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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-14
(45)【発行日】2024-06-24
(54)【発明の名称】対称性ボラフォームソホロシドの生産の改善
(51)【国際特許分類】
C12P 7/64 20220101AFI20240617BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240617BHJP
C12N 15/90 20060101ALN20240617BHJP
【ＦＩ】
C12P7/64 ZNA
C12N1/19
C12N15/90 102Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021529127
(86)(22)【出願日】2019-11-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(86)【国際出願番号】 EP2019082063
(87)【国際公開番号】W WO2020104582
(87)【国際公開日】2020-05-28
【審査請求日】2022-11-18
(31)【優先権主張番号】18207793.3
(32)【優先日】2018-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】500454046
【氏名又は名称】ウニベルズィタイト・ヘント
(73)【特許権者】
【識別番号】522442825
【氏名又は名称】アンフィスター
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ローランツ，ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】ファン・レンテルヘム，リサ
(72)【発明者】
【氏名】ソータルト，ビム
(72)【発明者】
【氏名】レメリー，イェレ
【審査官】池上 佳菜子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１５４５２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－１２３０１９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ソホロ脂質を含有する混入脂肪酸を含まない完全対称性ボラソホロシドの生産方法であって、脂肪族尾部の鎖長が少なくとも炭素６個である脂肪族アルコールを変異した真菌株に供給する工程を含み、前記真菌株は機能不能のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能不能のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有し、前記真菌株は、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａまたはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａクレードのソホロ脂質生産株である、方法。
【請求項2】
前記ＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子および前記ＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子はノックアウトされている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記脂肪族尾部の鎖長が少なくとも炭素６個である脂肪族アルコールは、ヘキサノール、オクタノール、デカノール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、パルミトレイルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、オレイルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、またはこれらの混合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記対称性ボラソホロシドはアセチル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
機能不能のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能不能のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有する変異した真菌株であって、前記真菌株は、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａまたはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａクレードのソホロ脂質生産株である、真菌株。
【請求項6】
前記ＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子および前記ＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子はノックアウトされている、請求項５に記載の変異した真菌株。
【請求項7】
酸性ソホロ脂質、ラクトン酸ソホロ脂質、またはボラソホロ脂質などのソホロ脂質を含有する混入脂肪酸を含まない完全対称性ボラソホロシドを生産するための、請求項５または６に記載の変異した真菌株の使用。
【請求項8】
完全対称性末端ジオールを生産するための、請求項５または６に記載の変異した真菌株の使用。
【請求項9】
前記対称性ボラソホロシドは、アルキルソホロシドをさらに含む混合物の一部である、請求項７に記載の使用。
【請求項10】
アルキルソホロシドを生産するための、請求項５または６に記載の変異した真菌株の使用。
【請求項11】
前記真菌株は、ソホロ脂質生合成経路における第２のグルコシル化工程を担う機能不能のグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１をさらに含む、請求項５に記載の変異した真菌株。
【請求項12】
対称性ボラグルコシドを生産するための、請求項１１に記載の変異した真菌株の使用。
【請求項13】
前記対称性ボラグルコシドはアセチル化されている、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の技術分野
本発明は、新規のバイオサーファクタントの微生物生産の分野に関する。より具体的には、本発明は、２つのソホロース部位がグリコシド結合によって疎水性リンカーに結合しているいわゆる「対称性（アセチル化）ボラフォーム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）ソホロシド」を大量生産するための、機能異常のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能異常のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有する酵母Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａなどの真菌株の使用を開示する。加えて、本発明はさらに、当該酵母を（アセチル化）アルキルソホロシドの生産にも使用できることを開示する。
本発明は、新規のバイオサーファクタントの微生物生産の分野に関する。より具体的には、本発明は、２つのソホロース部位がグリコシド結合によって疎水性リンカーに結合しているいわゆる「対称性（アセチル化）ボラフォーム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）ソホロシド」を大量生産するための、機能異常のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能異常のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有する酵母Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａなどの真菌株の使用を開示する。加えて、本発明はさらに、当該酵母を（アセチル化）アルキルソホロシドの生産にも使用できることを開示する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
糖脂質およびその他の生化学物質を生産するための基盤的な生物として、工業用のソホロ脂質生産酵母Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａを利用できることが示されている（Ｒｏｅｌａｎｔｓら、２０１３；Ｒｏｅｌａｎｔｓら、２０１６）。この点における最新の功績の１つとして、いわゆるボラソホロシド（ｂｏｌａ ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ（ＳＳ））の生産を目的とした当該酵母の再設計が記載されている（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら、２０１８）（図１）。このボラＳＳは、以前に記載されたボラソホロ脂質（ＳＬ）に代わる、より良好な化学的安定性を有する新たな種類の糖脂質である（Ｓｏｅｔａｅｒｔら、２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１６）。実際、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）は、アセチルトランスフェラーゼ（ａｔ）、ラクトナーゼエステラーゼ（ｓｂｌｅ）、およびアルコールオキシダーゼ１（ｆａｏ１）を欠損しているＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株に脂肪族アルコールを供給するとボラ－ソホロシドを生産することを開示している。しかしながら、このボラ－ソホロシドは、ボラ－ソホロシドに加えて、相当量のボラフォームソホロ脂質を含む。このため、ボラフォームソホロ脂質の生産をソホロシド化合物の生産へとさらにシフトさせるために、株のさらなる改善が依然として必要とされている。また、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍにより生産されたボラソホロシドは、非対称性ボラソホロシド（すなわち、１つのソホロース部位が末端付近に結合し、もう１つが末端に結合している）と対称性ボラソホロシド（２つのソホロースが末端に結合している）の混合物である。Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍによって記載される分子は、ａｔ遺伝子（アセチルトランスフェラーゼ）が欠失しているために、アセチル化されていない。
糖脂質およびその他の生化学物質を生産するための基盤的な生物として、工業用のソホロ脂質生産酵母Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａを利用できることが示されている（Ｒｏｅｌａｎｔｓら、２０１３；Ｒｏｅｌａｎｔｓら、２０１６）。この点における最新の功績の１つとして、いわゆるボラソホロシド（ｂｏｌａ ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ（ＳＳ））の生産を目的とした当該酵母の再設計が記載されている（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら、２０１８）（図１）。このボラＳＳは、以前に記載されたボラソホロ脂質（ＳＬ）に代わる、より良好な化学的安定性を有する新たな種類の糖脂質である（Ｓｏｅｔａｅｒｔら、２０１３；Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１６）。実際、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）は、アセチルトランスフェラーゼ（ａｔ）、ラクトナーゼエステラーゼ（ｓｂｌｅ）、およびアルコールオキシダーゼ１（ｆａｏ１）を欠損しているＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株に脂肪族アルコールを供給するとボラ－ソホロシドを生産することを開示している。しかしながら、このボラ－ソホロシドは、ボラ－ソホロシドに加えて、相当量のボラフォームソホロ脂質を含む。このため、ボラフォームソホロ脂質の生産をソホロシド化合物の生産へとさらにシフトさせるために、株のさらなる改善が依然として必要とされている。また、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍにより生産されたボラソホロシドは、非対称性ボラソホロシド（すなわち、１つのソホロース部位が末端付近に結合し、もう１つが末端に結合している）と対称性ボラソホロシド（２つのソホロースが末端に結合している）の混合物である。Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍによって記載される分子は、ａｔ遺伝子（アセチルトランスフェラーゼ）が欠失しているために、アセチル化されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
Ｔａｋａｈａｓｈｉら（２０１６）は、ｆａｏ１遺伝子を欠失させたＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株に脂肪族アルコールを供給した際、野生型よりもアルキルソホロシド生産が増加したことを記載している。しかしながら、この生産増加は、依然として、望ましくない酸性ソホロ脂質およびラクトン酸ソホロ脂質の生産を伴う。
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の記載
本発明は、混入ソホロ脂質（酸性、ラクトン酸、ボラ）を含まない完全対称性ボラソホロシドの生産方法であって、脂肪族尾部の鎖長が少なくとも炭素６個である脂肪族アルコールをＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株に供給する工程を含み、当該真菌株は機能異常のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能異常のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有する、方法に関する。
本発明は、混入ソホロ脂質（酸性、ラクトン酸、ボラ）を含まない完全対称性ボラソホロシドの生産方法であって、脂肪族尾部の鎖長が少なくとも炭素６個である脂肪族アルコールをＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株に供給する工程を含み、当該真菌株は機能異常のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能異常のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有する、方法に関する。
【0005】
用語「完全対称性ボラソホロシド」は、２つのソホロース体またはソホロース単位が脂肪族疎水性リンカーの末端位置（ω位）のみに付着しているボラソホロシド（すなわち、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）により記載される通り、脂肪族疎水性リンカーまたは脂肪族尾部の各側にそれぞれ位置する２つのソホロース単位からなるソホロシド）を指す。
【0006】
脂肪族（疎水性）リンカーまたは脂肪族鎖は、少なくとも６個（すなわち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）の炭素原子を含有し得て、分枝状であり得て、かつ／または不飽和（ｉｎｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を含有し得る。
【0007】
用語「混入ソホロ脂質を含まない」は、混入副生成物としての酸性ソホロ脂質、ボラソホロ脂質、および／またはラクトン酸ソホロ脂質が測定可能な量で生産されないような完全対称性ボラソホロシドの生産を指す。
【0008】
用語「真菌株」は、ソホロ脂質を生産できる酵母株などの特定の真菌の任意の遺伝子バリアントまたはサブタイプを指す。言い換えると、本発明は、当該真菌株が内因的にまたは遺伝子改変後にソホロ脂質を生産できる真菌株である、上述される使用に関する。より具体的には、この真菌株は、以下（これらに限定されない）を含む真菌種である：Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａとして最初に同定されたＣａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａ（Ｇｏｒｉｎら、１９６１）、Ｃ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９７０）、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅ（Ｃｈｅｎら、２００６）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ（Ｔｕｌｌｏｃｈら、１９６８）、Ｃａｎｄｉｄａ ｂａｔｉｓｔａｅ（Ｋｏｎｉｓｈｉら、２００８）、Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌｏｒｉｃｏｌａ（Ｉｍｕｒａら、２０１０）、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｅ、およびＣａｎｄｉｄａ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｙ－２７２０８（Ｋｕｒｚｍａｎら、２０１０）、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｏｉ（Ｋｕｒｔｚｍａｎ、２０１２）、およびＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａクレードのその他の任意の株。より具体的には、本発明は、当該Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａがＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｂｏｍｂｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ２２２１４（ＣＢＳ ６００９）株またはこれに由来する株である、上述される使用に関する。
【0009】
用語「変異した真菌株」は、上記に定義されるとおりの真菌株であって、当該株を変異させて酵素ＣＹＰ５２Ｍ１およびＦＡＯ１を機能不能または機能異常としたものに関する。ＣＹＰ５２Ｍ１の場合には、これは脂肪族アルコール基質のヒドロキシル化が生じ得ないということを意味し、ＦＡＯ１の場合には、脂肪族アルコール上に存在するＯＨ基の対応アルデヒドへの酸化が生じ得ないということを意味する。
【0010】
用語「機能異常の」は、概して、「正常に」機能していない、および／または機能が存在しないもしくは損なわれている、遺伝子またはタンパク質を意味する。したがって、この用語は、ａ）機能が存在しないために機能不能となっている、ｂ）機能は存在するが機能不能となっている、またはｃ）機能は存在するがその機能が弱くなっているもしくは低下している、遺伝子またはタンパク質を指す。用語「機能異常の」は、具体的に、完全な機能を有する酵素ＣＹＰ５２Ｍ１およびＦＡＯ１をコードする能力を失った遺伝子、またはそのＣＹＰ５２Ｍ１活性およびＦＡＯ１活性を完全にもしくは部分的に失ったポリペプチドおよび／もしくはタンパク質を指す。「部分的に」は、当該酵素の活性（当技術分野において周知される任意の方法により測定される）が当該酵素の野生型の活性と比較して有意に低い（ｐ＜０．０５）ことを意味する。
【0011】
上記に定義される「機能異常の」核酸分子は、当該核酸の転写または翻訳を静めるための変異または任意の周知の手段によって得ることができる。当該手段は、核酸断片、マーカー遺伝子、もしくはその他の任意の分子を標的遺伝子の機能性翻訳領域部分もしくは非翻訳領域部分に挿入すること、標的遺伝子の機能性翻訳領域部分もしくは非翻訳領域部分を変異もしくは除去すること、特定のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはこれらの組み合わせを使用すること、または当業者に周知されるその他の任意の手段を含む。
【0012】
用語「変異」は、当該真菌株のゲノムにおける自然変異および／または誘発変異を指す。当該変異は、点変異、欠失、挿入、またはその他の任意の種類の変異で有り得る。
【0013】
同様に、上記に定義される「機能異常の」ポリペプチドは、本発明に係る標的遺伝子の機能を弱くするまたは破壊する任意の（小さな）化合物またはその他の手段によって得ることができる。転写もしくは翻訳を静めるための手段、または本発明に係る標的遺伝子の機能を破壊するための手段、または標的遺伝子の必要なレギュレーター／アクチベータータンパク質の機能を破壊するための手段は、抗体、アミノ酸、ペプチド、小分子、アプタマー、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の開始に使用されるｄｓＲＮＡなどのオリゴリボヌクレオチド配列、またはアンチセンス核酸など（これらに限定されない）の任意の分子の使用を含む。したがって、このような分子は、標的タンパク質もしくはそのアクチベーター／レギュレータータンパク質に結合できる、または、たとえば標的タンパク質もしくはそのアクチベーター／レギュレーターをコードするｍＲＮＡへの結合およびその分解によって標的酵素もしくはそのアクチベーター／レギュレーターの細胞合成を妨げることができる。
【0014】
「機能異常の」ＣＹＰ５２Ｍ１およびＦＡＯ１は、当業者に周知される任意の方法によって得られる、活性が低下した酵素を指す。こうした方法の例としては、点変異の導入、切断したまたは変異させた酵素の使用、阻害剤または抗体の使用、および上述される方法のうち任意のものがあるが、これらに限定されない。
【0015】
したがって、用語「機能異常の」は、適用される真菌株のゲノム中に上述される特定の遺伝子（ｃｙｐ５２Ｍ１およびｆａｏ１）が存在しないことをも指す。
【0016】
当該遺伝子ならびにこれらにコードされる酵素ＣＹＰ５２Ｍ１およびＦＡＯ１は、当技術分野において周知されており、たとえばＷＯ２０１１１５４５２３（ＣＹＰ５２Ｍ１）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（２０１６）（ＦＡＯ１）に記載されている。
【0017】
よって、より具体的には、本発明は、ＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子がノックアウトされている、上述される方法に関する。
【0018】
さらに、本発明は、脂肪族尾部の鎖長が少なくとも炭素６個であるアルコールがヘキサノール、オクタノール、デカノール、ウンデシルアルコール、ラウリルアルコール、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール、パルミトレイルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、オレイルアルコール、ノナデシルアルコール、アラキジルアルコール、またはこれらの混合物である、上述される方法に関する。
【0019】
また、本発明は、完全対称性ボラソホロシドが（テトラ、トリ、ジ、またはモノ）アセチル化されている、上述される方法にも関する。
【0020】
用語「アセチル化」は、具体的に、ボラソホロシドまたはアルキルソホロシド中に存在する２つのソホロース部位のうち一方または両方における６’位または６’’位に「アセチル」官能性を含有するボラソホロシドまたはアルキルソホロシドを意味する。用語「アセチル化」（またはエタノイル化（ｅｔｈａｎｏｙｌａｔｉｏｎ））は、より一般的には、化学化合物にアセチル官能基を導入してアセトキシ基とする反応、すなわち、活性水素原子をアセチル基に置換することを表す。ヒドロキシル基の水素原子をアセチル基（ＣＨ３ＣＯ）で置き換えることを伴う反応によって、特定のエステル（アセテート）が生成する。
【0021】
また、本発明は、機能異常のＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび機能異常のＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼを有するＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株にも関する。
【0022】
この株は、当技術分野において周知される任意の方法によって作製でき、上述される。ＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼとＦＡＯ１のノックアウト株を作製するための具体的な方法は、「実施例」部分の「材料および方法」部分にさらに記載されるが、これらに限定されない。
【0023】
よって、より具体的には、本発明は、ＣＹＰ５２Ｍ１チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびＦＡＯ１脂肪族アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子がノックアウトされている、上述されるＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株に関する。
【0024】
さらに、本発明は、上述される通り、ソホロ脂質を含有する混入脂肪酸を含まない完全対称性ボラソホロシドを生産するための、上述されるＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株の使用に関する。
【0025】
また、本発明は、完全対称性ジオールを生産するための、上述されるＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株の使用にも関する。当該ジオールは、図６中に示されるとおり、対称性ボラソホロシドの前駆体である。
【0026】
さらに、本発明は、当該対称性ボラソホロシドが、アルキルソホロシドをさらに含む混合物の一部である、上述されるＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株の使用に関する。
【0027】
当該混合物ができる理由は、供給した脂肪族アルコールがヒドロキシル化され得るよりも前にいくつかの脂肪族アルコール分子が後の酵素ＵＧＴＡ１およびＵＧＴＢ１（また、さらに参照）の作用でグリコシル化され、次いで分泌されるためである。このために、ボラソホロシドの生産と共に、「未完成」のボラソホロシドまたはその他のボラソホロシド中間生成物としてのアルキルソホロシドが生産される。
【0028】
よって、本発明は、アルキルソホロシドを生産するための、上述されるＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ株などの変異した真菌株の使用にも関する。
【0029】
実際、当該アルキルソホロシドは、供給した脂肪族アルコールの脂肪族鎖のもう一方の側がヒドロキシル化されず、グリコシル化されて、アルキルソホロシドとして分泌された場合に生産される。
【0030】
さらに、本発明は、当該真菌株が、ソホロ脂質／ソホロシド生合成経路における第２のグルコシル化工程を担う機能異常のグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴＢ１）をさらに含む、上述される変異した真菌株に関する。
【0031】
用語「ソホロ脂質生合成経路における第２のグルコシル化工程を担うグルコシルトランスフェラーゼ」は、ＷＯ２０１１１５４５２３中に詳細に記載される。実際、ＷＯ２０１１１５４５２３は、ソホロ脂質経路においては第１のグリコシル化（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例２を参照）および第２のグリコシル化工程（ＷＯ２０１１１５４５２３の実施例３を参照）があり、「第１」のグリコシルトランスフェラーゼ（すなわちＵＧＴＡ１）および「第２」のグリコシルトランスフェラーゼ（すなわちＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＨＭ４４０９７４のＵＧＴＢ１、およびＳａｅｒｅｎｓら、２０１１中にも詳細に記載される（Ｙｅａｓｔ：２７９－２９２））が関与していることを開示する。
【0032】
用語「機能異常の」は上述される。
また、本発明は、対称性ボラグルコシドを生産するための、上述される変異した真菌株の使用にも関する。
また、本発明は、対称性ボラグルコシドを生産するための、上述される変異した真菌株の使用にも関する。
【0033】
用語「対称性ボラグルコシド」は、上述されるとおり、脂肪族疎水性リンカーまたは脂肪族尾部（または鎖）の両側に、２つの末端（ω）グリコシド結合を介してグルコース分子を１つずつ有するグルコシドに関する。
【0034】
本発明は、「アセチル化」対称性ボラグルコシドおよび「非アセチル化」対称性ボラグルコシドの両方に関するが、具体的には、当該対称性ボラグルコシドがアセチル化されている、上述される変異した真菌株の使用に関する。
【0035】
用語「アセチル化」は上述される。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】ソホロ脂質（ＳＬ）（左）およびソホロシド（ＳＳ）（右、灰色で囲ってある）の化学構造。比較としてボラＳＬおよび酸性ＳＬが示されている。ボラソホロ脂質とソホロシドとの間の違いを強調するためにグリコシド結合およびエステル結合が示されており、カルボキシル基を有する酸性ＳＬとの違いを強調するためにアルキルＳＳのメチル基が示されている。Ｒ基は、Ｈまたはアセチル（ＣＯＣＨ３）基を表す。
【図2】脂肪族アルコールオキシダーゼ（ｆａｏ１）ノックアウトカセット、ならびにｕｒａ３栄養要求性Δｃｙｐ５２Ｍ１株のｆａｏ１座へのその組み込みを示す概略図。ｕｒａ３遺伝子をマーカー遺伝子として使用した。ｆａｏ１ノックアウトカセットの正確な組み込みを調べるためのコロニーＰＣＲに用いる各プライマー対が、オレンジ色で示される。
【図3】振とうフラスコにおいて親Δｃｙｐ５２Ｍ１株（○）と比較してΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株（●）を特徴づけするための重要なパラメータ。Ａ）ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、Ｂ）ｐＨ、およびＣ）グルコース濃度（ｇ／Ｌ）について、平均値とそれぞれの標準偏差が示される。培養４８時間後に、疎水性基質として１．８（ｗ／ｖ）％のオレイルアルコールを添加した。
【図4】Ａ）Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株とＢ）Δｃｙｐ５２Ｍ１株とにそれぞれ１．８（ｗ／ｖ）％のオレイルアルコールを供給したもの（いずれも３倍希釈）を比較した、振とうフラスコ実験の最終試料のＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム。ＵＰＬＣ－ＭＳで求めた各質量が、各ピークの上に示される。太字は、アルキルＳＳに対応する質量を示す。生じ得る糖脂質の質量の全体像が表２に与えられる。
【図5】オレイルアルコールを供給した際のΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株におけるアルキルソホロシド（ＳＳ）の生産について提案される経路。（１）脂肪族アルコールオキシダーゼｆａｏ１、（２）脂肪族アルデヒド脱水素酵素ＦＡＤ、（３）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ５２Ｍ１、（４）グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＡ１、（５）グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＢ１、（６）アセチルトランスフェラーゼＡＴ、および（７）ＳＬトランスポーターＭＤＲ。ｆａｏ１遺伝子およびｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子をノックアウトすると（図中の×印）、脂肪族アルコールが、対応する脂肪族アルデヒドにも、対応するジオール（この場合、１，１８－オクタデセンジオール）にも変換されず、また、新たな脂肪酸がヒドロキシル化されることもなく（図中の×印）、次いでＳＬ生合成に入ることもない。このようにして、蓄積されるアルコールはグルコシルトランスフェラーゼＵＧＴＡ１およびＵＧＴＢ１によって直接グルコシル化され、これらは逐次的に、脂肪族アルコールとアルキルグルコシドバックボーンとのそれぞれにグルコース分子を付加する。非アセチル化アルキルＳＳが得られ、これは、アセチルトランスフェラーゼＡＴによってアセチル化されて非アセチル化、モノアセチル化、およびジアセチル化のアルキルＳＳの混合物を生じるべきである。最後に、これらの糖脂質は、おそらくは、野生型ＳＬの分泌を担うＭＤＲトランスポーターによって、細胞外に輸送されると考えられる（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１３）。
【図6】Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を使用しこれにオレイルアルコールを供給する生産経路の全体像。ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子をノックアウトすることによって、経路Ａにおいて示唆されるとおりグリコシル化のみが生じ得てアルキルＳＳのアセチル化混合物が生じ得ることが予期され（アセチル化は２つまで）、アセチル化はＲ基として表される。しかしながら、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａにおけるおそらくはＣＹＰ５２酵素の、別の未知かつ予想外の活性のために、ヒドロキシル化が観察され、これによって、グリコシル化後にアセチル化ボラＳＳが生じた（アセチル化は４つまで）。最終的に、主としてボラＳＳと微量のアルキルＳＳとの混合物がみられた。ヒドロキシル化は、Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）により報告されたΔａｔΔｓｂｌｅΔｆａｏ１株とは異なり、末端のみにおいて生じた。
【図7】Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株により生産され精製されたオレイルアルコールに基づく（Ｃ１８：１）ボラＳＳについて確認された構造組成。１００％末端（ω）ヒドロキシル化化合物のみがみられた。
【図8】異なる第１級アルコール（ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、またはオレイルアルコール）を供給した場合の、培養時間の関数としてのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の、Ａ）ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、およびＢ）グルコース濃度。平均値およびそれぞれの標準偏差が示される。培養４８時間後に、１．８（ｗ／ｖ）％のアルコールをそれぞれ添加した。
【図9】培養４８時間後に１．８（ｗ／ｖ）％の（Ａ）ラウリルアルコール、（Ｂ）ミリスチルアルコール、（Ｃ）パルミチルアルコール、（Ｄ）ステアリルアルコール、または（Ｅ）オレイルアルコールを供給したΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてのエンドＵＰＬＣ－ＥＬＳＤクロマトグラム。すべてのエンドブロスは３倍希釈される。アルキルＳＳ（アセチル化は２つまで可能）およびボラＳＳ（アセチル化は４つまで可能）についての保持時間が示される。太字は、供給した各アルコールがボラＳＳ（濃い灰色）およびアルキルＳＳ（黒）、アルコールおよびアルキルＧＳ（薄い灰色）に組み込まれた場合の糖脂質化合物を示す。保持時間が１分未満のピークは、試料中に糖、タンパク質、および塩として存在する強い親水性の化合物の混合物に対応する。
【図10】培養４８時間後に１．８（ｗ／ｖ）％の各第１級アルコールを供給した場合の、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株によるボラＳＳの生産（Ａ）およびアルキルＳＳの生産（Ｂ）と培養時間との相関。生産は、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって求めたピーク領域の合計（Ｖ．秒）として示される。（Ｃ）培養４８時間後に１．８（ｗ／ｖ）％のラウリルアルコール（黒）、ミリスチルアルコール（濃い灰色）、パルミチルアルコール（中程度の灰色）、ステアリルアルコール（薄い灰色）、またはオレイルアルコール（白色）を供給したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株のエンドブロスの、異なる種類の糖脂質についての相対的なピーク領域（％）を、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤで求めたもの。
【図11】三重ノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１ ΔＵＧＴＢ１）は、（アセチル化）対称性ボラグルコシド（ＧＳ）を生産する。図は、（アセチル化）対称性ボラグルコシドを合成する経路を示す。下図は、実際の（アセチル化）対称性ボラグルコシドＣ１８：１を示す。Ｒ＝ＣＯＣＨ３またはＨ。
【発明を実施するための形態】
【0037】
実施例
材料および方法
株、培地、および培養条件
親株として、ＳＬ欠損Δｃｙｐ５２Ｍ１株Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａを使用した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１３ａ）。Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ（２０１８）による記載と同様にして、ｕｒａ３遺伝子を、自身のプロモーターおよびチロシンキナーゼ（ｔｋ）ターミネーターの制御下でΔｃｙｐ５２Ｍ１株の個々のｆａｏ１座に組み込むことによって、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａの脂肪族アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトを得た。新しい株の形質転換コロニー３つを、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株と平行して、増殖および糖脂質生産の観点において評価した。培養、選択、および形質転換は、Ｌｏｄｅｎｓら（２０１８）により記載されるとおりに行なった。
材料および方法
株、培地、および培養条件
親株として、ＳＬ欠損Δｃｙｐ５２Ｍ１株Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａを使用した（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１３ａ）。Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ（２０１８）による記載と同様にして、ｕｒａ３遺伝子を、自身のプロモーターおよびチロシンキナーゼ（ｔｋ）ターミネーターの制御下でΔｃｙｐ５２Ｍ１株の個々のｆａｏ１座に組み込むことによって、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａの脂肪族アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトを得た。新しい株の形質転換コロニー３つを、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株と平行して、増殖および糖脂質生産の観点において評価した。培養、選択、および形質転換は、Ｌｏｄｅｎｓら（２０１８）により記載されるとおりに行なった。
【0038】
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａを使用する生産実験を、Ｌａｎｇら（２０００）により記載される生産用培地を使用して行なった。振とうフラスコ実験のために、５ｍＬの試験管培養を２４時間（３０℃）行い、その後、振とうフラスコに移した（４％接種）。脂肪族アルコール（オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、またはセチルアルコール、これらを４８時間の培養後に添加）を供給して、生産実験を行なった。また、疎水性アルコールを添加しない場合についても、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株を評価した。各生産実験について、培地からグルコースが枯渇した際に培養を停止した。実験を２回行ない、平均値と標準偏差が示される。
【0039】
分子技術
一般的な技術
ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）により記載されるとおりに、一般的な分子技術を用いた。ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターおよびｐＪＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ベクターに基づく、Ｅ．ｃｏｌｉでクローニングおよび維持したベクターバックボーンから、線形欠失カセットを作製し、クローニング工程は以下に記載される。すべてのプライマー配列が表１中に示され、株構築の視覚的表現が図２中に示される。
一般的な技術
ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）により記載されるとおりに、一般的な分子技術を用いた。ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターおよびｐＪＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ベクターに基づく、Ｅ．ｃｏｌｉでクローニングおよび維持したベクターバックボーンから、線形欠失カセットを作製し、クローニング工程は以下に記載される。すべてのプライマー配列が表１中に示され、株構築の視覚的表現が図２中に示される。
【0040】
表１：Δｃｙｐ５２Ｍ１株におけるＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ脂肪族アルコールオキシダーゼ遺伝子（ｆａｏ１）のノックアウト株の作製に使用したプライマー。
【0041】
【表1】
【0042】
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１ノックアウト株の作製
ｆａｏ１ノックアウトカセットの作製はＶａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）により記載され、これを使用してＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ Δｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿Ｔｔｋ株（または、以下、Δｕｒａ３Δｃｙｐ５２Ｍ１株とよばれる）を形質転換した。ｈｐｈ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｕｓから単離し、これはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ耐性をコードする（Ｇｒｉｔｚ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９８３）。形質転換後、選択ＳＤ培地上でｕｒａ３陽性コロニーを選択した。カセットが正確に組み込めていることを、コロニーＰＣＲによって確認した。新たに作製したΔｕｒａ３：：０ Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿ｔＴＫ Δｆａｏ１：：Ｐｕｒａ３＿ｕｒａ３＿Ｔｔｋ株（以下、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１とよばれる）について、成功したコロニーを３つずつ選択した。
ｆａｏ１ノックアウトカセットの作製はＶａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）により記載され、これを使用してＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ Δｕｒａ３：：０Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿Ｔｔｋ株（または、以下、Δｕｒａ３Δｃｙｐ５２Ｍ１株とよばれる）を形質転換した。ｈｐｈ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｕｓから単離し、これはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ耐性をコードする（Ｇｒｉｔｚ＆Ｄａｖｉｅｓ、１９８３）。形質転換後、選択ＳＤ培地上でｕｒａ３陽性コロニーを選択した。カセットが正確に組み込めていることを、コロニーＰＣＲによって確認した。新たに作製したΔｕｒａ３：：０ Δｃｙｐ５２Ｍ１：：Ｐｇａｐｄ＿ｈｐｈ＿ｔＴＫ Δｆａｏ１：：Ｐｕｒａ３＿ｕｒａ３＿Ｔｔｋ株（以下、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１とよばれる）について、成功したコロニーを３つずつ選択した。
【0043】
下流のプロセスおよび特徴づけ
オレイルを供給した場合にΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株が生産した産物の精製をアルカリ加水分解（ｐＨ１２、５Ｍ ＮａＯＨ、３７℃、１時間）によって行なって、糖脂質を十分に脱アセチル化し、より均一な産物を得た。精製および乾燥させた産物を、ＮＭＲ分析（以下を参照）に供するために、分取液体クロマトグラフィー（ＰＬＣ）によってさらに分画した。
オレイルを供給した場合にΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株が生産した産物の精製をアルカリ加水分解（ｐＨ１２、５Ｍ ＮａＯＨ、３７℃、１時間）によって行なって、糖脂質を十分に脱アセチル化し、より均一な産物を得た。精製および乾燥させた産物を、ＮＭＲ分析（以下を参照）に供するために、分取液体クロマトグラフィー（ＰＬＣ）によってさらに分画した。
【0044】
分取用層クロマトグラフィー（ＰＬＣ）
緑色蛍光指標（Ｆ２５４）（Ａｎａｌｔｅｃｈ）を含浸させたシリカゲルを２ｍｍ被覆したＵｎｉｐｌａｔｅ ２０×２０ｃｍ ＰＬＣプレートを使用した。まず、試料１００ｍｇをＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。続いて、この溶液を、プレートの底から２ｃｍのところに、長い線状に塗布した。ＳＬ混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水、６５／１５／２、ｖ／ｖ／ｖ）を入れた溶媒チャンバーに、このＰＬＣプレートを入れた（Ａｓｍｅｒら、１９８８）。溶媒が展開されてそれぞれ蒸発した後、２５４ｎｍの紫外光下にプレートを置いた。続いて、明確に示されている対象領域をメスでこそげ取り、こそげ取ったシリカゲルを集めた。続いて、ＭｉｌｌｉＱ水 ２０ｍＬをファルコン（ｆａｌｃｏｎ）に添加することによってこの化合物を分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を集め、プロセスを繰り返した。ボラＳＳ産物を含有する全上清をろ過して（カットオフ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標） ＧＶ）、残留しているシリカゲル粒子を除去した。最後に、Ａｌｐｈａ １－４凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ）を使用して水を除去し、ＮＭＲ分析に用いるのに好適な高純度の乾燥産物を得た。
緑色蛍光指標（Ｆ２５４）（Ａｎａｌｔｅｃｈ）を含浸させたシリカゲルを２ｍｍ被覆したＵｎｉｐｌａｔｅ ２０×２０ｃｍ ＰＬＣプレートを使用した。まず、試料１００ｍｇをＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。続いて、この溶液を、プレートの底から２ｃｍのところに、長い線状に塗布した。ＳＬ混合溶媒（クロロホルム／メタノール／水、６５／１５／２、ｖ／ｖ／ｖ）を入れた溶媒チャンバーに、このＰＬＣプレートを入れた（Ａｓｍｅｒら、１９８８）。溶媒が展開されてそれぞれ蒸発した後、２５４ｎｍの紫外光下にプレートを置いた。続いて、明確に示されている対象領域をメスでこそげ取り、こそげ取ったシリカゲルを集めた。続いて、ＭｉｌｌｉＱ水 ２０ｍＬをファルコン（ｆａｌｃｏｎ）に添加することによってこの化合物を分解（ｒｅｓｏｌｖｅ）し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を集め、プロセスを繰り返した。ボラＳＳ産物を含有する全上清をろ過して（カットオフ ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標） ＧＶ）、残留しているシリカゲル粒子を除去した。最後に、Ａｌｐｈａ １－４凍結乾燥機（Ｃｈｒｉｓｔ）を使用して水を除去し、ＮＭＲ分析に用いるのに好適な高純度の乾燥産物を得た。
【0045】
分析技術
増殖の追跡
試料１ｍＬを生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈したものについて、Ｊａｓｃｏ Ｖ ６３０ バイオ分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して培養物の光学濃度（ＯＤ）を６００ｎｍにおいて測定した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）（培養物体積あたりのＣＦＵの対数平均ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表す）を求めることによって、培養実験における酵母細胞の生存能力を評価した（Ｓａｅｒｅｎｓら、２０１１）。一方、風袋を量ったエッペンドルフチューブに入れた発酵試料１ｍＬを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、続いて、細胞ペレットを生理溶液１ｍＬで２回洗浄することによって、細胞の乾燥重量（ＣＤＷ）を求めた。残った細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間入れた後、秤量した。空のエッペンドルフチューブの重量を差し引いて、ＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を計算した。
増殖の追跡
試料１ｍＬを生理溶液（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で希釈したものについて、Ｊａｓｃｏ Ｖ ６３０ バイオ分光光度計（Ｊａｓｃｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して培養物の光学濃度（ＯＤ）を６００ｎｍにおいて測定した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）（培養物体積あたりのＣＦＵの対数平均ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）として表す）を求めることによって、培養実験における酵母細胞の生存能力を評価した（Ｓａｅｒｅｎｓら、２０１１）。一方、風袋を量ったエッペンドルフチューブに入れた発酵試料１ｍＬを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、続いて、細胞ペレットを生理溶液１ｍＬで２回洗浄することによって、細胞の乾燥重量（ＣＤＷ）を求めた。残った細胞ペレットを７０℃のオーブンに５日間入れた後、秤量した。空のエッペンドルフチューブの重量を差し引いて、ＣＤＷ（ｇ／Ｌ）を計算した。
【0046】
グルコース濃度の追跡
２７００ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用し、または超高性能液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）を使用し、これを蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）に接続して、グルコース濃度を求めた。ＵＰＬＣ分析には、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、７５％アセトニトリルおよび０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）の均一（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の流速（０．５ｍＬ／分）を適用した（５分／試料）。ＥＬＳ検出のために、噴霧器を１５℃に冷却し、ドリフト管の温度を５０℃に維持した。ＥＬＳ検出における増加（ｇａｉｎ）を１００としたところ、グルコース０ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間に線形の範囲がみられた（Ｅｍｐｏｗｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）。グルコース消費を表現するために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得たグルコース濃度に線形の曲線をフィットさせ、個々の傾きをとってグルコース消費率（ｇ／Ｌ．時間）として示した。
２７００ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＹＳＩ Ｉｎｃ．）を使用し、または超高性能液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）を使用し、これを蒸発光散乱検出器（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ）に接続して、グルコース濃度を求めた。ＵＰＬＣ分析には、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を３５℃で使用し、７５％アセトニトリルおよび０．２％トリエチルアミン（ＴＥＡ）の均一（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の流速（０．５ｍＬ／分）を適用した（５分／試料）。ＥＬＳ検出のために、噴霧器を１５℃に冷却し、ドリフト管の温度を５０℃に維持した。ＥＬＳ検出における増加（ｇａｉｎ）を１００としたところ、グルコース０ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間に線形の範囲がみられた（Ｅｍｐｏｗｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）。グルコース消費を表現するために、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤによって得たグルコース濃度に線形の曲線をフィットさせ、個々の傾きをとってグルコース消費率（ｇ／Ｌ．時間）として示した。
【0047】
糖脂質の分析
純粋エタノール１ｍＬと発酵ブロス０．５ｍＬとの混合物を５分間激しく振とうすることによって、糖脂質分析用の試料を調製した。続いて、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを除去し、ＰＴＦＥフィルタ（カットオフ ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用して上清をろ過し、５０％エタノール（特記しない限り）中に十分に希釈し、その後、（超）高圧液体クロマトグラフィー質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）および（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）で分析した。
純粋エタノール１ｍＬと発酵ブロス０．５ｍＬとの混合物を５分間激しく振とうすることによって、糖脂質分析用の試料を調製した。続いて、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを除去し、ＰＴＦＥフィルタ（カットオフ ０．２２μｍ、Ｎｏｖｏｌａｂ）を使用して上清をろ過し、５０％エタノール（特記しない限り）中に十分に希釈し、その後、（超）高圧液体クロマトグラフィー質量分析（（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＭＳ）および（Ｕ）ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）で分析した。
【0048】
ＬＣ（島津）をＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＬＣ）検出システムに接続して使用して、ＨＰＬＣ－ＭＳを行なった。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ－１８ Ｅｎｄｃａｐｐｅｄ １００－４．６ｍｍカラム（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を３０℃で用いて、異なる成分を極性によって分離した。ＬＣ－ＭＳ法では、０．５％酢酸を含むＭｉｌｌｉＱと純粋アセトニトリル（ＡＣＮ）との２種の溶媒に基づく勾配溶出を用いる。分析の間、流速１ｍＬ／分を適用した。勾配は５％アセトニトリルから開始して、４０分かけて９５％まで線形に増加させる。この後、９５％アセトニトリルをさらに１０分間維持し、その後５分間で５％アセトニトリルに戻す。試料１つあたりの総分析時間は６０分間／試料である。ＭＳのスキャン範囲は２１５～１１００ｇ／ｍｏｌに設定した。ＨＰＬＣ－ＭＳについて記載したものと同様の条件を用い、Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２０００ＥＳ ＥＬＳＤ（Ａｌｌｔｅｃｈ）と接続したものを使用して、４０℃においてＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を行なった。その他の条件はすべて、ＨＰＬＣ－ＭＳについて記載したものと同様である。
【0049】
Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）およびＡｃｑｕｉｔｙ ＥＬＳＤ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用し、ＵＰＬＣ－ＭＳの場合と同じカラムおよび分析方法を用いて、ＵＰＬＣ－ＥＬＳＤ分析を行なった。ＥＬＳＤ検出のために、噴霧器を１２℃に冷却し、ドリフト管の温度を５０℃に維持し、増加を２００に設定した。糖脂質を定量するために、精製産物の希釈系列を調製した。入手可能なＣ１８：１アセチル化ボラＳＳ精製バッチ（バッチ番号 ＳＬ２４Ａ）および精製アセチル化Ｃ１６：０アルキルＳＳバッチ（バッチ番号 ａＡｌｋＣ１６＿２）を使用して、ボラＳＳおよびアルキルＳＳをそれぞれ定量した。
【0050】
一方、Ａｃｃｅｌａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＵＰＬＣ－ＭＳを行なった。糖脂質分析には、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）と、流速０．６ｍＬ／分において、０．５％酢酸（ＭｉｌｌｉＱ中）（Ａ）および１００％アセトニトリル（Ｂ）に基づく勾配溶出系とを適用した。方法は以下の通りである：最初の６．８分間で初濃度５％ Ｂ（９５％ Ａ）を９５％ Ｂ（５％ Ａ）まで線形に増加させ、次の１．８分間で線形に減少させて５％ Ｂ（９５％ Ａ）に戻す。続いて、流れが終了するまで５％ Ｂ（９５％ Ａ）を維持する（１０分／試料）。陰イオンモードを用い、試料２μＬを注入した。加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源を用いてＭＳ検出を行ない、条件は、２１５～１３００ｍ／ｚの範囲の質量を定性的に検出できるように設定した。
【0051】
１Ｈ／ＢＢ ｚ－勾配プローブ（ＢＢＯ、５ｍｍ）を備えるＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩを使用して、すべての１Ｈおよび１３ＣのＮＭＲスペクトルを４００ＭＨｚおよび１００．６ＭＨｚのそれぞれにおいて記録した。ＤＭＳＯ－［Ｄ６］を、溶媒として、および内部化学シフト標準（１Ｈには２．５０ｐｐｍ、１３Ｃには３９．５２ｐｐｍ）として使用した。ＴＯＰＳＰＩＮ ３．２ソフトウェアを使用して、すべてのスペクトルを処理した。Ｂｒｕｋｅｒパルスプログラムライブラリにおいて入手可能な標準配列から、アタッチドプロトンテスト（Ａｔｔａｃｈｅｄ Ｐｒｏｔｏｎ Ｔｅｓｔ、ＡＰＴ）、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、およびＨＳＱＣのスペクトルを得た。文献（Ｇｈｅｙｓｅｎ、Ｍｉｈａｉ、Ｃｏｎｒａｔｈ、＆Ｍａｒｔｉｎｓ、２００８；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００６）に従って、個別仕様の設定を使用した（ＨＭＢＣ（３２スキャン）、ＴＯＣＳＹ（ＭＬＥＶスピンロック １００ミリ秒、混合時間（ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅ） ０．１秒、待ち時間（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｅｌａｙ） １．２７秒、１６スキャン）、およびＨ２ＢＣ（混合時間 ２１．８ミリ秒、待ち時間 １．５秒、１６スキャン））。
【0052】
統計学的分析
２つの異なる群を比較する際には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェアを使用し、信頼水準９５％にて、ウェルチの検定を行なった。複数の群の比較には、分散の分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、ボンフェローニの多重比較検定補正を用い、信頼水準９５％にて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェアを使用した。ｐＨ、ＣＦＵ、ＯＤ、およびグルコース消費といったパラメータには、酵母細胞を静止期に取得した際（４８時間の培養後）の平均値をとった。一般的に、グラフ中に示されるデータは、実験を２回繰り返した平均および標準偏差である（特記しない限り）。
２つの異なる群を比較する際には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェアを使用し、信頼水準９５％にて、ウェルチの検定を行なった。複数の群の比較には、分散の分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、ボンフェローニの多重比較検定補正を用い、信頼水準９５％にて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０４ソフトウェアを使用した。ｐＨ、ＣＦＵ、ＯＤ、およびグルコース消費といったパラメータには、酵母細胞を静止期に取得した際（４８時間の培養後）の平均値をとった。一般的に、グラフ中に示されるデータは、実験を２回繰り返した平均および標準偏差である（特記しない限り）。
【0053】
結果
ノックアウト株の構築
脂肪族アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトカセット（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）中に記載される）を使用して、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｕｒａ３株を形質転換した。選択用ＳＤプレート上でｕｒａ３＋コロニーを選択した後、２つのプライマー組み合わせ（表１を参照）を使用するコロニーＰＣＲを行なうことによって、ノックアウトカセットの両側における正確な組み込みを制御した。さらなる特徴づけのために、新たに作製したΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の正確なコロニーを３つ選択した。当該新たな株の、選択した３つの形質転換体は、ＯＤ、ＣＦＵ、グルコース消費、および糖脂質生産の観点において互いに類似する挙動を示した。したがって、次のセクションでは、増殖、ｐＨ、グルコース消費、および糖脂質生産の観点からの親Δｃｙｐ５２Ｍ１株との比較について、１つのコロニーのみについて検討する。
ノックアウト株の構築
脂肪族アルコールオキシダーゼｆａｏ１ノックアウトカセット（Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら（２０１８）中に記載される）を使用して、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｕｒａ３株を形質転換した。選択用ＳＤプレート上でｕｒａ３＋コロニーを選択した後、２つのプライマー組み合わせ（表１を参照）を使用するコロニーＰＣＲを行なうことによって、ノックアウトカセットの両側における正確な組み込みを制御した。さらなる特徴づけのために、新たに作製したΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の正確なコロニーを３つ選択した。当該新たな株の、選択した３つの形質転換体は、ＯＤ、ＣＦＵ、グルコース消費、および糖脂質生産の観点において互いに類似する挙動を示した。したがって、次のセクションでは、増殖、ｐＨ、グルコース消費、および糖脂質生産の観点からの親Δｃｙｐ５２Ｍ１株との比較について、１つのコロニーのみについて検討する。
【0054】
ノックアウト株の最初の特徴づけ
野生型Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａについては、ナタネ油（ｃｏｌｚａ ｏｉｌ）（オレイン酸６０～８０％）または純粋オレイン酸のＳＬタイターが最も良好である（Ａｓｍｅｒら、１９８８；Ｒａｕら、２００１）（すなわち、炭素鎖長Ｃ１８の疎水性基質）。よって、新たに作製したｆａｏ１ノックアウト株を、まず、Ｃ１８脂肪族アルコール（すなわち、オレイルアルコール（Ｃ１８：１）、疎水性基質として）を入れた振とうフラスコで評価した。
野生型Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａについては、ナタネ油（ｃｏｌｚａ ｏｉｌ）（オレイン酸６０～８０％）または純粋オレイン酸のＳＬタイターが最も良好である（Ａｓｍｅｒら、１９８８；Ｒａｕら、２００１）（すなわち、炭素鎖長Ｃ１８の疎水性基質）。よって、新たに作製したｆａｏ１ノックアウト株を、まず、Ｃ１８脂肪族アルコール（すなわち、オレイルアルコール（Ｃ１８：１）、疎水性基質として）を入れた振とうフラスコで評価した。
【0055】
増殖、ｐＨ、およびグルコース消費
ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、ｐＨ、およびグルコース消費などの重要なパラメータが図３中に示される。評価した２回分の平均値および標準偏差が示される。ＯＤ６００の展開は示されていない、というのは、測定におけるオレイルアルコール基質との干渉のためである。培養時間の関数としてのｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）値の観点において（図３Ａ）、新たな株と参照株との間で有意に異なるＣＦＵ値は得られなかった。観察されたｐＨの低下は等しかった（図３Ｂ）。図３Ｃ中に示されるとおり、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株および親株のグルコース消費率は類似している（０．４７±０．０６ｇ／Ｌ．時間、および０．４７±０．０１ｇ／Ｌ．時間）。
ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）、ｐＨ、およびグルコース消費などの重要なパラメータが図３中に示される。評価した２回分の平均値および標準偏差が示される。ＯＤ６００の展開は示されていない、というのは、測定におけるオレイルアルコール基質との干渉のためである。培養時間の関数としてのｌｏｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）値の観点において（図３Ａ）、新たな株と参照株との間で有意に異なるＣＦＵ値は得られなかった。観察されたｐＨの低下は等しかった（図３Ｂ）。図３Ｃ中に示されるとおり、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株および親株のグルコース消費率は類似している（０．４７±０．０６ｇ／Ｌ．時間、および０．４７±０．０１ｇ／Ｌ．時間）。
【0056】
糖脂質生産
図４中に示される、評価した株の糖脂質生産をみると、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株とは明らかに異なる生産プロファイルが観察できる。
図４中に示される、評価した株の糖脂質生産をみると、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株について、Δｃｙｐ５２Ｍ１親株とは明らかに異なる生産プロファイルが観察できる。
【0057】
親Δｃｙｐ５２Ｍ１株（図４Ｂ）は、糖脂質を全く生産しなかった（または、生産したが非常に少量であった）（＜７分）。それより後の保持時間（＞７分間）では、オレイン酸に対応する小さなピーク（２８２ｇ／ｍｏｌ）が確認できる（Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株で観察されるものと類似）。アルキルＳＳはほとんど検出されず、このことは、供給したオレイルアルコールが、大体、依然として機能できている（ＦＡＯがノックアウトされていないため）ω酸化経路によって酸化されて、対応するオレイン酸となっていることを示す。続いて、ｃｙｐ５２Ｍ１ノックアウトによりオレイン酸のヒドロキシル化が阻害されているためにグルコシルトランスフェラーゼはこの脂肪酸をグリコシル化できず、そのため、オレイン酸が蓄積する、またはβ酸化によって分解される。
【0058】
親株とは異なり、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株（図４Ａ）については、糖脂質生産が明らかに観察される。保持時間３．０～４．５分で顕著な量の糖脂質がみられ、５．５～６．５分では微量がみられた。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析後、驚くべきことに、初期の保持範囲（３～４．５分間）における質量は、目的としていたアルキルＳＳ（５５０～７００ｇ／ｍｏｌの範囲）ではなく、実際にはボラＳＳ（９００～１１００ｇ／ｍｏｌの範囲）に対応することがわかった。実際、アルキルＳＳが検出されたが、上述されるように５．５～６．５分において微量のみであった。こうしたボラＳＳの合成は、理論的には（先行技術に基づけば）この株では起こり得ない、というのは、ｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子が欠失しているために、供給した脂肪族アルコールのヒドロキシル化を経由するジオール形成（図５を参照）（ボラＳＳの合成に必要）が起こり得ないためである。実際、親株ではこうした作用は観察されず（図４Ｂを参照）、当技術分野において言及されるとおり、実際、オレイルアルコール（図４Ｂを参照）またはオレイン酸および／もしくはナタネ油（ｒａｐｅｓｅｅｄ ｏｉｌ）（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１３）に対する酸化／ヒドロキシル化活性を全く示さない。
【0059】
よって、驚くべきことに、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株は、オレイルアルコールを供給した場合に主として、初期の保持時間（３．０～４．５分）に対応するボラＳＳを生産する（図６）。この株ではＡＴ遺伝子をノックアウトしていないため（ボラＳＳを生産するよう設計された株（Ｓｏｅｔａｅｒｔら、２０１３；Ｖａｎ Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍら、２０１８）とは対照的である）、上述されるこの新しい株についてはボラＳＳのアセチル化も観察される。４．４分のテトラアセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳ（１１００ｇ／ｍｏｌ）はボラＳＳに最も豊富に含まれる成分であり、続いて豊富なのはトリアセチル化物およびジアセチル化物（それぞれ、１０１６ｇ／ｍｏｌ、および１０５８ｇ／ｍｏｌ）である。また、非アセチル化およびモノアセチル化のＣ１８：１ボラＳＳも検出された（それぞれ、９３２ｇ／ｍｏｌ、および９７４ｇ／ｍｏｌ）。モノアセチル化、ジアセチル化、およびトリアセチル化のボラＳＳが４．０５分および４．１５分という２つの異なるピークで現れたが、このことは恐らく、文献（Ｄａｖｉｌａら、１９９３；Ｓａｅｒｅｎｓら、２０１１；Ｓａｅｒｅｎｓ、２０１２）中に示される酸性ＳＬについて示されるのと同様に、この分子のアセチル化パターンが異なることによって説明される。また、Ｃ１８：１ボラＳＳに加えて、供給したオレイルアルコール基質のＣ１６の量から生じた、Ｃ１６：０に基づくＳＳ（９０６ｇ／ｍｏｌ）が検出される（基質中に混入量２～１０％のセチルアルコールまたは１－ヘキサデカノールが存在する）。また、微量のアルキルＳＳも生産され、主としてＣ１８：１の非アセチル化、モノアセチル化、およびジアセチル化のアルキルＳＳが検出され（それぞれ、５９２／６３４／６７６ ｇ／ｍｏｌ）、また、極微量のＣ１６：０アルキルＳＳもみられた（それぞれ、５６６／６０８／６５０ ｇ／ｍｏｌ）。
【0060】
よって、供給したアルコールは、単に蓄積してアルキルＳＳとなるのではなく、有利なことに、対応するジオールにヒドロキシル化され、２回のＵＧＴＡ１およびＵＧＴＢ１のグリコシル化サイクルを経てボラＳＳを生じるようである（図６を参照）。アルコールを供給した親株はオレイルアルコールを供給した際にこれらの化合物を生産しなかったことから、ｃｙｐ５２Ｍ１およびｆａｏ１のノックアウト組み合わせが非常に重要であるようである。
【0061】
生産された化合物を詳細に特徴づけするために、記載されるように、混合物からボラＳＳおよびアルキルＳＳを精製した。
【0062】
ＮＭＲ構造分析
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株のブロスに由来する精製した非アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳの標準について、ＮＭＲ分析を行なった。
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株のブロスに由来する精製した非アセチル化Ｃ１８：１ボラＳＳの標準について、ＮＭＲ分析を行なった。
【0063】
驚くべきことに、ＮＭＲ分析により、図７中に示されるように、生産されたボラＳＳにおいて２つのソホロース部位が疎水性リンカーに末端（ω）のみで結合していることが示された。よって、化学式がＣ４２Ｈ７６Ｏ２２である完全対称性の糖脂質分子が得られる。
【0064】
鎖長の異なる脂肪族アルコールの供給
予期しないことに、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株にオレイルアルコールを供給した場合に、ボラＳＳまたはアルキルＳＳのいずれも均一には生産されなかった。その代わりに、この２つの混合物がみられ、新たな糖脂質の大部分は（アセチル化）ボラＳＳであり、アルキルＳＳはごく微量生産された。テトラアセチル化ボラＳＳの生産は予期していなかった、というのは、今まで、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａでの糖脂質生産に関与する唯一の酵素がＣＹＰ５２Ｍ１酵素であると考えられていたためである。第１級アルコールの鎖長が糖脂質生産に及ぼす影響を評価するために、異なる基質をΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株に供給した。平行して親株Δｃｙｐ５２Ｍ１についても評価した。Ｄａｖｉｌａら（１９９４）がアルカンについて報告しているのと同様に、鎖長１２～１８の中鎖アルコールおよび長鎖アルコールを選択した。上述される実験と同様に、４８時間培養した後で疎水性基質を添加した。
予期しないことに、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株にオレイルアルコールを供給した場合に、ボラＳＳまたはアルキルＳＳのいずれも均一には生産されなかった。その代わりに、この２つの混合物がみられ、新たな糖脂質の大部分は（アセチル化）ボラＳＳであり、アルキルＳＳはごく微量生産された。テトラアセチル化ボラＳＳの生産は予期していなかった、というのは、今まで、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａでの糖脂質生産に関与する唯一の酵素がＣＹＰ５２Ｍ１酵素であると考えられていたためである。第１級アルコールの鎖長が糖脂質生産に及ぼす影響を評価するために、異なる基質をΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株に供給した。平行して親株Δｃｙｐ５２Ｍ１についても評価した。Ｄａｖｉｌａら（１９９４）がアルカンについて報告しているのと同様に、鎖長１２～１８の中鎖アルコールおよび長鎖アルコールを選択した。上述される実験と同様に、４８時間培養した後で疎水性基質を添加した。
【0065】
増殖、ｐＨ、およびグルコース消費
ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはオレイルアルコールを添加しても、Δｃｙｐ５２Ｍ１株のＣＦＵ値にはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株ほど大きな影響を及ぼさなかった（図８）。しかしながら、ラウリルアルコールを添加した場合には、その他の供給した基質のいずれとも異なって、ＣＦＵの著しい低下が認められた（図８Ａ）。セチルアルコールまたはステアリルアルコール（０．４８ｇ／Ｌ．時間 対 ０．３８ｇ／Ｌ．時間）と比較して、ミリスチルアルコールまたはオレイルアルコールを供給した場合に著しく高いグルコース消費率がみられた。ラウリルアルコールの添加後（接種の４８時間）、グルコース消費が停止した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてのみ、基質添加後１００時間でグルコース消費が再度開始し（０．３３ｇ／Ｌ．時間）、グルコースの全量が枯渇するまで継続した。これは、ＣＦＵの展開に準じる（図８Ａ）。
ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはオレイルアルコールを添加しても、Δｃｙｐ５２Ｍ１株のＣＦＵ値にはΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株ほど大きな影響を及ぼさなかった（図８）。しかしながら、ラウリルアルコールを添加した場合には、その他の供給した基質のいずれとも異なって、ＣＦＵの著しい低下が認められた（図８Ａ）。セチルアルコールまたはステアリルアルコール（０．４８ｇ／Ｌ．時間 対 ０．３８ｇ／Ｌ．時間）と比較して、ミリスチルアルコールまたはオレイルアルコールを供給した場合に著しく高いグルコース消費率がみられた。ラウリルアルコールの添加後（接種の４８時間）、グルコース消費が停止した。Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についてのみ、基質添加後１００時間でグルコース消費が再度開始し（０．３３ｇ／Ｌ．時間）、グルコースの全量が枯渇するまで継続した。これは、ＣＦＵの展開に準じる（図８Ａ）。
【0066】
また、疎水性基質を添加しない場合のΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株についても調べた。ＣＦＵおよびグルコース消費は、アルコール（ラウリルアルコールを除く）を供給した培養物と比べて著しく異なるものではなかった。
【0067】
糖脂質生産
第１級アルコールの添加前、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１培養物およびΔｃｙｐ５２Ｍ１培養物のいずれも、定量可能な糖脂質生産を示さなかった。これは予期されたことであった、というのは、ｃｙｐ５２Ｍ１がノックアウトされているために、新たな脂肪酸が糖脂質生産経路に入ることはできず、新たな糖脂質生産を開始するためにはこのアルコールを供給しなければならないためである。
第１級アルコールの添加前、Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１培養物およびΔｃｙｐ５２Ｍ１培養物のいずれも、定量可能な糖脂質生産を示さなかった。これは予期されたことであった、というのは、ｃｙｐ５２Ｍ１がノックアウトされているために、新たな脂肪酸が糖脂質生産経路に入ることはできず、新たな糖脂質生産を開始するためにはこのアルコールを供給しなければならないためである。
【0068】
Δｃｙｐ５２Ｍ１株については、疎水性基質を添加した後、ＥＬＳＤでの分析後にピークは確認できず、このことは、予期されたことと、以前（Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ、２０１０）に記載されたこととに準じるものであった。供給した異なる第１級アルコールについてのΔｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株の糖脂質最終生産プロファイルをＵＰＬＣ－ＥＬＳＤで分析したものが、図９中に示される。供給した各アルコールについて、アセチル化のボラＳＳおよびアルキルＳＳの混合物が生産された。予期されたように、生産されたすべての糖脂質は、供給したアルコールに直接由来していた。これはｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子がノックアウトされていることにより、任意の新たな脂肪酸（主としてＣ１６～Ｃ１８）または発生させた脂肪酸（アルコールの酸化が起こり得る）の実施が除かれるためである。
【0069】
ラウリルアルコールについては、非アセチル化からテトラアセチル化までのＣ１２：０ボラＳＳが検出され得た（５８０／９３４／９７６／１０１８ ｇ／ｍｏｌ）。Ｃ１２：０ボラＳＳに加えて、それより後の保持時間において非アセチル化からジアセチル化のＣ１２：０アルキルＳＳ（５１０／５５２／５９４ ｇ／ｍｏｌ）もみられた。しかしながら、クロマトグラムにおける最も豊富なピークは、モノアセチル化アルキルＳＳのピークとジアセチル化アルキルＳＳのピークの間にあるＣ１２：０アルキルグルコシド（ＧＳ）（３４８ｇ／ｍｏｌ）に対応していた。
【0070】
ミリスチルアルコールおよびセチルアルコールについては、非常に類似する生産プロファイルが観察された。Ｃ１４：０またはＣ１６：０のボラＳＳ（３．００～４．００分、および３．００～４．３分）およびＣ１４：０またはＣ１６：０のアルキルＳＳ（４．５～５．８分、および５．２～６．５分）に対応する明瞭な保持時間を、それぞれのアセチル化とともに見分けることができた。ＭＳにより、Ｃ１４：０およびＣ１６：０の非アセチル化アルキルＧＳ（３７６ｇ／ｍｏｌ、および４０４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。微量のジアセチル化のＣ１４：０またはＣ１６：０のアルコールＳＳ（またはボラＧＬ）（６３８ｇ／ｍｏｌ、または６６６ｇ／ｍｏｌ）が検出できた。
【0071】
Δｃｙｐ５２Ｍ１Δｆａｏ１株にステアリルアルコールを供給した場合、アセチル化Ｃ１８：０ボラＳＳ（９３４／９７６／１０１８／１０６０／１１０２ ｇ／ｍｏｌ）およびＣ１８：０アルキルＳＳ（５９４／６３６／６７８ ｇ／ｍｏｌ）の混ざった生産が再度観察される。さらに、微量のＣ１８：０アルキルＧＳ（４３２ｇ／ｍｏｌ）が検出された。同様に、ミリスチルアルコールおよびセチルアルコールについては、ジアセチル化Ｃ１８：０アルコールＳＳ（またはボラＧＬ）（６９４ｇ／ｍｏｌ）が検出された。
【0072】
オレイルアルコールを添加した結果、上述される糖脂質生産プロファイルが得られた。また、非アセチル化、モノアセチル化、およびジアセチル化のＣ１６：０およびＣ１８：１のアルキルＳＳ（それぞれ、５６６／６０８／６５０ ｇ／ｍｏｌ、および５９２／６３４／６７６ ｇ／ｍｏｌ）ならびに非アセチル化のＣ１６：０およびＣ１８：１のアルキルＧＳ（４０４ｇ／ｍｏｌ、および４３０ｇ／ｍｏｌ）も検出された。同様に、その他のアルコールについては、ジアセチル化Ｃ１８：１アルコールＳＳ（またはボラＧＬ）（６９２ｇ／ｍｏｌ）も検出された。
【0073】
対称性ボラグルコシドを生産するための三重ノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１ ΔＵＧＴＢ１）の作製。
【0074】
三重ノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１ ΔＵＧＴＢ１）を作製するために、Ｌｏｄｅｎｓら（２０１９）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：１－１３）により記載される通りに、まず、二重ノックアウト株（ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１）からｕｒａ３マーカーを除去した。Ｓａｅｒｅｎｓら（２０１１）により記載されるプラスミド「ｐＧＫＯ ｕｇｔＢ１」から、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびにプライマー対としてＧＴＩＩ－４７２ＦおよびＧＴＩＩ＋２３９Ｒ（ＧＴＩＩ－４７２（順方向：５’－ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣ－３’（配列番号１９））／ＧＴＩＩ＋２３９（逆方向：５’－ＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＡＧ－３’（配列番号２０）））を使用して、ｕｒａ３マーカーを有する線形のＵＧＴＢ１ノックアウトカセットを作製した。この欠失カセットをｕｒａ３陰性ΔＣＹＰ５２Ｍ１ ΔＦＡＯ１株中に形質転換して、正確な形質転換体を選択した。図１１中に示すように、得られる株は（アセチル化）対称性ボラグルコシドを生産する。
【0075】
引用文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】