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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-14
(45)【発行日】2024-06-24
(54)【発明の名称】新規のＤＮＡアプタマー及びこれの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20240617BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240617BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240617BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20240617BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20240617BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240617BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240617BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240617BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240617BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240617BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240617BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240617BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K31/7088
A61K45/00
A61K47/59
A61K47/61
A61P1/02
A61P1/16
A61P1/18
A61P11/00
A61P25/28
A61P35/00
A61P43/00 121
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022503567
(86)(22)【出願日】2019-07-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-10
(86)【国際出願番号】 KR2019008987
(87)【国際公開番号】W WO2021010534
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2022-07-08
(31)【優先権主張番号】10-2019-0086862
(32)【優先日】2019-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514039912
【氏名又は名称】ナショナル キャンサー センター
(73)【特許権者】
【識別番号】521272148
【氏名又は名称】ジェーピーバイオエー・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＪＰ ＢＩＯ Ａ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，ユンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ホ，ギュン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ソンイル
(72)【発明者】
【氏名】キム，インフ
【審査官】谷合 正光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１２６６４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５２８５８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０７３５３５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１５
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４７／５９
Ａ６１Ｋ ４７／６１
Ａ６１Ｐ １／０２
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ １／１８
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号６の塩基配列からなる、ＤＮＡアプタマー。
【請求項2】
配列番号４の塩基配列からなる、ＤＮＡアプタマー。
【請求項3】
請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡアプタマーを含む、癌組織ターゲッティング用組成物。
【請求項4】
請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡアプタマーを含む、癌診断用組成物。
【請求項5】
請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡアプタマーを含む、癌治療用組成物。
【請求項6】
前記癌は、膵臓癌、大腸癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍、口腔癌、または、乳癌である、請求項５に記載の癌治療用組成物。
【請求項7】
前記ＤＮＡアプタマーと結合された抗癌剤をさらに含む、請求項５又は請求項６に記載の癌治療用組成物。
【請求項8】
前記抗癌剤がＭＭＡＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ＭＭＡＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、カリケアミシン、メルタンシン、ラブタンシン、テシリン、ドキソルビシン、シスプラチン、ＳＮ－３８、デュオカルマイシン、及びピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択された１つ以上であるものである、請求項７に記載の癌治療用組成物。
【請求項9】
前記ＤＮＡアプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはこれの誘導体、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはこれの誘導体、デンドリマーまたはホスホリルコリン含有重合体と結合されたものである、請求項５～請求項８のいずれか一項に記載の癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、新規のＤＮＡアプタマーに関するものである。具体的には、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸを用いて膵臓癌ＤＮＡライブラリーから膵臓癌細胞に特異的に結合するものとして選別されたＤＮＡアプタマーに関するものである。本開示は、国立癌センターの機関固有研究事業及び中小ベンチャー企業部のＴＩＰＳプログラム（民間投資主導型の技術創業支援事業）の一環として行った研究から導き出されたものである。
【0002】
［課題固有番号：ＮＣＣ－１２１００８０、研究課題名：Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸを活用した膵臓癌特異的転移因子の発掘］
【0003】
［課題固有番号：ＮＣＣ－１７１０４００、研究課題名：癌微細環境で分泌されるリン酸化酵素ＦＡＭ２０Ｃによる膵臓癌転移調節機序の研究］
【0004】
［課題固有番号：Ｓ２５６２３５１、研究課題名：アプタマー－抗体－薬品融合体を用いた膵臓癌治療剤の開発］
【背景技術】
【0005】
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）とは、独特の３次元構造を有し抗体と同様に対象標的に特異的に結合する単一－ストランドＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドをいう。一般に、アプタマーはナノモル～ピコモルに達する低い濃度でも高い結合力を有する特徴を有する。
【0006】
アプタマーは、ターゲット－特異的結合特性によってしばしば抗体と比較されるが、抗体に比べ、アプタマーは細胞または動物を用いた生物学的工程なしに化学的合成により簡単に製造可能であり、高い温度でも比較的に安定しており、小さいサイズであるので、対象標的へのアプローチ性に優れている。さらに、化学的合成過程で簡単に多様な変形が可能であり、非－免疫性及び無毒性という点で治療剤としての使用の可能性において抗体に比べて有利な長所を有する。ただし、アプタマーは、生体内に存在する核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）により分解され、半減期が短いという短所を有している。このような短所は多様な化学的変形を用いて克服されることができる。
【0007】
膵臓癌は、予後が最も良くない癌腫であって、癌診断後１年以内の死亡率が癌腫全体において１位である。２年生存率が１０％程度であり、５年生存率は８％以内に過ぎない。ここ２０年間、ほぼすべての癌において５年生存率が大幅に増加したが、膵臓癌は、１９９７年に集計された５年生存率３％から、２０１６年には８％程度までの増加に過ぎない暗鬱な結果を示している。
【0008】
実際に膵臓癌患者の中で手術が可能な患者群は２０％前後であり、これすらも腫瘍の大きさが１ｃｍ以下であり、リンパ節転移及び遠隔転移がない場合であってこそ手術後に９０％以上の高い生存率を期待できるが、ほとんどの患者は診断時に既に手術を施すことができないケースに該当する。手術が不可能な場合には、ほとんど抗癌剤や放射線治療に依存しているが、明確に標準化された治療法がないので、できるだけ膵臓癌を早期に診断することが生存率を高めるのに重要である。
【0009】
膵臓癌は、早期症状がほとんど現れないだけでなく、患者が症状を感じるようになると相当な水準に進行した状態がほとんどなので、膵臓癌の早期診断は非常に難しい。現在は、膵臓癌に使用できる早期診断マーカーが事実上ない状況である。
【0010】
早期膵臓癌は、腫瘍の大きさが２ｃｍ未満であり、膵臓内に限定されており、浸潤及びリンパ節転移がないケースであると一般に定義される。しかし、膵臓癌の大きさが早期膵臓癌の基準の２ｃｍ未満であるとしても、５０％に達するケースに転移が伴っている。腫瘍の大きさ、リンパ節転移、遠隔転移の有無によって膵臓癌の病期を区分するとき、早期膵臓癌に分類する第ＩＩ病期でも上腸間膜静脈や肝門脈連結部位に浸潤が生じる場合が多く、少数の細胞による初期転移が発見される場合が多い。このような場合には手術が不可能である。映像学的に遠隔転移が発見されず、腫瘍が膵臓に限定されていると判断されて手術が施された場合にも、手術後の短期間内に遠隔転移が発見される場合が多い。この場合、手術を施しても再発の可能性が非常に高く、効果が明確な抗癌剤がないので、診断後の平均生存率が６～１２カ月に過ぎない。このため、膵臓癌完治のための唯一の方法である早期手術的切除のためにも、本格的な遠隔転移や、少数の細胞による初期転移以前の早期膵臓癌を診断する必要がある。
【0011】
細胞表面蛋白質に対する特異的プローブの開発は、細胞表面蛋白質の細胞外部の部分のみを組換え蛋白質に分離精製した後、これを抗原とした抗体を開発したり、アプタマー選択のための素材として用いられる。アプタマー選別のためのスクリーニング実行方法を一般にＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）技法と呼ぶ。しかし、このような方法は、組換え蛋白質を分離して用いる場合がほとんどであるが、この時、細胞表面蛋白質の３次元的構造が変形される可能性が高く、蛋白質の３次元的構造が標的蛋白質との結合に重要である場合、実際の細胞表面の標的蛋白質には結合できない状況が生じ得る。
【0012】
既存のＳＥＬＥＸ技法とは異なり、生きている細胞を用いて細胞膜特異的にアプタマーを選別するＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ方法を用いる場合には、これらの限界を克服する可能性が高い。
【0013】
本開示では、膵臓癌細胞を対象にＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ方法を用いて膵臓癌に高い結合力を有するＤＮＡアプタマーを選別し、選別されたアプタマーに対して細胞ターゲッティング性能を確認して本開示を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【文献】大韓民国登録特許第１０－１４５８９４７号
【文献】大韓民国登録特許第１０－１２５０５５７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本開示は、新規のＤＮＡアプタマーを提供することを目的とする。具体的には、前記新規のＤＮＡアプタマーは癌特異的に結合するＤＮＡアプタマーである。
【0016】
本開示の他の目的は、癌特異的に結合するＤＮＡアプタマーを用いて癌の診断方法または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本開示は、癌細胞の探知に有用なアプタマーを開発するためのものであって、膵臓癌細胞膜に特異的に結合するアプタマーを、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ方法を用いて選別した。具体的には、本開示は、転移した膵臓癌組織から分離した細胞ＣＭＬｕ－１を標的細胞として用い、正常な膵臓組織細胞ＨＰＮＥを対照群細胞として用いて膵臓癌細胞に特異的に結合するアプタマーを選別した。
【0018】
本開示は、一側面において、配列番号６の塩基配列を含むＤＮＡアプタマーを提供し、本開示は、一側面において、配列番号６の塩基配列と、９０％以上、または、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡアプタマーを提供する。本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーは、癌特異的に結合するものであり得る。本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６の塩基配列からなるものであり得る。
【0019】
また、本開示は、一側面において、配列番号４の塩基配列と、９０％以上、または、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡアプタマーを提供する。本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーは、配列番号４の塩基配列からなるものであり得る。
【0020】
本開示において、「９０％以上の配列相同性を有する塩基配列」とは、１個～数個のヌクレオチドが追加、結実または置換されて９０％以上１００％未満の配列に共通性があるもので、類似の癌特異的結合能が見られる塩基配列を意味する。
【0021】
本開示の一側面において、配列番号４の塩基配列と、９０％以上の配列相同性を有するものは、配列番号４の塩基配列のうち配列番号６の塩基配列に対応する位置ではなく、他の位置で配列番号４の塩基配列と異なる塩基配列を有するものを意味し得る。
【0022】
本開示において、「ＤＮＡアプタマー」は、短い単一ストランドオリゴヌクレオチドとして高い親和度と特異性で対象標的に結合する特性を有し、それぞれ独特の３次元構造を有するものを意味し得る。繰り返された生体外の選別及び濃縮過程を通じてＤＮＡアプタマーライブラリーから特定の対象標的に特異的に結合するＤＮＡ分子、即ち、ＤＮＡアプタマーの選別が可能である。
【0023】
本開示のある実験例において、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ過程を通じて濃縮されたＤＮＡプールのアプタマー配列を分析して類似の配列同士グループ化した結果、１１個のアプタマーファミリー（ＳＱ１～ＳＱ１１）が分類された。このうち、膵臓癌由来の転移した癌細胞であるＣＭＬｕ－１に対して結合力が高いグループとしてＳＱ８が確認された。
【0024】
また、膵臓癌組織由来細胞に特異的に結合するＳＱ８（配列番号４）アプタマー（８０ｍｅｒ）を鋳型として合成収率の増進及び合成費用の削減のために、これの切れた形態のアプタマー（２８ｍｅｒ）を製作した。具体的には、標的細胞ＣＭＬｕ－１への結合力をほぼ維持しながらもサイズを半分以上に減らしたＳＱ８－４アプタマーを製作した（配列番号６）。本開示の発明者は、当該ＳＱ８－４アプタマーがＳＱ８配列で癌細胞及び癌組織ターゲッティング能力に重要な機能をする部位であると判断し、これに基づいて追加実験を行った。
【0025】
一方、本開示の実施例において、Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸに用いた標的細胞は、同所移植実験を通じて転移した膵臓癌組織から得たＣＭＬｕ－１であった。このため、本開示は、特に膵臓癌の診断に役立つことができる。
【0026】
本開示は、前記アプタマーを含む癌組織ターゲッティング用組成物を提供する。本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーを含む組成物は、前記成分にさらに同一または類似の機能をする有効成分、または、組成物の剤形を安定化させたりアプタマーの安定性を増進させたりする成分をさらに含み得る。本開示の一側面において、組成物は製薬組成物であり得る。
【0027】
また、本開示は、前記アプタマーを含む癌診断用組成物を提供する。
【0028】
本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーは、作用剤モイエティと結合されて用いられ得る。
【0029】
本開示の一側面において、作用剤モイエティは、細胞毒性剤、免疫抑制剤、造影剤（例えば、蛍光団またはキレート）、ナノ合成物質または毒素ポリペプチドであり得る。ここで、細胞毒性剤は化学療法剤であり得る。
【0030】
本開示は、一側面において、本開示の一側面による新規ＤＮＡアプタマー及び前記ＤＮＡアプタマーと結合された抗癌剤を含む、癌治療用組成物に関するものであり得る。
【0031】
本開示の一側面において、癌は膵臓癌、大腸癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍、口腔癌または乳癌であり得るが、これに制限されるわけではない。
【0032】
本開示の一側面において、抗癌剤は、ＭＭＡＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ＭＭＡＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、カリケアミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ラブタンシン（ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ４）、テシリン（ｔｅｓｉｒｉｎｅ；ＳＣＸ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ＳＮ－３８、デュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、及びピロロベンゾジアゼピン（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ；ＰＢＤ）からなる群から選択された１つ以上であり得るが、これに制限されるわけではない。
【0033】
本開示の一側面において、ＤＮＡアプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはこれの誘導体、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）またはこれの誘導体、デンドリマーまたは双性イオン－含有生体適合性重合体（例えば、ホスホリルコリン含有重合体）と結合されたものであり得る。
【0034】
本開示の一側面において、組成物は、生理学的に許容可能な賦形剤、担体、または、添加剤をさらに含み得、これにはデンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキシド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファデンプン、コーンスターチ、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール及びタルクなどが用いられ得るが、これに制限されるわけではない。
【0035】
一方、本開示の一側面において、組成物は、関連技術分野の通常の技術者によって理解されているように、選択された投与経路に応じて多様な形態で対象体に投与され得る。例えば、局所、経腸または非経口適用によって投与され得る。局所適用は、表皮、吸入、浣腸剤、点眼剤、点耳剤及び身体内の粘膜を通じた適用を含んでいるが、これに制限されるわけではない。経腸適用は、経口投与、直腸投与、膣投与及び胃栄養供給チューブなどを含み得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、角皮下、関節内、皮膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻腔、肺内、脊髄腔内、直腸及び局所投与方式を含み得る。
【0036】
また、本開示の一側面において、組成物は投与経路などに応じて適切な形態で製剤化され得る。製剤化する場合には、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤などを用いて調剤され得るが、これに制限されるわけではない。
【0037】
本開示の一側面において、組成物には投与経路と、対象体の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、排泄率などによって通常の技術者が有効であると判断する量の本開示の一側面によるＤＮＡアプタマーが含まれ得る。
【発明の効果】
【0038】
本開示の癌細胞に高い結合力を有するものとして選別されて最適化されたＤＮＡアプタマーは、標的細胞及び組織ターゲッティング効率が増進し、癌の診断及び治療などに効果的に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】図１は、本開示のＤＮＡライブラリーに含まれたヌクレオチドの形態、及びこれを増幅または同定するのに用いられる前方プライマー及び後方プライマーの形態に関するものである。具体的には、ＤＮＡライブラリーに含まれたヌクレオチドは５’－末端に２０個の一般ヌクレオチドがあり、中間に４０個の無作為塩基配列を有し、３’－末端に追加で２０個の一般ヌクレオチドからなる。前方プライマーは５’－末端をＣｙ５で標識し（５’－Ｃｙ５－配列－３’）、後方プライマーは５’－末端をビオチンで標識した（５’－ビオチン－配列－３’）。
【図2】図２は、本開示のＤＮＡライブラリーに含まれた、膵臓癌細胞結合力を有するｓｓＤＮＡプールを濃縮させ、繰り返し回数に応じて細胞結合力の増加の有無をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。
【図6a】図６ａは、本開示のＳＱ８アプタマーの標的細胞結合力をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。具体的には、実施例１（ＳＱ８アプタマー）と未処理対照例及び比較例１（ＤＮＡプールライブラリー）の標的細胞結合力を測定した。
【図6b】図６ｂは、本開示のＳＱ８－４アプタマーの標的細胞結合力をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。具体的には、実施例１（ＳＱ８アプタマー）及び実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）と未処理対照例及び比較例１（ＤＮＡプールライブラリー）の標的細胞結合力を測定した。
【図8】図８は、共焦点顕微鏡を通じて本開示の実施例１（ＳＱ８アプタマー）の標的細胞へのターゲッティング様相を確認した図面である。灰色の楕円形で表示された部分が核を示し、最も明るく白い色で表示された部分が細胞表面に結合するか、または、細胞へ内在化されたアプタマーを示す。
【図9】図９は、共焦点顕微鏡を通じて本開示の実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）の標的細胞へのターゲッティング様相を確認した図面である。灰色の楕円形で表示された部分が核を示し、最も明るく白い色で表示された部分が細胞表面に結合するか、または、細胞へ内在化されたアプタマーを示す。
【図12】図１２は、ヒト膵臓癌患者の膵臓癌細胞に対する異種移植マウスモデルにおいて、生体発光イメージング実験を通じて本開示の実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）の膵臓癌組織へのターゲッティング様相を確認した図面である。
【図13】図１３は、本開示のＳＱ８－４アプタマーの多様な膵臓癌細胞株に対する結合力をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。具体的には、実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）と未処理対照例及び比較例３（ＳＱ８－４－Ｃｏｍｐアプタマー）の細胞結合力を測定した。
【図15a】図１５ａ及び図１５ｂは、本開示のＳＱ８－４アプタマーの多様な癌細胞株に対する結合力をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。具体的には、実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）と未処理対照例及び比較例３（ＳＱ８－４－Ｃｏｍｐアプタマー）の細胞結合力を測定した。
【図15b】図１５ａ及び図１５ｂは、本開示のＳＱ８－４アプタマーの多様な癌細胞株に対する結合力をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）で確認した結果である。具体的には、実施例２（ＳＱ８－４アプタマー）と未処理対照例及び比較例３（ＳＱ８－４－Ｃｏｍｐアプタマー）の細胞結合力を測定した。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本開示は、前述した側面及び後述する実験例または実施例を通じて更に明確になるものである。以下では、本開示の添付の表を参照して記述される実施例を通じて当該業界の通常の技術者が容易に理解して実現することができるように詳細に説明することにする。しかし、これらの実験例または実施例は、本開示を例示的に説明するためのものであって、本開示の範囲がこれらの実験例または実施例に限定されるわけではない。
【0041】
［実験例１］Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸを用いたアプタマースクリーニング
【0042】
Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ技法を用いて膵臓癌細胞特異的に結合するアプタマーをスクリーニングするための実験方法を図３に概略的に記載した。
【0043】
詳述すると、まず膵臓癌の特徴的な細胞膜蛋白質を表現する生きている細胞株を得るために、膵臓癌細胞を動物に移植して癌が転移した組織から膵臓癌細胞株ＣＭＬｕ－１を単離した（図３Ａ）。
【0044】
ｓｓＤＮＡライブラリーを製作し、これに対して膵臓癌細胞株であるＣＭＬｕ－１細胞を標的細胞（陽性細胞）として用い、対照群細胞（陰性細胞）としてｈＴＥＲＴ／ＨＰＮＥ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｓｔｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を用いてスクリーニングした。対照群細胞には結合せず、膵臓癌細胞のみに結合するｓｓＤＮＡ選別過程を繰り返して選択された濃縮されたｓｓＤＮＡプールをクローニングし、配列分析した後、グループ化した。
【0045】
（１）ヒト膵臓癌細胞株の異種移植マウスモデルから転移した膵臓癌細胞株の構築
【0046】
転移した膵臓癌細胞ＣＭＬｕ－１は下記方法で得た。具体的には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）マウスモデルを作った。まず、膵臓癌の転移状況を模写（ｍｉｍｉｃ）できる動物モデルを構築するにおいて、時期に応じた腫瘍形成の状況を非侵襲的にモニタリングできるようにホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が持続的に発現する細胞株である膵臓癌細胞株（ＣＦＰＡＣ－１－Ｌｕｃｉ ｃｅｌｌｓ）を確立して用いた。膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ－１－ＬｕｃｉをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに同所移植し、４３日が過ぎた後、膵臓から転移した肺組織から腫瘍組織を摘出して遺伝型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を行って転移した細胞の遺伝的性質が膵臓癌細胞と同じであることを確認した後、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）として分離して培養した。転移腫瘍組織から分離したＣＭＬｕ－１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）及び１００ＩＵ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ａｎｔｉ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ；Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）培地で培養・維持した。
【0047】
このように得たＣＭＬｕ－１細胞をＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸで陽性選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のための細胞として用い、ＡＴＣＣ Ｉｎｃ.から購入したヒト膵管上皮正常細胞（Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＰＮＥ）を陰性選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のための対照群細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌ）として用いた。
【0048】
（２）ｓｓＤＮＡライブラリーの製作及びＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸのためのプライマーの製作
【0049】
膵臓癌－特異的アプタマーＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ使用のためのＤＮＡライブラリーは、一般及び独特のヌクレオチドの組合わせで構成されたＤＮＡ配列のプール（ｐｏｏｌ）であった。５’－末端に２０個の一般ヌクレオチドがあり、中間に４０個の無作為塩基配列を有し、３’－末端に追加で２０個の一般ヌクレオチドからなる。蛍光－活性化細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ；「ＦＡＣＳ」；別名「フローサイトメーター」）を用いて選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の濃縮をモニタリングするために５’－末端をＣｙ５で標識し、３’－末端はｓｓＤＮＡ精製のためにビオチンで標識した（図１）。また、前方プライマーは５’－末端をＣｙ５で標識し（５’－Ｃｙ５－配列－３’）、後方プライマーは５’－末端をビオチンで標識した（５’－ビオチン－配列－３’）。ＤＮＡライブラリーに含まれたＤＮＡ形態と、用いられる前方及び後方プライマーの形態は、下記表１の通りである。
【0050】
【表1】
【0051】
各溶出されたプールを増幅させるためにＰＣＲが用いられた。ストレプトアビジン－ビオチン結合でビオチン化された相互補完ストランドを捕獲し、二重－ストランドＤＮＡはＮａＯＨに変成させることを通じてｓｓＤＮＡを分離した。ＰＣＲ混合物を準備し、メーカーの指示に従ってＰＣＲ反応を行った。
【0052】
（３）Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を通じたライブラリースクリーニング
【0053】
前記製作されたｓｓＤＮＡライブラリーに対してＣＭＬｕ－１細胞を標的細胞（陽性細胞）として用い、ｈＴＥＲＴ／ＨＰＮＥ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｓｔｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を対照群細胞（陰性細胞）として用いてスクリーニングを行った。
【0054】
１０ｎｍｏｌのＤＮＡライブラリーを５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.１ｍｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ、及び１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）である、結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）１,０００μＬに溶解させた。ＤＮＡライブラリーまたは濃縮されたプールを９５℃で１０分間変成させ、氷の上で１０分間冷却させた後、オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）で４℃で１時間ＣＭＬｕ－１細胞とともに培養した。結合していないＤＮＡ配列を除去するために、ＣＭＬｕ－１を３回洗浄した後、結合したＤＮＡは１,０００μＬの結合緩衝液を用いて９５℃で１５分間遠心分離機を通じて溶出した。対抗選択（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を行うために、各アプタマープールをｈＴＥＲＴ／ＨＰＮＥを１時間培養し、その後、陰性選択を行うために、上澄液を採取した。濃縮されたプールはＦＡＣＳを用いてモニタリングされ、アプタマー候補を同定するためにシークエンシング用キアゲンクローニングキット（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）にクローニングした。
【0055】
（４）濃縮されたｓｓＤＮＡプールのクローニング及びシークエンシング及び多重配列整列の分析
【0056】
候補配列の選択のために５回濃縮されたｓｓＤＮＡプールをクローニングし、シークエンシングした。ｓｓＤＮＡプールは変形されていないプライマーを用いてＰＣＲで増幅され、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にライゲーションし、ＨＩＴＴＭ－ＤＨ５αコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）にクローニングした。これにより、２００個のクローニングされた配列がコスモジンテック（ソウル、韓国）を通じて分析され、ＣｌｕｓｔａｌＸ １.８３で整列した。
【0057】
各濃縮回数による濃縮程度を確認した結果は、図２の通りである。
【0058】
前記（１）～（４）の過程は、図３で図式化された。この過程を通じて配列確認された各アプタマーを類似の配列を有する各アプタマーにグループ化し、これを通じてＣｙ５－標識アプタマーファミリー候補１１個（ＳＱ１～ＳＱ１１）が確認された。当該アプタマーファミリーのプール全体での含量は、下記表２の通りであった。
【0059】
【表2】
【0060】
［実験例２］濃縮されたアプタマーファミリー候補の標的細胞結合特異性の確認
【0061】
実験例１の（４）で得られた濃縮されたアプタマーファミリー候補のＣＭＬｕ－１標的細胞結合特異性をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を通じて確認した。
【0062】
各Ｃｙ５－標識アプタマーファミリー候補を３×１０５ＣＭＬｕ－１細胞及びｈＴＥＲＴ／ＨＰＮＥ細胞とともにＣｅｌｌ－ＳＥＬＥＸで用いられた４℃の結合緩衝液で１時間培養した。細胞を０.１％ＮａＮ３を含む結合緩衝液で３回洗浄し、結合された配列を有するペレットを結合緩衝液に再懸濁させた。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｌｉｂｕｒＴＭ及びＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を通じて１０,０００個の細胞を測定して蛍光分析を行い、データはＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１０.０.７を用いて分析した。
【0063】
各Ｃｙ５－標識アプタマーファミリー候補のターゲット細胞結合力を測定した結果は、図４の通りである。対象ターゲット細胞である転移した膵臓癌細胞（ＣＭＬｕ－１）に結合特異性が高いアプタマーであるＳＱ８を確認し、この配列は下記の通りである。
【0064】
*ＳＱ８アプタマー配列
【0065】
５’－ＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ－３’（配列番号４）
【0066】
［実験例３］ＳＱ８アプタマーの分析及びアプタマー断片機能の確認
【0067】
前記実験例２を通じて選ばれたＳＱ８の配列による２次構造を確認した結果は、図５の通りである。また、細胞結合力を再確認するために、ＳＱ８アプタマー（実施例１）、未処理対照例及び比較例１（ＤＮＡプールライブラリー）の標的細胞結合力を実験例２と同一の方法でＦＡＣＳを用いて測定した。その結果は、図６ａで確認できるように、対照例及び比較例１は、類似の水準の低い結合力を示した一方、実施例１のＳＱ８アプタマーは、標的細胞結合力が顕著に優れた。
【0068】
ＳＱ８アプタマーの中に膵臓癌特異的結合に特に重要な部分が存在するか確認するために、ＳＱ８の一部分を含む多様なアプタマーを製造して標的細胞との結合力を確認した。細胞結合力は維持しながらアプタマー全体の大きさを減らすことができるならば、アプタマーの製造費用は下げながら細胞内浸透力を増進させることができるものである。結果的には、下記表３の配列のＳＱ８－４アプタマー（実施例２）が標的細胞結合力をほぼ維持しながらも優れたエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）能力を有することを確認した。具体的には、実施例１、実施例２、未処理対照例、及び比較例１（ＤＮＡプールライブラリー）の標的細胞結合力を実験例２と同一の方法でＦＡＣＳを用いて測定した。その結果は、図６ｂで確認できるように、対照例及び比較例１は、類似の水準の低い結合力を示した一方、実施例１のＳＱ８アプタマーは、標的細胞結合力が顕著に優れ、実施例２のＳＱ８－４アプタマーは、実施例１より標的細胞結合力が顕著に優れた。
【0069】
ＳＱ８－４の配列は下記の通りであり（配列番号６）、該当する２次構造は図７の通りである。また、次の実験で実施例１及び２の比較群として用いるために、比較例２（ＳＱ８－Ｃｏｍｐ；ＳＱ８と一部分で相補的な核酸配列を有するアプタマー；配列番号５）及び比較例３（ＳＱ８－４－Ｃｏｍｐ；ＳＱ８－４と相補的な核酸配列を有するアプタマー；配列番号７）を製造した。
【0070】
【表3】
【0071】
［実験例４］選択されたアプタマーの細胞及び組織内の効率のよいターゲッティングの確認
【0072】
（１）選択されたアプタマーのエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）効率を共焦点顕微鏡イメージングを通じて確認した。
【0073】
１×１０４細胞／ウェルの対照群細胞（ＨＰＮＥ）と標的細胞（ＣＭＬｕ－１）をｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）でコーティングされた８－ウェルチャンバスライド（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に実験の４時間前にプレーティングした。洗浄緩衝液で洗浄した後に、４℃の結合緩衝液２００ｕｌに２５０ｎＭのＣｙ５－標識アプタマー（即ち、実施例１、実施例２、比較例２、及び比較例３）、または、比較例１（ＤＮＡプールライブラリー）を添加して培養した。２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核を染色した。この後、細胞を共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて映像化し、イメージはソフトウェア（Ｚｅｎ ｂｌｕｅ）で分析した。
【0074】
実施例１及び実施例２の共焦点顕微鏡の実験結果は、図８及び図９の通りである。図面で最も明るく見える白色の部分が、アプタマーが多く集まっていることを示す。図８及び図９で見られるように、実施例１及び実施例２のアプタマーが対照群細胞に比べて膵臓癌細胞を十分にターゲッティングし、細胞内のエンドサイトーシス（内在化）もうまくいくことを確認することができた。また、実施例１及び実施例２のアプタマーは、比較例より顕著に優れて膵臓癌細胞を十分にターゲッティングし、細胞内のエンドサイトーシスもうまくいくことを確認することができた。
【0075】
（２）生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）蛍光イメージングを通じてアプタマーの膵臓癌ターゲティングを確認した。
【0076】
雌Ｈｓｄ：無胸腺ヌード－Ｆｏｘｎ１ヌードマウス（Ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ:６週齢）をＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（フランス）から購入した。これらを光と湿度が制御される条件の無特異病原体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）環境に保管し、国立癌センター動物施設で飼料と水の供給を受けた。すべての動物実験は、国立癌センター研究所（ＮＣＣＲＩ，ｕｎｉｔ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣＣ－１６－１６３Ｄ）の実験動物運営委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ；ＩＡＣＵＣ）から許可を受けて行った。ＮＣＣＲＩは、国際実験動物管理評価認証協会から認可された機関である。
【0077】
膵臓癌の同所異種移植マウスモデルは、ＡＴＣＣから購入したＣＦＰＡＣ－１細胞（１×１０６細胞）をマウス膵尾（ｔａｉｌ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｓ）に注射して構築した。接種３週後にマウスは治療によってＣｙ５.５が標識された実施例１及び比較例２または実施例２及び比較例３の２つのグループに分かれ、前記Ｃｙ５.５－標識アプタマー（３００ｐｍｏｌ／５０ｕｌのＰＢＳ）を静脈内に投与した。
【0078】
生体外実験のためには、投与１５分後または３時間後にマウスを犠牲にして解剖した。腫瘍組織を得て、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて生体発光イメージングで映像化した。すべての映像データは、ソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【0079】
実施例１及び実施例２の生体発光イメージング実験結果は、図１０及び図１１のグレースケール（Ｇｒａｙ ｓｃａｌｅ）図の通りである。また、イメージング結果から得たフラックス全体（ｔｏｔａｌ ｆｌｕｘ）を図１０及び図１１にグラフで示した。
【0080】
各図の上段のイメージング結果では、白色で明るく示されるほど細胞にアプタマーが多く結合したということを意味する。実施例１及び実施例２のアプタマーは、比較例２及び比較例３に比べてイメージング結果が白色で示されることを確認できる。一方、比較例２及び３のイメージング結果では、白色で示される部分は存在しなかった。
【0081】
従って、本開示のアプタマーが他の比較群アプタマーに比べ、膵臓癌組織に特異的に移動して結合するということを確認でき、膵臓癌組織に対する顕著に優れたターゲッティング効率を有することを確認できた。
【0082】
［実験例５］ヒト患者膵臓癌組織のマウス同所異種移植モデル（Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌ；ＰＤＯＸモデル）でのターゲッティングの確認
【0083】
本開示のアプタマーが患者腫瘍組織の複雑性（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）及び異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を反映できる患者－由来同所異種移植モデル（「ＰＤＯＸモデル」）でも優れたターゲッティング効率を有するか確認するために、蛍光イメージングを用いた生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）検証実験を行った。
【0084】
国立癌センター医生命研究審議委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ；「ＩＲＢ」）の審議を経た後、研究に同意した患者を対象に検体を確保してヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（フランス）から購入）の膵臓に直接移植した患者－由来同所異種移植モデル（ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ，ＰＤＯＸ）を製作した。膵臓癌患者の原発性腫瘍検体（以下「ＨＰＴ」と称する）は、手術的切除直後に、手術が不可能な進行性膵臓癌患者の場合は、患者から肝転移組織生検検体（以下「ＧＵＮ」と称する）を採取した直後に、培地に浸されたチューブに入れて移動してできるだけ速かに雌Ｈｓｄ：無胸腺ヌード－Ｆｏｘｎ１ヌードマウス（実験例４と同一に入手）の膵臓の膵尾に切除及び縫合して移植した（ＰＤＯＸ１世代、Ｆ１）。その後、周期的に腹部促進及びＭＲＩ映像装備を通じて腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが３０００ｍｍ３に到達すると、マウスを犠牲にして腫瘍組織を得た後、一定の大きさ（３ｍｍ＊３ｍｍ＊３ｍｍ）の腫瘍組織を多数の個体のヌードマウスに同所再移植して次世代（Ｆ２，Ｆ３，Ｆ４…）を形成させ、個体数を増幅した。
【0085】
４世代（Ｆ４）で構築された患者－由来同所異種移植マウスモデルを三匹ずつ２つのグループに分け、それぞれＣｙ５.５が標識されたアプタマー（３００ｐｍｏｌ／５０ｕｌのＰＢＳ）である実施例２及び比較例３を静脈投与した。投与１５分後にマウスを犠牲にした後、解剖して腫瘍組織を得た後、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて生体発光イメージングで映像化した。すべての映像データは、ソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。
【0086】
【0087】
図１０及び図１１のように、図１２でも図面の上段のイメージング結果では、白色で明るく示されるほど細胞にアプタマーが多く結合したということを意味し、実施例２のアプタマーは、比較例３に比べて白色水準が非常に高いことを確認できる。一方、比較例３のイメージング結果では、白色で示される部分は存在しなかった。
【0088】
即ち、本開示のアプタマーは、患者腫瘍組織の複雑性（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）及び異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を保有しているＰＤＯＸモデルでも顕著に優れたターゲッティング効率を有していることを確認できた。
【0089】
［実験例６］多様な膵臓癌細胞株での結合能の確認
【0090】
多様な種類の膵臓癌細胞株に対する本開示のアプタマーの結合能を確認するために、追加のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）実験を行った。
【0091】
実験例２と同一の方法でフローサイトメトリーを行うものの、Ｃｙ５－標識された実施例２及び比較例３を２５０ｎＭの濃度で用いた。細胞は、ＣＦＰＡＣ－１細胞株、Ｃａｐａｎ－１細胞株、ＨＰＡＦ－ＩＩ細胞株、ＭＩＡ ＰａＣａ細胞株、ＢｘＰＣ－３細胞株、及びＰＡＮＣ－１細胞株をそれぞれ用いた。このような細胞株は、いずれもＡＴＣＣから購入した。
【0092】
【0093】
図１３及び１４の結果によると、本開示の実施例２のアプタマーは、比較例３のアプタマーに比べ、すべての膵臓癌細胞株に対してさらに優れて特異的に結合することを確認できる。先に詳察した実験例４及び５の結果と総合すると、本開示のアプタマーは、多様な類型の膵臓癌細胞に特異的に結合するものであることを確認できる。
【0094】
また、実施例１のアプタマーは実施例２のアプタマーを含むものであるので、同様に多様な類型の膵臓癌細胞に特異的に結合するものである。
【0095】
［実験例７］多様な癌腫細胞株での結合能の確認
【0096】
多様な癌腫の細胞株に対する本開示のアプタマーの結合能を確認するために、追加のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）実験を行った。
【0097】
実験例２と同一の方法でフローサイトメトリーを行うものの、Ｃｙ５－標識された実施例２及び比較例３を２５０ｎＭの濃度で用いた。細胞は、ＨＴＣ１１６細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株、Ａ５４９細胞株、Ｕ８７細胞株、ＣＡＬ２７細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株、ＭＣＦ７細胞株、及びＫＰＬ４細胞株をそれぞれ用いた。このような細胞株は、いずれもＡＴＣＣから購入した。
【0098】
【0099】
図１５ａ、図１５ｂ及び図１６の結果によると、本開示の実施例２のアプタマーは、比較例３のアプタマーに比べ、多様な癌細胞株、即ち、大腸癌、肝癌、肺癌、脳腫瘍、口腔癌及び乳癌の細胞株に対してさらに優れて特異的に結合することを確認できる。先に詳察した実験例４及び５の結果と総合すると、本開示のアプタマーは多様な類型の癌細胞に特異的に結合するものであることを確認できる。
【0100】
また、実施例１のアプタマーは実施例２のアプタマーを含むものであるので、同様に多様な類型の癌細胞に特異的に結合するものである。
【0101】
［実験例８］膵管腺癌腫のＰＤＯＸ－由来細胞株での結合能の確認
【0102】
本開示のアプタマーが、実際の臨床患者の膵臓癌細胞に特異的に十分に結合する可能性を有するか否かを確認するために、追加のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）実験を行った。
【0103】
限定された細胞分裂後に死滅する正常細胞とは異なり、癌細胞は無限分裂の特性を有しているので、腫瘍組織から分離された癌細胞は、形質転換がなくても無限増殖が可能な細胞株を形成することができ、患者の臨床的、分子生物学的な特性を反映させることができると考えられる。本実験で、膵臓癌ＰＤＯＸマウスから摘出した腫瘍組織を３ｍｍ＊４ｍｍに切り出した後、細胞を結合組織から分離するためにコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）が含まれたＨｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）と混合して組織解離装置（Ｇｅｎｔｌｅ Ｍａｃｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）で１時間反応させる。反応終了の後、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）が含まれたＲＰＭＩ培地で酵素活性を抑制し、続いて遠心分離すれば、組織から解離した細胞の沈殿物を得ることができる。ウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ培地でこれを懸濁して１０ｃｍの培養皿に２×１０６個の水準に細胞を一様に敷き、二日ごとに培地を交換しながら正常の線維芽細胞と死んだ細胞を除去して膵臓癌患者別のＰＤＯＸ由来癌細胞株を確立した。確立した各細胞株の命名は、由来したＰＤＯＸの命名と同一である。
【0104】
肝転移患者生検組織を用いたＧＵＮ＃３８及びＧＵＮ＃４１と、手術的切除検体を用いたＨＰＴ＃１９、ＨＰＴ＃２２、ＨＰＴ＃４３ ＰＤＯＸモデルの腫瘍組織から分離した癌細胞株を対象に実験例２と同一の方法でフローサイトメトリーを行うものの、Ｃｙ５－標識された実施例２及び比較例３を２５０ｎＭの濃度で用いた。
【0105】
【0106】
図１７及び図１８の結果によると、本開示の実施例２のアプタマーは、比較例３のアプタマーに比べ、複数の患者から得た膵臓癌組織から由来した多様なＰＤＯＸ－由来細胞株に対してさらに優れて特異的に結合することを確認できる。先に詳察した実験例４及び５の結果と総合すると、本開示のアプタマーは、実際の臨床で患者の膵臓癌組織に特異的に結合するものであることを確認できる。
【0107】
また、実施例１のアプタマーは、実施例２のアプタマーを含むものであるので、同様に患者の膵臓癌組織に特異的に結合するものである。
【0108】
以上、一部の実施例と添付の図面に示された例によって本開示の技術的思想が説明されたが、本開示の属する技術分野で通常の知識を有する者が理解できる本開示の技術的思想及び範囲を逸脱しない範囲で多様な置換、変形及び変更がなされ得るという点を理解すべきである。また、そのような置換、変形及び変更は、添付の請求の範囲内に属すると考えられなければならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15a】
【図15b】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】