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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-12
(45)【発行日】2024-06-20
(54)【発明の名称】喉頭癌上皮細胞用の培養培地、培養方法及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20240613BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240613BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20240613BHJP
C07K 14/50 20060101ALN20240613BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20240613BHJP
A61K 31/519 20060101ALN20240613BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12Q1/04
C07K14/62
C07K14/50
C07K14/79
A61K31/519
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022573183
(86)(22)【出願日】2020-07-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 CN2020103428
(87)【国際公開番号】W WO2021237905
(87)【国際公開日】2021-12-02
【審査請求日】2023-01-24
(31)【優先権主張番号】202010454162.8
(32)【優先日】2020-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522460863
【氏名又は名称】中科院合肥技▲術▼▲創▼新工程院
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 青松
(72)【発明者】
【氏名】胡 ▲潔▼
(72)【発明者】
【氏名】任 涛
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／０７３９０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】X. Liu, et al.，The American Journal of Pathology，2012年，Vol.180, No.2，p.599-607
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
喉頭癌上皮細胞を培養するための初代細胞培養培地であって、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤；インスリン様成長因子１；線維芽細胞成長因子７；インスリン－トランスフェリン－セレン複合体；肝細胞成長因子；Ｙ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２の少なくとも１つから選択されるＲＯＣＫキナーゼ阻害剤；並びにＡ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８、ＬＹ３６４９４、及びＳＪＮ２５１１の少なくとも１つから選択されるＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤を含むことを特徴とし、
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリール、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたヘテロアリールから選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、１．２５μＭ～１０μＭであり、
前記インスリン様成長因子１の量が、１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、
前記繊維芽細胞成長因子７の量が、５ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、
前記インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記肝細胞成長因子の量が、１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、
前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量が、１．２５μＭ～２０μＭであり、
前記ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量が、１２５ｎＭ～１０００ｎＭである、
初代細胞培養培地。
【請求項2】
Ｒ１が、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたナフチル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニルから選択され、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル、ピペリジルＣ１～Ｃ６アルキル、及びテトラヒドロピラニルＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される、
請求項１に記載の初代細胞培養培地。
【請求項3】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉａ）：【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、
Ｒ６は、独立して、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、請求項１に記載の初代細胞培養培地。
【請求項4】
Ｒ１が１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、Ｒ５が水素であり、
Ｒ６が、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである、請求項３に記載の初代細胞培養培地。
【請求項5】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の初代細胞培養培地：【表1A】
【表1B】
【表1C】
【表1D】
【表1E】
【請求項6】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～１０μＭであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項7】
前記インスリン様成長因子１の量が、１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、前記繊維芽細胞成長因子７の量が、２０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、
前記インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ１０μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記肝細胞成長因子の量が、１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、
前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～１０μＭであり、
前記ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量が、１２５ｎＭ～５００ｎＭであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項8】
血清、ウシ下垂体抽出物、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ＢＭＰ阻害剤、ニコチンアミド、又はＮ－アセチルシステインを含まないことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項9】
前記喉頭癌上皮細胞が、喉頭癌細胞、正常喉頭癌上皮細胞、及び喉頭癌上皮幹細胞から選択されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項10】
喉頭癌上皮細胞を培養する方法であって、（１）請求項１～９のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地を調製する工程と、
（２）Ｘ線又はγ線を照射した絨毛細胞を培養容器に予め敷き詰める工程と、
（３）喉頭癌組織から分離した初代喉頭癌上皮細胞を、絨毛細胞を予め敷き詰めた前記培養容器に接種し、工程（１）の前記初代細胞培養培地を用いて培養する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項11】
喉頭癌疾患を治療するための薬剤を評価又はスクリーニングする方法であって、（１）請求項１０に記載される前記培養方法により、喉頭癌上皮細胞を培養する工程と、
（２）試験する前記薬剤を選択し、種々の薬剤濃度勾配に希釈する工程と、
（３）工程（１）で得られた前記喉頭癌上皮細胞に、勾配に希釈した前記薬剤を添加し、細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療技術分野に関し、特に初代喉頭癌上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は増殖させるための培養培地及び培養方法、更には培養細胞を薬物の有効性評価及びスクリーニングに用いる方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
喉頭癌の発生率は、全身の悪性腫瘍の５．７％～７．６％を占める。喉頭癌は、耳鼻咽喉科領域では、上咽頭癌、並びに鼻腔癌及び副鼻腔癌に次いで第３位となっている。蔓延している年齢は５０歳～７０歳である。中国では東北地方で最も発生率が高く、患者の大半は男性である。病因はあまり明らかではないが、大気汚染の激しい都市では、汚染が軽度の都市よりも発生率が高い。喉頭癌の分子病態は未だ不明であり、特に中期及び後期の喉頭癌を有する患者に対する治療法は未だ限られているため、臨床現場では５年生存率が低く、個別化された的確な服薬指導がなされていない。
【0003】
機能的試験とは、癌患者の細胞に対する抗腫瘍薬の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法を指す。この方法を適用する鍵となるのは、短い成長周期を有し、喉頭癌患者の生物学的特徴を表し得る腫瘍細胞モデルを開発することである。さらに、癌患者に適時に精密投薬指導を与えるには、この細胞モデルは、臨床投薬の有効性を迅速かつ効率的に予測する操作が容易であるべきである。しかしながら、癌患者の初代腫瘍細胞からの細胞モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹立の成功率が通常低いこと、成長周期が長いこと、及び間葉系細胞（例えば、線維芽細胞等）の過剰増殖等の問題は全て、この分野における開発を制限する。現在、腫瘍細胞の機能的試験の分野において比較的成熟している初代上皮／幹細胞を培養する技術は２つ存在する。一方は、照射された絨毛細胞及びＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を使用して初代上皮細胞の成長を促進し、個別の患者の薬物感受性を調査することであり、つまり、条件付き細胞リプログラミング技術である（非特許文献１）。もう一方の技術は、成体幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３Ｄ培養して、組織及び器官に類似したオルガノイドを得ることである（非特許文献２）。
【0004】
オルガノイド技術は、３Ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養用の細胞外マトリックス内に患者の自己初代上皮細胞を埋め込む技術である。しかしながら、この技術の培養培地には、様々な特定の成長因子（例えば、Ｗｎｔタンパク質、及びＲ－スポンジンファミリータンパク質等）を加える必要があることから、これは高価であり、臨床における広範な使用には適していない。さらに、培養過程全体を通して、オルガノイドは細胞外マトリックスゲル内に埋め込まれている必要があり、細胞接種、継代、及び薬物感受性試験の播種工程は、２Ｄ培養操作と比較して面倒で時間がかかる。さらに、この技術によって形成されるオルガノイドのサイズを制御することは困難であり、一部のオルガノイドは大きくなりすぎて内部壊死を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイド技術は２Ｄ培養技術よりも操作性及び適用性に劣っている。これには専門の技術者が操作する必要があるため、臨床におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験のための広範囲かつ幅広い使用には適していない（非特許文献３）。
【0005】
細胞リプログラミングは、患者の自己初代上皮細胞をマウス由来のフィーダー細胞と共培養する手法である。しかしながら、喉頭癌試料を試験することは文献に報告されていないため、文献に報告されている培地成分が初代喉頭癌細胞を急速に増殖させることができるかどうかは不明である。
【0006】
上記の技術の制限に鑑みて、短い培養期間、抑制可能なコスト、及び簡便な操作をもたらし得る、臨床における初代喉頭癌上皮細胞用の培養技術を開発することが必要とされている。この技術を適用して初代喉頭癌腫瘍細胞モデルを構築すると、培養喉頭癌細胞は、喉頭癌患者の生物学的特徴を表し得る。個別の癌患者に由来する細胞モデルにおいて抗腫瘍薬の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することにより、抗腫瘍薬の奏効率を臨床において改善することができ、不適切な薬物によって患者に引き起こされる痛み及び医療資源の浪費を減らすことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Liu et al., Am J Pathol, 180: 599-607, 2012
【文献】Hans Clevers et al., Cell, 11; 172(1-2): 373-386, 2018
【文献】Nick Barker, Nat Cell Biol, 18(3): 246-54, 2016
【発明の概要】
【0008】
従来技術の不足に鑑みて、本発明は、初代喉頭癌上皮細胞を培養する培養培地、及び該培養培地を使用して初代喉頭癌上皮細胞を培養する方法を提供することを意図している。本発明の初代喉頭癌上皮細胞のための培養培地及び培養方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養期間が短く、コストを抑制可能であり、操作が簡便であるという目標を達成することができる。この技術を適用して初代喉頭癌腫瘍細胞モデルを構築すると、喉頭癌患者の生物学的特徴を有する初代喉頭癌細胞を得ることができ、これらを新薬スクリーニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験において適用することができる。
【0009】
本発明の一態様は、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤を含む、初代喉頭癌上皮細胞を培養するための初代細胞培養培地を提供することであり、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【0010】
好ましい実施の形態において、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉａ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【0011】
好ましくは、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩、若しくは溶媒和物から選択される少なくとも１つである：
【0012】
【表1A】
【表1B】
【表1C】
【表1D】
【表1E】
【0013】
最も好ましくは、本発明のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は化合物１である。
【0014】
本発明の実施の形態では、培養培地中のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量は、通常１．２５μＭ～１０μＭ、好ましくは２．５μＭ～１０μＭ、より好ましくは５μＭである。
【0015】
好ましくは、本発明の初代細胞培養培地は、１つ以上の以下の因子：インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）；線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）；インスリン－トランスフェリン－セレン複合体（ＩＴＳ）；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；Ｙ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２の少なくとも１つから選択されるＲＯＣＫキナーゼ阻害剤；並びにＡ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８、ＬＹ３６４９４、及びＳＪＮ２５１１の少なくとも１つから選択されるＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤を更に含む。
【0016】
好ましい実施の形態では、培養培地中の線維芽細胞成長因子７の量は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量は、それぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくはそれぞれ１０μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、インスリン様成長因子１の量は、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、肝細胞成長因子の量は、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤は、好ましくはＹ２７６３２であり、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量は、好ましくは１．２５μＭ～２０μＭ、より好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤は好ましくはＡ８３－０１であり、ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量は、好ましくは１２５ｎＭ～１０００ｎＭ、より好ましくは１２５ｎＭ～５００ｎＭである。
【0017】
条件付き細胞リプログラミング培地及びオルガノイド培地と比較すると、この培地の組成には、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が添加されているが、血清、ウシ下垂体抽出物等の不確定成分、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ＢＭＰ阻害剤等、オルガノイド培養に必要なニッチ因子（niche factors）を含有せず、またニコチンアミド及びＮ－アセチルシステインを含まないことにより、培地の費用を大幅に削減し、培地調製の操作プロセスを簡略化し、コスト制御が可能で、操作性の良い初代喉頭癌上皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を実現する。
【0018】
本発明においては、初代喉頭癌上皮細胞は、喉頭癌細胞、正常喉頭癌上皮細胞、及び喉頭癌上皮幹細胞から選択され得る。
【0019】
本発明の一態様は、以下の工程を含む、初代喉頭癌上皮細胞を培養する方法を提供することである：
【0020】
（１）本発明の初代細胞培養培地を上記組成に従って調製する工程。
【0021】
（２）照射した絨毛細胞を培養容器に予め敷き詰める工程。
具体的には、絨毛細胞は、例えば、照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞であり得、照射源はＸ線又はγ線、好ましくはγ線であり、照射線量は３０Ｇｙ～５０Ｇｙ、好ましくは３５Ｇｙである。具体的には、照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、６ウェルプレート、又はＴ２５細胞培養フラスコ等の培養容器に２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、壁に付着させた後使用のため保存する。
具体的には、絨毛細胞は、例えば、照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞であり得、照射源はＸ線又はγ線、好ましくはγ線であり、照射線量は３０Ｇｙ～５０Ｇｙ、好ましくは３５Ｇｙである。具体的には、照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、６ウェルプレート、又はＴ２５細胞培養フラスコ等の培養容器に２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、壁に付着させた後使用のため保存する。
【0022】
（３）初代喉頭癌上皮細胞を喉頭癌組織から分離する工程。
【0023】
初代喉頭癌上皮細胞は、例えば、喉頭癌組織試料及び傍癌組織試料から取得され得る。例えば、喉頭癌組織試料は、説明を受けた上で同意した喉頭癌患者の癌組織から外科的切除によって取得され、傍癌組織試料は、喉頭組織から少なくとも５ｃｍ離れた喉頭癌組織から採集される。上述の組織試料の採集は、外科的摘除又は生検から３０分以内に行われる。より詳細には、滅菌環境において、非壊死部位からの組織試料を０．５ｃｍ３を超えるその体積で切り取った後に、組織試料を予冷した３ｍＬ～５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に入れ、これを蓋付きのプラスチック製滅菌遠心分離チューブ内に入れて、氷上で研究室に輸送する。ここでは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、１体積％～２体積％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び／又は０．２体積％～０．４体積％のプリモシン（Primocin）を含有する（以下、組織輸送液と称する）。ストレプトマイシン／ペニシリンを用いる場合、ストレプトマイシンの濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２００μｇ／ｍＬであり、ペニシリンの濃度範囲は２５Ｕ／ｍＬ～４００Ｕ／ｍＬ、好ましくは５０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬであり、プリモシンを用いる場合、濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１００μｇ／ｍＬである。
【0024】
生物学的安全キャビネット内で、組織試料を細胞培養ディッシュに移した後に、これを輸送液ですすぎ、組織試料の表面上の血球を洗い流す。すすいだ組織試料を別の新しい培養ディッシュに移し、１ｍＬ～３ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して組織試料を体積３ｍｍ３未満の組織片に分ける。
【0025】
組織試料片を遠沈管に移し、卓上遠心機（Sigma、３－１８Ｋ）にて１０００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離を行う。上清を捨てた後、組織輸送液と組織消化液を１：１の割合で加える（投与量は、組織１０ｍｇ当たり組織消化液約５ｍＬであり、組織消化液の調製方法は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、５０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬデオキシリボ核酸Ｉ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ、０．１ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウム、５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを、体積比１：１のＨＢＳＳ及びＲＰＭＩ－１６４０に溶解させることを含む）。次いで、試料に番号を付け、シールフィルムで封をし、そして３７℃、２００回転～３００回転の恒温式振盪機（Zhichu Instrument ＺＱＬＹ－１８０Ｎ）で消化する。消化が完了したかどうかを１時間ごとの観察により判断する。明らかな組織ブロックが見つからない場合は、消化を終了することができ、そうでなければ、４時間～８時間の範囲の消化時間で、十分な消化が行われるまで消化を続ける。消化後、未消化の組織ブロックを細胞フィルタースクリーン（細胞スクリーンのメッシュサイズは、例えば７０μｍである）で濾過する。フィルタースクリーン上の組織ブロックを組織輸送液ですすぎ、残留細胞を遠沈管にすすぎ入れ、卓上遠心機で１０００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍ、３分～５分間遠心分離を行う。上清を捨てた後、残った細胞塊を観察して血球が残っているかどうかを判断する。血球があれば血球溶解液（Sigmaから購入）１ｍＬ～５ｍＬを加えた後よく混ぜ、５分に１回よく振って混ぜながら４℃で１０分～２０分間溶解する。溶解後に得られたものを取り出して１０００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離する。上清を捨てた後、本発明の初代細胞培養培地を加えて再懸濁する。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、細胞の総数を求める。
【0026】
（４）絨毛細胞を予め接種した培養容器に、工程（３）で分離した初代喉頭癌上皮細胞を接種し、工程（１）で得られた初代細胞培養培地を用いて培養する工程。
【0027】
より具体的には、３５Ｇｙの照射線量のγ線を照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、マルチウェルプレートの１ウェルにおいて２×１０４細胞／ｃｍ２～４×１０４細胞／ｃｍ２（例えば、２×１０４細胞／ｃｍ２）の密度で予め接種し、壁に付着させた後、初代喉頭癌細胞を２×１０４細胞／ｃｍ２～８×１０４細胞／ｃｍ２（例えば、４×１０４細胞／ｃｍ２）の密度で接種し、各ウェルに初代上皮細胞培養培地０．５ｍＬ～２ｍＬを加え、次いでプレートを細胞インキュベーター内で８日～１６日間、例えば３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養し、培養中、４日ごとに新鮮な初代細胞培養培地を使用して交換し、初代喉頭癌上皮細胞がマルチウェルプレートの底面積の約８０％～９０％を占める細胞密度に成長した時点で消化及び継代を行う。
【0028】
オルガノイド技術と比較して、この工程は、初代細胞とマトリックスゲルとを氷上で均一に混合して、ゲル液滴を形成し、ゲル液滴の固化を待ってから培地を添加することを必要としない。さらに、高価な細胞外マトリックスゲルの使用量を削減し、操作工程が簡略化される。
【0029】
任意に、接種された初代喉頭癌上皮細胞を８日～１６日間培養した後、培養容器内に形成された細胞クローンが底面積の８０％を覆うように収束したら上清を捨て、０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）１ｍＬ～２ｍＬを加えて１分間消化を行い、０．２５％トリプシンを除去した後、細胞消化のため再度０．０５％トリプシンを１ｍＬ～２ｍＬ加え、次いで、これを室温で５分～２０分間インキュベートする。消化された細胞を、例えば５％（体積／体積）のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む２ｍＬ～４ｍＬの培養液に再懸濁し、１０００ｒｐｍ～３０００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離する。消化された単細胞を本発明の初代細胞培養培地を用いて再懸濁し、得られた細胞懸濁液を、絨毛細胞を予め敷き詰めたＴ２５細胞培養フラスコに入れ、連続培養を行う。Ｔ２５細胞培養フラスコの前処理操作は、工程（２）と同じである。
【0030】
増殖した喉頭癌上皮細胞は２Ｄで成長することから、不均一なサイズのオルガノイドが避けられ、オルガノイド技術を使用した増殖において起こり得る過剰成長したオルガノイドの内部壊死が回避される。
【0031】
別の態様において、本発明の初代喉頭癌上皮細胞の培養方法によって培養した喉頭癌上皮細胞、特に喉頭癌細胞を、以下の工程を含む薬効評価及び薬物スクリーニングに使用することができる：
【0032】
（１）初代喉頭癌上皮細胞を得て、より好ましくは、喉頭癌患者に由来する癌組織試料又は生検癌組織試料を得て、初代喉頭癌上皮細胞を分離し、上記初代喉頭癌上皮細胞を培養する方法に従って初代喉頭癌上皮細胞（特に初代喉頭癌細胞）を少なくとも１０５個の大きさ、好ましくは少なくとも１０６個の大きさの細胞数まで培養して増殖させる工程。
【0033】
（２）試験する薬物を選択する工程。
【0034】
（３）基準として薬物の最大血漿濃度Ｃｍａｘに基づき、初期濃度としてＣｍａｘの２倍～５倍を取り、薬物を種々の薬物濃度勾配、例えば５個～１０個の薬物濃度勾配、好ましくは６個～８個の薬物濃度勾配へと希釈する工程。
【0035】
（４）工程（１）において培養した喉頭癌上皮細胞を消化して単一細胞懸濁液にし、フローイメージングカウンターで細胞数を計数し、本発明の初代細胞培養培地で単一細胞懸濁液を希釈し、希釈された細胞懸濁液を１ウェル当たり２０００個～４０００個の細胞の密度でマルチウェルプレートに一様に、例えば１ウェル当たり５０μＬの細胞希釈液で加え、一晩付着させる工程。
【0036】
この工程により、フィーダー細胞の存在が初代細胞の計数及びその後の初代細胞生存率アッセイに干渉し得るという細胞リプログラミング技術の問題が避けられ、オルガノイド技術でのようなマトリックスゲルを含む細胞懸濁液を氷上で混合し、埋め込み、その後に播種するという面倒な工程の必要性が排除されることから、操作法が大幅に簡易化され、技術の操作性及び実用性が向上する。接種される細胞はオルガノイドのような３Ｄ構造ではなく単一細胞懸濁液であるため、この技術では、オルガノイド技術と比較して、播種細胞数がより均一になり、ウェル間の細胞数の変動がより小さくなり得ることから、その後の高スループット薬物スクリーニング操作により適したものとなる。
【0037】
（５）高スループット自動ワークステーションを使用して、工程（４）において得られた付着細胞に、従来の化学療法薬、標的薬、抗体薬、又はそれらの組合せ等の選択された候補薬物を勾配希釈で添加する工程。
【0038】
（６）薬物を添加した数時間後、例えば７２時間後に、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存率検出キット（Promegaから購入）を使用して喉頭癌上皮細胞の生存率を検出して、薬物活性をスクリーニングする工程。
【0039】
詳細には、各ウェルに、例えば１０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Promegaから購入）を加え、均一に振盪した後に、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの化学発光強度を測定する。横軸として薬物濃度を取り、縦軸として蛍光強度を取ることで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、測定値に基づいて薬物用量－効果曲線を作成し、試験された細胞の増殖に対する薬物の阻害強度を計算する。
【0040】
本発明の初代喉頭癌細胞を薬物スクリーニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験において使用する場合に、細胞の２Ｄ成長のため、薬物との相互作用は、オルガノイド技術における薬物試験時間より迅速である（オルガノイド技術における平均投与時間は６日である）。
【0041】
本発明の有益な効果としては、以下のことも挙げられる：
【0042】
（１）初代喉頭癌上皮細胞の培養の成功率は、８５％超の成功率で改善され得る。
【0043】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代培養した喉頭癌上皮細胞は、初代細胞の由来患者の病理学的表現型及び不均一性を再現することを確実にし得る。
【0044】
（３）培地の組成には血清が含まれていないため、様々なバッチからの血清の質及び量によって影響されない。
【0045】
（４）喉頭癌上皮細胞は高効率で増殖することができ、ここで、１０４個レベルの開始細胞数から約２週間以内に１０６個の規模の喉頭癌上皮細胞の増殖に成功し、増殖した喉頭癌上皮細胞は継続的な継代能力を有する。
【0046】
（５）氷上で操作する必要がなく、継代工程においてマトリックスゲルを解離させる必要がなく、細胞の消化及び継代を１０分～１５分以内に完了することができる。
【0047】
（６）初代喉頭癌培養培地は、高価なＷｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリーのタンパク質、ＢＭＰ阻害剤等の因子を必要としないため、培養にかかるコストを抑制可能であり、細胞の培養コストを節約することができる。
【0048】
（７）操作が簡便である：オルガノイド技術と比較して、オルガノイド技術のようにマトリックスゲルに細胞を埋め込む必要がなく、操作工程が単純で容易である。
【0049】
（９）本技術は、喉頭癌上皮細胞を大量に培養して高い均一性で提供することができることから、新しい候補化合物の高スループットスクリーニング及び患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性機能的試験に適している。
【0050】
この実施形態の細胞培養培地を使用して、喉頭癌細胞、正常喉頭癌上皮細胞、喉頭癌上皮幹細胞、又はこれらの細胞の少なくともいずれかを含む組織を含む、ヒト又は他の哺乳動物に由来する喉頭癌上皮細胞を培養することができる。同時に、本発明の培養培地を使用して、初代喉頭癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培養するためのキットを開発することも可能である。
【0051】
さらに、この実施形態の培養方法により得られた細胞を、再生医療、喉頭癌上皮細胞の基礎医学研究、薬物奏効のスクリーニング、及びＥＳＣＣ疾患に関する新薬の開発等において使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図2】培養培地中の因子の増加が初代喉頭癌細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。
【図4A】図４Ａ及び図４Ｂは、１つの臨床喉頭癌組織試料（番号０Ｓ０００３）から分離した細胞を、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて、それぞれ４日目及び１２日目まで培養し、倒立顕微鏡下で撮影した喉頭癌細胞の写真である。
【図4B】図４Ａ及び図４Ｂは、１つの臨床喉頭癌組織試料（番号０Ｓ０００３）から分離した細胞を、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて、それぞれ４日目及び１２日目まで培養し、倒立顕微鏡下で撮影した喉頭癌細胞の写真である。
【図5】喉頭癌の１つの外科的切除試料（番号０Ｓ０００６）から分離した細胞を６種類の異なる培養培地で７日間培養して収集した細胞の総数の比較図である。
【図6】６つの外科的に切除した喉頭癌試料（番号０Ｓ００１１、０Ｓ００１２、０Ｓ００１３、０Ｓ００１４、０Ｓ００１５、０Ｓ００１６）から分離した細胞を６種類の異なる培養培地の条件下で７日間培養して得られた細胞増殖効果の比較図である。
【図7】１つの臨床喉頭癌組織試料（番号０Ｓ０００４）から分離した細胞を、６種類の異なる培養培地の条件下で培養して得られた細胞成長曲線の比較図である。
【図8A】図８Ａ及び図８Ｂは、喉頭癌の１つの外科的切除試料（番号０Ｓ００１５）から分離した細胞を本発明の培養培地ＳＣＭで培養して得た喉頭癌細胞を、それぞれ非特異的核色素ＤＡＰＩ及び喉頭癌特異抗体ｐ６３で染色した写真である。
【図8B】図８Ａ及び図８Ｂは、喉頭癌の１つの外科的切除試料（番号０Ｓ００１５）から分離した細胞を本発明の培養培地ＳＣＭで培養して得た喉頭癌細胞を、それぞれ非特異的核色素ＤＡＰＩ及び喉頭癌特異抗体ｐ６３で染色した写真である。
【図9】喉頭癌の１つの外科的切除試料（番号０Ｓ０００１）の元の組織細胞と、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて細胞を培養して得られた喉頭癌細胞との免疫組織化学的結果の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本明細書では、上皮細胞は、上皮組織から得られた分化した上皮細胞及び上皮幹細胞を含む。「上皮幹細胞」とは、上皮細胞に分化し得る長期自己複製能を有する細胞であり、上皮組織由来の幹細胞である。上皮組織の例としては、角膜、口腔粘膜、皮膚、結膜、膀胱、腎尿細管、腎臓、消化器（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸含む）、大腸（結腸含む））、肝臓、膵臓、乳腺、唾液腺、涙腺、前立腺、毛根、気管、肺等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞培養培地は、喉頭癌由来の上皮細胞用の培養培地であることが好ましい。
【0054】
さらに、本明細書では、「上皮性腫瘍細胞」とは、上述の上皮組織に由来する細胞の腫瘍化によって得られる細胞を指す。
【0055】
本明細書では、「オルガノイド」とは、制御された空間内で細胞が自発的に高密度に組織化及び凝集して形成された３次元の器官様細胞組織を指す。
【0056】
（ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の調製例）
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
【0057】
１．ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤化合物１の調製
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
【化3】
【0058】
メチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ２）：２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）酢酸（２．０ｇ）、次いでメタノール（３０ｍｌ）を丸底フラスコに加え、続いて塩化チオニル（１．２ｍｌ）を氷浴下で滴下して加えた。反応系を８５℃で一晩反応させた。反応終了後、この系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られた白色固体をそのまま次の工程に使用した。
【0059】
メチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ３）：丸底フラスコにメチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２ｇ）、次いでアセトン（３０ｍｌ）及び炭酸カリウム（２．２ｇ）を加え、次いで氷塩浴で系を－１０℃に冷却した後、アセトン中の２，４－ジクロロ－５－ニトロピリミジン（３．１ｇ）の溶液をゆっくりと加えた。反応系を室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、濾液から減圧下で溶剤を除去し、残渣を加圧シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ３を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３５９．０。
【0060】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ４）：丸底フラスコにメチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２．５ｇ）、次いで酢酸（５０ｍｌ）及び鉄粉（３．９ｇ）を加えた。反応系を６０℃で２時間撹拌した。反応終了後、反応系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られたものを飽和炭酸水素ナトリウム溶液でアルカリ性に中和し、酢酸エチルで抽出した。有機相を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ４を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ２９７．０。
【0061】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ５）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１０ｍｌ）を加え、－３５℃に冷却し、続いてヨードメタン（０．９ｍｌ）、次いで水素化ナトリウム（６１５ｍｇ）を加え、反応系を２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相をそれぞれ水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ５を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３２５．０。
【0062】
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド（１）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（１００ｍｇ）、スルファニルアミド（５３ｍｇ）、ｐ－トルエンスルホン酸（５３ｍｇ）及びｓｅｃ－ブタノール（５ｍｌ）を加えた。反応系を１２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄し、化合物１を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ４６１．１。
【0063】
２．本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物の調製
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
【0064】
【表2A】
【表2B】
【表2C】
【表2D】
【表2E】
【0065】
（実施例１）
ヒト初代喉頭癌上皮細胞の分離
喉頭癌組織試料、すなわち試料番号０Ｓ００２０、０Ｓ００２１及び０Ｓ００２２は、インフォームドコンセントを得た３人の喉頭癌患者の癌組織から外科的切除により得られたものである。以下、試料の１つ（番号０Ｓ００２０）について説明する。
ヒト初代喉頭癌上皮細胞の分離
喉頭癌組織試料、すなわち試料番号０Ｓ００２０、０Ｓ００２１及び０Ｓ００２２は、インフォームドコンセントを得た３人の喉頭癌患者の癌組織から外科的切除により得られたものである。以下、試料の１つ（番号０Ｓ００２０）について説明する。
【0066】
上述の組織試料を、外科的摘除又は生検の後３０分以内に収集した。より具体的には、無菌環境下で、非壊死部位の組織試料を０．５ｃｍ３超の体積で切り出し、予め冷却した４ｍＬの組織輸送液（表１に示す具体的な処方）に入れた。輸送液は５ｍＬの蓋付きプラスチック製滅菌凍結保存チューブ（Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd.から購入）に入れ、コールドチェーン（０℃～１０℃）で実験室に運んだ。
【0067】
【表3】
【0068】
【表4】
【0069】
生物学的安全キャビネット内で、組織試料（番号０Ｓ００２０）を１００ｍｍの細胞培養ディッシュ（NESTから購入）に移した。この組織試料を組織輸送液ですすいだ。組織試料の表面上の残留した血液を洗い流した。組織試料の表面上の脂肪等の余分な組織を取り除いた。すすいだ組織試料を別の新しい１００ｍｍの培養ディッシュに移し、２ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して、組織試料を体積３ｍｍ３未満の組織片に分けた。
【0070】
組織試料片を１５ｍＬ遠沈管に移し、卓上遠心機（Sigma、３－１８Ｋ）で１５００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。上清を捨てた後、組織輸送液と組織消化液を１：１の比で加えた（投与量は組織１０ｍｇに対して組織消化液約５ｍＬであり、具体的な処方を表２に示した）。次いで、試料に番号を付けてシールフィルムで封をした後、３７℃、３００回転の恒温式振盪機（Zhichu Instrument ＺＱＬＹ－１８０Ｎ）で消化した。消化が完了したかどうかを１時間ごとの観察により判断した。
【0071】
消化後、未消化の組織ブロックを７０μｍのフィルタースクリーンで濾過した。フィルタースクリーン上の組織ブロックを組織輸送液ですすぎ、残留した細胞を遠沈管にすすぎ入れ、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離を行った。
【0072】
上清を捨てた後、残った細胞塊を観察して血球が残っているかどうかを判断した。血球があれば血球溶解液（Sigmaから購入）３ｍＬを加えた後よく混ぜ、５分に１回よく振って混ぜながら４℃で１５分間溶解した。溶解後に得られたものを取り出して１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を捨て、消化及び分離された初代喉頭癌細胞を提供し、これに基礎培地（ＢＭ）を加えて再懸濁した。基礎培地は、市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に０．２体積％のプリモシン（Invivogenから購入、濃度５０ｍｇ／ｍＬ）を加え、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd．）で計数して得た総細胞数は２０８００００個であった。
【0073】
他の２つの喉頭癌組織試料を上記と同じ方法に従って分離し、総細胞数はそれぞれ１９７００００個（０Ｓ００２１）及び２３２００００個（０Ｆ００２２）であった。
【0074】
（実施例２）
初代喉頭癌上皮細胞に対する培養培地の最適化
（１）種々の因子による効果
培養したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養溶液で培養）を０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）で消化し、消化を、５％（体積／体積）ウシ胎児血清（ExCell Biotech Co., Ltd.から購入）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養溶液（Corningから購入）を用いて終了させ、得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を廃棄した。遠心分離した細胞沈殿物を、１０％ウシ胎児血清を含む上記ＤＭＥＭ培養溶液に再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co, Ltd.）で計数した。細胞に３５Ｇｙの照射線量のγ線を照射し、次いで２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に接種した。３７℃のインキュベーターで細胞が壁に付着するまで細胞をインキュベートした。初代細胞を接種する前に、培養容器から培養培地を取り除いた。
初代喉頭癌上皮細胞に対する培養培地の最適化
（１）種々の因子による効果
培養したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養溶液で培養）を０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）で消化し、消化を、５％（体積／体積）ウシ胎児血清（ExCell Biotech Co., Ltd.から購入）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培養溶液（Corningから購入）を用いて終了させ、得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を廃棄した。遠心分離した細胞沈殿物を、１０％ウシ胎児血清を含む上記ＤＭＥＭ培養溶液に再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co, Ltd.）で計数した。細胞に３５Ｇｙの照射線量のγ線を照射し、次いで２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で培養容器に接種した。３７℃のインキュベーターで細胞が壁に付着するまで細胞をインキュベートした。初代細胞を接種する前に、培養容器から培養培地を取り除いた。
【0075】
基礎培地（ＢＭと略記する）の調製：ＢＭを、市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に０．２体積％のプリモシン（Invivogenから購入、濃度５０ｍｇ／ｍＬ）を加え、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。
【0076】
次に、基礎培地（ＢＭ）に異なる種類と濃度の添加剤因子（表３）を加え、種々の添加剤成分を含有する喉頭癌上皮細胞用培養培地を調製した。
【0077】
【表5A】
【表5B】
【0078】
異なる成分を含む培養培地を、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた４８ウェルプレートに５００μｌ／ウェルの容量で加えた。実施例１に記載されるものと同じ方法に従って喉頭癌組織から分離した喉頭癌細胞（番号０Ｓ００６４）を、４×１０４細胞／ウェルの細胞数で、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた上記の４８ウェル培養プレートに接種した。表面消毒後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、同数の新しく分離した喉頭癌細胞（番号０Ｓ００６４）を異なる培地処方のもとで培養した。培養開始後、４日ごとに培養培地を交換し、絨毛細胞を補填した。１０日間の培養後、細胞計数を行った。実験コントロールとして、添加剤を一切加えていない基礎培地（ＢＭ）を使用した。結果を図１Ａ～図１Ｆに示す。
【0079】
図の縦軸は、基礎培地ＢＭでの培養後に得られた細胞数に対する、異なる培地での培養後に得られた細胞数の比を示す。図に示すように、表３に従って種々の濃度の種々の因子をＢＭに添加すると、細胞増殖に対する異なる効果をもたらし得る。中でも、Ｂ２７添加剤、Ｎ２添加剤、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子１、線維芽細胞成長因子７、化合物１、Ｙ２７６３２、及びＡ８３－０１は特定の濃度範囲において細胞増殖に対して一定の促進効果を提供した。
【0080】
（２）本発明の方法により得られた初代喉頭癌細胞の増殖に及ぼす培養培地中の因子の増加の影響
基礎培地ＢＭにそれぞれ種々の低分子、添加剤、及び成長因子（表４）を順に添加し、種々の添加剤成分を含有する喉頭癌上皮細胞用培養培地を調製した。
基礎培地ＢＭにそれぞれ種々の低分子、添加剤、及び成長因子（表４）を順に添加し、種々の添加剤成分を含有する喉頭癌上皮細胞用培養培地を調製した。
【0081】
【表6】
【0082】
γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた４８ウェルプレートに、異なる成分を含む培養培地を５００μｌ／ウェルの量で加え、同時にＢＭ培地を実験コントロールとして使用した。実施例１に記載の方法に従って喉頭癌組織から分離した喉頭癌細胞（番号０Ｓ００６５）を、４×１０４細胞／ウェルの細胞数で、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた上記の４８ウェル培養プレートに接種した。表面消毒後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、同数の新しく分離した喉頭癌細胞（番号０Ｓ００６５）を異なる培地処方のもとで培養した。７日間の培養後、細胞計数を行った。結果を図２に示した。
【0083】
図に示すように、この特許において、初代喉頭癌細胞（以下、ＳＣＭと略記する）の培養及び増殖に最も好ましい培養培地は７番であると判断された。このことから、Ｎ２添加剤及びＢ２７添加剤等、いくつかの因子、低分子阻害剤、又は或る特定の濃度の血清及び血清の代替物を更に添加しても、細胞増殖の促進に大きな効果は与えなかった。
【0084】
（３）本発明で得られた初代喉頭癌細胞の増殖に対する種々の濃度の添加剤因子の効果
本発明の初代喉頭癌上皮細胞用培養培地（ＳＣＭと略記する）の調製：基礎培地（ＢＭ）に、最終濃度４０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ－７）、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、１：５０の希釈比のインスリン－トランスフェリン－セレン複合体（ＩＴＳ）ストック溶液（ＳＣＭ培地中、最終濃度１０μｇ／ｍｌのインスリン、最終濃度５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム）、最終濃度５μＭの化合物１、最終濃度１０μＭのＹ２７６３２、及び最終濃度２５０ｎＭのＴＧＦβ１阻害剤Ａ８３－０１を加え、初代喉頭癌上皮細胞用の培養培地を調製した。
本発明の初代喉頭癌上皮細胞用培養培地（ＳＣＭと略記する）の調製：基礎培地（ＢＭ）に、最終濃度４０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ－７）、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、１：５０の希釈比のインスリン－トランスフェリン－セレン複合体（ＩＴＳ）ストック溶液（ＳＣＭ培地中、最終濃度１０μｇ／ｍｌのインスリン、最終濃度５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム）、最終濃度５μＭの化合物１、最終濃度１０μＭのＹ２７６３２、及び最終濃度２５０ｎＭのＴＧＦβ１阻害剤Ａ８３－０１を加え、初代喉頭癌上皮細胞用の培養培地を調製した。
【0085】
実施例１と同様の方法を用いて、喉頭癌患者の癌組織から癌組織に由来する喉頭癌上皮細胞を分離して得た（試料番号０Ｓ０００５）。次に、癌組織に由来する喉頭癌細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、総細胞数を得た。次いで、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ ２ｍＬを１２ウェルプレートに加え、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、１２ウェルプレート内の培地上清を捨て、０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）０．５ｍＬを加えて１分間消化を行い、０．２５％トリプシンを除去した後、細胞消化のため再度０．０５％トリプシン０．５ｍＬを加え、次いで顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で観察して細胞が完全に消化されるまで室温で５分～２０分インキュベートし、次いで、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養溶液１ｍｌを用いて消化を終了させ、得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を廃棄した。遠心分離した細胞沈殿物を基礎培地ＢＭに再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数して総細胞数を求めた。得られた細胞を、以下の培養実験に用いた。
【0086】
次に、種々の処方の以下の７種類の培養培地を調製し、実験を行った。
【0087】
製剤１：線維芽細胞成長因子７を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤２：インスリン－トランスフェリン－セレン複合体を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤３：インスリン様成長因子１を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤４：肝細胞成長因子を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤５：Ｙ２７６３２を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤６：化合物１を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤７：Ａ８３－０１を含まないＳＣＭ培地組成。
製剤２：インスリン－トランスフェリン－セレン複合体を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤３：インスリン様成長因子１を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤４：肝細胞成長因子を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤５：Ｙ２７６３２を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤６：化合物１を含まないＳＣＭ培地組成；
製剤７：Ａ８３－０１を含まないＳＣＭ培地組成。
【0088】
消化された細胞懸濁液を上記製剤１～製剤７でそれぞれ希釈し、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた４８ウェルプレートに、１ウェル当たり１００００個及び２５０μＬの容量で蒔いた。
【0089】
製剤１の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、調製した線維芽細胞成長因子７を、線維芽細胞成長因子７の最終濃度がそれぞれ８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ及び１．２５ｎｇ／ｍｌとなるように１ウェル当たり２５０μＬ加え、コントロールウェル（ＢＣ）として製剤１の培地を使用した。
【0090】
製剤２の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体ストック溶液の最終濃度がそれぞれ１：１６００、１：８００、１：４００、１：２００、１：１００、１：５０、及び１：２５になるように（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．１５６２５μｇ／ｍｌ、０．１５６２５ｎｇ／ｍｌ；０．６２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．３１２５ｎｇ／ｍｌ；１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０．６２５ｎｇ／ｍｌ；２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ；及び２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌに対応する）調製したインスリン－トランスフェリン－セレン複合体を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤２の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0091】
製剤３の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、インスリン様成長因子１の最終濃度がそれぞれ８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、及び１．２５ｎｇ／ｍｌとなるように調製したインスリン様成長因子１を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤３の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0092】
製剤４の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、肝細胞成長因子の最終濃度がそれぞれ８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、及び１．２５ｎｇ／ｍｌとなるように調製した肝細胞成長因子を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤４の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0093】
製剤５の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、Ｙ２７６３２の最終濃度がそれぞれ４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、及び０．６２５μＭとなるように調製したＹ２７６３２を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤５の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0094】
製剤６の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、化合物１の最終濃度がそれぞれ４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、及び０．６２５μＭとなるように調製した化合物１を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤６の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0095】
製剤７の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、Ａ８３－０１の最終濃度がそれぞれ４０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、及び６２．５ｎＭとなるように調製したＡ８３－０１を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤７の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0096】
４８ウェルの約８５％まで細胞を増殖させた後、細胞を消化して計数し、コントロールウェル（ＢＣ）の細胞数を参照して比を算出し、結果を図３Ａ～図３Ｇに示した。図３Ａ～図３Ｇのそれぞれにおいて、比は、各培養培地を用いることにより培養された１回目の継代の細胞数と、対応するコントロールウェルにより培養された１回目の継代の細胞数との比を表す。この比が１より大きい場合は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製培地の増殖促進効果が、コントロールのウェル培地の増殖促進効果よりも好ましいことを示し、この比が１より小さい場合は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製培地の増殖促進効果が、コントロールのウェル培地の増殖促進効果よりも悪いことを示す。
【0097】
図３Ａ～図３Ｇの結果によると、培養培地中の線維芽細胞成長因子７の量は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌであり、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体の体積濃度は、好ましくは１：２５～１：１００、より好ましくは１：２５～１：１５０であり（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはそれぞれ１０μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌに相当する）、インスリン様成長因子１の量は、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、肝細胞成長因子の量は、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌであり、Ｙ２７６３２の量は、好ましくは１．２５μＭ～２０μＭ、より好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、化合物１の量は、好ましくは１．２５μＭ～１０μＭ、より好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、Ａ８３－０１の量は、好ましくは１２５ｎＭ～１０００ｎＭであり、より好ましくは１２５ｎＭ～５００ｎＭである。
【0098】
（実施例３）
ヒト喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞の培養
実施例１と同様の方法を用いて、喉頭癌患者の癌組織から癌組織に由来する喉頭癌上皮細胞を分離して得た（試料番号０Ｓ０００３）。次に、癌組織に由来する喉頭癌細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、総細胞数を得た。次いで、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ ２ｍＬを１２ウェルプレートに加え、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。
ヒト喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞の培養
実施例１と同様の方法を用いて、喉頭癌患者の癌組織から癌組織に由来する喉頭癌上皮細胞を分離して得た（試料番号０Ｓ０００３）。次に、癌組織に由来する喉頭癌細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、総細胞数を得た。次いで、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ ２ｍＬを１２ウェルプレートに加え、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。
【0099】
図４Ａは、この実施例によるγ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、４日目まで培養した細胞の顕微鏡画像（１００倍倒立位相差顕微鏡で撮影）である。顕微鏡による観察は、癌組織由来の培養された初代喉頭癌細胞が大きなクローンを形成したことを示す。図４Ｂは、この実施例による接種後１２日目まで培養した細胞の顕微鏡画像（１００倍倒立位相差顕微鏡で撮影）であり、視野内が細胞でいっぱいになっていることを示す。図４Ａ及び図４Ｂから、分離した初代喉頭癌細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養すると、明らかなクローンの形成を顕微鏡下で見ることができ、１２日間増殖させた後、細胞数が有意に増殖したことが分かり、本発明の技術は喉頭癌上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に増殖する技術であることが示唆された。
【0100】
（実施例４）
喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞の増殖促進に対する種々の培養培地の影響
（１）種々の培養培地が初代細胞のクローン形成及び初代細胞の増殖効果に及ぼす影響の比較
実施例２と同様の方法で初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭを調製し、コントロールとして基礎培地ＢＭを調製した。また、別のコントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術に使用される培養培地ＦＭを追加で調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい。培養培地の処方を表５に示す。同時に、更なるコントロールとして、初代喉頭癌細胞ＳＣＭ－１及びＳＣＭ－２の培養培地を調製し、培地ＳＣＭ中のインスリン－トランスフェリン－セレン複合体を、それぞれ１：５０の体積比でＢ２７添加剤、１：１００の体積比でＮ２添加剤に置き換えた処方の培養培地を得た。さらに、追加のコントロールとして、市販の培地である規定ケラチノサイトＳＦＭ（以下、「ＫＳＦＭ培地」とも称する）をGibcoから購入し、培養培地の処方を表６に示す。
喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞の増殖促進に対する種々の培養培地の影響
（１）種々の培養培地が初代細胞のクローン形成及び初代細胞の増殖効果に及ぼす影響の比較
実施例２と同様の方法で初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭを調製し、コントロールとして基礎培地ＢＭを調製した。また、別のコントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術に使用される培養培地ＦＭを追加で調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい。培養培地の処方を表５に示す。同時に、更なるコントロールとして、初代喉頭癌細胞ＳＣＭ－１及びＳＣＭ－２の培養培地を調製し、培地ＳＣＭ中のインスリン－トランスフェリン－セレン複合体を、それぞれ１：５０の体積比でＢ２７添加剤、１：１００の体積比でＮ２添加剤に置き換えた処方の培養培地を得た。さらに、追加のコントロールとして、市販の培地である規定ケラチノサイトＳＦＭ（以下、「ＫＳＦＭ培地」とも称する）をGibcoから購入し、培養培地の処方を表６に示す。
【0101】
【表7】
【0102】
【表8】
【0103】
実施例１と同様の方法を使用して、喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞（番号０Ｓ０００６）を取得した。次に、以下の６つの培養条件で、同じ密度（４×１０４細胞／ｃｍ２）で細胞の培養を行った。
【0104】
Ａ．本発明の技術：γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入）を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、本発明の初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ １ｍＬを用いて培養を行った。
【0105】
Ｂ．細胞条件付きリプログラミング技術：γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入）を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに、初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、１ｍＬの細胞条件付きリプログラミング培地ＦＭを用いて２４ウェルプレートで培養した（詳細な工程はLiu et al., Nat. Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい）。
【0106】
Ｃ．γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入）を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、１ｍＬの培養培地ＳＣＭ－１を用いて２４ウェルプレートで培養を行った。
【0107】
Ｄ．γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入）を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、１ｍＬの培養培地ＳＣＭ－２を用いて２４ウェルプレートで培養を行った。
【0108】
Ｅ．初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で２４ウェルプレートに接種し、市販の培地ＫＳＦＭ １ｍＬを用いて２４ウェルプレートで培養した。
【0109】
Ｆ．γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞（ATCCから購入）を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに初代喉頭癌細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２ｍＬの基礎培地ＢＭを用いて２４ウェルプレートで培養を行った。
【0110】
上記の６つの培養において、６つの培養条件下で培地を５日ごとに一新して細胞を培養した。同時に、２４ウェルプレートでの各培地の培養下での細胞クローン形成及び細胞増殖状態を観察し、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で細胞成長状態を撮影することにより記録した。
【0111】
本発明の技術で培養した喉頭癌の初代癌細胞（番号０Ｓ０００６）に、培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、２４ウェルプレート内の培地上清を捨て、０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）０．５ｍＬを加えて１分間消化し、０．２５％トリプシンを除去した後、細胞消化のため再度０．０５％トリプシン０．５ｍＬを加え、次いでこれを顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で観察して細胞が完全に消化されるまで３７℃で１０分インキュベートし、次いで、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養溶液１ｍｌを用いて消化を終了させ、得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を廃棄した。遠心分離した細胞沈殿物を本発明の培養培地に再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数して総細胞数を求めたところ、３１７０００個であった。他の５つの培養条件で培養した細胞を、上記と同様の操作プロセスで消化し、計数した。ＦＭ、ＳＣＭ－１、ＳＣＭ－２、ＫＳＦＭ、及びＢＭの培地を使用して培養した細胞の総数は、それぞれ１６６７００個、２６６１００個、２７７２００個、９５６００個、及び３５９００個であった。
【0112】
図５は、番号０Ｓ０００６の細胞から異なる条件下で増幅された細胞の総数のプロットである。
【0113】
図６は、実施例１による６つの喉頭癌患者試料（番号０Ｓ００１１、番号０Ｓ００１２、番号０Ｓ００１３、番号０Ｓ００１４、番号０Ｓ００１５、番号０Ｓ００１６）から分離した初代喉頭癌細胞を６種類の異なる培養培地の条件下で７日間培養して得た細胞増殖効果の比較図であり、√は中程度のクローン形成能及び増殖促進効果を表し、√√は、顕著なクローン形成能及び増殖促進効果を表し、√√√は極めて大きなクローン形成能及び増殖促進効果を表し、×はクローン形成がないことを表す。図より、培養培地ＳＣＭは、喉頭癌組織由来初代細胞の培養において、クローン形成能及び細胞増殖促進効果の点で、他の５つの培養条件に対して有意に優れていることが確認される。
【0114】
（２）初代喉頭癌細胞の種々の培養培地における連続培養及び成長曲線
この実施例の（１）と同様の方法を使用して、初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭと、コントロールとしての培養培地ＦＭ、ＳＣＭ－１、ＳＣＭ－２、ＫＳＦＭ、及びＢＭを得た。
この実施例の（１）と同様の方法を使用して、初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭと、コントロールとしての培養培地ＦＭ、ＳＣＭ－１、ＳＣＭ－２、ＫＳＦＭ、及びＢＭを得た。
【0115】
喉頭癌組織由来の初代喉頭癌細胞（番号０Ｓ０００４）を以下の６種類の培養培地で培養した後、この実施例の（１）と同様の方法を使用して消化、継代及び計数した。
【0116】
継代した細胞が培養プレート内で再びプレートの底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、上記の操作方法に従って培養細胞を消化、収集及び計数した。細胞を再び４×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、連続培養を行った。
【0117】
以下は、異なる培養条件下での初代喉頭癌上皮細胞の細胞集団倍加数の算出式である。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
【0118】
図７は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって描かれた、６種類の異なる培養条件下での０Ｓ０００４細胞の成長曲線を示す。横軸は細胞培養日数を表し、縦軸は累積細胞増殖の倍数、すなわち培養期間中の細胞増殖の倍数を表す。値が大きいほど、一定時間内に細胞が何倍にも増殖しており、すなわち、より多くの細胞が増殖している。傾きは、細胞の増殖速度を表す。図より、本発明の培養培地ＳＣＭとＳＣＭ－１、ＳＣＭ－２で培養した喉頭癌上皮細胞の増殖速度は、他の３つの培養条件よりも優れていることが確認され、本発明の技術により初代喉頭癌上皮細胞を連続培養できることも確認できる。
【0119】
（実施例５）
癌組織由来の初代喉頭癌細胞の同定
（１）原発喉頭癌組織及び継代培養後の喉頭癌細胞の免疫蛍光法による同定
実施例１と同様の方法を用いて、喉頭癌患者の癌組織から癌組織に由来する喉頭癌上皮細胞を分離して得た（試料番号０Ｓ００１５）。次に、癌組織に由来する喉頭癌細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、総細胞数を得た。次いで、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。同時に、免疫蛍光染色用の円形細胞スライド（Thermo Fisherから購入）を２４ウェルプレートに予め入れておいた。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ １ｍＬを２４ウェルプレートに加え、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。
癌組織由来の初代喉頭癌細胞の同定
（１）原発喉頭癌組織及び継代培養後の喉頭癌細胞の免疫蛍光法による同定
実施例１と同様の方法を用いて、喉頭癌患者の癌組織から癌組織に由来する喉頭癌上皮細胞を分離して得た（試料番号０Ｓ００１５）。次に、癌組織に由来する喉頭癌細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、総細胞数を得た。次いで、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。同時に、免疫蛍光染色用の円形細胞スライド（Thermo Fisherから購入）を２４ウェルプレートに予め入れておいた。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ １ｍＬを２４ウェルプレートに加え、次いで、これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。
【0120】
２４ウェルプレート内の細胞が底面積の８０％を覆うまで増殖した時点で培養溶液を捨て、４％ホルムアルデヒドを用いて氷上で３０分間細胞を固定した。得られたものをＰＢＳ（Shanghai Sangon Biotechから購入）で５分×３回洗浄した。ＰＢＳを捨てた後、浸透液を加え、得られたものを、光を当てずに３０分間振とう（約１００ｒｐｍ）して膜を破り、次いで、ＰＢＳで５分間×３回洗浄を行った。その後、ＰＢＳ＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Shanghai Sangong Biotechから購入）を用いて、ブロッキング用の５体積％ＢＳＡ（Shanghai Sangong Biotechから購入）溶液を調製し、３７℃で３０分間ブロッキングを行った。
【0121】
抗体を希釈するためＰＢＳ＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を前もって調製し、扁平上皮癌特異的抗体ｐ６３（CSTから購入）を１：５０の比率で希釈した。ブロッキング溶液を捨て、調製した一次抗体希釈液を添加した。これを４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートした。得られたものを４℃で取り出した後、室温に戻し、３７℃で１時間続けてインキュベートした後、ＰＢＳで５分×３回洗浄した。
【0122】
二次抗体の希釈には、前もってＰＢＳ＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を調製し、励起光４８８ｎｍのウサギ蛍光二次抗体（Thermo Fisherから購入）を１：１０００の比率で希釈した。得られたものを室温、暗所で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで５分×３回洗浄した。
【0123】
非特異的蛍光色素ＤＡＰＩ（Sigmaから購入）をＰＢＳで１：１０００の体積比で希釈し、室温暗所にて５分間染色に使用した。得られたものをＰＢＳで５分×３回洗浄した。記録用に顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で写真を撮影した。
【0124】
図８Ａ及び図８Ｂは、それぞれ１０倍の対物レンズ下の異なる視野で撮影した蛍光写真であり、このうち、図８Ａは非特異的蛍光色素ＤＡＰＩで核を染色した写真であり、図８Ｂは喉頭癌特異抗体ｐ６３（核に存在する）で染色した写真である。図に示すように、図８Ａで核を示した位置は、図８Ｂでは全て緑色に染色されており、培養細胞は喉頭扁平上皮癌細胞であり、臨床病理診断と一致することを示す。
【0125】
（２）原発喉頭癌組織及び継代培養後の喉頭癌細胞の免疫組織化学による同定
喉頭癌患者の外科的切除試料から緑豆大の癌組織（試料番号０Ｓ０００１）を採取し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸漬した。残った癌組織から、実施例１と同様の方法で喉頭癌上皮細胞（試料番号０Ｓ０００１）を得た。試料０Ｓ０００１を、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて、実施例３の方法に従い、６継代目まで連続培養した。
喉頭癌患者の外科的切除試料から緑豆大の癌組織（試料番号０Ｓ０００１）を採取し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸漬した。残った癌組織から、実施例１と同様の方法で喉頭癌上皮細胞（試料番号０Ｓ０００１）を得た。試料０Ｓ０００１を、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて、実施例３の方法に従い、６継代目まで連続培養した。
【0126】
免疫組織化学アッセイを用いて、試料０Ｓ０００１の元の組織と６継代目まで連続培養して得た初代細胞の重要な喉頭癌関連バイオマーカーの発現を検出した。組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して、ミクロトームで厚さ４μｍの組織切片に切り出した。次いで、通例の免疫組織化学的検出を行った（詳細な工程については、Li et al., Nature Communication, (2018) 9:2983を参照されたい）。使用した一次抗体は、サイトケラチン（ｐＣＫ）（CSTから購入）、ｐ６３抗体（CSTから購入）、及びＫｉ６７抗体（R&Dから購入）であった。
【0127】
図９は、元の組織細胞と、本発明の培養培地ＳＣＭを用いて細胞を培養して得られた喉頭癌細胞との免疫組織化学的結果の比較である。図９から、本発明の技術により喉頭癌細胞（試料番号０Ｓ０００１）を６継代目まで培養した細胞における喉頭癌関連バイオマーカーの発現は、その細胞が由来する元の組織切片におけるマーカーの発現と一致することが確認された。このことは、本発明の技術によって培養された細胞は、喉頭癌患者の癌組織の本来の病態特性を維持していることを示唆する。
【0128】
（実施例６）
癌組織由来の初代喉頭癌細胞のマウスでの異種移植による腫瘍形成実験
病理診断された喉頭癌患者１名の癌組織から、実施例１と同様の方法を使用して喉頭癌細胞（番号０Ｓ０００３）を分離し、取得した。０Ｓ０００３を実施例３の方法に従って本発明の培養培地ＳＣＭを用いて培養し、喉頭癌細胞数が１×１０７に達した時点で、実施例４と同様の方法を使用して喉頭癌細胞を消化し、収集した。本発明の喉頭癌細胞用培養培地ＳＣＭとＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）を１：１の割合で混合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地１００μＬを用いて５×１０６個の喉頭癌細胞を再懸濁し、得られたものを６週齢の雌性高度免疫不全マウス（ＮＣＧ）（Nanjing Model Animal Research Centerから購入）の喉頭癌脂肪パッドと右前肢の腋下にそれぞれ注入した。喉頭癌細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を３日ごとに観察して写真撮影した。
癌組織由来の初代喉頭癌細胞のマウスでの異種移植による腫瘍形成実験
病理診断された喉頭癌患者１名の癌組織から、実施例１と同様の方法を使用して喉頭癌細胞（番号０Ｓ０００３）を分離し、取得した。０Ｓ０００３を実施例３の方法に従って本発明の培養培地ＳＣＭを用いて培養し、喉頭癌細胞数が１×１０７に達した時点で、実施例４と同様の方法を使用して喉頭癌細胞を消化し、収集した。本発明の喉頭癌細胞用培養培地ＳＣＭとＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）を１：１の割合で混合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地１００μＬを用いて５×１０６個の喉頭癌細胞を再懸濁し、得られたものを６週齢の雌性高度免疫不全マウス（ＮＣＧ）（Nanjing Model Animal Research Centerから購入）の喉頭癌脂肪パッドと右前肢の腋下にそれぞれ注入した。喉頭癌細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を３日ごとに観察して写真撮影した。
【0129】
腫瘍細胞接種後２１日目にマウスの２つの腫瘍細胞接種部位の両方において腫瘍形成が観察され得る。２１日目から４０日目まで、マウスにおける腫瘍増殖は明らかであった。これは、本発明の培養方法により培養した癌組織由来の喉頭癌細胞がマウスにおいて腫瘍形成性を有することを示している。
【0130】
（実施例７）
癌組織由来の喉頭癌細胞の薬物感受性機能的試験
喉頭癌患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来の喉頭腫瘍試料から培養した喉頭癌細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
癌組織由来の喉頭癌細胞の薬物感受性機能的試験
喉頭癌患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来の喉頭腫瘍試料から培養した喉頭癌細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
【0131】
１．初代喉頭癌細胞の播種：実施例１の方法に従って得られた分離喉頭癌細胞（番号０Ｓ００２０及び番号０Ｓ００２２）の細胞懸濁液を、γ線照射したＮＩＨ－３Ｔ３細胞を予め敷き詰めた１２ウェルプレートに、４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種した。調製した初代喉頭癌上皮細胞用培養培地ＳＣＭ ２ｍＬを１２ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れて培養した。培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、１２ウェルプレート内の培地上清を捨て、０．２５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）０．５ｍＬを加えて１分間消化を行い、０．２５％トリプシンを除去した後、細胞消化のため再度０．０５％トリプシン０．５ｍＬを加え、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で観察して細胞が完全に消化されるまで細胞を３７℃で１０分インキュベートし、次いで、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養溶液１ｍＬを用いて消化を終了させ、得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を廃棄した。遠心分離した細胞沈殿物を培養培地ＳＣＭに再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数して総細胞数を求めたところ、それぞれ８３００００個及び７６８０００個であった。２０００細胞／ウェル～４０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレートに細胞を接種し、一晩細胞を接着させた。
【0132】
２．薬物勾配実験：
（１）薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した：１０μＭの試験される薬物ストック溶液の４０μＬをそれぞれ最大濃度とし、そこからそれぞれ１０μＬの溶液をピペッティングして、２０μＬのＤＭＳＯを含む０．５ｍＬ ＥＰチューブに加え、上記ＥＰチューブからの溶液１０μＬを再度２０μＬのＤＭＳＯが入った２つ目の０．５ｍＬ ＥＰチューブにピペッティングした（すなわち、薬物を１：３の比で希釈した）。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる７個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を３８４ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のＤＭＳＯを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例では、試験する薬物は、ボルテゾミブ（MCEから購入）、ジスルフィラム（MCEから購入）、ゲフィチニブ（MCEから購入）、及びエルロチニブ（MCEから購入）であった。
（１）薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した：１０μＭの試験される薬物ストック溶液の４０μＬをそれぞれ最大濃度とし、そこからそれぞれ１０μＬの溶液をピペッティングして、２０μＬのＤＭＳＯを含む０．５ｍＬ ＥＰチューブに加え、上記ＥＰチューブからの溶液１０μＬを再度２０μＬのＤＭＳＯが入った２つ目の０．５ｍＬ ＥＰチューブにピペッティングした（すなわち、薬物を１：３の比で希釈した）。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる７個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を３８４ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のＤＭＳＯを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例では、試験する薬物は、ボルテゾミブ（MCEから購入）、ジスルフィラム（MCEから購入）、ゲフィチニブ（MCEから購入）、及びエルロチニブ（MCEから購入）であった。
【0133】
（２）高スループット自動ワークステーション（ＪＡＮＵＳ、Perkin Elmer）を使用して、３８４ウェルの薬物貯蔵プレートにおける様々な濃度の薬物及び溶剤コントロールを、喉頭癌細胞が播種された３８４ウェルの細胞培養プレートに加えた。薬物群及び溶剤コントロール群を、それぞれ３つの反復実験ウェルで配置した。各ウェルに加えた薬物の容量は１００ｎＬであった。
【0134】
（３）細胞生存率の試験：投与７２時間後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイキット（Promegaから購入）を使用して、薬物投与後に培養細胞の化学発光値を検出した。化学発光値の大きさは、細胞生存率及び細胞生存率に対する薬物の効果を反映している。調製された１０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出液を各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Perkin Elmer）を使用して、混合後に化学発光値を検出した。
【0135】
（４）細胞生存率の試験：細胞生存率（％）＝薬物ウェルの化学発光値／コントロールウェルの化学発光値×１００％の式により、種々の薬物で処理した細胞の細胞生存率を算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフを作成し、半数阻害率ＩＣ５０を計算すると同時に、種々の薬物のヒト体内最大血中濃度Ｃｍａｘ下での細胞生存率も計算した。
【0136】
（５）薬物感受性試験結果を図１０に示す。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、２名の異なる喉頭癌患者の外科的に切除した癌組織試料（試料番号０Ｓ００２０及び試料番号０Ｓ００２２）から培養した喉頭癌細胞の２種類の化学療法剤であるボルテゾミブ及びジスルフィラムと、標的化薬物であるゲフィチニブ及びエルロチニブに対する感受性を表す。具体的には、図１０Ａは、試料番号０Ｓ００２０から培養した喉頭癌細胞の４剤に対する感受性の結果、図１０Ｂは、試料番号０Ｓ００２２から培養した喉頭癌細胞の４剤に対する感受性の結果を示す。図中、横軸の破線に相当する濃度は、ヒト体内におけるこれら４剤の最大血中濃度Ｃｍａｘを示す。結果は、同じ患者からの細胞が、ヒト体内の各最大血中濃度の異なる薬物に対して異なる感受性を有すること、また異なる患者からの細胞が、ヒト体内の最大血中濃度の薬物に対して異なる感受性を有することも示す。結果によれば、喉頭癌患者への臨床使用における薬物の有効性を判断することができる。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、２名の異なる喉頭癌患者の外科的に切除した癌組織試料（試料番号０Ｓ００２０及び試料番号０Ｓ００２２）から培養した喉頭癌細胞の２種類の化学療法剤であるボルテゾミブ及びジスルフィラムと、標的化薬物であるゲフィチニブ及びエルロチニブに対する感受性を表す。具体的には、図１０Ａは、試料番号０Ｓ００２０から培養した喉頭癌細胞の４剤に対する感受性の結果、図１０Ｂは、試料番号０Ｓ００２２から培養した喉頭癌細胞の４剤に対する感受性の結果を示す。図中、横軸の破線に相当する濃度は、ヒト体内におけるこれら４剤の最大血中濃度Ｃｍａｘを示す。結果は、同じ患者からの細胞が、ヒト体内の各最大血中濃度の異なる薬物に対して異なる感受性を有すること、また異なる患者からの細胞が、ヒト体内の最大血中濃度の薬物に対して異なる感受性を有することも示す。結果によれば、喉頭癌患者への臨床使用における薬物の有効性を判断することができる。
【産業上の利用可能性】
【0137】
本発明は、初代喉頭癌上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は増殖させるための培養培地及び培養方法を提供する。本発明の培養培地及び培養方法を用いて培養した細胞子孫及びオルガノイドは、薬物の有効性評価及びスクリーニング、毒性判定、並びに再生医療に利用することが可能である。したがって、本発明は産業上適用可能である。
【0138】
以上、本発明を詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、当業者であれば本発明の原理に従って改変を加えることが可能である。したがって、本発明の原理に従って行われる全ての改変は、本発明の保護範囲に含まれると解釈されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
