特許 7503642 微小ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ｍｉｎｉＧＮＣ）抗体様タンパク質、その製造方法及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-12

(45)【発行日】2024-06-20

(54)【発明の名称】微小ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ｍｉｎｉＧＮＣ）抗体様タンパク質、その製造方法及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240613BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240613BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240613BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240613BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240613BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240613BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240613BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240613BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 H

A61P35/00

A61P37/06

A61P31/00

C12P21/08

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022555924

(86)(22)【出願日】2021-03-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-01

(86)【国際出願番号】 US2021022847

(87)【国際公開番号】W WO2021188736

(87)【国際公開日】2021-09-23

【審査請求日】2022-11-16

(31)【優先権主張番号】62/991,042

(32)【優先日】2020-03-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517218697

【氏名又は名称】システィミューン， インク．

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＳＴＩＭＭＵＮＥ， ＩＮＣ．

(73)【特許権者】

【識別番号】522263714

【氏名又は名称】バイリ－バイオ（チェンドゥ）ファーマスーティカル シーオー．，エルティーディー．

【住所又は居所原語表記】１３９ Ｂａｉｌｉ Ｒｏａｄ， Ｗｅｎｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１１１３０， ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ツー， イ

(72)【発明者】

【氏名】チャタジー，スミリ

(72)【発明者】

【氏名】ガレット，デニス アール．

(72)【発明者】

【氏名】ツァイ，ツング－アイ

(72)【発明者】

【氏名】レンショー， ブレア

(72)【発明者】

【氏名】ヴィンセント， クリストファー， ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ウェイト，アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】マック，ガー シー アマンダ

【審査官】三谷 直也

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１６４３２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５３７４４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／００５６４０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１８－５０９１７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２５５５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２０９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００４／００３３５６１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０１５３４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２４５２３３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端及びＣ末端を有する五重特異性抗体様タンパク質であって、
第１単量体及び第２単量体を含み、
前記第１単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで第１結合単量体、ＣＨ１ドメイン、第１ヒンジ、第１ＣＨ２ドメイン、及び第１ＣＨ３ドメインを含み、前記第１単量体は、Ｎ末端に結合した第１結合ドメイン（Ｄ１）及び末端に結合した第４結合ドメイン（Ｄ４）を含み、
前記第２単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで第２結合単量体、ＣＬドメイン、第２ヒンジ、第２ＣＨ２ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含み、前記第２単量体は、Ｎ末端に結合した第２結合ドメイン（Ｄ２）及びＣ末端に結合した第５結合ドメイン（Ｄ５）を含み、
前記第１結合単量体及び前記第２結合単量体は、二量体を形成するように構成され、
前記第１単量体及び前記第２単量体は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間の少なくとも１つのジスルフィド結合、及び第１ヒンジと第２ヒンジの間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して共有結合でペアとなり、
前記第１結合単量体は、ＶＨドメインを含み、前記第２結合単量体は、ＶＬドメインを含み、前記ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬドメインは、Ｆａｂ領域を第３結合ドメイン（Ｄ３）として形成し、或いは前記第１結合単量体及び前記第２結合単量体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を第３結合ドメイン（Ｄ３）として形成し、
前記五重特異性抗体様タンパク質は、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号２１に示されるアミノ酸配列及び配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号２５に示されるアミノ酸配列及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号２９に示されるアミノ酸配列及び配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号６９に示されるアミノ酸配列及び配列番号７１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号７３に示されるアミノ酸配列及び配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号７７に示されるアミノ酸配列及び配列番号７９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号８１に示されるアミノ酸配列及び配列番号８３に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号８５に示されるアミノ酸配列及び配列番号８７に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号８９に示されるアミノ酸配列及び配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号９３に示されるアミノ酸配列及び配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号９７に示されるアミノ酸配列及び配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１２９に示されるアミノ酸配列及び配列番号１３１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ２０に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１３３に示されるアミノ酸配列及び配列番号１３５に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ２０に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１４９に示されるアミノ酸配列及び配列番号１５１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２がＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１６９に示されるアミノ酸配列及び配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＮＫＧ２Ｄ受容体であり、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１７３に示されるアミノ酸配列及び配列番号１７５に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＮＫＧ２Ｄ受容体であり、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し、又は
配列番号１７７に示されるアミノ酸配列及び配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｄ１がＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２がＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３がＮＫＧ２Ｄ受容体であり、Ｄ４が４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５がＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する、五重特異性抗体様タンパク質。

【請求項2】

前記第１ＣＨ３ドメインは、ホール構造を形成するように構成され、前記第２ＣＨ３ドメインは、ノブ構造を形成するように構成され、前記第１ＣＨ２ドメインと第１ＣＨ３ドメイン及び前記第２ＣＨ２ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体化して相補的なＦｃドメインを形成するように構成される、請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質。

【請求項3】

前記Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、それぞれ独立してｓｃＦｖドメイン、ＶＨＨドメイン、受容体又はリガンドである、請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質。

【請求項4】

請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質をコードする単離された核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。

【請求項6】

請求項４に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。

【請求項7】

請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質と、細胞毒性剤とを含む、免疫複合体。

【請求項8】

請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項9】

請求項７に記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項10】

精製された請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質を含む、がん、自己免疫疾患又は感染症に罹患している対象を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項11】

請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質の調製方法であって、
請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質をコードするＤＮＡ配列が発現されるように宿主細胞を培養する工程と、
前記五重特異性抗体様タンパク質を精製する工程と、
を含む、方法。

【請求項12】

有効濃度の請求項１に記載の五重特異性抗体様タンパク質を含む溶液であって、前記溶液は、血漿である、溶液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照

【0002】

本出願は、２０２０年３月１７日に提出された米国仮出願第６２／９９１，０４２号の優先権を主張し（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ））、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本出願は、がん免疫療法に用いる多重特異性抗体の技術分野に関し、より具体的には、免疫細胞及び腫瘍細胞の両方の表面分子に対して多重結合活性を有する微小ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ｍｉｎｉＧＮＣ）抗体の製造及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

治療用抗体は、がん、感染症、自己免疫などの疾患の治療の主力となっている。モノクローナルである単一特異性抗体は、例えば特定のシグナル伝達経路の阻害又は活性化を介して疾患を治療するための直接的なメカニズムを提供する一方、多重特異性抗体は、より複雑な治療メカニズムを提供することができる。複数の異なる抗原又は単一抗原内の複数のエピトープを標的とすることにより、細胞の共局在化や活性化などの生物学的応答は引き出される。これによって、例えば、Ｔ細胞やその他の免疫細胞を特定の抗原発現腫瘍細胞の部位にリダイレクトすることが可能になる。このように、二重特異性及び多重特異性抗体は、免疫腫瘍学の分野で重要なプラットフォームとなっている。

【0005】

多特異性抗体プラットフォームの利点により、このようなフレームワークが数多く開発されている。このようなプラットフォームの一つは、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）として知られている。ＧＮＣタンパク質には、機能的に独立した複数の結合部分を連結して、エフェクター細胞と標的細胞の両方を結合できる単一の実体にするタンパク質が含まれる（出願人の出願ＷＯ／２０１９／００５６４１、ＷＯ２０１９１９１１２０及びＰＣＴ／ＵＳ２０／５９２３０；その全体が本明細書に組み込まれる）。一般に、これらのプラットフォームは少なくとも２つの特異性に制限されており、２つ以上の抗原への結合を必要とする複雑な治療メカニズムの探索を妨げている。２つ以上の特異性を持つ抗体プラットフォームでは、通常、結合ドメインの数を増加させるために、望ましくない物理的及び生物学的特性を有する大きな分子を形成する必要がある。分子が大きく複雑になると、凝集や溶解性の問題が発生する可能性が高くなるため、分子量の増大は発展を妨害する可能性がある。さらに、大きな高分子は、固形腫瘍に浸透する能力が、小さなサイズのタンパク質と比較して妨げられる可能性がある。したがって、モノクローナルＩｇＧ抗体よりも顕著に大きくないものの、３つ以上の特異性を有する多重特異性抗体プラットフォームが必要である。

【発明の概要】

【0006】

以下の概要は単なる例示であり、決して限定することを意図するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、及び特徴に加えて、さらなる態様、実施形態、及び特徴は、図面及び以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。

【0007】

本発明は、結合特異性を有するタンパク質（例えば、多重特異性抗体を含む多重特異性タンパク質様抗体）、これらの結合タンパク質の断片（ｓｃＦｖドメイン、Ｆａｂ領域、Ｆｃドメイン、ＶＨ、ＶＬ、軽鎖、重鎖、可変領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）など）を提供する。本発明は、さらにこの抗体様タンパク質の製造方法及び使用方法を提供する。

【0008】

一態様において、本発明は、多重特異性抗体様タンパク質を提供する。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端を有し、第１単量体と第２単量体とを含む。第１単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで第１結合単量体、ＣＨ１ドメイン、第１ヒンジ、第１ＣＨ２ドメイン及び第１ＣＨ３ドメインを含む。第１単量体は、必要に応じてＮ末端に結合した第１結合ドメイン（Ｄ１）及び／又はＣ末端に結合した第４結合ドメイン（Ｄ４）を含み得る。第２単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで第２結合単量体、ＣＬドメイン、第２ヒンジ、第２ＣＨ２ドメイン及び第２ＣＨ３ドメインを含む。第２単量体は、必要に応じてＮ末端に結合した第２結合ドメイン（Ｄ２）及び／又はＣ末端に結合した第５結合ドメイン（Ｄ５）を含み得る。第１結合単量体及び第２結合単量体は、二量体を形成するように構成される。第１単量体及び第２単量体は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合及び第１ヒンジと第２ヒンジとの間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して共有結合でペアとなる。前記多重特異性抗体様タンパク質は、少なくとも二重特異性である。

【0009】

一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、三重特異性、四重特異性又は五重特異性であり得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、モノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、精製されたモノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、ヒト化抗体であり得る。

【0010】

一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、さらに第１ＣＨ３ドメインと第２ＣＨ３ドメインとの間にジスルフィド結合を含み得る。

【0011】

一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、さらに第１ヒンジと第２ヒンジとの間に第２ジスルフィド結合を含み得る。

【0012】

一実施形態において、接続リンカーは、様々なドメインの間に使用される。一実施形態において、前記接続リンカーは、（Ｇ_ｘＳ_ｙ）_ｎリンカーを含み得る。ここで、ｎ、ｘ及びｙは、それぞれ独立して１から１０の整数である。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４又はＤ５は、リンカーを介してＮ又はＣ末端に結合される。一実施形態において、前記リンカーは、（Ｇ_ｘＳ_ｙ）_ｎリンカーを含み得る。ｎ、ｘ及びｙは、それぞれ独立して１から１０の整数であり得る。一実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０である。一実施形態において、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０である。一実施形態において、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０である。

【0013】

一実施形態において、第１ＣＨ３ドメインは、ホール（ｈｏｌｅ）構造を形成するように構成され、第２ＣＨ３ドメインは、ノブ（ｋｎｏｂ）構造を形成するように構成される。第１ドメインＣＨ２と第１ＣＨ３ドメイン、及び第２ＣＨ２ドメインと第２ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体化されて相補的なＦｃドメインを形成するように構成される。

【0014】

一実施形態において、第１ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ又はＹ４０７Ｖに少なくとも１つの「ホール」変異を含み、第２ＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗに「ノブ」変異を含み得る。

【0015】

一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆに変異を含み得る。

【0016】

一実施形態において、Ｆｃドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣから選択されるエフェクター細胞機能を排除するようにエンジニアリングされる。

【0017】

一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｋ３２２Ａ（Ｅｕナンバリング）に少なくとも１つの変異を含み得る。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｋ３２２Ａに変異を含む。一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｋ３２２Ａ（Ｅｕナンバリング）に変異を含む。一実施形態において、Ｆｃドメインは、ヌル変異を含む。一実施形態において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、変異Ｓ２２８Ｐ（Ｅｕナンバリング）を含む。一実施形態において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、変異Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３４Ａ（Ｅｕナンバリング）を含む。

【0018】

一実施形態において、重鎖定常配列は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来し得る。

【0019】

一実施形態において、前記Ｆｃドメインは、配列番号３１３又は３１４と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0020】

一実施形態において、第１結合単量体は、ＶＨドメインを含み、第２結合単量体は、ＶＬドメインを含み得る。ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬドメインは、Ｆａｂ領域を第３結合ドメイン（Ｄ３）として構成する。一実施形態において、Ｆａｂ領域は、ＶＨ－４４ＣとＶＬ １００Ｃとの間にジスルフィド結合を含み得る。

【0021】

一実施形態において、第１結合単量体と第２結合単量体は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を第３結合ドメイン（Ｄ３）として構成する。

【0022】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、それぞれ独立してｓｃＦｖドメイン、ＶＨＨドメイン、受容体又はリガンドである。

【0023】

一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＬドメインに結合したＶＨドメインを含み得る。一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＨ－ＶＬ方向を有し得る。一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＬ－ＶＨ方向を有し得る。

【0024】

一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＬとＶＨの間にジスルフィド結合を含み得る。一実施形態において、前記ジスルフィド結合は、ｓｃＦｖドメインのＶＬ１００とＶＨ４４の間にある。一実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＶＨに変異Ｒ１９Ｓを含み得る。

【0025】

一実施形態において、ＶＨＨドメインは、ＶＨ又はＶＨＨに変異Ｒ１９Ｓを含み得る。

【0026】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５の少なくとも１つ、２つ又は３つは、ｓｃＦｖであり得る。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、全てｓｃＦｖであり得る。

【0027】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５の少なくとも１つ、２つ又は３つは、ＶＨＨドメインであり得る。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、全てＶＨＨドメインであり得る。

【0028】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５の少なくとも１つ、２つ又は３つは、受容体であり得る。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、全て受容体であり得る。

【0029】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５の少なくとも１つ、２つ又は３つは、リガンドであり得る。一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、全てリガンドであり得る。

【0030】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５は、それぞれ独立してＴ細胞活性化受容体、免疫細胞結合受容体、免疫チェックポイント分子、共刺激因子、白血球の受容体、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、組織細胞の受容体、癌細胞の受容体又はそれらの組み合わせから選択される抗原に対して結合特異性を有し得る。

【0031】

一実施形態において、Ｔ細胞活性化受容体の結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の結合ドメインに隣接する。

【0032】

一実施形態において、Ｔ細胞活性化受容体は、ＣＤ３を含み得る。

【0033】

一実施形態において、免疫チェックポイント受容体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ＬＯＸ－１、ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＣＤ４７、ＨＶＥＭ ＳＩＲＰα、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ７３、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＣＤ４７又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0034】

一実施形態において、共刺激受容体は、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７、ＣＤ３０又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0035】

一実施形態において、腫瘍関連抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＲＦＶＩＩＩ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ３９、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＨＬＡ－Ｇ、ＦｃＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＬＩＶ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１３８、ＣＤ７０、ｕＰＡＲ、ＣＤ３８又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0036】

一実施形態において、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、それぞれ独立してＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＲＯＲ１、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＨＬＡ－Ｇ、ＦｃＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＬＩＶ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１３８、ＣＤ７０、ＣＤ１６、ｕＰＡＲ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＣＤ４７、ＣＤ３８、ＮＫｐ４６、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１６０、ＬＯＸ－１、ＳＩＲＰα ＣＤ２７から選択される抗原に対して結合特異性を有し得る。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを含み得る。

【0037】

一実施形態において、Ｄ１はＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ又はＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ２はＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３又はＣＤ１９に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ３はＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ３又はＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ４は４－１ＢＢ又はＥＧＦＲに対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１又はＨＥＲ３に対して結合特異性を有する。

【0038】

一実施形態において、Ｄ１はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。

【0039】

一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。

【0040】

一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。

【0041】

一実施形態において、Ｄ１はＣＤ３又はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３又はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。

【0042】

一実施形態において、Ｄ１及びＤ４はそれぞれＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２及びＤ５はそれぞれＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。

【0043】

一実施形態において、Ｄ１はＣＤ２０に対して結合特異性を有し、Ｄ２はＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。

【0044】

一実施形態において、Ｄ１はＮＫＧ２Ｄリガンドに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＣＤ１９に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し得る。

【0045】

一実施形態において、Ｄ１はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＮＫＧ２Ｄ受容体を含み得る。一実施形態において、前記タンパク質は、ＣＤ１９に対して結合特異性を有するＤ２をさらに含み得る。一実施形態において、前記タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有するＤ５をさらに含み得る。一実施形態において、前記タンパク質は、４－１ＢＢに対して結合特異性を有するＤ４をさらに含み得る。

【0046】

一実施形態において、多重特異性抗体様タンパク質は二重特異性である。一実施形態において、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ１はＨＥＲ２に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ５はＨＥＲ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４はＥＧＦＲに対して結合特異性を有する。

【0047】

一実施形態において、二重特異性抗体様タンパク質は、配列番号１及び３、５及び７、９及び１１、１３及び１５、５３及び５５、５７及び５９、１１３及び１１５、１１７及び１１９、１２１及び１２３、１２５及び１２７、１５７及び１５９、２９７及び２９９、又は１９９及び２０１と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0048】

一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、三重特異性である。一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ１はＣＥＡに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有する。 一実施形態において、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ５はＨＥＲ３に対して結合特異性を有する。一実施形態において、前記抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３及びＣＤ３に対して結合特異性を有する三重特異性抗体である。一実施形態において、三重特異性抗体様タンパク質は、配列番号４１及び４３、４５及び４７、４９及び５１、１０１及び１０３、１０５及び１０７、１０９及び１１１、１９５及び１９７、１３７及び１３９、又は１６１及び１６３と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0049】

一実施形態において、多重特異性抗体様タンパク質は四重特異性である。一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ４は４－１ＢＢに対して結合特異性を有する。一実施形態において、Ｄ１はＥＧＦＲに対して結合特異性を有し、Ｄ２はＨＥＲ３に対して結合特異性を有し、Ｄ３はＣＤ３に対して結合特異性を有し、Ｄ５はＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する。前記抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＣＤ３及び４－１ＢＢに対して結合特異性を有する四重特異性である。前記抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有する四重特異性である。一実施形態において、前記四重特異性抗体様タンパク質は、配列番号３３及び３５、３７及び３９、１４１及び１４３、１４５及び１４７、又は１６５及び１６７と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0050】

一実施形態において、前記抗体は、五重特異性である。一実施形態において、前記抗体様タンパク質は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＣＤ３、４－１ＢＢ及びＰＤ－Ｌ１に対して結合特異性を有し得る。一実施形態において、五重特異性抗体様タンパク質は、配列番号１７及び１９、２１及び２３、２５及び２７、２９及び３１、６９及び７１、７３及び７５、７７及び７９、８１及び８３、８５及び８７、８９及び９１、９３及び９５、９７及び９９、１２９及び１３１、１３３及び１３５、１４９及び１５１、１６９及び１７１、１７３及び１７５、又は１７７及び１７９と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0051】

第２態様において、本発明は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の新規配列を提供する。一実施形態において、本発明は、前記ＣＤＲを含むタンパク質、抗体様タンパク質又は抗体を提供する。

【0052】

一実施形態において、前記ＣＤＲは、ＣＥＡに対して親和性を有し得る。一実施形態において、前記ＣＤＲは、ＣＥＡに対して平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。前記ＫＤは、０．１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ又は５０ｎＭ以下である。一実施形態において、前記ＣＤＲは、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５又は３０６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0053】

一実施形態において、本発明は、ＣＥＡに対して親和性を有するタンパク質を提供する。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３０１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ１を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３０２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ２を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３０３と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ３を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３１４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ１を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３０５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ２を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号３０６と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ３を有し得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号２７９、２８０、２８１又は２８２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号２７９、２８０、２８１又は２８２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0054】

一実施形態において、本発明は、可変領域を有する多重特異性抗体様タンパク質を提供する。前記可変領域は、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５又は３０６から選択されるアミノ酸配列を含み得る。

【0055】

一実施形態において、前記ＣＤＲは、ＣＤ３に対して親和性を有し得る。一実施形態において、前記ＣＤＲは、ＣＤ３に対して平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。前記ＫＤは、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ又は５００ｎＭ以下である。一実施形態において、前記ＣＤＲは、配列番号３０７、３０８、３０９、３１０、３１１又は３１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0056】

一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３０７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ１を有する。一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３０８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ２を有する。一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３０９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｈ３を有する。一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ１を有する。一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ２を有する。一実施形態において、ＣＤ３に対して親和性を有する前記タンパク質は、配列番号３１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ Ｌ３を有する。

【0057】

一実施形態において、前記タンパク質は、配列番号２２７－２３０、２３１－２３４、２３５－２３８、２３９－２４２及び２９１－２９４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、配列番号２２７－２３０、２３１－２３４、２３５－２３８、２３９－２４２及び２９１－２９４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0058】

一実施形態において、前記多重特異性抗体様タンパク質は、可変領域を有し得る。前記可変領域は、配列番号３０７、３０８、３０９、３１０、３１１又は３１２から選択されるアミノ酸配列を含み得る。

【0059】

別の態様において、本発明は、前記多重特異性抗体様タンパク質、断片、ドメイン及び領域をコードする単離された核酸配列を提供する。

【0060】

別の態様において、本発明は、前記単離された核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

【0061】

別の態様において、本発明は、前記単離された核酸配列を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、前記宿主細胞は、前記発現ベクターを含む。一実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。

【0062】

別の態様において、本発明は、前記多重特異性抗体様タンパク質の調製方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、多重特異性抗体様タンパク質をコードするＤＮＡ配列が発現されるように宿主細胞を培養するステップと、前記多重特異性抗体を精製するステップとを含む。一実施形態において、前記方法は、前記多重特異性抗体様タンパク質が産生される条件下で宿主細胞を培養するステップと、前記抗体様タンパク質を回収するステップとを含む。

【0063】

別の態様において、本発明は、免疫複合体を提供する。一実施形態において、前記免疫複合体は、造影剤及び／又は細胞毒性剤に結合した多重特異性抗体様タンパク質を含み得る。

【0064】

別の態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。一実施形態において、前記医薬組成物は、多重特異性抗体様タンパク質及び薬学的に許容される担体を含み得る。一実施形態において、前記医薬組成物は、放射性同位体、放射性核種、毒素、治療薬、化学療法薬又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。一実施形態において、前記医薬組成物は、前記免疫複合体、及び薬学的に許容される担体を含み得る。

【0065】

別の態様において、本発明は、がん、自己免疫疾患又は感染症に罹患している対象を治療又は予防する方法を提供する。一実施形態において、前記方法は、前記対象に精製された多重特異性抗体様タンパク質を含む医薬組成物、免疫複合体又は前記医薬組成物を投与するステップを含み得る。一実施形態において、前記方法は、有効量の治療薬を共投与するステップをさらに含み得る。一実施形態において、前記治療薬は、抗体、化学療法剤、酵素又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0066】

一実施形態において、前記対象はヒトである。一実施形態において、前記対象は哺乳類である。一実施形態において、前記対象はチンパンジーである。一実施形態において、前記対象はペット動物である。

【0067】

別の態様において、本発明は、有効濃度の前記多重特異性抗体様タンパク質、免疫複合体又は医薬組成物を含む溶液を提供する。一実施形態において、前記溶液は、対象の血漿である。

【図面の簡単な説明】

【0068】

本明細書の開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。図面は、本明細書の開示に従って用意されたいくつかの実施形態のみを示しており、従って、その範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本明細書の開示は、添付の図面の使用を通じてさらなる特異性及び詳細が説明され得る。

【0069】

【図1】５つの結合ドメイン（Ｄ１－Ｄ５）を有するｍｉｎｉＧＮＣ分子のヘテロ二量体構成を示す。ここで、２つの単量体は、鎖Ａ（Ｎ－Ｄ１－Ｄ３／ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ４－Ｃ）及び鎖Ｂ（Ｎ－Ｄ２－Ｄ３／ＶＬ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ５－Ｃ）によってコードされる。

【0070】

【図2】ＶＨ又はＦｃのいずれかにノックアウト変異（ＫＯ）を有するエンジニアリングされたｍｉｎｉＧＮＣの鎖Ａ及び鎖Ｂの二量体化を示す。（２Ａ）プロテインＡ精製によるホモ二量体（ａ）、所望のヘテロ二量体（ｂ）、及び鎖Ｂ単量体（ｃ）への混合物の分画。（２Ｂ）非還元及び還元条件下で予想サイズでのプロテインＡ分画ホモ二量体（ａ）、ヘテロ二量体（ｂ）、鎖Ｂ単量体（ｃ）及び鎖Ａ単量体（ｄ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。

【0071】

【図3】ペンタｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｐ６）、テトラｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｅ２）、トリｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｘ３）、バイｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｘ２）及びモノｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｏ２）分子を用いた、ＢＸＰＣ３腫瘍細胞に対する多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ分子媒介ＴＤＣＣの比較効力を示す。

【0072】

【図4】０．１から５．５ｐＭの範囲のＥＣ５０値を有する、ＢＸＰＣ３腫瘍細胞株に対するｍｉｎｉＧＮＣ分子媒介ＴＤＣＣの比較効力を示す。

【0073】

【図5】比較効力を測定するＴＤＣＣアッセイの生存曲線を示す。（Ａ）膵臓がん細胞（ＨＰＡＦＩＩ）に対するステープル化ドメインを有する多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ分子（ペンタｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８Ｐ１）、テトラｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８Ｅ２及びＳＩ－６８Ｅ１）及びトリｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８ｘ２））の殺傷効力（ＴＤＣＣアッセイ）。（Ｂ）ＭＣＦ－７乳がん細胞に対するＳＩ－６８Ｘ１の効力。

【0074】

【図6】乳がん細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対する二量体ＮＫＧ２Ｄ受容体を有する多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ分子（三重特異性（ＳＩ－４９Ｒ２５）、四重特異性（ＳＩ－４９Ｐ＿Ｘ）、五重特異性（ＳＩ－４９ＰＭ１及びＳＩ－４９Ｐ８）を含む）の殺傷機能（ＴＤＣＣアッセイ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0075】

以下の詳細な説明では、その一部を構成する添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、通常、類似の記号は類似のコンポーネントを識別します。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。 本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に記載され、図に示されているように、本開示の側面は、本明細書で明示的に検討されている様々な構成で配置、置換、結合、分離、及び設計が可能であることは、容易に理解できる。

【0076】

本発明は、特に単離された抗体、この抗体の製造方法；この抗体若しくは抗原結合断片から構成される二重特異性若しくは多重特異性分子、抗体薬物複合体及び／又は免疫複合体；この抗体、二重特異性若しくは多重特異性分子、抗体薬物複合体及び／又は免疫複合体を含む医薬組成物；前記分子及び組成物を製造する方法；ならびに本発明の分子及び組成物を用いてがんを治療する方法を提供する。

【0077】

本発明は、微小構成の多重特異性ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ＧＮＣ）抗体（ｍｉｎｉＧＮＣ）を開示する。ｍｉｎｉＧＮＣプラットフォーム分子は、１つ、２つ、３つ又は４つの追加結合ドメインを有するＦａｂ－ヒンジ－Ｆｃ領域コア構造（Ｄ１からＤ５）の形成を特徴とする２つのポリペプチド鎖の組み立てられたヘテロ二量体である（図１）。この２つのポリペプチドでは、鎖Ａ（又は鎖１）：Ｎ－Ｄ１－Ｄ３（ＶＨ）－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ４－Ｃ、及び鎖Ｂ（又は鎖２）：Ｎ－Ｄ２－Ｄ３（ＶＬ）－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ５－Ｃで構成され得る。この２鎖のＦｃドメインは、ヘテロ二量体の形成を促進するために、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」としても知られている相補的な変異を含むようにエンジニアリングされる。ｍｉｎｉＧＮＣプラットフォーム分子は、可変成分を含み得る。例えば、Ｆａｂ領域のＶＨ及びＶＬは、結合特異性を有するか又は有さない非Ｆａｂ二量体によって置換され得る。追加の結合ドメインは、ｓｃＦｖ若しくはＶＨＨなどの抗体フラグメント、又はリガンド若しくは受容体などの非抗体構造であり得る。ｍｉｎｉＧＮＣプラットフォーム抗体は、２価、３価、４価又は５価であり、最大５つの異なる特異性を有するとともに、通常の２価ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤのトリｍｉｎｉＧＮＣ Ａｂ）のサイズを保持するか、又はわずかに大きい（１７５ｋＤのテトラｍｉｎｉＧＮＣ Ａｂ及び２００ｋＤのペンタｍｉｎｉＧＮＣ Ａｂ）。

【0078】

本発明は、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体、特に五重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体（ペンタｍｉｎｉＧＮＣ Ａｂ）の製造及び使用方法に関する。通常、ＧＮＣ抗体などのＧＮＣタンパク質は、腫瘍細胞を標的としながらＴ細胞を活性化するなど、免疫細胞に関与するための２つの部分を含むことを特徴とする。ＧＮＣ抗体と同様に、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、Ｔ細胞活性化のための抗ＣＤ３、共刺激のための抗４－１ＢＢ、免疫チェックポイントを阻害するための抗ＰＤ－Ｌ１など、免疫細胞に関与するための複数の抗原結合ドメインを保持する。がんを治療するための抗体療法の有効性を向上させるために、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、ＧＮＣ抗体の２つの部分の特徴を保持しながら、構造的に安定してコンパクトになるように設計されている。この改善により、同じ又は異なる腫瘍細胞上に第２腫瘍関連抗原に対する結合特異性を追加することは可能になる。ＧＮＣ抗体と比較して、ｍｉｎｉＧＮＣにはＦｃＲｎを介したリサイクルと半減期の延長、及び容易なプロテインＡによる精製を可能にするＦｃドメインが含まれる。必要に応じて、Ｆｃ受容体媒介性免疫を組み込むことができる。Ｆｃを含むｍｉｎｉＧＮＣ抗体は非常にコンパクトであるため、開発性を向上させ、腫瘍への浸透を促進することができる。ＧＮＣ抗体は通常、抗原結合ドメイン（ＡｇＢＤ）の数が増加したため、ＩｇＧ抗体よりも大きく、Ｔ細胞と腫瘍細胞の両方に結合するための空間的柔軟性を提供する。一方、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、ヒトＩｇＧの１５０ｋＤと比較して、ヒトＩｇＧ抗体とおおよそ同じサイズを保持し、二重特異性では１１０－１３０ｋＤ、三重特異性では１２０－１６０、四重特異性では１３０－１９０ｋＤ、五重特異性では１４０－２２０ｋＤである。各鎖に１つ又は２つのｓｃＦｖを組み込むことで、腫瘍の微小環境をナビゲートしながら、鎖ペアリングの複雑化を軽減し、安定性を向上させることができる。これらの特徴的な機能により、ＧＮＣ及びｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、腫瘍関連抗原を標的とする部分が同じであるため、同じがんを治療するための有効な抗体療法の代替となる可能性がある。前記腫瘍関連抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＲＦＶＩＩＩ、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＥｐＣＡＭ、グリピカン－３、ｇｐＡ３３、ＧＤ２、ＴＲＯＰ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ３９、ＣＬＤＮ１８．２、ＤＬＬ３、ＨＬＡ－Ｇ、ＦｃＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＬＩＶ－１、ＭＵＣ１、ＣＤ１３８、ＣＤ７０、ｕＰＡＲ、ＣＤ３８を含むが、これらに限定されない。

【0079】

「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物活性を示す限り、具体的には、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ）をカバーする。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ｓｃＦｖ、二重特異性、二重有効、ヒト及びヒト化抗体であってもよい。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ断片、並びにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブラリの産物、上述したいずれかの抗体及び断片のエピトープ結合断片が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する結合部位を含む分子を含んでもよい。免疫グロブリンは、任意のタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。一実施形態では、抗体は、完全抗体及び完全抗体に由来の任意の抗原結合断片であってもよい。典型的な抗体は、通常、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖からなるヘテロ四量体タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈと略記）及び重鎖定常ドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌと略記）及び軽鎖定常ドメインから構成される。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、超可変相補性決定領域ｓ（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域のドメインにさらに分けられ得る。各可変ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）は、通常、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配列される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合領域がある。

【0080】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにコンタミネーションされていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。例えば、本明細書の開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７参照）。

【0081】

モノクローナル抗体は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び／又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、一方、鎖の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含んでいてもよい（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５［１９８４］）。

【0082】

モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ又はファージディスプレイ（レビューはＳｉｅｇｅｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．９：１５－２２（２００２）参照）を含むさまざまな方法を使用して、又は初代Ｂ細胞から直接抗体を分子クローニングすること（Ｔｉｌｌｅｒ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：４５３－７（２０１１）参照）で生産し得る。本発明において、抗体は、ハイブリドーマやディスプレイなどのその後の戦略と組み合わせて、ウサギ、マウス又はラマを免疫する方法によって作成された。ウサギは、親和性、多様性、特異性の高い抗体を作成することが知られている（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４９：ｅ３０５）。ウサギの免疫及びその後のＢ細胞培養に加えて、抗体の生成と発見のための他の一般的な戦略には、他の動物（マウスなど）の免疫、その後のハイブリドーマ及び／又はファージ、酵母若しくは哺乳動物細胞でのディスプレイ；或いは合成可変遺伝子ライブラリーを用いたディスプレイが含まれる。この抗体発見の一般的な方法は、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ Ｏｎｅ．９：ｅ８６１８４（２０１４）に記載されている方法と似ている。

【0083】

「抗原又はエピトープ結合部分もしくは断片」という用語は、抗原に結合することができる抗体の断片を指す。これらの断片は、インタクト抗体の抗原結合機能及び追加機能の能力を有していてもよい。結合断片の例は、合成リンカーによって単一ポリペプチド鎖に接続された抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＶＬ、定常軽鎖（ＣＬ）、ＶＨ、及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、さらに小さなサブフラグメントであってもよく、単一のＣＤＲドメイン、特にＶＬ及び／又はＶＨドメインのいずれかからのＣＤＲ３領域と同じくらい小さいドメインで構成されてもよい（Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－４９（２０００））。抗体断片は、当業者に知られている従来の方法を使用して生産される。抗体断片は、インタクト抗体で使用される同じ技術を使用して、有用性に関してスクリーニングできる。

【0084】

「抗原又はエピトープ結合断片」は、多くの当該技術分野で知られている技術により、本明細書の開示の抗体に由来し得る。例えば、精製モノクローナル抗体をペプシンなどの酵素で切断し、ＨＰＬＣゲルろ過にかけることができる。次に、Ｆａｂ断片を含む適切な画分を収集し、膜濾過などにより濃縮し得る。抗体の活性断片の単離のための一般的な技術のさらなる説明については、例えば、Ｋｈａｗ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２３：１０１１－１０１９（１９８２）、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：６６３－６９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照。

【0085】

抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋できるＦ（ａｂ'）_２断片が生成される。

【0086】

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいてもよい。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ'の本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

【0087】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体で構成され、非共有結合で緊密に結合している。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力があるが、結合部位全体よりも親和性が低くなる。

【0088】

脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。

【0089】

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置はよく知られている。

【0090】

「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために変更されてもよい。「ヒト化抗体」を得る方法は、当業者によく知られている。（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３２ （１９８９），Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：４２１（１９９１）参照）。

【0091】

本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」という用語は互換性があり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される生体分子を意味すると定義される。

【0092】

本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味すると定義され、文脈が不適切でない限り複数形を含む。

【0093】

「単離された」とは、それが自然に発生する成分の少なくともいくつかを含まない生体分子を意味する。「単離された」とは、本明細書に開示の様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、発現元の細胞又は細胞培養物から同定及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。典型的には、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離された抗体」とは、異なる抗原結合特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。

【0094】

「組換え」とは、外因性宿主細胞で組換え核酸技術を使用して抗体が生成されることを意味する。

【0095】

「抗原」という用語は、生物、特に動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘発することができる実体又はその断片を指す。この用語は、抗原性又は抗原決定基に関与する免疫原及びその領域を含む。

【0096】

また、本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原性剤に対する抗体、T細胞又は他の反応性免疫細胞の生産を誘発又は増強し、ヒト又は動物の免疫応答に寄与する物質を指す。個体が治療される障害を緩和又は軽減するために、本明細書の開示の投与された免疫原性組成物に対して十分な抗体、T細胞及び他の反応性免疫細胞を生産すると、免疫応答が生じる。

【0097】

特定の抗原又はエピトープに対する「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」とは、非特異的相互作用とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した制御分子との競合により決定し得る。

【0098】

「親和性」という用語は、抗体／抗原、受容体／リガンドなどの２つのポリペプチド間の引力の尺度を指す。２つのポリペプチド間の固有の引力は、特定の相互作用の結合親和性平衡解離定数（ＫＤ）として表すことができる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、バイオレイヤー干渉法によって測定することができる。ここで、ＫＤは、ｋｄｉｓ（解離速度定数）とｋｏｎ（結合速度定数）の比、即ち、ＫＤ＝ｋｄｉｓ／ｋｏｎである。

【0099】

特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０^－４Ｍ、少なくとも約１０^－５Ｍ、少なくとも約１０^－６Ｍ、少なくとも約１０^－７Ｍ、少なくとも約１０^－８Ｍ、少なくとも約１０^－９Ｍ、少なくとも約１０^－１０Ｍ、少なくとも約１０^－１１Ｍ、少なくとも約１０^－１２Ｍ、又はそれ以上の抗原又はエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得る。ここで、ＫＤは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープに対して対照分子の２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きいＫＤを有してもよい。

【0100】

また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照に対するエピトープについて少なくとも２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きい抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体により示すことができる。ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）速度を意味する。

【0101】

２つの配列間の「相同性」は、配列の同一性によって決定される。互いに比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基の割合に関する。配列同一性は、コンピュータープログラムを使用して従来通りに決定できる。所定の配列と本明細書の開示の上記の配列との比較において現れる逸脱は、例えば、追加、欠失、置換、挿入又は組換えによって引き起こされてもよい。

【0102】

本明細書の開示は、本明細書に含まれる特定の実施形態及び実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されてもよい。本明細書の開示は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されたが、そのような詳細な説明は、開示の範囲に対する限定とみなされるべきではない。

【0103】

実施例
実施例１：五重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の構造

【0104】

ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の設計は、鎖Ａと鎖Ｂの間のヘテロ二量体の２本のポリペプチド鎖の共発現及び組み立てに依存する（図１）。鎖Ａは、天然の重鎖（ＨＣ）であり得る一方、鎖Ｂは、軽鎖とＨＣのＦｃドメインとの間の組換え融合ペプチドである。この抗体のコアには、Ｆａｂ領域（ＶＨ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬ）があり、その後ろにヒンジ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ＣＨ２－ＣＨ３／ＣＨ２－ＣＨ３）である。ホモ二量体を不安定化し、ヘテロ二量体の形成を促進するために、ＣＨ３ドメインに「Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」変異又は他の相補的な変異セットを導入することができる（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９６；９：６１７－２１）。Ｔｈｅ鎖ＡのＣＨ３ドメインにおける「ホール」変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４７０Ｖで構成され、鎖ＢのＣＨ３ドメインにおける「ノブ」変異は、Ｔ３６６Ｗである。鎖Ｂ上のＴ３６６Ｗ変異によって構成される「ノブ」は、優先的に鎖Ａ上の３つの変異によって構成される「ホール」と相互作用する。この優先的なペアリングは、ヘテロ二量体をさらに安定化することができる一方、Ｆａｂドメインコンポーネントの非共有結合ペアリング（即ち、鎖Ａ上のＶＨ－ＣＨ１と鎖Ｂ上のＶＬ－Ｃｋ）は、機能的なＦａｂ領域を構成する。言い換えれば、機能的なＤ３結合ドメイン（例えば、機能的なＦａｂ領域又は非Ｆａｂ受容体二量体）は、鎖Ａ－鎖Ｂヘテロ二量体でのみ作成することができる。ＧＮＣ抗体と比較して、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、依然として天然ＩｇＧ（Ｆａｂ，Ｆｃ）及び他の可変配列に基づく構造（例えば、ｓｃＦｖ及びＶＨＨ）由来の抗体断片を含むが、ヘテロ二量体の形成後にＦａｂ領域－ヒンジ－Ｆｃ領域構造を優先的に構成するようにエンジニアリングされる。ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の特徴は、このエンジニアリングされた構造のコンパクトさである。

【0105】

構造的に多様化された１つ又は複数の抗原結合ドメインをＤ１、Ｄ２、Ｄ４又はＤ５としてｍｉｎｉＧＮＣ分子の２つのＮ末端及び２つのＣ末端に付加することにより、最大５つの結合特異性を形成することができる。これらの付加結合ドメインのそれぞれは、ｓｃＦｖ及びＶＨＨなどの可変配列に基づく構造、又はリガンド及び受容体などの非可変配列に基づく構造であり得る。図１に示すように、Ｄ１及びＤ２は、それぞれ鎖Ａ及び鎖ＢのＮ末端に結合した結合ドメインを指し、Ｄ４及びＤ５は、それぞれ鎖Ａ及び鎖ＢのＣ末端に結合した結合ドメインを指す。従って、五重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ（ペンタｍｉｎｉＧＮＣ）抗体の２つのポリペプチドは、以下のように構成され得る。
鎖Ａ：Ｎ－Ｄ１－Ｄ３（ＶＨ）－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ４－Ｃ
鎖Ｂ：Ｎ－Ｄ２－Ｄ３（ＶＬ）－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｄ５－Ｃ
ここで、図１に示すように、ＶＬはＶλ又はＶκであり、ＣＬはＣλ又はＣκであり得る。

【0106】

結合ドメインの数及びそれらの結合特異性に応じて、１つ又は複数の結合ドメインを減少させてテトラ、トリ及びバイｍｉｎｉＧＮＣにすることにより図１のペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体の構造を簡略化することができる。例えば、表１は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を標的とする効果を最適化するための抗ＣＤ３ｍｉｎｉＧＮＣ抗体のファミリーの生成及び特徴付けを示す。この場合、各結合ドメインは、１つの結合特異性を発揮する。その５つの結合ドメインのうちの２つが抗原の同じエピトープを標的とする（即ち、同じ結合特異性を有する）場合、このペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、四重特異性ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体となる。

【0107】

実施例２：エンジニアリングされたｍｉｎｉＧＮＣ抗体のコア構造

【0108】

ｍｉｎｉＧＮＣの構造が安定して機能的なヘテロ二量体タンパク質に変換可能であることを証明するために、簡易な非対称フォーマットを設計してｍｉｎｉＧＮＣ分子のヘテロ二量体形成に対する構成と変異の影響を評価した。簡単に言えば、単一のｓｃＦｖ（Ｄ１）は鎖ＡのＮ末端に融合され、鎖Ｂは追加の結合ドメインを含まない。このように、鎖Ａと鎖Ｂの間の二量体化の各種の割合は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとＳＥＣによって区別することができる。鎖Ａホモ二量体は観察されず、鎖Ｂホモ二量体、鎖Ａヘテロ二量体及び鎖Ｂヘテロ二量体の予測サイズは、それぞれ１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ及び１２５ｋＤａである（図２）。

【0109】

混合物からヘテロ二量体ｍｉｎｉＧＮＣ分子を選択的に精製するための戦略を設計するために、鎖ＢのＣＨ３ドメイン（Ｈ４３５及びＹ４３６）における２つのアミノ酸残基を置換した。特に、ヒスチジン（Ｈ４３５）は、治療用抗体の精製中にプロテインＡ樹脂への鎖Ｂの結合に重要であり（Ｔｕｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、このアミノ酸の置換又はＰｒｏＡノックアウト変異（ＰｒｏＡＫＯ）は、プロテインＡ結合を終了させる。この戦略により、プロテインＡカラムからの選択的溶出によるヘテロ二量体の分離が可能になる。プロテインＡカラムは親重鎖結合部位を介してヘテロ二量体を保持するため、鎖ＢがプロテインＡ結合を欠いていることから鎖Ｂホモ二量体は通過する。鎖Ｂ上のＰｒｏＡＫＯの設計は、ＩｇＧ３サブクラスの相同領域から取得した残基を有するプロテインＡ結合部位のアミノ酸置換により免疫原性を変更する可能性のある問題を最小限に抑える。ほとんどのｍｉｎｉＧＮＣ分子は主にＩｇＧ１サブタイプの構造及び配列を組み込むが、ＩｇＧ３は、プロテインＡ、プロテインＧ及びＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）への結合においていくつかの特定の構造摂動を伴う他のＩｇＧサブクラスと全体的に類似した構造を有する。この違いは、ＩｇＧ３のＲ４３５（他のサブタイプではＨ４３５）の存在がＦｃとプロテインＡの相互作用を排除する、以前に明らかにされたＦｃ配列の違いに基づくものである。したがって、したがって、代表的なｍｉｎｉＧＮＣ分子では、ｍｉｎｉＧＮＣ鎖Ｂ上のプロテインＡ結合に重要なアミノ酸（Ｈ４３５及びＦ４３６）が、ＩｇＧ３対応配列（Ｒ４３５及びＹ４３６）に変異した。

【0110】

鎖ＢのＮ末端に融合したｓｃＦｖが追加された多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体のクラスでは、ｓｃＦｖがＶＨ３ファミリーに由来する場合、依然としてプロテインＡ結合と相互作用する可能性がある。ＶＨ３にコードされた抗体は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）と相互作用することが知られており、ＦＲ１、ＣＤＲ２及びＦＲ３における残基は、ＳＰＡ結合に関与することが確認されており（Ｒｏｂｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９５）、構造データは、単一の関連領域を非結合免疫グロブリンからの対応領域で置換することにより、ＶＨ３にコードされた抗体によるプロテインＡ結合が排除されることを示している。ＦＲ１のアミノ酸Ｒ１９の置換は、プロテインＡへの結合に重要であることが確認され、ＶＨ４ファミリーにおける同等領域からのアミノ酸配列（Ｓ１９）を用いて実施された。

【0111】

ＰｒｏＡＫＯの異なる組み合わせ（Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（Ｆｃ）及びＲ１９Ｓ（ＶＨ））を含む４つの異なるバージョンの鎖Ｂ変異（配列番号３、７、１１及び１５）を有する４セットのｍｉｎｉＧＮＣ抗体（配列番号１－１６）を分析サイズ排除クロマトグラフィーにより精製及び分析した。両方のセットの変異を有する鎖Ｂを含むタンパク質のみが鎖Ｂの混入物を完全に除去できた（図２Ａ）。このＶＨ３プロテインＡノックアウト変異（Ｒ１９Ｓ）及び鎖Ｂ上のＦｃプロテインＡノックアウト変異（Ｈ４３５Ｒ，Ｆ４３６Ｙ）は、ほとんどの多重特異性抗体フォーマットに組み込まれ、バイ、トリ、テトラ及びペンタｍｉｎｉＧＮＣ分子の生成に使用された。

【0112】

代替抗体アイソタイプを有する機能的なｍｉｎｉＧＮＣタンパク質を生成する可能性を実証するために、ＩｇＧ４定常領域を含む例示的なｍｉｎｉＧＮＣを生成した。ＳＩ－７５ＸＭ９（配列番号２９７－３００）は、ＩｇＧ１ ＣＨ１、ヒンジ及びＦｃがＩｇＧ４ ＣＨ１、ヒンジ及びＦｃに置換された以外、ＳＩ－７５Ｘ５（配列番号１－４）二重特異性ｍｉｎｉＧＮＣの類似体である。特に、両方のタンパク質は、同じ結合ドメイン（Ｄ２の抗ＨＥＲ３ドメイン及びＤ３の抗ＣＤ３＊ドメイン）を有し、同じコア構造及び変異を含む（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ Ｆｃ変異；抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖにおけるＲ１９Ｓ；及びＦｃにおけるＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ変異）。表８に示すように、ＳＩ－７５ＸＭ９は、ＳＩ－７７Ｘ５に匹敵する力価を有し、分析ＳＥＣによって評価されるように、プロテインＡ精製後に目的タンパク質の割合が１９％大幅に増加した（８５．６％ＰＯＩ対７２．２％ＰＯＩ）。高分子量種の減少は、ＩｇＧ４の短いヒンジ長（１５ではなく１２個のアミノ酸）に関連する可能性があり、これにより高次オリゴマーの会合傾向が減少する可能性がある。したがって、代替抗体アイソタイプを有するｍｉｎｉＧＮＣタンパク質を生成することができるとともに、凝集の減少などのより好ましい特性をもたらすこともできる。

【0113】

実施例３：多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の構成

【0114】

第１グループの多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体を生成及び特徴付けするために、３つの部分１結合ドメイン（即ち、αＣＤ３、αＰＤ－Ｌ１及びα４－１ＢＢ）、及びＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対する２つの部分２結合ドメインを選択して比較した。表１に示すように、このグループをさらにペンタｍｉｎｉＧＮＣ、テトラｍｉｎｉＧＮＣ、トリｍｉｎｉＧＮＣ及びバイｍｉｎｉＧＮＣグループに細分化した。各サブグループにおいて、少なくとも１つのｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、Ｄ３からのＣＤ３結合を有した。ペンタｍｉｎｉＧＮＣグループは、ＳＩ－７５Ｐ６（配列番号１７、１９；Ｄ３位置からのαＥＧＦＲを有する）、ＳＩ－７５Ｐ４（配列番号２１、２３；Ｄ４に４－１ＢＢ受容体に対するリガンドである４１ＢＢＬを有する）、ＳＩ－７５Ｐ３（配列番号２５、２７）及びＳＩ－７５Ｐ９（配列番号２９、３１；Ｄ３からのαＨＥＲ３を有する）を含む。α４－１ＢＢ又はαＰＤ－Ｌ１ドメインの存在下と非存在下での効果を比較するために、テトラｍｉｎｉＧＮＣグループは、２つの抗体、即ちＳＩ－７５Ｅ１（配列番号３３、３５）及びＳＩ－７５Ｅ２（配列番号３７、３９）を含む。ヘテロ二量体のＮ末端又はＣ末端上の２つの部分２結合ドメインを比較するために、トリｍｉｎｉＧＮＣグループは、３つの抗体、即ち、ＳＩ－７５Ｘ３（配列番号４１、４３）、ＳＩ－７５Ｘ１６（配列番号４５、４７）及びＳＩ－７５Ｘ１８（配列番号４９、５１）を含む。バイｍｉｎｉＧＮＣグループは、３つの抗体、即ち、ＳＩ－７５Ｘ１（配列番号５３、５５）、ＳＩ－７５Ｘ２（配列番号５７、５９）及びＳＩ－７５Ｘ５（配列番号１、３）を含み、それぞれが１つの部分１結合ドメイン及び１つの部分２結合ドメインを有する。

【0115】

第１グループのｍｉｎｉＧＮＣ抗体の各メンバーをコードするＤＮＡをベクターｐＴＴ５にクローニングし、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを用いて許容できる力価で９日間発現させた。５ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムでｍｉｎｉＧＮＣ抗体を精製した後、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ又はＰｕｒｉｆｉｅｒシステムのいずれかで高負荷１６／６００ ２００ｐｇ分取ＳＥＣカラムを用いたサイズ排除を行った。多角度光散乱（ＭＡＬＳ、Ｗｙａｔｔシステム）に接続されたウォーターズＨＰＬＣを用いてＳＥＣ凝集体を分析し、ｄｎ／ｄｃ計算方法により正しい分子量を特定した。

【0116】

実施例４：結合親和性のＯｃｔｅｔ分析

【0117】

ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の機能を評価するために、各ドメインの結合親和性をＢｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｏｃｔｅｔ ３８４システム）により決定した。Ｏｃｔｅｔ分析により、選択したｍｉｎｉＧＮＣ抗体がすべての同種抗原に対する結合特異性及び親和性を保持していることを確認した。各ｍｉｎｉＧＮＣ抗体をＡＨＣセンサーに１０ｕｇ／ｍｌで１８０秒間ロードした後、６０秒のベースラインステップ、１００ｎＭの市販ヒト抗原との１８０秒の関連付けステップ、及び３６０秒の解離ステップを実施した。すべてのステップのサンプルはＯｃｔｅｔ緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に含まれた。１：１結合モデルを用いたフィッティングを実施して親和性ＫＤ値を抽出した。表１に示すように、各結合ドメインの結合親和性は、そのＫＤによって測定されるように、許容範囲内で変化する。部分１結合では、ａＣＤ３ドメインのＫＤは、１７．４から３６．２ｎＭであり、αＰＤ－Ｌ１のＫＤは、１から２．７２ｎＭであり、α４－１ＢＢのＫＤは、７．５１から３７．３ｎＭであり得る。部分２結合では、αＥＧＦＲのＫＤは、５．５６から１１．１であり、ａＨＥＲ３のＫＤは、１１２．８から１８５ｎＭであり得る。

【0118】

実施例５：多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体比較効力

【0119】

がん細胞の殺傷効力を測定するために、第１グループの多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体をＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイにかけた。このグループのｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、すべての分子にαＣＤ３結合ドメインがあるため、Ｔ細胞を利用し、Ｔ細胞媒介性細胞溶解をリダイレクトし、最終的に標的細胞を殺すことができる。

【0120】

発光に基づくＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイを使用し、ルシフェラーゼの構成的発現による細胞生存率の定量化により、抗体誘導性細胞傷害の程度を測定した。ルシファー化ＢＸＰＣ３ヒト膵臓がん細胞株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を３７℃、５％ＣＯ２で１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）培地において培養した。細胞生存率をＶｉ－ＣＥＬＬ自動セルカウンターで監視した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）。標的細胞の表面発現をフローサイトメトリーにより測定した。ヒト膵臓がん細胞であるＢＸＰＣ３細胞をヒト汎Ｔ細胞と５：１のエフェクター／標的（Ｅ：Ｔ）比で共培養し、抗体を５倍希釈系列（０－３０ｎＭ）で添加した。Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐバルク液体ディスペンサー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用い、標的細胞を５００細胞／ウェル（２０μＬ／ウェル）、Ｔ細胞を２５００細胞／ウェル（２０μＬ／ウェル）でポリスチレンＴＣ処理マイクロプレート（３８４ウェル、白色、平底）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に順次接種した。抗体希釈物を添加し（１０μＬ／ウェル）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、発光に基づく細胞生存率を定量化した。２０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて腫瘍細胞の生存率に対応する発光を測定した。

【0121】

データをシグモイド関数にフィッテイングして計算し、比較のために表１にＥＣ５０値を示した。図３は、ペンタｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｐ６）、テトラｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｅ２）、トリｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｘ３）、バイｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｘ２）、及びモノｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｏ２）分子から選択されるｍｉｎｉＧＮＣ抗体の用量依存細胞生存率曲線を示す。すべての多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、ＢＸＰＣ３細胞を完全に死滅できる一方、ペンタ及びテトラｍｉｎｉＧＮＣ抗体の両方は、ｐＭレベルのＥＣ５０範囲で高い効力を着実に示した。この点で、ＳＩ－７５Ｘ１は非常に強力であった。このデータは、ＢＸＰＣ３がん細胞を標的とする場合、部分１結合ドメイン、特にαＰＤ－Ｌ１ドメインが免疫チェックポイント阻害剤として重要な役割を果たすことを示している。

【0122】

実施例６：ｍｉｎｉＧＮＣ抗体におけるＣＤ３結合ドメインの構成

【0123】

定義により、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、それぞれその部分１及び２結合ドメインの結合を介して、少なくとも１つの免疫エフェクター細胞及び１つの標的癌細胞と相互作用することができる。ｍｉｎｉＧＮＣ抗体構成の一般的なスキーム（図１）により、２つの部分２結合ドメインをＤ１とＤ２に割り当てる場合、有効性はそれらをＤ１とＤ４又はＤ２とＤ５に割り当てる場合と異なる可能性があり、これは、細胞表面における標的の相対位置が上下又は両側で異なるためである。そこで、第２グループのペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体を構成して表２に示した。このグループのｍｉｎＧＮＣ抗体は、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、４－１ＢＢ及びＰＤ－Ｌ１ に対して同じ結合特異性を有し、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５に同じ結合ドメインを有する。ＳＩ－６８Ｐ１３（配列番号６９，７１）は、αＣＤ３ Ｄ３ドメインを有し、Ｄ２の違い（即ち、αＣＤ１９ｖｓ．αＨＥＲ３）以外、第１グループのＳＩ－７５Ｐ３と同様であるとともに、αＣＤ３ドメインの位置がＤ１に変更された以外、第２グループのＳＩ－６８Ｐ１７（配列番号７３，７５）と同様である。第２グループの残りのｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、Ｄ１（αＣＤ３）及びＤ３（αＥＧＦＲ）と同じ結合特異性を有する。ＳＩ－６８Ｐ１７は、ＣＤ１９、４－１ＢＢ及びＰＤ－Ｌ１のそれぞれに対して結合特異性を有する。

【0124】

抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞活性化に基づく免疫療法において中心的な役割を果たす。治療用抗体の開発にはヒト化抗体が望ましい。位置効果を試験するために、ＣＤ３ドメインを位置Ｄ１及びＤ３に組み込んで、ＳＩ－６８Ｐ１７（配列番号７３、７５）及びＳＩ－６８Ｐ１３（配列番号６９、７１）を生成した。ヒト化フレームワークの抗ＣＤ３配列１（ＣＤ３＊＊）、２（ＣＤ３＊＊＊）、３（ＣＤ＊＊＊＊）及び４（ＣＤ＊＊＊＊＊）を発現カセットにクローニングしてＳＩ－６８Ｐ１５（配列番号７７，７９）、ＳＩ－６８Ｐ１８（配列番号８１，８３）、ＳＩ－６８Ｐ１９（配列番号８５，８７）及びＳＩ－６８Ｐ１６（配列番号８９，９１）を生成した（表２）。各発現カセットを２５ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯにトランスフェクトし、８日間発現させた後、各ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体を回収及び精製するためにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを行った。抗体は良好な力価で産生された（表２）。Ｏｃｔｅｔにより、異なるＣＤ３ドメインを含むペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体がそれぞれヒトＣＤ３に結合できることを確認した（表２）。各ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体を、ＡＨＣセンサーを介して１０μｇ／ｍｌでロードし、連続希釈（最大２００ｎＭ、１：２．５希釈）又は単一の１００ｎＭ濃度のＨｉｓタグ付きヒトＣＤ３に結合した。得られた１：１結合モデルに対するグローバルフィットは、ペンタＧＮＣ抗体が低ナノモル範囲の親和性でＣＤ３に結合することを示した（表２）。

【0125】

がん細胞に対するＣＤ３媒介性Ｔ細胞指向性細胞毒性の効果を評価するために、ＢＸＰＣ３腫瘍細胞株を標的として使用した。抗体の段階希釈物（０～３０ｎＭ；１～５希釈係数）をルシフェリア化標的細胞及び活性化Ｔ細胞（薬物の直前に接種；エフェクター：標的＝５：１）を含む白色３８４ウェルプレートに総量５０μｌで添加した。さらに７２時間後、２０ｕｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、ルシファー化腫瘍細胞の生存率に対応する発光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて決定した。データをシグモイド関数にフィッテイングしてＥＣ５０値を計算した結果、図４及び表２に示すように、０．１～５．５ｐＭの範囲であった。このデータは、抗ＣＤ３の配置、構成及び結合親和性にある程度の柔軟性があることを示している。

【0126】

実施例７：ＶＨＨを結合ドメインとして有する多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体

【0127】

複数のｓｃＦｖドメインを含むＧＮＣ及びｍｉｎｉＧＮＣ抗体などの多重特異性抗体プラットフォームでは、同じ分子内の複数のＶＨ及びＶＬドメインによる鎖のミスペアリングに関連する潜在的な問題がある。異なるＶＨドメインとＶＬドメインは、互いに相互作用する傾向が異なる。異なる特異性の結合ドメインが優れた相互作用エネルギーを有する場合、タンパク質が集合するときに間違ったペアリングが形成される可能性がある。その結果、どの結合ドメインも標的抗原に結合しない。

【0128】

ＶＨＨは、単一のＩｇドメインを有する「抗体」、即ち、「重鎖のみ」を指し、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はナノボディとしても知られている。第１単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見られる重鎖抗体からエンジニアリングされ、Ｖ_ＨＨ断片（ＶＨＨ）としても知られている。ＶＨＨドメインは、いくつかの好ましい特性により、抗体に基づく治療法にますます組み込まれている。ＶＨＨドメインは、より伝統的に使用されているｓｃＦｖドメインと比較して、安定性と溶解性が向上した。従来の抗体可変領域のＶＨ／ＶＬ界面は疎水性であるが、それらの表面が一時的に露出すると、著しい凝集又は沈殿が生じる可能性がある。一方、ＶＨＨドメインは本来より親水性の高い表面を有するため、優れた溶解性と安定性を有する。Ｆａｂ又はｓｃＦｖドメインと比較して、ＶＨＨドメインの明らかな利点は、サイズが小さいことである。Ｆａｂドメインは約５０ｋＤａ、ｓｃＦｖドメインは約２５ｋＤａであるのに対し、ＶＨＨドメインは非常にコンパクトな１２～１５ｋＤａである。ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、５つの結合ドメインを含む（図１）。ｓｃＦｖドメインの代わりにＶＨＨドメインを組み込むことにより、分子サイズが大幅に減少し、腫瘍への浸透が増加する。

【0129】

第３グループの多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対するＶＨＨ結合ドメインを有するように作成及び構成された（Ｇｏｔｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｅｌｉｓｅｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１８）（表３）。五重、三重及び二重特異性単一ドメイン可変領域（ＶＨＨ）が組み込まれたｍｉｎｉＧＮＣ分子は、合理的な力価で構築及び精製された。各多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－７５Ｐ５（配列番号９３，９５）、ＳＩ－７５Ｐ８（配列番号９７，９９）、ＳＩ－７５Ｘ４（配列番号１０１，１０３）、ＳＩ－７５Ｘ１７（配列番号１０５，１０７）、ＳＩ－７５Ｘ１９（配列番号１０９，１１１）、ＳＩ－７５Ｘ９（配列番号１１３－１１５）、ＳＩ－７５Ｘ１１（配列番号１１７，１１９）、ＳＩ－７５Ｘ１５（配列番号１２１，１２３）及びＳＩ－７５Ｘ１３（配列番号１２５，１２７）のドメインの結合活性は、Ｏｃｔｅｔにより確定された。ＡＨＣセンサーを用いてＧＮＣ抗体を１０ｕｇ／ｍｌの濃度で１８０秒間捕捉した。６０秒のベースラインステップの後、単一濃度の抗原を用いて１８０秒の結合ステップを実施した。被験抗原は、２００ｎＭのヒトＥＧＦＲ（自社精製）、１００ｎＭのヒトＣＤ３（Ａｃｒｏ ＣＤＤ－Ｈ５２Ｗ１）、２０ｎＭのヒトＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ ＰＤ１－Ｈ５２２９）、４００ｎＭのヒト４－１ＢＢ（自社精製）、２００ｎＭのヒトＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）を含む。結合後、４２０秒の解離ステップを行った。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン１１）の１対１結合モデルを用いてＫＤ値を計算して表に示した。データは、ＶＨＨが組み込まれたｍｉｎｉＧＮＣプラットフォームにおいてすべてのドメインが高い親和性を保持することを示している。

【0130】

がん細胞であるＢＸＰＣ３腫瘍細胞株を標的として用いてＴ細胞指向性細胞傷害性を評価した。抗体の段階希釈物（０～３０ｎＭ；１～５希釈係数）をルシフェリア化標的細胞及び活性化Ｔ細胞（薬物の直前に接種；エフェクター：標的＝５：１）を含む白色３８４ウェルプレートに総量５０μｌで添加した。さらに７２時間後、２０ｕｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、ルシファー化腫瘍細胞の生存率に対応する発光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて決定した。ＥＣ５０値を表３に示した。

【0131】

実施例８：発現とタンパク質の品質を改善するためにエンジニアリングされたＦａｂ（Ｄ３）ドメイン

【0132】

必要に応じて、ｆａｂ領域のＶＨ－ＶＬ界面にジスルフィドステープルを導入した（図５）。このエンジニアリングの目的は、コア－ｆａｂ界面で共有ジスルフィド結合を形成することによりヘテロ二量体のペアリングを改善し、全体の構造を安定化することであった（Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。システインペアを任意に導入して、鎖ＢのＶＬＡ１００及び鎖Ａのｆａｂ領域の対応ＶＨＡ４４でジスルフィド結合を形成した。

【0133】

Ｆａｂにおけるステープル化された可変領域の効果を分析するために、同一の結合特異性を有する一対のペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体（ＳＩ－３８Ｐ１１及びＳＩ－７６ＰＭ１）（配列番号１２９及び１３１；１３３及び１３５）を作成した。図１の命名システムによれば、この２つの抗体の鎖Ａは、Ｄ１にαＣＤ２０ ｓｃＦｖ、Ｄ３にαＣＤ３ ＶＨ（ＶＨ Ｆａｂ－ＣＨ１－Ｆｃ）、Ｄ４にα４－１ＢＢを有する一方、鎖Ｂは、Ｄ２にαＣＤ１９、Ｄ３にαＣＤ３Ｖ_Ｌ（ＶＫａｐｐａ Ｆａｂ ＣＬ－Ｆｃ）、Ｄ５にαＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含む（表４）。ＳＩ－７６ＰＭ１は、Ｄ３（ＶＨ／ＶＬ Ｆａｂ－ＣＨ１／ＣＬ－Ｆｃ）にジスルフィドを追加して構築され、ＳＩ－３８Ｐ１１は、ＶＨ／ＶＬ Ｆａｂに追加のジスルフィドペアリングなしで構築された。

【0134】

Ｄ３位にジスルフィドステープルを含むか又は含まないペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体構築物をＥｘｐｉＣＨＯシステムで発現させた。ステープル化Ｄ３を有する構築物（ＳＩ－７６ＰＭ１）はＳＩ－３８Ｐ１１よりも顕著に高い力価で生成された。両方のタンパク質を５ｍＬ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムで精製した後、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔ又はＡｋｔａ Ｐｕｒｅ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステムで高負荷１６／６００ ２００ｐｇ分取ＳＥＣカラムを用いてサイズ排除を行った。多角度光散乱（ＭＡＬＳ、Ｗｙａｔｔシステム）に接続されたウォーターズＨＰＬＣを用いてＳＥＣ凝集体を分析し、ｄｎ／ｄｃ計算方法により正しい分子量を特定した。表４に示すようにすべての分析を実施した結果、ジスルフィド結合、即ち、「Ｄ３ステープル化Ｆａｂ」、ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体は、５％高い目的タンパク質の産生を示した。両方の分子は、同等の抗原結合動態を示した（表４）。

【0135】

実施例９：ステープル化ｓｃＦｖ結合ドメインを有する多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ抗体

【0136】

多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ分子のコア構造は、ヘテロ二量体を安定化するためのいくつかの特徴（共有結合したヒンジ、及びＦｃ領域のＣＨ３ドメインによる非共有的で優先的な「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」の相互作用）を獲得するように設計された。安定性とコンパクトさは望ましいものであるが、Ｄ１とＤ２又はＤ３とＤ４がより近接することが、それらの安定性及び独立した機能に影響を与えるかどうかはまだ不明である。それぞれの追加した結合ドメインの安定性及び独立性を保持するために、各ｓｃＦｖドメインのＶＬ１００とＶＨ４４にジスルフィド結合を導入し、つまり、各ｓｃＦｖドメインをステープル化することができる。ＶＬとＶＨの間のジスルフィド結合をすべてのｓｃＦｖドメインに用いて構造全体を安定化することができる。或いは、選択された少なくとも１つのｓｃＦｖドメインの任意の位置にジスルフィド結合を導入することができる。

【0137】

ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を標的とするＤ１及びＤ２を有する４つのｍｉｎｉＧＮＣ抗体（トリｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８Ｘ２，配列番号１３７，１３９）、テトラｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８Ｅ１，配列番号１４１，１４３；ＳＩ－６８Ｅ２，配列番号１４５，１４７）及びペンタｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－６８Ｐ１，配列番号１４９，１５１）分子を含む）は、膵臓がん細胞（ＨＰＡＦ－ＩＩ）に対するＴＤＣＣの比較効力を測定するためにグループ化された。４－１ＢＢ及びＰＤ－Ｌ１に対する部分１の結合特異性は変化であったが、ＣＤ３は多重特異性に関してグループ内のＤ３と同様に一定であった。これら４つのｍｉｎｉＧＮＣ抗体のそれぞれをコードする発現構築物は、すべてのｓｃＦｖドメインがジスルフィド結合を有するように修飾された。構造体をＥｘｐｉＣＨＯシステムで個別に発現させ、各抗体を適切な力価で精製した。それぞれの抗原への結合動態をＯｃｔｅｔにより確定した。ＡＨＣセンサーを用いてｍｉｎｉＧＮＣ抗体を１０ｕｇ／ｍｌの濃度で１８０秒間捕捉した。６０秒のベースラインステップの後、単一濃度の抗原を用いて１８０秒の結合ステップを行った。被験抗原は、２００ｎＭのヒトＥＧＦＲ（自社精製）、１００ｎＭのヒトＣＤ３（Ａｃｒｏ ＣＤＤ－Ｈ５２Ｗ１）、２０ｎＭのヒトＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ ＰＤ１－Ｈ５２２９）、４００のヒト４－１ＢＢ（自社精製）、２００ｎＭのヒトＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）を含む。結合した後、４２０秒の解離ステップを行った。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン１１）の１対１結合モデルを用いてＫＤ値を計算して表に示した。すべてステープル化されたｓｃＦｖドメインを有する各ｍｉｎｉＧＮＣ分子の分析されたＫＤ値（表５）をそれぞれの抗原に対するモノクローナル抗体対照のＫＤ（表６）と比較した。結合動態データは、各ステープル化ｓｃＦｖドメインがそれぞれのｍＡｂ又はＦｃ－ｓｃＦｖ対照（ＳＩ－１Ｃ３（配列番号１８１，１８３）、ＳＩ－１Ｃ７（配列番号１８５）、ＳＩ－９Ｃ２１（配列番号１８７，１８９）、ＳＩ－３５ＳＦ１１（配列番号１９１）、ＳＩ－３ＳＦ１１（配列番号１９３）、ＳＩ－２０Ｃ１４（配列番号２８７及び２８９））と同等の結合親和性を有することを示している（表６）。これは、１つ又は複数のｓｃＦｖドメインをステープル化しても、結合親和性にはほとんど影響を与えないことを示唆している。

【0138】

ｍｉｎｉＧＮＣ抗体の効力に対するステープル化ｓｃＦｖドメインの効果を評価するために、Ｔ細胞指向性細胞毒傷害（ＴＤＣＣ）アッセイを使用し、標的細胞はＨＰＡＦ－ＩＩ、ヒト膵臓がん細胞系であった（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。標的細胞の表面発現は、フローサイトメトリーによって検証された。抗体の段階希釈物（０～３０ｎＭ；１～５希釈係数）をルシフェリア化標的細胞及び活性化Ｔ細胞（薬物の直前に接種；エフェクター：標的＝５：１）を含む白色３８４ウェルプレートに総量５０μＬで添加した。さらに７２時間後、２０ｕｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、ルシファー化腫瘍細胞の生存率に対応する発光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて決定した。データをシグモイド関数にフィッテイングしてＥＣ５０値を計算した。図６及び表５に示すように、生存曲線は、４つのｍｉｎｉＧＮＣ抗体の効力が全てｐＭの用量範囲内にあり、ペンタｍｉｎｉＧＮＣ抗体がテトラｍｉｎｉＧＮＣ及びトリｍｉｎｉＧＮＣ抗体よりも高いＴＤＣＣ効力を発揮する傾向があることを明らかにした。この観察も、ステープル化ｓｃＦｖドメインの使用がほとんど影響を与えないことを示している。

【0139】

実施例１０：ＮＫＧ２Ｄ受容体二量体を結合ドメインとして有するｍｉｎｉＧＮＣ

【0140】

結合特異性の数の増加により、ＧＮＣ抗体はＴ細胞だけでなく、Ｔ細胞のサブセット、ナチュラルキラー細胞、その他の免疫細胞（部分１結合ドメイン特異性として総称される）にも結合することができる（出願人の出願ＷＯ／２０１９／００５６４１及びＷＯ２０１９１９１１２０；その全体が本明細書に組み込まれる）。部分１の結合特異性の一部は、標的細胞に対する細胞応答又は認識に取って代わる可能性がある。例えば、ＮＫＧ２Ｄは、形質転換細胞及び感染細胞を検出及び除去するための主な認識受容体であり、そのリガンドは、ウイルス感染又はゲノムストレス（例えば、がん）の結果として、細胞ストレス中で誘導される。ヒトでは、ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞で発現される。ｍｉｎｉＧＮＣ抗体のクラスへの結合ドメイン／特異性としてのＮＫＧ２Ｄの追加は、単一の多機能治療薬としての抗体の細胞毒性及び有効性を改善することができる。

【0141】

ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄは活性化受容体として機能し、それ自体が細胞毒性を引き起こすことができる一方、ＣＤ８^＋Ｔ細胞では、ＮＫＧ２Ｄの機能は共刺激シグナルを送ってそれらを活性化することである。ＮＫＧ２Ｄは、ホモ二量体を形成し、その外部ドメインはリガンド結合に役立つ。この機能は、ＮＫＧ２ＤをｍｉｎｉＧＮＣフォーマットの非可変配列に基づく結合ドメインとして認定し、他の結合ドメインを追加して多重特異性ＮＫＧ２Ｄ－ｍｉｎｉＧＮＣタンパク質のクラスを作成することができる。１つのｍｉｎｉＧＮＣフォーマットにおいて、１つのｍｉｎｉＧＮＣフォーマットにおいて、個々のＮＫＧ２Ｄ単量体は、鎖Ａ及び鎖ＢのＤ３位置に組み込まれ、Ｆｃ二量体化で二量体ＮＫＧ２Ｄ受容体を形成した。したがって、ＮＫＧ２Ｄは、多重特異性ｍｉｎｉＧＮＣ分子がそのリガンドに結合するための受容体として機能する。別のｍｉｎｉＧＮＣフォーマットにおいて、ＮＫＧ２Ｄタンデムリピートは、ホモ二量体化して機能的な二量体受容体を形成する個々のＮＫＧ２Ｄ単量体間に（ＧｘＳｙ）ｎスペーサー／リンカーを追加することによって設計された。このＮＫＧ２Ｄタンデム二量体構造は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ４又はＤ５に配置することができる。

【0142】

表７に示すように、このクラスは、モノＮＫＧ２Ｄ－ｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｒ２６、配列番号１５３、１５５）、バイｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｒ２７、配列番号１５７、１５９）、トリｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｒ２５、配列番号１６１、１６３）、テトラｍｉｎｉＧＮＣ（ＳＩ－４９Ｐ＿Ｘ、配列番号１６５、１６７）、及びペンタｍｉｎｉ－ＧＮＣ分子（ＳＩ４９Ｐ８、ＳＩ－４９Ｐ９、配列番号１６９、１７１、１７７及び１７９）を含む。ＳＩ－４９ＰＭ１（配列番号１７３、１７５）は、ＳＩ－４９Ｐ８のＤ１（αＣＤ３）及びＤ３の位置を置換することによって作成され、ＮＫＧ２Ｄ又はＣＤ３のＯｃｔｅｔ結合親和性は、この置換によって影響されなかった。他の部分１結合ドメインの結合親和性はこのクラスのＮＫＧ２Ｄ－ｍｉｎｉＧＮＣ分子において安定したままであったが、ＮＫＧ２Ｄ の結合親和性は２ 倍以内であった。したがって、ペンタｍｉｎｉＧＮＣ分子は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合するためのＮＫＧ２Ｄ受容体の結合機能を有する。

【0143】

ＮＫＧ２Ｄ－ｍｉｎｉＧＮＣ分子、トリ、テトラ及びペンタｍｉｎｉＧＮＣ分子のＴＤＣＣの効力を評価及び比較するために、ＳＩ－４９Ｒ２５、ＳＩ－４９Ｐ＿Ｘ、ＳＩ－４９Ｐ８及びＳＩ－４９ＰＭ１を用いてＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞株を標的とした。ｍｉｎｉＧＮＣタンパク質の段階希釈物（０～３０ｎＭ、１～５希釈係数）を、ルシフェリア化ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を含む白色の３８４ウェルプレートに２４時間前に添加し、３７℃で増殖させた。活性化Ｔ細胞をｍｉｎｉＧＮＣ分子（エフェクター：標的＝１５：１）の直前に総量５０μｌで接種した。さらに７２時間インキュベートした後、２０ｕｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、ルシファー化腫瘍細胞の生存率に対応する発光を、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて決定した。データをシグモイド関数にフィッテイングしてＥＣ５０値を計算した（図７）。用量生存率曲線によれば、２つのグループがあり、テトラ及びペンタｍｉｎｉＧＮＣ分子は、トリｍｉｎｉＧＮＣ分子であるＳＩ－４９Ｒ２５よりも強力であった。表７に示すように、この違いは、αＰＤ－Ｌ１の追加による可能性がある。しかし、ＳＩ－４９Ｒ２５のＥＣ５０値（５９．３ｎＭ）は、比較的強力であると考えるべきである。乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１にとって、汎Ｂ細胞マーカーであるＣＤ１９は非関与腫瘍抗原である。この点に関して、ＳＩ－４９Ｒ２５は、ＣＤ３及びＮＫＧ２Ｄリガンドに対する２つの結合特異性を有するとみなすことができる。したがって、このデータは、様々なｍｉｎｉＧＮＣ抗体形式へのＮＫＧ２Ｄ受容体の組み込みがＴＤＣＣの効力に寄与することを示している。より広い意味では、ｍｉｎｉＧＮＣ抗体分子は複数の結合特異性に対応して、がんなどの標的細胞に対して最適化の免疫応答を調節、協力及びダイレクトすることができる。

【0144】

【表1】

【0145】

【表2】

【0146】

【表3】

【0147】

【表4】

【0148】

【表5】

【0149】

【表6】

【0150】

【表7】

【0151】

【表8】

【0152】

【表9】

【0153】

配列表

>Sequence ID 1: SI-75X5 Chain A Amino Acid Sequence
QVQLQESGGRLVQPGEPLSLTCKTSGIDLSSNAIGWVRQAPGKGLEWIGVIFGSGNTYYASWAKGRFTISRSTSTVYLKMNSLRSEDTAIYYCARGGYSSDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

>Sequence ID 2: SI-75X5 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 3: SI-75X5 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 4: SI-75X5 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 5: SI-75X6 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 6: SI-75X6 Chain A Nucleotide Sequence
CAAGTGCAGTTGCAAGAAAGTGGTGGTAGACTGGTTCAGCCTGGTGAACCCTTGTCACTGACGTGTAAAACAAGCGGCATTGATCTGTCCTCTAACGCCATCGGATGGGTCCGACAGGCCCCAGGAAAAGGTCTGGAGTGGATCGGAGTTATCTTCGGGAGCGGCAATACATACTACGCAAGCTGGGCAAAAGGGCGATTTACGATATCACGGAGCACCTCTACAGTTTATTTGAAAATGAACTCCCTCCGGTCCGAGGATACCGCGATATATTACTGTGCCAGAGGGGGGTACTCCTCTGATATCTGGGGGCAGGGTACACTGGTTACAGTTTCATCCGCTAGCACCAAAGGCCCCTCTGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGAGGCACTGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCTGTGACTGTGTCCTGGAACTCTGGAGCCCTGACCTCTGGAGTGCACACCTTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCTGGCCTCTACAGCCTGTCCTCTGTGGTCACTGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGTCCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCAGCCCCAGAGGCTGCTGGAGGCCCCTCTGTGTTCCTCTTCCCTCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCAGAAGTCACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCATGAAGACCCAGAAGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGATGGAGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGAGAAGAGCAGTACAACTCCACCTACCGAGTGGTGTCTGTGCTGACTGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGGAAGGAGTACAAGTGTGCTGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATTGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTCTACACCCTGCCTCCCTCCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGTGCTGTGAAAGGCTTCTACCCCAGTGACATTGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCCTTCTTCCTGGTCTCCAAGCTGACTGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAATGTGTTCTCCTGCTCTGTCATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCTGGA

>Sequence ID 7: SI-75X6 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 8: SI-75X6 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 9: SI-75X7 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 10: SI-75X7 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 11: SI-75X7 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 12: SI-75X7 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 13: SI-75X8 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 14: SI-75X8 Chain A Nucleotide Acid Sequence
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>Sequence ID 15: SI-75X8 Chain B Amino Acid Sequence

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>Sequence ID 16: SI-75X8 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 18: SI-75P6 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 19: SI-75P6 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 20: SI-75P6 Chain B Nucleotide Sequence CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCACAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGCCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCAGAAATCGTCCTTACACAATCTCCTAGCACACTGAGTGTGAGCCCCGGCGAACGCGCGACTTTCTCTTGCAGGGCAAGTCAATCCATAGGGACTAATATACATTGGTATCAACAAAAGCCAGGTAAACCACCCAGGCTTTTGATTAAGTATGCAAGTGAGTCTATTTCCGGTATCCCTGACCGCTTCTCTGGATCAGGCAGTGGCACAGAGTTCACACTCACCATATCTAGTGTGCAATCAGAGGACTTCGCCGTGTATTACTGCCAACAGAATAATAACTGGCCGACTACCTTCGGACCCGGTACAAAGCTGACCGTTTTACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAAGCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACAGATTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGACATTCAGATGACACAGTCACCGTCTACGCTCTCAGCCTCAGTAGGCGATAGGGTGACTATCACCTGCCAAGCCTCCCAATCTATAAGTTCACACCTCAACTGGTATCAACAGAAACCCGGTAAAGCACCGAAGCTGCTCATCTACAAGGCATCAACTCTTGCCTCAGGTGTGCCTAGTCGCTTCTCCGGGAGCGGCTCCGGTACTGAGTTTACTTTGACGATATCTTCCCTCCAACCCGACGACTTCGCCACATACTATTGTCAGCAGGGTTATAGTTGGGGAAATGTTGACAATGTGTTTGGAGGGGGAACGAAAGTGACTGTGTTGGGAGGGGGAGGAAGTGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGTGGCTCCGGCGGGGGTGGAAGCGAAGTGCAATTGCTCGAAAGTGGTGGCGGACTTGTGCAACCTGGTGGAAGCCTCTCACTCTCTTGCGCGGCGAGTGGTTTTAGCTTCAGTAGCGGCTACGATATGTGCTGGGTAAGACAGGCTCCTGGTAAAGGCCTTGAGTGGATTGCGTGTATCGCCGCCGGGTCTGCTGGTATAACATACGATGCAAACTGGGCGAAAGGGCGCTTCACAATCTCCAGGGACAACTCAAAAAATACATTGTACCTCCAGATGAATAGCCTGAGAGCCGAAGACACCGCAGTCTACTATTGCGCAAGGTCAGCATTTAGCTTCGATTATGCAATGGATCTTTGGGGCCAGGGGACGCTCGTCACCGTCTCATCTTGA
>Sequence ID 21: SI-75P4 Chain A Amino Acid Sequence

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>Sequence ID 22: SI-75P4 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 29: SI-75P9 Chain A Amino Acid Sequence
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Sequence ID 30: SI-75P9 Chain A Nucleotide GAAATCGTCCTTACACAATCTCCTAGCACACTGAGTGTGAGCCCCGGCGAACGCGCGACTTTCTCTTGCAGGGCAAGTCAATCCATAGGGACTAATATACATTGGTATCAACAAAAGCCAGGTAAACCACCCAGGCTTTTGATTAAGTATGCAAGTGAGTCTATTTCCGGTATCCCTGACCGCTTCTCTGGATCAGGCAGTGGCACAGAGTTCACACTCACCATATCTAGTGTGCAATCAGAGGACTTCGCCGTGTATTACTGCCAACAGAATAATAACTGGCCGACTACCTTCGGACCCGGTACAAAGCTGACCGTTTTAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCACAAGTACAGTTGCAGCAATCCGGTCCCGGTCTCGTCAAACCGAGTGAGACGCTTAGTATAACGTGTACTGTTTCAGGCTTTAGCCTTACGAACTATGGAGTTCACTGGATTCGGCAGGCACCCGGCAAAGGTTTGGAATGGCTGGGTGTTATTTGGTCAGGTGGAAATACAGACTATAACACCCCCTTTACAAGTCGGTTCACAATTACGAAAGATAATTCCAAAAATCAAGTTTATTTCAAGTTGAGATCCGTCCGCGCGGACGACACTGCGATCTACTATTGTGCGAGGGCACTGACCTACTACGATTACGAATTTGCGTATTGGGGGCAAGGGACTCTTGTAACAGTCTCGAGCGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCACAGGTGCAGCTGCAGGAGAGTGGAGGAGGCCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCCTACTGGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAACATCAACAGAGATGGCTCTGCCTCCTACTATGTGGACTCTGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGATGATGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACAGCTGTGTACTACTGTGCCAGAGACCGAGGTGTGGGCTACTTTGACCTGTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACTGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGCGCCGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGTGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGCGGCGGTTCAGGTGGTGGGGGATCCGACGTTGTGATGACGCAGTCTCCTAGTTCAGTATCAGCGTCTGTTGGGGATCGAGTCACGATTACATGCCAGGCGAGCCAAAATATTAGGACGTATCTGTCTTGGTATCAACAAAAGCCTGGTAAGGCTCCAAAACTCCTCATTTACGCCGCTGCCAACTTGGCTAGTGGAGTACCTTCACGCTTTAGTGGGTCAGGTTCTGGAACAGATTTTACGTTGACGATCTCCGATTTGGAACCAGGGGACGCTGCCACGTATTATTGCCAGTCCACCTACCTCGGGACTGACTACGTTGGTGGGGCGTTTGGCGGAGGAACAAAACTCACTGTACTTGGTGGTGGTGGTTCAGGCGGGGGGGGTTCCGGCGGAGGCGGTTCTGGGGGTGGAGGTTCCGAGGTTCAGTTGGTTGAAAGTGGGGGGGGACTCGTTCAGCCTGGAGGCTCTTTGCGACTTTCTTGTACCGCTTCTGGGTTCACTATAAGTTCATATCATATGCAATGGGTAAGACAGGCGCCTGGTAAGGGACTTGAATACATAGGAACAATAAGCTCTGGTGGTAACGTCTATTACGCCTCATCCGCGCGGGGGAGGTTTACAATTTCCAGGCCTTCTAGCAAAAACACGGTAGATCTGCAAATGAACTCTCTTCGCGCTGAAGATACAGCAGTCTACTACTGCGCCAGGGATTCAGGGTATTCTGACCCCATGTGGGGGCAGGGCACATTGGTTACCGTGTCCTCTTGA
>Sequence ID 31: SI-75P9 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 32: SI-75P9 Chain B Nucleotide Sequence

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>Sequence ID 33: SI-75E1 Chain A Amino Acid Sequence

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>Sequence ID 34: SI-75E1 Chain A Nucleotide Sequence

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>Sequence ID 35: SI-75E1 Chain B Amino Acid Sequence

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>Sequence ID 36: SI-75E1 Chain B Nucleotide Sequence

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>Sequence ID 38: SI-75E2 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 39: SI-75E2 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 51: SI-75X18 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 52: SI-75X18 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 53: SI-75X1 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 54: SI-75X1 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 55: SI-75X1 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 58: SI-75X2 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 63: SI-75O2 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 64: SI-75O2 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 65: SI-75O7 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 66: SI-75O7 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 67: SI-75O7 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 68: SI-75O7 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 69: SI-68P13 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 70: SI-68P13 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 71: SI-68P13 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 72: SI-68P13 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 75: SI-68P17 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 76: SI-68P17 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 77: SI-68P15 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 78: SI-68P15 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 79: SI-68P15 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 80: SI-68P15 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 81: SI-68P18 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 82: SI-68P18 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 83: SI-68P18 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 84: SI-68P18 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 85: SI-68P19 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 86: SI-68P19 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 87: SI-68P19 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 88: SI-68P19 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 92: SI-68P16 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 94: SI-75P5 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 96: SI-75P5 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 98: SI-75P8 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 100: SI-75P8 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 101: SI-75X4 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 102: SI-75X4 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 118: SI-75X11 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 129: SI-38P11 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 130: SI-38P11 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 131: SI-38P11 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 134: SI-76PM1 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 139: SI-68X2 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 140: SI-68X2 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 141: SI-68E1 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 142: SI-68E1 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 148: SI-68E2 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 149: SI-68P1 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 150: SI-68P1 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 152: SI-68P1 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 158: SI-49R27 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 160: SI-49R27 Chain B Nucleotide Sequences
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>Sequence ID 164: SI-49R25 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 169: SI-49P8 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 177: SI-49P9 Chain A Amino Acid
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>Sequence ID 178: SI-49P9 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 179: SI-49P9 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 180: SI-49P9 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 181: SI-1C3 Heavy Chain Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 182: SI-1C3 Heavy Chain Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 183: SI-1C3 Light Chain Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 184: SI-1C3 Light Chain Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 185: SI-1C7 Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 186: SI-1C7 Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 187: SI-9C21 Heavy Chain Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 188: SI-9C21 Heavy Chain Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 189: SI-9C21 Light Chain Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 190: SI-9C21 Light Chain Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 191: SI-35FS11 Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 192: SI-35FS11 Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 193: SI-3FS11 Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 194: SI-3FS11 Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 195: SI-68X1 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 196: SI-68X1 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 197: SI-68X1 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 198: SI-68X1 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 199: SI-68X3 Chain A Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 200: SI-68X3 Chain A Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 201: SI-68X3 Chain B Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 202: SI-68X3 Chain B Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 203: αEGFR VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 204: αEGFR VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 205: αEGFR VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 206: αEGFR VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 207: αEGFR* VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 208: αEGFR* VH Nucleotide Sequence
CAAGTGCAACTCCAGGAGAGTGGGCCGGGATTGGTTAAACCGAGCGAGACCCTGAGTCTCACGTGTACAGTTTCAGGCGGGAGCGTGAGCTCAGGCGACTATTACTGGACATGGATAAGACAGAGTCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGATCGGTCATATTTATTATTCAGGGAACACTAACTATAATCCATCTTTGAAATCCCGATTGACAATCTCTATCGATACCAGTAAAACCCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGCGTTACTGCTGCAGACACAGCCATATACTATTGCGTACGCGATCGCGTGACTGGAGCCTTCGACATATGGGGGCAGGGAACGATGGTAACAGTCTCGAGC
>Sequence ID 209: αEGFR* VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 210: αEGFR* VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 211: αEGFR* VH Stapled Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 212: αEGFR* VH Stapled Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 213: αEGFR* VL Stapled Amino Acid Sequence
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGCGTKVEIK
>Sequence ID 214: αEGFR* VL Stapled Nucleotide Sequence
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGCTTTCGGCTGTGGGACCAAGGTGGAAATTAAA
>Sequence ID 215: αCD19 VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 216: αCD19 VH Nucleotide Sequence
CAGGTCACATTGAAGGAATCTGGCCCCGGCCTTGTTCAGCCAGGACAGACCCTTAGCCTCACCTGTGCCTTCAGTGGTTTTTCTCTTAGCACTAGCGGTATGGGGGTCGGCTGGATTCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGTCTTGAGTGGTTGGCTCACATTTGGTGGGACGACGACAAACGGTATAATCCTGCCTTGAAAAGTCGGCTGACCATTAGTAAGGATACCTCAAAAAATCAAGTGTACTTGCAAATGAATAGCCTTGACGCCGAGGATACGGCTGTATATTATTGCGCGCGGATGGAACTCTGGTCTTACTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGGACTCTCGTCACGGTCTCGAGC
>Sequence ID 217: αCD19 VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 218: αCD19 VL Nucleotide Sequence
GAAAATGTATTGACACAGAGCCCCGCCTCCCTCAGTGCCTCACCTGGGGAAAGGGTAACTATCACTTGCTCTGCATCAAGCAGCGTCTCATACATGCATTGGTATCAACAAAAGCCTGGACAGGCCCCCAAGCTCTGGATATACGATACGAGCAAGCTGGCTTCCGGCGTACCTAGCCGCTTCAGTGGTTCCGGCTCAGGCAACGATCACACCCTTACGATTTCCAGTATGGAACCCGAAGATTTTGCAACTTATTATTGTTTCCAGGGGAGCGTGTACCCATTCACTTTCGGGCAGGGGACAAAAGTGACCGTCCTA
>Sequence ID 219: αCD3 VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 220: αCD3 VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 221: αCD3 VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 222: αCD3 VL Nucleotide Sequence
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>Sequence ID 223: αCD3 VH stapled Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 224: αCD3 VH stapled Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 225: αCD3 VL stapled Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 226: αCD3 VL stapled Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 227: αCD3* VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 228: αCD3* VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 229: αCD3* VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 230: αCD3* VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 231: αCD3** VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 232: αCD3** VH Nucleotide Sequence
GAAGTCCAATTGGTAGAAAGTGGCGGTGGTCTGGTGCAACCTGGTGGATCTCTTCGCCTCTCATGCGCCGCTAGTGGCTTTACTATTTCAACTAATGCGATGAGCTGGGTTCGCCAGGCCCCCGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGCGTCATCACCGGCAGGGACATTACATACTATGCGAGTTGGGCAAAGGGCAGGTTCACGATTAGCCGCGATACTTCAAAGAATACCGTTTACCTTCAAATGAATAGCTTGAGGGCGGAAGACACAGCTGTGTATTACTGCGCGAGGGATGGAGGTAGTTCCGCCATAACTTCCAACAACATATGGGGACAAGGCACGCTGGTTACTGTCTCGAGT

>Sequence ID 233: αCD3** VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 234: αCD3** VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 235: αCD3*** VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 236: αCD3*** VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 237: αCD3*** VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 238: αCD3*** VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 239: αCD3**** VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 240: αCD3**** VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 242: αCD3**** VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 243: αPD-L1 VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 244: αPD-L1 VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 245: αPD-L1 VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 246: αPD-L1 VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 247: α4-1BB VH Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 248: α4-1BB VH Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 249: α4-1BB VL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 250: α4-1BB VL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 251: 41BBL Amino Acid Sequence
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>Sequence ID 252: 41BBL Nucleotide Sequence
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>Sequence ID 253: NKG2D dimer Amino Acid Sequence
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
>Sequence ID 254: NKG2D dimer Nucleotide Sequence
TTTCTTAATTCCCTTTTCAACCAAGAGGTTCAGATCCCCTTGACTGAAAGCTATTGCGGCCCTTGTCCGAAAAACTGGATATGTTACAAGAATAATTGTTACCAATTCTTCGACGAAAGCAAGAACTGGTATGAGAGTCAGGCGTCTTGTATGAGTCAGAATGCCAGCCTGCTTAAGGTTTATTCAAAAGAAGACCAGGATCTGCTTAAGTTGGTAAAGAGCTACCACTGGATGGGGCTGGTACATATCCCAACGAATGGGTCATGGCAGTGGGAGGACGGTTCTATTCTGAGTCCAAATCTCCTGACGATCATCGAAATGCAGAAAGGGGACTGTGCCCTGTATGCATCATCCTTCAAGGGGTACATCGAGAACTGCAGTACCCCAAATACCTACATTTGTATGCAAAGAACGGTTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGCGGCTCAGGAGGTGGCGGTTCAGGAGGCGGCGGATCTTTCCTAAACTCATTATTCAACCAAGAAGTTCAAATTCCCTTGACCGAAAGTTACTGTGGCCCATGTCCTAAAAACTGGATATGTTACAAAAATAACTGCTACCAATTTTTTGATGAGAGTAAAAACTGGTATGAGAGCCAGGCTTCTTGTATGTCTCAAAATGCCAGCCTTCTGAAAGTATACAGCAAAGAGGACCAGGATTTACTTAAACTGGTGAAGTCATATCATTGGATGGGACTAGTACACATTCCAACAAATGGATCTTGGCAGTGGGAAGATGGCTCCATTCTCTCACCCAACCTACTAACAATAATTGAAATGCAGAAGGGAGACTGTGCACTCTATGCCTCGAGCTTTAAAGGCTATATAGAAAACTGTTCAACTCCAAATACGTACATCTGCATGCAAAGGACTGTG
>Sequence ID 255: αHER3 VH Amino Acid Sequence
QVQLQESGGGLVKPGGSLSLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSS
>Sequence ID 256: αHER3 VH Nucleotide Sequence
CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGCCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGT
>Sequence ID 257: αHER3 VL Amino Acid Sequence
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVL
>Sequence ID 258: αHER3 VL Nucleotide Sequence
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA
>Sequence ID 259: αCD20 VH Amino Acid Sequence
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSS
>Sequence ID 260: αCD20 VH Nucleotide Sequence
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCCGGCCGGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACCGTCTCGAGC
>Sequence ID 261: αCD20 VL Amino Acid Sequence
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLTVL
>Sequence ID 262: αCD20 VL Nucleotide Sequence
CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCCGCCATCCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGGGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGTGCGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCCGGGTGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTG
>Sequence ID 263: EGFR VHH Amino Acid Sequence
EVQLQESGGGLVQAGDSLSLSCLVSGRSFNSYTMGWFRQAPGKEREFVAAILWSGPTTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAALGVLVLAPGNVYSYWGQGTQVTVSS

>Sequence ID 264: EGFR VHH Nucleotide Sequence
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCGGCGGCCTGGTGCAGGCTGGGGACAGCCTGAGCCTGTCCTGCCTGGTGTCTGGCCGCTCCTTCAACTCCTACACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCTGGGAAGGAGCGGGAGTTTGTGGCTGCCATCCTGTGGAGTGGCCCCACCACCTACTATGCTGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACTGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCAGAGGACACAGCTGTGTACTACTGTGCTGCTGCCCTGGGAGTGCTGGTGCTGGCCCCTGGCAATGTGTACAGCTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACTGTCTCGAGC
>Sequence ID 265: HER3 VHH Amino Acid Sequence
QVQLVQSGGGLVQAGGSLSLSCAFSGRTFSMYTMGWFRQAPGKEREFVAANRGRGLSPDIADSVNGRFTISRDNAKNTLYLQMDSLKPEDTAVYYCAADLQYGSSWPQRSSAEYDYWGQGTTVTVSS
>Sequence ID 266: HER3 VHH Nucleotide Sequence
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGGAGGCCTGGTGCAGGCTGGGGGCAGCCTGAGCCTGAGCTGTGCCTTCTCTGGCCGCACCTTCTCCATGTACACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGAGAGAGTTTGTGGCTGCCAACAGAGGCAGAGGCCTGAGCCCAGACATTGCTGACTCTGTGAATGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGGACAGCCTGAAGCCAGAGGACACAGCTGTGTACTACTGTGCTGCTGACCTGCAGTATGGCAGCAGCTGGCCTCAGAGGAGCTCTGCTGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTGTGACTGTCTCGAGC
>Sequence ID 267: αPD-L1 Stapled VH Amino Acid Sequence
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKCLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSS
>Sequence ID 268: αPD-L1 Stapled VH Nucleotide Sequence
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCT
>Sequence ID 269: αPD-L1 Stapled VL Amino Acid Sequence
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGCGTKVEIK
>Sequence ID 270: αPD-L1 Stapled VL Nucleotide Sequence
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCTGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAATAG
>Sequence ID 271: α4-1BB VH Stapled Amino Acid Sequence
RSLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKCLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSS
>Sequence ID 272: α4-1BB VH Stapled Nucleotide Sequence
CGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGGCAGGCACCTGGGAAGTGCCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCAAGCTCCGCTAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
>Sequence ID 273: α4-1BB VL Stapled Amino Acid Sequence
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGCGTKVEIK
>Sequence ID 274: α4-1BB VL Stapled Nucleotide Sequence
GACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACTTGGAACCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCTGTGGGACCAAGGTGGAGATCAAATGA
>Sequence ID 275: αHer3 VH Stapled Amino Acid Sequence
QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKCLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVST
>Sequence ID 276: αHer3 VH Stapled Nucleotide Sequence
CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGCCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTGTCGACA
>Sequence ID 277: αHer3 VL Stapled Amino Acid Sequence
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGCGTKVTVL
>Sequence ID 278: αHer3 VL Stapled Nucleotide Sequence
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCTGTGGGACCAAGGTGACCGTCCTA
>Sequence ID 279: αCEA 656E11 VH Amino Acid Sequence
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGTQYVCWVRQAPGKGLEWIGCIYVDVANTYYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASHDTVCAGCGLDLWGQGTLVTVSS
>Sequence ID 280: αCEA 656E11 VH Nucleotide Sequence
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCACCCAGTACGTGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATGTGGATGTGGCTAACACTTACTACGCGACCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGTCATGATACTGTTTGTGCTGGTTGTGGTTTGGACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>Sequence ID 281: αCEA 656E11 VL Amino Acid Sequence
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSTYYNNIIYGAAFGGGTKVEIK
>Sequence ID 282: αCEA 656E11 VL Nucleotide Sequence
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAATCTACTTATTATAATAATATCATTTATGGGGCTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>Sequence ID 283: αHER2 VH Amino Acid Sequence
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVST
>Sequence ID 284: αHER2 VH Nucleotide Sequence
GAAGTACAGCTTGTTGAGAGTGGTGGTGGACTTGTCCAACCAGGGGGAAGTCTGCGGCTGTCATGCGCAGCCTCTGGCTTCAACATTAAGGACACCTACATTCACTGGGTTCGGCAAGCGCCGGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCGCCAGGATATACCCTACCAACGGGTACACCAGGTATGCAGATAGCGTTAAGGGTAGATTCACTATTTCAGCTGACACTAGCAAGAACACCGCGTATCTCCAGATGAACTCCCTTCGCGCCGAGGATACGGCTGTGTACTACTGCTCTAGGTGGGGAGGAGATGGGTTTTACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGAACACTCGTTACGGTGTCGACA
>Sequence ID 285: αHER2 VL Amino Acid Sequence
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
>Sequence ID 286: αHER2 VL Nucleotide Sequence
GACATCCAAATGACGCAGTCTCCCTCCAGTTTGAGTGCAAGTGTGGGAGACAGAGTTACGATCACATGTAGGGCAAGTCAGGACGTCAATACAGCCGTCGCATGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCGAAACTTCTGATTTACTCTGCAAGTTTCCTCTACAGTGGTGTTCCTAGTCGCTTCAGTGGGTCTCGGTCAGGCACCGATTTTACCCTGACAATTAGCAGCTTGCAACCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAACATTATACCACCCCTCCCACATTTGGACAAGGCACGAAGGTAGAGATTAAA
>Sequence ID 287: SI-20C14 (anti-CEA 656E11) Heavy Chain Amino Acid Sequence
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSGTQYVCWVRQAPGKGLEWIGCIYVDVANTYYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASHDTVCAGCGLDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>Sequence ID 288: SI-20C14 (anti-CEA 656E11) Heavy Chain Nucleotide Sequence
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCACCCAGTACGTGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATGTGGATGTGGCTAACACTTACTACGCGACCTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGTCATGATACTGTTTGTGCTGGTTGTGGTTTGGACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAA
>Sequence ID 289: SI-20C14 (anti-CEA 656E11) Light Chain Amino Acid Sequence
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSTYYNNIIYGAAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>Sequence ID 290: SI-20C14 (anti-CEA 656E11) Light Chain Nucleotide Sequence
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAATCTACTTATTATAATAATATCATTTATGGGGCTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
>Sequence ID 291: αCD3***** VH Amino Acid Sequence
QQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGIDLSSNAIGWVRQAPGKGLEWVGVIFGSGNTYYASWAKGRFTISRSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYSSDIWGQGTLVTVSS
>Sequence ID 292: αCD3***** VH Nucleotide Sequence
CAACAGTTGGTTGAGTCTGGTGGCGGTCTCGTTAAGCCTGGAGGGTCCCTTCGGCTTAGTTGTGCGGCCTCTGGGATCGACCTGTCTAGCAACGCTATAGGATGGGTACGGCAAGCTCCGGGCAAAGGCCTTGAGTGGGTCGGCGTTATTTTTGGGAGCGGTAATACGTACTACGCCAGCTGGGCAAAAGGTAGGTTCACTATCAGTCGATCAAAGAACACGGTATATCTTCAGATGAACAGTCTCCGGGCGGAGGACACCGCGGTTTATTATTGCGCAAGGGGGGGATACTCCTCAGACATATGGGGCCAAGGTACTTTGGTGACGGTCTCGAGC
>Sequence ID 293: αCD3***** VL Amino Acid Sequence
DPVLTQSPSSLSASVGDRVTISCQSSQSVAKNNNLAWFQQKPGQAPKLLIYSASTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCSARDSGNIQSFGGGTKVEIK
>Sequence ID 294: αCD3***** VL Nucleotide Sequence
GATCCAGTTCTGACACAAAGTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCAGTCGGCGACAGAGTGACCATCAGTTGCCAGAGCTCACAGTCTGTGGCTAAGAACAACAACTTGGCGTGGTTCCAACAGAAACCTGGACAGGCTCCGAAATTGCTGATCTATTCTGCTTCCACGCTTGCTGCTGGTGTTCCTTCCCGCTTTTCAGGTAGTGGTAGCGGGACAGACTTCACTTTGACTATAAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACCTACTATTGTTCTGCTAGAGACAGTGGAAATATTCAGTCCTTTGGGGGGGGAACGAAGGTCGAAATAAAG
>Sequence ID 295: NKG2D Monomer Amino Acid Sequence
FLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
>Sequence ID 296: NKG2D Monomer Nucleotide Sequence
TTTCTGAATAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCACTGACCGAGAGCTATTGTGGACCTTGTCCTAAGAACTGGATCTGTTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAATTGGTATGAAAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAAAACGCCTCTCTGCTGAAGGTGTACTCCAAAGAAGATCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGTCCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCAACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAAGACGGCAGCATCCTGAGCCCTAACCTGCTGACAATCATTGAGATGCAGAAAGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGTTCTTTTAAGGGCTACATCGAAAACTGTAGCACCCCTAACACCTACATCTGCATGCAGAGAACAGTG
>Sequence ID 297: SI-75XM9 chain A amino acid sequence
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>Sequence ID 298: SI-75XM9 chain A nucleotide sequence
CAAGTGCAGTTGCAAGAAAGTGGTGGTAGACTGGTTCAGCCTGGTGAACCCTTGTCACTGACGTGTAAAACAAGCGGCATTGATCTGTCCTCTAACGCCATCGGATGGGTCCGACAGGCCCCAGGAAAAGGTCTGGAGTGGATCGGAGTTATCTTCGGGAGCGGCAATACATACTACGCAAGCTGGGCAAAAGGGCGATTTACGATATCACGGAGCACCTCTACAGTTTATTTGAAAATGAACTCCCTCCGGTCCGAGGATACCGCGATATATTACTGTGCCAGAGGGGGGTACTCCTCTGATATCTGGGGGCAGGGTACACTGGTTACAGTTTCATCCGCTAGCACCAAGGGACCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCTTGCTCCAGATCCACCTCCGAGTCTACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGCGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCTTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCTGGCGGCCCATCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAAGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCAGCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCAAGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTCCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGATGA
>Sequence ID 299: SI-75XM9 chain B amino acid sequence
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>Sequence ID 300: SI-75XM9 chain B nucleotide sequence
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>Sequence ID 301: anti-CEA 656E11 CDR-H1 amino acid sequence
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>Sequence ID 302: anti-CEA 656E11 CDR-H2 amino acid sequence
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>Sequence ID 303: anti-CEA 656E11 CDR-H3 amino acid sequence
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>Sequence ID 304: anti-CEA 656E11 CDR-L1 amino acid sequence
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>Sequence ID 305: anti-CEA 656E11 CDR-L2 amino acid sequence
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>Sequence ID 307: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-H1 amino acid sequence
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>Sequence ID 308: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-H2 amino acid sequence
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>Sequence ID 309: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-H3 amino acid sequence
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>Sequence ID 310: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-L1 amino acid sequence
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>Sequence ID 311: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-L2 amino acid sequence
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>Sequence ID 312: anti-CD3 283E3 (BSM/FRS) CDR-L3 amino acid sequence
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>Sequence ID 313: human IgG1 amino acid sequence
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>Sequence ID 314: human IgG4 amino acid sequence

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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