特許 7505148 ＬＡＧ３に結合する抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-17

(45)【発行日】2024-06-25

(54)【発明の名称】ＬＡＧ３に結合する抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240618BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240618BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240618BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240618BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 U

A61K31/713

A61P35/00

A61P37/06

A61P17/06

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022574129

(86)(22)【出願日】2021-02-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-29

(86)【国際出願番号】 CN2020120614

(87)【国際公開番号】W WO2021243919

(87)【国際公開日】2021-12-09

【審査請求日】2023-01-31

(31)【優先権主張番号】202010509498.X

(32)【優先日】2020-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519439209

【氏名又は名称】ベイジン マブワークス バイオテック カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フ、ウェンキ

(72)【発明者】

【氏名】リ、ジアンメイ

(72)【発明者】

【氏名】リ、フェン

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５００００６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０２８６７２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＡＧ３に結合し、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、およびＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、およびＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域、および前記ＶＬ ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、５、６および７、または、（２）それぞれ、配列番号１、２、４、５、６および８、に記載されるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、または１４に記載されるか、または、これらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、または２０に記載されるか、または、これらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号９および１５、（２）それぞれ、配列番号１０および１６、（３）それぞれ、配列番号１１および１７、（４）それぞれ、配列番号１１および１９（５）それぞれ、配列番号１２および１７、（６）それぞれ、配列番号１２および１９、（７）それぞれ、配列番号１３および１８、（８）それぞれ、配列番号１３および２０、または、（９）それぞれ、配列番号１４および２０、に記載されるか、または、これらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

前記重鎖可変領域に連結された配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、および／または前記軽鎖可変領域に連結された配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

マウス、キメラ、またはヒト化抗体である、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項9】

請求項８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項10】

請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分、請求項７に記載の核酸分子、または請求項８に記載の発現ベクター、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項11】

さらに、抗癌剤、抗感染症剤、または抗炎症剤を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

固形腫瘍の治療に使用するための、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項13】

前記固形腫瘍が、結腸腺癌、乳癌、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、または胃癌である、請求項１２に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部分。

【請求項14】

自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

【請求項15】

前記自己免疫疾患がプラーク乾癬である、請求項１４に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部分。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願および参照による組込み］
本出願は、２０２０年６月５日に出願された中国特許出願第２０２０１０５０９４９８．Ｘ号に基づく優先権を主張する。

【0002】

上記の出願、および本明細書に引用された、またはその出願手続き中に引用されたすべての文献（「出願引用文献」）、および本明細書に引用または参照されたすべての文献（ここに引用されたすべての文献資料、特許、公開特許出願を含むがこれに限定されない）（「本明細書での引用文献」）、および本明細書での引用文献において引用または参照されたすべての文献は、本明細書に言及された、または本明細書に参照により組み込まれる文献中の任意の製品に関する任意の製造元の指示、説明、製品仕様、製品シートと共に、ここで本明細書に参照により組み込まれて、本発明の実施で利用できるものである。より具体的には、参照されたすべての文献は、個々の文献が参照によって組み込まれるように具体的かつ個々に示された場合と同程度まで、参照によって組み込まれる。本開示で言及されたＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最も早い有効出願日のＧｅｎｂａｎｋ配列とすることにより、参照により組み込まれる。

【0003】

本出願における文献の引用または特定は、そのような文献が本開示の従来技術として利用可能であることを承認するものではない。

【0004】

本開示は、ヒトＬＡＧ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分、その調製および使用、特に、癌、感染症、および自己免疫疾患などの炎症性疾患などのＬＡＧ３と関連するヒト疾患の治療におけるその使用に関するものである。

【背景技術】

【0005】

免疫反応とは、免疫細胞上の刺激性分子または抑制分子が活性化または不活性化され、反応を適切または最適なレベルに維持する複雑なプロセスである。例えば、場合により、ＰＤ－１やＣＴＬＡ－４などの抑制性受容体をアップレギュレートして共刺激性受容体の活性バランスをとり、免疫細胞活性化を制限し、これにより自己免疫または自己炎症を防止している。しかしながら、そのような抑制メカニズムが腫瘍細胞によって操作され、免疫攻撃からそれらを保護して、癌の発生や進行につながる場合がある。病原体感染時、特に慢性感染時には、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）も高いレベルで発現し、免疫抑制につながり、敗血症、ハンセン病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などを含む疾患を発症する（Ｂｕｎｎ ＰＡ， Ｊｒ．（１９９８） Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２５（２ ｓｕｐｐｌ ６）：１－３）。ＰＤ－１やＣＴＬＡ－４を標的とする抗体は、クリニックの癌治療薬として承認されているが、多くの癌患者は応答しない（Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ等（２０１２） Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６６：２４４３－２４５４）。したがって、ＬＡＧ３やＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ３）などの追加の抑制性受容体に関心が集まっている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＣ等、（２０１６） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４：９８９－１００４）。

【0006】

ＬＡＧ３は、ＣＤ２２３としても知られており、ＣＤ４と構造的に類似したＩ型膜貫通タンパク質である。活性化Ｔ細胞やＮＫ細胞で初めて発見され、Ｔ細胞活性化や機能、ＮＫ細胞の増殖を制御する負の制御的役割を果たすことが示唆された（Ｔｕｒｎｉｓ ＭＥ等（２０１５） Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５：１８９２－１９０５）。具体的には、細胞表面で二量体化したＬＡＧ３分子はＭＨＣクラスＩＩ分子と安定的に結合し、ＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ相互作用により、抗原依存性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞刺激のダウンレギュレーションを介して免疫反応を減衰させる場合がある。例えば、メラノーマ細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子と浸潤Ｔ細胞上のＬＡＧ３との結合は、ＭＨＣ ＩＩ陰性の腫瘍細胞株では見られないＴ細胞の疲弊を促進し得る（Ｈｅｍｏｎ Ｐ等（２０１１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８６： ５１７３－５１８３）。過剰なＬＡＧ３分子は、リソソーム区画で分解されるか、またはメタロプロテアーゼＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７によってＴ細胞表面から切断されて免疫抑制を減衰させると考えられる（Ｃｌａｙｔｏｎ ＫＬ等、（２０１５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８９： ３７２３－３７３６、 Ｂａｅ Ｊ等、（２０１４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９３： ３１０１－３１１２、 Ｗｏｏ ＳＲ等、（２０１０） Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０： １７６８－１７７７）。

【0007】

また、ＬＡＧ３はＧａｌｅｃｔｉｎ－３またはＬＳＥＣｔｉｎと結合し、それぞれ腫瘍微小環境内でのＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制や抗原特異的エフェクターＴ細胞によるＩＦＮγ生成抑制につながる場合がある（Ｋｏｕｏ Ｔ等、（２０１５） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．３： ４１２－４２３、 Ｘｕ Ｆ等、（２０１４） Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４： ３４１８－３４２８）。

【0008】

ＬＡＧ３は、休止状態の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）では低いレベルで、活性化Ｔｒｅｇでは高いレベルで構成的に発現している。ＬＡＧ３の発現はＴｒｅｇの分化と最大限の抑制活性に必要であり（Ｈｕａｎｇ ＣＴ等、（２００４） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１： ５０３－５１３）、Ｔｒｅｇ上のＬＡＧ３へのＭＨＣクラスＩＩ結合は、ＤＣ活性化と成熟を阻害することが示されている（Ｌｉａｎｇ Ｂ等、（２００８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０：５９１６－５９２６）。

【0009】

上記のように、ＬＡＧ３は一般的に免疫系を抑制し、免疫反応をダウンレギュレートする。ＬＡＧ３の発現は、感染の重症度と強い相関があることが分かっており、腫瘍浸潤Ｔ細胞におけるＬＡＧ３レベルの高さは、腫瘍細胞による逃避機構に寄与していると考えられる（Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｋ等、（２０１０） Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２： １３－２３）。別の態様では、ＬＡＧ３の機能不全は、自己免疫疾患の発現または増悪につながる場合がある。

【0010】

ＭＫ－４２８０（Ｍｅｒｃｋ、ヒト化ＩｇＧ４抗体）やＢＭＳ－９８６０１６（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂｍ、完全ヒトＩｇＧ４抗体）などの拮抗する抗ＬＡＧ３抗体は、単独または抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１との組み合わせにおいて、乳癌、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、および胃癌などを含む固形癌の治療のために開発され、臨床試験されている。また、拮抗する抗ＬＡＧ３抗体は、自己免疫疾患を有する患者病巣のＬＡＧ３＋免疫細胞を標的とし、除去する場合がある。例えば、ＧＳＫ２８３１７８１（グラクソ・スミスクライン）は現在、プラーク乾癬の患者を対象に臨床試験が行われている（Ａｎｄｒｅｗｓ ＬＰ等、（２０１７） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２７６（１）：８０－９６）。

【0011】

ＬＡＧ３の免疫系制御における役割を考慮して、向上した薬物特性を持つ抗ＬＡＧ３抗体の必要性が残されている。

【0012】

本出願における文献の引用または特定は、そのような文献が本発明の従来技術として利用可能であることを承認するものではない。

【発明の概要】

【0013】

本開示は、ＬＡＧ３（例えば、ヒトＬＡＧ３、およびサルＬＡＧ３）に結合する単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＢＭＳ－９８６０１６などの従来技術の抗体と比較して、ヒト／サルＬＡＧ３に対する同等の結合活性／親和性、ＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ相互作用に対する同等またはそれ以上の阻害活性、Ｔ細胞活性化促進効果、および同等またはそれ以上のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を有している。

【0014】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＬＡＧ３タンパク質の検出、ＬＡＧ３関連疾患の治療などを含む、様々な用途に使用することが可能である。

【0015】

したがって、１つの態様において、本開示は、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域およびＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域を有するＬＡＧ３と結合する単離モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）、またはその抗原結合部分に関連し、ここで、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域およびＶＨ ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号１、２および３、（２）それぞれ、配列番号１、２および４、または（３）それぞれ、配列番号２１、２２および２３に記載されたアミノ酸配列を含むか、または少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得、および／または軽鎖可変領域がＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域およびＶＬ ＣＤＲ３領域から構成され得、ここで、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域．およびＶＬ ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号５、６および７、（２）それぞれ、配列番号５、６および８、または（３）それぞれ、配列番号２４、２５および２６に記載されるアミノ酸配列を含み得、または、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0016】

特定の実施形態では、本開示の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨ ＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、およびＶＬ ＣＤＲ３領域を含んでいてよく、これらは、（１）それぞれ、配列番号１、２、３、５、６および７、（２）それぞれ、配列番号１、２、４、５、６および８、または（３）それぞれ、配列番号１８、１９、２０、２１、２２および２３に記載されるか、または、これらと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。

【0017】

本開示の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、２７、２８、２９または３０に記載されるか、または、これらと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域から構成されてもよい。

【0018】

本開示の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、３１、３２、３３または３４に記載されるか、または、これらと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域から構成されてもよい。

【0019】

特定の実施形態では、本開示の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、（１）それぞれ、配列番号９および１５、（２）それぞれ、配列番号１０および１６、（３）それぞれ、配列番号１１および１７、（４）それぞれ、配列番号１１および１９、（５）それぞれ、配列番号１２および１７、（６）それぞれ、配列番号１２および１９、（７）それぞれ、配列番号１３および１８、（８）それぞれ、配列番号１３および２０、（９）それぞれ、配列番号１４および２０、（１０）それぞれ、配列番号２７および３１、（１１）それぞれ、配列番号２８および３２、（１２）それぞれ、配列番号２９および３３、（１３）それぞれ、配列番号２９および３４、（１４）それぞれ、配列番号３０および３３、または（１５）それぞれ、配列番号３０および３４、に記載されるか、または、これらと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域および軽鎖可変領域から構成されてよい。

【0020】

本開示の単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含んでいてもよい。重鎖定常領域は、ＩｇＧ４重鎖定常領域であってよく、例えば、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、または、より具体的には配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有するＳ２２８Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、またはその断片などであってよい。軽鎖定常領域は、例えば、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するヒトカッパ軽鎖定常領域、またはその断片などの、カッパ軽鎖定常領域であってもよい。ＩｇＧ４重鎖定常領域におけるＳ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体の構造的安定性を強化するのに役立ち得る。重鎖定常領域のＮ末端は、重鎖可変領域のＣ末端に連結されていてもよく、軽鎖定常領域のＮ末端は、軽鎖可変領域のＣ末端に連結されていてもよい。

【0021】

特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域などのＩｇＧ１重鎖定常領域であってもよく、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域などのカッパ軽鎖定常領域であってもよい。

【0022】

特定の実施形態における本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖から構成されるか、またはそれらを含んでく、各重鎖は、上記の重鎖定常領域、重鎖可変領域またはＶＨ ＣＤＲ配列から構成されてよく、各軽鎖は、上記の軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、またはＶＬ ＣＤＲ配列からから構成されてよく、重鎖可変領域のＣ末端は重鎖定常領域のＮ末端に結合し、軽鎖可変領域のＣ末端は軽鎖定常領域のＮ末端に結合し、抗体はＬＡＧ３に結合する。本開示の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。本開示の抗体はカッパ定常領域を含み得る。他の実施形態における本開示の抗体またはその抗原結合部分は、単鎖抗体であってもよいし、または、ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）_２断片などの抗体断片から構成されてもよい。

【0023】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ヒトおよびサルのＬＡＧ３に特異的に結合し、ＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ相互作用を阻害し、Ｔ細胞活性化を促進し、ｉｎ ｖｉｖｏの抗癌効果を提供し得る。また、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗炎症作用を提供し、自己免疫疾患などの炎症性疾患の治療または軽減に使用し得る。

【0024】

本開示はまた、細胞毒素または抗癌剤などの治療剤に連結された、本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫コンジュゲートを提供する。本開示はまた、前述の抗体、またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分（例えば、第２の抗体）に連結された、本開示の抗体、またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供する。別の態様では、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部とすることができる。本開示は、さらに、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの、上記のＣＡＲまたはＴＣＲを有する免疫細胞を提供する。

【0025】

本開示の抗体、またはその抗原結合部分、免疫コンジュゲート、二重特異性分子、または免疫細胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物も提供される。

【0026】

本開示の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子並びに、そのような核酸を含む発現ベクターおよびそのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本開示に包含される。発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合部分を調製する方法も提供され、（ｉ）宿主細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現させる段階、および（ｉｉ）宿主細胞またはその細胞培養物から抗体または抗原結合部分を単離する段階を含む。

【0027】

別の態様では、本開示は、対象における免疫反応を強化するための方法であって、本開示の抗体、またはその抗原結合部分の治療上有効な量を対象に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、本開示の組成物、または二重特異性分子を投与することを含む。免疫反応増強に用いられる抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。

【0028】

別の態様では、本開示は、腫瘍の進行を治療または低減を必要とする対象のための方法であって、本開示の抗体、またはその抗原結合部分の治療上有効な量を対象に投与することを含む、方法を提供する。癌は、結腸腺癌、乳癌、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、および胃癌を含むが、これらに限定されない固形腫瘍であってもよい。癌治療に用いられる抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。特定の実施形態では、方法は、本開示の組成物、発現ベクター、二重特異性分子、または免疫コンジュゲートを投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、抗ＲＯＲ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの少なくとも１つの追加の抗癌抗体またはその抗原結合部分をさらに投与され得る。さらに別の実施形態では、対象は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－２１）、または共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７抗体および／または抗ＧＩＴＲ抗体）をさらに投与されてもよい。別の実施形態では、対象は、細胞傷害性剤であってよい化学療法剤をさらに投与されてもよい。本開示の抗体またはその抗原結合部分は、例えば、マウス、ヒト、キメラまたはヒト化抗体またはその抗原結合部分であってもよい。

【0029】

別の態様では、本開示は、感染症を治療または緩和を必要とする対象のための方法であって、本開示の抗体、またはその抗原結合部分の治療上有効な量を対象に投与することを含む、方法を提供する。感染症は、ウイルス、細菌、真菌、またはマイコプラズマ感染によって引き起こされる疾患であってもよい。感染症治療に用いられる抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。特定の実施形態では、方法は、本開示の組成物、発現ベクター、二重特異性分子、または免疫コンジュゲートを投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗マイコプラズマ剤などの少なくとも１つの抗感染剤でさらに投与されてもよい。

【0030】

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における自己免疫疾患を治療または緩和するための方法であって、本開示の抗体、またはその抗原結合部分の治療上有効な量を対象に投与することを含む、方法を提供する。自己免疫疾患の治療のための抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１アイソタイプであってもよく、ＩｇＧ１重鎖定常領域は、強化された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または強化された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発するようにさらに設計されてもよい。特定の実施形態では、方法は、本開示の組成物、発現ベクター、二重特異性分子、または免疫細胞を投与することを含んでいる。特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合部分、組成物、発現ベクター、二重特異性分子、または免疫細胞は、病巣部またはその周辺に投与され得る。特定の実施形態では、対象は、プラーク乾癬治療のために、ＩＬ－２阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤（例えば、Ｔａｌｔｚ^Ｒ Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、および／または抗ＩＬ－２３阻害剤などの少なくとも１つの抗炎症剤をさらに投与されてもよい。

【0031】

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例から明らかであるが、これは限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用されるすべての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許および特許出願公開の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。

【0032】

したがって、本発明の目的は、従来公知の製品、製品の製造方法、または製品の使用方法を本発明に包含しないことであり、したがって、出願人は、従来公知の製品、プロセス、または方法の免責事項を開示する権利を留保し、本明細書に開示する。さらに、本発明は、ＵＳＰＴＯ（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２，第１段落）またはＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない製品、プロセス、または製品の製造方法または製品の使用方法を本発明の範囲に包含する意図するものではないことに留意し、したがって、出願人は、過去に記載した製品、製品の製造方法または製品の使用方法の免責事項を開示し、本明細書に権利を留保する。技術分野に適合していることが、本発明の実施において利点であり得る。ＥＰＣ５３（ｃ）、ＥＰＣ規則２８（ｂ）および（ｃ）。本出願の系統、または他の系統、または第三者の先行出願における出願人の許諾特許の対象である実施形態を明示的に否認するすべての権利は、明示的に留保される。本明細書のいかなる内容も、約束と解釈されるものではない。

【0033】

本開示、特に請求項および／または段落において、「含む」、「構成する」、「有する」等の用語は、米国特許法において帰属する意味を有することができ、例えば、それらは、「含む」、「含まれる」、「含んでいる」などを意味し、「本質的に構成する」、「本質的に含む」などの用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記載されていない要素を許容するが、従来技術に見出される要素または本発明の基本特性または新規特性に影響を与える要素を除外することに留意されたい。

【図面の簡単な説明】

【0034】

以下の詳細な説明は、例として与えられるが、記載された特定の実施形態にのみ専ら本発明を限定することを意図されていなく、添付図面と併せて最もよく理解され得る。

【0035】

【図1】Ｄａｕｄｉ細胞上のＭＨＣＩＩへのＬＡＧ３結合に対するマウス抗ＬＡＧ３抗体の阻害効果を示す。

【0036】

【図2】ＩＦＮ－γ分泌によって測定される、ＡＰＣを媒介したＴ細胞活性化におけるマウス抗ＬＡＧ３抗体の役割を示す。

【0037】

【図3】キメラ１０１Ｆ４抗体（１０１Ｆ４－ＣＭ）およびキメラ１３４Ｇ１０抗体（１３４Ｇ１０－ＣＭ）のＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＬＡＧ３（Ｂ）およびＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３（Ｃ）への結合活性を示す。

【0038】

【図4】ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＬＡＧ３（Ｂ）、ＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３（Ｃ）に対するキメラ抗体およびヒト化１０１Ｆ４抗体の結合活性、並びにＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３（Ｄ）、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＬＡＧ３（Ｅ）、ＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３（Ｆ）に対するキメラ抗体およびヒト化１３４Ｇ１０抗体の結合活性を示す。

【0039】

【図5】ヒト化１０１Ｆ４（Ａ）および１３４Ｇ１０（Ｂ）抗体のＤａｕｄｉ細胞上のＭＨＣＩＩへのＬＡＧ３結合を阻害する活性を示す。

【0040】

【図6】ヒト化１３４Ｇ１０（Ａ）および１０１Ｆ４（Ｂ）抗体と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせが、ＩＦＮ－γ分泌により測定されるＴ細胞活性化を用量依存的に誘導することを示す。

【0041】

【図7】ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２および１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８のヒトＬＡＧ３（Ａ）、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３（Ｂ）、ＨＥＫ２９３Ａ／アカゲザルＬＡＧ３（Ｃ）、ＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３（Ｄ）および活性化ヒトＰＢＭＣ（Ｅ）への結合活性を示す。

【0042】

【図8】キメラ抗体１０１Ｆ４－ＣＭ（Ａ）、ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２（Ｂ）および１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（Ｃ）、キメラ抗体１３４Ｇ１０－ＣＭ（Ｄ）およびヒト化抗体１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（Ｅ）のヒトＬＡＧ３に対する結合親和性を示す。

【0043】

【図9】ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２（Ａ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（Ｂ）、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（Ｃ）のサルＬＡＧ３に対する結合親和性を示す。

【0044】

【図10】ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２および１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（Ａ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ３－８および１０１Ｆ４Ｈ３Ｌ３－８（Ｂ）が、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、Ｔ細胞活性化を促進したことを示す。

【0045】

【図11】ヒトＬＡＧ３を有するトランスジェニックマウスにおいて、溶媒（ＰＢＳ）、ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３、またはポジティブコントロールで治療した群からの平均腫瘍体積変化（Ａ）および２５日目（Ｂ）の平均腫瘍重量、および溶媒（Ｃ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２（Ｄ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（Ｅ）、ポジティブコントロール（Ｆ）および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（Ｇ）で治療した群からの個々のマウスにおける腫瘍体積変化を示す。

【0046】

【図12】ヒトＬＡＧ３およびＰＤ－１を有するトランスジェニックマウスにおいて、溶媒、ヒト化抗体１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８、またはポジティブコントロールで治療した群からの平均腫瘍体積変化（Ａ）、および溶媒（Ｂ）、ポジティブコントロール（Ｃ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（Ｄ）、および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（Ｅ）で治療した群からの個々のマウスでの腫瘍体積変化を示す。

【0047】

【図13】ヒトＬＡＧ３を導入したトランスジェニックマウスの末梢血中のＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する抗ＬＡＧ３抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示す。

【0048】

【図14】溶媒（ＰＢＳ）、ヒト化抗体１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３、抗ＰＤ－１抗体、または１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせで治療した群における平均腫瘍体積変化（Ａ）、および溶媒（ＰＢＳ）、ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８、抗ＰＤ－１抗体、または１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせで治療した群における平均腫瘍体積変化（Ｂ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本開示がより容易に理解され得ることを保証するべく、特定の用語をまず定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して記載される。

【0050】

「ＬＡＧ３」とは、リンパ球活性化遺伝子３を指す。「ＬＡＧ３」という用語は、変異型、アイソフォーム、ホモログ、オーソログ、パラログを含む。例えば、ヒトのＬＡＧ３タンパク質に特異的な抗体は、特定の場合、ヒト以外の種、例えばサルなどからのＬＡＧ３タンパク質と交差反応を示し得る。他の実施形態では、ヒトＬＡＧ３タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＬＡＧ３タンパク質に完全に特異的であり得、他の種または他のタイプのものに対して交差反応性を示さないか、または特定の他の種からのＬＡＧ３と交差反応を示すが他のすべての種とは交差反応性を示さない場合がある。

【0051】

用語「ヒトＬＡＧ３」は、ヒト由来のアミノ酸配列を有するＬＡＧ３タンパク質を指し、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号がＮＰ＿００２２７７．４であるヒトＬＡＧ３のアミノ酸配列、または配列番号３７に記載のヌクレオチド配列によりエンコードされるものなどを指す。用語「サルまたはアカゲザルＬＡＧ３」は、サル由来のアミノ酸配列を有するサルＬＡＧ３タンパク質を指し、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号がＸＰ＿００１１０８９２３．１であるサルＬＡＧ３のアミノ酸配列、または配列番号３８に記載されるヌクレオチド配列によってエンコードされるものなどを指す。用語「マウスＬＡＧ３」は、マウス由来のアミノ酸配列を有するＬＡＧ３タンパク質を指し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号がＮＰ＿０３２５０５．１であるマウスＬＡＧ３のアミノ酸配列、または配列番号３９に記載のヌクレオチド配列によりエンコードされるものなどを指す。

【0052】

本明細書でいう「抗体」には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭの全抗体並びにその抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの単鎖が含まれる。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣ_Ｌを含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存的な領域が点在する。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３，ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々なセル（例えば、エフェクター細胞）、および、古典的補体経路の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介できる。

【0053】

本明細書で使用する抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＬＡＧ３タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ'）_２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等、（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、および、（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってエンコードされているが、これらは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域がペアになって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作ることが可能な合成リンカーによって結合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄ等、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６ およびＨｕｓｔｏｎ等、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８５：５８７９－５８８３を参照）。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を使用して取得され、断片は、インタクト抗体と同一の方式で、有用性に関してスクリーニングされる。

【0054】

本明細書で使用する「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、ＬＡＧ３タンパク質を特異的に結合する単離抗体は、ＬＡＧ３タンパク質以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトのＬＡＧ３タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種のＬＡＧ３タンパク質など、他の抗原に対して交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないことがあり得る。

【0055】

本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から取得された抗体を指す。すなわち、天然に発生する可能性がある変異、および／または、少量存在し得る翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化）を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して指向性がある、特異性の高い抗体である。ポリクローナル抗体製剤が典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して指向性がある異なる抗体を含むのと対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向性がある。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンに汚染されていないハイブリドーマ培養液で合成されるという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、特定の方法による抗体の生成を必要とするものと解釈されるものではない。例えば、本発明による使用するモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ技術、ヒト免疫グロブリン座またはヒト免疫グロブリン配列をエンコードする遺伝子の一部またはすべてを有する動物でヒトまたはヒト様抗体を製造する技術などを含む様々な技法により製造することができる。

【0056】

本明細書で使用する場合、「マウス抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域も、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系免疫グロブリン配列によってエンコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダムまたは部位特異的変異誘発、または、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用する場合、「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がマウスのフレームワーク配列に移植された抗体を含むことが意図されていない。

【0057】

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト起源からの遺伝物質をヒトの遺伝物質と組み合わせることによって作られる抗体を指す。またはより一般的には、キメラ抗体とは、ある種の遺伝物質と別の種の遺伝物質を有する抗体のことである。

【0058】

本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させるように改変されたタンパク質配列を有する非ヒト種の抗体を指す。

【0059】

「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。

【0060】

本明細書で使用する「ヒトＬＡＧ３に特異的に結合する」抗体は、ヒトＬＡＧ３タンパク質（および場合により１または複数の非ヒト種由来のＬＡＧ３タンパク質）に結合するが、非ＬＡＧ３タンパク質には実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体はヒトＬＡＧ３タンパク質と「高い親和性」、すなわちＫ_Ｄが５．０×１０^－８Ｍまたはそれ以下、より好ましくは１．０×１０^－８Ｍまたはそれ以下、より好ましくは５．０×１０^－９Ｍまたはそれ以下で結合することである。

【0061】

本明細書で使用する場合、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質または細胞に結合しない、または、高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０^－５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０^－４Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは１．０×１０^－２Ｍ以上のＫ_Ｄでタンパク質または細胞に結合することを意味する。

【0062】

ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して、１．０×１０^－６Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは５．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０^－６Ｍ以下、より好ましくは１０^－７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

【0063】

本明細書で使用する場合、「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」または「Ｋ_ａ」という用語は、特定の抗体‐抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、本明細書で使用する場合、「Ｋ_ｄｉｓ」または「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体‐抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用する場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、Ｋ_ａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から取得される解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）で表現される。抗体のＫ_Ｄ値は、本技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用する、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ^ＴＭ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用することによるものである。

【0064】

半数効果濃度としても知られる「ＥＣ_５０」という用語は、指定された曝露時間後のベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

【0065】

本明細書で使用する「抗体依存性細胞毒性」、「抗体依存細胞媒介細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、抗ＬＡＧ３抗体などの抗体によって膜表面抗原が結合された腫瘍細胞または免疫細胞などの標的細胞を免疫系のエフェクター細胞が活発に溶解させる、細胞媒介性免疫防御メカニズムを指す。

【0066】

「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、一般的に、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体が表面抗原と結合すると古典的補体系を誘発し、膜侵襲複合体の形成と標的細胞の溶解を誘導するエフェクター機能を指す。本開示の抗体は、ＬＡＧ３に結合することにより、癌細胞に対してＣＤＣを誘導する。

【0067】

「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、哺乳類および非哺乳類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの哺乳類が好ましい。

【0068】

「治療上有効な量」という用語は、疾患または状態（癌など）に関連する症状を予防または緩和する、および／または疾患または状態の重症度を軽減するのに十分な、本開示の抗体またはその抗原結合部分の量を意味する。治療上有効な量は、治療される病状の文脈に沿うものと理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に識別される。

【0069】

拮抗型ＬＡＧ３抗体」とは、ＬＡＧ３がＭＨＣ ＩＩなどのリガンドに結合することによって誘導されるＬＡＧ３シグナルを阻害または抑制しうる抗ＬＡＧ３抗体を指す。拮抗するＬＡＧ抗体は、Ｔ細胞活性化を促進し得、サイトカインを放出させ、免疫反応を高める。

【0070】

本開示の様々な態様が、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。

【0071】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＢＭＳ－９８６０１６などの従来技術の抗体と比較して、ヒト／サルＬＡＧ３に対する同等の結合活性／親和性、およびＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ相互作用に対する同等またはそれ以上の阻害活性を有している。

【0072】

より重要なことは、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＢＭＳ－９８６０１６などの従来技術の抗体よりも高いＴ細胞活性化促進効果、およびＢＭＳ－９８６０１６およびＭＫ－４２８０などの従来技術の抗体と比較して同等またはさらに高いｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を有し得ることである。

【0073】

好ましくは、本開示の抗体はモノクローナル抗体である。追加的または代替的に、抗体は例えば、マウス、キメラ、または、ヒト化モノクローナル抗体であり得る。

【0074】

本開示の例示的な抗体は、下記および以下の例に記載されるように構造的および化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体である。

【0075】

表１における重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって定義された。しかしながら、本技術分野において周知のように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔナンバリングシステム／方法など、他のシステムによっても決定できる。

【0076】

重鎖／軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列のＳＥＱ ＩＤ番号を表１に列挙するが、一部の抗体では同一のＶ_ＨまたはＶ_Ｌ配列を共有する。

【0077】

本開示の例示的な抗体は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含んでもよい。重鎖定常領域は、治療する疾患／病状に応じて、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１重鎖定常領域としてもよい。ＩｇＧ４重鎖定常領域は、例えば、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有する、例えば、Ｓ２２８Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であってよい。ＩｇＧ４定常領域におけるＳ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体の構造的安定性を高めるのに役立ち得る。軽鎖定常領域は、例えば、配列番号３６のアミノ酸配列を有する、ヒトカッパ定常領域などのカッパ定常領域であってもよい。

【0078】

ヒトＬＡＧ３に結合する他の抗ＬＡＧ３抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（またはＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＬＡＧ３抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列（またはＣＤＲ配列）と「組み合わされる」ことが可能である。好ましくは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖（またはそのような鎖の中のＣＤＲ）が組み合わされるとき、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアからのＶ_Ｈ配列は、構造的に同様のＶ_Ｈ配列と置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_ＬペアからのＶ_Ｌ配列は、構造的に同様のＶ_Ｌ配列と置き換えられる。

【0079】

したがって、１つの実施形態において、本開示の抗体、またはその抗原結合部分は、以下のものを含んでいる。
（ａ）上記表１に列挙したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）上記表１に列挙したアミノ酸配列を含む、または別の抗ＬＡＧ３抗体のＶ_Ｌであって、抗体がヒトＬＡＧ３と特異的に結合する、軽鎖可変領域。

【0080】

［表１：重鎖／軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列ＩＤ番号］

【表1】

【0081】

別の実施形態では、本開示の抗体、またはその抗原結合部分は、以下を含む。
（ａ）上記表１に列挙した重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域および、
（ｂ）上記表１に列挙した軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、または別の抗ＬＡＧ３抗体のＣＤＲであって、その抗体がヒトＬＡＧ３を特異的に結合するもの。

【0082】

さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＬＡＧ３と結合する他の抗体のＣＤＲと結合する抗ＬＡＧ３抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３、および／または異なる抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３を組み合わせたものを含んでいる。

【0083】

加えて、本技術分野において、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立のＣＤＲ３ドメインは単独で、類似の抗原に対する抗体の結合特異性を決定できること、ならびに、同一のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測通りに生成できることが周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ等、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０ （２０００）、Ｂｅｉｂｏｅｒ等、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９６：８３３－８４９ （２０００）、Ｒａｄｅｒ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国． ９５：８９１０－８９１５ （１９９８）、 Ｂａｒｂａｓ等， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１６：２１６１－２１６２ （１９９４）、Ｂａｒｂａｓ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国． ９２：２５２９－２５３３ （１９９５）、 Ｄｉｔｚｅｌ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：７３９－７４９ （１９９６）、 Ｂｅｒｅｚｏｖ等、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８： Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８ （２００１）、 Ｉｇａｒａｓｈｉ等、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ （Ｔｏｋｙｏ） １１７：４５２－７ （１９９５）、 Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ等、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０ （１９９８）、 Ｌｅｖｉ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 米国． ９０：４３７４－８ （１９９３）、 Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５２１８－５３２９（１９９４）およびＸｕおよびＤａｖｉｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照。また、米国特許第６，９５１，６４６号、第６，９１４，１２８号、第６，０９０，３８２号、第６，８１８，２１６号、第６，１５６，３１３号、第６，８２７，９２５号、第５，８３３，９４３号、第５，７６２，９０５号および第５，７６０，１８５号を参照。これらの参考文献の各々は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0084】

したがって、別の実施形態では、本開示の抗体は、抗ＬＡＧ３抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２と、抗ＬＡＧ３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、または別の抗ＬＡＧ３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、この抗体はヒトＬＡＧ３に特異的に結合することができる。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＬＡＧ３との結合を競合し、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同一のエピトープに結合し、および／または（ｄ）本開示の抗ＬＡＧ３抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態では、抗体は、抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、または別の抗ＬＡＧ３抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含んでよく、ここで、抗体はヒトＬＡＧ３に特異的に結合することが可能である。別の実施形態では、本開示の抗体は、抗ＬＡＧ３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、または別の抗ＬＡＧ３抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含み得、ここで、抗体はヒトＬＡＧ３に特異的に結合することが可能である。

【0085】

別の実施形態では、本開示の抗ＬＡＧ３抗体のものとは１または複数の保存的改変によって異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む本開示の抗体が提供される。本技術分野において、抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾が行われ得ることが理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ等、（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８、ｄｅ Ｗｉｌｄｔ等、（１９９７） Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０：８３５－４１、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ等、（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６８６４－２６８７０、Ｈａｌｌ等、（１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１６０５－１２、 Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５、 Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ 等、（１９９８） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６およびＢｅｅｒｓ等、（２０００） Ｃｌｉｎ． Ｃａｎ． Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照。

【0086】

したがって、１つの実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域から構成され、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙された配列、および／またはその保存的改変体から構成され、および／または
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙された配列、および／またはその保存的改変体から構成され、および／または
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙された配列、およびその保存的改変体から構成され、および／または
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、および／またはＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙された配列、および／またはその保存的改変体から構成され、および、
（ｅ）抗体は、ヒトＬＡＧ３と特異的に結合する。

【0087】

本開示の抗体は、ヒトＬＡＧ３に対する高い親和性結合など、上記した以下の機能特性のうちの１または複数を有する。

【0088】

様々な実施形態において、抗体は例えば、マウス、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得る。

【0089】

本明細書で使用する場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響しない、または、それを変更しないアミノ酸修飾を指すことを意図する。そのような保存的改変はアミノ酸置換、追加および欠失を含む。部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発など、本技術分野において知られている標準的な技法によって、本開示の抗体に改変が導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域における１または複数のアミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書において記載された機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上に記載された機能）について試験され得る。

【0090】

本開示の抗ＬＡＧ３抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列の１または複数を有する抗体を出発材料として用い、改変型抗体を設計して、本開示の抗体を調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ）、例えば、１または複数のＣＤＲ領域、および／または、１または複数のフレームワーク領域における１または複数の残基を改変することによって設計され得る。追加的または代替的に、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、抗体は、定常領域内の残基を改変することによって設計され得る。

【0091】

特定の実施形態において、抗体の可変領域を操作するために、ＣＤＲ移植が使用され得る。抗体は、主に６の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より、個々の抗体間の多様性が高い。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体－抗原相互作用を担っているため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の天然に発生する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に発生する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｊｏｎｅｓ等、（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｑｕｅｅｎ等、（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照。また、米国 ８６：１００２９－１００３３、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。

【0092】

したがって、本開示の別の実施形態は、上記の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、および／または、上記の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体、または、その抗原結合部分に関連する。これらの抗体は本開示のモノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ ＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含み得る。

【0093】

そのようなフレームワーク配列は、公共のＤＮＡデータベース、または、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上でｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）、並びに、Ｋａｂａｔ等、（１９９１）、前掲のＴｏｍｌｉｎｓｏｎ等、（１９９２） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８、およびＣｏｘ等、（１９９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６で入手可能である。これらの各々の内容は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能である。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）および３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見られる以下の重鎖生殖系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９ ＆ＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。

【0094】

抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、（１９９７））と呼ばれる配列類似性検索方法の１つを使用して、まとめられたタンパク質配列データベースと比較される。

【0095】

本開示の抗体において使用される好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と同様の構造である。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域に移植され得るか（フレームワーク配列は生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に由来する）、または、ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１または複数の変異を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の例において、抗体の抗原結合能力を維持または強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かった（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照されたい）。

【0096】

別の種類の可変領域修飾は、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域におけるアミノ酸残基を変異させ、これによって、目的の抗体の１または複数の結合特性（例えば親和性）を改善することである。変異を導入するために、部位指向性変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発が実行され得、抗体結合に対する作用、または、他の目的の機能特性が、本技術分野において知られているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価され得る。好ましくは、保存的改変（本技術分野において知られている）が導入される。変異は、アミノ酸置換、追加、または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５より多くない残基が変更される。

【0097】

したがって、別の実施形態では、本開示は、以下のものを含む重鎖可変領域を含む単離抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。（ａ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加を有するアミノ酸配列、（ｂ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｈ ＣＤＲ２領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加を有するアミノ酸配列、（ｃ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｈ ＣＤＲ３領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加をを有するアミノ酸配列、（ｄ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加を有するアミノ酸配列、（ｅ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｌ ＣＤＲ２領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加を有するアミノ酸配列、および（ｆ）本開示の配列から構成されるＶ_Ｌ ＣＤＲ３領域、または１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または追加を有するアミノ酸配列。

【0098】

本開示の操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に改変が行われたものを含む。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を経験した抗体は、抗体の由来元である生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体の由来元である生殖系列配列と比較することによって特定され得る。

【0099】

別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内、または、さらには１または複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させ、これによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下することを伴う。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。

【0100】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる改変に加えて、または代替して、本開示の抗体は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または、抗原依存性細胞毒性など、抗体の１または複数の機能的特性を変更するために、Ｆｃ領域内の改変を含むように設計され得る。さらに、本開示の抗体は、化学的に改変され得る（例えば、１または複数の化学的部分が抗体に付着され得る）か、または、そのグリコシル化を変更するために改変され得、これにより、同様に抗体の１または複数の機能的特性が再度変更される。

【0101】

１つの実施形態において、Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増加または減少するように改変される。この方法は、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するために、または、抗体の安定性を増加または減少させるために変更される。

【0102】

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために、変異される。より具体的には、ネイティブのＦｃヒンジドメインのスタフィロコッカスタンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合と比べて弱いＳｐＡ結合を抗体が有するように、１または複数のアミノ酸変異が、Ｆｃヒンジ断片のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン界面領域に導入される。この方法は、米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。

【0103】

さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は改変される。例えば、グリコシル化された抗体が作られ得る（すなわち、抗体はグリコシル化を有しない）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために変更され得る。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１または複数の部位を変更することによって実現され得る。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換が行われ得、これによって、当該部位のグリコシル化が除去される結果となる。そのようなアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。

【0104】

追加的または代替的に、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体、または、二分ＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体など、グリコシル化の種類が変更された抗体が作られ得る。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証された。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変更した宿主細胞において、抗体を発現させることによって実現され得る。グリコシル化機構を変更した細胞が本技術分野において説明され、本開示の組換え抗体を発現させるための宿主細胞として使用され得、これによって、グリコシル化が変更された抗体が産生される。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株において発現する抗体がそれらの炭水化物上にフコースが欠如するように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）‐フコシルトランスフェラーゼ）が欠如する。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８‐／‐細胞株が、２つの置換ベクトルを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作成された（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号およびＹａｍａｎｅ‐Ｏｈｎｕｋｉ等、（２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照）。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラーゼをエンコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載し、したがって、そのような細胞株において発現する抗体は、α－１，６結合関連酵素を低減または除去することによって低フコシル化を示す。ＥＰ１，１７６，１９５はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ‐アセチルグルコサミンにフコースを追加するための酵素活性が低い、または、酵素活性を有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載する。ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５は、Ａｓｎ（２９７）－結合した炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、結果として、その宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化も生じる変異型ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載している（Ｓｈｉｅｌｄｓ等、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照されたい）。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ０６／０８９２３１に記載されるように、ニワトリの卵において産生され得る。代替的に、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗体が、アオウキクサなどの植物細胞において産生さ得る。植物系で抗体を生成する方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ ＆ Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号第０４０９８９／３１４９１１に対応する米国特許出願に開示されている。ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／５４３４２は、工学的細胞株で発現するように設計された抗体が、結果として、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように設計された細胞株を記載している（（Ｕｍａｎａ等、（１９９９） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０もまた参照）。代替的に、フコシダーゼ酵素を用いて抗体のフコース残基を切断してもよい。例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ等、（１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

【0105】

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の改変はＰＥＧ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血中）半減期を増加させるためにＰＥＧ化され得る。抗体をＰＥＧ化するために、抗体またはその断片は典型的には、１または複数のＰＥＧ群が抗体または抗体断片に取り付けられる条件下において、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書で使用する場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１－Ｃ_１０）アルコキシまたはアリールオキシ‐ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール‐マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することが意図される。特定の実施形態において、ＰＥＧ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法が本技術分野において知られ、本開示の抗体に適用され得る。例えば、ＥＰＯ １５４ ３１６およびＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照されたい。

【0106】

本開示の抗体は、その異なるクラスを検出および／または区別するための様々な物理的特性を特徴とし得る。

【0107】

例えば、抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれにおける１または複数のグリコシル化部位を含み得る。そのようなグリコシル化部位は、変更された抗原結合に起因して、結果として、抗体の免疫原性の増加、または、抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ等（１９７２） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２、 Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （２００４） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４、 Ｗａｌｌｉｃｋ等（１９８８） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９、 Ｓｐｉｒｏ （２００２） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ、 Ｐａｒｅｋｈ等（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７、 Ｍｉｍｕｒａ等（２０００） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ‐Ｘ‐Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて発生することが知られている。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含まない抗ＬＡＧ３抗体であることが好ましい。これは、可変領域においてグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択すること、または、グリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれによって達成され得る。

【0108】

好ましい実施形態において、抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ‐ＧまたはＤ‐Ｇ配列で発生し、結果として、ポリペプチド鎖にねじれを導入して安定性を減少させる（イソアスパラギン酸作用）イソアスパラギン酸残基の作成をもたらし得る。

【0109】

各抗体は、一般的に６～９．５のｐＨ範囲に収まる固有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的には、７－９．５のｐＨ範囲に収まり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的には、６～８のｐＨ範囲に収まる。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下において、いくつかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ると推測される。したがって、抗ＬＡＧ３抗体は、正常範囲に収まるＰＩ値を含むことが好ましい。これは、正常範囲におけるｐＩを有する抗体を選択すること、または、荷電表面残基を変異させることのいずれかによって達成できる。

【0110】

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域またはＣＤＲをエンコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞が、細胞可溶化物において、または、部分的に精製された、または実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技法によって、他の細胞成分または他の混入物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質などから精製されるとき、「単離」される、または、「実質的に純粋に精製される」。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでもよく、または含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0111】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下でさらに説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖および重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローン技法によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）取得される抗体については、そのような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリから回収され得る。

【0112】

本開示の好ましい核酸分子には、ＬＡＧ３モノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列またはＣＤＲをエンコードするものが含まれる。Ｖ_ＨおよびＶ_ＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が取得されると、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作され得る。これらの操作において、Ｖ_ＬまたはＶ_ＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーなどの、別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってエンコードされるアミノ酸配列がインフレームに留まるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味するように意図される。

【0113】

Ｖ_Ｈ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得るが、もっとも好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0114】

Ｖ_Ｌ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野において知られ、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。

【0115】

ｓｃＦｖ遺伝子を作成するために、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬをエンコードするＤＮＡ断片は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列が連続した単鎖タンパク質として発現され得るように、フレキシブルリンカーをエンコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をエンコードするものと作動可能に連結され、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域がフレキシブルリンカーによって結合される（例えば、Ｂｉｒｄ等、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ等、（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．米国 ８５：５８７９－５８８３、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照）。

【0116】

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技法を使用して産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性の形質転換、および、ファージディスプレイ技法を含む。キメラまたはヒト化抗体も本技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照し、これらの内容は特に参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

【0117】

本開示の抗体はまた、本技術分野において周知のように、例えば、組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション法（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマによって産生され得る。１つの実施形態において、標準的な分子生物学技法によって取得される部分的または完全長軽鎖および重鎖をエンコードするＤＮＡは、１または複数の発現ベクターに挿入される。したがって、遺伝子は、転写および翻訳調節配列に作動可能に連結される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する意図される機能を担うように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味するように意図される。

【0118】

「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサ、および、抗体遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌに記載される（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサ、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマなど、哺乳類細胞において高いレベルのタンパク質発現を指令するウイルス性要素を含む。代替的に、ユビキチンプロモーターまたはβグロブリンプロモーターなど、非ウイルス性制御配列が使用され得る。さらに、追加で、異なるソースからの配列から構成される制御エレメント、例えば、ＳＶ４０初期プロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長尺反復からの配列を含むＳＲαプロモーターシステムなど（Ｔａｋｅｂｅ等、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。

【0119】

抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同一、または別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作成するために可変領域が使用される。それらは、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にエンコードしている発現ベクターに挿入される。したがって、Ｖ_Ｈセグメントは、ベクター内のＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントは、ベクター内のＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結される。追加的または代替的に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをエンコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、または、異種混合のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。

【0120】

抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本開示の組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起源）および選択可能マーカ遺伝子など、追加の配列を保有し得る。選択可能マーカ遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、選択可能マーカ遺伝子は典型的には、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカ遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共に、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。

【0121】

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をエンコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般に使用される幅広い多種多様の技法、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物または真核生物のいずれの宿主細胞において発現することも理論上可能であるが、真核細胞（哺乳類宿主細胞がもっとも好ましい）における抗体の発現がもっとも好ましい。なぜなら、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞は、原核細胞と比較して、適切に折り畳まれた、免疫活性抗体を組み立てて分泌する可能性が高いからである。

【0122】

本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国 ７７：４２１６－４２２０に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているＤＨＦＲ選択可能マーカと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞を含む。特にＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するために、別の好ましい発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に開示されたＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をエンコードする組み換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入した場合、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは宿主細胞を培養する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。 抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。

【0123】

本開示の抗体は、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）などの免疫複合体を形成するために、治療剤に結合させることができる。適切な治療薬としては、細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸送阻害剤、プロテアソーム阻害薬、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体と治療薬は、好ましくは、ペプチジルリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーなどのような切断可能なリンカーを介して結合される。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号、第６，９８９，４５２号、および第７，１２９，２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８，６５８、ＷＯ０７／０５１，０８１、ＷＯ０７／０５９，４０４、ＷＯ０８／０８３，３１２、およびＷＯ０８／１０３，６９３、米国特許公開２００６００２４３１７、２００６０００４０８１、および２００６０２４７２９５に記載のように調製でき、これらの本開示は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。

【0124】

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結された１または複数の本開示の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書で使用する場合、［二重特異性分子］は、３またはそれ以上の特異性を有する分子を含む。

【0125】

一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＬＡＧ３結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。３つ目の特異性は、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４に対するもので、免疫反応を強化することができる。代替的に、第３の特異性は、抗強化因子（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に伴う表面タンパク質に結合し、これによって標的細胞に対する免疫反応を増加させる分子に対するものであってもよい。例えば、抗増強因子は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＬＡＧ３、またはＩＣＡＭ－１を介して）または他の免疫細胞と結合し、結果として、標的細胞に対する免疫反応の増加をもたらすことができる。

【0126】

二重特異性分子には多くの異なるフォーマットおよびサイズがあり得る。サイズスペクトルの一端では、二重特異性分子は、従来の抗体フォーマットを保持するが、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、異なる特異性を各々が有する２つの結合アームを有する。他の極端な例は、２つの単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）をペプチド鎖で連結した構造を含む二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構造である。中サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。これらのフォーマットおよび他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション、または化学的方法によって調製され得る。例えば、前掲のＫｕｆｅｒ等、Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）、およびｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７ （２０００）、および本明細書に引用された参考文献を参照されたい。
［キメラ抗原受容体］

【0127】

本開示は、抗ＬＡＧ３ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体をさらに提供し、抗ＬＡＧ３ ｓｃＦｖは、本開示の重鎖／軽鎖可変領域および／またはＣＤＲを含む。

【0128】

本開示のキメラ抗原受容体は、（ａ）抗ＬＡＧ３ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）シグナル伝達ドメインおよび／またはコスティミュレーションドメインを含む細胞内ドメインから構成されてもよい。

【0129】

別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、１または複数の抗体またはその抗原結合部分、抗体またはその抗原結合部分をエンコードする１または複数の核酸、１または複数の免疫コンジュゲート、ＣＡＲを保有する１または複数の免疫細胞、および／または１または複数の本開示の二重特異性分子を含む、医薬組成物を提供する。組成物は、任意に、１または複数の追加の薬学的活性成分、例えば、抗癌抗体、抗感染抗体、抗炎症抗体、または免疫反応を高めるための抗体などの別の抗体または薬物など、または抗癌剤、抗感染剤、抗炎症剤、またはコスト調節剤などの別の非抗体治療剤を含有してもよい。本開示の医薬組成物はまた、例えば、抗癌剤、抗感染剤、抗炎症剤、またはコスティミュレーション剤との併用療法で投与することができる。

【0130】

医薬組成物は任意の数の賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤として、担体、表面活性剤、増粘剤、または乳化剤、固体結合剤、分散助剤、または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、着香剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存料、等張剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択および使用は、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）の、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに教示されており、これらの本開示は参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0131】

医薬組成物は、好ましくは（例えば注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に好適である。投与経路に応じて、活性成分を物質でコーティングして、酸の作用およびそれを不活性化し得る他の自然条件から保護することができる。本明細書で使用する「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限定されない。代替的に、本開示の抗体は、局所、表皮または粘膜の投与経路などの非経口経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所的に投与することができる。

【0132】

医薬組成物は、無菌水溶液または分散系の形態であり得る。また、それらはマイクロエマルション、リポソーム、または、高い薬物濃度に好適な他の順序構造で製剤化され得る。

【0133】

単回投与形態を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象、および、特定の投与方法に応じて変動し、一般的に、治療効果を生じさせる組成物の量である。一般的に、この量の範囲は、薬学的に許容される担体と組み合わされた、１００％中、約０．０１％から約９９％の活性成分、好ましくは、約０．１％から約７０％、もっとも好ましくは、約１％から約３０％の活性成分である。

【0134】

最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように投与量が調節される。例えば、単回ボーラスを投与でき、いくつかの分割された用量を経時的に投与でき、または、治療状況の緊急事態による指示に応じて用量を比例して低減または増加させることができる。投与を容易にするために、および、投与量を統一するために、単位用量形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用する単位用量形態とは、治療される対象のための単位投与量として好適な物理的な不連続単位を指す。各単位は、必要な医薬担体に伴い所望の治療効果を生じさせるために算出された活性成分の所定量を含む。抗体は代替的に、徐放性製剤として投与できる。この場合、必要な投与頻度が少ない。

【0135】

抗体の投与については、投与量は、宿主体重の約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または、１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または、３～６か月に１回の投与を伴う。本開示の抗ＬＡＧ３抗体の好ましい投与量は、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は以下の投与スケジュールの１つを使用して与えられる。（ｉ）４週間ごとに６投与量、次に３ヶ月ごと、（ｉｉ）３週間ごと、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重。いくつかの方法において、約１－１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法において、約２５－３００μｇ／ｍｌ）の血漿抗体濃度を達成するように、投与量が調節される。

【0136】

本開示の抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合部分の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度と期間の増加、または疾患苦悩による障害または障害の防止の結果をもたらす。例えば、担癌の対象を治療する場合、「治療上有効な投与量」は好ましくは、未治療の対象と比べて、腫瘍増殖を少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％抑制する。治療上有効な量の治療抗体は、腫瘍の大きさを減少させ、または、そうでない場合、典型的には人または他の哺乳類である対象の症状を緩和することができる。自己免疫疾患を有する対象の治療のために、「治療上有効な投与量」は、好ましくは、未治療の対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％炎症を緩和し、または完全に炎症を除去する。

【0137】

医薬組成物、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤であり得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９７８を参照されたい。

【0138】

治療用組成物は、（１）無針皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４、および４，５９６，５５６号）、（２）マイクロ注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入機器（米国特許第４，４４７，２３３および４，４４７，２２４号）、（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６および４，４７５，１９６号）などの医療機器を介して投与され得る。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0139】

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏの適切な分散を保証するために製剤化され得る。例えば、本開示の治療抗体が血液脳関門を超えることを保証するために、それらは、特定の細胞または臓器への選択的輸送を強化する標的化部分を追加的に含み得るリポソームにおいて製剤化され得る。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、５，３７４，５４８号、５，４１６，０１６号、および５，３９９，３３１号、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５、Ｕｍｅｚａｗａ等、（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８、Ｂｌｏｅｍａｎ等、（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ等、（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０、Ｂｒｉｓｃｏｅ等、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ等、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０、ＫｅｉｎａｎｅｎおよびＬａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、およびＫｉｌｌｉｏｎおよびＦｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。

【0140】

本開示の医薬組成物は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ用途があり、例えば、癌、炎症性疾患、または感染症疾患、またはより一般的には癌または感染症疾患の患者における免疫反応増強、または自己免疫疾患などの炎症性疾患の患者の病巣における免疫細胞減少を含む、治療および／または防止での有用性を有する。医薬組成物は、人間の被験者に、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで、腫瘍増殖を抑制するため、病原体を減少または除去するため、または自己免疫性炎症を緩和するために投与することができる。

【0141】

癌細胞の増殖および生存を抑制する本開示の医薬組成物の能力を考慮すると、本開示は、腫瘍の成長が対象において抑制されるように本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要としている対象における腫瘍細胞の成長を抑制するための方法を提供する。本開示の医薬組成物によって治療できる腫瘍の非限定的な例としては、結腸腺癌、乳癌、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、および胃癌（元および／または転移性）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本開示の医薬組成物は、本開示の組成物によって成長が抑制され得る難治性または再発性の悪性腫瘍にも適用され得る。

【0142】

本開示の医薬組成物は、病原体を低下または除去するために使用されてもよい。したがって、本開示は、それを必要とする対象において、ウイルス、細菌、真菌、またはマイコプラズマによって引き起こされる、感染症を治療するための方法を提供し、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含んでいる。

【0143】

本開示の医薬組成物は、炎症性疾患を治療または緩和するために使用され得る。したがって、本開示は、それを必要とする対象における自己免疫疾患を治療するための方法を提供し、特に病巣部またはその周辺に、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含んでいる。自己免疫疾患は、プラーク乾癬の場合がある。

【0144】

本開示のこれらの方法および他の方法は下でさらに詳細に説明される。

【0145】

別の態様では、本開示は、本開示の医薬組成物を、対象における腫瘍増殖の抑制に有効な１または複数の追加の抗体または非抗体剤と共投与する併用療法の方法を提供する。１つの実施形態において、本開示は、本開示の医薬組成物と、抗ＴＩＭ３抗体、抗抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体などの１または複数の追加の抗体を対象に投与することを含む、対象における腫瘍増殖を抑制するための方法を提供する。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、標準的な癌治療とさらに併用されてもよい。例えば、ＬＡＧ３シグナル遮断は、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ‐１阻害、さらに化学療法レジームとも組み合わせることができる。例えば、化学療法剤は、本開示の医薬組成物と共に投与することができ、これは細胞傷害性剤であってもよい。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、５－ＦＵは抗ＬＡＧ３療法を受けている患者に投与される。抗ＬＡＧ３療法と併用し得る他の治療法としては、インターロイキン２（ＩＬ－２）の投与、放射線、手術、またはホルモン遮断などが含まれるが、これらに限定されない。

【0146】

別の態様では、本開示は、本開示の医薬組成物が、細菌、ウイルス、真菌、および／またはマイコプラズマなどの病原体を低減または除去するのに有効な１または複数の追加の抗体または非抗体剤と共投与される併用療法の方法を提供する。例えば、本開示の医薬組成物は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗マイコプラズマ剤などの抗感染剤とともに投与されてもよい。

【0147】

別の態様では、本開示は、本開示の医薬組成物を、プラーク乾癬などの自己免疫疾患を治療または緩和するのに有効な１または複数の追加の抗体または非抗体剤と共投与する併用療法の方法が提供される。例えば、本開示の医薬組成物は、プラーク乾癬治療のためのＩＬ－２阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤（例えば、Ｔａｌｔｚ^R Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、および／または抗ＩＬ－２３阻害剤などの自己免疫疾患の治療剤と共に投与されてもよい。

【0148】

本明細書において説明される治療剤の組み合わせは、薬学的に許容される担体における単一の組成物として同時に投与され得るか、または、薬学的に許容される担体における各薬剤と共に別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組み合わせは、順次に投与され得る。

【0149】

さらに、併用療法の１より多くの用量が順次に投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点において、逆になり得、または、同じ順序に維持され得、連続投与は、同時投与、または、それらの任意の組み合わせと組み合わされ得る。

【0150】

本開示は以下の例においてさらに図示されるが、これは、さらなる限定として解釈されるべきでない。本出願全体において引用される、すべての図面およびすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願公開の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
［例］
［実施例１ ヒト、サルまたはマウスＬＡＧ３を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株の構築］

【0151】

ヒト、サルまたはマウスのＬＡＧ３タンパク質を安定的に過剰発現する細胞株を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ，ＮＪ，中国）を用いて構築した。簡潔に説明すると、ヒト、サルまたはマウスのＬＡＧ３ ｃＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号、３７，３８，３９）を合成し、次に、制限部位ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの間でｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏベクター（北京 Ｉｎｏｖｏｇｅｎ、中国）にサブクローニングした。レンチウイルスは、リポフェクタミン（登録商標）３０００キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）の説明書にしたがって、ｐＬＶ－ＥＧＦＰ（２Ａ）－Ｐｕｒｏ－ＬＡＧ３、ｐｓＰＡＸおよびｐＭＤ２．Ｇプラスミドを共導入してＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）に生成させた。共導入後３日目に、１０％ＦＢＳ（Ｃａｔ＃：ＦＮＤ５００，Ｅｘｃｅｌｌ）を添加した細胞培養液（ＤＭＥＭ，Ｃａｔ＃：ＳＨ３００２２．０１，Ｇｉｂｃｏ）からレンチウイルスを採取した。次に、このＨＥＫ２９３Ａ細胞にレンチウイルスを感染させ、ヒト、サルまたはマウスＬＡＧ３に安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株、すなわちＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／ｒｈ ＬＡＧ３細胞およびＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３細胞をそれぞれ生成した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ａ細胞を、０．２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｃａｔ＃：Ａ１１１３８－０３，Ｇｉｂｃｏ）を含む培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で７日間培養した。ヒトＬＡＧ３およびサルＬＡＧ３タンパク質の発現は、市販の抗ＬＡＧ３抗体（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，米国，Ｃａｔ＃：３６９２０５）を用いてＦＡＣＳにより確認した。同様に、市販の抗マウスＬＡＧ３抗体（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＬＡＧ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，米国，Ｃａｔ＃：１２５２０７）を用いて、マウスＬＡＧ３タンパク質の発現をＦＡＣＳにより確認した。
［実施例２ ヒトＬＡＧ３に対するモノクローナルマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の生成］

【0152】

マウス抗ヒトＬＡＧ３モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、従来のハイブリドーマ融合技術を用い、いくつかの改変を加えて生成した。
［免疫化］

【0153】

１３匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ，北京，中国）に、下の表２の方式にしたがって、リコンビナントヒトＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０２Ｈ）とリコンビナントサルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（ＡＣＲＯ，中国，Ｃａｔ＃：ＬＡ３－Ｃ５２５２）を注射した。ヒトＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃおよびサルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃタンパク質は、等体積のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＩＧＭＡ，米国，Ｃａｔ＃：Ｆ５８８１－１０＊１０ＭＬ），Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ´ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＩＧＭＡ，米国，Ｃａｔ＃：Ｆ５５０６－６＊１０ＭＬ）またはＰＢＳを用いて超音波処理によって乳化させた。

【0154】

［表２：免疫化方式］

【表2】

【0155】

各ブーストの１週間後、各マウスから５０μｌのマウス血清を採取し、組換えヒトＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０８Ｈ），サルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（ＡＣＲＯ，中国，Ｃａｔ＃：ＬＡ３－Ｃ５２５２）およびマウスＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：５３０６９－Ｍ０８Ｈ）を用いたＥＬＩＳＡによる力価測定に使用した。また、実施例１で調製したヒトＬＡＧ３、サルＬＡＧ３またはマウスＬＡＧ３を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ａを用いて、ＦＡＣＳにより力価測定を行った。

【0156】

最終ブースト後のＥＬＩＳＡとＦＡＣＳ解析結果に基づいて、血清力価の高い１０匹のマウスを選択し、ハイブリドーマ細胞株を生成した。ハイブリドーマ細胞株の生成

【0157】

ハイブリドーマ細胞株は、従来のハイブリドーマ融合技術を用い、軽微な変更を加えて生成した。

【0158】

最終追加免疫の４日後、マウスを犠牲にし、脾臓を採取して、ＰＢＳにおいて単個細胞浮遊液として調製した。脾臓細胞はＤＭＥＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ＃：ＳＨ３０２４３．０１Ｂ）で３回洗浄した。対数期における生存骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８１）を、ネズミ脾臓細胞と１：４の比で混合した。次に細胞を２回洗浄し、次にＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃：Ｐ７１８１）を用いて細胞融合を実行した。融合後の細胞をＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、１０％ＦＢＳと１Ｘ ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ０２６２）を添加した細胞成長培地（ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：Ｃ２２４００５００ＣＰ））にて懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェルあたり２００μｌ（５×１０^４細胞／ウェル）ずつ平板培養し、３７℃、加湿５％、ＣＯ_２インキュベータで７日間インキュベートした。次に、成長培地を１０％ＦＢＳ＋１Ｘ ＨＴを添加した新鮮な成長培地に交換した。２～３日後、ハイブリドーマ細胞はＥＬＩＳＡとＦＡＣＳでスクリーニングされた。
［ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング］

【0159】

まず、Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＥＬＩＳＡ 結合アッセイを用いて、ヒトＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０８Ｈ）に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングした。ヒトＬＡＧ３結合体を産生するクローンは、アカゲザルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（ＡＣＲＯ，中国，Ｃａｔ＃：ＬＡ３－Ｃ５２５２）およびマウスＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：５３０６９－Ｍ０８Ｈ）を用いてサルまたはマウスＬＡＧ３との交差反応能力についてさらに試験した。

【0160】

ＥＬＩＳＡアッセイにより、２１１のハイブリドーマクローンがヒトとサルの両方のＬＡＧ３タンパク質に特異的結合することが特定された。ＦＡＣＳによるハイブリドーマ細胞株のスクリーニング

【0161】

さらに、実施例１で調製したＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／ｒｈ ＬＡＧ３細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３細胞を用いて、ＨＥＫ２９３Ａ細胞上に発現したヒト、アカゲザル、またはマウスのＬＡＧ３タンパク質に対する結合能力を２１１個のハイブリドーマクローンについてスクリーニングを行った。

【0162】

ＦＡＣＳスクリーニングに基づいて、ＨＥＫ２９３Ａ／ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３細胞およびＨＥＫ２９３Ａ／ｒｈ ＬＡＧ３細胞のいずれに対しても高い結合能を示す７８個の陽性クローンが得られた。
［Ａｎｔｉ－ＬＡＧ３ 抗体を産生するハイブリドーマクローンのサブクローニング］

【0163】

７８のハイブリドーマクローンが２回のサブクローニングを受けた。サブクローニングの間、各親クローンからの複数のサブクローン（ｎ＞３）が選択され、上記のように、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイによって確認された。このプロセスを通じて選択されたサブクローンは、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞として定義された。最終的に、ヒトとサルの両方のＬＡＧ３に高い結合能を持つ４７個のサブクローン（各親クローンから１個のサブクローン）を得ることができた。
［実施例３ マウス抗ＬＡＧ３抗体によるＤａｕｄｉ細胞上のＭＨＣ ＩＩへのヒトＬＡＧ３結合の抑制］

【0164】

ＬＡＧ－３のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を抑制するクローン能力を試験するために、ヒトＦｃ（ｈＬＡＧ－３－ｈＩｇ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０２Ｈ）と結合したヒトＬＡＧ－３細胞外ドメインなどを含むＬＡＧ－３融合タンパク質上で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイが実行され、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＤａｕｄｉ細胞が培養された。

【0165】

簡潔に説明すると、４７個のハイブリドーマ細胞から各々採取した細胞培養液１００μｌに、１０μｇ／ｍｌのｈＬＡＧ－３－ｈＩｇ融合タンパク質を添加した。２×１０^５Ｄａｕｄｉ細胞を添加する前に、混合物を室温で２０分間インキュベートした。混合物をさらに４℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し（５分、３００ｘｇ）、１×ＰＢＳバッファ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．４）で２回洗浄し、組換えＰＥ標識Ｆ（ａｂ´）２抗ｈＩｇＧ Ｆｃ（１：２００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国，Ｃａｔ＃：Ｈ１０１０４）とともに４℃で３０分インキュベートした。細胞はＰＢＳで１回洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＬＡＧ－３－ｈＩｇの結合を試験した。ブランクウェルにはｈＬＡＧ－３－ｈＩｇを添加しないで、ネガティブコントロールとしてｈＬＡＧ－３－ｈＩｇ ｗｉｔｈ Ｈｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｉｎ，米国，Ｃａｔ＃：ＬＴ１２０３１）を用いた。ポジティブコントロールとして、参照抗体ＢＭＳ－９８６０１６（ＢＭＳと呼ばれる、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／カッパ定常領域を持つＥＰ２３２０９４０Ｂ１に開示されたアミノ酸配列を用いて調製）＋ｈＬＡＧ－３－ｈＩｇが使用された。

【0166】

その結果を図１にまとめたが、ＢＭＳはＤａｕｄｉ細胞上のＭＨＣ ＩＩ複合体へのＬＡＧ３融合タンパク質の結合を完全に阻害できることを示す。試験したマウス抗ｈＬＡＧ３抗体のうち、ＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ結合を完全に阻害したものは全部で１２クローンであった。
［実施例４ マウス抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体の精製とアイソタイプの決定］

【0167】

ＬＡＧ３－ＭＨＣＩＩ阻害活性を有する１２個のクローンを選択し、さらなる特性評価を行った。まず、モノクローナルマウス抗体の精製を行った。簡潔に説明すると、１％ＨＴ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃：１１０６７－０３０）が添加された１００ｍｌの新鮮な無血清培地（Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ＃：１２０４５－０７６）を各々が有するＴ１７５細胞培養フラスコにおいて各サブクローンのハイブリドーマ細胞を培養させた。３７℃の５％ＣＯ_２を有するインキュベータに細胞培養液を１０日間維持した。細胞培養液を採取し、次に３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次に０．２２μｍ膜を用いた濾過を行い、細胞残屑を除去した。次に、前平衡タンパク質Ａ親和性カラム（ＧＥ、米国、Ｃａｔ＃：１７０４０５０１）を使用してモノクローナルマウス抗体を精製し、溶出緩衝液（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０～ｐＨ３．５）で溶出した。次に、抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で維持し、ＮａｎｏＤｒｏｐ器具を使用して、その濃度を決定した。

【0168】

精製された各抗体のアイソタイプは、製造元のマニュアルにしたがって、Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｋａｐｐａ ａｎｄ Ｌａｍｂｄａ－Ｍｏｕｓｅ（Ｔｈｅｒｍａｌ、米国、Ｃａｔ＃：２６１７９）およびＭｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ、米国、Ｃａｔ＃：ＩＳ０２－１ＫＴ）を使用することによって決定された。

【0169】

１０１Ｆ４を含むほとんどのクローンはＩｇＧ１／ｋａｐｐａ抗体を産生し、１３４Ｇ１０はＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａ抗体を産生した。１３４Ｇ１０および１０１Ｆ４の発現力価はそれぞれ、８．６ｍｇ／Ｌおよび３．４ｍｇ／Ｌであった。
［実施例５ ヒトおよびサルのＬＡＧ３に結合した精製マウス抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体］

【0170】

精製されたマウス抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、まずＥＬＩＳＡアッセイにより、リコンビナントヒト、サル、マウスＬＡＧ３タンパク質との結合能を試験した。

【0171】

ＥＬＩＳＡプレートに５００ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０８Ｈ）５０μｌを４℃にて一晩コーティングした。ウェルを２００μｌの阻害緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ）で室温で２時間阻害して、次に、連続希釈した抗ＬＡＧ３抗体（４０μｇ／ｍｌから開始）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で３回洗浄し、５０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，米国，Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ｍｌ）を加え、室温で１時間インキュベートした。新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（ＢＤ、米国、Ｃａｔ＃：５５５２１４）を用いて、プレートを室温で５分間開発した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｅｓ、米国）で４５０ｎｍの吸光度を読んだ。

【0172】

さらに、サルまたはマウスのＬＡＧ３に対する１２種類のＬＡＧ３ ｍＡｂｓの種間交差反応性を直接ＥＬＩＳＡ法で試験した。簡潔に説明すると、５０μｌの５００ｎｇ／ｍｌのサルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈＦｃ（ＡＣＲＯ，中国，Ｃａｔ＃：ＬＡ３－Ｃ５２５２）またはマウスＬＡＧ３－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：５３０６９－Ｍ０８Ｈ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次に、１００μｌずつ連続希釈した抗ＬＡＧ３抗体（４０μｇ／ｍｌから開始）とインキュベートを行った。次に、ＨＲＰを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，米国，Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ｍｌ）を添加した。ポジティブコントロールとしてＢＭＳ－９８６０１６を使用した。

【0173】

代表的な２つの抗体と参照抗体のＥＣ_５０値を表３にまとめた。データによると、本開示の１２種類の抗体すべてがヒトおよびサルのＬＡＧ３に結合したが、いずれもマウスのＬＡＧ３とは交差反応がないことが示された。

【0174】

［表３：代表的なマウス抗ＬＡＧ３抗体とヒト、サル、またはマウスＬＡＧ３との結合能］

【表3】

［実施例６ ＨＥＫ２９３Ａ細胞上に発現させたヒトおよびサルＬＡＧ３タンパク質に結合させたマウス抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体］

【0175】

ＨＥＫ２９３Ａ細胞上に発現したヒト、サルおよびマウスのＬＡＧ３タンパク質に対する抗ＬＡＧ３抗体の結合能を決定するために、実施例１で生成したヒト、サルおよびマウスのＬＡＧ３をそれぞれ安定的に過剰発現させたＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いてＦＡＣＳによる細胞ベースの結合アッセイを実行した。簡潔に説明すると、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に入れた１０^５個のＨＥＫ２９３Ａ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、次に５０μｌの連続希釈した抗ＬＡＧ３抗体（５倍希釈、４０μｇ／ｍｌから開始）を添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、５００倍に希釈したＡＰＣ結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，米国，Ｃａｔ＃：４０５３０８）をプレートに添加した。４℃で１時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次に、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）を使用して細胞蛍光を観察した。

【0176】

１０１Ｆ４、１３４Ｇ１０および参照抗体のＥＣ_５０値を以下の表４にまとめた。データによると、本開示のマウス抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体は、すべてがヒトおよびサルのＬＡＧ３に対して高い結合能を示したが、マウスＬＡＧ３には結合しないことが示された。

【0177】

［表４：マウス抗ＬＡＧ３抗体とヒト、サル、マウスＬＡＧ３との結合活性］

【表4】

［実施例７ エピトープビニング］

【0178】

エピトープビニングのために、競合ＥＬＩＳＡアッセイを実行した。簡潔に説明すると、９６ウェルプレートに５μｇ／ｍｌのＢＭＳを１ウェルあたり５０μｌでコーティングし、４℃で一晩静置した。２００μｌの阻害緩衝液（１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清および０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ）を用いて、ウェルを室温で２時間阻害した。Ｈｕｍａｎ ＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０８Ｈ），０．５μｇ／ｍｌ，１ウェルあたり５０μｌをプレートに加え、さらに室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μｌの１μｇ／ｍＬ抗ＬＡＧ３抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次に１:２００００に希釈した抗マウスＦｃ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ，米国，Ｃａｔ＃：Ａ９３０９－１ＭＣ）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳで３回洗浄し、新たに調製したＵｌｔｒａ－ＴＭＢ（Ｈｕｚｈｏｕ Ｙｉｎｇｃｈｕａｎｇ，中国，Ｃａｔ＃：ＴＭＢ－Ｓ－００３）で５分間、室温で開発した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＲ ｉ３Ｘ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ４５０）。

【0179】

１０１Ｆ４を含む５つのマウス抗体は、参照抗体であるＢＭＳと抗原結合において競合し、これらの抗体とＢＭＳは同一または類似のエピトープに結合することが示された。１３４Ｇ１０を含む残りの抗体は、抗原結合において参照抗体と競合せず、これらの抗体はＢＭＳと比較して異なるエピトープに結合していることが示された。
［実施例８ 精製マウス抗ＬＡＧ３抗体は、ヒトＬＡＧ３とＤａｕｄｉ細胞上のＭＨＣ ＩＩとの結合を抑制した。］

【0180】

ＭＨＣ ＩＩ分子へのＬＡＧ３結合を阻害するマウス抗ＬＡＧ３抗体の能力を、実施例３に記載したようにＦＡＣＳによって試験した。

【0181】

簡潔に説明すると、ＰＢＳで連続希釈したマウス抗ＬＡＧ３抗体５０μｌ（５倍希釈、最高濃度４０μｇ／ｍｌ）を、１０μｇ／ｍｌのｈＬＡＧ－３－ｈＩｇ融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０２Ｈ）５０μｌとともに室温で２０分間インキュベートした。次に、混合物を加え、１００μｌのＰＢＳバッファ中で２×１０^５のＤａｕｄｉ細胞とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレット化（３分間、４００ｘｇ）し、１×ＰＢＳバッファで２回洗浄し、リペレット化した後、リコンビナントＰＥ標識Ｆ（ａｂ´）２抗ｈＩｇＧ Ｆｃ（１：２００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，米国，Ｃａｔ＃：Ｈ１０１０４）を加え、４℃、３０分でインキュベートし、１×ＰＢＳで１回洗浄した。ＬＡＧ－３－ｍＩｇ結合の解析は、ＦＡＣＳフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。ポジティブコントロールとしてＢＭＳを使用した。

【0182】

データによると、本開示の抗体はすべてがＬＡＧ３のＭＨＣ ＩＩ分子への結合を阻害することが示された。１０１Ｆ４、１３４Ｇ１０および参照抗体のＥＣ_５０値は以下の表５にまとめられており、１３４Ｇ１０のＥＣ５０はＢＭＳのそれより低い値であった。

【0183】

［表５：ＬＡＧ３－ＭＨＣＩＩ相互作用に対するマウス抗ＬＡＧ３抗体の阻害能力］

【表5】

［実施例９ マウス抗ＬＡＧ３抗体によるＴ細胞活性化促進効果］

【0184】

ＡＰＣを媒介するＴ細胞活性化に対するマウス抗ＬＡＧ３抗体の役割を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによって検討した。

【0185】

簡潔に説明すると、健康なヒトドナーの血液試料からＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取して、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させた。
ＰＢＭＣを３７℃インキュベータで２時間培養し、容器壁に付着した細胞を単離単球として採取した。単球は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：７９５４－ＧＭ）と１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：６５０７－ＩＬ）とともにプレート培養された。３日後、培養培地の半分を新鮮培地に交換した。培養６日目に、培養培地を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ，米国，Ｃａｔ＃２１０－ＴＡ－１００）、１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃７２７０－ＩＬ－０２５）、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ２（ＴＯＣＲＩＳ，米国，Ｃａｔ＃３６３－２４－６）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃２１０－ＬＢ－０２５）を含む新鮮培地で置き換えた。この細胞をさらに２日間培養して、樹状細胞（ＤＣ）を取得した。

【0186】

別の健康なヒトドナーの血液試料からＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって集め、次にＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させた。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国，Ｃａｔ＃：１１３４６Ｄ）を用いて、製造元の指示にしたがってＰＢＭＣから分離された。

【0187】

９６ウェルＵ底プレート中の１００μｌ／ウェル完全培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に、最初のドナーからのＤＣは２．５×１０４細胞／ウェルで播種し、２番目のドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞は５×１０^４細胞／ウェルで播種した。抗ＬＡＧ３抗体（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、またはコントロール抗体Ｈｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｉｎ，米国，Ｃａｔ＃：ＬＴ１２０３１）を１ウェルあたり５０μｌを細胞に添加し、さらにプレートを７２時間培養した。培養上清中のＩＦＮ－γ濃度は、ＩＦＮ－γ定量キット（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：ＳＩＦ５０）を用いたＥＬＩＳＡ法により、製造元のプロトコルにしたがって決定した。アッセイは３連で行われた。ブランクウェルには単離したＣＤ４＋Ｔ細胞のみを入れ、ＤＣ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＨｅｌをネガティブコントロールとして使用した。ＤＣ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞および１００μｇ／ｍｌのＢＭＳをポジティブコントロールとして使用した。

【0188】

図２に示すように、１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０を含む６つの抗体は、Ｈｅｌ制御と比較して、Ｔ細胞による強化ＩＦＮ－γの分泌を促進し、最も高いＩＦＮ－γレベルが、マウス抗ＬＡＧ３抗体１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０で治療したウェルで検出された。
［実施例１０ １０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体のキメラ抗体の発現と精製］

【0189】

さらに、１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体について検討した。２つの候補の重鎖／軽鎖可変領域配列を、文献（Ｊｕｓｔｅ等、（２００６）、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１、３４９（１）：１５９－６１）に記載されているように、退化プライマーのセットを用いた標準的なＰＣＲ法を用いてハイブリドーマ細胞からクローニングし、次に、シーケンシングした。配列ＩＤ番号と配列を表１および表６にまとめた。重鎖可変領域＋ヒトＩｇＧ４定常領域（変異Ｓ２２８Ｐあり）をエンコードする配列、または軽鎖可変領域＋ヒトカッパ定常領域（それぞれ配列番号３５および３６に記載の重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列）をエンコードする配列を、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位間でｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，米国）に挿入して、発現ベクターを構築した。ここで、重鎖可変領域のＣ末端をヒトＩｇＧ４定常領域のＮ末端に連結し、軽鎖可変領域のＣ末端をヒトカッパ定常領域のＮ末端に連結した。

【0190】

発現ベクターは、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞（Ｃｏｂｉｏｅｒ、ＮＪ、中国）にトランスフェクトされたＰＥＩである。具体的には、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ^ＴＭ（登録商標）２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：１２３３８－０１８）で培養し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて発現ベクターをＤＮＡでトランスフェクトさせた。ＰＥＩの比率は１：３、細胞培地１ｍｍあたり１．５μｇのＤＮＡを導入した。トランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞を、１２０ＲＰＭで振とうしながら、５％ＣＯ_２下で、３７℃でインキュベータにおいて培養した。１０－１２日後、培養上清を採取し、実施例４に記載したようにして上清からモノクローナル抗体を精製した。本明細書では、キメラ抗体を「ＸＸ－ＣＭ」とも呼ぶ。
［実施例１１ ＨＥＫ２９３Ａ細胞上に発現させたヒトおよびサルＬＡＧ３タンパク質に結合したキメラ抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体１０１Ｆ４－ＣＭおよび１３４Ｇ１０－ＣＭの生成］

【0191】

キメラ抗ＬＡＧ３抗体１０１Ｆ４－ＣＭおよび１３４Ｇ１０－ＣＭを、実施例６に記載のプロトコルに従い、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／ｒｈ ＬＡＧ３細胞およびＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３細胞への結合能力をそれぞれ特性評価した。

【0192】

図３に示すように、２つのキメラ抗体は、ヒトＬＡＧ３（図３のＡ）およびサルＬＡＧ３（図３のＢ）の両方に対して高い結合能を有するが、マウスＬＡＧ３（図３のＣ）には結合しなかった。
［実施例１２ 例示的な抗ＬＡＧ３抗体のヒト化］

【0193】

上記の特性評価とアッセイに基づき、１０１Ｆ４と１３４Ｇ１０はヒト化され、さらに検討された。マウス１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体のヒト化は、米国特許第５，２２５，５３９（本明細書に参照として組み込まれる）および以下に記載のように、十分に確立されたＣＤＲ－移植方法を用いて実行された。

【0194】

マウス１０１Ｆ４、１３４Ｇ１０抗体のヒト化用アクセプターフレームワークを選択するために、１０１Ｆ４、１３４Ｇ１０の軽鎖、重鎖可変領域配列をＮＣＢＩウェブサイトのヒト免疫グロブリン遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）とブラストさせた。１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０と最も相同性が高いヒト生殖細胞系のＩＧＶＨおよびＩＧＶＫをヒト化のためのアクセプターとして選択した。１０１Ｆ４では、ヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ１－２４＊０１が選択され、ヒト軽鎖アクセプターはＩＧＫＶ１－３３＊０１が選択された。１３４Ｇ１０では、ヒト重鎖アクセプターはＩＧＨＶ３－２１＊０１が選択され、ヒト軽鎖アクセプターはＩＧＫＶ４－１＊０１が選択された。

【0195】

ＣＤＲループ構造を支援する重要な役割を果たしていると考えられるフレームワーク残基を特定するべく、１０１Ｆ４と１３４Ｇ１０の可変ドメインについ３次元構造のシミュレートを行い、これに基づいてヒト化抗体における逆突然変異を設計した。

【0196】

上記の構造モデリングに基づき、１０１Ｆ４の重鎖について５つの潜在的な逆突然変異（Ｍ７０Ｌ、Ｅ７２Ａ、Ｖ２４Ａ、Ｖ６８Ａ、Ｔ９８Ｇ）が特定され、１０１Ｆ４の軽鎖について４つの逆突然変異（Ｔ６９Ｑ、Ｆ７１Ｙ、Ｍ４Ｉ、Ｙ３６Ｆ）が特定された。そして、１３４Ｇ１０の重鎖には２つの潜在的な逆突然変異（Ｇ４４ＲとＳ４９Ｇ）が特定され、１３４Ｇ１０の軽鎖には３つの逆突然変異（Ｄ９Ｓ、Ｇ１０６Ａ、Ｓ６９Ｔ）が特定された。

【0197】

表１に示すように、１０１Ｆ４と１３４Ｇ１０の両方について、３つのヒト化重鎖可変領域と３つのヒト化軽鎖可変領域が設計され、それぞれ合計５つのヒト化抗体が生成された。ヒト化抗体の配列と配列ＩＤ番号を表１および表６にまとめた。

【0198】

重鎖可変領域＋ヒトＩｇＧ４定常領域をエンコードする配列（変異Ｓ２２８Ｐあり）、および軽鎖可変領域＋ヒトカッパ定常領域をエンコードする配列（それぞれ、配列番号３５および３６に記載される重鎖定常領域および軽鎖定常領域のアミノ酸配列）を化学的に合成した後、ＥｃｏＲ Ｉ ／ Ｘｈｏ ＩおよびＣｌａ Ｉ ／ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を用いてＧＳ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にそれぞれサブクローニングし、重鎖可変領域のＣ末端をヒトＩｇＧ４定常領域のＮ末端に連結し（突然変異Ｓ２２８Ｐあり）、軽鎖可変領域のＣ末端をヒトカッパ定常領域のＮ末端に連結した。すべての発現構築をＤＮＡ配列によって確認した。ＥＸＰｉＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）に重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターをトランスフェクトし、実施例１０に記載のプロトコルに従い、５個のヒト化１０１Ｆ４抗体と５個のヒト化１３４Ｇ１０抗体を一時的に発現させた。ヒト化抗体は、実施例４に記載したように精製した。
［実施例１３ ヒト化１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体の特性評価］

【0199】

ヒト化１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体を、実施例６に記載のプロトコルに従い、ＨＥＫ２９３Ａ／ヒトＬＡＧ３細胞、ＨＥＫ２９３Ａ／ｒｈ ＬＡＧ３細胞、およびＨＥＫ２９３Ａ／マウスＬＡＧ３細胞への結合の能力について特性評価した。結果を図４に示す。

【0200】

これらのヒト化抗体は、実施例８のプロトコルにしたがって、Ｄａｕｄｉ細胞上に発現したＭＨＣ ＩＩへのヒトＬＡＧ３の結合を阻害する能力についても試験された。そのデータを図５に示した。

【0201】

キメラおよびヒト化１０１Ｆ４および１３４Ｇ１０抗体のＴ細胞応答を刺激する能力は、実施例９のプロトコルに従い、いくつかの改変を加えて、ＭＬＲアッセイによって決定した。簡潔に説明すると、１人の健康なヒトのドナーの血液試料からＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって集め、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させた。ＰＢＭＣを３７℃のインキュベータで２時間培養し、容器壁に付着した細胞を単離単球として採取した。単球は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：７９５４－ＧＭ）および１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：６５０７－ＩＬ）とともに２４ウェルプレート中で培養された。３日後、培地の半分を新鮮培地に交換した。培養６日目に、培養培地を、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－４、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ，米国，Ｃａｔ＃２１０－ＴＡ－１００）、１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃７２７０－ＩＬ－０２５）、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ２（ＴＯＣＲＩＳ、米国、Ｃａｔ＃３６３－２４－６）および、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ，米国，Ｃａｔ＃２１０－ＬＢ－０２５）を含む新鮮培地で置き換えた。この細胞をさらに２日間培養してＤＣを生成した。次に、別の健康なヒトドナーの血液試料からＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって採取し、次にＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国，Ｃａｔ＃：１１３４６Ｄ）を用いて、製造元の指示にしたがってＰＢＭＣから分離された。最初のドナーからのＤＣは２．５×１０^４細胞／ウェルで播種され、２番目のドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞は５×１０^４細胞／ウェルで、９６ウェルＵ底プレートに１００μｌの完全培地（９０％ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中に播種された。抗ヒトＰＤ－１抗体（ニボルマブ、α－ＰＤ １とも呼ばれ、米国特許第８，００８，４４９号明細書に開示されたアミノ酸配列を用いて調製されたものであって、ヒトＩｇＧ４／カッパ定常領域を有する、１ウェルあたり１００μｌ、最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、さらにプレートを５日間培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にα－ＰＤ １（１μｇ／ｍｌ）を含む完全培地１００μｌと、抗ＬＡＧ３抗体（１００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、または４μｇ／ｍｌの濃度）またはコントロール抗体Ｈｅｌ（ＬｉｆｅＴｅｉｎ、米国、Ｃａｔ＃：ＬＴ１２０３１）を含む完全培地を１００μｌ添加した。このプレートをさらに７２時間培養した。ＩＦＮ－γ濃度は、ＩＦＮ－γレベル判定キット（Ｒ＆Ｄ、米国、Ｃａｔ＃：ＳＩＦ５０）を用いて、製造元のプロトコルにしたがってＥＬＩＳＡ法により決定した。アッセイは３連で行われた。ポジティブコントロールとしてＢＭＳを使用した。

【0202】

図４に示すように、ヒト化１３４Ｇ１０抗体は対応するキメラ抗体と同様の結合活性を示し、ヒト化１０１Ｆ４抗体間では結合活性の差が存在した。

【0203】

図５に示すように、すべてのヒト化１０１Ｆ４抗体および１３４Ｇ１０抗体は、ＭＨＣ ＩＩへのＬＡＧ３結合に対して、それぞれのキメラ抗体と同様の阻害能力を有しており、ＢＭＳのそれと比較して同等またはそれ以上の阻害能力を有していた。

【0204】

図６に示すように、すべてのヒト化１０１Ｆ４抗体および１３４Ｇ１０抗体は、αＰＤ－１前処理したＴ細胞活性化を促進し、ＩＦＮ－γ値はＢＭＳ群と同等またはそれより高かった。１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３抗体は、最も優れたＴ細胞応答促進効果を示した。
［実施例１４ ファージディスプレイによるヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２の親和性成熟］

【0205】

本明細書における抗体の結合活性／親和性をさらに改善させるため、親和性成熟のためにファージディスプレイ技法により１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２を選択した。簡潔に説明すると、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２の重鎖および軽鎖ＣＤＲにおいて、結合活性／親和性に重要と思われる残基を特定するために、３次元構造モデリング・シミュレーションを実行した。特定されたＣＤＲ残基は、特別に設計されたプライマーと部位指向性変異誘発の標準プロトコルを用いたＰＣＲにより、重鎖／軽鎖変異導入に使用された。次に、ファージディスプレイライブラリーを構築し、ｈＬＡＧ３－ｈＦｃ結合アガロースビーズを用いてバイオパニングを受けた。３回のスクリーニングと濃縮の後、高結合員を選択し、採取し、次に細菌細胞に感染させるために使用した。細菌のコロニーを持ち上げ、９６ウェルプレート上で培養させた。細胞ベースのＥＬＩＳＡを実行し、後にシーケンシングされた高結合員を特定した。重鎖および軽鎖のＣＤＲの良性変異を特定し、次にそれを用いて新しいファージディスプレイライブラリーを構築し、さらに３回のバイオパニングを受けた。最も結合力の高い１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８が特定されたが、これは親クローン１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２と比較して、ＶＨ ＣＤＲ３領域に３つの変異、ＶＬ ＣＤＲ３領域に１つの変異を含んでいた。次に、全長のＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／ｋａｐｐａ抗体としてＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させた。

【0206】

１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２および１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８のヒトＬＡＧ３への結合活性を、実施例５のプロトコルにしたがって、ＥＬＩＳＡ法により試験した。ヒトＬＡＧ３、ｒｈＬＡＧ３またはマウスＬＡＧ３を発現するＨＥＫ２９３細胞に対するこれら２つの抗体の結合活性を、実施例６に記載のプロトコルに従いＦＡＣＳで試験した。さらに、活性化したヒトＰＢＭＣに対する２つの抗体の結合活性をＦＡＣＳで調査した。簡潔に説明すると、ヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心分離で採取し、次に完全培地（ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ＋ヒトＩＬ－２ （２０ ＩＵ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ＃：２０２－ＩＬ）＋ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃：１１１３２Ｄ））に３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベータ下で２日間再懸濁させて活性化Ｔ細胞を取得した。次に、細胞を採取し、実施例６に記載したようにＦＡＣＳで試験した。

【0207】

その結果を図７に示したが、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８は、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２と比較して、遊離および細胞表面発現ヒトおよびサルＬＡＧ３タンパク質に対する結合活性が著しく向上していることが示唆された。
［実施例１５ ヒトおよびサルのＬＡＧ３に対する例示的なキメラまたはヒト化抗ＬＡＧ３抗体のＳＰＲによる結合親和性］

【0208】

キメラ抗体とヒト化抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ８Ｋ器具（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ヒトとサルのＬＡＧ３タンパク質に対する結合親和性を試験した。簡潔に説明すると、ヒトＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，中国，Ｃａｔ＃：１６４９８－Ｈ０２Ｈ）、または、サルＬＡＧ３（ＥＣＤ）－ｍＦｃタンパク質（ＡＣＲＯ，中国，Ｃａｔ＃：ＬＡ３－Ｃ５２Ａ０）をＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃：ＢＲ－１００５－３０）に１００－２００応答単位（ＲＵ）で結合し、反応しなかった群は１Ｍエタノールで阻害をした。０．３μＭから１０μＭの濃度範囲で連続希釈した抗体をＳＰＲランニングバッファ（ＨＢＳ－ＥＰバッファ、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、Ｃａｔ＃：ＢＲ－１００６－６９）に３０μＬ／分で注射した。結合容量は、空白制御のＲＵを減算して算出した。１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して会合速度（ｋａ）および解離速度（Ｋｄ）を算出した。平衡解離定数Ｋ_Ｄは、ｋｄ／ｋａ比として算出した。

【0209】

ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭで測定したそれらのキメラ抗体またはヒト化抗体のヒトＬＡＧ３に対する結合親和性曲線を図８に示すが、１０１Ｆ４－ＣＭ、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８、１３４Ｇ１０－ＣＭ、および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３に対するＫａ値はそれぞれ、４．０３Ｅ＋０５、９．６０Ｅ＋０５、１．０４Ｅ＋０５、９．３９Ｅ＋０４、１．６６Ｅ＋０５であり、これらの抗体のＫ_ｄ値はそれぞれ、３．３５Ｅ－０４、３．９８Ｅ－０１、２．１４Ｅ－０４、６．９２Ｅ－０５、４．３５Ｅ－０５であり、これらの抗体のＫ_Ｄ値はそれぞれ、８．３３Ｅ－１０、４．１４Ｅ－０７、２．０５Ｅ－０９、７．３７Ｅ－１０、２．６２Ｅ－１０である。親和性成熟化した抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８は、親抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２と比較して、ヒトＬＡＧ３に対して著しく高い結合親和性を有していた。

【0210】

ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭで測定した抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のサルＬＡＧ３への結合親和性曲線を図９に示すが、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３に対するＫａ値はそれぞれ、３．９４Ｅ＋０６、１．６２Ｅ＋０５、および１．２３Ｅ＋０７であり、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のＫ_ｄ値はそれぞれ、１．９２Ｅ－０３、１．５９Ｅ－０４および２．４６Ｅ－０６であり、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のＫ_Ｄ値はそれぞれ、４．８８Ｅ－１０、９．８０Ｅ－１０および２．０１Ｅ－１３である。データによると、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８のサルＬＡＧ３に対する結合親和性はヒトＬＡＧ３に対するものと同等であり、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のサルＬＡＧ３に対する結合親和性はヒトＬＡＧ３に対するものより高いことが示された。
［実施例１６ 親和性成熟化抗体によるＴ細胞活性化促進効果］

【0211】

ヒト化抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２および１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（親和性成熟あり）のＴ細胞応答を刺激する能力を、実施例１３のプロトコルにしたがって、ＭＬＲアッセイにより決定した。ポジティブコントロールとしてＢＭＳを使用した。

【0212】

実施例１４の親和性成熟データに基づき、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ３に対して上記のようにＶＨ ＣＤＲ３領域に３つのアミノ酸変異とＶＬ ＣＤＲ３領域に１つのアミノ酸変異を有する１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ３－８を構築し、１０１Ｆ４Ｈ３Ｌ３に対して上記のようにＶＨ ＣＤＲ３領域に３つのアミノ酸変異とＶＬ ＣＤＲ３領域に１つのアミノ酸変異を有する１０１Ｆ４Ｈ３Ｌ３－８を構築した。１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ３－８および１０１Ｆ４Ｈ３Ｌ３－８を、実施例１０に記載したように全長、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／カッパ抗体として調製し、実施例４に記載したように精製し、実施例１３に記載したようにＴ細胞活性化促進に対するそれらの能力について試験した。ポジティブコントロールとしてＢＭＳを使用した。

【0213】

図１０に示すように、親和性成熟の有無にかかわらず、すべてのヒト化抗体は抗ＰＤ－１前処理Ｔ細胞活性化を促進し、抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ３－８および１０１Ｆ４Ｈ３Ｌ３－８はＢＭＳと比較して同等またはそれ以上の促進能力を示した。１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８は最も高い促進活性を示し、特に高濃度では１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２よりもＩＦＮ－γの分泌をより多く誘導した。
［実施例１７ ヒト化抗体はｉｎ ｖｉｖｏで抗癌効果を発揮した。］

【0214】

ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／カッパ定常領域を有する抗ＬＡＧ３抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を、ヒトＬＡＧ３（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ，中国）をトランスジェニックマウスのＭＣ３８マウス結腸腺癌に移植することにより確立した動物モデルにおいて検討した。ポジティブコントロールとして、抗ＬＡＧ３抗体ＭＫ－４２８０（ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／カッパ定常領域とＷＯ２０１６／０２８６７２Ａｌに開示されたアミノ酸配列を用いて調製）を用いた。

【0215】

マウスは１×１０^６個のＭＣ３８細胞を片方の脇腹に皮下注射し、０日目に１群に１０匹のマウスで５群にランダムに振り分けた。次に、これらの動物に、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（１０ｍｇ／ｋｇ）、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＭＫ－４２８０（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳをそれぞれ０、４、７、１１、１４および１８日目に、ｉ．ｐ．投与した。

【0216】

１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果は、さらにヒトＰＤ－１×ＬＡＧ３ダブルノックインマウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ、中国）で試験した。ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）／カッパ定常領域を有するＢＭＳ－９８６０１６をポジティブコントロールとして使用した。簡潔に説明すると、マウスに１×１０^６個のＭＣ３８細胞を片方の脇腹に皮下注射し、０日目に１群に１０匹のマウスで４群にランダムに振り分けた。次に、これらの動物に１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（１０ｍｇ／ｋｇ）、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＭＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳをそれぞれ０、４、７、１１、１４および１８日目にｉ．ｐ．投与した。

【0217】

腫瘍の大きさとマウス体重を経時的に測定した。腫瘍の大きさ（幅と長さ）をキャリパーで計測し、ＴＶ＝（長さ×幅^２）／２という式で腫瘍体積を算出した。腫瘍体積の変化を図１１および図１２に示し、群間の腫瘍体積の差を一元配置分散解析により解析した。

【0218】

２５日目にマウスを犠牲にした。腫瘍を分離して重量を測定し、コラゲナーゼを含むハンクス緩衝液に配置した。次に、腫瘍を小さい片に切断し、コラゲナーゼを有するＨａｎｋｓ緩衝液において、穏やかに振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。次に、コラゲナーゼを不活性化して免疫細胞の生存を維持するために１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳを各試料に添加した。試料を７０μｍの細胞フィルタ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃：３５２３５０）に通し、新しい管に配置した。試料をペレット化し、ＰＢＳＦ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）に１^＊１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で再懸濁させた。試料をＰＢＳＦ緩衝液で２回洗浄後、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４５（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７８５^ＴＭ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５抗体、 Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国、Ｃａｔ＃：１０３１４９）、１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ８（ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ Ａｎｔｉｂｐｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国、Ｃａｔ＃：１００７１２）および１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国、Ｃａｔ＃：１００２０３）添加した。結果として生じる混合物を４℃で３０分インキュベートした。細胞はＰＢＳＦバッファで２回洗浄し、ＦＡＣＳマシン（ＢＤ）で解析した。

【0219】

図１１および図１２に示すように、抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３は、ヒトＬＡＧ３を有するトランスジェニックマウスの腫瘍増殖を著しく抑制し、試験した抗体の中で最も優れた抗癌効果が認められた。

【0220】

図１３に示すように、抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３は、ヒトＬＡＧ３を導入したトランスジェニックマウスの腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞を著しく増加させることがわかった。
［実施例１８ ヒト化抗体による抗ＰＤ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性の強化］

【0221】

ヒトＬＡＧ３（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、中国）を導入したトランスジェニックマウスにＭＣ３８マウス結腸腺癌を移植して確立した動物モデルを用いて、抗体１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８または１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３と抗ＰＤ－１抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１（ＣＤ２７９），Ｃａｔ＃ＢＥ０１４６、米国）の相乗効果（ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果）を検討した。マウスは１×１０^６個のＭＣ３８細胞を片方の脇腹に皮下注射し、０日目に１群に１０匹のマウス、８群にランダムに振り分けた。４群の動物に１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ－１抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８＋抗ＰＤ－１（１０ｍｇ／ｋｇ＋１ｍｇ／ｋｇ）、ＰＢＳをそれぞれ０、４、７、１１、１４、１８日目にｉ．ｐ．投与した。残りの４群の動物には、０、４、７、１１、１４、１８日目にそれぞれ１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ－１抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）、１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３＋抗ＰＤ－１（１０ｍｇ／ｋｇ＋２．５ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳをｉ．ｐ．投与した。

【0222】

腫瘍の大きさとマウス体重は経時的に観察した。腫瘍の大きさ（幅と長さ）をキャリパーで計測し、ＴＶ＝（長さ×幅^２）／２という式で腫瘍体積を算出した。抗体投与群における腫瘍体積が３．５ｃｍ^３に到達する前に実験を終了した。群間の腫瘍体積の差は一元配置分散解析で解析した。

【0223】

その結果を図１４に示す。データによると、各群のマウスに個体差はあるものの、１０１Ｆ４Ｈ２Ｌ２－８および１３４Ｇ１０Ｈ２Ｌ３は、溶媒群と比較して明らかに腫瘍増殖を抑制することが確認された。抗ＬＡＧ３抗体と抗ＰＤ－１抗体を組み合わせて使用した場合、単一抗体療法よりも優れた抗癌効果が得られた。

【0224】

いくつかの例示的な抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表６にまとめた。

【0225】

［表６：配列］

【表6】

【0226】

このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明の思想または範囲から逸脱することなく、その多くの明白な変形が可能であるので、上記の段落によって定義された発明は、上記の説明に記載された特定の詳細に限定されないことが明らかに理解されるものと思われる。
［他の可能な項目］
［項目１］
ＬＡＧ３に結合し、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、およびＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、およびＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域、前記ＶＨ ＣＤＲ３領域、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域、および前記ＶＬ ＣＤＲ３領域は、（１）それぞれ、配列番号 １、２、３、５、６および７、（２）それぞれ、配列番号１、２、４、５、６および８、または、（３）それぞれ、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６に記載されるアミノ酸配列を含む 、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
［項目２］
前記重鎖可変領域が、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、２７、２８、２９または３０に記載のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目３］
前記軽鎖可変領域が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、３１、３２、３３または３４に記載のアミノ酸配列を含む、項目１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目４］
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、（１）それぞれ、配列番号９および１５、（２）それぞれ、配列番号１０および１６、（３）それぞれ、配列番号１１および１７、（４）それぞれ、配列番号１１および１９（５）それぞれ、配列番号１２および１７、（６）それぞれ、配列番号１２および１９、（７）それぞれ、配列番号１３および１８、（８）それぞれ、配列番号１３および２０、（９）それぞれ、配列番号１４および２０、（１０）それぞれ、配列番号２７および３１、（１１）それぞれ、配列番号２８および３２、（１２）それぞれ、配列番号２９および３３、（１３）それぞれ、配列番号２９および３４、（１４）それぞれ、配列番号３０および３３、または、（１５）それぞれ、配列番号３０および３４に記載のアミノ酸配列を含む、項目２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目５］
前記重鎖可変領域に連結された重鎖定常領域であるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域、および／または前記軽鎖可変領域に連結された軽鎖定常領域であるヒトカッパ軽鎖定常領域を有する、項目１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目６］
前記重鎖定常領域が、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目７］
（ａ）ヒトＬＡＧ３と結合する、（ｂ）サルＬＡＧ３と結合する、（ｃ）マウスＬＡＧ３と結合しない、（ｄ）ＬＡＧ３－ＭＨＣ ＩＩ複合体相互作用を阻害する、（ｅ）Ｔ細胞活性化を誘導する、および／または（ｆ）ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を提供する、項目１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目８］
マウス、キメラ、またはヒト化抗体である、項目１から７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目９］
項目１から８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子。
［項目１０］
項目１から８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［項目１１］
さらに、抗癌剤、抗感染症剤、または抗炎症剤を含む、項目１０に記載の医薬組成物。
［項目１２］
固形腫瘍の治療に使用するための、項目１から８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目１３］
前記固形腫瘍が、結腸腺癌、乳癌、腎細胞癌、メラノーマ、膵臓癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、または胃癌である、項目１２に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部分。
［項目１４］
自己免疫疾患の治療に使用するための、項目１から８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
［項目１５］
前記自己免疫疾患がプラーク乾癬である、項目１４に記載の使用のための抗体またはその抗原結合部分。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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