特許 7505713 アミロイドペプチドバリアント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-17

(45)【発行日】2024-06-25

(54)【発明の名称】アミロイドペプチドバリアント

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/46 20060101AFI20240618BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240618BHJP

【ＦＩ】

C07K14/46 ZNA

A61K38/17

A61P43/00 111

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2021549163

(86)(22)【出願日】2020-02-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-06

(86)【国際出願番号】 US2020019557

(87)【国際公開番号】W WO2020172686

(87)【国際公開日】2020-08-27

【審査請求日】2022-11-04

(31)【優先権主張番号】62/809,167

(32)【優先日】2019-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521365060

【氏名又は名称】ロヨラ メリーマウント ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｌｏｙｏｌａ Ｍａｒｙｍｏｕｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(73)【特許権者】

【識別番号】521365071

【氏名又は名称】マウント セイント メアリーズ ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｍｏｕｎｔ Ｓａｉｎｔ Ｍａｒｙ’ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】モフェット，デビッド

(72)【発明者】

【氏名】ノガジ，ルイザ

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】IAPP isoform 5, partial [Pan troglodytes]，Database GenBank［online］, Accession No. PNI98857.1，［令和５年９月１２日検索］，2018年01月19日，インターネット <URL : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/PNI98857.1>

【文献】IAPP isoform 3, partial [Pongo abelii]，Database GenBank [online], Accession No. PNJ86803.1，［令和５年９月１２日検索］，2018年01月19日，インターネット <URL : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/PNJ86803.1>

【文献】J. AM. CHEM. SOC. ，2005年，Vol.127, No.45，15690-15691, Supporting Information

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）配列番号１７～１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＩＡＰＰペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のＩＡＰＰペプチドおよび１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項3】

ヒトＩＡＰＰ凝集を阻害するための医薬組成物であって、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＩＡＰＰペプチドおよび１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月２２日に出願された「ＡＭＹＬＯＩＤ ＰＥＰＴＩＤＥ ＶＡＲＩＡＮＴＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＤＩＡＢＥＴＥＳ」というタイトルの米国特許出願第６２／８０９，１６７号からの優先権の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

多くのタンパク質は、様々な疾患に連鎖し得る代替的な、ミスフォールドした構造をとることが公知である。タンパク質、例えば２型糖尿病におけるヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ、アミリン）、アルツハイマー病におけるＡβ４２、およびパーキンソン病におけるα－シヌクレインは全て、ミスフォールドして毒性オリゴマーおよび線維に凝集することが公知である。これらのミスフォールドしたタンパク質は細胞にとって毒性であることが公知であるが、これらの疾患の進行においてそれらが果たす正確な役割は謎のままである。

【0003】

アミロイド疾患はヒトの健康に対する深刻な脅威となる。２型糖尿病と関連付けられる経済的および社会的費用は過去１０年にかけて十分に文書化されている。米国糖尿病学会（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、米国において集団の約８．３％である２５８０万人の子供および成人が糖尿病を有し、２００万に近い新たな症例が各年で診断されていると概算している。この疾患の有病率は年齢と共に増加するため、２型糖尿病に罹患した人の数は集団の加齢と共に増加する。この疾患の進行を予防または緩慢化させるための治療が見出されなければ、米国人だけで１億人もが次の４０年のうちに糖尿病を有し得ると概算され、コストは年間で１７４０億ドルより高くなると概算される。２００８年に、米国において１１６０億ドルが直接的な医療費に費やされ、追加の間接的な費用は、労働損失、能力障害および若年死のために５８０億ドルと概算される。

【0004】

肥満症は２型糖尿病に連鎖した明確な要因であるが、肥満者の７０％より多くは糖尿病を有さず、他の要因がこの疾患の進行に影響を及ぼすことを示唆している。２型糖尿病の進行に連鎖した１つのあり得る要因はアミロイド原性ペプチド膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＩＡＰＰ）の凝集である。この３７アミノ酸のポリペプチドは膵臓のβ膵島細胞からインスリンと共分泌される。２型糖尿病の進行の間に、ＩＡＰＰは様々な異なるアミロイド原性状態に凝集する。ＩＡＰＰは、この疾患に罹患した患者の９０％より多くにおいてアミロイドの細胞外沈着として見出されることが公知である。

【0005】

ＩＡＰＰ凝集および糖尿病の間の連鎖は、非ヒトにも拡張されるようである。ヒトと同様に、ネコおよび霊長動物は糖尿病を発症することが公知である。これもヒトと同様に、ネコおよび霊長動物は、凝集して毒性アミロイドを形成するＩＡＰＰバリアントを発現する。反対に、ラット、マウスおよびハムスターからのＩＡＰＰバリアントは凝集せず、毒性のアミロイド原性の種も形成しない。ラット、マウスおよびハムスターは、糖尿病を自然発生的に発症しない。しかしながら、マウスおよびラットがヒトＩＡＰＰを発現するように操作された場合、それらは２型糖尿病および該疾患と関連付けられる症状を発症する。

【0006】

最近、ＩＡＰＰの１つの形態はシリンドリン（ｃｙｌｉｎｄｒｉｎ）フォールドをとり得ることが示唆された。凝集物形成性ＩＡＰＰ分子の構造は未だ決定されていないが、これらの凝集物の一部は細胞にとって高度に毒性であることは明確である。合成ＩＡＰＰは、ヒト膵島β細胞の他に様々な追加の哺乳動物細胞系に加えられた場合に、インビトロで高度に毒性の剤として作用することを研究は示している。ＩＡＰＰは、２型糖尿病に罹患した患者の約９０％においてアミロイドの細胞外沈着として見出される。ＩＡＰＰはまた、哺乳動物細胞に加えられた場合にインビトロで毒性の剤であることが示されている。ＩＡＰＰの自己集合が疾患の発症にどのように繋がるのかは依然として明確でないが、より低次のタンパク質凝集物（２～１０個の自己集合したタンパク質）の形成が細胞毒性および最終的に疾患の進行に繋がることを最近の研究は示唆している。

【発明の概要】

【0007】

本発明者らは最近、ヒトＩＡＰＰ凝集を阻害し、かつ哺乳動物細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューする一連のＩＡＰＰペプチドを同定した。これらのＩＡＰＰバリアントは、ｈＩＡＰＰ凝集の強力な阻害剤であり、治療剤およびアミロイドタンパク質の根本的な毒性を理解するためのプローブとして使用することができる。本ＩＡＰＰペプチドは、以下の配列：
ａ）配列番号１５～１８、
ｂ）配列番号２６～３７、
ｃ）配列番号４２～４６、
ｄ）配列番号５３～６４、および
ｅ）配列番号６５～６８
の１つから選択されるアミノ酸配列を有する。

【0008】

これらのペプチドとしては、ウェッデルアザラシＩＡＰＰ（配列番号１５～１８）、アライグマＩＡＰＰ（配列番号２６～３７および配列番号４２～４６）、ならびにニワトリＩＡＰＰ（配列番号５３～６４および配列番号６５～６８）から突然変異したペプチドが挙げられる。一部の実施形態において、好ましい配列としては、配列番号１６～１７（ＷＳ＿ＲＬおよびＷＳ＿ＲＰ）、配列番号４６（Ｒａｃ＿Ｌ２６Ｙ）、配列番号３１～３４（Ｒ１－２７～Ｒ１－３０）、配列番号６６～６８（Ｃｈｖ１６Ｌ、ＣｈＩ２２Ｌ、ＣｈＹ２６Ｌ）、ならびに配列番号５９～６１（Ｃ１－２７～Ｃ１－２９）が挙げられる。

【0009】

以上のＩＡＰＰペプチドは、インビトロまたはインビボでｈＩＡＰＰ凝集を阻害するために使用することができる。１つの実施形態において、これらのペプチドは、アミロイド疾患、例えば糖尿病の治療において使用することができる。治療応用において使用される場合、ＩＡＰＰペプチドは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせられて医薬組成物を形成することができる。

【0010】

ネコ、イヌ、ニワトリ、ホッキョクグマ、アライグマ、およびウェッデルアザラシにおいて天然に見出されるＩＡＰＰペプチドもまた、アミロイド疾患の治療においておよびｈＩＡＰＰ凝集を阻害するために使用することができる。これらのペプチドは、配列番号２～７から選択される配列を有することができる。アライグマおよびニワトリのＩＡＰＰペプチドが好ましい。

【0011】

本ＩＡＰＰペプチドはそのため、アミロイド疾患を患う対象を治療する方法であって、ＩＡＰＰペプチドをそれを必要とする対象に投与するステップを含み、ＩＡＰＰペプチドが、配列番号２～７、配列番号１５～１８、配列番号２６～３７、配列番号４２～４６、配列番号５３～６４、および配列番号６５～６８から選択されるアミノ酸配列を有する、方法において使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、ヒトＩＡＰＰを様々な動物のＩＡＰＰと比較した表である。ｈＩＡＰＰから異なるアミノ酸を太字で指し示す。

【図2】図２は、ヒトＩＡＰＰを他の種からのＩＡＰＰと混合したチオフラビンＴ結合アッセイの結果を示すチャートである。少なくとも３回の試行の平均を、試行の間の標準偏差を指し示すエラーバーと共に示す。

【図3】図３は、ＩＡＰＰバリアントの原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）走査の結果を示す。３７μＭのヒトＩＡＰＰを７５μＭの各動物ＩＡＰＰと混合し、試料を振盪と共に３７℃で４０分間インキュベートした。全ての走査は平坦化を伴わない未加工データを示し、１０μｍ×１０μｍである。

【図4】図４はＭＴＴ生存アッセイの結果を示すチャートである。一番左の黒バーは細胞単独での平均生存を示す。水平軸上のそれぞれの種識別表示（アライグマ、ニワトリなど）の上の左側のバーは、個々に１２．８μＭのｈＩＡＰＰまたは動物ＩＡＰＰバリアントの添加での平均細胞生存を指し示す。水平軸上のそれぞれの種識別表示の上の右側のバーは、各動物ＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰの細胞生存を示す（１：１の比での各指し示される動物ＩＡＰＰとのｈＩＡＰＰの１２．８μＭの混合物）。アステリスクは、ｈＩＡＰＰ単独およびアライグマまたはニワトリＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰの間の細胞生存における有意な増加を示す。

【図5】図５は、指し示される材料のＡＦＭ走査の結果を示す。ｈＩＡＰＰと標識された試料は４０μＭのｈＩＡＰＰを含有した。プラムリンチドおよびｈＩＡＰＰの試料は２：１モル混合物を含有した（４０μＭのｈＩＡＰＰと混合された８０μＭのプラムリンチド）。アライグマＩＡＰＰ単独およびプラムリンチド単独の試料は４０μＭの指し示されるペプチドを含有した。各試料を振盪と共に３７℃で４０分間インキュベートし、これはｈＩＡＰＰアミロイド形成を促進することが公知の条件である。全ての走査は平坦化を伴わない未加工データを示し、１０μｍ×１０μｍである。

【図6】図６はＭＴＴ生存アッセイの結果を示すチャートである。左側のバーは細胞単独での平均生存を示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の左側のバーは、個々に１２．８μＭのｈＩＡＰＰまたはＩＡＰＰバリアント（水平軸上に指し示されるバリアント）の添加での平均細胞生存を指し示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の右側のバーは、各ＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰの細胞生存を示す（１２．８μＭのｈＩＡＰＰと共に１：１の比の各ＩＡＰＰ）。

【図7】図７は、ｈＩＡＰＰアミロイド形成に対する阻害能力について試験されたアザラシＩＡＰＰのバリアントのアミノ酸配列を列記する表である。ｈＩＡＰＰアミロイド形成を阻害するペプチドは「阻害」の列における太字の「する」で指し示され、細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューするペプチドは「レスキュー」の列における太字の「する」で指し示される。

【図8】図８は、指し示されるウェッデルアザラシＩＡＰＰペプチドバリアントと混合された場合のｈＩＡＰＰのチオフラビンＴ結合アッセイの結果を示すチャートである。データは３回の試行の最小の平均を示し、エラーバーは試行の間の標準偏差を示す。

【図9】図９は、指し示されるウェッデルアザラシＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰのＡＦＭ画像を示す。全ての走査は平坦化を伴わない未加工データを示し、１０μｍ×１０μｍである。

【図10】図１０はＭＴＴ生存アッセイの結果を示すチャートである。一番左の黒バーは細胞単独での平均生存を示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示（ＷＳ、ＷＳ－Ｒなど）の上の左側のバーは、個々に１２．８μＭのｈＩＡＰＰまたはウェッデルアザラシＩＡＰＰバリアントペプチドの添加での平均細胞生存を指し示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の右側のバーは、ウェッデルアザラシＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰの細胞生存を示す（１：１の比でのウェッデルアザラシＩＡＰＰとのｈＩＡＰＰの１２．８μＭの混合物）。

【図11】図１１は、全長アライグマＩＡＰＰの配列の切断に基づくいくつかのペプチドを列記する表である。ｈＩＡＰＰアミロイド形成を阻害するペプチドは「阻害」の列における太字の「する」で指し示され、細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューするペプチドは「レスキュー」の列における太字の「する」で指し示される。

【図12】図１２は、指し示されるアライグマＩＡＰＰバリアントと混合された場合のｈＩＡＰＰのチオフラビンＴ結合アッセイの結果を示すチャートである。ヒトＩＡＰＰを振盪と共に３７℃で各指し示されるペプチドとインキュベートした。各ペプチドの４つの鉛直バーは、左から右にそれぞれ１０分、２０分、２５分、および３０分後の蛍光を指し示す。データは２回の試行の最小の平均を示し、エラーバーは試行の間の標準偏差を示す。

【図13】図１３は、アライグマＩＡＰＰ切断突然変異体について図１２に示される結果を描写するチャートである。各ペプチドの４つの鉛直バーは、左から右にそれぞれ１０分、２０分、２５分、および３０分後の蛍光を指し示す（３０分の読み取りは、チャートの左側のネイティブなアライグマＩＡＰＰについて含まれない）。

【図14】図１４は、アライグマＩＡＰＰの配列の突然変異に基づくいくつかのペプチドを列記する表である。ｈＩＡＰＰアミロイド形成を阻害するペプチドは「阻害」の列における太字の「する」で指し示され、細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューするペプチドは「レスキュー」の列における太字の「する」で指し示される。

【図15】図１５は、指し示されるニワトリおよびアライグマＩＡＰＰバリアントと混合された場合のｈＩＡＰＰのチオフラビンＴ結合アッセイの結果を示すチャートである。ヒトＩＡＰＰを振盪と共に３７℃で各指し示されるペプチドとインキュベートした。各ペプチドについての４つの鉛直バーは、左から右にそれぞれ１０分、２０分、２５分、および３０分後の蛍光を指し示す。データは２回の試行の最小の平均を示し、エラーバーは試行の間の標準偏差を示す。

【図16】図１６は、バリアントアライグマＩＡＰＰペプチドを比較したＭＴＴ生存アッセイの結果を示すチャートである。一番左の黒バーは細胞単独での平均生存を示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の左側のバーは、個々に１２．８μＭの各指し示されるＩＡＰＰペプチドの添加での平均細胞生存を指し示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の右側のバーは、指し示されるＩＡＰＰペプチドと混合されたｈＩＡＰＰの細胞生存を示す（１：１の比での各指し示されるＩＡＰＰペプチドとのｈＩＡＰＰの１２．８μＭの混合物）。

【図17】図１７は、ニワトリＩＡＰＰの配列の切断に基づくいくつかのペプチドを列記する表である。ｈＩＡＰＰアミロイド形成を阻害するペプチドは「阻害」の列における太字の「する」で指し示され、細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューするペプチドは「レスキュー」の列における太字の「する」で指し示される。

【図18】図１８は、指し示されるニワトリＩＡＰＰバリアントと混合された場合のｈＩＡＰＰのチオフラビンＴ結合アッセイの結果を示すチャートである。ｈＩＡＰＰを振盪と共に３７℃で各指し示されるペプチドとインキュベートした。各ペプチドの４つの鉛直バーは、左から右にそれぞれ１０分、２０分、２５分、および３０分後の蛍光を指し示す。データは２回の試行の最小の平均を示し、エラーバーは試行の間の標準偏差を示す。

【図19】図１９は、切断されたニワトリおよびアライグマＩＡＰＰペプチドのＡＦＭ走査の結果を示す。描写された走査において、Ｒ１－２３、Ｒ８－２３、およびＲ８－３０ペプチドはｈＩＡＰＰ凝集を阻害しなかったが、Ｒ１－２９、Ｒ１－２７、Ｃ１－２９、およびＣ１－２７ペプチドは阻害した。各試料は３７μＭのｈＩＡＰＰおよび７５μＭの指し示されるペプチドを含有した。試料を振盪と共に３７℃で４０分間インキュベートした。全ての走査は平坦化を伴わない未加工データを示し、１０μｍ×１０μｍである。

【図20】図２０は、ニワトリＩＡＰＰの配列の突然変異に基づくいくつかのペプチドを列記する表である。ｈＩＡＰＰアミロイド形成を阻害するペプチドは「阻害」の列における太字の「する」で指し示され、細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューするペプチドは「レスキュー」の列における太字の「する」で指し示される。

【図21】図２１は、バリアントニワトリＩＡＰＰペプチドを比較したＭＴＴ生存アッセイの結果を示すチャートである。一番左の黒バーは細胞単独での平均生存を示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の左側のバーは、個々に１２．８μＭのｈＩＡＰＰまたはニワトリＩＡＰＰバリアントの添加での平均細胞生存を指し示す。水平軸上のそれぞれのペプチド識別表示の上の右側のバーは、ニワトリＩＡＰＰバリアントと混合されたｈＩＡＰＰの細胞生存を示す（１：１の比での各指し示されるＩＡＰＰペプチドとのｈＩＡＰＰの１２．８μＭの混合物）。

【図22】図２２は、ｈＩＡＰＰと混合された場合のアライグマおよびニワトリＩＡＰＰバリアントのＡＦＭ走査の結果を示す。各試料は、３７μＭの指し示されるペプチドと混合された３７μＭのｈＩＡＰＰを含有した。試料を振盪と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、各試料を新たに切断されたマイカに沈着させた。

【発明を実施するための形態】

【0013】

定義
本明細書において使用される場合、以下の用語およびそのバリエーションは、そのような用語が使用される文脈により異なる意味が意図されなければ、以下に与える意味を有する。

【0014】

「約」および「おおよそ」は、そのような使用の状況が異なる意味を指し示さなければ、参照される量の１０％以内の量を指す。非限定的に例えば、「約１０」は９～１１を意味し、「約１０％」は９％～１１％を意味する。

【0015】

「アミロイド疾患」は、線維形態およびβ－シート二次構造を有する、ペプチドおよび／またはタンパク質、特にアミリンの凝集物により引き起こされるまたはそれと関連付けられる医学的状態を指す。ヒトＩＡＰＰはオリゴマーまたはプラークを形成することができ、そのような凝集物は、一部の場合には、ＩＩ型糖尿病およびアルツハイマー病と関連付けられる。

【0016】

「細胞保護」は、細胞損傷または死、特にｈＩＡＰＰへの曝露の毒性効果を減弱、軽減、または予防する能力を指す。細胞保護は、当該技術分野で公知のやり方、例えば細胞生存および細胞傷害性アッセイを用いて測定することができる。

【0017】

「ＩＡＰＰ」は、様々な動物、特に哺乳動物および鳥において見出される膵島アミロイドポリペプチドを指す。

【0018】

「ＩＡＰＰペプチド」は、ヒトＩＡＰＰ（配列番号１）と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を有するペプチドを指す。ＩＡＰＰペプチドは、ｈＩＡＰＰと比較して切断されることができ、好ましくは、ｈＩＡＰＰの少なくとも７０％、７３％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれより大きい長さを有する。好ましくは、ＩＡＰＰペプチドは、ｈＩＡＰＰと少なくとも８０％の配列同一性、例えば８９％、９２％、９５％の、または９７％までの配列同一性を有する。

【0019】

「阻害」は、アミロイドオリゴマー、線維、および凝集物に関して、そのような阻害を引き起こす材料の非存在下でのそのような材料の形成と比較して、そのようなオリゴマー、線維、および凝集物の形成を緩慢化させかつ／または予防することを意味する。アミロイド形成は、当該技術分野で公知のやり方で、例えば、チオフラビンＴ結合アッセイを用いて測定することができる。好ましくは、ＩＡＰＰペプチドはＩＡＰＰ凝集物形成を約５０％またはそれより高く阻害する。

【0020】

「医学的状態」は、対象において疾患、不快感および／または能力障害を引き起こす状態を指す。

【0021】

「薬学的効果」および「治療効果」は、対象における医学的状態の治癒、軽減、治療または予防を含めて、対象の生理学的機能の回復、矯正または修飾における効果を指す。「医薬組成物」および「医薬」は、薬学的効果を有する組成物である。

【0022】

「治療」は、医学的状態を減弱し、改善し、予防し、かつ／または消散させる行為を指す。治療は、治療を必要とする医学的状態の予防または発症後の治療のいずれかを指すことができる。

【0023】

「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語および該用語のバリエーション、例えば「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）は、他の添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しない。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語ならびに本明細書において使用される類似した参照語は、文脈におけるそれらの使用がそうでないことを指し示さなければ、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。２つの値の「間」にあるとして記載される範囲は、指し示される値を含む。

【0024】

ＩＡＰＰペプチド
他の種のＩＡＰＰペプチド
本発明者らは、様々な生物からの天然に存在するＩＡＰＰペプチドの凝集可能性を比較し、これとの関連でヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）とのそのようなペプチドの相互作用を評価した。これらの研究の間に、本発明者らは驚くべきことに、これらの動物ＩＡＰＰペプチドのいくつかは、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害する顕著な能力を示して、アミロイドの形成を予防し、かつ哺乳動物細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護することを見出した。

【0025】

本発明者らが評価した天然に存在するＩＡＰＰペプチドのアミノ酸配列を、太字で示されるヒトＩＡＰＰからの配列差異と共に図１に示す。ｈＩＡＰＰ凝集を阻害する能力を示すとして同定された動物ＩＡＰＰペプチドを図の上に列記し、阻害能力を欠いたバリアントを下に列記している。ウシ、デグー、モルモット、ウマ、ブタ、ラット、およびヒツジ起源のＩＡＰＰペプチドはヒトＩＡＰＰの凝集を阻害しなかったが、本発明者らは驚くべきことに、ネコ、イヌ、ニワトリ、ホッキョクグマ、アライグマ、およびアザラシ起源のＩＡＰＰは、ｈＩＡＰＰと混合された場合にそのような凝集を阻害できることを見出した。これらの阻害性ＩＡＰＰペプチドの配列を以下の表１に示す。

【0026】

【0027】

以下の実施例１～３において議論されるように、これらのペプチドはｈＩＡＰＰによる凝集物形成を阻害し（図１～３）、アライグマおよびニワトリＩＡＰＰペプチドはまた、生細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果からレスキューした（図４）。

【0028】

ウェッデルアザラシバリアント
ｈＩＡＰＰの凝集を阻害する能力を決定するためにウェッデルアザラシＩＡＰＰのバリアント（突然変異）を調製した。図７中の表に示されるように、これらの一部は、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害することおよび／または細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護することができることが見出された。これらの配列を以下の表２に示す。

【0029】

【0030】

指し示されるウェッデルアザラシバリアントと混合された場合のｈＩＡＰＰのチオフラビンＴ結合アッセイの結果を図８に示す。ＷＳ－ＲＬ（配列番号１６）およびＷＳ－ＬＰ（配列番号１８）ＩＡＰＰペプチドはｈＩＡＰＰ凝集を阻害した。ＷＳ－ＲＬおよびＷＳ－ＲＰ（配列番号１７）はまた、ＭＴＴアッセイにおいて細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューした（図１０）。しかしながら、ＷＳ－ＬＰ（およびＷＳ－Ｐ）ペプチドは、ｈＩＡＰＰの添加のありおよびなしで、細胞に対して毒性であることが判明した。

【0031】

アライグマバリアント
ｈＩＡＰＰによる凝集物形成を阻害し、そしてまた生細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果からレスキューするアライグマＩＡＰＰの能力を考慮して、天然のアライグマＩＡＰＰペプチド配列に基づく一連のＩＡＰＰペプチドを合成し、ヒトＩＡＰＰアミロイド形成を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューする能力について特徴付けた。図１２、図１６、および図１９に示されるように、アライグマＩＡＰＰペプチドのＣ末端から切断されたいくつかのＩＡＰＰペプチドは、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、そしてまた細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護することが見出された。全長アライグマＩＡＰＰのＮ末端（配列番号２１および２３）ならびに中央（配列番号２２、２４、および２５）からのアミノ酸の除去は、ｈＩＡＰＰの凝集を阻害することもその細胞傷害性を低減させることもないペプチドを結果としてもたらしたが、全長アライグマＩＡＰＰのＣ末端における１３アミノ酸までの除去は、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、そしてまた細胞を保護することができるペプチドを結果としてもたらした。以下の表３は、ｈＩＡＰＰ凝集物形成を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ細胞傷害性から保護する能力を有する切断されたアライグマｈＩＡＰＰペプチドを列記する。

【0032】

【0033】

対応する天然のアライグマＩＡＰＰペプチドは、膵臓細胞とインキュベートされた場合にある程度の細胞毒性を示したが、これらの切断されたペプチドは毒性を実質的に示さなかった。

【0034】

アライグマＩＡＰＰから改変（突然変異）された配列を有する追加のペプチドを作出し、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害するそれらの能力を分析した。以下の表４および図１２に示される配列はｈＩＡＰＰアミロイド形成の強い阻害を示した。

【0035】

【0036】

Ｒａｃ－Ｌ２６Ｙ（配列番号４６）は、最小の固有の毒性を示しながら、ｈＩＡＰＰ線維形成を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューする能力に優れていた。

【0037】

ニワトリバリアント
ｈＩＡＰＰによる凝集物形成を阻害し、そしてまた生細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果からレスキューするニワトリＩＡＰＰの能力を考慮して、天然のニワトリＩＡＰＰペプチド配列に基づく一連のＩＡＰＰペプチドを合成し、ヒトＩＡＰＰアミロイド形成を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューする能力について特徴付けた。図１８、図１９、および図２１に示されるように、ニワトリＩＡＰＰペプチドのＣ末端から切断されたいくつかのＩＡＰＰペプチドは、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害しかつ／または細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護することが見出された。全長ニワトリＩＡＰＰのＮ末端からのアミノ酸の除去は、ｈＩＡＰＰの凝集を阻害することもその細胞傷害性を低減させることもないペプチドを結果としてもたらし、２４アミノ酸を下回る長さに切断されたペプチドはアミロイド阻害能力を喪失した。しかしながら、全長ニワトリＩＡＰＰのＣ末端における１３アミノ酸までの除去は、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害することおよび／または細胞をｈＩＡＰＰ細胞傷害性から保護することができるペプチドを結果としてもたらす。これらのペプチドを以下の表５に示す。

【0038】

【0039】

対応する天然のニワトリＩＡＰＰペプチドは、膵臓細胞とインキュベートされた場合にある程度の細胞毒性を示したが、これらの切断されたペプチドは毒性を実質的に示さなかった。

【0040】

ニワトリＩＡＰＰから改変された配列を有する追加のペプチドを作出し、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害するそれらの能力を分析した。以下の表６における配列はｈＩＡＰＰアミロイド形成の強い阻害を示した。

【0041】

【0042】

Ｃｈ－Ｉ２２Ｌ（配列番号６７）は、最小の固有の毒性を示しながら、ｈＩＡＰＰ線維形成を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ毒性からレスキューすることができた（図１５、図２１、および図２２を参照）。

【0043】

ＩＡＰＰペプチドの効果の測定
当該技術分野で公知の多数のアッセイのいずれかを使用して、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害しかつ／または細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護するＩＡＰＰペプチドの能力を評価することができる。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合は、アミロイド形成をリアルタイムで同定するための１つのそのような技術である。ヒトＩＡＰＰは、凝集およびアミロイド形成の間にチオフラビンＴに結合することが公知であり、アミロイド原線維への結合で、ＴｈＴは４５０ｎｍで励起された場合に約４８２ｎｍの強い蛍光シグナルを与える。ＴｈＴ蛍光は試料中のアミロイド濃度と線形に相関しており、したがって試料中の凝集の量を決定するために使用することができる。この技術は、したがって、ｈＩＡＰＰによる凝集物の形成を結果としてもたらすことが公知の条件下でそのような物質をヒトＩＡＰＰと混合した場合にアミロイド阻害能力を有する物質を同定するために使用することができる。凝集の程度の決定はまた、他の技術、例えば原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して決定することができ、ＡＦＭは、ナノメートルの分解能で粒子の寸法、形状、および部分構造に関する情報を提供することができる。以上のアッセイおよび当業者により使用され得るその他において、有意な阻害は、ｈＩＡＰＰおよびＩＡＰＰペプチドと組み合わせられたｈＩＡＰＰの間の差異を測定することによりｔ検定を使用して決定することができる。有意な結果は＜０．０５のｔ検定値を示す。

【0044】

細胞保護は同様に、当該技術分野で公知の多数のアッセイにより測定することができる。１つのそのようなアッセイはＭＴＴアッセイであり、これは細胞代謝活性を評価するための比色アッセイである。細胞のサイトゾル区画中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性細胞オキシドレダクターゼ酵素は、テトラゾリウム色素ＭＴＴ ３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミドを、紫色を有する不溶性形態、ホルマザンに還元する。ＭＴＴ（および他のテトラゾリウム色素）の還元は細胞の代謝活性に依存するため、ＭＴＴアッセイの実施の過程における色の喪失は低い代謝活性を指し示し、そのため細胞損傷および死の指標である。

【0045】

医薬製剤
ＩＡＰＰペプチドは、筋肉内、静脈内、および皮下投与を含めて、当該技術分野で公知のやり方での投与のための医薬組成物（医薬）として製剤化することができる。投与の経路に依存して、医薬組成物は、液体として、粉末もしくは他の固体として、またはゲルとして製剤化することができる。組成物が粉末形態である場合、ＩＡＰＰペプチドは塩、例えば酢酸塩などの形態であることができる。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、ならびに／または、例えば、組成物を安定化させるためおよび／もしくは組成物を対象に送達するための、他の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。本医薬組成物のための賦形剤は、適切な添加剤、例えば薬学的に有効な担体（すなわち、無菌水、水、および食塩水など）、緩衝剤、中和剤、安定化剤、湿潤剤、粘度上昇剤、化学的安定化剤、増粘剤、希釈剤、ならびに／または溶媒を含むことができる。一部の実施形態のための賦形剤の例としては、アルコールおよびポリグリコール、グリセリン、ワックス、水、脱イオン水、および脂肪酸エステルなど、これらの混合物およびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路などによる、非経口投与のために好適な製剤としては、水性および非水性等張無菌注射溶液が挙げられる。

【0046】

ＩＡＰＰペプチドの使用
ＩＡＰＰペプチドは、例えば以下の実施例に記載されるように、ＩＡＰＰ凝集を阻害しまたは細胞を保護するために使用することができる。１つの実施形態において、外因的に適用された場合および細胞から分泌された場合の両方において細胞傷害性を誘導することが見出されているアミロイド線維、例えばｈＩＡＰＰの凝集物への曝露から細胞を保護するために、ＩＡＰＰペプチドはインビトロで細胞に投与される。本ＩＡＰＰペプチドはまた、インビボでＩＡＰＰ凝集を低減させるために対象に投与することができる。本ＩＡＰＰペプチドは特に、アミロイド疾患、例えば糖尿病を有するヒトまたは他の哺乳動物対象を治療するために使用することができる。本発明の１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ凝集を阻害しかつ細胞をｈＩＡＰＰ毒性から保護する本ＩＡＰＰペプチドは、アミロイド疾患を治療するために対象に投与することができる。

【0047】

アミロイド原線維形成を阻害しかつ細胞傷害性を減少させるヒトＩＡＰＰに由来するペプチド、例えばＡＮＦＬＶＨなどは、注射後の対象において空腹時血中グルコースレベルおよび耐糖能を向上させることが示されている（Ｗｉｊｅｓｅｋａｒａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １７：１００３～１００６、２０１５）。ＩＡＰＰペプチドプラムリンチドもまた、ヒトにおいて糖尿病を治療するために使用されている。このペプチドは、ラットＩＡＰＰ中に見出される３アミノ酸の置換を含有する。プラムリンチドは、しかしながら、本ＩＡＰＰペプチドよりもアミロイド原性であり、そしてまた細胞保護効果を有しない。図５に示されるＡＦＭ走査において見ることができるように、単独でのアライグマＩＡＰＰは凝集しなかったが、プラムリンチドは同じ条件下でアミロイド線維を形成した。アライグマＩＡＰＰペプチドはまた、ｈＩＡＰＰの凝集を予防したが、プラムリンチドは同じ条件下でこれをすることができなかった。アライグマおよびニワトリＩＡＰＰとは異なり、プラムリンチドはまた、細胞に対して毒性であり、細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果から保護する能力を有しない（図６を参照）。

【0048】

ＩＡＰＰペプチドは、当該技術分野で公知のやり方で、例えば非経口投与により、例えば筋肉内、静脈内、または皮下投与を介して、対象に投与することができる。１つの実施形態において、ＩＡＰＰペプチド組成物は、凝集したＩＡＰＰが見出される部位に、例えば膵臓、特にランゲルハンスの膵島に直接的に投与することができる。アミリンオリゴマーおよびプラークはまた、血管、血管周囲空間、および脳組織（実質）において同定されているため、これらの臓器または区画へのＩＡＰＰペプチド組成物の注射または適用もまた、対象に本ＩＡＰＰペプチドを投与するために行うことができる。

【0049】

関与する個々の対象の特定の必要性に依存して、本ペプチドは、アミロイド疾患に対する有効な治療を提供するための様々な用量で投与することができる。好ましくは、約１マイクログラム（ｍｃｇ）～約５００マイクログラムの用量を対象に投与することができ、これは例えば、約２ｍｃｇ、５ｍｃｇ、７ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２０ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、１７０ｍｃｇ、２００ｍｃｇ、２２０ｍｃｇ、２５０ｍｃｇ、２７０ｍｃｇ、３００ｍｃｇ、３２０ｍｃｇ、３５０ｍｃｇ、３７０ｍｃｇ、４００ｍｃｇ、４２０ｍｃｇ、４５０ｍｃｇ、または４７０ｍｃｇの用量である。例えば、本ＩＡＰＰペプチドは、例えば、０．１ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．１５ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．２ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．２５ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．３ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．４ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．７ｍｃｇ／ｋｇ／日、０．９ｍｃｇ／ｋｇ／日、１．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、１．２ｍｃｇ／ｋｇ／日、１．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、１．７ｍｃｇ／ｋｇ／日、２．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、２．２ｍｃｇ／ｋｇ／日、２．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、３．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、３．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、４．０ｍｃｇ／ｋｇ／日、４．５ｍｃｇ／ｋｇ／日、または５．０ｍｃｇ／ｋｇ／日の量で投与することができる。選択されたペプチドの凝集阻害活性、ペプチドの半減期、対象の生理学的特徴、対象の状態の程度または性質、および投与の方法などの要因は、当業者に公知のように、選択されたペプチドの有効量を構成するものを決定する。一般に、初期用量は、特定の対象の治療のための最適な投薬量を決定するために改変される。長期の時間的期間にかけて投与される本ペプチドの繰り返しの用量が要求されることがある。

【0050】

本発明の任意の実施形態の有効量は、当該技術分野における通常の技能を有する薬理学者および臨床医に公知の方法を使用して決定される。例えば、動物モデルを使用して、患者のための応用可能な投薬量を決定することができる。糖尿病および他のアミロイド疾患のための多数のモデルが公知である。ＩＡＰＰ由来のペプチドを評価するために使用されている２型糖尿病のトランスジェニックマウスモデルは、例えばＷｉｊｅｓｅｋａｒａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ， Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １７：１００３～１００６、２０１５）に開示されている。

【0051】

当業者に公知のように、非常に低用量のペプチド、すなわち、動物において最小の毒性であることが見出された用量（例えば、マウスにおいて１／１０×ＬＤ１０）を患者に最初に投与することができ、その用量が安全であると見出された場合、より高用量で患者を治療することができる。アミロイド疾患を治療するための本ペプチドの１つの治療有効量は次に、患者の症状が観察されるか、または減少もしくは排除されるべきことが患者により報告されるような時点までそのような状態を患う患者に増加性の量のそのようなペプチドを投与することにより決定することができる。

【0052】

本ペプチドの血中レベルは、常用の生物学的および化学的アッセイを使用して決定することができ、これらの血中レベルは、投与の経路および選択されたペプチドの半減期にマッチさせることができる。血中レベルおよび投与の経路を次に使用して、アミロイド疾患を予防および／または治療するための本ペプチドの１つを含む医薬組成物の治療有効量を確立することができる。

【0053】

アライグマおよびニワトリＩＡＰＰは、ヒトインスリンの存在下でｈＩＡＰＰ凝集を予防することが見出され、したがって糖尿病に対する治療と組み合わせた使用のために安全であることが留意されるべきである。アライグマおよびニワトリの両方のＩＡＰＰはまた、別の糖尿病治療であるプラムリンチドよりも凝集の傾向がより低い。

【実施例】

【0054】

実施例１：他の種からのｈＩＡＰＰ阻害剤を用いたチオフラビンＴアッセイ
ｈＩＡＰＰ凝集に対する阻害能力を有するＩＡＰＰペプチドを同定するために、多数の種（ウシ、デグー、モルモット、ウマ、ブタ、ラット、およびヒツジ、ウシ、デグー、モルモット、ウマ、ブタ、ラット、およびヒツジ）からの図１に示されるペプチドを２：１のモル比の動物ペプチド対ｈＩＡＰＰでｈＩＡＰＰと混合し、ｈＩＡＰＰ凝集および原線維形成を促進することが公知の条件下でインキュベートした。単独でのＩＡＰＰ、または動物ＩＡＰＰと混合されたｈＩＡＰＰをピペットでガラスチューブに入れ、ＨＦＩＰをスピードバキューム下で除去した。結果としてもたらされたペプチド試料を２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。

【0055】

３７μＭのヒトＩＡＰＰを７５μＭの各指し示される動物ＩＡＰＰと混合した。試料を２００ｒｐｍでの振盪と共に３７℃で４０分間インキュベートすることにより凝集を開始させた。指し示される時点に、各試料の１７μＬのアリコートを６６３μＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中の５０．０μＭのチオフラビンＴと混合した。Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００蛍光分光光度計を使用してチオフラビンＴ蛍光放出を次に４８８ｎｍで記録した。

【0056】

４０分後に、チオフラビンＴに結合する能力（図２を参照）および原子間力顕微鏡法を用いて同定されるような原線維を形成する能力についてこれらの試料をモニターした。

【0057】

実施例２：他の種からのｈＩＡＰＰ阻害剤を用いた原子間力顕微鏡法
ＡＦＭを使用して、図１に示される各動物ＩＡＰＰペプチドのアミロイド阻害能力を直接的に試験した。動物ＩＡＰＰを含むまたは含まないｈＩＡＰＰの試料を実施例１に記載されるように調製し、次に振盪と共に３７℃で４０分間インキュベートした。このインキュベーションの後に、１７μＬの各試料を新たに切断されたマイカに沈着させた。試料を室温で５分間インキュベートした後に、２００μＬの無菌水を用いて洗浄した。乾燥後に、Ａ／Ｃモードに設定されたＭＦＰ－３Ｄ原子間力顕微鏡（Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）および２４０μｍシリコンカンチレバー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して試料を走査した。

【0058】

ヒトＩＡＰＰは、これらの条件下で、マイカに沈着されかつＡＦＭを介して走査された場合に、高密度原線維を形成する。動物ＩＡＰＰバリアントの多くは、ＡＦＭを介して走査された場合に同様に原線維を形成し、アミロイドプラークをもたらすことが公知である。ｈＩＡＰＰと混合された場合、ウシ、デグー、イルカ、モルモット、ウマ、ブタ、ラットおよびヒツジからの動物ＩＡＰＰペプチドはいずれもｈＩＡＰＰ原線維形成に対して効果を有さず、またはｈＩＡＰＰを伴う原線維を促進するようであった。６つのＩＡＰＰバリアントはｈＩＡＰＰ原線維形成を阻害することが見出され、ニワトリ、ネコ、イヌ、ホッキョクグマ、アライグマ、およびアザラシはいずれも、線維形成を予防する有意な能力を示した。（ホッキョクグマＩＡＰＰを除いて）これらのＩＡＰＰペプチドの全ては、これらのまたは類似した条件下で凝集し、単独で原線維を形成することが公知であるという事実にこれはかかわらない。

【0059】

実施例３：他の種からのｈＩＡＰＰ阻害剤を用いた細胞生存アッセイ
生細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果からレスキューする動物ＩＡＰＰバリアントの能力を試験するために、生存および細胞傷害性の両方のアッセイを行った。細胞生存を試験するために、ミトコンドリアレダクターゼにより触媒される黄色のテトラゾリウム塩の紫色のホルマザン結晶への変換を測定するＭＴＴ比色アッセイを使用した。細胞生存研究は、ＲＩＮ－ｍ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２０５７）を使用して行った。等数のＲＩＮ－ｍ細胞を３連でプレーティングし、９６ウェルプレート中で終夜インキュベートした。翌日、１０％のＦＢＳを補足したフェノールレッドと共に新鮮なＲＰＭＩ－１６４０を細胞に加えた。ｃｅｎｔｒｉｖａｐ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＬａｂＯｎｃｏ）を使用してヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を各個々のヒトおよび動物ＩＡＰＰから除去した。全てのＩＡＰＰペプチド試料を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁した。均一な再懸濁を確実にするために、結果としてもたらされた各ＩＡＰＰ含有バイアルを、ピペットチップを用いて６回掻爬し、１５秒間ボルテックスした（Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ Ｍｉｘｅｒ）。各ＩＡＰＰペプチドの乾燥から細胞への各ＩＡＰＰペプチドの添加までの全過程を均一なものとして、各試料が等しい時間量にわたり各ＩＡＰＰペプチドとインキュベートされることを確実にした。ＩＡＰＰペプチドを細胞に加え、３７℃で４６時間インキュベートした。インキュベーション後に、各ウェル中の培地をフェノールレッドを含まない新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ－１２で置き換えた。ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－テトラゾリウムブロミド）を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルの底に形成されたホルマザン結晶を可溶化緩衝液（２０％のＳＤＳおよび５０％のジメチルホルムアミド）に再懸濁した。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各ウェルにおける吸光度を５７０ｎｍで取得した。培地はＡＴＣＣから入手した。全てのインキュベーションは、５％の二酸化炭素中３７℃で水ジャケット付きインキュベーター（Ｓｈｅｌｌ Ｌａｂ）中で行った。

【0060】

ＭＴＴ生存アッセイを使用して、単独でのｈＩＡＰＰの添加、単独での各動物ＩＡＰＰペプチドの添加、および各動物ＩＡＰＰペプチドと混合されたｈＩＡＰＰでのＲＩＮ－ｍ細胞の細胞生存を測定した（結果を図５に示す）。単独でのＲＩＮ－ｍ細胞を対照として使用し、１００％の細胞生存に設定した。１２．８μＭのヒトＩＡＰＰの添加は一貫して、５５＋／－５％への細胞生存における減少を結果としてもたらした。個々に１２．８μＭのアライグマ、ネコ、アザラシ、ホッキョクグマ、およびブタＩＡＰＰバリアントの添加は、細胞生存における平均で２０～２５％の減少を結果としてもたらしたが、ニワトリおよびラットＩＡＰＰの添加は、細胞生存に対する向上した効果を有した。１：１の比でのアライグマＩＡＰＰバリアントとのｈＩＡＰＰの混合（１２．８μＭの濃度の各ＩＡＰＰ）は、ＲＩＮ－ｍ細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果から保護した。ｈＩＡＰＰへのアライグマＩＡＰＰの添加は、細胞生存を５５％から平均で７２％に増加させた（ｐ＝０．００５７０５）。ｈＩＡＰＰへのニワトリＩＡＰＰバリアントの添加は、細胞生存を平均で７６％に増加させた（ｐ＝０．０１３５５６）。ｈＩＡＰＰへのネコおよびアザラシＩＡＰＰバリアントの添加もまた、約６２％に細胞生存を増加させ、より変化に富む結果であった。ホッキョクグマ、ラット、およびブタＩＡＰＰバリアントは、ＲＩＮ－ｍ細胞をｈＩＡＰＰの毒性効果から保護することができなかった。

【0061】

実施例４：ウェッデルアザラシＩＡＰＰペプチドバリアント
図７に示されるウェッデルアザラシＩＡＰＰのバリアントを用いてチオフラビンＴ結合アッセイを行った。ヒトＩＡＰＰ（３７μＭ）を指し示されるウェッデルアザラシバリアント（７５μＭ）のそれぞれと混合し、２００ｒｐｍでの振盪と共に３７℃で３０分間インキュベートした。結果を図８に示す。ウェッデルアザラシＩＡＰＰペプチドを同様に実施例２に記載されるように原子間力顕微鏡法に供した。図９に示されるこれらの結果は、ＷＳ＿ＲＬおよびＷＳ＿ＬＰバリアントはｈＩＡＰＰ線維形成の強い阻害剤であったことを指し示す。

【0062】

実施例５：切断されたアライグマＩＡＰＰペプチドバリアント
図１１に示されるアライグマＩＡＰＰのバリアントを用いてチオフラビンＴ結合アッセイを行った。ヒトＩＡＰＰを指し示されるアライグマバリアントのそれぞれと混合し、振盪と共に３７℃でインキュベートした。結果を図１２および図１３に示す。Ｒ１－２７、Ｒ１－２９、およびＲ１－３０バリアントはｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、そしてまたＭＴＴ生存アッセイにおいて細胞をｈＩＡＰＰ誘導性細胞傷害性からレスキューした（図１６を参照）。

【0063】

実施例６：突然変異したアライグマＩＡＰＰペプチドバリアント
図１０に示されるアライグマＩＡＰＰのバリアントを用いてチオフラビンＴ結合アッセイを行った。ヒトＩＡＰＰを指し示されるアライグマバリアントのそれぞれと混合し、振盪と共に３７℃でインキュベートした。結果を図１５に示す。図１６に示されるように、Ｒａｃ＿Ｖ８Ａ、Ｒａｃ＿Ｎ１３Ｄ、Ｒａｃ＿Ｌ１６Ｖ、Ｒａｃ＿Ｌ２２Ｉ、およびＲａｃ＿Ｌ２６ＹバリアントはｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、Ｒａｃ＿Ｌ２６Ｙはまた、ＭＴＴ生存アッセイにおいてｈＩＡＰＰの存在下で細胞生存を向上させた。

【0064】

実施例７：切断されたニワトリＩＡＰＰペプチドバリアント
図１７に示されるニワトリＩＡＰＰのバリアントを用いてチオフラビンＴ結合アッセイを行った。ヒトＩＡＰＰを指し示されるニワトリバリアントのそれぞれと混合し、振盪と共に３７℃でインキュベートした。結果を図１８に示す。Ｃ１－２７およびＣ１－２９バリアントはｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、そしてまたＭＴＴ生存アッセイにおいて細胞をｈＩＡＰＰ誘導性細胞傷害性からレスキューした（図２１を参照）。Ｃ１－２９ペプチドはＴｈＴ結合を予防したが、（実施例２に記載されるように）このペプチドを用いてＡＦＭ走査を行った場合にアミロイド線維が形成されたので、このペプチドはｈＩＡＰＰの凝集を阻害しないとして図１３において指し示される。しかしながら、それはＭＴＴアッセイにおいて細胞を保護することができたので、線維の形成の阻害に対してより低い効果を有しながら毒性オリゴマーの形成を阻害すると考えられる（より低い毒性かつＴｈＴに結合するより低い能力）。

【0065】

実施例８：突然変異したニワトリＩＡＰＰペプチドバリアント
図１４に示されるニワトリＩＡＰＰのバリアントを用いてチオフラビンＴ結合アッセイを行った。ヒトＩＡＰＰを指し示されるニワトリバリアントのそれぞれと混合し、振盪と共に３７℃でインキュベートした。結果を図１５に示す。Ｃｈ＿Ｖ１６Ｌ、Ｃｈ＿Ｉ２２Ｌ、およびＣｈ＿Ｙ２６ＬはｈＩＡＰＰ凝集を阻害し、そしてまたＭＴＴ生存アッセイにおいて細胞をｈＩＡＰＰ誘導性細胞傷害性からレスキューした（図２１を参照）。

【0066】

「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語および該用語のバリエーション、例えば「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）は、他の添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しない。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語ならびに本明細書において使用される類似した参照語は、文脈におけるそれらの使用がそうでないことを指し示さなければ、単数および複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。２つの値の「間」にあるとして記載される範囲は、指し示される値を含む。

【0067】

ある特定の好ましい実施形態を参照して本発明をかなりの詳細において記載したが、他の実施形態が可能である。例えば、本方法のために開示されるステップは、限定的であることは意図されず、各ステップが必然的に方法にとって必須であると指し示すことも意図されず、代わりに例示的なステップに過ぎない。したがって、添付の請求項の範囲は、本開示に含有される好ましい実施形態の記載に限定されるべきではない。

【0068】

本明細書における値の範囲の記載は単に、該範囲内に入る各別々の値を個々に言及するための簡略化された方法として役立つことが意図される。本明細書において他に指し示されなければ、各個々の値は、本明細書に個々に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。例えば、「約１０」は正確に１０の記載を含む。本明細書において参照される全ての参考文献は参照により全体が組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

0007505713000001.app