

【0071】

本方法によって製造されるＤＮＴ細胞の純度は本分野で既知の技術、たとえば、フローサイトメトリーやほかの生細胞表現型同定技術によって実証することができる。

【0072】

本発明によるＤＮＴ細胞の用途
また、本発明は、本発明の方法によって得られる二重陰性Ｔ細胞の任意の応用の全部における使用を含む。本発明の方法によって製造される異体Ｔ細胞は、多くの腫瘍の治療に使用することができ、大規模の製造が可能で、品質が安定して制御可能で、任意の適切な患者に随時に使用することができる。

【0073】

本発明の実施形態において、本発明の方法によって増幅された二重陰性Ｔ細胞は強い抗腫瘍作用を有する。そのため、一つの実施形態において、本発明は、腫瘍を治療する方法であって、それが必要な動物に有効量の本発明の方法によって得られた汎用型ＤＮＴ細胞を投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、本発明の方法によって得られる有効量の汎用型ＤＮＴ細胞の腫瘍を治療するための使用を含む。また、本発明は、有効量の本発明の方法によって得られる汎用型ＤＮＴ細胞の腫瘍を治療する薬物の製造における使用を含む。

【0074】

ここで使用される用語「有効量」とは、投与量および要求される時間内で有効に必要な結果を実現される投与量、たとえば、癌を治療する投与量である。

【0075】

ここで使用される用語「動物」は、動物界のすべてのメンバーを含み、ヒトを含む。一つの好適な実施形態において、前記動物はヒトである。

【0076】

用語「治療」は、疾患または病症（たとえば、癌、移植拒絶や移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー反応、感染など）の１つまたは複数の症状の軽減または改善、疾患の程度の軽減、疾患の安定化状態、疾患の拡散の予防、疾患の進行の遅延または緩和および疾患状態の改善または緩和、検出可能か、検出不能な症状の緩和および／または治療を受けない場合に予想される生存よりも延びる生存を含むが、これらに限定されない。

【0077】

腫瘍または癌の治療において、治療可能な腫瘍は、二重陰性Ｔ細胞を、単独であるいは、ほかの治療、たとえば、手術、放射線療法または様々な標的治療薬、免疫チェックポイント阻害剤、免疫細胞増強剤やＤＮＴ細胞の腫瘍組織における浸潤を増強させるナノ材料を含む化学療法などと併用して治療することができる任意の腫瘍である。

【0078】

治療可能な癌は、血管新生がしていない腫瘍または血管新生が基本的にしていない腫瘍、および血管新生がした腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（たとえば血液腫瘍、たとえば白血病やリンパ腫）または固形腫瘍を含んでもよい。本発明で治療する癌の種類は、癌、胚細胞腫瘍や肉腫、および一部の白血病やリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、たとえば肉腫、癌やメラノーマを含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌および児童腫瘍／癌も含む。

【0079】

血液癌は血液、骨髄、またはリンパ組織の癌である。血液（または血液原性）癌の例は、白血病を含み、それに急性白血病（たとえば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球型、単核球性や赤白血病）、慢性白血病（たとえば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髓性白血病や慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫（無痛および重症の場合）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病や脊髄形成異常が含まれる。

【0080】

固形腫瘍は、通常、嚢腫や液体領域の組織の腫瘤を含まない。固形腫瘍は良性でも悪性でもよい。異なる種類の固形腫瘍はこれらを形成する細胞の種類によって命名される（たとえば肉腫、癌やリンパ腫）。固形腫瘍は、たとえば肉腫および癌の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、卵巣癌を含む。

【0081】

また、本発明は、ＤＮＴ細胞のほかの治療の用途、たとえば、感染性疾患の治療および、たとえば、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植拒絶や移植片対宿主病の治療における免疫応答の調節を含む。このような場合、ＤＮＴ細胞を製造する方法は、適切な感染物、アレルゲンになる細胞または組織を抗原として添加することを含んでもよい。

【0082】

そのため、一つの実施形態において、本発明は、感染性疾患を治療する方法であって、有効量の本発明の方法によって得られる二重陰性Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、有効量の本発明の方法によって得られる二重陰性Ｔ細胞で感染性疾患を治療する使用を含む。また、本発明は、本発明の方法によって得られる有効量の二重陰性Ｔ細胞の感染性疾患を治療する薬物の製造における使用を含む。

【0083】

更なる実施形態において、本発明は、免疫応答を調節する方法であって、有効量の本発明の方法によって得られる二重陰性Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、有効量の本発明の方法によって得られる二重陰性Ｔ細胞の免疫応答を調節するための使用を含む。また、本発明は、本発明の方法有効量によって得られるの二重陰性Ｔ細胞の免疫応答を調節する薬物の製造における使用を含む。

【0084】

一つの実施形態において、ＤＮＴ細胞は、自己免疫疾患の治療に使用される。本発明によって治療できる自己免疫疾患は、糖尿病、関節炎、多発性硬化、エリテマトーデス、炎症性腸疾患、皮膚炎、脳膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球接着不全症、リウマチ熱、ライター症候群、全身性進行性硬化、原発性胆汁性肝硬変、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、ＣＮＳ炎症性病症、抗原抗体複合体を介する疾患、自己免疫溶血性貧血、リンパ腫性甲状腺腫、中毒性びまん性甲状腺腫、習慣性自然流産、レイノー症候群、糸球体性腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、組織特異性自己免疫、変性自己免疫遅延型過敏反応、ＡＩＤＳの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎およびアジソン病を含むが、これらに限定されない。

【0085】

もう一つの実施形態において、ＤＮＴ細胞は、移植片対宿主病の治療に使用され、ここで、移植片における免疫細胞がレシピエントの正常組織に免疫攻撃をする。移植された組織が免疫細胞を含有するとき、たとえば、白血病、再生不良性貧血を治療するとき、および酵素または免疫欠陥のため、健常者のドナーの骨髄またはリンパ組織を移植するとき、そのような場合がある。

【0086】

更なる実施形態において、ＤＮＴ細胞は、アレルギー反応の治療に使用される。アレルギー反応において、免疫系は、通常、無毒性・無害の抗原またはアレルゲンを攻撃する。本発明の方法によって予防または治療できるアレルギー反応は、花粉熱、喘息、アトピー性皮膚炎ならびにアメリカツタウルシおよびキヅタ、室内ヤケヒョウヒダニ、蜂花粉、堅果、甲殻類動物、ペニシリンに対するアレルギー反応を含むが、これらに限定されない。

【0087】

本発明の方法によって製造されるＤＮＴ細胞は、体内への投与に適する生物的適応性の形態で対象に投与する薬物にしてもよい。「体内への投与に適する生物的適応性の形態」とは、投与される物質の一つの形態で、ここで、治療効果が任意の毒性作用を超える。物質は、生きている生物に投与してもよく、ヒトおよび動物が含まれる。組成物は適切な形態、好ましくは注射、たとえば、静脈内、皮下、筋肉内の注射などによって投与される。

【0088】

ここに記載される組成物は、既知の薬学的に許容される組成物を製造する方法によって製造することができ、前記組成物は対象に投与可能で、このような有効量の細胞と薬学的に許容される担体の組み合わせは混合物である。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡ ２０００）に適切な担体が記載されている。これに基づき、組成物は、物質と１種または複数種の薬学的に許容される担体または希釈剤を合わせた溶液、生理溶液を含む、適切なｐＨを有する等張の緩衝溶液を含むが、これらに限定されない。

【0089】

たとえば、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに個体の必要な応答を引き起こす能力などの要素により、組成物の有効量は異なる。投与量の方案を調節することにより、最適な治療応答を提供することができる。たとえば、複数に分かれる投与量で毎週投与するか、投与量は治療状況に応じる比率で減少してもよい。

【0090】

本発明と併用できる薬物は、治療される疾患または病症を治療することができるほかの活性物質を含む。たとえば、腫瘍治療において、ほかの抗癌剤は同一の組成物または別の組成物で投与してもよい。

【0091】

本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病床、および患者の疾患の種類、重篤度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。

【0092】

「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、臨床試験によって決められる。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重の投与量、好ましくは１０^６～１０^８細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばＲｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１９：１６７６，１９８８）によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、患者の疾患の状況をモニタリングすることによって得られるため、治療の調節は医学分野の技術者によって容易に決めることができる。

【0093】

対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用される。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物はｉ．ｖ．注射によって施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい。

【0094】

本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのＴ細胞を治療的投与量に増殖させる方法によって活性化および増幅した細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、アザシチジン（ＡＲＡ－Ｃとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはＭＳ患者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療またはＰＭＬ患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやＦＫ５０６、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増幅した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。

【0095】

患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。ヒトへ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０^９個～１×１０^１１個の本発明の二重陰性Ｔ細胞を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。

【0096】

本発明の主な利点は以下の通りである。

【0097】

１） 配合とプロセスが改善され、臨床用ヒトＤＮＴ細胞の体外効率的増幅方法に適する。

【0098】

２） 配合とプロセスが改善され、ヒトＡＢ血清を使用することがなく、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）も必要ではない。

【0099】

３） 配合とプロセスが改善され、新しく濃縮されたＤＮＴ細胞も、凍結保護後に再生したＤＮＴ細胞も培養することができる。

【0100】

４） 配合とプロセスが改善され、一括に採取／凍結保存が可能で、複数回で再生して培養し、複数回の再注入または複数の患者に提供することができる。

【0101】

５） 配合とプロセスが改善され、細胞増幅数は１×１０^９細胞／ｍＬ全血以上に達することができる。

【0102】

６） 配合とプロセスが改善され、最終製品のＤＮＴ細胞の純度（ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^－） ≧ ８５％になるように保証される。

【0103】

７） 配合とプロセスが改善され、細胞体外効率的腫瘍殺傷活性（生物学的効力） ≧ ５０％になるように保証される。

【0104】

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。

【0105】

実施例１：磁気ビーズによって濃縮されるＤＮＴ細胞の体外増幅培養
１．１ 健常者ドナーのＤＮＴ細胞の磁気ビーズによる濃縮
健常者のドナーから末梢血を２０～２００ ｍｌ収集してヘパリンナトリウム含有管に入れた。リンパ細胞分離液で白膜層細胞を分離し、まずＣＤ４磁気ビーズでＣＤ４^＋細胞を除去し、さらにＣＤ８磁気ビーズでＣＤ８^＋細胞を除去し、これによって得られたがＣＤ４^＋とＣＤ８^＋が除去されたＤＮＴ細胞である。

【0106】

１．２ ＤＮＴ細胞の体外増幅培養
まず、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）でＴ２５培養瓶をコーティングし、工程１．１で得られたＤＮＴ細胞をＡＩＭ－Ｖ培地（１０％ドナー血漿および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）で１×１０^６～４×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整し、前記のコーティングされたＴ２５培養瓶に入れた。３７oＣの５％ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。

【0107】

３日目に、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（１０％ドナー血漿および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～１×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0108】

５日目に、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（１０％ドナー血漿および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～２×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0109】

７日目に、ＤＮＴ細胞の表現型と生存率を検出し、そして新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（５０ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0110】

９日目に、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（５０ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0111】

１０日目に、ＤＮＴ細胞の表現型と生存率を検出し、そして新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（５０ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して培養バッグに移し、続いて培養した。

【0112】

１２日目に、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（５０ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して培養バッグに移し、続いて培養した。

【0113】

１４日目に、ＤＮＴ細胞の表現型と生存率を検出し、最終製品の不純物の干渉が低下し、ＤＮＴ細胞の純度が向上するように、ＡＩＭ－Ｖ培地における抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の濃度を２５ ｎｇ／ｍＬに低下させた。新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（２５ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0114】

１５～１６日目に、必要により、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地（２５ ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）でＤＮＴ細胞を１×１０^６～３×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるように調整して続いて培養した。

【0115】

１７～１８日目に、必要により、ＤＮＴ細胞を回収した。

【0116】

１．３ ＤＮＴ細胞の回収およびＤＮＴ細胞製剤の作成
１７～１８日目に、必要により、ＤＮＴ細胞を回収した。２５０ ｍｌ円錐底遠心瓶尖で細胞を収集し、９００×ｇで１０分間遠心し、さらに溶媒で洗浄した。収集されたＤＮＴ細胞を溶媒で０．５～１×１０^８細胞／ｍＬの濃度になるように調整し、これをＤＮＴ細胞製剤の完成品とし、品質チェックに合格した後、臨床における使用に供した。

【0117】

実施例２：磁気ビーズによって濃縮されるＤＮＴ細胞の凍結保存後の体外増幅培養
２．１ 健常者ドナーのＤＮＴ細胞の磁気ビーズによる濃縮
上記１．１と同様である。

【0118】

２．２ 得られたＤＮＴ細胞の凍結保存
工程２．１で得られたＤＮＴ細胞を、０．９％生理食塩水で１回洗浄し、凍結保存液で再懸濁させて細胞濃度が３～５×１０^６細胞／ｍＬになるように調整し、液体窒素において凍結保存し、必要によって再生して体外増幅培養を行った。

【0119】

２．３．凍結保存ＤＮＴ細胞の再生
工程２．２で凍結保存されたＤＮＴ細胞を液体窒素から取出し、３７oＣの恒温オーブンで解凍した。解凍されたＤＮＴ細胞をＡＩＭ－Ｖ培地（５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）で１回洗浄し、さらにＡＩＭ－Ｖ培地（１０％ドナー血漿および５００ ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン－２を含有する）で再懸濁させた。

【0120】

２．４ ＤＮＴ細胞の体外増幅培養
上記１．２と同様である。

【0121】

１７～１８日目に、必要により、ＤＮＴ細胞を回収した。

【0122】

２．５ ＤＮＴ細胞の回収およびＤＮＴ細胞製剤の作成
上記１．３と同様である。

【0123】

実施例３：沈降で濃縮されるＤＮＴ細胞の体外増幅培養
３．１ 健常者ドナーのＤＮＴ細胞の濃縮
健常者のドナーから末梢血を２０～２００ ｍｌ収集してヘパリン化管に入れた。ＣＤ４／ＣＤ８リンパ細胞除去剤（ＲｏｓｓｅｔｔＳｅｐ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を利用し、ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋ Ｔ細胞を除去し、さらに等体積のＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ溶液でＰＢＭＣ分離を行った。このように得られた細胞は、ＣＤ４^＋とＣＤ８^＋が除去されたＤＮＴ細胞である。分離して得られた細胞を、０．９％生理食塩水で１回洗浄し、体外増幅培養を行った。

【0124】

３．２ ＤＮＴ細胞の体外増幅培養
上記１．２と同様である。

【0125】

１７～１８日目に、必要により、ＤＮＴ細胞を回収した。

【0126】

３．３ ＤＮＴ細胞の回収およびＤＮＴ細胞製剤の作成
上記１．３と同様である。

【0127】

実施例４：沈降で濃縮されるＤＮＴ細胞の凍結保存後の体外増幅培養
４．１ 健常者ドナーのＤＮＴ細胞の濃縮
上記３．１と同様である。

【0128】

４．２ 得られたＤＮＴ細胞の凍結保存
上記２．２と同様である。

【0129】

４．３．凍結保存ＤＮＴ細胞の再生
上記２．３と同様である。

【0130】

４．４ ＤＮＴ細胞の体外増幅培養
上記１．２と同様である。

【0131】

１７～１８日目に、必要により、ＤＮＴ細胞を回収した。

【0132】

４．５ ＤＮＴ細胞の回収およびＤＮＴ細胞製剤の作成
上記１．３と同様である。

【0133】

実施例５：応用例および効果データ
本実施例において、ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^－ Ｔ細胞（二重陰性Ｔ細胞、Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ細胞、ＤＮＴ細胞）を例とし、上記汎用型臨床用ヒトＤＮＴ細胞の効率的体外増幅方法によって体外増幅を行う過程と効果を検証した。

【0134】

応用例１
実施例１の方法に従い、磁気ビーズでＣＤ４^＋とＣＤ８^＋を除去して得られたＤＮＴ細胞を、そのまま本発明の方法（組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が５００ ＩＵ／ｍＬで、二段階で抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の使用量（第一段階５０ ｎｇ／ｍＬ、第二段階２５ ｎｇ／ｍＬ）を減少させ、インターロイキン－４も、ＡＢ血清も使用しない）によって体外増幅培養を行い、１７～２０日目に細胞を収集し、細胞の活性、表現型および細胞増幅総数を検出した。

【0135】

応用例２
実施例２の方法に従い、磁気ビーズでＣＤ４^＋とＣＤ８^＋を除去して得られたＤＮＴ細胞を、凍結保存後、再生し、さらに本発明の方法（組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が５００ ＩＵ／ｍＬで、二段階で抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の使用量（第一段階５０ ｎｇ／ｍＬ、第二段階２５ ｎｇ／ｍＬ）を減少させ、インターロイキン－４も、ＡＢ血清も使用しない）によって体外増幅培養を行い、１７～２０日目に細胞を収集し、細胞の活性、表現型および細胞増幅総数を検出した。

【0136】

応用例３
実施例３の方法に従い、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ細胞除去剤でＣＤ４^＋とＣＤ８^＋を除去して得られたＤＮＴ細胞を、そのまま本発明の方法（組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が５００ ＩＵ／ｍＬで、二段階で抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の使用量（第一段階５０ ｎｇ／ｍＬ、第二段階２５ ｎｇ／ｍＬ）を減少させ、インターロイキン－４も、ＡＢ血清も使用しない）によって体外増幅培養を行い、１７～２０日目に細胞を収集し、細胞の活性、表現型および細胞増幅総数を検出した。

【0137】

応用例４
実施例４の方法に従い、ＣＤ４／ＣＤ８リンパ細胞除去剤でＣＤ４^＋とＣＤ８^＋を除去して得られたＤＮＴ細胞を、凍結保存後、再生し、さらに本発明の方法（組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が５００ ＩＵ／ｍＬで、二段階で抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の使用量（第一段階５０ ｎｇ／ｍＬ、第二段階２５ ｎｇ／ｍＬ）を減少させ、インターロイキン－４も、ＡＢ血清も使用しない）によって体外増幅培養を行い、１７～２０日目に細胞を収集し、細胞の活性、表現型および細胞増幅総数を検出した。

【0138】

比較例１
既存技術に従い、培地に組み換えヒトインターロイキン－２（５００ ＩＵ／ｍＬ）、組み換えヒトインターロイキン－４（２ ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒトインターロイキン－７（８ ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒトインターロイキン－１２（５ ｎｇ／ｍＬ）、５％自家血漿および６％ＡＢ血清を添加した。具体的な細胞培養過程は上記応用例と同様である。

【0139】

比較例２
既存文献（Ｌｅｅ ＪＢら， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２５（７）：２２４１－２２５３， ２０１９）を参照し、２５０ ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２と１００ ｎｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を使用した。具体的な細胞培養過程は上記応用例と同様である。

【0140】

前記応用例と比較例の細胞を、それぞれ培養の１日目、７日目、１４日目および１７日目にサンプリングして細胞総数を検出し、細胞総数の変化を比較し、図１のように応用例と比較例の細胞生長曲線を得た。図１からわかるように、応用例の細胞は、７日目から細胞数が顕著に増え始めたが、比較例１では、１４日目になって初めて顕著に増え始めた。比較例２では、７日目から１４日目で細胞数が少し増加し、１４日目から初めて細胞数が顕著に増え始めた。同様の培養時点では、本発明の方法は比較例と比べてＤＮＴ細胞が多く増幅できたことが示された。

【0141】

１７日目にＤＮＴ細胞を収集し、応用例と比較例の細胞生存率、表現型の純度およびＤＮＴ増幅倍率を比較し、結果を表１に示す。

【表1】

【0142】

表１では、応用例１および応用例３と比較例１および比較例１はいずれもＤＮＴ細胞を新しく分離した後、そのまま培養したものである。ＤＮＴ細胞の増幅倍率を比較すると、本発明の方法では、磁気ビーズと沈降でＤＮＴ細胞を濃縮した後、体外増幅で得られたＤＮＴ細胞の増幅倍率がそれぞれ１５８７３．６８倍と２０９４８．０８倍で、遥かに比較例１の８８２７．９３倍と比較例２の９４０２．６５倍よりも高く、一方、細胞の表現型および細胞生存率に大きな差がなかった。そのため、２種の異なる方法によって濃縮されたＤＮＴ細胞は本発明の増幅技術によってより多いＤＮＴ細胞の製品が得られた。

【0143】

得られた細胞を分離して凍結保存し、再生後、本発明の方法によって体外増幅を行い、応用例２および応用例４を得た（表１）。凍結保存なしにそのまま培養された比較例１および比較例２と比較すると、２種の異なる方法によってＤＮＴ細胞を濃縮した後、凍結保存してＤＮＴ細胞を再生させた後、体外増幅で得られたＤＮＴ細胞の増幅倍率がそれぞれ１０７７８．９５倍と１０８１９．４１倍で、凍結保存なしにそのまま培養された比較例１（８８２７．９３倍）と比較例２（９４０２．６５倍）に相当し、かつＤＮＴ細胞の純度および細胞生存率に顕著な差がなかった。

【0144】

応用例５
末梢血からＣＤ４^＋とＣＤ８^＋を除去して濃縮して得られたＤＮＴ細胞を、液体窒素で７日、１４日、および３０日凍結保存した後、再生し、さらに本発明の増幅方法（組み換えヒトインターロイキン－２の濃度が５００ ＩＵ／ｍＬで、二段階で抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の使用量（第一段階５０ ｎｇ／ｍＬ、第二段階２５ ｎｇ／ｍＬ）を減少させ、インターロイキン－４も、ＡＢ血清も使用しない）によって体外増幅培養を行い、１７日目に細胞を収集し、細胞の生存率、純度、細胞の生物学的効力および細胞増幅倍数を検出した。

【0145】

新鮮な全血から濃縮されたＤＮＴ細胞と凍結保存後再生されたＤＮＴ細胞の細胞生存率、純度、細胞の生物学的効力およびＤＮＴ細胞の増幅倍率を比較し、結果を表２に示す。

【表2】

【0146】

表２からわかるように、新しくＤＮＴ細胞を濃縮した後、連続１７日培養したＤＮＴ細胞のロットと、ＤＮＴ細胞は異なる時間（７日、１４日、３０日）で凍結保存後、再生して体外培養したＤＮＴ細胞のロットとを比較すると、細胞の生存率（＞８５％）、細胞の純度（ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^－，＞９０％）、腫瘍殺傷活性（＞５０）および体外増幅倍率のいずれにも顕著な差がなく、ここで、各ロットの増幅倍率における差は、異なるドナー間のＤＮＴ細胞の特性に関連するが、いずれも臨床の輸液の要求に合致する。全体的に、本発明は、新しく濃縮されたＤＮＴ細胞および凍結保存後、再生されたＤＮＴ細胞の体外におけるＤＮＴ細胞の大量増幅に適し、最終製品のＤＮＴ細胞の生存率が８５％以上で、純度が９０％超で、生物学的効力が５０％超で、ＤＮＴ細胞の増幅倍率も８０００倍以上に達する。

【0147】

以上の実施例で実証されたように、本発明によって提供される０日にＤＮＴ細胞を凍結保存後の効率的体外増幅プロセスは、臨床治療プランの細胞製造における柔軟性に適し、既存特許の増幅技術に基づき、生産プロセスをさらに改善し、ＤＮＴ細胞の体外増幅レベルを１７日内で８０００倍向上させる。一回の増幅で得られるＤＮＴ細胞は複数の患者の臨床治療投与量を提供することができる。

【0148】

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

【図1】