特許 7504901 カスパーゼ活性の誘導

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-14

(45)【発行日】2024-06-24

(54)【発明の名称】カスパーゼ活性の誘導

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/77 20060101AFI20240617BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240617BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240617BHJP

【ＦＩ】

A61K31/77

A61P43/00 105

A61P35/00

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2021551905

(86)(22)【出願日】2020-02-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-19

(86)【国際出願番号】 US2020020028

(87)【国際公開番号】W WO2020180581

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-13

(31)【優先権主張番号】62/813,853

(32)【優先日】2019-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502141050

【氏名又は名称】ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100128495

【弁理士】

【氏名又は名称】出野 知

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100144417

【弁理士】

【氏名又は名称】堂垣 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147212

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 直樹

(72)【発明者】

【氏名】ウォルフル－グプタ、キャロライン

(72)【発明者】

【氏名】スコット、アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】レバロン、マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ジョーダン、スーザン エル．

(72)【発明者】

【氏名】シュミット、ロバート エル．

(72)【発明者】

【氏名】セティヴァリ、ラジャ

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】特表平０７－５０２２７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Daria Y Alakhova et al.，Pluronics and MDR Reversal: An Update，Molecular Pharmaceutics，American Chemical Society，2014年，vol.11，2566-2578

【文献】Zhu Chengshen et al.，Structure-property Relationship of Ethylene Oxide and Propylene Oxide Random Copolyethers，JOURNAL OF ZHENGZHOU UNIVERSITY，中国，2005年，vol.37, no.2，81-84, 87

【文献】Minko Tamara et al.，Pluronic block copolymers alter apoptotic signal transduction of doxorubicin in drug-resistant cancer cells，Journal of Contorolled Release，2005年07月20日，vol.105, no.3，269-278

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－ ３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００－ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カスパーゼ活性を誘導するための調製物であって、以下の式によって表される化合物と、生理食塩水と、を含み、

【化1】

式中、化合物がランダムコポリマーであり、Ｒ^１が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^２が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^１がＲ^２とは異なり、ｘ＞０およびｙ＞０であり、ｘとｙの合計が４～２０，０００であり、前記化合物が、２００～７，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、調製物。

【請求項2】

前記化合物が、処理培地中０．００１ミリモル～７５ミリモルの濃度を有する、請求項１に記載の調製物。

【請求項3】

前記カスパーゼがエフェクターカスパーゼである、請求項１に記載の調製物。

【請求項4】

前記カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の調製物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示の実施形態は、カスパーゼ活性を誘導する方法を対象とする。

【背景技術】

【0002】

がんは、異常な細胞増殖を伴う疾患群である。結腸癌または腸癌と称され得る結腸直腸癌は、結腸または直腸における制御されていない細胞増殖に由来するがんである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

結腸直腸癌は、一般的に診断される悪性腫瘍である。結腸直腸癌のための治療には、手術、放射線療法、および／または化学療法が含まれる。しかしながら、治療に利用され得る新たな方法および／または新たな組成物が依然として必要とされている。

【0004】

本開示は、カスパーゼ活性を誘導する方法であって、細胞を、以下の式によって表される処理化合物と接触させることを含み、

【化1】

式中、処理化合物がランダムコポリマーであり、Ｒ^１が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^２が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^１がＲ^２とは異なり、ｘとｙの合計が４～２０，０００である。

【0005】

本開示の上記の概要は、各々の開示される実施形態を説明するようにも、本開示の全ての実施態様を説明するようにも意図されていない。以下の説明は、例証的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願にわたるいくつかの個所では、例のリストを通じて指針が提供され、これらの例は、様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合にも、列挙されたリストは、単に代表的な群としての役割を果たし、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0006】

理論に拘束されることを望むことなく、結腸直腸癌の発症に関与する１つのメカニズムは、ＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）タンパク質を産生するＡＰＣ遺伝子の変異である。ＡＰＣタンパク質は、細胞内のβ－カテニンタンパク質の蓄積を防ぐのに役立つタンパク質ベースの破壊複合体の一部である。ＡＰＣタンパク質およびβ－カテニンタンパク質は、細胞表面受容体を介して細胞にシグナルを伝えるＷＮＴ（ウイングレス／統合）シグナル伝達経路のうちの１つの一部である。一般に、細胞がＷＮＴによって刺激されると、破壊複合体が非活性化され、β－カテニンタンパク質が核内に入り、遺伝情報の転写を制御する転写因子（ＴＣＦ）に結合する。正常な細胞進行に関与する遺伝子が活性化され、これは、調節されたプロセスである。ＡＰＣタンパク質の不在下では、β－カテニンタンパク質は高レベルに継続的に蓄積して核内に移動し、ＴＣＦに結合し、その後、ＴＣＦがＤＮＡに結合し、がん原遺伝子の転写を活性化する可能性がある。がん原遺伝子が高レベルで不適切に発現されると、それらはがん遺伝子になる。活性化されたがん遺伝子は、個体におけるアポトーシスに指定された細胞を生存させ、代わりに増殖させる可能性があり、これは、結腸直腸癌の発症につながる可能性がある。

【0007】

カスパーゼ活性を誘導する方法が本明細書に開示される。有利なことに、カスパーゼ活性を誘導することは、アポトーシスを誘発する、すなわち、細胞死を誘導することができる。いくつかの用途では、壊死と比較してアポトーシスが望ましい。カスパーゼ活性を誘導することにより、いくつかの細胞内タンパク質が分解されて、細胞死をもたらす可能性がある。アポトーシスによる細胞死は、例えば、結腸直腸癌細胞に望ましい影響を与える可能性がある。

【0008】

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」、「いくつかの」、および「１つ以上の」は、別途指示されない限り、互換的に使用され得る。「および／または」という用語は、列記された項目のうちの１つ、１つ以上、または全てを意味する。終点による数値範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数値が含まれ、例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる。

【0009】

本明細書に開示されるカスパーゼ活性を誘導する方法は、細胞を処理化合物と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「処理化合物」とは、以下の式Ｉによって表され得る化合物を指し、

【化2】

式中、処理化合物がランダムコポリマーであり、Ｒ^１が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^２が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ^１がＲ^２とは異なり、ｘとｙの合計が４～２０，０００である。

【0010】

４から２０，０００までの全ての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、ｘとｙの合計は、４、５、６、７、８、または１０の下限から、２０，０００、１９，０００、１８，０００、１７，０００、１６，０００、または１５，０００の上限までとすることができる。

【0011】

前述のように、処理化合物は、ランダムコポリマーである。本開示の１つ以上の実施形態は、ｘがｙとは異なることを提供する。本開示の１つ以上の実施形態は、ｘがｙと同じであることを提供する。式Ｉが単一のｘ基および単一のｙ基を例証しているが、当業者であれば、処理化合物がランダムコポリマーであるように、式Ｉによって表される処理化合物が処理化合物のポリマー構造中の様々な位置に位置する複数のｘ基および／または複数のｙ基を含み得ることを理解するであろう。

【0012】

式Ｉによって表される処理化合物は、ポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）と称され得る。本開示の実施形態は、処理化合物がランダムコポリマー、すなわち、ランダムエチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマーであることを提供する。処理化合物は、例えば、開始剤としてプロピレングリコールおよび／またはジプロピレングリコールを利用し、かつエチレンオキシドとプロピレンオキシドの混合供給物を添加することによって形成することができる。

【0013】

１つ以上の実施形態は、処理化合物が非置換と称され得る未修飾であることを提供する。言い換えれば、処理化合物のポリマー主鎖は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに由来する構造単位のみを含む。

【0014】

処理化合物は、処理化合物の総重量に基づいて、１０～９０重量パーセントのエチレンオキシドに由来する構造単位を含み得る。１０重量パーセントから９０重量パーセントまでの全ての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、処理化合物は、処理化合物の総重量に基づいて、１０、１５、２０、３０、または４０重量パーセントの下限から、９０、８５、８０、７０、または６０重量パーセントの上限までのエチレンオキシドに由来する構造単位を含むことができる。

【0015】

処理化合物は、処理化合物の総重量に基づいて、１０～９０重量パーセントのプロピレンオキシドに由来する構造単位を含み得る。１０重量パーセントから９０重量パーセントまでの全ての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、処理化合物は、処理化合物の総重量に基づいて、１０、１５、２０、３０、または４０重量パーセントの下限から、９０、８５、８０、７０、または６０重量パーセントの上限までのプロピレンオキシドに由来する構造単位を含むことができる。

【0016】

本開示の実施形態は、処理化合物が２００～２，０００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有することを提供する。２００ｇ／ｍｏｌから２，０００，０００ｇ／ｍｏｌまでの全ての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、処理化合物は、２００、３００、４００、４５０、５００、または６００ｇ／ｍｏｌの下限から、２，０００，０００、１，７５０，０００、１，５００，０００、１，２５０，０００、１，０００，０００、７５０，０００、５００，０００、２５０，０００、１００，０００、７５，０００、５０，０００、２５，０００、１０，０００、８０００、７５００、７０００、または６５００ｇ／ｍｏｌの上限までのＭｎを有することができる。

【0017】

処理化合物は、異なる用途によって異なり得る既知の方法、機器、および／または条件を使用して調製され得る。処理化合物は商業的に入手され得る。

【0018】

前述のように、本明細書に開示されるカスパーゼ活性を誘導する方法は、細胞を処理化合物と接触させることを含む。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞を処理化合物と接触させることがインビボで生じることを提供する。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞を処理化合物と接触させることがインビトロで生じることを提供する。細胞は、いくつかの異なる既知の方法、機器、および／または条件を利用することによって、処理化合物と接触し得る。様々な方法、機器、および／または条件が異なる用途に利用され得る。

【0019】

処理化合物は、既知の処理培地とともに利用され得る。例えば、処理化合物は、細胞を接触させる前に既知の治療媒体中に溶解して、有効量を提供することができる。１つ以上の実施形態は、処理化合物と処理培地が組み合わせされて溶液を形成することができることを提供する。溶液は、均質な溶液であり得る。処理培地の例には、とりわけ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ １６４０、およびマッコイ５Ａ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの処理培地が市販されている。

【0020】

処理化合物は、処理培地中０．００１ミリモル（ｍＭ）～７５ｍＭの濃度を有することができる。０．００１ｍＭから７５ｍＭまでの全ての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、処理化合物の有効濃度は、処理培地中０．００１、０．００５、０．０１、０．１、または１．０ｍＭの下限から、７５、７２、７０、６８、または６５ｍＭの上限までとすることができる。

【0021】

細胞は、有効量の処理化合物と接触し得る。本明細書で使用される場合、「治療有効量」および／または「治療量」と互換的に使用され得る「有効量」という用語は、意図された用途を提供する、例えば、カスパーゼ活性を誘導するのに十分な処理化合物の量を指す。細胞を有効量の処理化合物と接触させることは、望ましくは、望ましくない細胞がカスパーゼ活性の誘導に起因するアポトーシスによる細胞死を受ける疾患治療、例えば、結腸直腸癌治療を提供することができる。有効量は、当業者によって容易に決定され得る考慮事項の中でもとりわけ、特定の用途、例えば、インビトロまたはインビボ、治療される対象、例えば、対象の体重および年齢、病状の重症度、および／または投与方法に応じて変化し得る。本明細書で使用される場合、治療される「対象」とは、動物界の任意の構成員、例えば、ヒトを含む哺乳動物を指す。

【0022】

本開示の実施形態は、特定の用量が、利用される特定の処理化合物、従うべき投与レジメン、投与のタイミング、および／または処理化合物が運ばれる物理的送達系に応じて変化し得ることを提供する。例えば、有効量の処理化合物は、単回投与または複数回投与によって細胞と接触し得る。

【0023】

本開示の実施形態は、処理化合物と接触する細胞ががん性細胞であることを提供する。例えば、細胞は、結腸直腸癌細胞であり得る。結腸直腸癌細胞は、結腸癌細胞、腸癌細胞、および／または結腸直腸腺癌細胞とも称され得る。本開示の１つ以上の実施形態は、追加の細胞、すなわち、非がん性細胞が処理化合物と接触し得ることを提供する。

【0024】

理論に拘束されることを意図することなく、システイン－アスパラギン酸プロテアーゼとも称され得るカスパーゼは、アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼのファミリーである。カスパーゼには、カスパーゼ２、８、９、１０、１１、１２を含むイニシエーターカスパーゼと、カスパーゼ３、６、７を含むエフェクターカスパーゼの２種類が存在する。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞を処理化合物と接触させることがエフェクターカスパーゼ活性を誘導することを提供する。本開示の１つ以上の実施形態は、カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、またはそれらの組み合わせから選択されることを提供する。

【0025】

前述のように、カスパーゼ活性を誘導することは、アポトーシスを有利に誘発することができる。誘導されたカスパーゼ活性は、いくつかの異なる既知の方法、機器、および／または条件によって決定され得る。例えば、誘導されたカスパーゼ活性は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ ４．Ｂ．Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅによって決定される、１超の平均相対カスパーゼ活性によって証明され得る。本明細書で使用される場合、「相対カスパーゼ活性」は、相対アポトーシスと互換的に利用され得る。

【0026】

本明細書で論じられる処理化合物を利用することは、がん治療に利用されるいくつかの他のポリマー化合物と比較して、改善された、すなわち、低減された緩下剤効果を有利に提供し得る。この低減された緩下剤効果は、比較的大きい緩下剤効果に関連するいくつかの他のポリマー化合物と比較して、望ましい患者コンプライアンスの増加を提供するのに役立ち得る。

【0027】

本開示の１つ以上の実施形態は、結腸直腸癌を治療する方法を提供する。本方法は、結腸直腸癌細胞を処理化合物と接触させることを含むことができる。

【0028】

本開示の１つ以上の実施形態は、がんを治療する方法を提供する。本方法は、処理化合物を哺乳動物に投与することを含むことができる。

【実施例】

【0029】

本実施例では、例えば、以下を含む、材料に関する様々な用語および名称を使用する。

【0030】

ポリ（エチレングリコールラン－プロピレングリコール）（Ｍｎ：２５００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）

【0031】

細胞（ヒト結腸、結腸直腸腺癌、ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３）、ＡＴＣＣから入手）

【0032】

マッコイ５Ａ（成長培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）

【0033】

ウシ胎児血清（ＡＴＣＣから入手）

【0034】

ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ １４１９０－１４４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）

【0035】

完全成長培地（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００７、ＡＴＣＣから入手）

【0036】

トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）、カタログ番号２５２０００５６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）

【0037】

チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）

【0038】

カルシウムおよびマグネシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ １４０４０－１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）

【0039】

Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ（発光アッセイ、カタログ番号Ｇ８０９３、Ｐｒｏｍｅｇａから入手）

【0040】

ジメチルスルホキシド（カタログ番号２７６８５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）

【0041】

培養の開始および維持
培養の開始および維持を以下のように行った。培養の開始および維持を、「Ｔｈａｗｉｎｇ，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」ＮＣＩ－ＰＢＣＦ－ＨＴＢ３８（ＨＴ－２９）結腸腺癌（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３８（商標））；２０１２年２月２７日；バージョン１．６に従って行った。

【0042】

ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３８（商標））細胞（１ｍＬあたりおよそ１×１０^６個の細胞を含む）を開始し、マッコイ５Ａおよびウシ胎児血清（１０％（ｖ／ｖ））を含むＴ－２５フラスコに播種した。その後、ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００７（３７℃の水浴中で少なくとも１５分間加温）を使用して、ＨＴ－２９細胞を増殖させた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ_２で維持した加湿インキュベーター（ＳＡＮＹＯ ＩＮＣＴ－１６－ＣＭＴ、ＭＣＯ－１９ＡＩＣ（ＵＶ））内で成長させた。その後、細胞を１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、１×トリプシン－ＥＤＴＡを使用してＴ－７５フラスコ内で週１～３回継代培養し、５分間未満適用し、完全成長培地を剥離した細胞に添加することによりトリプシン－ＥＤＴＡの酵素作用を阻止した。その後、８０～９０％コンフルエンシーに達した時点で、細胞を１：５～１：１６の分割比範囲に分割した。継代数、コンフルエンシー％、生存率％（実験設定日のみ）、および全ての期における細胞形態などの継代培養および成長増殖活性を記録した。細胞を対数成長期で維持した。

【0043】

細胞培養プレーティング（０日目）
細胞培養プレーティングを以下のように行った。単一の８０～９０％コンフルエントＴ－７５フラスコからの細胞懸濁液をトリプシン－ＥＤＴＡおよび完全成長培地で収集した。細胞濃度および生存率を取得するために、細胞計数を、各スライドの２つのチャンバに各々１０μＬの１：１の０．４％トリパンブルー色素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｔ１０２８２）および細胞懸濁液を備えたＣＯＵＮＴＥＳＳ自動セルカウンター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｃ１０２２７、ＣＮＴＲ－７－ＣＭＴ）を使用して取得した。細胞計数および生存率を単一のスライドの両方のチャンバから平均化した。その後、生存細胞（９０％以上の生存率として定義）を含む完全成長培地を、マルチチャネルピペットを使用して滅菌９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞密度あたり、５０００～６０００細胞／ウェル（４０，０００～４８，０００細胞／ｍＬ）を、「生理食塩水のみ」の細胞なし対照ウェルとして利用したウェルを除き、各ウェルに添加し、プレート上のＡ列から開始してＨ列まで、各々等量の１２５μＬの細胞懸濁液をウェル毎に添加した。アポトーシスおよび細胞毒性の２つのエンドポイントの各々に使用したプレートは、それぞれ、固体の白色プレートおよび透明なプレートであった。細胞を２４±２時間インキュベートして付着させた。

【0044】

ポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）ストックの調製
ストック溶液を、滅菌生理食塩水中、ポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）のそれぞれの目標濃度で調製した。このアッセイでは、高分子量による溶解限度に基づいて、必要に応じて溶液またはピペッティング可能な懸濁液のいずれかを生成するためにより低いストック濃度調製物（ｗ／ｖ）の調整を行うか、またはアッセイで使用する前に生理食塩水の少しずつ増加させた添加、連続混合、ボルテックス、超音波処理、または撹拌によって可溶化を達成した。可溶化に必要な場合、生理食塩水を３７℃に予熱した後に、ポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）と混合した。細胞懸濁液プレーティング日（０日目）に、試験物質毎に総体積１０ｍＬを調製した。

【0045】

細胞毒性試薬の調製
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミドを、カルシウムおよびマグネシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中５ｍｇ／ｍＬで調製した。設定日（０日目）毎に総体積３０ｍＬ（ｗ／ｖ）を調製し、使用するまで４℃で保管した。

【0046】

投薬溶液の調製（０日目）
各試験物質ストックの投薬溶液／懸濁液を、マッコイ５Ａおよび１％ウシ胎児血清を各々合計１５ｍＬで調製した。０．００１５～６０ｍＭの投薬溶液／懸濁液を達成するために、様々な量の投薬ストックを利用した。投薬溶液／懸濁液を滅菌リザーバ内で調製し、目に見える均一性が達成されるまでピペットで繰り返し混合した。２ｍＬ容量の滅菌９６ディープウェルブロックを使用して、２ｍＬの投薬溶液／懸濁液を処理群の６個の複製ウェルの各々に添加し、生理食塩水のみの細胞対照および生理食塩水のみの「細胞なし」のバックグラウンド補正対照の１２個のウェルの各々に添加した。プレートを半無作為化統計的設計に従って確立した。各試験物質を、数値的に、かつ処理されるウェルを特定するために使用したカラーコードにより特定した。ブロックをシーリングテープ、プレートの蓋で覆い、４℃の実験室冷蔵庫（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３５Ｂ１、ＲＦＲ－２２－ＣＭＴ）に一晩入れた。

【0047】

処理（１日目）
投薬溶液／懸濁液を含む全ての９６ディープウェルブロックを冷蔵庫から取り出し、３７℃のビーズ浴中に最低３０分間入れた。プレーティングのおよそ２４時間後、ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、１つずつ処理した。セルプレートの全てのウェルを、Ａ列から開始してＨ列まで６ウェル吸引デバイスを使用して吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、各１００μＬの投薬溶液／懸濁液（ブロック由来）を、Ａ列から開始してＨ列まで（同じ順序で）９６ウェル細胞処理プレートの各ウェルに添加した。ウェルの乾燥を防止し、かつ細胞付着および生存率を維持するために、全てのウェルを一度に２列ずつ吸引して処理し、ピペット先端を列毎に交換した。全てのプレートをインキュベーター内に入れ、収集前に２４±２時間または４８±２時間処理させた。

【0048】

収集（２日目および３日目）
アポトーシス
アポトーシスの評価を以下のように行った。アポトーシスを「Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ」４．Ｂ．Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ９６－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って行った。Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ構成成分を約６０分間かけて室温に予熱した。白色プレートをインキュベーターから（１つずつ）取り出し、処理培地を吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。アッセイ試薬（バッファーおよび基質）を手動で混合し、試薬リザーバに添加し、マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬのアッセイ試薬混合物を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレート（ホイルを用いて光から保護したもの）をプレートシェーカー上に置き、室温でおよそ８００ｒｐｍで５分間回転させた。その後、プレートを分析前に室温でさらに２５分間インキュベートした。発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー上の各プレートの相対光単位（ＲＬＵ）に関して記録した。

【0049】

細胞毒性
細胞毒性の評価を以下のように行った。前述のように、細胞毒性試薬（５ｍｇ／ｍＬ）を約３０分間かけて室温に予熱し、その後、カルシウムおよびマグネシウムを含む１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中に希釈して、０．６７５ｍｇ／ｍＬの濃度（最終）にした。透明なプレートをインキュベーターから（１つずつ）取り出し、処理培地を吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、２００μＬの細胞毒性試薬（最終）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、その後、プレートをシーリングテープで覆い、３７℃の加湿インキュベーター内で４時間インキュベートした。インキュベートした後、上清を吸引し、ジメチルスルホキシド（２００μＬ）を各ウェルに添加した。ピペッティングを繰り返して完全に混合した後、細胞溶解物を新しい透明な９６ウェルプレートに移し、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー上で６００ｎｍおよび６３０ｎｍの吸光度で定量化した。

【0050】

分析
相対カスパーゼ活性を以下のように計算した：（ＲＬＵ_{フォアグラウンド}）－（ＲＬＵ_{生理食塩水のみの「細胞なし」対照}）＝（ＲＬＵ_{バックグラウンド補正}）、

【0051】

（各試験物質含有ウェルの（ＲＬＵ_{バックグラウンド補正}））／（１２個の生理食塩水のみの対照ウェルの平均（ＲＬＵ_{フォアグラウンド}）＝相対カスパーゼ活性（式中、ＲＬＵは相対光単位である）。

【0052】

各試験物質含有ウェルの相対カスパーゼ活性／６個の複製物＝平均相対カスパーゼ活性。利用した様々な濃度についての結果を表に報告する。

【0053】

細胞生存率を以下のように計算した。

【0054】

（Ａｂｓ_{６００フォアグラウンド}）－（Ａｂｓ_{６００生理食塩水のみの「細胞なし」対照）}＝（Ａｂｓ_{６００バックグラウンド補正}）

【0055】

（Ａｂｓ_{６３０フォアグラウンド}）－（Ａｂｓ_{６３０生理食塩水のみの「細胞なし」対照）}＝（Ａｂｓ_{６３０バックグラウンド補正}）

【0056】

（Ａｂｓ_{６００バックグラウンド補正}）－（Ａｂｓ_{６３０バックグラウンド補正）}＝（Ａｂｓ_{６００－６３０}）

【0057】

（各試験物質含有ウェルの（Ａｂｓ_{６００－６３０}））／（１２個の生理食塩水のみの対照ウェルの平均（Ａｂｓ_{６００－６３０}）＝細胞生存率％

【0058】

各試験物質含有ウェルの細胞生存率％／６個の複製物＝平均細胞生存率％。利用した様々な濃度についての結果を表２に報告する。

【表1】

【0059】

表１のデータは、それぞれの平均相対カスパーゼ活性（ラン１、２、３）値によって示されるように、細胞を、１５ｍＭ、３０ｍＭ、および６０ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）に曝露したときに、有利な相対カスパーゼ活性、すなわち、１超の平均相対カスパーゼ活性が提供されたことを説明している。

【表2】

【0060】

表２のデータは、細胞を、１５ｍＭ、３０ｍＭ、および６０ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール－ラン－プロピレングリコール）に曝露した２４時間後に、望ましい適切な生存率、すなわち、５０％以上の（ラン１、２、３）の平均生存率％が提供されたことを説明している。
（態様）
（態様１）
カスパーゼ活性を誘導する方法であって、細胞を、以下の式によって表される処理化合物と接触させることを含み、

【化1】

式中、処理化合物がランダムコポリマーであり、Ｒ ^１ が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ ^２ が水素およびヒドロキシル基から選択され、Ｒ ^１ がＲ ^２ とは異なり、ｘとｙの合計が４～２０，０００である、方法。
（態様２）
前記処理化合物が、２００～２，０００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、態様１に記載の方法。
（態様３）
前記処理化合物が、処理培地中０．００１ミリモル～７５ミリモルの濃度を有する、態様１に記載の方法。
（態様４）
前記細胞ががん性細胞である、態様１に記載の方法。
（態様５）
前記カスパーゼがエフェクターカスパーゼである、態様１に記載の方法。
（態様６）
前記カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、またはそれらの組み合わせから選択される、態様１に記載の方法。
（態様７）
アポトーシスを誘発することをさらに含む、請求項１に記載の方法。