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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-14
(45)【発行日】2024-06-24
(54)【発明の名称】婦人科腫瘍の初代細胞の培養方法及びその支援培地
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20240617BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240617BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 G
C12N5/09
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2022525687
(86)(22)【出願日】2020-11-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-28
(86)【国際出願番号】 CN2020126391
(87)【国際公開番号】W WO2021088847
(87)【国際公開日】2021-05-14
【審査請求日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】201911069251.4
(32)【優先日】2019-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911069291.9
(32)【優先日】2019-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520492695
【氏名又は名称】北京基石生命科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸ ＨＥＡＬＴＨ ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】２０１－Ｃ１１ Ｗｅｓｔ， Ｅ－Ｐａｒｋ， Ｎｏ．６５ Ｘｉｎｇｓｈｉｋｏｕ Ｒｄ．， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】張函▲すうえ▼
(72)【発明者】
【氏名】▲いん▼申意
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１１１６８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１０６２９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５０９０２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２２６４７２（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｙ－２７６３２、プロゲステロン、β－エストラジオール、及びヒト細胞培養用基礎培地の組成を有するとともに、前記ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢにおけるペニシリンの最終濃度が１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢにおけるストレプトマイシンの最終濃度が１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢにおけるアンホテリシンＢの最終濃度が２５０～２５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度が８～１２ｍＭであり、前記ＧｌｕｔａＭａｘの最終濃度が０．８～１．２％（体積百分率）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０～１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０～５０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が０．５～２ｍＭであり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１％（体積百分率）であり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度が５～２０μＭであり、前記プロゲステロンの最終濃度が５０～１００ｎＭであり、前記β－エストラジオールの最終濃度が１０～５０ｎＭであり、残部がヒト細胞培養用基礎培地であることを特徴とする、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地。
【請求項2】
前記培地は、前記ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記Ｙ－２７６３２、前記プロゲステロン、前記β－エストラジオール、及び前記ヒト細胞培養用基礎培地を含む溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項3】
前記培地における各成分は、単独で存在し、使用時に配合に従って調製されることを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項4】
前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記Ｙ－２７６３２、前記プロゲステロン、及び前記β－エストラジオールは、それぞれ母液として存在していることを特徴とする、請求項３に記載の培地。
【請求項5】
前記母液は、１０００～１０００００倍の母液であり：１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ母液は、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ母液は、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ母液は、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
１０００×ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ母液は、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
１０００×Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン母液は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及び水の組成を有し、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの濃度は０．５Ｍであり、残部は水であり；
１０００×Ｙ－２７６３２母液は、Ｙ－２７６３２及び水の組成を有し、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０ｍＭであり、残部は水であり；
１０００００×プロゲステロン母液は、プロゲステロン及び無水エタノールの組成を有し、プロゲステロンの最終濃度は１ｍＭであり、残部は無水エタノールであり；
１０００００×β－エストラジオール母液は、β－エストラジオール及び無水エタノールの組成を有し、β－エストラジオールの最終濃度は１ｍＭであり、残部は無水エタノールであることを特徴とする、請求項４に記載の培地。
【請求項6】
前記ＢＳＡは、前記１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ母液、前記１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ母液、前記１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ母液、前記１０００×ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ母液において、母液として存在し、前記ＢＳＡが使用する直前に調製されることを特徴とする、請求項５に記載の培地。
【請求項7】
前記ＢＳＡは１００倍の母液として存在し、１００×ＢＳＡ溶液はＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、前記１００×ＢＳＡ溶液において、前記ＢＳＡの最終濃度は０．１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであることを特徴とする、請求項６に記載の培地。
【請求項8】
前記ヒト細胞培養用基礎培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、細胞単離緩衝液、細胞消化液、サンプル洗浄液、消化停止液、細胞凍結保存液及び１％ ＣＹＴＯＰ（登録商標）溶液のうちの少なくとも１種の試薬とを含む、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための支援試薬であって、前記サンプル解離液は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩＩ、コラゲナーゼＩＶ及びＰＢＳの組成を有し、前記コラゲナーゼＩの前記サンプル解離液における最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬであり、前記コラゲナーゼＩＩＩの前記サンプル解離液における最終濃度は２５０～３５０Ｕ／ｍＬであり、前記コラゲナーゼＩＶの前記サンプル解離液における最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり、
前記サンプル保存液は、ウシ胎児血清、ペニシリン・ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ及びＨＢＳＳの組成を有し、前記ウシ胎児血清の最終濃度は１～５％（体積百分率）であり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭであり、残部はＨＢＳＳであり；
前記細胞単離緩衝液は、ペニシリン・ストレプトマイシン、ヘパリンナトリウム、及びＰＢＳの組成を有し、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度は１０ＩＵ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
前記細胞消化液は、Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ及びＰＢＳの組成を有し、Ａｃｃｕｔａｓｅは前記細胞消化液１０ｍＬ当たりにおいて４～６ｍＬであり、ＥＤＴＡの最終濃度は５ｍＭであり、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは１．５～２．５ｍＬであり、残部はＰＢＳであり、
前記サンプル洗浄液は、ペニシリン・ストレプトマイシン及びＰＢＳの組成を有し、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり；
前記消化停止液は、ウシ胎児血清、ペニシリン・ストレプトマイシン、及びＤＭＥＭ培地の組成を有し、前記ウシ胎児血清の最終濃度は８～１２％であり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン・ストレプトマイシンにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、残部はＤＭＥＭ培地であり；
前記細胞凍結保存液は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＳＯ、及び１％メチルセルロース溶液の組成を有し、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、前記ＤＭＳＯ、及び前記１％メチルセルロース溶液は、それらの体積比が２０：２：（０．８～１．２）であり、前記１％メチルセルロース溶液は、濃度が１ｇ／１００ｍｌであるメチルセルロース水溶液であり；
前記１％ ＣＹＴＯＰ（登録商標）溶液は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）及びフッ素オイルの組成を有し、前記１％ ＣＹＴＯＰ（登録商標）溶液１００ｍＬ当たりにおいてＣＹＴＯＰ（登録商標）を１ｍＬ含み、残部はフッ素オイルであることを特徴とする、支援試薬。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の培地又は請求項９に記載の支援試薬の、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための使用。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の培地を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を懸濁培養する工程を含む、婦人科腫瘍の初代細胞を培養する方法。
【請求項12】
前記婦人科腫瘍の初代細胞は、婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞又は婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞は、請求項９に記載のサンプル解離液を用いて婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を解離処理して得られたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
１ｍｇ組織当たり０．１～０．３ｍＬの前記サンプル解離液の量で、切断した前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を、事前に３７℃に予熱した前記サンプル解離液により処理して、３７℃、１５分間～３時間の解離時間という条件で、サンプル解離を行う工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を前記サンプル解離液で解離することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞は、請求項９に記載の細胞単離緩衝液を用いて婦人科腫瘍における胸腔液サンプルから単離して得られたものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプル中の細胞を前記細胞単離緩衝液で懸濁させた後、密度勾配遠心分離により前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞を得る工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルを前記細胞単離緩衝液で単離することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
細胞培養容器Ｍを用いて前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で懸濁培養して、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養し、２～４日毎に培地を一回交換する工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で懸濁培養し、前記細胞培養容器Ｍは、
（Ｉ）ポリスチレン材質の細胞培養容器、ポリカーボネート材質の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート材質の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂材質の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー材質の細胞培養容器又は低付着性表面の細胞培養容器；及び
（ＩＩ）（Ｉ）における細胞培養容器をＣＹＴＯＰ（登録商標）修飾した細胞培養容器
のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞培養容器は、細胞培養皿、細胞培養ウェルプレート、又は細胞培養用マイクロウェルプレートチップであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記（ＩＩ）において、前記（Ｉ）における細胞培養容器を、エッチング出力 ２０Ｗ、エッチング時間 ３分間というエッチング条件で、純酸素エッチングした後、前記細胞培養容器の表面を請求項９に記載の１％ ＣＹＴＯＰ（登録商標）溶液で覆い、前記１％ ＣＹＴＯＰ（登録商標）溶液を乾燥することにより、ＣＹＴＯＰ（登録商標）修飾を完了する工程を含む方法において、前記（Ｉ）における細胞培養容器をＣＹＴＯＰ（登録商標）修飾することを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離前処理を行う工程であって、婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルの表面を、体積百分率で７０～７５％であるエタノールで洗浄し、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルを請求項９に記載のサンプル洗浄液及び無菌ＰＢＳ溶液で順番に洗浄する工程を、さらに含むことを特徴とする、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記解離前処理を行う前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルは、その解離時間が２時間以下であり、前記解離前処理を行う直前に請求項９に記載のサンプル保存液に保存されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離処理を前記サンプル解離液で行った後、さらに、解離反応を請求項９に記載の消化停止液で停止させ、細胞懸濁液を収集し、前記細胞懸濁液を濾過して組織残片及び接着細胞を除去し、遠心分離した後、無菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、再度遠心分離した後、前記培地で細胞ペレットを再懸濁させる工程を含むことを特徴とする、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記婦人科腫瘍の初代細胞を前記培地で培養する過程において、前記婦人科腫瘍の初代細胞が直径８０～１２０μｍの塊を形成するとき、前記婦人科腫瘍の初代細胞を継代させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記継代を行う際に使用する細胞消化液は、請求項９に記載の細胞消化液であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記継代を行う際に使用する消化停止液は、請求項９に記載の消化停止液であることを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
２～３回継代して増幅させた前記婦人科腫瘍の初代細胞を凍結保存及び／又は蘇生する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記凍結保存を行う際に用いる細胞凍結保存液は、請求項９に記載の細胞凍結保存液であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記婦人科腫瘍は、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、又はそれらの転移病巣であることを特徴とする、請求項１１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的には、婦人科腫瘍の初代細胞の培養方法及びその支援培地に関する。
【背景技術】
【0002】
一般的な婦人科系腫瘍には、乳がん、卵巣がん及び子宮内膜がん等が挙げられる。中国の国立がんセンターの２０１８年のデータ統計によると、２０１４年、中国で、乳がんは女性の悪性腫瘍の発症率の１６．５％を占め、死亡率は７．８％に達し、それぞれ女性腫瘍の１位と５位にランクされた。現在、中国の乳がんの５年生存率は９０％（米国）に対して、７３．１％に過ぎず、先進国とのギャップがまだ大きい。また、中国における卵巣がんの発生率は、女性の悪性腫瘍の２．５％を占め、過去１０年間で３０％増加した。これらの婦人科系腫瘍は、中国の女性の生命健康に対して深刻な挑戦をもたらした。
【0003】
婦人科腫瘍は、世界中の研究機関や医療機関がその原因や発症の研究に多大な投資をしているにもかかわらず、ほとんど知られていない病気である。婦人科腫瘍は、その発症、進行は、多くのシグナル分子が相互作用して、複雑な分子制御ネットワークを形成すると同時に、外界の環境因子の影響にも影響される動的プロセスであると言われている。婦人科腫瘍の病因や発症・進行過程には、個人差が強く、一概には言えない。このため、婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞の培養物をモデルとして個人化の精確な研究を行うことは、婦人科腫瘍の研究分野、さらには婦人科腫瘍の診断・治療分野での傾向である。
【0004】
従来の初代腫瘍細胞の培養技術は、主に二次元培養、三次元培養、リプログラミング培養などの種類があり、いずれも、さまざまな程度に、培養サイクルが極めて長く、培養の成功率が低く、他の細胞の除去が困難であるという問題点に直面している。
【発明の概要】
【0005】
上記の技術課題を効果的に解決するために、本発明は、新しい婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞の培養技術及びその支援試薬を提供するものであり、当該技術の要旨は、以下の通りである：
（１）婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を温和な細胞解離用試薬で処理して、組織中の腫瘍細胞の活力を最大限に保障すること、（２）特殊な無血清培地を調製し、懸濁培養系を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を体外で培養し、腫瘍細胞の正常な増殖を確保すると同時に、正常細胞による妨害を最大限に排除すること。
（１）婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を温和な細胞解離用試薬で処理して、組織中の腫瘍細胞の活力を最大限に保障すること、（２）特殊な無血清培地を調製し、懸濁培養系を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を体外で培養し、腫瘍細胞の正常な増殖を確保すると同時に、正常細胞による妨害を最大限に排除すること。
【0006】
第１の態様において、本発明は、培地を特許請求する。
【0007】
本発明が特許請求している培地は、培地Ａ又は培地Ｂである。
【0008】
前記培地Ａは、抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｙ－２７６３２、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、β－エストラジオール（β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、及びヒト細胞培養用の基礎培地（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）の組成を有する。ただし、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるペニシリンの最終濃度が１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるアンホテリシンBの最終濃度が２５０～２５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度が８～１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、前記ＧｌｕｔａＭａｘの最終濃度が０．８～１．２％（例えば１％であり、％は体積百分率を表す）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０～１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０～５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）の最終濃度が１～１０μｇ／ｍＬであり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１％（体積百分率）であり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度が５～２０μＭであり、前記プロゲステロンの最終濃度が５０～１００ｎＭであり、前記β－エストラジオールの最終濃度が１０～５０ｎＭであり、残部がヒト細胞培養用の基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）である。
【0009】
前記培地Ｂは、抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｙ－２７６３２、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、β－エストラジオール（β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、及びヒト細胞培養用の基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）の組成を有する。ただし、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるペニシリンの最終濃度が１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体におけるアンホテリシンBの最終濃度が２５０～２５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度が８～１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、前記ＧｌｕｔａＭａｘの最終濃度が０．８～１．２％（例えば１％であり、％は体積百分率を表す）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０～１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０～５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度が０．５～２ｍＭであり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１％（体積百分率）であり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度が５～２０μＭであり、前記プロゲステロンの最終濃度が５０～１００ｎＭであり、前記β－エストラジオールの最終濃度が１０～５０ｎＭであり、残部がヒト細胞培養用の基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）である。
【0010】
さらに、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）は、１ミリリットル当たり、ペニシリン（アルカリ）１００００単位、ストレプトマイシン（アルカリ）１００００μｇ、及びアンホテリシンＢ２５μｇの組成を有する。前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，１００Ｘ」（例えばＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２、又はそれと同組成の他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」は、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）抗真菌剤として、０．８５％の塩溶液形態のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン及びアンホテリシンＢを用い、１ミリリットル当たり、ペニシリン（アルカリ）１００００単位、ストレプトマイシン（アルカリ）１００００μｇ、及びアンホテリシンＢ ２５μｇを含む。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは、細胞培地中のＬ－グルタミンを直接置換することができる、先進的な細胞培養の添加剤である。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは、「ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（例えばＧｉｂｃｏ＃３５０５００６１、又はそれと同じ組成の他の製品）である。前記「ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」の成分は、Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅであり、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅの代替品であり、その濃度は２００ｎＭであり、溶媒は０．８５％のＮａＣｌ溶液である。前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、「Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２００１、又はそれと同組成の他の製品）である。前記「Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）」は、最終濃度１ｍＭのヒトトランスフェリン(ホロ)（Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｈｏｌｏ））、５００ｍｇ／Ｌの組換えインスリンの全鎖（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆｕｌｌ Ｃｈａｉｎ）、０．６３ｍｇ／Ｌのプロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、１０ｍＭのプトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、０．５２ｍｇ／Ｌのセレナイト（Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）を含む。前記Ｙ－２７６３２は、「Ｙ－２７６３２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＴＰ競合性のＲＯＣＫ－Ｉ阻害剤及びＲＯＣＫ－ＩＩ阻害剤であり、Ｋｉはそれぞれ２２０ｎＭ及び３００ｎＭである）」（例えば、ＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２、又はそれと同組成の他の製品）である。
【0011】
本発明の特定の実施形態では、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）は、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＨＥＰＥＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５６３００８０であり、前記ＧｌｕｔａＭＡＸは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃３５０５００６１であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦは、商品番号Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－１５－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦは、商品番号Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－１８Ｂ－５０であり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦは、商品番号Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－３９－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰは、商品番号Ｒ＆Ｄ＃３５２－ＭＳ－０５０であり、前記ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅは、商品番号Ｓｅｌｌｅｃｋ＃Ｓ１６９６であり、前記Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅは、商品番号Ｓｉｇｍａ＃Ａ９１６５であり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２００１であり、前記Ｙ－２７６３２は、商品番号ＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２であり、前記プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）は、商品番号Ｓｉｇｍａ＃Ｖ９００６９９であり、前記β－エストラジオール（β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）は、商品番号Ｓｉｇｍａ＃Ｅ２７５８であり、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１２６３４０１０である。
【0012】
さらに、前記の婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地は、２つの形態で存在することができる。
【0013】
前記２つの形態の一つとして、前記培地Ａは、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、前記ヒドロコルチゾン、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記Ｙ－２７６３２、前記プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、前記β－エストラジオール（β－ＥｓｔｒａｄｉｏＬ）、及び前記ヒト細胞培養用基礎培地（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を含む溶液であり；
前記培地Ｂは、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記Ｙ－２７６３２、前記プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、前記β－エストラジオール（β－ＥｓｔｒａｄｉｏＬ）及び前記ヒト細胞培養用基礎培地（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を含む溶液である。
前記培地Ｂは、前記抗菌－抗真菌剤三重抗体（ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンＢ）、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記Ｙ－２７６３２、前記プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、前記β－エストラジオール（β－ＥｓｔｒａｄｉｏＬ）及び前記ヒト細胞培養用基礎培地（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）を含む溶液である。
【0014】
前記培地は、調製後、０．２２μＭのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過滅菌する必要があり、４℃で２週間保存可能である。
【0015】
前記２つの形態の他の一つとして、前記培地中の各成分は、単独で存在し、使用時に配合に従って調製される。
【0016】
さらに、前記培地中のヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰは、ストック液（母液）の形態で保存する（－８０℃で長期保存）ことができるが、具体的には、１０００倍ストック液（母液）であってもよい。Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）及びＹ－２７６３２は、ストック液（母液）の形態で保存する（－２０℃で長期保存）ことができるが、具体的には、１０００倍ストック液（母液）であってもよい。プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）及びβ－エストラジオール（β－ＥｓｔｒａｄｉｏＬ）は、ストック液（母液）の形態で保存する（－２０℃で長期保存）ことができるが、具体的には、１０００００倍ストック液（母液）であってもよい。
【0017】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦストック液は、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0018】
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦストック液は、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0019】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦストック液は、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0020】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＭＳＰストック液は、ヒト組換えタンパク質ＭＳＰ、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0021】
上記の４つの１０００倍ストック液において、前記ＢＳＡは、１００倍ストック液（母液）の形態で存在する（使用する直前に調製する）ことができるが、具体的には、ＢＳＡ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ１９３３）の最終濃度は０．１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0022】
また、１０００×Ｎ－アセチル－Ｌ－システインストック液は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及び超純水の組成を有し、ただし、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの濃度は０．５Ｍであり、残部は超純水である。
【0023】
１０００×Ｙ－２７６３２は、Ｙ－２７６３２及び超純水の組成を有し、ただし、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０ｍＭであり、残部は超純水である。
【0024】
１０００００×Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅストック液は、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ及び無水エタノールの組成を有し、ただし、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの最終濃度は１ｍＭであり、残部は無水エタノールである。
【0025】
１０００００×β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌストック液は、β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ及び無水エタノールの組成を有し、ただし、β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１ｍＭであり、残部は無水エタノールである。
【0026】
１０００×ヒドロコルチゾンは、ヒドロコルチゾン及び超純水の組成を有し、ただし、前記ヒドロコルチゾンの最終濃度は０．５Ｍであり、残部は超純水である。
【0027】
前記培地は、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地である。
【0028】
上記培地において、前記「最終濃度」は、前記培地における最終濃度である。
【0029】
第２の態様において、本発明は、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための支援試薬を特許請求する。
【0030】
本発明に係る婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための支援試薬は、前記培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、細胞単離緩衝液、細胞消化液、サンプル洗浄液、消化停止液、細胞凍結保存液及び１％ ＣＹＴＯＰ溶液のうち、少なくとも１種の試薬とを含む。
【0031】
前記サンプル解離液は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩＩ、コラゲナーゼＩＶ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記コラゲナーゼＩの前記サンプル解離液における最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、前記コラゲナーゼＩＩＩの前記サンプル解離液における最終濃度は２５０～３５０Ｕ／ｍＬ（例えば２９０Ｕ／ｍＬ）であり、前記コラゲナーゼＩＶの前記サンプル解離液における最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、残部はＰＢＳである。
【0032】
ここで、コラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕは、プロテアーゼの酵素活性の観点から定義すると、コラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）を３７℃、ｐＨ７．５の条件下で、１Ｕプロテアーゼで５時間処理することにより、Ｌ－ロイシン１μｍｏｌを放出することができる。
【0033】
本発明の特定の実施形態では、前記コラゲナーゼＩは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１７１００～０１７であり、前記コラゲナーゼＩＩＩは、商品番号Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃Ｃ８４９０であり、前記コラゲナーゼＩＶは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１７１０４－０１９であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0034】
前記サンプル保存液は、ウシ胎児血清、二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）、ＨＥＰＥＳ及びＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’s平衡塩溶液）の組成を有し、ただし、前記ウシ胎児血清の最終濃度は１～５％（例えば２％であり、％は体積百分率を表す）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、残部はＨＢＳＳである。
【0035】
本発明の特定の実施形態では、前記二重抗体Ｐ／Ｓは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0036】
前記細胞単離緩衝液は、二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）、ヘパリンナトリウム、及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）におけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）におけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度は１０ＩＵ／ｍＬであり、残部はＰＢＳである。
【0037】
本発明の特定の実施形態では、前記二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）は、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２であり、前記ヘパリンナトリウムは、商品番号Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃Ｈ８２７０であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0038】
前記細胞消化液は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（アキュターゼ）、ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ及びＰＢＳの組成を有し、ただし、Ａｃｃｕｔａｓｅは前記細胞消化液１０ｍＬ当たりにおいて４～６ｍＬ（例えば、５ｍＬ）であり、ＥＤＴＡの最終濃度は５ｍＭ（即ち、１０μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ）であり、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは１．５～２．５ｍＬ（例えば、２ｍＬ）であり、残部はＰＢＳである。
【0039】
さらに、前記Ａｃｃｕｔａｓｅは、「ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１、又はそれと同じ組成の他の製品）である。前記Ａｃｃｕｔａｓｅは、単一成分型酵素で、Ｄ－ＰＢＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液に可溶である。前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは、「ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ），ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１２６０４０１３、又はそれと同じ組成の他の製品）である。前記「ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ），ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ」は、２００ｍｇ／ＬのＫＣｌ、２００ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８０００ｍｇ／ＬのＮａＣｌ、２１６０ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４５７．６ｍｇ／ＬのＥＤＴＡを含み、組換えプロテアーゼをさらに含む。
【0040】
本発明の特定の実施形態では、前記Ａｃｃｕｔａｓｅは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１であり、前記０．５ＭのＥＤＴＡは、商品番号Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＡＭ９２６１であり、前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１２６０４０１３であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0041】
前記サンプル洗浄液は、二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）及びＰＢＳの組成を有し、ただし、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、残部はＰＢＳである。
【0042】
本発明の特定の実施形態では、前記二重抗体Ｐ／Ｓは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0043】
前記消化停止液は、ウシ胎児血清、二重抗体Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン）、及びＤＭＥＭ培地の組成を有し、ただし、前記ウシ胎児血清の最終濃度は８～１２％（例えば１０％であり、％は体積百分率を表す）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記二重抗体Ｐ／Ｓにおけるストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、残部はＤＭＥＭ培地である。
【0044】
本発明の特定の実施形態では、前記ビス抗Ｐ／Ｓは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０１２２であり、前記ＰＢＳは、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0045】
前記細胞凍結保存液は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＳＯ、及び１％メチルセルロース溶液の組成を有し、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、前記ＤＭＳＯ、及び前記１％メチルセルロース溶液は、それらの体積比が２０：２：（０．８～１．２）であり、前記１％メチルセルロース溶液は、濃度が１ｇ／１００ｍｌであるメチルセルロース水溶液である。
【0046】
本発明の特定の実施形態では、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、商品番号Ｇｉｂｃｏ＃１２６３４０１０であり、前記ＤＭＳＯは、商品番号Ｓｉｇｍａ＃Ｄ２４３８であり、前記メチルセルロースは、商品番号Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７０２７である。
【0047】
前記１％ ＣＹＴＯＰ溶液は、ＣＹＴＯＰ及びフッ素オイルの組成を有し、前記１％ ＣＹＴＯＰ溶液１００ｍＬに対してＣＹＴＯＰを１ｍＬ含み、残部はフッ素オイルである。
【0048】
ここで、前記ＣＹＴＯＰは、ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ（１－ｂｕｔｅｎｙｌｖｉｎｙｌｅｔｈｅｒ）ｐｏｌｙｍｅｒである。前記フッ素オイルは、商品番号３Ｍ＃ＦＣ４０のフッ素オイル、又はそれと同じ組成の他の製品であってもよい。
【0049】
本発明の特定の実施形態では、前記ＣＹＴＯＰは、具体的には、商品番号Ａｓａｓｈｉ ｇｌａｓｓ＃ＣＴＬ－８０９Ｍであり、前記フッ素オイルは、具体的には、商品番号３Ｍ＃ＦＣ４０である。
【0050】
前記サンプル保存液は、サンプルの体から離れた後の一時的保存に用いることができ、サンプルの体から離れた場合、サンプル中の細胞の活性を短時間で維持することができる。前記サンプル保存液は、調製後４℃で１ヶ月間保存可能である。
【0051】
前記サンプル洗浄液は、サンプルの洗浄及び消毒に用いられる。前記サンプル洗浄液は、使用する直前に調製することが必要である。
【0052】
前記サンプル解離液は、サンプルの解離に用いることができ、サンプル中の婦人科腫瘍の初代細胞を組織から解離させることができる。前記サンプル解離液は、使用する直前に調製することは必要である。ここで、その中のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩＩ及びコラゲナーゼＩＶは、ストック液（母液）の形態で、－２０℃で長期保存することができるが、具体的には１０倍ストック液（母液）であってもよい。１０×コラゲナーゼＩストック液は、前記コラゲナーゼＩ及びＰＢＳの組成を有し、前記コラゲナーゼＩの最終濃度が２０００Ｕ／ｍＬであり；１０×コラゲナーゼＩＩＩストック液は、前記コラゲナーゼＩＩＩ及びＰＢＳの組成を有し、前記コラゲナーゼＩＩＩの最終濃度が２０００Ｕ／ｍＬであり；１０×コラゲナーゼＩＶストック液は、前記コラゲナーゼＩＶ及びＰＢＳの組成を有し、前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度が２０００Ｕ／ｍＬであり；残部はＰＢＳである。前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩＩ及び前記コラゲナーゼＩＶの酵素活性についての定義は、先に定義した通りである。
【0053】
前記細胞単離緩衝液は、婦人科腫瘍の胸腹水サンプル中の細胞を懸濁させるための緩衝液である。前記細胞単離緩衝液は、調製後４℃で１ヶ月間保存可能である。
【0054】
前記細胞消化液は、細胞塊の消化及び継代に用いることができ、婦人科腫瘍の塊を単一細胞に消化することができる。前記細胞消化液は、使用する直前に調製することが必要である。
【0055】
前記消化停止液は、サンプルを解離する過程又は細胞を消化する過程を終了させることに用いることができ、前記消化停止液は、調製後、４℃で１ヶ月間保存可能である。
【0056】
前記婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地は、婦人科腫瘍の初代細胞の培養に用いることができる。前記婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地は、調製後、０．２２μＭのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過滅菌されて、４℃で２週間保存可能である。
【0057】
前記細胞凍結保存液は、使用する直前に調製することが必要である。ここで、前記１％メチルセルロース溶液は、４℃での長期保存が可能である。
【0058】
本発明において、前記「最終濃度」とは、すべで相応な成分の相応な溶液における最終濃度を意味している。
【0059】
第３の態様において、本発明は、前記培地又は支援試薬の、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための使用を特許請求している。
【0060】
第４の態様において、本発明は、婦人科腫瘍の初代細胞を培養する方法を特許請求している。
【0061】
本発明が特許請求している婦人科腫瘍の初代細胞を培養する方法は、前記培地を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を懸濁培養する工程を含む。
【0062】
ここで、前記婦人科腫瘍の初代細胞は、婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞又は婦人科腫瘍における胸腹水サンプルの初代腫瘍細胞であってもよい。
【0063】
前記婦人科腫瘍の初代細胞が婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞である場合、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞は、前記サンプル解離液を用いて婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を解離させることにより得ることができる。
【0064】
さらに、１ｍｇ組織に対して０．１～０．３ｍＬ（例えば０．１ｍＬ）の前記サンプル解離液である量で、前記切断された前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織（例えば、０．８～１．２ｍｍ３の小片に切断）を、事前に３７℃に予熱した前記サンプル解離液により処理して、３７℃、１５分間～３時間の解離時間の条件で、サンプル解離を行う工程を含む方法により、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を前記サンプル解離液で解離することができる。単一細胞が大量に観察されるまで、サンプルの解離状態を１５分ごとに顕微鏡下で観察した。
【0065】
前記婦人科腫瘍の初代細胞が婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞である場合、前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞が前記細胞単離緩衝液を用いて婦人科腫瘍における胸腔液サンプルから単離することができる。
【0066】
さらに、前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプル中の細胞を前記細胞単離緩衝液で懸濁させた後、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌリンパ球分離液を用いる）により前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞を得る工程を含む方法により、前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルを前記単離緩衝液で単離することができる。
【0067】
前記婦人科腫瘍の胸腔液サンプルを前記単離緩衝液で単離する前に、さらに、前記婦人科腫瘍の胸腔液サンプル中の不純物、血餅等の細胞に対する密度勾配分離を妨害する成分を除去するように、前記婦人科腫瘍の胸腔液サンプルの分離前処理工程をさらに含んでもよい。
【0068】
前記方法において、細胞が直径８０～１２０μｍ（例えば、１００μｍ）の塊を形成するまでに、細胞培養容器Ｍを用いて、前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で懸濁培養し、２～４日毎に（例えば、３日毎に）培地を一回交換する工程を含む方法により、前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で懸濁培養することができる。
【0069】
ここで、初期接種密度は、１０５個／ｃｍ２の容器底面積であってもよく、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度で敷いた。
【0070】
ここで、前記細胞培養容器Ｍは、（Ｉ）ポリスチレン材質の細胞培養容器、ポリカーボネート材質の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート材質の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂材質の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー材質の細胞培養容器又は低付着性表面の細胞培養容器、及び（ＩＩ）（Ｉ）における細胞培養容器をＣＹＴＯＰで修飾した細胞培養容器のいずれか一つであってもよい。
【0071】
さらに、前記細胞培養容器は、細胞培養皿、細胞培養ウェルプレート、又は細胞培養用マイクロウェルプレートチップ（例えば、実施例１５における図５に示すマイクロプレートチップ）などである。
【0072】
前記（ＩＩ）において、前記（Ｉ）における細胞培養容器を、エッチング出力２０Ｗ、エッチング時間３分間のエッチング条件で純酸素エッチングした後、前記細胞培養容器の表面を前記１％ ＣＹＴＯＰ溶液で覆い、前記１％ ＣＹＴＯＰ溶液を乾燥することにより、ＣＹＴＯＰ修飾を完了する工程を含む方法により、前記（Ｉ）における細胞培養容器をＣＹＴＯＰ修飾することができる。
【0073】
さらに、前記方法において、婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルの表面を、体積百分率で７０～７５％（例えば７５％）のエタノールで１０～３０秒間洗浄し、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルを、前記サンプル洗浄液で１０～２０回（例えば１０回）洗浄し、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルを、無菌ＰＢＳ溶液で５～１０回（例えば５回）洗浄した後、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルから不純物、結合組織、脂肪組織、壊死組織などの、初代細胞の培養に影響を与えた成分を除去するように、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離前処理を行う工程をさらに含んでもよい。
【0074】
前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離前処理を行う工程は、氷上で操作することが必要であり、また、全部の操作は１０分間以内に完了する必要がある。
【0075】
さらに、前記解離前処理を行う前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルの、体から離れた時間が２時間以内であることが必要であり、前記解離前処理を行う直前まで前記サンプル保存液に保存する必要がある。
【0076】
さらに、前記方法において、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離処理を前記サンプル解離液で行った後、解離反応を、８～１５倍（例えば、１０倍）の体積の前述消化停止液で停止させ、細胞懸濁液を収集し、１００μｍ又は４０μｍの無菌の細胞ろ過網を用いて前記細胞懸濁液を濾過して組織残片及び接着細胞を除去し、８００～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）で、室温で１０～１５分間（例えば、１０分間）遠心分離し、上清を廃棄した後、３～５ｍＬ（例えば、５ｍＬ）の無菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、さらに８００～１０００ｇ（例えば８００ｇ）で、室温で１０～１５分間（例えば、１０分間）遠心分離し、上清を廃棄した後、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞の培地で細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡下で細胞状態を観察し、細胞計数を行う工程をさらに含んでもよい。
【0077】
さらに、前記方法において、前記婦人科腫瘍の初代細胞が直径８０～１２０μｍ（例えば１００μｍ）の塊を形成するときに、前記婦人科腫瘍の初代細胞を継代する工程をさらに含んでもよい。
【0078】
さらに、前記継代を行う際に用いられる消化温度は、３７℃であった。
【0079】
更に、前記継代を行う際に用いられる消化停止液は、すなわち、前記消化停止液である。
【0080】
より具体的には、前記継代を行う工程は、以下のとおりである。継代しようとする細胞塊を収集し、遠心分離して細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、それをさらに遠心分離した後、細胞塊を前記細胞消化液で再懸濁し、細胞塊がすべて単一細胞に消化されるまでに３７℃で消化し、前記消化停止液（その用量が５～１０倍であってもよく、例えば１０倍の用量である）で消化反応を停止し、細胞懸濁液を収集し、それを遠心分離した後、婦人科腫瘍の初代細胞の培地で細胞ペレットを再懸濁し、カウントした後、低付着性表面を有する培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞を懸濁培養する（初期接種密度は、１０５個／ｃｍ２の容器底面積であり、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度でよい）。上記の継代工程における全ての遠心分離は、具体的には、８００ｇ～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）で、室温で１０～２０分間（例えば、１０分間）遠心分離することであってもよい。
【0081】
さらに、前記方法は、２～３回継代して増幅させた前記婦人科腫瘍の初代細胞を凍結保存及び／又は蘇生する工程をさらに含んでもよい。
【0082】
ここで、前記凍結保存する際に用いる細胞凍結保存液は、本明細書に記載の細胞凍結保存液である。
【0083】
さらに、前記凍結保存を行う工程は、以下のとおりである。凍結保存しようとする細胞塊を収集し、それを遠心分離した後、細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、さらに遠心分離した後、細胞塊を前記細胞消化液で再懸濁し、細胞塊が全て単一細胞に消化されるまでに３７℃で消化し、前記消化停止液（その用量が５～１０倍であってもよく、例えば１０倍の用量である）で消化反応を停止し、細胞懸濁液を収集し、それを遠心分離した後、細胞ペレットを０．５～２×１０６／ｍＬ（例えば１０６／ｍＬ）という密度で、前記細胞凍結保存液で再懸濁させ、勾配降温カセットで一晩凍結保存した後、液体窒素へ転移して長期保管する。上記の凍結保存工程における全ての遠心分離は、具体的には、８００ｇ～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）で、室温で１０～２０分間（例えば、１０分間）遠心分離することであってもよい。
【0084】
さらに、前記蘇生を行う工程は、以下のとおりである。蘇生しようとする細胞を入れた凍結保存チューブを液体窒素から取り出し、３７～３９℃（例えば、３７℃）の無菌水中で細胞を急速に溶け、遠心分離した（例えば、８００～１０００ｇ（例えば８００ｇ）、室温で５～１０分間（例えば１０分間）遠心分離した）後、細胞ペレットを前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で、再懸濁し、その後、低付着性表面を有する培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞を懸濁培養する（初期接種密度は、１０５個／ｃｍ２の容器底面積でよく、１チューブ当たりの細胞（１０６個）を３．５ｃｍの培養皿へ蘇生する）。
【0085】
上記のそれぞれの態様において、前記婦人科腫瘍の初代細胞は、婦人科腫瘍の患者の手術サンプル、又は穿刺生検サンプル若しくは胸腔液サンプル（胸水若しくは腹水）から単離される。ここで、好ましくは、手術サンプルから得られる婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織標本は、重量が２０ｍｇを超え、穿刺生検サンプル（固形腫瘍サンプルに属する）は４本を超え、胸腔液サンプルが１００ｍＬを超える。
【0086】
本発明において、前記ＰＢＳは、全て１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３～７．５であってもよい。その具体的な組成は、以下のとおりである：溶剤は水であり、溶質及びその濃度は、ＫＨ２ＰＯ４１４４ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ９０００ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ ７９５ｍｇ／Ｌである。
【図面の簡単な説明】
【0087】
【図1】乳がんの組織を処理した後に得られた単細胞である。スケールは、１００μｍであり、１００倍に拡大した。Ａ及びＢは、それぞれ二つの並行処理である。
【図2】乳がんの組織を初代培養した後に得られた細胞塊である。スケールは、１００μｍであり、１００倍に拡大した。Ａは培地Ａで培養して得られたものであり、Ｂは培地Ｂで培養して得られたものである。
【図3】乳がんの組織を初代培養した後に得られた婦人科腫瘍細胞のＨＥ染色図である。スケールは、１００μｍであり、２００倍に拡大した。Ａは培地Ａで培養して得られたものであり、Ｂは培地Ｂで培養して得られたものである。
【図4】乳がんの組織を初代培養した後に得られた腫瘍細胞塊の、パラフィン切片を用いた免疫組織化学染色図である。スケールは、１００μｍであり、２００倍に拡大した。Ａは培地Ａで培養して得られたものであり、Ｂは培地Ｂで培養して得られたものである。
【図5】本発明に係るマイクロプレートチップの設計図である。
【発明を実施するための形態】
【0088】
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特に指定がない限り、いずれも常法である。以下の実施例に使用された試験材料は、特に指定がない、いずれも従来の生化学試薬販売元から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、３回の繰り返し実験を設定し、その結果を平均化したものである。
【0089】
実施例１．婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための試薬の調製
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表１に示す。
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表１に示す。
【0090】
【0091】
サンプル保存液を調製した後、５ｍＬずつ１５ｍＬの遠心分離管に分注され、分注した後、４℃で１ヶ月間保存した。
【0092】
２．サンプル洗浄液（１００ｍＬ）
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表２に示す。
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表２に示す。
【0093】
【0094】
サンプル洗浄液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0095】
３．サンプル解離液（１０ｍＬ）
サンプル解離液（１０ｍＬ）の具体的な配合を表３に示す。
サンプル解離液（１０ｍＬ）の具体的な配合を表３に示す。
【0096】
【0097】
表３において、コラゲナーゼストック液の調製は表４～表６に示す。
【0098】
【0099】
１０×コラゲナーゼＩストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて１ｍＬずつ分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0100】
【0101】
１０×コラゲナーゼＩＩＩストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて１ｍＬずつ分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0102】
【0103】
１０×コラゲナーゼＩＶストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて１ｍＬずつで分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0104】
表４～６において、コラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕをプロテアーゼの酵素活性で定義すると：コラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）を３７℃、ｐＨ７．５という条件下で、１Ｕプロテアーゼで５時間処理することにより、Ｌ－ロイシン１μｍｏｌを放出することができる。
【0105】
４．細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な配合を表７に示す。
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な配合を表７に示す。
【0106】
【0107】
細胞消化液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0108】
５．消化停止液（１００ｍＬ）
消化停止液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表８に示す。
消化停止液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表８に示す。
【0109】
【0110】
消化停止液を調製した後、４℃で１ヶ月間保存することが可能である。
【0111】
６．婦人科腫瘍の初代細胞の培地（１００ｍＬ）
婦人科腫瘍の初代細胞の培地（１００ｍＬ）には２種類があり、それぞれ、培地Ａ及び培地Ｂと表記した。前記培地Ａの具体的な配合を表９に示す。前記培地Ｂの具体的な配合を表１０に示す。
婦人科腫瘍の初代細胞の培地（１００ｍＬ）には２種類があり、それぞれ、培地Ａ及び培地Ｂと表記した。前記培地Ａの具体的な配合を表９に示す。前記培地Ｂの具体的な配合を表１０に示す。
【0112】
【0113】
【0114】
婦人科腫瘍の初代細胞の培地を調製した後、０．２２μＭのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過滅菌されて４℃で２週間保存可能である。
【0115】
表９及び表１０において、ヒト組換えタンパク質ストック液の調製を表１２～表１５に示し、ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅストック液の調製を表１６に示し、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅストック液の調製を表１７に示し、Ｙ－２７６３２ストック液の調製を表１８に示し、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅストック液の調製を表１９に示し、β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌストック液の調製を表２０に示す。これらのストック液を調製する時に必須な１００×ＢＳＡ溶液の調製を表１１に示す。
【0116】
【0117】
１００×ＢＳＡ溶液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0118】
【0119】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－８０℃での長期保存が可能である。
【0120】
【0121】
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－８０℃での長期保存が可能である。
【0122】
【0123】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－８０℃での長期保存が可能である。
【0124】
【0125】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＭＳＰストック液を調製した後、１．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－８０℃での長期保存が可能である。
【0126】
【0127】
１０００×Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅストック液を調製した後、０．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0128】
【0129】
１０００×Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅストック液を調製した後、０．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0130】
【0131】
１０００×Ｙ－２７６３２ストック液を調製した後、０．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0132】
【0133】
１０００ ００×Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅストック液を調製した後、０．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0134】
【0135】
１００００×β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌストック液を調製した後、０．５ｍＬの無菌遠心分離管を用いて分注した。当該ストック液は、－２０℃での長期保存が可能である。
【0136】
７．細胞凍結保存液
細胞凍結保存液の具体的な配合は表２１に示すとおりである。
細胞凍結保存液の具体的な配合は表２１に示すとおりである。
【0137】
【0138】
細胞凍結保存液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0139】
表２１において、１％メチルセルロース溶液の調製を表２２に示す。
【0140】
【0141】
１％メチルセルロース溶液は、調製後、４℃での長期保存が可能である。
【0142】
８．１％ ＣＹＴＯＰ溶液
【0143】
１％ ＣＹＴＯＰ溶液は、調製後、常温での長期保存が可能である。
【0144】
９．細胞単離緩衝液（１００ｍＬ）
細胞単離緩衝液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表２４に示す。
細胞単離緩衝液（１００ｍＬ）の具体的な配合を表２４に示す。
【0145】
【0146】
細胞単離緩衝液は、調製後、４℃で１ヶ月間保存が可能である。
【0147】
表２４において、ヘパリンナトリウム溶液の調製を表２５に示す。
【0148】
【0149】
１０００×ヘパリンナトリウム溶液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0150】
実施例２．婦人科腫瘍の手術後の標本／生検穿刺の標本／胸腔液サンプルの取得
１、三級・一流の病院との連携、連携は、正規の医学倫理審査を経て実施した。
２、主治医は、医学ガイドラインに規定された臨床徴候に従って患者群を選択し、手術中の臨床徴候に従って体外培養のために適切なサンプルを選択する。サンプルの選択基準は以下のとおりである：原発乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、又はそれらの転移病巣であり；また、手術標本の重量が２０ｍｇを超えたサンプル、胸腔液サンプルが１００ｍＬを超えたサンプル、又は穿刺生検の標本が４本を超えたサンプルである。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供する。患者の氏名、身分証明書の番号等の患者のプライバシーに関する情報を秘匿し、統一された実験番号に置き換える。また、実験番号の命名規則は、採集されたサンプルの８桁の数字である日付＋患者の院内番号の下４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルの場合、患者の院内番号がＴ００１５１２７６５であれば、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５である。
４、手術中に、外科医は、手術室の無菌環境で、新鮮な術後の標本／生検穿刺の標本を採集し、予め準備したサンプル保存液（実施例１参照）に入れた。サンプルは、体から離れた後、氷で一時的に保管され、２時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。胸腔液サンプルを、４８時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。
１、三級・一流の病院との連携、連携は、正規の医学倫理審査を経て実施した。
２、主治医は、医学ガイドラインに規定された臨床徴候に従って患者群を選択し、手術中の臨床徴候に従って体外培養のために適切なサンプルを選択する。サンプルの選択基準は以下のとおりである：原発乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、又はそれらの転移病巣であり；また、手術標本の重量が２０ｍｇを超えたサンプル、胸腔液サンプルが１００ｍＬを超えたサンプル、又は穿刺生検の標本が４本を超えたサンプルである。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供する。患者の氏名、身分証明書の番号等の患者のプライバシーに関する情報を秘匿し、統一された実験番号に置き換える。また、実験番号の命名規則は、採集されたサンプルの８桁の数字である日付＋患者の院内番号の下４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルの場合、患者の院内番号がＴ００１５１２７６５であれば、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５である。
４、手術中に、外科医は、手術室の無菌環境で、新鮮な術後の標本／生検穿刺の標本を採集し、予め準備したサンプル保存液（実施例１参照）に入れた。サンプルは、体から離れた後、氷で一時的に保管され、２時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。胸腔液サンプルを、４８時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。
【0151】
実施例３．婦人科腫瘍の固形腫瘍の組織サンプルに対する解離前処理
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は１０分間以内に完了する必要がある。
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は１０分間以内に完了する必要がある。
【0152】
下記の操作に使用する手術器具は、いずれも高温高圧で滅菌され、乾燥しておく必要がある。
１．サンプルを秤量した。
２．サンプルの表面を７５％（体積百分率）のエタノールで１０～３０秒間洗浄した。
３．サンプルをサンプル洗浄液で５回、無菌ＰＢＳ溶液で５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、サンプル中の脂肪組織、結合組織、壊死組織を慎重に剥離した。
１．サンプルを秤量した。
２．サンプルの表面を７５％（体積百分率）のエタノールで１０～３０秒間洗浄した。
３．サンプルをサンプル洗浄液で５回、無菌ＰＢＳ溶液で５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、サンプル中の脂肪組織、結合組織、壊死組織を慎重に剥離した。
【0153】
実施例４．婦人科腫瘍の固形腫瘍の組織サンプルに対する解離
下記の実施例に使用する手術器具は、いずれも高温高圧で滅菌され、乾燥しておく必要がある。
下記の実施例に使用する手術器具は、いずれも高温高圧で滅菌され、乾燥しておく必要がある。
【0154】
１．組織を眼科用ハサミで１ｍｍ３程度の小さな塊に切断した。
２．１ｍｇ組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液の量で、切断した組織サンプルを、事前に３７℃に予熱したサンプル解離液により処理して、３７℃、１５分間～３時間の解離時間の条件で、サンプル解離を行った。単一細胞が大量に観察されたまでに、サンプルの解離状態を１５分間ごとに顕微鏡下で観察した。
３．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止させ、細胞懸濁液を収集した。
４．細胞懸濁液を１００μｍの無菌の細胞ろ過網で濾過し、組織残片及び接着細胞を除去した。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞を５ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
７．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁し、顕微鏡下で細胞状態を観察し、細胞数をカウントした。
２．１ｍｇ組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液の量で、切断した組織サンプルを、事前に３７℃に予熱したサンプル解離液により処理して、３７℃、１５分間～３時間の解離時間の条件で、サンプル解離を行った。単一細胞が大量に観察されたまでに、サンプルの解離状態を１５分間ごとに顕微鏡下で観察した。
３．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止させ、細胞懸濁液を収集した。
４．細胞懸濁液を１００μｍの無菌の細胞ろ過網で濾過し、組織残片及び接着細胞を除去した。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞を５ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
７．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁し、顕微鏡下で細胞状態を観察し、細胞数をカウントした。
【0155】
図１に示すように、解離して得られた単細胞懸濁液には、腫瘍細胞の以外にも、赤血球、リンパ球、繊維細胞などの各種細胞が大量に混在していた。本方法の利点の１つは、その後の培養過程において、がん細胞のみが大量に増殖できるが、他の細胞の割合は徐々に少なくし、あるいは消失し、最終的に純度の高い婦人科腫瘍の初代腫瘍細胞が得られることにある。
【0156】
実施例５．婦人科腫瘍の胸腔液サンプルに対する前処理
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は１０分間以内に完了する必要がある。
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は１０分間以内に完了する必要がある。
【0157】
１．婦人科腫瘍の胸腔液サンプルを氷上で３０分間ほど静置し、サンプル中の血餅及び大きな不溶性固体をサンプル管の底部に沈降させた；
２．上清を５０ｍＬの無菌遠心分離管に慎重に移し、１倍の体積の予冷されたＰＢＳを加えて均一に混合した；
３．２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した；
４．細胞単離緩衝液（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させ、２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した；
５．細胞単離緩衝液（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞の濃度を１０７／ｍＬに調整した。
２．上清を５０ｍＬの無菌遠心分離管に慎重に移し、１倍の体積の予冷されたＰＢＳを加えて均一に混合した；
３．２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した；
４．細胞単離緩衝液（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させ、２０００ｇで、４℃で５分間遠心分離し、上清を廃棄した；
５．細胞単離緩衝液（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞の濃度を１０７／ｍＬに調整した。
【0158】
実施例６．婦人科腫瘍の胸腔液サンプルに対する密度勾配遠心分離
１．５０ｍＬの無菌遠心分離管を用いて、細胞懸濁液と同じ体積のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を採取した。
２．細胞懸濁液を、細胞分離液の上層に、両者の間に明確な界面が形成されるように慎重に加えた。
３．２０００ｇで、水平方向に常温の遠心分離を２０分間行った。
４．中間層の白色膜を新しいチューブに吸引して取った。
５．細胞ペレットを２０ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁させ、１５００ｇで、常温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、細胞状態を顕微鏡で観察し、細胞数をカウントした。
１．５０ｍＬの無菌遠心分離管を用いて、細胞懸濁液と同じ体積のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を採取した。
２．細胞懸濁液を、細胞分離液の上層に、両者の間に明確な界面が形成されるように慎重に加えた。
３．２０００ｇで、水平方向に常温の遠心分離を２０分間行った。
４．中間層の白色膜を新しいチューブに吸引して取った。
５．細胞ペレットを２０ｍＬの無菌ＰＢＳで再懸濁させ、１５００ｇで、常温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、細胞状態を顕微鏡で観察し、細胞数をカウントした。
【0159】
この結果から分かるように、解離して得られた単細胞懸濁液には、腫瘍細胞の以外にも赤血球、リンパ球、繊維細胞などの各種細胞が大量に混在している。本方法の利点の１つは、後続の培養過程において、がん細胞のみが大量に増殖できるが、他の細胞の割合は徐々に少なくし、あるいは消失し、最終的に純度の高い婦人科腫瘍の初代細胞が得られることにある。
【0160】
実施例７．婦人科腫瘍の初代細胞に対する培養
１．低付着性表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の懸濁培養を行った。用いられた培地は、実施例１における婦人科腫瘍の初代細胞の培地Ａ又はＢである。また、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度で敷いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
１．低付着性表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の懸濁培養を行った。用いられた培地は、実施例１における婦人科腫瘍の初代細胞の培地Ａ又はＢである。また、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度で敷いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
【0161】
前記培地が培地Ａである場合、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅの最終濃度は１０μｇ／ｍＬであり；Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭであり；Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの最終濃度は１００ｎＭであり；β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１０ｎＭであった。
【0162】
前記培地が培地Ｂである場合、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの最終濃度は１ｍＭであり；Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭであり；Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの最終濃度は１００ｎＭであり；β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１０ｎＭである。
【0163】
２．毎日、細胞の状態を観察し、細胞が直径１００μｍ程度の塊を形成するまで、３日毎に培地を交換した。
【0164】
図２に示すように、腫瘍細胞は３～１０日間の培養により直径１００μｍの細胞塊に大量に増殖し、腫瘍細胞の総数は１０７個を超えることができ、他の種類の細胞の数量は、顕著に低減し、あるいは消失した。本方法は、大量のサンプルに対する試験を経てから、婦人科腫瘍の初代腫瘍細胞の体外培養の成功率を７０％にすることができた。
【0165】
実施例８．婦人科腫瘍の初代細胞の継代
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２．細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
３．細胞塊を細胞消化液（実施例１参照）で再懸濁させ、３７℃で消化した。細胞塊の消化状況を５分間毎に顕微鏡で観察し、細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで観察した。
４．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止し、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、細胞数をカウントした。
７．低付着性表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行った。用いられた培地は、実施例１における婦人科腫瘍の初代細胞の培地である。また、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度で敷いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２．細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
３．細胞塊を細胞消化液（実施例１参照）で再懸濁させ、３７℃で消化した。細胞塊の消化状況を５分間毎に顕微鏡で観察し、細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで観察した。
４．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止し、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、細胞数をカウントした。
７．低付着性表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行った。用いられた培地は、実施例１における婦人科腫瘍の初代細胞の培地である。また、６ウェルプレートを例として、１ウェル当たり１０６個の細胞という密度で敷いて、３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
【0166】
実施例９．婦人科腫瘍の初代細胞に対する凍結保存
懸濁培養された婦人科腫瘍の初代細胞を、２～３回継代して増殖させた後、凍結保存することができる。
懸濁培養された婦人科腫瘍の初代細胞を、２～３回継代して増殖させた後、凍結保存することができる。
【0167】
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
２．細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
３．細胞塊を細胞消化液（実施例１参照）で再懸濁させ、３７℃で消化した。細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで、細胞塊の消化状況を１５分間毎に顕微鏡で観察した。
４．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止し、細胞懸濁液を収集して細胞数をカウントした。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを細胞凍結保存液（実施例１参照）で１０６／ｍＬの密度で再懸濁させ、２ｍＬの凍結保存チューブの１管当たり、１ｍＬの細胞懸濁液を入れ、また、それを勾配降温カセットで一晩凍結保存した後、液体窒素へ転移して長期保存する。
２．細胞塊を無菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
３．細胞塊を細胞消化液（実施例１参照）で再懸濁させ、３７℃で消化した。細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで、細胞塊の消化状況を１５分間毎に顕微鏡で観察した。
４．解離反応を１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で停止し、細胞懸濁液を収集して細胞数をカウントした。
５．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
６．細胞ペレットを細胞凍結保存液（実施例１参照）で１０６／ｍＬの密度で再懸濁させ、２ｍＬの凍結保存チューブの１管当たり、１ｍＬの細胞懸濁液を入れ、また、それを勾配降温カセットで一晩凍結保存した後、液体窒素へ転移して長期保存する。
【0168】
実施例１０．婦人科腫瘍の初代細胞の蘇生
液体窒素中に保存された婦人科腫瘍の初代細胞に対して蘇生を行うことができる。
液体窒素中に保存された婦人科腫瘍の初代細胞に対して蘇生を行うことができる。
【0169】
１．５分間早く、３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存チューブを液体窒素から取り出し、細胞を３７℃の無菌水において急速に溶けた。
３．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
４．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、低付着性表面を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行い、１チューブ当たりの細胞を３．５ｃｍの培養皿へ蘇生し、細胞培養箱により３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で培養した。
２．凍結保存チューブを液体窒素から取り出し、細胞を３７℃の無菌水において急速に溶けた。
３．８００ｇで、室温で１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。
４．細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地（実施例１参照）で再懸濁させ、低付着性表面を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行い、１チューブ当たりの細胞を３．５ｃｍの培養皿へ蘇生し、細胞培養箱により３７℃、５％ＣＯ２という培養条件で培養した。
【0170】
実施例１１．婦人科腫瘍の初代細胞に対するＨＥ染色同定
下記の実施例で使用された試薬・消耗品に対する説明は、以下のとおりである。
下記の実施例で使用された試薬・消耗品に対する説明は、以下のとおりである。
【0171】
ＨＥ染色キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｇ１１２０）；
カチオン脱離防止スライドガラス（ＺＳＧＢ－ＢＩＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬社、分析純度）；
中性の樹脂ガム（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
カチオン脱離防止スライドガラス（ＺＳＧＢ－ＢＩＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬社、分析純度）；
中性の樹脂ガム（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
【0172】
１．懸濁細胞を１０４／ｍＬの濃度の細胞懸濁液とし、カチオン脱離防止スライドガラスに１０μＬ滴下し、自然乾燥させた。
２．風乾された細胞に、４℃で予冷されたメタノール／アセトン混合液（体積比１：１） ５０μＬを慎重に滴下し、その後、スライドガラスを４℃の冷蔵庫に入れ、１０分間固定した。
３．細胞が固定されたスライドガラスを取り出し、室温で自然乾燥させた。
４．スライドガラスを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
５．スライドガラス上の水分が微乾燥したところ、１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸引して除去し、スライドガラスを水道水２００μＬで３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴下して１分間分化した。
８．分化液を吸引して除去し、スライドガラスを、水道水で２回、蒸留水で１回、順番に洗浄した。
９．スライドガラス表面の水分を吸引して除去し、２００μＬのエオシン染色液を滴下して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸引して除去し、順に、７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールで、２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間のリンスで脱水した。
１１．エタノールが乾燥した後、キシレン５０μＬを滴下して細胞の透過を行った。
１２．キシレンが完全に乾燥した後、中性の樹脂ガムを１滴滴下し、カバーガラスでシールし、顕微鏡で観察し、写真を撮った。
２．風乾された細胞に、４℃で予冷されたメタノール／アセトン混合液（体積比１：１） ５０μＬを慎重に滴下し、その後、スライドガラスを４℃の冷蔵庫に入れ、１０分間固定した。
３．細胞が固定されたスライドガラスを取り出し、室温で自然乾燥させた。
４．スライドガラスを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
５．スライドガラス上の水分が微乾燥したところ、１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸引して除去し、スライドガラスを水道水２００μＬで３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴下して１分間分化した。
８．分化液を吸引して除去し、スライドガラスを、水道水で２回、蒸留水で１回、順番に洗浄した。
９．スライドガラス表面の水分を吸引して除去し、２００μＬのエオシン染色液を滴下して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸引して除去し、順に、７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールで、２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間のリンスで脱水した。
１１．エタノールが乾燥した後、キシレン５０μＬを滴下して細胞の透過を行った。
１２．キシレンが完全に乾燥した後、中性の樹脂ガムを１滴滴下し、カバーガラスでシールし、顕微鏡で観察し、写真を撮った。
【0173】
図３は、体外培養で得られた婦人科腫瘍の初代腫瘍細胞のＨＥ染色の効果図を示す。これらの細胞は、一般的に、高い核細胞質比、ハイパークロマティック核、核内のクロマチンの凝縮、多核、不均一な細胞サイズなどの腫瘍細胞の特徴を有することが分かった。
【0174】
実施例１２．婦人科腫瘍の初代細胞の免疫組織化学染色同定
下記の実施例で使用された試薬に対する説明は、以下の通りである。
下記の実施例で使用された試薬に対する説明は、以下の通りである。
【0175】
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬社、分析純度）、パラホルムアルデヒドの粉末を超純水で溶解して、４％のパラホルムアルデヒド溶液（４ｇ／１００ｍＬ）を調製した；
過酸化水素（北京化学試薬社、３５％）；
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、ＳＬ０３８）；
免疫組織化学一次抗体（福建邁新生物技術開発有限公司、ｋｉｔ－００１２）；
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０５７１９）；
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ、ａｂ９３６８４）；
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標） ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ，８０５９Ｓ）
供試培地：実施例１における２種の婦人科腫瘍の初代細胞の培地：すなわち、培地Ａ又は培地Ｂ。
過酸化水素（北京化学試薬社、３５％）；
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、ＳＬ０３８）；
免疫組織化学一次抗体（福建邁新生物技術開発有限公司、ｋｉｔ－００１２）；
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０５７１９）；
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ、ａｂ９３６８４）；
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標） ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ，８０５９Ｓ）
供試培地：実施例１における２種の婦人科腫瘍の初代細胞の培地：すなわち、培地Ａ又は培地Ｂ。
【0176】
前記培地が培地Ａである場合、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅの最終濃度は１０μｇ／ｍＬであり；Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭであり；Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの最終濃度は１００ｎＭであり；β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１０ｎＭであった。
【0177】
前記培地が培地Ｂである場合、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；ヒト組換えタンパク質ＭＳＰの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり；Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの最終濃度は１ｍＭであり；Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭであり；Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの最終濃度は１００ｎＭであり；β－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌの最終濃度は１０ｎＭである。
【0178】
以下の手順により、実施例１における婦人科腫瘍の初代細胞の培地で培養して得られた婦人科腫瘍の細胞塊を収集し、パラフィン切片で行った。
１．切片を、キシレンＩ、キシレンＩＩの順でそれぞれ１０分間浸漬した。
２．無水エタノールI（５分間）－無水エタノールII（５分間）－９５％アルコール（５分間）－８０％アルコール（５分間）－７０％アルコール（５分間）に再度浸漬し、次いで、脱イオン水で、各回ずつ２分間、２回リンスした。
３．組織切片を修復カセットに入れ、次いで、組織が浸漬されるように、適量の希釈されたＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を添加した。
４．マイクロ波におけるミッドレンジで、１０分間修復し（液体が沸騰した時点で時間をカウントし始めた）した。なお、この過程において、組織が切片の上で乾燥することを防止するべきである。
５．修復カセットを電子レンジから取り出し、自然冷却下で降温し、修復液は室温に降温した後、スライドカラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で毎回ずつ３分間、３回リンスした（リンスの過程において、組織を破壊しないように組織に当てリンスしてはいけない）。
６．調製された３％の過酸化水素（脱イオン水で希釈した３０％の過酸化水素）を切片組織へ滴下して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。
７．吸水紙でＰＢＳを乾燥して、１０％のヤギ血清（二次抗体の種属の由来と同一又は類似）をスライドカラスへ滴下し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸水紙でスライドカラス上の組織の周囲にある液体を乾燥し、組織の周囲に油性ペンで輪を描き、次いで、希釈された一次抗体を滴下し、湿潤カセットにおいて４℃で一晩インキュベートした。
９．切片をＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。切片に対して吸水紙で乾燥した後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを滴下して二次抗体を標識し、室温で６０分間インキュベートした。
１０．切片をＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。ＰＢＳ液体を振り落とした後、切片に対して吸水紙で干し、また、新鮮に調製したＤＡＢ発色液を切片ごとに滴下し、顕微鏡で観察し、陽性シグナルになった後に水道水で切片をリンスして発色を終了させた。
１１．ヘマトキシリンで１分間再度染色し、水洗した後、酸性エタノール分化液で分化し、水道水でさらにリンスして青色に戻した。
１２．切片を水に置いてリンスした後、切片を、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールI－無水エタノールII－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に、投入して脱水させ、透明にした。各試薬において２分間ずつ放置し、最後に、切片をドラフトチャンバーに置いて風乾させた。
１３．中性の樹脂ガムを用いて切片をシールし、カバーガラスで蓋をした。ドラフトチャンバーに置いて乾燥させた。
１４．干した切片に対して、顕微鏡下で観察してもよいか、写真を撮ってもよい。
１．切片を、キシレンＩ、キシレンＩＩの順でそれぞれ１０分間浸漬した。
２．無水エタノールI（５分間）－無水エタノールII（５分間）－９５％アルコール（５分間）－８０％アルコール（５分間）－７０％アルコール（５分間）に再度浸漬し、次いで、脱イオン水で、各回ずつ２分間、２回リンスした。
３．組織切片を修復カセットに入れ、次いで、組織が浸漬されるように、適量の希釈されたＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を添加した。
４．マイクロ波におけるミッドレンジで、１０分間修復し（液体が沸騰した時点で時間をカウントし始めた）した。なお、この過程において、組織が切片の上で乾燥することを防止するべきである。
５．修復カセットを電子レンジから取り出し、自然冷却下で降温し、修復液は室温に降温した後、スライドカラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で毎回ずつ３分間、３回リンスした（リンスの過程において、組織を破壊しないように組織に当てリンスしてはいけない）。
６．調製された３％の過酸化水素（脱イオン水で希釈した３０％の過酸化水素）を切片組織へ滴下して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。
７．吸水紙でＰＢＳを乾燥して、１０％のヤギ血清（二次抗体の種属の由来と同一又は類似）をスライドカラスへ滴下し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸水紙でスライドカラス上の組織の周囲にある液体を乾燥し、組織の周囲に油性ペンで輪を描き、次いで、希釈された一次抗体を滴下し、湿潤カセットにおいて４℃で一晩インキュベートした。
９．切片をＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。切片に対して吸水紙で乾燥した後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを滴下して二次抗体を標識し、室温で６０分間インキュベートした。
１０．切片をＰＢＳで毎回ずつ３分間、３回リンスした。ＰＢＳ液体を振り落とした後、切片に対して吸水紙で干し、また、新鮮に調製したＤＡＢ発色液を切片ごとに滴下し、顕微鏡で観察し、陽性シグナルになった後に水道水で切片をリンスして発色を終了させた。
１１．ヘマトキシリンで１分間再度染色し、水洗した後、酸性エタノール分化液で分化し、水道水でさらにリンスして青色に戻した。
１２．切片を水に置いてリンスした後、切片を、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールI－無水エタノールII－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に、投入して脱水させ、透明にした。各試薬において２分間ずつ放置し、最後に、切片をドラフトチャンバーに置いて風乾させた。
１３．中性の樹脂ガムを用いて切片をシールし、カバーガラスで蓋をした。ドラフトチャンバーに置いて乾燥させた。
１４．干した切片に対して、顕微鏡下で観察してもよいか、写真を撮ってもよい。
【0179】
図４は、体外培養された乳がんの初代腫瘍細胞塊を免疫組織化学的に染色した結果を示した。細胞塊を構成する細胞はＥＲ陽性であり、患者の病理結果と一致しており、本方法により培養して得られたものは、純度の高い腫瘍細胞であることが確認された。
【0180】
実施例１３．異なる種類の婦人科腫瘍サンプルからの初代腫瘍細胞の体外培養
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは、完全に一致しているが（前述のとおり）、サンプルの病理タイプのみが異なっている。テストを行った各サンプルの状況を表２６に示す。
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは、完全に一致しているが（前述のとおり）、サンプルの病理タイプのみが異なっている。テストを行った各サンプルの状況を表２６に示す。
【0181】
【0182】
このことから、本発明の方法は、様々な種類の婦人科腫瘍の固形腫瘍サンプルに対して初代腫瘍細胞の体外培養において、非常に高い成功率を達成できることが分かった。
【0183】
実施例１４．ＣＹＴＯＰ修飾された細胞培養の消耗品を用いた婦人科腫瘍の初代腫瘍細胞の培養
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは完全に一致し（前述のとおり）、ＣＹＴＯＰ修飾の方法は完全に一致しているが、細胞培養の消耗品の材質のみが異なっている（表２７）。
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは完全に一致し（前述のとおり）、ＣＹＴＯＰ修飾の方法は完全に一致しているが、細胞培養の消耗品の材質のみが異なっている（表２７）。
【0184】
ここで、ＣＹＴＯＰ修飾の方法は以下の通りである。まず、細胞培養容器を、出力２０Ｗ、時間３分間というエッチング条件で純酸素を用いてエッチングした。その後、培養皿又は培養プレート表面を適量（９６ウェルプレートを例とし、１穴当たり２０μＬであり、また、適量とは、培養皿の底部を完全に覆うこと）の１％ ＣＹＴＯＰ溶液で覆い、ＣＹＴＯＰ溶液が完全に乾燥した後、使用可能となる。
【0185】
【0186】
表２７より、ＣＹＴＯＰ修飾したことで、サンプルの培養成功率が大幅に向上されたことがわかった。
【0187】
実施例１５．マイクロプレートチップの加工
本実施例では、射出成形の加工方式を用い、ＰＭＭＡ材料（或いはＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳ等の材料）で加工して本発明に係る婦人科腫瘍の初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。当該チップは、初代の婦人科腫瘍細胞の培養及び体外の薬剤感受性試験に使用することができる。マイクロプレートチップの設計図を図５に示す。
本実施例では、射出成形の加工方式を用い、ＰＭＭＡ材料（或いはＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳ等の材料）で加工して本発明に係る婦人科腫瘍の初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。当該チップは、初代の婦人科腫瘍細胞の培養及び体外の薬剤感受性試験に使用することができる。マイクロプレートチップの設計図を図５に示す。
【0188】
実際には、ＰＭＭＡ材料（或いはＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳ等の材料）を用いて、設計図の図５に示したマイクロプレートチップの構造を作製し、その後、その表面を前記ＣＹＴＯＰ修飾の方法（実施例１４参照）によりＣＹＴＯＰ修飾して、ここで述べる婦人科腫瘍の初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。
【産業上の利用可能性】
【0189】
本発明は、新鮮な婦人科腫瘍の手術サンプル、穿刺生検サンプル、又は胸腔液サンプルから、婦人科腫瘍の初代細胞を抽出して培養するための方法及びその支援試薬を提供しており、また、当該方法は、以下の利点を有している。
１．組織サンプルの用量が少なく、婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術サンプル２０ｍｇ程度のみが必要である；
２．培養サイクルが短く、１０７オーダーの初代腫瘍細胞を得るのに、３～１０日しか必要ない；
３．培養安定性が高く、本方法により、合格した婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術標本を体外培養する成功率が最大７０％である；
４．細胞の純度が高く、本方法により得られた婦人科腫瘍の初代細胞の培養物において、腫瘍細胞の割合は７０％～９５％に達したが、他の細胞による妨害が少ない。
１．組織サンプルの用量が少なく、婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術サンプル２０ｍｇ程度のみが必要である；
２．培養サイクルが短く、１０７オーダーの初代腫瘍細胞を得るのに、３～１０日しか必要ない；
３．培養安定性が高く、本方法により、合格した婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術標本を体外培養する成功率が最大７０％である；
４．細胞の純度が高く、本方法により得られた婦人科腫瘍の初代細胞の培養物において、腫瘍細胞の割合は７０％～９５％に達したが、他の細胞による妨害が少ない。
【0190】
本発明に係る方法により得られた婦人科腫瘍の初代細胞の培養物は、複数種の細胞レベルの体外実験、次世代シーケンシング、動物モデルの構築、細胞株の構築などに応用することができる。当該培養方法は、婦人科腫瘍の研究と臨床診断・治療の分野での幅広い応用が期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
