▶ クローダ インターナショナル パブリック リミティド カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-14
(45)【発行日】2024-06-24
(54)【発明の名称】ワクチンアジュバント効果を有するフィラメント状ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 47/46 20060101AFI20240617BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240617BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240617BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240617BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240617BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240617BHJP
【ＦＩ】
A61K47/46
A61K9/14
A61K39/39
A61K47/28
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021534730
(86)(22)【出願日】2019-12-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 EP2019085444
(87)【国際公開番号】W WO2020127115
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2022-08-23
(31)【優先権主張番号】18213540.0
(32)【優先日】2018-12-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】506352278
【氏名又は名称】クローダ インターナショナル パブリック リミティド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】コーフェイ フー
(72)【発明者】
【氏名】ラウラン ドロクス
(72)【発明者】
【氏名】イーレク リンブラズ
【審査官】梅田 隆志
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５３０２１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】LENDEMANS, D.G., et al.，The Journal of pharmacy and pharmacology，2005年，Vol. 57，No. 6，p.729-733.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コレステロール及びキラヤサポニンを含むナノ粒子であって、キラヤサポニンとコレステロールの比が１２：１～１８：１であり、前記ナノ粒子が糸状（フィラメント状）であり、
前記糸状ナノ粒子が４～８ｎｍのフィラメント径又は厚さを有し、
前記粒子が３５～４５ｎｍの長さをもつ末端が閉じていないひも状のナノ粒子から構成される形態Ｂを含む、ナノ粒子。
【請求項2】
前記粒子が１０～１５ｎｍの半径をもつ、閉じた、実質的に環状のナノ粒子から構成される形態Ａを更に含み、かつ、前記キラヤサポニンとコレステロールの混合物中の形態Ａの形態Ｂに対する比が、２０：８０～４５：５５である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
キラヤサポニンとコレステロールの間の比が、１４：１～１７：１である、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項4】
抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物及び食品関連化合物から選択される少なくとも１つの両親媒性分子又は疎水性分子をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の１つ又は複数のナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項6】
抗がん剤、白金配位化合物、タキサン化合物、カンプトテシン化合物、抗腫瘍性ビンカアルカロイド、抗腫瘍性ヌクレオシド、ナイトロジェンマスタード又はニトロソウレアアルキル化剤、抗腫瘍性アントラサイクリン、トラスツズマブ及び抗腫瘍性ポドフィロトキシン、代謝拮抗剤、ステロイド、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）の阻害剤、シタラビン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、トリセル及びトラベクチジンからなる群より選択される少なくとも１つの薬学的に活性な化合物をさらに含み、該活性な化合物が前記ナノ粒子に組み込まれても、又は前記組成物と混合されていてもよい、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
がんの治療に使用するための、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、賦形剤、アジュバント及び／又は担体をさらに含む医薬組成物として製剤化された請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項8】
次のステップ：ａ．１つ又は複数のＣ1－Ｃ6アルコール、Ｃ2－Ｃ6ケトン、Ｃ1－Ｃ3カルボン酸のＣ1－Ｃ6アルキルエステル、及び直鎖又は環状Ｃ4－Ｃ8エーテルから選択される有機溶媒中のコレステロールの非水溶液から前記溶媒を除去することによって、反応容器の内面及び／又は前記反応容器内に位置する水不溶性の多孔質体の表面上にコレステロールの層を調製するステップ、
ｂ．１つ又は複数の塩の溶液、緩衝溶液、又は無塩蒸留水でありうる、予め７０℃±５℃に熱せられている水性反応媒体を加えること・ステップ、
ｃ．キラヤサポニンの溶液を、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えて、１２：１～１８：１の（重量／重量）キラヤサポニン：コレステロールの最終比を得るステップ、
ｄ．反応混合物を７０℃±５℃で約１時間熱するステップ、
ｅ．反応混合物を４℃±２℃に一晩冷却し、形成された粒子を分離し、過剰キラヤサポニンを除去するステップ、
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子を製造する方法。
【請求項9】
前記有機溶媒がエタノール及び／又はアセトンである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記有機溶媒が蒸発によって除去される、請求項８又は９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記水性反応媒体が酢酸緩衝液である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記水性反応媒体がＰＢＳ緩衝液である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
過剰キラヤサポニンの前記除去が、好適なゲルろ過媒体上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって行われる、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ステロール及びトリテルペノイドサポニン、例えばキラヤサポニンから選択されるキラヤ・サポナリア・モリーナ（Quillaja saponaria Molina）に由来する成分などを含むフィラメント状又は糸状のナノ粒子に関する。より具体的には、本発明は、ワクチン、がん治療及び薬物送達における前記（said）フィラメント状ナノ粒子の使用、それら粒子の製造方法、並びにその使用、例えばヒトへの使用と獣医学的使用の両方に向けたワクチンアジュバントとしての使用などに関する。
【背景技術】
【0002】
ワクチンには、動物及びヒトにおいて感染症からの長期保護を提供するために、免疫増強剤及び送達システムを含む最適なアジュバントが必要である。油乳濁液、リポ多糖類、ポリマー、サポニン、リポソーム、サイトカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、細菌毒素などは、研究中のワクチン又は認可されたワクチンで既に実際に使われている一般的なアジュバントである。サポニンをベースとするアジュバントは、細胞を介した免疫系を刺激し、かつ抗体産生を増強する能力を有し、少量しかアジュバント活性に必要ないという利点を有する。
【0003】
ＩＳＣＯＭ－マトリックスは、リン脂質も含む系におけるキラヤサポニンとコレステロールの間の相互作用の結果として生じる、一連の構造的に画定された楕円体状（spheroidal）で中空のかご状自己組織化ナノ粒子（動的光散乱法（ＤＬＳ）で観察して４０～６０ｎｍ）である。それらは負の静電的帯電を示し、実測ゼータ電位が約－３０ｍＶである。ＩＳＣＯＭ－マトリックスと抗原の組み合わせはＩＳＣＯＭと呼ばれる。キラヤサポニン（及びおそらくトリテルペノイドコアを有する全てのサポニン）は、ＩＳＣＯＭ－マトリックスの構造化と安定化を誘導するコレステロールに対して高い親和性をもつと考えられている。
【0004】
ＩＳＣＯＭは、サイズ及び形状の点でウイルス粒子に似ているので、抗原送達のために広く調べられている（Barr, 1998）。ＩＳＣＯＭの高い免疫応答は、主にＱＳ（キラヤ・サポナリア）サポニン、特に強い免疫刺激活性を呈するアシル化成分、例えばＱＳ－２１などの存在と関連する（Boyaka et al., 2001）。これがＩＳＣＯＭの特有の性質と相まって、全体的なアジュバント効果をもたらし、液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘導することが報告されている（Sun et al., 2009）。
【0005】
ＩＳＣＯＭの製造に伴う最大の課題は、この分子が本質的に水に不溶性であるので、水相におけるコレステロールの「可溶化」に関連する。ＩＳＣＯＭの形成の背後にある基本的な考えは、コレステロールを、混合ミセルの形態又は共界面活性剤（co-detergents）若しくはリン脂質によって形成され、小胞に組み込まれた形態で、バルク溶媒に供給することである。キラヤサポニンのミセル溶液を添加すると、サポニンミセルへのコレステロール分子の再分布及び特徴的なＩＳＣＯＭ粒子への分子の再構成がもたらされる。しかし、実際には、このプロセスにおいて集団の均一性及び粒子数の点でさまざまな結果が生じる。したがって、凝集又は残留コレステロール及びリン脂質（例えばホスファチジルコリン）を除去するために、遠心分離、限外濾過、タンジェンシャルフロー又は透析を介した複数の下流精製工程が必要である。そのような技術は、製造プロセスの間に必然的に材料のロスが発生する。ＩＳＣＯＭの大規模製造にとってより不利益なのは、製造コストをさらに増加させる製薬グレードのリン脂質（及び時として共界面活性剤）の使用である。また、高価な（非動物由来の）半合成コレステロールが失われることも、製造コストの高騰を招く。まとめると、このような収率のばらつきとロスは、手頃なサポニンベースのアジュバントナノ粒子の大規模製造にとって重大な障害となる。
【0006】
ＩＳＣＯＭ生産に関連する製剤化の問題のいくつかは、いわゆる「Ｇ３」サポニンをベースとするナノ粒子を生じる、リン脂質を含まない新しい調製方法の発見により、Morein et al.によって対処されている。それらの粒子はとりわけ国際特許出願の、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載されている。しかし、前記調製方法は、残念ながら、得られた生成物が不均一かつばらつきのある粒子径分布を示すため、商業規模で実施することが困難であることもわかっており、今般、本発明の発明者によって、実際には２つの特許出願に記載のものとは異なる形態の粒子を製造することが実証された。
【0007】
本発明者らは、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載の手順のスケールアップの試みに鋭意取り組んできたが、特許出願に記載され、電子顕微鏡写真上で～２０ｎｍの円形スポットとして現れる「Ｇ３」ナノ粒子は、該出願の指示に従うことによって再現できないことに気付いた。これは、得られた生成物を、その２つの特許出願で採用された透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）だけでなく、動的光散乱法（ＤＬＳ）と原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）でも分析したときに初めて分かった。問題は単に、クレームされている２０ｎｍ粒子がＴＥＭ分析でしか見ることができず、ＤＬＳでもＡＦＭでも見ることができないということであった。
【0008】
分析手法はその方法論と分析前の試料調製において著しく異なる。ＴＥＭでは、数マイクロリットルの（リン酸緩衝液、ＰＢＳ中の）コロイド溶液を金属グリッド上に蒸着させ、真空下で乾燥させた後、造影剤でスパッタリングし、電子ビームで可視化する。高い電子密度（高い分子密度）の領域が、二次元平面に投影されて観察される。ＡＦＭでは、数マイクロリットルの試料を原子的に平坦な基板（新たにへき開したマイカシート）上に蒸着させし、乾燥させ、厚さが数ナノメートルの共振ＡＦＭチップで走査する。得られた画像は、基板の表面のトポロジー及び表面上の粒子が三次元で現れる場所を示す。特に、粒子の厚さを測定することができる。ＤＬＳでは、試料はそのまま（すなわち乾燥させずに）分析され、リン酸緩衝液に溶解され、粒子径分布の統計的な記述が与えられる。ＡＦＭイメージングでは、「Ｇ３」粒子は、異なるサイズ及び形状の不均一な集団として現れ、時には球状であり、時には長さが最大数１００ｎｍで、厚さが４ｎｍ～１０ｎｍしかないサイズの１つの軸に沿って伸びた形状（ひも状）であり、直径が２０ｎｍ～３０ｎｍにそろった均一な球状ではなかった。ＤＬＳの平均サイズ分布は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットでクレームされているような２０ｎｍではなく、一貫して５０ｎｍ～６０ｎｍの範囲であった。したがって、本発明者らは、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットにおける～２０ｎｍの「Ｇ３」粒子としてＴＥＭで観察されたものが、試料調製におけるアーチファクトのせいでありうるのではないかと推測した。これは、コレステロールもサポニンも含まず、リン酸緩衝液のみを含む試料をＴＥＭで分析したところ、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示の「Ｇ３」粒子の図１Ａとほとんど同一のＴＥＭ画像が得られたことによって裏付けられた。図１を参照。これより、２つの特許出願に記載されている約２０ｎｍの直径を有する「Ｇ３」ナノ粒子（例えば国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット）の図１Ａを参照）は、実際には、試料の蒸発時に緩衝系から析出したリン酸塩結晶若しくは凝集体、又は金属基板グリッドとの相互作用（リン酸イオンは金属表面に親和性を有する）によって形成されたものであることが証明された。同一の緩衝系のみ、又は金属グリッドの代わりに炭素基板グリッド上に蒸着させた緩衝系中のサポニン－コレステロール粒子（本物の「Ｇ３」粒子）の対照観察は、特許出願で報告されている直径が～２０ｎｍのディスク形状構造を決して生じず、そのアーチファクトな性質を示した。ＤＬＳでは、リン酸塩は分析条件下で溶解しているので、そのような粒子は見えなかった。
【0009】
これらの調製物は結局、とりわけさまざまな異なる接種実験において生物学的効果を、示したので、本発明の発明者らは、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載されている「Ｇ３粒子」の性質及び／又は形態を調べることにした。この目的のために、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示されているオリジナルの手順を５回実施し、得られた粒子をＤＬＳで分析した。その結果は、もとの手順は、個々の実験で不均一な粒子径分布を有する粒子をもたらし（図２を参照）、さらに実験間のばらつきが大きかった。この均一性の欠如は市販アジュバントとしては許容されないと結論づけられた。
【0010】
したがって、医薬用の担体／送達粒子として、又はワクチンアジュバントとして使用できるサポニンベースのナノ粒子のための、信頼性が高く、スケールアップが可能な手順を開発する必要性が依然残っている。
【発明の概要】
【0011】
今般、本発明の発明者らは、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示されているオリジナルの製造方法で得られた粒子の形態とサイズ分布はともに、少数の重要な反応パラメーターを変えることによって、特に高温で粒子をインキュベートすること及び初期調製物におけるサポニンとコレステロールの比を調整することによって、大幅に改変できることを発見した。図２のＤＬＳグラフに描かれたている、見かけの大きさが異なる２種類以上の粒子とは対照的に、本発明の方法に従って製造された粒子は、ＤＬＳで測定したとき、均一なサイズを有する（単分散、図４を参照）。
【0012】
したがって、本発明の第１の形態では、コレステロール並びにトリテルペノイドサポニン、例えば、Quil A（登録商標）などのキラヤ・サポナリア・モリーナ由来の成分、又はそれから単離される、画分ＱＳ－７、ＱＳ－８、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８及びＱＳ－２１などの成分、又は画分ＱＢ－９０などのキラヤ・ブラジリエンシス（Quillaja brasiliensis）由来の成分などを含み、糸状（フィラメント状）であることを特徴とするナノ粒子が提供される。これらのナノ粒子は、これ以降、本出願全体を通して「NanoQuil F70」粒子と呼ぶ。
【0013】
第２の態様では、本発明は、第１の態様のNanoQuil F70ナノ粒子を製造する方法を提供し、この方法は以下のステップを含む。
ａ）１つ又は複数のＣ1－Ｃ6アルコール、Ｃ2－Ｃ6ケトン、Ｃ1－Ｃ3カルボン酸のＣ1－Ｃ6アルキルエステル、及び直鎖又は環状Ｃ4－Ｃ8エーテルから選択される有機溶媒中のコレステロールの非水溶液から溶媒を除去することによって、反応容器の内面及び／又は前記反応容器内に位置する水不溶性の多孔質体の表面上にコレステロールの層を調製するステップ、
ｂ）１つ又は複数の塩の溶液、緩衝溶液、又は無塩蒸留水でありうる、好ましくは予め７０℃±５℃に熱せられている水性反応媒体を加えるステップ、
ｃ）トリテルペノイドサポニン、例えばキラヤサポニンなどの溶液を、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えて、１０：１～２０：１、好ましくは１６：１の（重量／重量）サポニン：コレステロールの最終比を得るステップ、
ｄ）反応混合物を７０℃±５℃で約１時間熱するステップ、
ｅ）反応混合物を４℃±２℃に一晩冷却し、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、形成された粒子を分離し、過剰サポニンを除去するステップ。
ａ）１つ又は複数のＣ1－Ｃ6アルコール、Ｃ2－Ｃ6ケトン、Ｃ1－Ｃ3カルボン酸のＣ1－Ｃ6アルキルエステル、及び直鎖又は環状Ｃ4－Ｃ8エーテルから選択される有機溶媒中のコレステロールの非水溶液から溶媒を除去することによって、反応容器の内面及び／又は前記反応容器内に位置する水不溶性の多孔質体の表面上にコレステロールの層を調製するステップ、
ｂ）１つ又は複数の塩の溶液、緩衝溶液、又は無塩蒸留水でありうる、好ましくは予め７０℃±５℃に熱せられている水性反応媒体を加えるステップ、
ｃ）トリテルペノイドサポニン、例えばキラヤサポニンなどの溶液を、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えて、１０：１～２０：１、好ましくは１６：１の（重量／重量）サポニン：コレステロールの最終比を得るステップ、
ｄ）反応混合物を７０℃±５℃で約１時間熱するステップ、
ｅ）反応混合物を４℃±２℃に一晩冷却し、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、形成された粒子を分離し、過剰サポニンを除去するステップ。
【0014】
本発明の第２の態様による方法で調製された「NanoQuil F70」ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載の「Ｇ３」ナノ粒子を含む先行技術と、とりわけＤＬＳ分析で測定したときの形態（糸状（フィラメント状）対円形／球状）と粒子分散（均一対不均一）のユニークな組み合わせによって実質的に異なる。
【0015】
国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示の手順の方法ステップと本発明の方法ステップを比較すると、第２の態様のNanoQuil F70ナノ粒子を画定する構造的特徴が、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載の手順に対する製造手順の改変に起因するのは明らかである。
【0016】
本発明によるナノ粒子は、１つ又は幾つかの化合物、例えば、がんの治療に使用されるものを含む医薬品並びに追加の物質が追加の機能及び補完的な作用様式を提供する栄養関連化合物の送達システムとして使用することができる。
【0017】
第３の態様では、NanoQuil F70ナノ粒子及びそれを含む組成物はそれ自体で、医薬として、任意選択で、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、賦形剤、添加剤、アジュバント及び／又は担体をさらに含む医薬組成物に使用することができる。
【0018】
両親媒性分子及び疎水性分子は、抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物、及び栄養物（nutriment）から選択でき、本発明によるナノ粒子に組み込まれてもよく、又は組成物中でそのナノ粒子と混合されてもよい。代替として、化合物が別々のナノ粒子に組み込まれる。
【0019】
本発明の医薬組成物は、ワクチンと組み合わせて使用するために、季節性インフルエンザウイルスワクチンと組み合わせて使用するために、パンデミックインフルエンザワクチンと組み合わせて使用するために、又は緊急用ワクチン、例えば生物兵器に対するワクチンなどと組み合わせて使用するためにアジュバントとして使用することができる。
【0020】
したがって、本発明はまた、本発明によるNanoQuil F70粒子を、とりわけ上記のようにアジュバントとして含む医薬ワクチン製剤にも関わる。
【0021】
本発明はまた、生物によって引き起こされる又は悪化する疾患を治療又は予防するための方法であって、対象者に、本発明による医薬ワクチン製剤を、それを必要とする人に投与することを含む方法にも関する。
【0022】
さらに、本発明は、固形腫瘍を含むがんの治療方法であって、それを必要とする患者に、薬学的に有効な量の本発明によるNanoQuil F70ナノ粒子又はそれを含有する組成物を投与することを含む方法に関わる。
【0023】
さらに、本発明は、それを必要とする患者に、薬学的に有効な量のNanoQuil F70ナノ粒子又はそれを含む組成物を投与することを含むがんの治療に使用するためのNanoQuil F70ナノ粒子又はそれを含有する組成物に関わる。
【0024】
さまざまな種類のがん細胞に対する上記のＧ３粒子と本発明のNanoQuil F70ナノ粒子の治療効果はともに、ナノ粒子が分裂周期を終了させることによってがん細胞をアポトーシス細胞に転換させる能力によって生じると考えられている。
【0025】
NanoQuil F70ナノ粒子又はそれを含有する組成物は、非経口的に投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下注射、注入技術の静脈内注射、筋肉内注射、皮内注入法、エレクトロポレーション（ＥＰ）、針なし注射については、ジェットインジェクション、ジーンガン、ビルジェクター（biljector）並びに、経口、エアロゾル投与を含む。
【0026】
本発明はまた、本発明によるがんの治療法の個々の患者への適用性を評価するための方法であって、
・前記患者由来のがん細胞を、本発明によるNanoQuil F70ナノ粒子又はそのようなナノ粒子を含有する医薬組成物とインビトロで接触させること、
・前記ナノ粒子又は医薬組成物の、前記がん細胞に対する治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定すること
を含む方法にも関し、この方法は、ナノ粒子又は医薬組成物が、前記がん細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示した場合に、前記個々の患者に適用可能であると評価される。
・前記患者由来のがん細胞を、本発明によるNanoQuil F70ナノ粒子又はそのようなナノ粒子を含有する医薬組成物とインビトロで接触させること、
・前記ナノ粒子又は医薬組成物の、前記がん細胞に対する治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定すること
を含む方法にも関し、この方法は、ナノ粒子又は医薬組成物が、前記がん細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示した場合に、前記個々の患者に適用可能であると評価される。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】図１Ａ：「電子顕微鏡観察（ＥＭ）は、コレステロールと、ＱＨＣ、ジテルペノイドを１：１：０．５のモル比で含むナノ粒子を示す。本発明によれば、粒子は約１７～２０ｎｍの平均直径を有する」と記載されている国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットの図１Ａの写し。 図１Ｂ：コレステロール又はサポニンを含有せず、リン酸緩衝液だけを含有する試料の電子顕微鏡像。このＴＥＭ写真で捉えられた２０ｎｍの「ナノ粒子」は、図１Ａと同様の試料調製を行った後、リン酸緩衝液の所要の蒸発中に析出した単なるリン酸塩である。
【図3-1】図３Ａ及びＢ：水性反応媒体としてＰＢＳ（図３Ａ）又は蒸留水（図３Ｂ）を使用し、７０℃で約１時間のインキュベーションした、本発明によるNanoQuil F70粒子の透過型電子顕微鏡観察。ＴＥＭ写真は、反応媒体に関係なく、得られたF70粒子は、フィラメント状（糸状）の形状、すなわち国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットの円盤状とされているナノ粒子とは全く異なる形態を有することを明らかにする。
【図3-2】図３Ｃ：上記のNanoQuil F70製造プロトコールに従って、４つの異なる水性反応媒体：蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、生理食塩水（Ｄ．Ｗ．中の０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して製造したNanoQuil F70ナノ粒子を示す棒グラフ。 これらの製剤において、粒子径（流体力学的直径）の違いがＤＬＳで観察された。ＰＢＳ中で製剤化したNanoQuil F70が最も大きなサイズ（約４２ｎｍ）を示し、次いで生理食塩水中で製剤化したNanoQuil F70（約３５ｎｍ）が続く。酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及び蒸留水中で製剤化したNanoQuil F70粒子は、それぞれ約２５ｎｍ及び２４ｎｍの粒子径を示す。
【図4】図３ＡでＴＥＭ分析したのと同じ粒子を、ここではＤＬＳで粒子径分布を分析したもの。これにより、本発明による粒子は、ＰＢＳ中で調製した場合、平均流体力学的直径が４２．２ｎｍ±１．０ｎｍの単分散であることが明らかになる。ＰＢＳ以外の媒体で作られた粒子については、図３Ｃを参照されたい。
【図5】ＰＢＳ中で調製したNanoQuil F70の３つのバッチの、ＳＥＣで精製する前の動的光散乱（ＤＬＳ）分析。
【図6】Sephacryl S300-HR上でＳＥＣによって精製したNanoQuil F70のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム。１３ｍＬ容のSephacryl S300-HRカートリッジから６ｍＬで溶出し、精製したNanoQuil F70が入った画分をＨＰＬＣで分析した。２０ｍＬと３２ｍＬの間のシグナルの積分（灰色のバー）を用いて、画分中のサポニンを定量する。３９ｍＬのシグナルの積分を用いて、コレステロールを定量する。
【図7】ＳＥＣ画分に集められたQuilA（薄い灰色）及びコレステロール（濃い灰色）の相対量。QuilAが４．２ｍｇ／ｍＬのNanoQuil F70の１ｍＬの量を、Sephacryl S300-HRカラムに載せ、１ｍＬの画分をＨＰＬＣによる定量分析のために集めた。検出可能な量のQuilAを含有する４ｍＬから１３ｍＬまでのＳＥＣ画分が示されている。NanoQuil F70とQuilAは参照として示されている。
【図8】NanoQuil F70のsephacryl S300-HRによるＳＥＣ画分の溶血作用。
【図9】QuilA単独での溶血アッセイ。グラフは、赤血球（ＲＢＣ）から放出されるヘモグロビンを、ＲＢＣの希釈度の関数として示す。 ０．４ｍｇ／ｍＬで、QuilAは、このアッセイにおいて完全な溶血能を示す。０．３ｍｇ／ｍＬ以下では、溶血作用の減少が見られる。 方法：２０μＬのQuilAを、ＰＢＳ中に０．９倍から０．１倍に希釈した１８０μＬの新鮮なヒツジの血液に加えた。混合物を３７℃で４５分間インキュベートし、細胞を５００×ｇで５分間沈殿させる。上清中のヘモグロビンは、５８０ｎｍでの吸光度を測ることによって測定する。
【図10】nanoQuil F70粒子を用いた溶血アッセイ。グラフは、赤血球（ＲＢＣ）から放出されるヘモグロビンを、ＲＢＣの希釈度の関数として示す。試験方法は図９と同じ。 図１０Ａ：QuilA単独（図９）と比較して、未精製（未加工）nanoQuil F70は、１ｍｇ／ｍＬのQuilA相当濃度で溶血作用を示す。２ｍｇ／ｍＬの未加工nanoQuil F70では、溶血作用は、０．２ｍｇ／ｍＬの遊離QuilAで誘発された溶血作用と同程度であった。 図１０Ｂ：S300-HRで精製したnanoQuil F70は、２ｍｇ／ｍＬのQuilA相当濃度まで溶血作用を示さない。４ｍｇ／ｍＬの精製nanoQuil F70では、溶血作用は、０．１ｍｇ／ｍＬの遊離QuilA又は１ｍｇ／ｍＬの未加工nanoQuil F70で誘起される溶血作用よりも低い、あるいは同程度である。
【図11】Ｇ３粒子とnanoQuil F70粒子のアジュバント効果の比較。Ｇ３－ＶＡＸ粒子とNanoquil粒子の間に有意な差は見られなかった。しかし、「nanoQuil F70」は「Ｇ３」よりも、わずかに強力な抗体応答が得られ、ばらつきが少ないようであった。
【0028】
定義
本明細書における用語及び単語はすべて、別段の具体的な指示がない限り、関連する技術分野において通常与えられる意味を有すると解釈されるものとする。明確にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
本明細書における用語及び単語はすべて、別段の具体的な指示がない限り、関連する技術分野において通常与えられる意味を有すると解釈されるものとする。明確にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【0029】
ワクチン製剤は、予防的に使用され、１つ又は複数の特定の疾患への／に対する（to/against）防御免疫を向上／増強する医薬製剤である。
【0030】
本発明による治療ワクチンは、疾患に関係がある構成要素に特異的な抗原が本発明の製剤に含まれる場合、又は抗原が、がん治療に特有であるようにがん／腫瘍中に存在する場合に、疾患を治癒させる又はそれを治療するために使用することができる。ワクチンは、処置された対象において免疫応答を誘発する「抗原」、及び任意選択で「アジュバント」又は「免疫増強剤」と呼ばれる免疫応答を向上させるためにワクチンに添加される物質を含む。
【0031】
したがって、「抗原」は、ワクチン中の活性のある特異的部分であり、ワクチンが免疫性を向上させることを狙う疾患を引き起こす完全な微生物、例えばウイルス又は細菌などである場合もある。抗原はまた、前記微生物の一部、サブユニット、例えばタンパク質（サブユニット）、タンパク質の一部、病原微生物から単離された、又は組換えＤＮＡ技術によって作製された、又は合成的に生成され、ペプチドと呼ばれるタンパク質などであってもよい。ペプチドはタンパク質よりも少ないアミノ酸を有し、一般に規則的な三次元構造の折り畳みを有しない。
【0032】
「アジュバント」は、予防又は治療ワクチンの抗原部分に対する免疫応答のレベル及び／又は質を高めるワクチン構成成分である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本発明の発明者らは、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットの手順に従って調製した粒子で（動的光散乱法、ＤＬＳで分析したときに）見られた不均一性は、驚くべきことに、高温で粒子をインキュベートし、初期調製物中のサポニンとコレステロールの比を調節することによって克服できることを発見した。また、他の方法パラメーター、例えばコレステロール膜の表面積及び厚さ並びに溶媒極性なども関与する可能性がある。本開示によるNanoQuil F70粒子は、（国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットにおける見かけ上の円盤状の形態とは対照的に、）フィラメント状、「糸状」であり、開いた形状（open-shaped）、すなわちひも状若しくはヌードル状（noodle-like）、又は閉じた形状（closed-shape）／環状のいずれかでありうるという点で、本開示による手順によって作られる「NanoQuil F70」粒子の形態は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示の手順によって作られた見かけ上円盤状の「Ｇ－３」粒子の形態とは異なる。図３Ａ及びＢを参照。本開示によるNanoQuil F70ナノ粒子は、例えばＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバント製剤とは対照的に、リン脂質又は共界面活性剤（MEGA-10など）とともに製剤化されておらず、それらを含有していない。
【0034】
本発明の第１の態様では、したがって、コレステロール及びトリテルペノイドサポニン、例えばQuil A（登録商標）などのキラヤ・サポナリア・モリーナ由来の成分、又はそれから分離される、画分ＱＳ－７、ＱＳ－８、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、及びＱＳ－２１などの成分、又は画分ＱＢ－９０などのキラヤ・ブラジリエンシス由来の成分などを含み、糸状（フィラメント状）であることを特徴とするナノ粒子（「NanoQuil F70」）が提供される。
【0035】
上記のように、第１の態様によるナノ粒子は、ＴＥＭ分析によって、２つの別個の形態で存在することが見出され、両方とも特徴的な糸状（フィラメント状）の形状を有する。１つの形態は、末端が閉じていない（open-ended）、すなわちひも状又はヌードル状であり、もう１つの形態は、閉じており、実質的に環状である。これ以降に記載される方法に従って製造されるナノ粒子は、典型的には両方の形態を含有する。
【0036】
一実施形態では、したがって、NanoQuil F70ナノ粒子は２つの形態：
・閉じた、実質的に環状のナノ粒子からなる形態Ａ、及び
・末端が閉じていない、ひも状（worm-like）ナノ粒子からなる形態Ｂ
を含みうる。
・閉じた、実質的に環状のナノ粒子からなる形態Ａ、及び
・末端が閉じていない、ひも状（worm-like）ナノ粒子からなる形態Ｂ
を含みうる。
【0037】
形態Ａ：形態Ｂの比は、他のパラメーターなかでも特に、使用される反応溶媒の性質及び／又は使用される反応溶媒のｐＨによって影響される。
【0038】
さらなる実施形態では、形態Ａと形態Ｂの前記混合物は、２０：８０～４５：５５の比、例えば約３５：６５など、例えば３０：７０～４０：６０などを有する。
【0039】
別の実施形態では、形態ＡとＢの前記混合物は５：９５～１０：９０の比を有する。
【0040】
一実施形態では、第１の態様によるナノ粒子は、実質的に１つの形態のみで構成され、すなわち、そのナノ粒子は少なくとも約９５％の形態Ａ又は形態Ｂのいずれかを含有する。
【0041】
別の実施形態では、形態Ａの実質的に環状のナノ粒子は１０～１５ｎｍの半径を有し、形態Ｂの末端が閉じていないナノ粒子は３５～４５ｎｍの長さを有しする。値はともにＴＥＭで測定される。
【0042】
一実施形態では、フィラメントの直径又は厚さは、４～８ｎｍ、好ましくは５～７ｎｍ、例えば５．８±０．８ｎｍなどである。
【0043】
別の実施形態では、形態Ａの実質的に環状のナノ粒子は、６５～１２０ｎｍの周囲長、例えば７０～８０ｎｍなど、例えば８０～９０ｎｍなど又は例えば８５～１２０ｎｍなどを有する。
【0044】
別の実施形態では、形態Ａの実質的に環状のナノ粒子は７５±７ｎｍの周囲長を有する。
【0045】
別の実施形態では、形態Ａの実質的に環状のナノ粒子は１０３．５±１７ｎｍの周囲長を有する。
【0046】
別の実施形態では、キラヤサポニンとコレステロールの間の比は、１２：１～１８：１、例えば１４：１～１７：１など、好ましくは１６：１である。
【0047】
本発明の第１の態様によるNanoQuil F70ナノ粒子は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載のいわゆる「Ｇ３」ナノ粒子を含む先行技術とは、とりわけ形態（フィラメント状／糸状対円盤状）及び粒子分散（均一対不均一）のユニークな組み合わせによって実質的に異なる。
【0048】
糸状ナノ粒子は薬物送達システムの分野でかなりの関心を集めている。B. Karagoz et al.によって論文報告された研究「Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA)-control over the morphology of nanoparticles for drug delivery applications. 」, Polym. Chem., 2014では、円筒状でひも状のナノ粒子は、乳がん細胞に薬剤を送達した際に、従来の球状のものよりも７倍致死性が高いが、健康な細胞に対してはより高い毒性はないことが示されている。
【0049】
これらの結果は、「Pair correlation microscopy reveals the role of nanoparticle shape in intracellular transport and site of drug release」、Nature Nanotechnology １２巻、８１～８９頁（２０１７年）で、Elizabeth Hinde et al.によって報告された別の研究で裏付けられている。Hinde et al.は、形状は異なるが表面の化学的性質が同じであるポリマーナノ粒子が、異なる速度でさまざまな細胞障壁を移動し、最終的には薬物の放出部位を定めることを示した。このグループは、ミセル、小胞（vesicles）、桿体（rods）、ひも形（worms）がどのようにして細胞に入り、エンドソーム系から脱出して核膜孔複合体を介して核に到達するかを測定した。ミセルや小胞ではなく、桿体やひも形は受動的拡散によって核に入った。例えば核局在化シグナルを用いて核へのアクセスを良くすると、核内でより多くのドキソルビシン放出がもたらされ、より強い細胞毒性と相関した。したがって、そのグループの結果は、細胞の主要な障壁である核膜を横切る薬物送達が、ドキソルビシンの効率に重要であり、適切な形状のナノ粒子を用いて達成できることを示している。
【0050】
本発明の第２の態様では、第１の態様のフィラメント状（糸状）のNanoQuil F70粒子の製造方法が提供され、その方法は以下のステップを含む。
ａ）１つ又は複数のＣ1－Ｃ6アルコール、Ｃ2－Ｃ6ケトン、Ｃ1－Ｃ3カルボン酸のＣ1－Ｃ6アルキルエステル、及び直鎖又は環状Ｃ4－Ｃ8エーテルから選択される有機溶媒中のコレステロールの非水溶液から溶媒を除去することによって、反応容器の内面及び／又は前記反応容器内に位置する水不溶性の多孔質体の表面上にコレステロールの層を調製するステップ、
ｂ）１つ又は複数の塩の溶液、緩衝溶液、又は無塩蒸留水でありうる、好ましくは予め７０℃±５℃に熱せられている水性反応媒体を加えるステップ、
ｃ）トリテルペノイドサポニン、例えばキラヤサポニンなどの溶液を、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えて、１０：１～２０：１、好ましくは１６：１の（重量／重量）サポニン：コレステロールの最終比を得るステップ、
ｄ）反応混合物を７０℃±５℃で約１時間熱するステップ、
ｅ）反応混合物を４℃±２℃に一晩冷却し、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、形成された粒子を分離し、過剰サポニンを除去するステップ。
ａ）１つ又は複数のＣ1－Ｃ6アルコール、Ｃ2－Ｃ6ケトン、Ｃ1－Ｃ3カルボン酸のＣ1－Ｃ6アルキルエステル、及び直鎖又は環状Ｃ4－Ｃ8エーテルから選択される有機溶媒中のコレステロールの非水溶液から溶媒を除去することによって、反応容器の内面及び／又は前記反応容器内に位置する水不溶性の多孔質体の表面上にコレステロールの層を調製するステップ、
ｂ）１つ又は複数の塩の溶液、緩衝溶液、又は無塩蒸留水でありうる、好ましくは予め７０℃±５℃に熱せられている水性反応媒体を加えるステップ、
ｃ）トリテルペノイドサポニン、例えばキラヤサポニンなどの溶液を、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えて、１０：１～２０：１、好ましくは１６：１の（重量／重量）サポニン：コレステロールの最終比を得るステップ、
ｄ）反応混合物を７０℃±５℃で約１時間熱するステップ、
ｅ）反応混合物を４℃±２℃に一晩冷却し、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、形成された粒子を分離し、過剰サポニンを除去するステップ。
【0051】
第２の態様のポイントａ）に関して、当業者であれば、本発明のNanoQuil F70粒子を製造するために、水不溶性コレステロールと水溶性サポニンの密接な接触を達成することの重要性を理解するであろう。これには、溶媒が接触可能な大きなコレステロール表面を作る必要がある。本発明の一実施形態では、これは、サポニン溶液が後に添加できる反応容器の内面に、コレステロールの層をできる限り薄く調製する、かつ／又は蒸着させることによって実施される。
【0052】
あるいは、別の実施形態では、コレステロールの層は、サポニン溶液と接触できる水不溶性多孔質体の表面に調製する、かつ／又は蒸着させることができる。上記実施形態の両方において、実際には、コレステロールの層は、好適な有機溶媒中のコレステロールの溶液を蒸発させることによって調製する、かつ／又は蒸着させることができる。
【0053】
最後に、本発明の異なる実施形態では、非水溶性コレステロールと水溶性サポニンの密接な接触はまた、コレステロールとサポニンの別々の溶液が高速かつ高乱流で混合される連続流マイクロリアクターでも達成することができる。
【0054】
当業者であれば、「反応容器」という用語が、第１の態様による方法において概説された単位操作に適し、かつそれと適合性のある、いずれの種類及びサイズの容器、試験管、バレル、フラスコ、ジャグ（jug）、箱（bin）又は入れ物（receptacle）を指すことを理解するであろう。反応容器は、試験管、遠心チューブ、１つ又は複数の口をもつ（necked）丸底又は洋梨形フラスコなどの通常の研究室器具から都合よく選択することができ、それらは典型的にはガラス又は好適な耐溶剤性ポリマーから製造される。スケールアップ及び製造目的のための反応容器は、パイロットスケール及び製造スケールの反応器から選択することができ、それらの反応器は、ガラスライニングされうるか、又はステンレス鋼若しくは他の合金から製造されうる。
【0055】
当業者であれば、「水に不溶性の多孔質体」という用語が、中空繊維などの開放セル構造及び好適な形状を有し、多孔質ガラス、エアロゲル及び他の無機ゲル、多孔質アルミナ、ジルコニア又はシリカ粒子、金属発泡体並びに多孔性ポリマーなどの好適な水不溶性の多孔質材料から製造された好適なサイズの任意の物品を意味することをさらに理解するであろう。
【0056】
当業者であれば、コレステロール溶液からの溶媒の除去が、溶液の蒸発によって好都合に実施できることをさらに理解するであろう。これは、反応容器の内容物を撹拌しながら、任意選択で加熱して、中程度の真空を適用することを含む。前記撹拌は、反応容器を回転させることによって、又は撹拌子若しくはパドルスターラーなどの反応容器内の内部スターラーを適用することによって行うことができる。
【0057】
代替えとして、コレステロール溶液からの溶媒の除去は、任意選択で反応容器中の内容物を撹拌しながら、空気、アルゴン又は窒素の流れを反応容器内に通すことによって行うことができる。
【0058】
溶媒を除去する方法にかかわらず、前記除去は、反応容器の内側及び／又は多孔質体の表面に、さまざまな厚さ及び粗さを有するコレステロールの層の堆積をもたらす。
【0059】
第２の態様のポイントｂ）に関して、上記のNanoQuil F70製造プロトコールに従って、４つの異なる水性反応媒体：蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、生理食塩水（Ｄ．Ｗ．中の０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）のを用いて、NanoQuil F70ナノ粒子を製造した。
【0060】
これらの製剤において、粒子径（流体力学的直径）の違いがＤＬＳで観察された。ＰＢＳ中で製剤化したNanoQuil F70は最も大きなサイズ（約４２ｎｍ）を示し、生理食塩水中で製剤化したNanoQuil F70（約３５ｎｍ）が続く。酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及び蒸留水で製剤化したNanoQuil F70粒子は、それぞれおよそ２５ｎｍ及び２４ｎｍの粒子径を示す（図３Ｃを参照）。
【0061】
ＤＬＳ分析では、与えられる粒子の直径は流体力学的直径である。流体力学的直径又はストークス直径は、分析物と同じ速度で拡散する相当剛体球の直径、すなわち、粒子を取り囲む水和層を仮定して、測定される粒子と同じ並進拡散係数を有する球の直径である。したがって、測定されるのは溶液中の粒子の回転半径である。これは、「静的」条件下での粒子の形態に関する情報を与えないが、それはＴＥＭで評価することができる。
【0062】
ＴＥＭ分析を用いて、上記ポイントｂ）で異なる水性反応媒体を使用することは、他の粒子形態の違いにもつながることがわかった。下表からわかるように、異なる媒体中で製造された開放ナノ粒子対閉鎖ナノ粒子（形態Ａ：形態Ｂ）の比は異なる。ＰＢＳ緩衝液の場合、その比はＡ：Ｂが約８：９２であるが、蒸留水及び酢酸緩衝液の場合、約４０：６０である。すべての値はＴＥＭ画像解析で測定される。
【0063】
【表1】
【0064】
したがって、NanoQuil F70粒子形態は、プロセスパラメーターを変えることによって微調整することができ、これは先行技術の手順と比べて大きな利点である。出願人は、さまざまなタイプの粒子及び組成比が、個々の用途を見つけることを想定している。
【0065】
したがって、１つの実施形態では、ポイントｂ）の下で添加される水性反応媒体は、酢酸緩衝液又はＰＢＳ緩衝液などの緩衝液である。別の実施形態では、ポイントｂ）の下で添加される水性反応媒体は、生理食塩水（蒸留水中の０．８５％ＮａＣｌ）などの１つ又は複数の塩の溶液である。さらに別の態様では、ポイントｂ）の下で添加される水性反応媒体は無塩蒸留水である。好ましいい実施形態では、ポイントｂ）の下で添加される水性反応媒体は、～４．６のｐＨを有する酢酸緩衝液である。
【0066】
別の実施形態では、NanoQuil F70粒子の製造過程は４～５のｐＨで行われる。別の実施形態では、NanoQuil F70粒子の製造過程は５～６のｐＨで行われる。別の実施形態では、NanoQuil F70粒子の製造過程は６～７のｐＨで行われる。別の実施形態では、NanoQuil F70粒子の製造過程は７～８のｐＨで行われる。
【0067】
第２の態様のポイントｃ）に関して、Quil A（又は別のキラヤ画分）の添加は、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ前後の濃度の水溶液を用いて行われる。サポニン：コレステロール（重量／重量）の１０：１～２０：１の最終比、好ましくは１６：１の最終比が得られるように、十分な量のそのような溶液が添加される。
【0068】
第２の態様による方法のポイントｄ）における得られた反応混合物の加熱は、本発明の本質的な特徴であり、上記のように、国際公開第２０１３０５１９９４号の粒子と対比して、製造された粒子の形態及び粒子径分布を劇的に変化させる。
【0069】
したがって、好ましい実施形態では、第１の態様による方法のポイントｄ）において、得られた反応混合物は７０℃±５℃に約１時間加熱される。当業者であれば、加熱は本発明の本質的な特徴であるが、正確な反応温度、加熱の時間、加熱の速度並びに加熱中及びその後の冷却中の温度プロファイルはすべて、特に製造方法を新しい規模に拡大する際に、分析し最適化する必要があるパラメーターであることを理解するであろう。方法パラメーターを分析し最適化することは、当業者によって十分に理解されたタスクであり、進歩性を有する熟練（inventive skills）を必要としない、慣習的な実行タスクと考えられる。
【0070】
第２の態様のポイントｅ）に関して、本発明のNanoQuil F70粒子の最終の分離は精製ステップを含む。このステップが含まれるのは、本発明の第２の態様による、サポニンとコレステロールを製剤化する過程から生じる「未加工」NanoQuil F70粒子が、残留遊離サポニンのミセルを完全に含まないことがなく、したがって、NanoQuil F70粗生成物は、バッチごとに異なる量の遊離サポニンミセルを含みうるからである。最終精製ステップは、バッチ間のばらつきを許容レベルまで減らす。これについては以下で考察することになる。
【0071】
キラヤ・サポナリア・モリーナ由来の部分的に精製されたサポニンの商業的混合物であるキラヤ種由来のサポニン、例えばQuilAなどは、水性緩衝液中でミセルとして送達されると、他の多くのサポニンと同様に、生体膜に対して固有の溶解活性を有する（Kensil, C. R. et al. (1991). Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. The Journal of Immunology, 146(2), 431-437; Oda, K., et al. (2000). Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants. Biological Chemistry, 381(1), 67-74）。この形態では、キラヤサポニンは、ワクチンアジュバントとして注射された場合、その強力な細胞膜溶解作用（細胞の破壊又は溶解に至る反応）により、有害な急性炎症症候群を誘発する。
【0072】
親水性部分と親油性部分の両方をもつサポニン分子の構造は、これらの分子に顕著な界面活性剤効果を与える。
【0073】
注入されると、サポニン分子はそれ自体で、細胞膜上のコレステロール及びリン脂質と相互作用し、それにより界面活性剤として作用する。この作用は、下記の実験の項に記載のように、ヒツジ赤血球で行われる溶血アッセイにおいて定量される。
【0074】
サポニンの溶媒効果は接種物の周囲の組織との溶菌反応をもたらす。したがって、サポニンをワクチンアジュバントとして使用するための推奨投与量は、注射部位に臨床的に重大な有害反応を（潰瘍、壊死などの形で）引き起こさず、良好な免疫刺激効果を達成するというバランスを反映したものでなければならない。しかしこれは、それらのアジュバントを適用する際に投与量に関していくつかの制限を与える。
【0075】
NanoQuil F-70及び他のサポニン含有粒子アジュバントを調製するとき、コレステロールとともに、この場合はNanoQuil F70複合体への取り込みによって固定化されない遊離サポニンがある程度過剰に存在する可能性がある。
【0076】
この遊離サポニンは、上記のように周囲の組織で溶解反応を誘導する能力を依然として有することになる。ワクチン接種においてサポニンベースのアジュバントが受け入れられるためには、サポニンの免疫増強効果に影響を及ぼすことなく、膜を溶解するその潜在的な能力をできるだけ低くする必要がある。この目的のために、NanoQuil F70ナノ粒子の精製ステップは、許容可能な生成物を確保するために必要である。
【0077】
本出願人は、ゲル濾過（以下ではサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣと呼ばれる）が、粗生成物から過剰なサポニンを十分に除去することを見出した。さらに、ＳＥＣの方法論は工業生産規模に容易に拡張可能である。
【0078】
ゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣとも呼ばれる）は、カラムに充填されたゲル濾過媒体を分子が通過する際に、大きさの違いに応じて分子を分離する。イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーとは違って、分子はクロマトグラフィー媒体に結合せず、その結果緩衝液の組成は分離度（ピーク間の分離の程度）に直接影響しない。したがって、ゲル濾過の大きな利点は、試料の種類又はさらなる精製、分析若しくは保存のための要件に適合するように、分離を変えることなく条件を変えることができることである。
【0079】
１つの実施形態では、残留サポニンの除去は、例えばSephacryl 300又は当業者が進歩性を有する熟練なしで選択できると思われる他のゲル濾過媒体を用いて実施される。ＳＥＣ方法論は２０～５０ｎｍの平均サイズ（反応媒体に依る流体力学的直径）をもつNanoQuil F70粒子を、～５ｎｍの平均サイズを有する残留サポニンミセルから分離することができ、それによって溶解作用が大幅に減少した生成物を得ることができる。
【0080】
NanoQuil F70ナノ粒子の溶血活性に対する過剰サポニンの除去の効果は、下記の実験の項に満遍なく記載されており、「未加工」ナノ粒子の溶血作用をＳＥＣ精製粒子と比較することによって容易に示すことができる。（図９及び１０を参照）。
【0081】
分析されたnanoQuil F70ナノ粒子（複合体化されたQuilAを含有）の溶血作用は、「QuilA相当量」として最も効率的に提示される。QuilA自体と比較して、未精製（未加工）nanoQuil F70は、１ｍｇ／ｍＬのQuilA相当濃度で溶血作用を誘導する。２ｍｇ／ｍＬの未精製nanoQuil F70では、溶血作用は０．２ｍｇ／ｍＬの遊離QuilAの溶血作用と同程度である。したがって、この調製物の溶血作用は、QuilA自体に対して約１０倍減少したと見なすことができる。
【0082】
Sephacryl 300-HR精製nanoQuil F70は、２ｍｇ／ｍＬのQuilA相当濃度まで溶血作用を示さない。４ｍｇ／ｍＬでは、精製nanoQuil F70は、０．１ｍｇ／ｍＬの遊離QuilA又は１ｍｇ／ｍＬの未精製nanoQuil F70によって誘導される溶血作用よりも低い又はそれと同程度の溶血作用を示す。したがって、精製nanoQuil F70ナノ粒子の溶血作用は、QuilA自体に対して少なくとも４０倍減少した、又は未加工nanoQuil F70に対して約４倍減少したと見なすことができる。
【0083】
nanoQuil F70粒子のＳＥＣ精製のこの効果（溶解作用の減少）は驚くほど高く、そのうえ、局所反応源性を同時に増加させることなくサポニン含有アジュバントを安全に注入できる量の上限を上げるので、治療の観点から非常に重要である。その結果、アジュバントとしてnanoQuil F70粒子を使用することにより、所与の注射でより高い免疫応答を誘導することが可能になりうる。
【0084】
本発明の好ましい実施形態では、サポニン含有nanoQuil F70ナノ粒子によって誘導される溶血作用は、未加工又は粗製nanoQuil F70ナノ粒子に対して行われるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などのゲル濾過技術を用いると、純粋な複合体を形成していない形態の同一のサポニン、例えばQuilAなどによって誘導される溶血作用と比較して少なくとも２０倍、例えば２０倍、３０倍又は４０倍など減少する。
【0085】
国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレットに開示の手順の方法ステップを本発明の方法ステップと比較すると、第２の態様のnanoQuil F70ナノ粒子を画定する構造的特性は、製造手順の改変の直接的な結果であることは明らかである。
【0086】
したがって、特定の実施形態では、本発明の第１の態様によるナノ粒子は、第２の態様による方法によって得ることができる。
【0087】
ワクチンアジュバントとしてのそれらの使用のほかに、本発明によるnanoQuil F70ナノ粒子は、例えば、がんの治療に用いられるものを含む医薬品並びに追加の物質が追加の機能及び補完的な作用様式を提供する栄養関連化合物のための１個又は数個の化合物の送達システムとしても使用することができる。
【0088】
第３の態様では、NanoQuil F70ナノ粒子及びそれを含む組成物はそれ自体で、医薬として、任意選択で、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤賦形剤、添加剤、アジュバント及び／又は担体をさらに含む医薬組成物中で使用することができる。
【0089】
好適な薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤としては、任意の及びすべての従来の溶媒、分散媒体、充填剤、固体担体、水溶液、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該分野で周知であり、例として、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company、米国ペンシルベニア州に記載されている。いずれかの従来の媒体又は薬剤が有効成分と相容れない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分を組成物に組み込むこともできる。
【0090】
本発明はまた、少なくとも１つの薬剤的に活性な化合物、例えば、抗がん剤、白金配位化合物、タキサン化合物、カンプトテシン化合物、抗腫瘍性ビンカアルカロイド、抗腫瘍性ヌクレオシド誘導体、ナイトロジェンマスタード又はニトロソウレアアルキル化剤、抗腫瘍性アントラサイクリン誘導体、トラスツズマブ及び抗腫瘍性ポドフィロトキシン誘導体、キラヤ・サポナリア・モリーナ及びそれらのサブ断片（sub fragments）、抗体又はモノクローナル抗体の受容体、例えばＦｃ受容体又は黄色ブドウ球菌のプロテインＡのＤＤ（the DD of Protein A of Staphylococcus aureus）、がんを治療するための薬剤、例えばシタラビン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、トリセル及びトラベクチジンからなる群より選択される薬剤などをさらに含む医薬組成物を含み、その活性化合物はナノ粒子に組み込まれていてもよく、組成物と混合されていてもよい。
【0091】
さらなる抗がん剤は、好ましくは、白金配位化合物、タキサン化合物、カンプトテシン化合物、抗腫瘍性ビンカアルカロイド、抗腫瘍性ヌクレオシド誘導体、ナイトロジェンマスタード又はニトロソウレアアルキル化剤、抗腫瘍性アントラサイクリン誘導体、トラスツズマブ及び抗腫瘍性ポドフィロトキシン誘導体から選択される。
【0092】
「白金配位化合物」という用語は、本明細書において、イオンの形態で白金を供給する任意の腫瘍細胞増殖阻害白金配位化合物を意味するために使用される。好ましい白金配位化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、塩化クロロ（ジエチレントリアミン）白金（ＩＩ）、ジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）、ジアミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）、スピロプラチン、イプロプラチン、ジアミン（２－エチルマロナト）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）、（４－カルボキシフタロ－１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソシトラト）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－シス－（ピルバト）白金（ＩＩ）、（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－オキサラト－白金（ＩＩ）、オルマプラチン及びテトラプラチンが挙げられる。
【0093】
シスプラチンは、例えば、商品名Platinolでブリストル・マイヤーズスクイブ社から、水、滅菌生理食塩水又は他の好適な溶媒で構成する（constitution）ための粉末として市販されている。他の白金配位化合物及びそれらの医薬組成物は市販され、かつ／又は従来の技術によって調製することができる。
【0094】
タキサン化合物としては、例えばブリストル・マイヤーズスクイブのTaxol、ローヌ・プーランク・ローラーのドセタキセル（Taxotere）、及びサノフィパスツールのCabazitaxelが挙げられる。他のタキサン化合物は、例えば欧州特許第２５３７３８号、欧州特許第２５３７３９号及び国際公開第９２／０９５８９号パンフレットに記載の従来の方法で、又はそれに類似する方法によって調製することができる。
【0095】
カンプトテシン化合物にはイリノテカンとトポテカンがある。イリノテカンは、例えばローヌ・プーランク・ローラーから商品名Camptoで市販されており、例えば欧州特許第１３７１４５号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。トポテカンは、例えばスミスクライン・ビーチャムから商品名Hycamtinで市販されており、例えば欧州特許第３２１１２２号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。他のカンプトテシン化合物は、従来の方法、例えば、イリノテカン及びトポテカンについて上記された方法に類似の方法によって調製することができる。
【0096】
抗腫瘍ビンカアルカロイドとしては、上記のビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。ビンブラスチンは、例えば注射用硫酸塩としてイーライリリー社から商品名Velbanで市販されており、例えば独国特許第２１２４０２３号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。ビンクリスチンは、例えば注射用硫酸塩としてイーライリリー社から商品名Oncovinで市販されており、例えば上記の独国特許第２１２４０２３号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。ビノレルビンは、例えば注射用酒石酸塩としてグラクソ・ウエルカムから商品名Navelbineで市販されており、例えば米国特許第４３０７１００号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。他の抗腫瘍ビンカアルカロイドは、従来の方法で、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンについて上記された方法に類似の方法によって調製することができる。
【0097】
抗腫瘍ヌクレオシド誘導体としては、上記の５－フルオロウラシル、ゲムシタビン及びカペシタビンが挙げられる。５－フルオロウラシルは広く市販されており、例えば米国特許第２８０２００５号に記載のように調製することができる。ゲムシタビンは、例えばイーライリリーから商品名Gemzarで市販されており、例えば欧州特許第１２２７０７号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。
【0098】
カペシタビンは、例えばホフマン・ラ・ロシュから商品名Xelodaで市販されており、例えば欧州特許第６９８６１１号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。他の抗腫瘍ヌクレオシド誘導体は、従来の方法、例えばカペシタビン及びゲムシタビンについて上記された方法に類似の方法によって調製することができる。
【0099】
ナイトロジェンマスタード化合物としては、シクロホスファミド及びクロラムブシルが挙げられる。シクロホスファミドは、例えばブリストル・マイヤーズスクイブから商品名Cytoxanで市販されており、例えば英国特許第１２３５０２２号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。クロラムブシルは、例えばグラクソ・ウエルカムから商品名Leukeranで市販されており、例えば米国特許第３０４６３０１号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。本発明における使用のための好ましいニトロソウレア化合物としては、上記のカルムスチン及びロムスチンが挙げられる。カルムスチンは、例えばブリストル・マイヤーズスクイブから商品名BiCNUで市販されており、例えば欧州特許第９０２０１５号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。ロムスチンは、例えばブリストル・マイヤーズスクイブから商品名CeeNUで市販されており、例えば米国特許第４３７７６８７号明細書に記載されているように、又はそれに類似する方法によって調製することができる。
【0100】
抗腫瘍アントラサイクリン誘導体としては、上記のダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシンが挙げられる。ダウノサシンは、例えば塩酸塩としてＢｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商品名Cerubidineで市販されており、例えば、米国特許第４０２０２７０号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。
【0101】
ドキソルビシンは、例えば塩酸塩としてアストラから市販されており、例えば米国特許第３８０３１２４号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。イダルビシンは、例えば塩酸塩として、ファルマシア＆アップジョンから商品名Idamycinで市販されており、例えば米国特許第４０４６８７８号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。他の抗腫瘍アントラサイクリン誘導体は、従来の方法、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシンについて上記された方法に類似する方法によって調製することができる。
【0102】
トラスツズマブは、ジェネンテックから商品名Herceptinで市販されており、米国特許第５８２１３３７号明細書又はＰＣＴ特許明細書の国際公開第９４／０４６７９号パンフレット及び国際公開第９２／２２６５３号パンフレットに記載のように得ることができる。
【0103】
抗腫瘍抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体としては、エトポシド及びテニポシドが挙げられる。エトポシドは、例えばブリストル・マイヤーズスクイブから商品名VePesidで市販されており、例えば欧州特許第１１１０５８号明細書に記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。テニポシドは、例えばブリストル・マイヤーズスクイブから商品名Vumonで市販されており、例えばＰＣＴ特許明細書の国際公開第９３／０２０９４号パンフレットに記載のように、又はそれに類似の方法によって調製することができる。他の抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は、従来の方法、例えばエトポシド及びテニポシドについて上記された方法と類似の方法によって調製することができる。
【0104】
したがって、抗がん剤は、例えば以下から選ぶことができる。
１．多官能アルキル化剤：
ニトロソウレア、マスタード（ナイトロジェンマスタード）、メタンスルホン酸塩（ブスルファン）、エチレンイミン
２．他のアルキル化剤：
プロカルバジン（Matulane）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アルトレタミン（Hexalen）、シスプラチン（Platinol）
３．代謝拮抗剤
抗葉酸化合物（メトトレキサート）、アミノ酸拮抗薬（アザセリン）
４．プリン拮抗薬
メルカプトプリン（６－ＭＰ）、チオグアニン（６－ＴＧ）、リン酸フルダラビン、クラドリビン（Leustatin）、ペントスタチン（Nipent）
５．ピリミジン拮抗薬
フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃ）、アザシチジン
６．植物アルカロイド
ビンブラスチン（Velban）、ビンクリスチン（Oncovin）、エトポシド（ＶＰ－１６、VePesid）、テニポシド（Vumon）、トポテカン（Hycamtin）、イリノテカン（Camptosar）、パクリタキセル（Taxol）、ドセタキセル（Taxotere）
７．抗生物質
アントラサイクリン、ドキソルビシン（アドリアマイシン、Rubex、Doxil）、ダウノルビシン（DaunoXome）、ダクチノマイシン（Cosmegen）、イダルビンシン（Idamycin）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（Mutamycin）、ブレオマイシン（Blenoxane）
８．モノクローナル抗体
９．ホルモン剤
タモキシフェン（Nolvadex）、フルタミド（Eulexin）、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリド及びゴセレリン（ゾラデックス））、アロマターゼ阻害剤、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Arimidex）
１０．他の抗がん剤
アムサクリン、ヒドロキシウレア（Hydrea）、アスパラギナーゼ（Elspar）、ミトキサントロン（Novantrone）、ミトタン、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子、アミフォスチン
１．多官能アルキル化剤：
ニトロソウレア、マスタード（ナイトロジェンマスタード）、メタンスルホン酸塩（ブスルファン）、エチレンイミン
２．他のアルキル化剤：
プロカルバジン（Matulane）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アルトレタミン（Hexalen）、シスプラチン（Platinol）
３．代謝拮抗剤
抗葉酸化合物（メトトレキサート）、アミノ酸拮抗薬（アザセリン）
４．プリン拮抗薬
メルカプトプリン（６－ＭＰ）、チオグアニン（６－ＴＧ）、リン酸フルダラビン、クラドリビン（Leustatin）、ペントスタチン（Nipent）
５．ピリミジン拮抗薬
フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃ）、アザシチジン
６．植物アルカロイド
ビンブラスチン（Velban）、ビンクリスチン（Oncovin）、エトポシド（ＶＰ－１６、VePesid）、テニポシド（Vumon）、トポテカン（Hycamtin）、イリノテカン（Camptosar）、パクリタキセル（Taxol）、ドセタキセル（Taxotere）
７．抗生物質
アントラサイクリン、ドキソルビシン（アドリアマイシン、Rubex、Doxil）、ダウノルビシン（DaunoXome）、ダクチノマイシン（Cosmegen）、イダルビンシン（Idamycin）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（Mutamycin）、ブレオマイシン（Blenoxane）
８．モノクローナル抗体
９．ホルモン剤
タモキシフェン（Nolvadex）、フルタミド（Eulexin）、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリド及びゴセレリン（ゾラデックス））、アロマターゼ阻害剤、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Arimidex）
１０．他の抗がん剤
アムサクリン、ヒドロキシウレア（Hydrea）、アスパラギナーゼ（Elspar）、ミトキサントロン（Novantrone）、ミトタン、レチノイン酸誘導体、骨髄増殖因子、アミフォスチン
【0105】
両親媒性分子及び疎水性分子は、抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物、及び栄養物から選択でき、本発明によるnanoQuil F70ナノ粒子に組み込まれてもよく、又は組成物中でそのナノ粒子と混合されてもよい。本発明による組成物はまた、別個のナノ粒子に組み込まれた異なる両親媒性分子及び疎水性分子を含んでもよい。
【0106】
本発明のNanoQuil F70ナノ粒子を含む医薬組成物は、上記のように、例えば開発中のワクチン若しくは認可されたワクチンで既に実際に使われているワクチンと組み合わせて使用するための、場合、季節性インフルエンザワクチンと組み合わせて使用するための、パンデミックインフルエンザワクチンと組み合わせて使用するための、又は緊急時ワクチン、例えば生物兵器に対するワクチンなどと組み合わせて使用するための、又は薬物送達システムの成分として使用するためのワクチンアジュバントとして使用することができる。したがって、本発明のNanoQuil F70ナノ粒子は、ヒトへの使用のためと獣医学的使用のため両方のワクチンのアジュバントとして有用である。
【0107】
したがって、本発明はまた、本発明によるNanoQuil F70粒子を、特に上記のアジュバントとして含む薬学的ワクチン製剤、例えばヒト又は獣医学ワクチンなどに関わる。
【0108】
好ましい実施形態では、ＱＳ－２１サポニンを含むNanoQuil F70粒子は、ヒトワクチンのアジュバントとして使用するのに特に適している。別の実施形態では、QuilAサポニンを含むNanoQuil F70粒子は、獣医学ワクチンのアジュバントとして使用するのに特に適している。
【0109】
別の実施形態では、医薬組成物は、１つ又は複数のステビオールグリコシドなどのジテルペンをさらに含む。
【0110】
本発明はまた、生物によって引き起こされる又は悪化する疾患を治療又は予防する方法であって、本発明による医薬ワクチン製剤を、対象に、それを必要とする人に投与することを含む方法に関する。
【0111】
さらに、本発明は、薬学的に有効な量の本発明によるナノ粒子又は組成物を、それを必要とする患者に投与することを含むがんの治療方法に関する。１つの実施形態によれば、前記がんは、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、卵巣がん、頸がん、肺がん、肝がん、腎臓がん、口腔がん、血液がんである。がんは以下に位置している可能性がある。副腎（副腎がん、副腎の腺癌、副腎皮質癌腫；肛門、肛門がん（肛門扁平上皮癌腫）；膀胱がん（膀胱扁平上皮癌腫）、膀胱がん（膀胱の移行上皮癌腫）；血液、播種性血管内凝固症候群、低ナトリウム血症、好中球減少性敗血症、腫瘍崩壊症候群；骨、内軟骨腫（軟骨腫、オリエ病）、ユーイング肉腫、骨肉腫、（骨原性肉腫）、骨転移、骨がん（軟骨の軟骨肉腫）；骨髄、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；脳、脳腫瘍（脳の多形性膠芽腫）、脳腫瘍（脳の神経膠腫）、脳のリンパ腫、髄芽腫／原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）（髄芽腫／原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ））、脳の髄膜腫、神経芽腫、能の原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、脳への転移、聴神経腫瘍、脳腫瘍（脳星細胞腫）；乳房、乳がん（乳房の癌腫）、乳がん（乳房の炎症性癌腫）、男性乳がん（男性乳癌腫）、乳がん（浸潤性乳癌腫）（浸潤性乳癌腫（乳がん））、乳がん（前浸潤性小葉状癌腫；非浸潤性小葉癌腫；ＬＣＩＳ）（前浸潤性小葉状癌腫（非浸潤性小葉癌腫；ＬＣＩＳ；乳がん））、乳がん（前浸潤性乳管癌；非浸潤性小葉癌；ＤＣＩＳ）（前浸潤性乳管癌（非浸潤性小葉癌；ＤＣＩＳ；乳がん））；盲腸、腸がん（盲腸の腺癌）；子宮頸部、子宮頸がん（子宮頸部の扁平上皮癌腫）；結腸直腸、結腸がん（結腸の腺癌）、直腸がん（直腸の腺癌）、頭頸部、扁桃がん（扁桃のリンパ腫）、喉頭のがん（喉頭がん、喉頭の扁平上皮癌腫）、咽頭がん（咽頭の扁平上皮癌腫）、舌がん（舌の扁平上皮癌腫）、咽喉がん（扁桃の扁平上皮癌腫）、口腔がん（口底の扁平上皮癌腫）；腎臓、腎がん（腎細胞癌腫；ＲＣＣ）；肝臓、肝がん（肝細胞癌腫）、肝臓への転移；肺、肺がん（肺の大細胞癌腫）、胸水、肺がん（肺の腺癌）、小細胞肺がん（肺の癌腫）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、胸膜の悪性中皮腫、肺がん（肺の扁平上皮癌腫）；リンパ系；ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、脳リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）；筋肉、胆管のがん（胆管癌腫胆道がん）、筋肉の平滑筋肉腫、筋肉の横紋筋肉腫、軟部肉腫；食道、食道がん（食道の扁平上皮癌腫）、食道がん（食道の腺癌）；卵巣、卵巣がん（卵巣の腺癌）；膵臓、膵がん（膵臓の腺癌）、膵神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）；陰茎、陰茎のがん（陰茎の扁平上皮癌腫）、ペロニー病；下垂体、下垂体がん（下垂体の癌腫）、抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（サイアド）（抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（サイアド））；前立腺、前立腺がん（前立腺の神経内分泌癌腫）、前立腺がん（前立腺の腺癌）；皮、皮膚がん（皮膚の基底細胞癌腫）、皮膚がん（皮膚の扁平上皮癌腫）、メルケル細胞癌腫（ＭＣＣ）、皮膚がん（悪性皮膚黒色腫）、ほくろ（良性色素性病変、良性メラノサイト系病変、メラノサイト性母斑、母斑細胞性母斑）；小腸、小腸がん（小腸のリンパ腫）、小腸がん（小腸の腺癌）；脊髄、脊髄神経膠腫、脊髄の髄膜腫、脊髄への転移、脊髄星細胞腫（腫瘍）、脊髄がん（脊髄のリンパ腫）；胃、ゾリンジャー・エリソン症候群（ガストリノーマ）、胃のリンパ腫（胃リンパ腫）、胃がん（胃の腺癌）；精巣、精巣がん（精巣のセミノーマ）、精巣がん（精巣の奇形腫）；甲状腺、甲状腺がん（甲状腺の濾胞細胞）、甲状腺の髄質細胞、甲状腺の乳頭細胞、甲状腺がん（甲状腺の未分化）；子宮、妊娠性絨毛性疾患（奇胎妊娠）（奇胎妊娠（妊娠性絨毛性疾患、ＧＴＤ））、子宮がん（子宮内膜の腺癌）；外陰部、外陰がん（外陰部の扁平上皮癌腫）；他のがん、原発不明の腫瘍（ＴＵＰ）、慢性疼痛症候群、カルチノイド腫瘍及びカルチノイド症候群、神経内分泌腫瘍；他のがん疾患、慢性疾患の貧血、がん疼痛、脊椎手術後痛症候群（ＦＢＳＳ）、ＨＩＶエイズ（ヒト免疫不全ウイルス及び後天性免疫不全症候群）、腎疾患－慢性腎不全、栄養失調、聴器毒性、点状出血性皮膚紫斑病、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）。
【0112】
nanoQuil F70ナノ粒子のがん細胞に対する効果の例は、下記の実施例の項に示されている。
【0113】
医薬組成物は、滅菌された注射可能な水性又は油性懸濁液の形態でありうる。この懸濁液は、上記の好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、既知の技術に従って製剤化することができる。また、滅菌注射可能調製物は、非毒性非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射可能溶液又は懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油が従来から溶媒又は懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用されている。
【0114】
溶液又は懸濁液はまた、次のアジュバントのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調整剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器又はガラス若しくはプラスチック製の複数回投与量容器（multiple dosage vessels）に封入することができる。
【0115】
一般に、本発明のNanoQuil F70粒子は薬学的に有効な量で投与される。実際に投与される粒子の量は、典型的には、治療される状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況に照らして、医師によって決定されることになる。
【0116】
本発明によるナノ粒子は、任意の微生物に対する任意のワクチンにおけるアジュバントとして使用することができる。鳥、ヒトなどの哺乳動物、ネコや、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどの家畜に使用することができる。１つの実施形態によれば、本発明は、動物のレンサ球菌に対するワクチン及びウマのインフルエンザに対するワクチンのアジュバントとして使用される。
【0117】
nanoQuil F70ナノ粒子のワクチンアジュバントとしての効果の例は、下記の実施例の項に示されている。
【0118】
ヒトへの使用と獣医学的使用のための投与量はともに、含まれる他の化合物に応じて変えることができる。治療の期間を考慮して、投与量は１日＜５０μｇから１ｍｇ以上までの範囲とすることができる。
【実施例】
【0119】
実施例１ － 反応媒体としてＰＢＳ又は酢酸緩衝液を用いた未加工NanoQuil F70ナノ粒子の製造
材料
・植物コレステロール ロットＳＣＯＬ１２９－２ 材料コード：Ｃ１２３１、シグマアルドリッチ
・Quil A原液１００ｍｇ／ｍＬ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ株式会社（A/S）
・ＰＢＳ緩衝液 ｐＨ７．４、又は酢酸２～１０ｍＭ緩衝液 ｐＨ４．６
・蒸留水
・生理食塩水（蒸留水中０．８５％ＮａＣｌ）
・アセトン、欧州薬局方 ≧９９．５％
・５０ｍＬ容セルスターチューブ
・エアーポンプ Eheim200、型３７０２０１０
・サーモシェーカー及びスマートコントロール付きブロックサーモスタット オランダヘティヒラボテクノロジー（Hettich Lab Technology）製ＭＫＲ１３
・Sorvall ST16R遠心機、サーモサイエンティフィック
・クリーンベンチ、ホルトン サーモフィッシャーサイエンティフィック
・減圧濾過、１０００ｍＬ、ＳＦＣＡ、０．２２μＭ 滅菌済み、ＶＷＲ 欧州商品コード５１４－１０５８
・ピペット及びチップ（滅菌済み）
材料
・植物コレステロール ロットＳＣＯＬ１２９－２ 材料コード：Ｃ１２３１、シグマアルドリッチ
・Quil A原液１００ｍｇ／ｍＬ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ株式会社（A/S）
・ＰＢＳ緩衝液 ｐＨ７．４、又は酢酸２～１０ｍＭ緩衝液 ｐＨ４．６
・蒸留水
・生理食塩水（蒸留水中０．８５％ＮａＣｌ）
・アセトン、欧州薬局方 ≧９９．５％
・５０ｍＬ容セルスターチューブ
・エアーポンプ Eheim200、型３７０２０１０
・サーモシェーカー及びスマートコントロール付きブロックサーモスタット オランダヘティヒラボテクノロジー（Hettich Lab Technology）製ＭＫＲ１３
・Sorvall ST16R遠心機、サーモサイエンティフィック
・クリーンベンチ、ホルトン サーモフィッシャーサイエンティフィック
・減圧濾過、１０００ｍＬ、ＳＦＣＡ、０．２２μＭ 滅菌済み、ＶＷＲ 欧州商品コード５１４－１０５８
・ピペット及びチップ（滅菌済み）
【0120】
手順
１．植物由来コレステロールを、３．１２５ｍｇ／チューブ×５チューブ＝１５．６２５ｍｇ秤量する。
２．そのコレステロールに５ｍＬのアセトンを加え、ボルテックスでよく溶かす。
３．そのコレステロール溶液を１ｍＬ／チューブで分注する。
４．コレステロールを試験管のＶ底に均一に堆積させるために、チューブを回転させながらチューブ内に空気をポンプ注入してアセトンを蒸発させる。
５．７０℃の温かい水性反応媒体（５０ｍＬ／）：蒸留水、食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）又はＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加える。
６．１００ｍｇ／ｍＬのQuil A原液を５００μＬ／チューブに加え、１ｍｇ／ｍＬのQuil A溶液を得る。
７．．ＭＫＲ１３（材料の項を参照）上で７０℃にて６０分間インキュベートする。
８．４℃に直ちに冷やす。
９．４℃で一晩保存する。
１０．４６９６×Ｇで４５分間遠心分離する。
１１．プールした上清を０．２２μＭのフィルターを通して濾過する。
１．植物由来コレステロールを、３．１２５ｍｇ／チューブ×５チューブ＝１５．６２５ｍｇ秤量する。
２．そのコレステロールに５ｍＬのアセトンを加え、ボルテックスでよく溶かす。
３．そのコレステロール溶液を１ｍＬ／チューブで分注する。
４．コレステロールを試験管のＶ底に均一に堆積させるために、チューブを回転させながらチューブ内に空気をポンプ注入してアセトンを蒸発させる。
５．７０℃の温かい水性反応媒体（５０ｍＬ／）：蒸留水、食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）又はＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加える。
６．１００ｍｇ／ｍＬのQuil A原液を５００μＬ／チューブに加え、１ｍｇ／ｍＬのQuil A溶液を得る。
７．．ＭＫＲ１３（材料の項を参照）上で７０℃にて６０分間インキュベートする。
８．４℃に直ちに冷やす。
９．４℃で一晩保存する。
１０．４６９６×Ｇで４５分間遠心分離する。
１１．プールした上清を０．２２μＭのフィルターを通して濾過する。
【0121】
実施例２ － 再現性試験
上記実施例１で概説した手順の再現性を評価するために、NanoQuil F70ナノ粒子を、２０１８年７月１８日、１９日及び２０日の連続３日間に３回製造した。これらの３つのバッチ（試験－１、－２及び－３）のNanoQuil F70を、バッチ（２５０ｍＬ）毎に５～５０ｍＬのファルコンチューブ中で製剤化し、NanoQuil F70の名称が示唆するように７０℃で１時間インキュベートした（７０℃での製剤化）。非限定的な例として、製剤化プロトコールは次のように単純化することができる。
・植物コレステロールを１５．６２５ｍｇ秤量する。
・そのコレステロールに５ｍＬのアセトンを加え、よく溶かす。
・５～５０ｍＬのファルコンチューブにそのコレステロール溶液を１ｍＬ／チューブで分注する。
・コレステロールを各チューブのＶ底に均一に堆積させるために、チューブを回転させながらチューブ内に空気をポンプ注入してアセトンを蒸発させる。
・７０℃のＰＢＳを５０ｍＬ／チューブ加える。
・５００μＬ／チューブの１００ｍｇ／ｍＬのQuil A原液を加えて、１ｍｇ／ｍＬのQuil A溶液を得る。
・７０℃で６０分間インキュベートする。
・４℃に直ちに冷やす。
・４℃で一晩保存する。
・４６９６×ｇで４５分間遠心する。
・プールした上清を０．２２μＭフィルターに通して濾過する。
・４℃で保存する。
上記実施例１で概説した手順の再現性を評価するために、NanoQuil F70ナノ粒子を、２０１８年７月１８日、１９日及び２０日の連続３日間に３回製造した。これらの３つのバッチ（試験－１、－２及び－３）のNanoQuil F70を、バッチ（２５０ｍＬ）毎に５～５０ｍＬのファルコンチューブ中で製剤化し、NanoQuil F70の名称が示唆するように７０℃で１時間インキュベートした（７０℃での製剤化）。非限定的な例として、製剤化プロトコールは次のように単純化することができる。
・植物コレステロールを１５．６２５ｍｇ秤量する。
・そのコレステロールに５ｍＬのアセトンを加え、よく溶かす。
・５～５０ｍＬのファルコンチューブにそのコレステロール溶液を１ｍＬ／チューブで分注する。
・コレステロールを各チューブのＶ底に均一に堆積させるために、チューブを回転させながらチューブ内に空気をポンプ注入してアセトンを蒸発させる。
・７０℃のＰＢＳを５０ｍＬ／チューブ加える。
・５００μＬ／チューブの１００ｍｇ／ｍＬのQuil A原液を加えて、１ｍｇ／ｍＬのQuil A溶液を得る。
・７０℃で６０分間インキュベートする。
・４℃に直ちに冷やす。
・４℃で一晩保存する。
・４６９６×ｇで４５分間遠心する。
・プールした上清を０．２２μＭフィルターに通して濾過する。
・４℃で保存する。
【0122】
結果と考察
１． 生成物のQuil A回収
製造したNanoQuil F70ナノ粒子のQuil A含有量を、オルシノール試験（ビアル試験としても知られる）を用いて測定した。結果を図１２にグラフで示す。３つの試験バッチでは、Quil Aの回収率はそれぞれ９１．５％、９３．８％及び９８．３％と高く、すなわちすべて９０％超であった。
１． 生成物のQuil A回収
製造したNanoQuil F70ナノ粒子のQuil A含有量を、オルシノール試験（ビアル試験としても知られる）を用いて測定した。結果を図１２にグラフで示す。３つの試験バッチでは、Quil Aの回収率はそれぞれ９１．５％、９３．８％及び９８．３％と高く、すなわちすべて９０％超であった。
【0123】
２． 粒径
動的光散乱（ＤＬＳ）分析で測定した３つの製剤の平均粒径は、それぞれ４６．３２±１．４８ｎｍ、４０．０７±０．９８ｎｍ及び４２．２０±０．７４ｎｍであった。図５を参照。図１３にＤＬＳ測定のグラフによる概要を示す。
動的光散乱（ＤＬＳ）分析で測定した３つの製剤の平均粒径は、それぞれ４６．３２±１．４８ｎｍ、４０．０７±０．９８ｎｍ及び４２．２０±０．７４ｎｍであった。図５を参照。図１３にＤＬＳ測定のグラフによる概要を示す。
【0124】
３． 溶血作用の減少
３つのバッチの溶血減少率はかなり類似しており、試験－１で３１％、試験－２で２９％、試験－３で３１％である（図１４の棒グラフを参照）。これは、Quil AをF70に製剤化することによる副作用の同程度の減少レベル、すなわち副作用減少における高い程度の再現性が達成されたと見ることができる。しかし、試験バッチはすべて、ワクチンアジュバントとしては許容できないほど高い程度に溶血を誘発することが見られた。
３つのバッチの溶血減少率はかなり類似しており、試験－１で３１％、試験－２で２９％、試験－３で３１％である（図１４の棒グラフを参照）。これは、Quil AをF70に製剤化することによる副作用の同程度の減少レベル、すなわち副作用減少における高い程度の再現性が達成されたと見ることができる。しかし、試験バッチはすべて、ワクチンアジュバントとしては許容できないほど高い程度に溶血を誘発することが見られた。
【0125】
４． 他の反応媒体で製造したNanoQuil F70ナノ粒子
４つの異なる溶媒：蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、生理食塩水（Ｄ．Ｗ．中０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、NanoQuil F70プロトコールに従ってNanoQuil F70ナノ粒子を製造した。粒径（流体力学的直径）の違いが、これらの製剤においてＤＬＳによって観察された。ＰＢＳで製剤化したNanoQuil F70が最も大きいサイズ（約４２ｎｍ）を示し、生理食塩水で製剤化したNanoQuil F70（約３５ｎｍ）が続いた。酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及び蒸留水で製剤化したNanoQuil F70粒子は、それぞれ約２５及び２４ｎｍの粒径を示す（図１５の棒グラフを参照）。
４つの異なる溶媒：蒸留水（Ｄ．Ｗ．）、生理食塩水（Ｄ．Ｗ．中０．８５％ＮａＣｌ）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、NanoQuil F70プロトコールに従ってNanoQuil F70ナノ粒子を製造した。粒径（流体力学的直径）の違いが、これらの製剤においてＤＬＳによって観察された。ＰＢＳで製剤化したNanoQuil F70が最も大きいサイズ（約４２ｎｍ）を示し、生理食塩水で製剤化したNanoQuil F70（約３５ｎｍ）が続いた。酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）及び蒸留水で製剤化したNanoQuil F70粒子は、それぞれ約２５及び２４ｎｍの粒径を示す（図１５の棒グラフを参照）。
【0126】
実施例３ － Sephacryl S300-HRクロマトグラフィーを用いた未加工NanoQuil F70粒子のサイズ分離
細胞溶解を増加させやすい遊離（取り込まれていない）サポニンをNanoQuil F70粒子から除去するために、粗製NanoQuil F70生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製する。
細胞溶解を増加させやすい遊離（取り込まれていない）サポニンをNanoQuil F70粒子から除去するために、粗製NanoQuil F70生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製する。
【0127】
１３ｍＬの量のSephacryl S300-HR（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）をＰＤ－１０カートリッジに入れ、ＰＢＳ緩衝液また酢酸緩衝液で平衡化した。上記の実施例１に従って製造した１ｍＬの量の未加工NanoQuil F70粒子をカラムの上部に充填し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ材料を通して重力により透過させた。１ｍＬの画分を集めて、ＲＰ‐ＨＰＬＣを用いてサポニンとコレステロール含量を分析し、かつ溶血活性を試験した。
【0128】
nanoQuil F70のＳＥＣ画分のＲＰ－ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣをS300-HR画分中のサポニン及びコレステロールを検出及び定量する手段として用いた。全サポニンとコレステロール含量は、ＨＰＬＣ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）からのシグナルの積分として表され、S300-HR溶出体積の関数としてプロットした。ナイルレッド蛍光検出法（下記参照）と同様に、S300-HRクロマトグラムでは、サポニンが６～７ｍＬと９～１０ｍＬを中心とする２つのピークが示され、コレステロールは、NanoQuil粒子で予想されるように、主として６～７ｍＬのピークと関連している。
ＨＰＬＣをS300-HR画分中のサポニン及びコレステロールを検出及び定量する手段として用いた。全サポニンとコレステロール含量は、ＨＰＬＣ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）からのシグナルの積分として表され、S300-HR溶出体積の関数としてプロットした。ナイルレッド蛍光検出法（下記参照）と同様に、S300-HRクロマトグラムでは、サポニンが６～７ｍＬと９～１０ｍＬを中心とする２つのピークが示され、コレステロールは、NanoQuil粒子で予想されるように、主として６～７ｍＬのピークと関連している。
【0129】
方法：
NanoQuil F70のＳＥＣ分画からの各S300HR画分１００μＬをKromasil C4カラムでショートクロマトグラムを用いて分析した。図１６の棒グラフは、サポニンのピーク及びコレステロールのピークの合計に相当するS300HR画分の積分されたＣＡＤシグナルを示す。
NanoQuil F70のＳＥＣ分画からの各S300HR画分１００μＬをKromasil C4カラムでショートクロマトグラムを用いて分析した。図１６の棒グラフは、サポニンのピーク及びコレステロールのピークの合計に相当するS300HR画分の積分されたＣＡＤシグナルを示す。
【0130】
ナイルレッド蛍光分析
S300-HRによるＳＥＣ画分（４５μＬの画分＋５μＬの蛍光読み取り用１０μＭナイルレッド）の蛍光色素ナイルレッドによる分析は、サポニンの分布を示す。図１７の棒グラフを参照。ナイルレッド（ＮＲ）の蛍光は、水などの極性分子によってクエンチされ、したがって水性環境では弱い蛍光しか示さない。しかし、ナイルレッドが、サポニンのトリテルペノイドコアなどの無極性分子と相互作用するか、又はミセル構造に取り込まれると、その蛍光は桁違いに増強される。ナイルレッドをトレーサーとして用いて、S300-HR画分中の遊離QuilAサポニン又はNanoQuil粒子の存在をモニターした。
S300-HRによるＳＥＣ画分（４５μＬの画分＋５μＬの蛍光読み取り用１０μＭナイルレッド）の蛍光色素ナイルレッドによる分析は、サポニンの分布を示す。図１７の棒グラフを参照。ナイルレッド（ＮＲ）の蛍光は、水などの極性分子によってクエンチされ、したがって水性環境では弱い蛍光しか示さない。しかし、ナイルレッドが、サポニンのトリテルペノイドコアなどの無極性分子と相互作用するか、又はミセル構造に取り込まれると、その蛍光は桁違いに増強される。ナイルレッドをトレーサーとして用いて、S300-HR画分中の遊離QuilAサポニン又はNanoQuil粒子の存在をモニターした。
【0131】
S300-HRクロマトグラムは、NanoQuil粒子に対応する（ＴＥＭで確認した）画分６ｍＬ及び、QuilAミセルに対応する画分９ｍＬを中心とする２つのピークを示す。
【0132】
画分６ｍＬ及び７ｍＬ（図示せず）のＮＲ蛍光スペクトルは、最大蛍光波長を５７０ｎｍでnanoQuilに対して典型的なブルーシフト（コレステロールとの相互作用を示す）を示したが、画分９ｍＬ及び１０ｍＬは、最大蛍光波長を６２０ｎｍでQuilAミセルに対して典型的なスペクトルを示した。
【0133】
NanoQuil F70のＳＥＣ画分の溶血アッセイ
NanoQuil F70のＳＥＣ分画からの各画分の１２０μＬの量を、抗凝血剤で処理し、４８０μＬの希釈した新鮮なヒツジ血液に加える。NanoQuil F70のＳＥＣ画分の希釈係数は５倍であり、一方でヒツジ血液は２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中で１２．５倍に希釈される。３７℃で４５分間インキュベートした後、細胞を遠心分離で沈降させ、上清中に放出されたヘモグロビン量を４１５ｎｍ及び５４０ｎｍにおける吸光度によって測定する。溶血活性は、５４０ｎｍでの吸光度値の関数として、０．４ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬのQuilAサポニンを用いた較正範囲に対して表される。結果を図１８に示す。
NanoQuil F70のＳＥＣ分画からの各画分の１２０μＬの量を、抗凝血剤で処理し、４８０μＬの希釈した新鮮なヒツジ血液に加える。NanoQuil F70のＳＥＣ画分の希釈係数は５倍であり、一方でヒツジ血液は２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中で１２．５倍に希釈される。３７℃で４５分間インキュベートした後、細胞を遠心分離で沈降させ、上清中に放出されたヘモグロビン量を４１５ｎｍ及び５４０ｎｍにおける吸光度によって測定する。溶血活性は、５４０ｎｍでの吸光度値の関数として、０．４ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬのQuilAサポニンを用いた較正範囲に対して表される。結果を図１８に示す。
【0134】
最も溶血性の高いS300-HR画分、すなわち９ｍＬ及び１０ｍＬは、遊離QuilAを含有する画分である。nanoQuil F70を含有する画分６ｍＬ及び７ｍＬは、アッセイの条件において溶血作用を示さない。
【0135】
これは、「QuilA相当量」で表すこともできる。図１９の棒グラフを参照されたい。
【0136】
一方で、未加工のnanoQuil F70生成物は、確かに１ｍｇ／ｍＬ相当QuilA以上で溶血作用を示す。結果を図２０に示す。
【0137】
結果
NanoQuil F70ナノ粒子の定量分析に用いられる典型的なＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。１ｍｇ／ｍＬの固定量のQuilAサポニンに対して、０．１ｍｇ／ｍＬから０．８ｍｇ／ｍＬまでのコレステロールをスパイクすると、この濃度範囲にわたって線形応答が得られ、未知の画分（NanoQuil F70のＳＥＣ画分）におけるコレステロール含量の較正及び推定に使用することができた。
NanoQuil F70ナノ粒子の定量分析に用いられる典型的なＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。１ｍｇ／ｍＬの固定量のQuilAサポニンに対して、０．１ｍｇ／ｍＬから０．８ｍｇ／ｍＬまでのコレステロールをスパイクすると、この濃度範囲にわたって線形応答が得られ、未知の画分（NanoQuil F70のＳＥＣ画分）におけるコレステロール含量の較正及び推定に使用することができた。
【0138】
１３ｍＬ容のSephacryl S300-HRカートリッジから６ｍＬで溶出し、精製NanoQuil F70を含有する画分をＨＰＬＣで分析した。２０ｍＬと３２ｍＬの間のシグナルの積分（図６の水平の灰色のバーで示される）を用いて、画分中のサポニンを定量した。３９ｍＬでのシグナルの積分を用いてコレステロールを定量した。
【0139】
NanoQuil F70のＳＥＣ分画及びＲＰ－ＨＰＬＣによる定量分析の後、図７は、NanoQuil F70粒子が最初に画分５ｍＬ～８ｍＬに溶出され、QuilAサポニンとコレステロールの両方が検出され、一方で、コレステロールを含まない残存QuilAサポニンが後の画分９ｍＬ～１２ｍＬに溶出されることを明確に示している。この結果は、ＳＥＣ分画が想定されている機能の仕方と一致しており、粒子が大きいほど、Sephacrylビーズのポリマーメッシュにより少なく浸透し、したがって、より早くカラムから溶出する。Nanoquil F70粒子は２０～５０ｎｍ（反応媒体に依る）の流体力学的直径を有し、一方で、QuilAサポニンミセルは約５ｎｍの直径を有する。NanoQuil粒子及びQuilAサポニンミセルの分離も、Sephacryl S300-HRの分画範囲と一致した。ＳＥＣカラムにQuilAサポニンのみを載せた対照実験は、同じ条件下でQuilAサポニンが画分８～１１ｍＬに溶出することを示した。これは、NanoQuil F70を注入したとき（図７）、画分５～８ｍＬに見られるQuilAサポニンが実際にコレステロールと関連していることを裏付ける。画分５～８ｍＬの材料のＴＥＭ写真は、NanoQuil F70粒子であることを確認した。ＳＥＣ分画はまた、このバッチ中の遊離（検出可能なコレステロールを含まない）QuilAサポニンのミセルの量が、未加工NanoQuil F70生成物中のQuilAサポニンの総量の約５０％に相当することを示す。最後に、未加工NanoQuil F70生成物中で測定したコレステロール/QuilAサポニンの初期比は３％であり、一方で、５ｍｌから８ｍＬまでを合わせたＳＥＣ画分では１３％であることが分かった。
【0140】
４．２ｍｇ／ｍＬのQuilAのNanoQuil F70の１ｍＬの量をSephacryl S300-HRカラムに載せ、１ｍＬ画分をＨＰＬＣ定量分析用に集めた。検出可能な量のQuilAを含有するＳＥＣ画分（４ｍＬ～１３ｍＬ）を示す。参照としてNanoQuil F70及びQuilAを示す。
【0141】
各ＳＥＣ画分の溶血活性を測定し、１ｍｇ／ｍＬのQuilAサポニン参照、及び１ｍｇ／ｍＬのQuilAのNanoQuil F70未加工生成物と比較した。さまざまな試料の溶血活性は、細胞外培地中に放出されるヘモグロビンの量に直接相関する５４０ｎｍでの吸光度値として提示される。図８は、溶血活性がＳＥＣ画分９～１１ｍＬについてのみ観察され、その画分で遊離QuilAミセルが本質的に見られることを明確に示す。溶血活性は、画分５～８ｍＬでは記録されず、その画分では精製NanoQuilが溶出された（参考には図７を参照されたい）。これにより、ＳＥＣ画分中に溶出された材料が何であるかが確かめられる。図８の１ｍｇ／ｍＬのQuilA参照によって例示されるように、遊離QuilAサポニンミセルは著しい溶血活性を有することが知られているからである。結果はまた、約１２％のコレステロール／QuilA（重量／重量）を含有する画分６ｍＬ中の精製NanoQuil F70が有意な溶血活性を示さないことを示し（図８）、したがって、本開示によるプロトコールを用いて、コレステロールをQuilAサポニンミセルに直接取り込むことはNanoQuil F70をもたらし、さらにQuilAサポニンの溶血作用の強い阻害につながることを証明している。
【0142】
結論
Sephacryl S300-HRビーズを用いたサイズ排除クロマトグラフィーは、残存遊離QuilAサポニンミセルからNanoQuil F70粒子を成功裡に分離することがわかった。ＲＰ－ＨＰＬＣによるＳＥＣ画分の定量分析及びＵＶ吸光度検出は、コレステロール／QuilAサポニン比の決定を可能にし、各画分中の物質が何であるか（NanoQuil F70又は遊離QuilAサポニン）を確認した。遊離QuilAサポニンを含有する画分は、著しい溶血作用を示し、一方で、精製したNanoQuil F70を含有する画分は溶血作用を示さなかった。最後に、遊離残留サポニンミセルとして約５０％のQuilAサポニンを含有する未加工のNanoQuil F70試料でさえも、同様の量で遊離QuilAと比較して、限られた溶血活性を呈することを示した。これは、QuilAサポニンの固有の細胞膜溶解活性を有意に下げるために、本発明のプロトコールを使用して、直接コレステロールとQuilAサポニンを製剤化することの妥当性を裏付ける。
Sephacryl S300-HRビーズを用いたサイズ排除クロマトグラフィーは、残存遊離QuilAサポニンミセルからNanoQuil F70粒子を成功裡に分離することがわかった。ＲＰ－ＨＰＬＣによるＳＥＣ画分の定量分析及びＵＶ吸光度検出は、コレステロール／QuilAサポニン比の決定を可能にし、各画分中の物質が何であるか（NanoQuil F70又は遊離QuilAサポニン）を確認した。遊離QuilAサポニンを含有する画分は、著しい溶血作用を示し、一方で、精製したNanoQuil F70を含有する画分は溶血作用を示さなかった。最後に、遊離残留サポニンミセルとして約５０％のQuilAサポニンを含有する未加工のNanoQuil F70試料でさえも、同様の量で遊離QuilAと比較して、限られた溶血活性を呈することを示した。これは、QuilAサポニンの固有の細胞膜溶解活性を有意に下げるために、本発明のプロトコールを使用して、直接コレステロールとQuilAサポニンを製剤化することの妥当性を裏付ける。
【0143】
実施例４ － NanoQuil F70のアジュバント効果
本研究の目的は、Nanoquil F-70粒子のワクチンアジュバント効果を、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載のＧ３粒子と比較することであった。
本研究の目的は、Nanoquil F-70粒子のワクチンアジュバント効果を、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載のＧ３粒子と比較することであった。
【0144】
試験概要
・抗原：抗原Ｘ、１０ｕｇ／ワクチン接種
・アジュバント：Ｇ３－ＶＡＸ（Adjuvaq-V100、＃１５０６０９）又はNanoquil（#７０、１８０３２６）、５ｕｇ／ワクチン接種
・動物：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、８匹／群
・ワクチン接種：計３回皮下注、４週毎に１回
・試料：最終ワクチン接種から２週間語に採取した血清
・分析：ＥＬＩＳＡ（ヤギ抗マウスＩｇＧ／血清／ツイン（TWIN）抗原／ＳＴ－ＨＲＰ／ＴＭ）
・抗原：抗原Ｘ、１０ｕｇ／ワクチン接種
・アジュバント：Ｇ３－ＶＡＸ（Adjuvaq-V100、＃１５０６０９）又はNanoquil（#７０、１８０３２６）、５ｕｇ／ワクチン接種
・動物：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、８匹／群
・ワクチン接種：計３回皮下注、４週毎に１回
・試料：最終ワクチン接種から２週間語に採取した血清
・分析：ＥＬＩＳＡ（ヤギ抗マウスＩｇＧ／血清／ツイン（TWIN）抗原／ＳＴ－ＨＲＰ／ＴＭ）
【0145】
結果を図１１にグラフで示す。
【0146】
結論
・Ｇ３－ＶＡＸとNanoquilの間に有意差は見られなかった。
・しかし、Nanoquil F-70はＧ３よりもわずかにａｂ応答が強力で、ばらつきが少ないようである。
・Ｇ３－ＶＡＸとNanoquilの間に有意差は見られなかった。
・しかし、Nanoquil F-70はＧ３よりもわずかにａｂ応答が強力で、ばらつきが少ないようである。
【0147】
実施例５ － Ｕ９３７－１がん細胞に対するNanoQuil F70のアポトーシス効果
実験の目的
本実験の目的は、がん細胞株Ｕ９３７－１に対するNanoQuil F70のアポトーシス効果を調べることである。Ｕ９３７細胞はもともと男性患者の組織球性リンパ腫から単離されたモデル細胞株であり、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株として特徴付けられる。
実験の目的
本実験の目的は、がん細胞株Ｕ９３７－１に対するNanoQuil F70のアポトーシス効果を調べることである。Ｕ９３７細胞はもともと男性患者の組織球性リンパ腫から単離されたモデル細胞株であり、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株として特徴付けられる。
【0148】
機器設備
・滅菌クリーンベンチ、Biowizard Golden Line Ergosilence、Ｋｏｊａｉｒ
・ボルテックス、IKA MS3ベーシック
・インキュベーター、Forma Steri-Cycle ＣＯ２インキュベーター、サーモフィッシャーサイエンティフィック
・冷蔵庫
・遠心機、Allergra X-22R、ベックマン・コールター
・顕微鏡
・Burkerチャンバー
・分光光度計（Labsystems Multiskan RC、タイプ３５１）
・滅菌クリーンベンチ、Biowizard Golden Line Ergosilence、Ｋｏｊａｉｒ
・ボルテックス、IKA MS3ベーシック
・インキュベーター、Forma Steri-Cycle ＣＯ２インキュベーター、サーモフィッシャーサイエンティフィック
・冷蔵庫
・遠心機、Allergra X-22R、ベックマン・コールター
・顕微鏡
・Burkerチャンバー
・分光光度計（Labsystems Multiskan RC、タイプ３５１）
【0149】
材料
・上記の方法で得たNanoQuil F70粒子
・Ｕ９３７－１細胞は、Prof. Kenneth Nilsson（Rudbeck研究室、ウプサラ大学、スウェーデンウプサラ）のご厚意により提供された。
・最終濃度１０％のウシ胎児血清（シグマアルドリッチ）、ＰｅＳｔ（６０μｇ／ｍｌペニシリン；５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（カタログ番号９９２４５０、ＳＶＡ、ウプサラ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（カタログ番号９９２００５、ＳＶＡ、ウプサラ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（製品コード：９９２６０５；バッチ１６－８０８２；ＳＶＡ、ウプサラ）
・細胞培養プレート、９６ウェル 製品コード：８３．３９２４．５００、ロット：４０２５００１、ザルスタット
・ウプサラ大学病院基材部門（substrate department）製リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ５．９～６．０
・AlamarBlue（登録商標）生細胞試薬 １０×、調製済み溶液
・蒸留Ｈ2Ｏ
・細胞培養フラスコ、Corning（登録商標）細胞培養フラスコ、表面積７５ｃｍ2、カタログ番号：ＣＬＳ４３０６４１－１００ＥＡ、シグマアルドリッチ
・FINNTIP ３００μｌ（ＶＷＲ、６１３－２６１４）
・ピペットチップ １０００μｌ FINNTIP、カタログ番号：６１３－４４８５、ＶＷＲ
・９６ウェルＶ底プレート（ヌンク、デンマーク）
・トリパンブルー、カタログ番号：Ｔ８１５４、バッチ番号ＲＮＢＤ３１４２、シグマ
・１００ｍｌ容試薬リザーバー、カタログ番号：８９０９４－６５６、ロット：９６８１７、ＶＷＲ
・上記の方法で得たNanoQuil F70粒子
・Ｕ９３７－１細胞は、Prof. Kenneth Nilsson（Rudbeck研究室、ウプサラ大学、スウェーデンウプサラ）のご厚意により提供された。
・最終濃度１０％のウシ胎児血清（シグマアルドリッチ）、ＰｅＳｔ（６０μｇ／ｍｌペニシリン；５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（カタログ番号９９２４５０、ＳＶＡ、ウプサラ）及び２ｍＭ Ｌ－グルタミン（カタログ番号９９２００５、ＳＶＡ、ウプサラ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（製品コード：９９２６０５；バッチ１６－８０８２；ＳＶＡ、ウプサラ）
・細胞培養プレート、９６ウェル 製品コード：８３．３９２４．５００、ロット：４０２５００１、ザルスタット
・ウプサラ大学病院基材部門（substrate department）製リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ５．９～６．０
・AlamarBlue（登録商標）生細胞試薬 １０×、調製済み溶液
・蒸留Ｈ2Ｏ
・細胞培養フラスコ、Corning（登録商標）細胞培養フラスコ、表面積７５ｃｍ2、カタログ番号：ＣＬＳ４３０６４１－１００ＥＡ、シグマアルドリッチ
・FINNTIP ３００μｌ（ＶＷＲ、６１３－２６１４）
・ピペットチップ １０００μｌ FINNTIP、カタログ番号：６１３－４４８５、ＶＷＲ
・９６ウェルＶ底プレート（ヌンク、デンマーク）
・トリパンブルー、カタログ番号：Ｔ８１５４、バッチ番号ＲＮＢＤ３１４２、シグマ
・１００ｍｌ容試薬リザーバー、カタログ番号：８９０９４－６５６、ロット：９６８１７、ＶＷＲ
【0150】
安全に関する注意事項
サポニンは、人によっては、眼や呼吸器系への刺激、皮膚接触による炎症を引き起こすことがある。
・サポニン等との皮膚接触を避けるため手袋を着用すること
・クロロホルムの吸入を避けるためフードで作業すること
サポニンは、人によっては、眼や呼吸器系への刺激、皮膚接触による炎症を引き起こすことがある。
・サポニン等との皮膚接触を避けるため手袋を着用すること
・クロロホルムの吸入を避けるためフードで作業すること
【0151】
実験設定
ＰＢＳ ｐＨ７．４で、１０００μｇ／ｍｌから０．３２μｇ／ｍｌまでの濃度のNanoQuil F70粒子の連続希釈（１：５希釈）を調製する。セル上の最終濃度は、セル上で１００μｇ／ｍｌ～０．０３２μｇ／ｍｌであることになる。ブランクセルの対照にはＰＢＳを使用。
ＰＢＳ ｐＨ７．４で、１０００μｇ／ｍｌから０．３２μｇ／ｍｌまでの濃度のNanoQuil F70粒子の連続希釈（１：５希釈）を調製する。セル上の最終濃度は、セル上で１００μｇ／ｍｌ～０．０３２μｇ／ｍｌであることになる。ブランクセルの対照にはＰＢＳを使用。
【0152】
方法
生存率試験
・培養培地中のＵ９３７－１細胞をファルコンチューブに注ぐ。
・細胞を２００ｇで５～１０分間スピンダウンする。
・細胞培養培地を注ぎ出す。
・予め温めておいた新しい培地に細胞を再懸濁する。
・細胞をカウントし、トリパンブルー染色で生存率を判定する（生存率は≧９０％であるべきである）。
・細胞濃度を０．１１×１０6個の細胞／ｍＬに調整する。
・９６ウェルマイクロタイタープレートに、細胞を～２０ ０００個の細胞／ウェル（１８０μｌ）の細胞密度で播種する。
・NanoQuil F70製剤（２０μｌ）をウェルに加える（対照未処理細胞にはＰＢＳを使用）。
・培養時間中、プレートを３７℃、５％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気におく。
・６６時間後に、２０μｌのAlamar blueを加え、１時間毎に６時間（計７２時間）、５７０ｎｍと６２０ｎｍで蛍光（又は吸光度）シグナルを分光光度法で測定する。
生存率試験
・培養培地中のＵ９３７－１細胞をファルコンチューブに注ぐ。
・細胞を２００ｇで５～１０分間スピンダウンする。
・細胞培養培地を注ぎ出す。
・予め温めておいた新しい培地に細胞を再懸濁する。
・細胞をカウントし、トリパンブルー染色で生存率を判定する（生存率は≧９０％であるべきである）。
・細胞濃度を０．１１×１０6個の細胞／ｍＬに調整する。
・９６ウェルマイクロタイタープレートに、細胞を～２０ ０００個の細胞／ウェル（１８０μｌ）の細胞密度で播種する。
・NanoQuil F70製剤（２０μｌ）をウェルに加える（対照未処理細胞にはＰＢＳを使用）。
・培養時間中、プレートを３７℃、５％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気におく。
・６６時間後に、２０μｌのAlamar blueを加え、１時間毎に６時間（計７２時間）、５７０ｎｍと６２０ｎｍで蛍光（又は吸光度）シグナルを分光光度法で測定する。
【0153】
結果
ナノ粒子に製剤化されたキラヤサポニンのＱＳ－２１画分は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載のように、いくつかのがん細胞株にアポトーシスを誘導することが以前に示されている。単核球細胞株Ｕ９３７－１に対して明細書で試験したNanoQuil F70粒子のアポトーシス効果をAlamar blueアッセイで測定したところ、３日間のインキュベーション後、０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した。
ナノ粒子に製剤化されたキラヤサポニンのＱＳ－２１画分は、国際公開第２０１３０５１９９４号パンフレット及び国際公開第２０１４１６３５５８号パンフレットに記載のように、いくつかのがん細胞株にアポトーシスを誘導することが以前に示されている。単核球細胞株Ｕ９３７－１に対して明細書で試験したNanoQuil F70粒子のアポトーシス効果をAlamar blueアッセイで測定したところ、３日間のインキュベーション後、０．１５～０．２５ｍｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
