ホーム > 特許ランキング > 三洋化成工業株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 三洋化成工業株式会社の特許一覧 ▶ 日本製紙株式会社の特許一覧
特許7502888細胞培養基材用コーティング剤、細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-11
(45)【発行日】2024-06-19
(54)【発明の名称】細胞培養基材用コーティング剤、細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20240612BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20240612BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12M3/00 A
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020074723
(22)【出願日】2020-04-20
(65)【公開番号】P2021170945
(43)【公開日】2021-11-01
【審査請求日】2023-04-03
(73)【特許権者】
【識別番号】000002288
【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】000183484
【氏名又は名称】日本製紙株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】川端 慎吾
(72)【発明者】
【氏名】井上 佳一郎
(72)【発明者】
【氏名】富田 恒輝
(72)【発明者】
【氏名】山下 泰治
(72)【発明者】
【氏名】森田 昌浩
(72)【発明者】
【氏名】山崎 俊輔
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－１８７３１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－３２１１５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１８－１４３２１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５４１９５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０７４４３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１２２４７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Proc. Jpn. Acad., Ser B，2018年，Vol.94, No.4，pp.161-179
【文献】Cellulose，2008年，Vol.15，pp.571-580
【文献】日本化学会誌，1985年，Vol.6，pp.1259-1264
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含み、
前記酸化セルロース繊維（Ａ）がセルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維である
細胞培養基材用コーティング剤。
【請求項2】
前記アルキルアミン（Ｂ）がヘキシルアミンである請求項１に記載の細胞培養基材用コーティング剤。
【請求項3】
基材と、前記基材上に形成された塗膜とを備える細胞培養基材であり、前記塗膜が酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含み、
前記酸化セルロース繊維（Ａ）がセルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維である細胞培養基材。
【請求項4】
前記塗膜が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン及びプロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有する請求項３に記載の細胞培養基材。
【請求項5】
多糖分解酵素を含む細胞剥離用薬剤と、請求項３又は４に記載の細胞培養基材とを備える細胞培養用キット。
【請求項6】
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜を備える細胞培養基材の前記塗膜上で細胞を培養する培養工程、及び、細胞が培養されている前記塗膜を、多糖分解酵素を用いて分解する分解工程を含み、
前記酸化セルロース繊維（Ａ）がセルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維である細胞シートの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培養基材用コーティング剤、それを用いた細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
培養基材（担体ともいう）の表面から培養細胞を回収する方法としてトリプシン等のタンパク質分解酵素で処理することが行われている。しかし、タンパク質分解酵素で処理すると、培養細胞同士を接続する細胞外基質も分解してしまうため、培養細胞をシート状等の三次元形状を維持したまま回収することが出来なかった。
【0003】
タンパク質分解酵素を用いることなく、培養細胞をシート状等の三次元形状を維持したまま回収する方法として、アルギン酸等の親水性多糖類を含む培養用担体上で培養する方法（特許文献１及び３）及びセルロース等の難水溶性の多糖類を含む培養用担体上で細胞を培養して糖分解酵素又はアミノ基含有化合物で処理する方法（特許文献２）が報告されている。
【0004】
このうち、親水性多糖類を用いた培養担体は、担体であるゲル化した親水性多糖類の上で培養された細胞と担体表面との接着が不十分となることがあり、接着細胞の形状不良を引き起こしやすいという課題や、親水性多糖類のゲルの強度を向上させるために用いるキレート剤の影響によって細胞の増殖率が十分ではないという課題があった。
【0005】
また、難水溶性の多糖類を用いた培養担体で培養して糖分解酵素で処理する方法は、多糖類の分解が起こりにくいために短時間で細胞を回収することが難しく、アミノ基含有化合物で処理する方法は、細胞培養に必要なアミノ酸を培地に添加して培養できないために細胞の増殖率が十分ではないというという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２００７－２５９７３５号公報
【文献】特開２０１５－４８４６７号公報
【文献】特開２００５－１１０５３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、十分な細胞培養率で細胞培養を行うことができ、培養した細胞を短時間で細胞シートとして回収することができる細胞培養基材を形成することができる細胞培養基材用コーティング剤、それを用いた細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む細胞培養基材用コーティング剤を用いた細胞培養基材が、十分な細胞培養率で細胞培養を行うことができ、培養した細胞を短時間で細胞シートとして回収することができることを見出し、本発明に到達した。
【0009】
すなわち、本発明は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む細胞培養基材用コーティング剤；基材と、上記基材上に形成された塗膜とを備える細胞培養基材であり、上記塗膜が酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む細胞培養基材；多糖分解酵素を含む細胞剥離用薬剤と上記細胞培養基材とを備える細胞培養用キット；酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜を備える細胞培養基材の上記塗膜上で細胞を培養する培養工程、及び、細胞が培養されている上記塗膜を、多糖分解酵素を用いて分解する分解工程を含む細胞シートの生産方法である。
【発明の効果】
【0010】
本発明は、十分な細胞培養率で培養することができ、培養細胞を細胞シートとして短時間で回収することができる細胞培養基材用コーティング剤、それを用いた細胞培養基材、細胞培養用キット及び細胞シートの生産方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（細胞培養基材用コーティング剤）
本発明の細胞培養基材用コーティング剤は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む。
【0012】
酸化セルロース繊維（Ａ）は、セルロース分子が有する水酸基がアルデヒド基又はカルボキシル基に酸化されたセルロース繊維である。
セルロース繊維の酸化は、酸化剤を用いて公知の方法で行うことができる。
酸化剤としてはハロゲン、次亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸、これらの塩、ハロゲン化物、過酸化物、及びＮ－オキシル化合物等を用いることができる。
セルロース繊維の酸化は、酸化剤を用いて公知の方法で行うことができる。
酸化剤としてはハロゲン、次亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸、これらの塩、ハロゲン化物、過酸化物、及びＮ－オキシル化合物等を用いることができる。
【0013】
酸化セルロース繊維（Ａ）としては、セルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維であることが好ましい。
セルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維は、例えば、酸化剤としてＮ－オキシル化合物である２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－Ｎ－オキシル（以下、「ＴＥＭＰＯ」と記載することがある）を用いて原料となるセルロース繊維を特開２０１７－１６０３９６号公報、特開２０１５－１１３３７６号公報及び特開２０１５－１３４８７０号公報等に記載の公知の方法で酸化処理することで得ることができる。
このＴＥＭＰＯを用いて酸化処理した酸化セルロース繊維は、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースともよばれる。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤において用いる酸化セルロースとしては、上記の方法で酸化処理して得られるものの他、酸化セルロース繊維、酸化セルロースナノファイバー、及び、これらの分散体として市場にあるものを用いても良い。
セルロース分子に含まれるグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシル基に酸化された酸化セルロース繊維は、例えば、酸化剤としてＮ－オキシル化合物である２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－Ｎ－オキシル（以下、「ＴＥＭＰＯ」と記載することがある）を用いて原料となるセルロース繊維を特開２０１７－１６０３９６号公報、特開２０１５－１１３３７６号公報及び特開２０１５－１３４８７０号公報等に記載の公知の方法で酸化処理することで得ることができる。
このＴＥＭＰＯを用いて酸化処理した酸化セルロース繊維は、ＴＥＭＰＯ酸化セルロースともよばれる。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤において用いる酸化セルロースとしては、上記の方法で酸化処理して得られるものの他、酸化セルロース繊維、酸化セルロースナノファイバー、及び、これらの分散体として市場にあるものを用いても良い。
【0014】
酸化セルロース繊維（Ａ）が、グルコースユニットのＣ６位の水酸基をカルボキシル基に酸化した酸化セルロース繊維である場合、そのカルボキシル基の濃度は、酸化セルロース（Ａ）の質量に基づいて、１．０ｍｍｏｌ／ｇ以上であることが好ましく、より好ましくはカルボキシル基の濃度が１．２ｍｍｏｌ／ｇ～２．５ｍｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは１．３ｍｍｏｌ／ｇ～２．４ｍｍｏｌ／ｇ、特に好ましくは１．４ｍｍｏｌ／ｇ～２．３ｍｍｏｌ／ｇである。
上記カルボキシル基の濃度は、酸化反応時間、酸化反応温度、酸化反応時のｐＨ、及び酸化剤の添加量などを調整することにより調整できる。
上記カルボキシル基の濃度は、酸化反応時間、酸化反応温度、酸化反応時のｐＨ、及び酸化剤の添加量などを調整することにより調整できる。
【0015】
上記カルボキシル基の濃度は、酸化セルロースを０．５質量％の濃度で水に分散したスラリーに０．１Ｍ塩酸水溶液を加えてｐＨ２．５とした後、０．０５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下してｐＨが１１になるまで電気伝導度を測定し、電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム水溶液量（ａ）と下記式とを用いて算出する。
カルボキシル基の濃度〔ｍｍｏｌ／ｇ酸化セルロース〕＝ａ〔ｍｌ〕×０．０５／酸化セルロース質量〔ｇ〕
カルボキシル基の濃度〔ｍｍｏｌ／ｇ酸化セルロース〕＝ａ〔ｍｌ〕×０．０５／酸化セルロース質量〔ｇ〕
【0016】
本発明の細胞培養基材用コーティング剤に含まれるアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）は、アルキル基の炭素数が１～１８であるモノアルキルアミン化合物、それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるジアルキルアミン化合物、及び、それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるトリアルキルアミン化合物である。
アルキル基の炭素数が１～１８であるモノアルキルアミン化合物としては、例えば、エチルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、ドデシルアミン及びステアリルアミン等が挙げられる。
それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるジアルキルアミン化合物としては、例えば、ジエチルアミン、ジブチルアミン、ジオクチルアミン、ジドデシルアミン及びジステアリルアミン等が挙げられる。
それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるトリアルキルアミン化合物としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリドデシルアミン及びトリステアリルアミン等が挙げられる。
これらのうち細胞増殖率の観点から、アルキル基の炭素数が１～１８であるモノアルキルアミン化合物が好ましく、ヘキシルアミン、オクチルアミン及びドデシルアミンがより好ましく、さらに好ましくはヘキシルアミンである。
アルキル基の炭素数が１～１８であるモノアルキルアミン化合物としては、例えば、エチルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、ドデシルアミン及びステアリルアミン等が挙げられる。
それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるジアルキルアミン化合物としては、例えば、ジエチルアミン、ジブチルアミン、ジオクチルアミン、ジドデシルアミン及びジステアリルアミン等が挙げられる。
それぞれのアルキル基の炭素数が１～１８であるトリアルキルアミン化合物としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリドデシルアミン及びトリステアリルアミン等が挙げられる。
これらのうち細胞増殖率の観点から、アルキル基の炭素数が１～１８であるモノアルキルアミン化合物が好ましく、ヘキシルアミン、オクチルアミン及びドデシルアミンがより好ましく、さらに好ましくはヘキシルアミンである。
【0017】
本発明の細胞培養基材用コーティング剤に含まれる有機溶媒としては、アルキルアミン（Ｂ）が溶解する溶剤であれば特に制限なく使用することができる。
好ましい有機溶媒としては、アルコール系溶媒（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール及びｔｅｒｔ－ブタノール等）、エーテル系溶媒（テトラヒドロフラン及び１，４－ジオキサン等）、ケトン系溶媒（シクロヘキサノン及びメチルイソブチルケトン等）、ニトリル系溶媒（アセトニトリル等）、アミド系溶媒（ジメチルホルムアミド及びジメチルアセトアミド等）、ジメチルスルホキシド、ジオキシラン及びピロリドン等が挙げられる。
これらのうち、アルコール系溶媒を用いることがより好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ－ブタノール又はこれらの混合溶媒を用いることがさらに好ましい。
好ましい有機溶媒としては、アルコール系溶媒（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール及びｔｅｒｔ－ブタノール等）、エーテル系溶媒（テトラヒドロフラン及び１，４－ジオキサン等）、ケトン系溶媒（シクロヘキサノン及びメチルイソブチルケトン等）、ニトリル系溶媒（アセトニトリル等）、アミド系溶媒（ジメチルホルムアミド及びジメチルアセトアミド等）、ジメチルスルホキシド、ジオキシラン及びピロリドン等が挙げられる。
これらのうち、アルコール系溶媒を用いることがより好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ－ブタノール又はこれらの混合溶媒を用いることがさらに好ましい。
【0018】
本発明の細胞培養基材用コーティング剤は、時間あたりの細胞増殖を促進する観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン及びプロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子をさらに含有してもよい。
細胞接着因子とは、細胞同士を繋ぎ止める働きを持つ生理活性タンパク質であり、接着性タンパク質とも呼ばれることもある。本発明の細胞培養基材用コーティング剤がさらに細胞接着因子を含むと、培養細胞の培養器への接着伸展が促され培養の効率が向上し好ましい。
細胞接着因子とは、細胞同士を繋ぎ止める働きを持つ生理活性タンパク質であり、接着性タンパク質とも呼ばれることもある。本発明の細胞培養基材用コーティング剤がさらに細胞接着因子を含むと、培養細胞の培養器への接着伸展が促され培養の効率が向上し好ましい。
【0019】
本発明の細胞培養基材用コーティング剤は酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒と必要により用いる細胞接着因子とを公知の方法で均一に混合して得ることができる。
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒と必要により用いる細胞接着因子との混合順序に特に制限はないが、酸化セルロース繊維（Ａ）と有機溶媒との混合物にアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）を均一混合し、さらに必要により用いる細胞接着因子を混合することが好ましい。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤を得るための各原料の混合は、撹拌翼を用いた撹拌、ホモジナイザー及びミキサー等の公知の撹拌機を用いて行うことが出来る。
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒と必要により用いる細胞接着因子との混合順序に特に制限はないが、酸化セルロース繊維（Ａ）と有機溶媒との混合物にアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）を均一混合し、さらに必要により用いる細胞接着因子を混合することが好ましい。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤を得るための各原料の混合は、撹拌翼を用いた撹拌、ホモジナイザー及びミキサー等の公知の撹拌機を用いて行うことが出来る。
【0020】
酸化セルロース繊維（Ａ）と有機溶媒との混合物は、酸化セルロース繊維（Ａ）の粉体と有機溶媒とを公知の方法で混合する方法、及び酸化セルロース繊維（Ａ）の分散体に含まれる分散媒を有機溶媒に置換する方法等で得ることが出来る。
【0021】
酸化セルロース繊維（Ａ）の分散体に含まれる分散媒を有機溶媒に置換する方法としては、濾過、遠心分離又は乾燥により分散媒を除去した後に有機溶媒と混合する方法、及び酸化セルロースの分散体に有機溶媒を加えて加熱及び／又は減圧して分散媒を蒸留除去して有機溶媒に置換する方法等が挙げられる。
【0022】
酸化セルロース繊維（Ａ）が有するアルデヒド基に含まれるカルボニル基及び／又はカルボキシル基に含まれるカルボニル基と、アルキルアミン（Ｂ）が有する窒素原子とはその電荷密度の差によって相互作用し得る。そのため、本発明のコーティング剤中に含まれる酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）とは結合を形成している場合があると考えられる。
また、酸化セルロース繊維（Ａ）がカルボキシル基を有していた場合には、アルキルアミン（Ｂ）を均一混合する過程における条件（温度及び時間等）によってはカルボキシル基とアミノ基との縮合反応（アミド化）が進行する場合があると考えられ、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む混合物についての赤外分光スペクトルを測定してアミド結合の有無を確認することでアミド化が進行したか否かを確認することが出来る。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤に含まれる酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）とは、結合を形成していても良く、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）とのアミド化物であっても良い。
また、酸化セルロース繊維（Ａ）がカルボキシル基を有していた場合には、アルキルアミン（Ｂ）を均一混合する過程における条件（温度及び時間等）によってはカルボキシル基とアミノ基との縮合反応（アミド化）が進行する場合があると考えられ、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む混合物についての赤外分光スペクトルを測定してアミド結合の有無を確認することでアミド化が進行したか否かを確認することが出来る。
本発明の細胞培養基材用コーティング剤に含まれる酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）とは、結合を形成していても良く、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）とのアミド化物であっても良い。
【0023】
本発明の細胞培養基材用コーティング剤において、酸化セルロース繊維（Ａ）の含有量は、細胞培養基材用コーティング剤の塗工性の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、０．１質量％～１５質量％が好ましく、０．１質量％～１０質量％がさらに好ましい。
アルキルアミン（Ｂ）の含有量は、細胞培養基材用コーティング剤の塗工性の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、０．０１質量％～１０質量％が好ましく、０．０１質量％～５質量％がさらに好ましい。
有機溶媒の含有量は、細胞培養基材用コーティング剤の塗工性の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、１０～９９．８９質量％であることが好ましく、５０～９９．８質量％であることがより好ましく、８０～９９．５質量％であることがさらに好ましい。
また、必要により用いる細胞接着因子の含有量は、細胞接着の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、０．５～６０質量％が好ましく、０．７５～５０質量％がさらに好ましい。
アルキルアミン（Ｂ）の含有量は、細胞培養基材用コーティング剤の塗工性の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、０．０１質量％～１０質量％が好ましく、０．０１質量％～５質量％がさらに好ましい。
有機溶媒の含有量は、細胞培養基材用コーティング剤の塗工性の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、１０～９９．８９質量％であることが好ましく、５０～９９．８質量％であることがより好ましく、８０～９９．５質量％であることがさらに好ましい。
また、必要により用いる細胞接着因子の含有量は、細胞接着の観点から、細胞培養基材用コーティング剤の全重量に基づいて、０．５～６０質量％が好ましく、０．７５～５０質量％がさらに好ましい。
【0024】
（細胞培養基材）
本発明の細胞培養基材は、基材上に形成された塗膜を備える細胞培養基材であり、上記塗膜が酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む。
本発明の細胞培養基材は、基材上に形成された塗膜を備える細胞培養基材であり、上記塗膜が酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む。
【0025】
基材としては、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、フッ素樹脂、セルロース、セラミック、ガラス、ステンレス及びチタン等を用いた公知の細胞培養に用いられる基材を用いることができる。基材の形状は限定されず、シャーレ状、
フラスコ状、プレート状、袋状、中空糸膜（ストロー状、マカロニ状等）及びビーズ状等の任意の形状の基材を用いることができ、なかでもシャーレ状及びプレート状がシート状細胞の生産効率の点で好ましい。
なお、「シート状」とは、複数の細胞が３次元に集まって形成する形状であって塗膜の面方向に増殖して出来る形状であることを意味する。
フラスコ状、プレート状、袋状、中空糸膜（ストロー状、マカロニ状等）及びビーズ状等の任意の形状の基材を用いることができ、なかでもシャーレ状及びプレート状がシート状細胞の生産効率の点で好ましい。
なお、「シート状」とは、複数の細胞が３次元に集まって形成する形状であって塗膜の面方向に増殖して出来る形状であることを意味する。
【0026】
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキルアミン（Ｂ）と有機溶媒とを含む前記の細胞培養基材用コーティング剤を基材上に塗布して得られる塗膜である。細胞培養基材用コーティング剤の塗布方法としては、特に制限されず、ローラー、スプレーガン（エアスプレーガン、エアレススプレーガン、リシンガン、及び万能ガン等）、ハケ及びロールコーター等の公知の塗装手段を用いて行うことができ、基材の種類、及び形状等に応じて適宜選択することができる。塗布した細胞培養基材用コーティング剤からの有機溶媒の除去は、常圧又は減圧化での加熱乾燥又は常温乾燥による行うことができる。
本発明の細胞培養基材において、基材上に形成された塗膜の厚さは剥離性の観点から０．１μｍ～１００μｍであることが好ましく、さらに好ましくは１μｍ～５０μｍである。
本発明の細胞培養基材において、基材上に形成された塗膜の厚さは剥離性の観点から０．１μｍ～１００μｍであることが好ましく、さらに好ましくは１μｍ～５０μｍである。
【0027】
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜は、細胞接着性及び細胞死の観点から、水（３７℃）に対する接触角が１０～８０°であることが好ましく、２０～７０°がさらに好ましく、特に好ましくは２５～６５°である。接触角は、細胞培養基材用コーティング剤を接触角測定用支持体の表面に塗布乾燥して作製した測定用サンプルを用いて接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）で測定される。
【0028】
本発明の細胞培養基材が有する塗膜は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン及びプロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有することが好ましい。これらの細胞接着因子を含むと培養細胞と基材表面との密着性が向上し、培養細胞の形状が良好となり好ましい。
【0029】
細胞培養基材が有する塗膜が細胞接着因子を含む場合、その含有量は１ｃｍ２あたり０．５μｇ～５００μｇが好ましく、０．７μｇ～１００μｇがさらに好ましい。
【0030】
本発明の細胞培養基材を用いて培養された細胞は、細胞剥離用薬剤を用いて基材から剥離される。細胞の剥離に用いる細胞剥離用薬剤としては、上記の細胞培養基材から培養細胞を剥離できるものであれば制限無く使用できるが、酵素を含む事が好ましい。酵素としては、タンパク質分解酵素及び多糖分解酵素を含むことが出来、なかでも多糖分解酵素を含む事がさらに好ましい。
【0031】
（細胞培養用キット）
本発明の細胞培養キットは、多糖分解酵素を含む細胞剥離用薬剤と、上記細胞培養基材とを備える。多糖分解酵素としては、多糖を分解する酵素として知られているものを制限なく使用でき、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられる。
なかでも酸化セルロース繊維（Ａ）の分解性の観点から、セルラーゼであることが好ましい。本発明の細胞培養キットに含まれる細胞剥離用薬剤は多糖分解酵素を含むこと以外に制限は無く、多糖分解酵素をそのまま用いても良く、多糖分解酵素を液体成分に分散又は溶解して分散液又は溶液にしたものを用いても良い。
上記液体成分としては多糖分解酵素を分散又は溶解できる液体であれば特に限定されず、例えば、水や上記有機溶媒の中から適宜選択して用いることができる。液体成分には、緩衝作用を有する公知の酸及び塩基を必要に応じて含んでもよい。
本発明の細胞培養キットは、多糖分解酵素を含む細胞剥離用薬剤と、上記細胞培養基材とを備える。多糖分解酵素としては、多糖を分解する酵素として知られているものを制限なく使用でき、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられる。
なかでも酸化セルロース繊維（Ａ）の分解性の観点から、セルラーゼであることが好ましい。本発明の細胞培養キットに含まれる細胞剥離用薬剤は多糖分解酵素を含むこと以外に制限は無く、多糖分解酵素をそのまま用いても良く、多糖分解酵素を液体成分に分散又は溶解して分散液又は溶液にしたものを用いても良い。
上記液体成分としては多糖分解酵素を分散又は溶解できる液体であれば特に限定されず、例えば、水や上記有機溶媒の中から適宜選択して用いることができる。液体成分には、緩衝作用を有する公知の酸及び塩基を必要に応じて含んでもよい。
【0032】
（細胞シートの生産方法）
本発明の細胞シートの生産方法は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜を備える細胞培養基材の上記塗膜上で細胞を培養する培養工程、及び、細胞が培養されている上記塗膜を、多糖分解酵素を用いて分解する分解工程を含む。
本発明の細胞シートの生産方法は、酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜を備える細胞培養基材の上記塗膜上で細胞を培養する培養工程、及び、細胞が培養されている上記塗膜を、多糖分解酵素を用いて分解する分解工程を含む。
【0033】
酸化セルロース繊維（Ａ）とアルキル基の炭素数が１～１８であるアルキルアミン（Ｂ）とを含む塗膜を備える基材上で細胞を培養する培養工程は、上記の細胞培養基材を用いて細胞培養することで行うことが出来る。
【0034】
培養する細胞に特に制限はないが、医薬品の生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞等の培養に好ましく用いることができる。これらのうち、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞等の培養に特に好適に用いることができる。
【0035】
上記の塗膜を備える細胞培養基材上で細胞を培養する培養工程は、細胞培養基材として本発明の細胞培養基材を使用する以外は公知の方法を適用して行うことができ、細胞培養基材上に細胞を懸濁させた培地を加えて適切な条件で培養する方法等が挙げられる。
細胞を培養する条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素濃度が１～２０体積％（好ましくは３～１０体積％）、温度が５～４５℃（好ましくは３０～４０℃）の環境下で１時間～１００日間（好ましくは１～２０日間）、必要に応じて１～１０日毎（好ましくは２～３日毎）に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。
細胞を培養する条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素濃度が１～２０体積％（好ましくは３～１０体積％）、温度が５～４５℃（好ましくは３０～４０℃）の環境下で１時間～１００日間（好ましくは１～２０日間）、必要に応じて１～１０日毎（好ましくは２～３日毎）に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。
【0036】
培地としては、無血清培地（ＳＴＥＭＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ１７培地、ＴｅＳＲ ２、Ｅ８培地、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ－ＦＸ培地、ｈＥＳＦ９２ａｉ培地、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ培地、ｍＴｅＳＲＴＭ培地、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ－４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ－ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ－ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＴＧＴＭ培地及びこれらの混合培地等）；一般の培地（ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ－１００培地、Ｓｆ－９００ＩＩ培地、Ｅｘ－ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地）等が挙げられる。
【0037】
また、培地には、必要に応じて、血清を添加することができる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生児由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生児由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生児由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。血清を使用する場合、血清の使用量（重量％）は、培地の重量に基づいて、０．１～５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．３～３０重量％、特に好ましくは１～２０重量％である。
【0038】
培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
【0039】
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０－１６～１０－３重量％が好ましく、さらに好ましくは１０－１４～１０－５重量％、特に好ましくは１０－１２～１０－７重量％である。
【0040】
培地には、必要に応じて、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０－６～１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０－５～１重量％、特に好ましくは１０－４～０．１重量％である。
【0041】
基材上での細胞培養する培養工程において、培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては、細胞の増殖性を阻害しない等の観点から、培地１ｍＬ当たり、１００～１億個／ｍＬが好ましく、さらに好ましくは１０００～１千万個／ｍＬ、特に好ましくは１万～１００万個／ｍＬである。
【0042】
細胞の濃度は、トリパンブルー又はクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定して算出することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）等に記載された方法である｝。
また、培地に投入する細胞培養基材の乾燥重量（ｇ）は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地１Ｌ当たり、０．００５～８００ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０２～２００ｇ、特に好ましくは０．１～４０ｇである。
また、培地に投入する細胞培養基材の乾燥重量（ｇ）は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地１Ｌ当たり、０．００５～８００ｇが好ましく、さらに好ましくは０．０２～２００ｇ、特に好ましくは０．１～４０ｇである。
【0043】
培養条件としては、特に制限はなく培養する細胞に応じて適宜選択することができるが、好ましい条件としては、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度１～２０体積％、５～４５℃の環境下で１時間～１００日間、必要に応じて１～１０日毎に培地交換しなら培養する条件があげられる。さらに好ましい条件としては、ＣＯ２濃度３～１０体積％、３０～４０℃の環境下で１～２０日間、１～３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【0044】
本発明の細胞シートの生産方法は、細胞が培養されている上記塗膜を、多糖分解酵素を用いて分解する分解工程を含む。培養細胞が接着した塗膜を構成する酸化セルロース繊維を多糖分解酵素で分解することによって、シート状に増殖した細胞の形状を壊さずに細胞シートとして回収することができる。細胞シート１枚の厚さとしては特に制限はなく、細胞が面方向に互いに接着されて形成される細胞層が単層であっても複数層重なったものでも良い。本発明における細胞シートとしては、厚みが２００μｍ以下であることが好ましく、細胞培養のし易さや、取扱いの観点から、厚みが０．５～５０μｍのものがより好ましい。
【0045】
多糖分解酵素を用いて塗膜を分解する分解工程において用いる多糖分解酵素は、溶液にして用いることが好ましい。多糖分解酵素を溶液にして用いる場合、多糖分解酵素を水に溶解した水溶液であることが好ましい。溶液に含まれる多糖分解酵素の濃度は、細胞毒性及び細胞培養基材の分解性の観点から、溶液の重量を基準として、０．１～５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１～１重量％である。また、多糖分解酵素を含む水溶液は、緩衝作用を有する公知の酸及び塩基を必要に応じて含んでもよい。
【0046】
多糖分解酵素を用いて塗膜を分解する分解工程は、細胞培養後の容器に、多糖分解酵素を含む溶液を添加し、静置することで行うことが出来る。
分解工程における温度及び静置時間は、使用する多糖分解酵素に適した温度及び静置時間に調整して行うことができるが、多糖分解酵素としてセルラーゼを用いる場合には３５～４０℃の温度範囲及び１分～１２０分の静置時間で行うことが好ましい。
分解工程において多糖分解酵素が細胞培養基材上の塗膜に含まれる酸化セルロース繊維を分解し、細胞培養基材と培養された細胞とが剥離する。これによって培養容器中に剥離された細胞を細胞シートとして回収することができる。
分解工程における温度及び静置時間は、使用する多糖分解酵素に適した温度及び静置時間に調整して行うことができるが、多糖分解酵素としてセルラーゼを用いる場合には３５～４０℃の温度範囲及び１分～１２０分の静置時間で行うことが好ましい。
分解工程において多糖分解酵素が細胞培養基材上の塗膜に含まれる酸化セルロース繊維を分解し、細胞培養基材と培養された細胞とが剥離する。これによって培養容器中に剥離された細胞を細胞シートとして回収することができる。
【0047】
本発明の生産方法により得られた細胞シートは、細胞シートを疾患部位に貼り付けて行う細胞移植手術及び細胞再生手術等に好ましく用いることができる。
【実施例】
【0048】
以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。
【0049】
製造例１ 酸化セルロース繊維のエタノール分散体の作製
撹拌装置を備えた容器にＴＥＭＰＯ酸化セルロース繊維（日本製紙社製、カルボキシル基の濃度１．５４ｍｍｏｌ）の４．５％水分散体１００部と、エタノール１００部とを入れ、撹拌混合した。その後、ナイロンメッシュ（１１０メッシュ）を用いて減圧濾過を行った。ナイロンメッシュ上に残った濾過残渣の全量とエタノール１００部とを撹拌混合し、再びナイロンメッシュ（１１０メッシュ）を用いて減圧濾過を行い、濾過残渣を回収した。
回収した濾過残渣１７部とエタノール７３部とを均一になるまで撹拌を行うことで酸化セルロース繊維の濃度が５．０％であるエタノール分散体（水１％含有）９０部を得た。
撹拌装置を備えた容器にＴＥＭＰＯ酸化セルロース繊維（日本製紙社製、カルボキシル基の濃度１．５４ｍｍｏｌ）の４．５％水分散体１００部と、エタノール１００部とを入れ、撹拌混合した。その後、ナイロンメッシュ（１１０メッシュ）を用いて減圧濾過を行った。ナイロンメッシュ上に残った濾過残渣の全量とエタノール１００部とを撹拌混合し、再びナイロンメッシュ（１１０メッシュ）を用いて減圧濾過を行い、濾過残渣を回収した。
回収した濾過残渣１７部とエタノール７３部とを均一になるまで撹拌を行うことで酸化セルロース繊維の濃度が５．０％であるエタノール分散体（水１％含有）９０部を得た。
【0050】
＜実施例１＞
撹拌装置を備えた容器を用いて、製造例１で得られた酸化セルロース繊維のエタノール分散体（酸化セルロース繊維の濃度：５％）５０部とヘキシルアミン０．０３８部とを均一混合して本発明の細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を得た。
撹拌装置を備えた容器を用いて、製造例１で得られた酸化セルロース繊維のエタノール分散体（酸化セルロース繊維の濃度：５％）５０部とヘキシルアミン０．０３８部とを均一混合して本発明の細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を得た。
【0051】
＜実施例２＞
撹拌装置を備えた容器を用いて、製造例１で得られた酸化セルロース繊維のエタノール分散体（酸化セルロース繊維の濃度：５％）５０部とドデシルアミン０．０３５部とを均一混合して本発明の細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－２）を得た。
撹拌装置を備えた容器を用いて、製造例１で得られた酸化セルロース繊維のエタノール分散体（酸化セルロース繊維の濃度：５％）５０部とドデシルアミン０．０３５部とを均一混合して本発明の細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－２）を得た。
【0052】
＜実施例３＞
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を酸化セルロース繊維とヘキシルアミンとの合計濃度（以下、固形分と記載する）が０．５％となる様にエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維とを含む塗膜を有する本発明の細胞培養基材（Ｑ－１）を作製した。なお、「１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れる」とは、一つのウェルに１．０ｍＬずつ入れることを意味し、以下同様である。
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を酸化セルロース繊維とヘキシルアミンとの合計濃度（以下、固形分と記載する）が０．５％となる様にエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維とを含む塗膜を有する本発明の細胞培養基材（Ｑ－１）を作製した。なお、「１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れる」とは、一つのウェルに１．０ｍＬずつ入れることを意味し、以下同様である。
【0053】
＜実施例４＞
実施例２で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－２）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ドデシルアミンと酸化セルロース繊維とを含む塗膜を有する本発明の細胞培養基材（Ｑ－２）を作製した。
実施例２で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－２）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ドデシルアミンと酸化セルロース繊維とを含む塗膜を有する本発明の細胞培養基材（Ｑ－２）を作製した。
【0054】
＜実施例５＞
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに細胞接着因子であるプロネクチンＦ（Ｍｗ約１１万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製）を１重量％含有するプロネクチンＦ溶液（３７℃）を５．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－３）を作製した。
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに細胞接着因子であるプロネクチンＦ（Ｍｗ約１１万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製）を１重量％含有するプロネクチンＦ溶液（３７℃）を５．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－３）を作製した。
【0055】
＜実施例６＞
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに、細胞接着因子であるフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）を１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れクリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－４）を作製した。
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに、細胞接着因子であるフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）を１．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れクリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－４）を作製した。
【0056】
＜実施例７＞
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌずつ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに、細胞接着因子であるコラーゲン（倉敷紡績（株）製、「Ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ－Ｃ」）を１０．０重量％含有するコラーゲン溶液（３７℃、ｐＨ３）を５．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れクリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－５）を作製した。
実施例１で作製した細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）を固形分０．５％となるようにエタノールで希釈し、６ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／ｗｅｌｌずつ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。さらに、細胞接着因子であるコラーゲン（倉敷紡績（株）製、「Ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ－Ｃ」）を１０．０重量％含有するコラーゲン溶液（３７℃、ｐＨ３）を５．０ｍＬ／ｗｅｌｌ入れクリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾し、ヘキシルルアミンと酸化セルロース繊維と細胞接着因子とを含む塗膜を有する細胞培養基材（Ｑ－５）を作製した。
【0057】
＜比較例１＞
製造例１で作製した酸化セルロース繊維のエタノール分散体をエタノールで酸化セルロース繊維の濃度が０．５％となるように希釈し、６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾して、酸化セルロース繊維を含み、アルキルアミンを含まない塗膜を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－１）を作製した。
製造例１で作製した酸化セルロース繊維のエタノール分散体をエタノールで酸化セルロース繊維の濃度が０．５％となるように希釈し、６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾して、酸化セルロース繊維を含み、アルキルアミンを含まない塗膜を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－１）を作製した。
【0058】
＜比較例２＞
撹拌装置を備えた容器を用いて、水８００部にアルギン酸（和光純薬工業（株）製、「アルギン酸ナトリウム３００～４００」）２．４部を凝集塊が生じないように撹拌（８００ｒｐｍ）しながらゆっくりと添加し、アルギン酸溶解液を得た。得られた溶液を６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れた後、１Ｍ塩化カルシウム溶液を入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。風乾後、１００℃の乾燥機で１時間乾燥し、アルギン酸からなる塗膜を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－２）を得た。
撹拌装置を備えた容器を用いて、水８００部にアルギン酸（和光純薬工業（株）製、「アルギン酸ナトリウム３００～４００」）２．４部を凝集塊が生じないように撹拌（８００ｒｐｍ）しながらゆっくりと添加し、アルギン酸溶解液を得た。得られた溶液を６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし；ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）に１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れた後、１Ｍ塩化カルシウム溶液を入れ、クリーンベンチ内でＵＶを照射しながら６ｈｒ風乾した。風乾後、１００℃の乾燥機で１時間乾燥し、アルギン酸からなる塗膜を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－２）を得た。
【0059】
＜比較例３＞
セルロースフィルム（Ｗｈａｔ ｍａｎ社製、「純セルロースペーパー」）を６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし； ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）にはめ込み、細胞接着因子であるフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏ ｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を０．００１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）を１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れて２時間静置し、フィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－３）を得た。
セルロースフィルム（Ｗｈａｔ ｍａｎ社製、「純セルロースペーパー」）を６Ｗｅｌｌポリスチレン製培養プレート（表面処理なし； ＩＷＡＫＩ製Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｃｏｄｅ：１８１０－００６）にはめ込み、細胞接着因子であるフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏ ｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を０．００１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）を１．０ｍＬ／Ｗｅｌｌ入れて２時間静置し、フィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を有する比較用細胞培養基材（ＣＱ－３）を得た。
【0060】
＜実施例８＞
実施例３で作製した細胞培養基材（Ｑ－１）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養した。その後、セルラーゼ［セルライザーＡＣＥ（ナガセケムテックス社製）］を超純水で１０倍に希釈した溶液０．０５ｍｌを細胞剥離用薬剤として培養後の基材に添加した後、温度３７℃、二酸化炭素濃度と空気とを５：９５の体積比で混合した混合気の環境下で静置し、細胞培養基材（Ｑ－１）から細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例３で作製した細胞培養基材（Ｑ－１）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養した。その後、セルラーゼ［セルライザーＡＣＥ（ナガセケムテックス社製）］を超純水で１０倍に希釈した溶液０．０５ｍｌを細胞剥離用薬剤として培養後の基材に添加した後、温度３７℃、二酸化炭素濃度と空気とを５：９５の体積比で混合した混合気の環境下で静置し、細胞培養基材（Ｑ－１）から細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0061】
＜実施例９＞
実施例３で作製した細胞培養基材（Ｑ－１）にヒト類表皮癌由来細胞（Ａ４３１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例３で作製した細胞培養基材（Ｑ－１）にヒト類表皮癌由来細胞（Ａ４３１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0062】
＜実施例１０＞
実施例４で作製した細胞培養基材（Ｑ－２）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例４で作製した細胞培養基材（Ｑ－２）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0063】
＜実施例１１＞
実施例５で作製した細胞培養基材（Ｑ－３）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例５で作製した細胞培養基材（Ｑ－３）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0064】
＜実施例１２＞
実施例６で作製した細胞培養基材（Ｑ－４）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例６で作製した細胞培養基材（Ｑ－４）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0065】
＜実施例１３＞
実施例７で作製した細胞培養基材（Ｑ－５）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
実施例７で作製した細胞培養基材（Ｑ－５）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0066】
＜比較例４＞
比較例１で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－１）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
比較例１で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－１）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0067】
＜比較例５＞
比較例２で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－２）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を０．１ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
比較例２で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－２）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を０．１ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0068】
＜比較例６＞
比較例３で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－３）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
比較例３で作製した比較用細胞培養基材（ＣＱ－３）にマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）を３×１０５Ｃｅｌ１ｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃：５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ下で培養を行った。３日間培養後、実施例８と同じ細胞剥離用薬剤を０．０５ｍｌ添加した後、実施例８と同様にして細胞が剥離するまでの時間を計測した。剥離した細胞について以下の方法で評価し、結果を剥離時間と共に表１に記載した。
【0069】
＜水に対する接触角＞
実施例８～１３については、ポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ）上に膜厚５μｍとなるように、実施例１又は２で得られた細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）又は（Ｐ－２）の塗膜を形成した。塗膜を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
また、比較例４及び５については、ポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ）上に膜厚５μｍとなるように、比較例１又は２で得られた塗膜（例えば、比較例１では、酸化セルロース繊維を含み、アルキルアミンを含まない塗膜。例えば、比較例２では、アルギン酸からなる塗膜）を形成した。塗膜を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
また、比較例６については、ポリエチレンテレフタレートフィルム［東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ］上に膜厚５μｍとなるように、比較例３で得られたフィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を形成した。フィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
水５μＬ、撮影待機時間１０００ｍｓｅｃ、撮影間隔時間１０００ｍｓｅｃ、撮影回数１０回の条件で測定を５回行い、その平均値を算出し塗膜の水に対する接触角とした。
実施例８～１３については、ポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ）上に膜厚５μｍとなるように、実施例１又は２で得られた細胞培養基材用コーティング剤（Ｐ－１）又は（Ｐ－２）の塗膜を形成した。塗膜を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
また、比較例４及び５については、ポリエチレンテレフタレートフィルム（東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ）上に膜厚５μｍとなるように、比較例１又は２で得られた塗膜（例えば、比較例１では、酸化セルロース繊維を含み、アルキルアミンを含まない塗膜。例えば、比較例２では、アルギン酸からなる塗膜）を形成した。塗膜を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
また、比較例６については、ポリエチレンテレフタレートフィルム［東レ社製、「ルミラー５０Ｓ」、２１０ｍｍ×２９７ｍｍ×５０μｍ］上に膜厚５μｍとなるように、比較例３で得られたフィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を形成した。フィブロネクチンが含浸したセルロースフィルムからなる層を３７℃に温調し、同温度で接触角計（全自動接触角計ＰＤ－Ｗ、協和界面化学社製）を用い、下記条件での水に対する接触角を測定し、結果を表１に記載した。
水５μＬ、撮影待機時間１０００ｍｓｅｃ、撮影間隔時間１０００ｍｓｅｃ、撮影回数１０回の条件で測定を５回行い、その平均値を算出し塗膜の水に対する接触角とした。
【0070】
＜細胞培養基材の物性評価＞
＜細胞増殖率＞
剥離した細胞についてトリパンブルーを用いて生細胞数を計測し、以下計算式にて、増殖率を算出した。３日目の細胞培養増殖率としては、短い培養時間で細胞シートを得るという観点から３００％以上であることが好ましい、４００％以上であればより好ましい。
細胞増殖率＝［培養３日後の生細胞数］／［播種時の細胞数］×１００
＜細胞増殖率＞
剥離した細胞についてトリパンブルーを用いて生細胞数を計測し、以下計算式にて、増殖率を算出した。３日目の細胞培養増殖率としては、短い培養時間で細胞シートを得るという観点から３００％以上であることが好ましい、４００％以上であればより好ましい。
細胞増殖率＝［培養３日後の生細胞数］／［播種時の細胞数］×１００
【0071】
＜剥離時間及び剥離後の細胞の形状＞
培養後の細胞培養基材に細胞剥離用薬剤を添加してからの経時的な細胞の剥離具合を目視で確認して剥離するまので時間（単位：分）を計測した。細胞培養基材を揺らした時に細胞が細胞培養基材から浮き上がって揺れに対応して動くことが確認できたら剥離が完了したものとした。
剥離後の細胞の形状は上記の剥離が完了した後の状態を目視で観察して判断した。培養した細胞が一体のシートとして剥離できた場合には「シート状」と、細胞同士が離れてバラバラになりシートとして剥離できなかった場合には「バラバラ」と表１に記載した。
培養後の細胞培養基材に細胞剥離用薬剤を添加してからの経時的な細胞の剥離具合を目視で確認して剥離するまので時間（単位：分）を計測した。細胞培養基材を揺らした時に細胞が細胞培養基材から浮き上がって揺れに対応して動くことが確認できたら剥離が完了したものとした。
剥離後の細胞の形状は上記の剥離が完了した後の状態を目視で観察して判断した。培養した細胞が一体のシートとして剥離できた場合には「シート状」と、細胞同士が離れてバラバラになりシートとして剥離できなかった場合には「バラバラ」と表１に記載した。
【0072】
【表1】
【0073】
表１に記載の評価結果から、本発明の細胞培養基材用コーティング剤、細胞培養基材を用いることで十分な細胞培養率で培養することができ、短時間で培養細胞を細胞シートとして短時間で回収することが出来た。