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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-17
(45)【発行日】2024-06-25
(54)【発明の名称】スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント
(51)【国際特許分類】
C07K 16/44 20060101AFI20240618BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240618BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240618BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240618BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240618BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240618BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240618BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240618BHJP
C07K 4/12 20060101ALI20240618BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240618BHJP
【ＦＩ】
C07K16/44 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
G01N33/531 A
C07K4/12
C12P21/08
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022547007
(86)(22)【出願日】2021-09-07
(86)【国際出願番号】 JP2021032827
(87)【国際公開番号】W WO2022050423
(87)【国際公開日】2022-03-10
【審査請求日】2023-03-06
(31)【優先権主張番号】P 2020150003
(32)【優先日】2020-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】舛廣 善和
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１８１８３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１３４２２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】舛廣 善和，タンパク質の高発現や安定化を可能にし、 先端医療にも有望なスタビロンタグの開発，NUBIC NEWS，日本大学産官学連携知財センター，2017年07月01日，pp.11-12
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2010年，Vol.397, pp.345-349
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変領域と、を含み、
配列番号９、１０又は２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する、抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
【請求項2】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項１に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
【請求項3】
配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、且つ配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、請求項１又は２に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントをコードする核酸。
【請求項5】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項6】
請求項４に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントを含む、キット。
【請求項8】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み且つアミノ酸数が１５以下であるペプチドをさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターをさらに含む、請求項７又は８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。また、前記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はベクター、前記核酸又はベクターを導入した形質転換体、前記抗体又は抗原結合フラグメントからスタビロン改変体タグ融合タンパク質を解離可能なペプチド、及び、前記スタビロン改変体に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットに関する。
本願は、２０２０年９月７日に、日本に出願された特願２０２０－１５０００３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２０年９月７日に、日本に出願された特願２０２０－１５０００３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
一般的に、エピトープタグとして、ＦＬＡＧ（登録商標）タグが普及している（例えば、特許文献１）。エピトープタグは、タグを認識する抗体（抗タグ抗体）のエピトープとなるタグ配列のことをいう。ＦＬＡＧタグを始めとするエピトープタグは、抗タグ抗体とともに用いることにより、目的のタンパク質の局在や発現量を調査したり、精製したりすることができる。
これまでに、他分子のタンパク質分解を強力に防ぐモチーフであるスタビロン（Ｓｔａｂｉｌｏｎ）配列が知られている（例えば、特許文献２）。スタビロン配列は、天然に存在するアミノ酸配列である。
これまでに、他分子のタンパク質分解を強力に防ぐモチーフであるスタビロン（Ｓｔａｂｉｌｏｎ）配列が知られている（例えば、特許文献２）。スタビロン配列は、天然に存在するアミノ酸配列である。
【0003】
タンパク質の検出又は精製用のタグとしては、天然に存在しないアミノ酸配列を有することが好ましい。そのため、スタビロン改変体が提案されている（例えば、特許文献３）。特許文献３に記載のスタビロン改変体は、天然には存在しないアミノ酸配列を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特公平７－４２５５号公報
【文献】特許第５９６１３８０号公報
【文献】特許第６６４６３１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
スタビロン改変体をエピトープタグとして実用化するためには、スタビロン改変体に特異的に結合する抗体が必要である。
スタビロン改変体に特異的に結合する抗体を実用化するためには、工業的スケールでの産生が求められるため、モノクローナル抗体であることが望ましい。また、近年では動物愛護の観点からも、モノクローナル抗体が望ましい。
スタビロン改変体に特異的に結合する抗体を実用化するためには、工業的スケールでの産生が求められるため、モノクローナル抗体であることが望ましい。また、近年では動物愛護の観点からも、モノクローナル抗体が望ましい。
【0006】
そこで、本発明は、スタビロン改変体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することを課題とする。また、前記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はベクター、前記核酸又はベクターを導入した形質転換体、前記抗体又は抗原結合フラグメントからスタビロン改変体タグ融合タンパク質を解離可能なペプチド、及び、前記抗体又は抗原結合フラグメントを含むキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域と、を含み、スタビロン改変体に特異的に結合する、抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［２］配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域、及び、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域を含む、［１］に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［３］配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、且つ配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、［１］又は［２］に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［４］［１］～［３］のいずれか１つに記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントをコードする核酸。
［５］［４］に記載の核酸を含むベクター。
［６］［４］に記載の核酸を含む形質転換体。
［７］配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み、アミノ酸数が１５以下である、ペプチド。
［８］［１］～［３］のいずれか１つに記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントを含む、キット。
［９］［７］に記載のペプチドをさらに含む、［８］に記載のキット。
［１０］配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターをさらに含む、［８］又は［９］に記載のキット。
［１］（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域と、を含み、スタビロン改変体に特異的に結合する、抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［２］配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域、及び、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域を含む、［１］に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［３］配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、且つ配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない、［１］又は［２］に記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメント。
［４］［１］～［３］のいずれか１つに記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントをコードする核酸。
［５］［４］に記載の核酸を含むベクター。
［６］［４］に記載の核酸を含む形質転換体。
［７］配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含み、アミノ酸数が１５以下である、ペプチド。
［８］［１］～［３］のいずれか１つに記載の抗体、又は、その抗原結合フラグメントを含む、キット。
［９］［７］に記載のペプチドをさらに含む、［８］に記載のキット。
［１０］配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むベクターをさらに含む、［８］又は［９］に記載のキット。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、スタビロン改変体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することができる。また、前記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はベクター、前記核酸又はベクターを導入した形質転換体、前記抗体又は抗原結合フラグメントからスタビロン改変体タグ融合タンパク質を解離可能なペプチド、及び、前記抗体又は抗原結合フラグメントを含むキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】抗Ｆｌａｇ抗体又は抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。図中、Ａ～Ｆは、表１の６種の発現プラスミドを示す。
【図2】Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－ＳｔａｂｉｌｏｎＮｏ９／ｐｃＤＮＡ３を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞抽出液において、抗Ｆｌａｇ抗体（ＩＰ；Ｆｌａｇ）、抗体「２３－２Ｅ」（ＩＰ；２３）、又は抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」（ＩＰ；２４）を用いて免疫沈降し、ウエスタンブロット解析した結果を示す。図中。「Ｌｙｓａｔｅ」は免疫沈降を行っていないサンプルを示す。
【図3】免疫沈降サンプルをアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色した結果を示す。免疫沈降サンプルは、図２と同様のものを用いた。図中、「ＩＰ；Ｐｒｏｇ」は、ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅのみを添加して反応させたサンプル（抗体非添加）を示す。
【図4】Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ／ｐｃＤＮＡ３を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いて免疫染色した結果を示す。
【図5】ペプチドＡ（図中の「Ａ」）又はペプチドＢ（図中の「Ｂ」）によるスタビロン改変体タグ融合タンパク質の溶出試験の結果を示す。抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」結合ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅからスタビロン改変体タグ融合タンパク質を溶出し、溶出液のウエスタンブロット解析を行った。図中、「３．０」は０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０）を用いて溶出した結果を示す。
【図6】大腸菌発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性をウエスタンブロット解析により検討した結果を示す。図中、「ＩＰＴＧ（＋）」は、ｌａｃプロモーター制御下でスタビロン改変体タグ融合タンパク質を発現する大腸菌において、ＩＰＴＧによる発現誘導を行った菌体の抽出液を用いた結果を示す。図中、「ＩＰＴＧ（－）」は、ｌａｃプロモーター制御下でスタビロン改変体タグ融合タンパク質を発現する大腸菌において、ＩＰＴＧによる発現誘導を行わなかった菌体の抽出液を用いた結果を示す。
【図7】植物発現系及び昆虫発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性をウエスタンブロット解析により検討した結果を示す。図中、「（＋）」は、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を添加した生物抽出液を用いた結果を示す。図中、「（－）」は、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を添加していない生物抽出液を用いた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）態様を包含する。
【0011】
タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態から分離された状態を意味する。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ベクター、及び細胞は、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、単離されたポリヌクレオチド（単離されたＤＮＡ、単離されたＲＮＡ）、単離されたベクター、及び単離された細胞であり得る。
【0012】
本明細書において、塩基配列どうし又はアミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く、塩基配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。塩基配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【0013】
＜抗体、又は、その抗原結合フラグメント＞
一態様において、本発明は、スタビロン改変体に特異的に結合する抗体、又は、その抗原結合フラグメントを提供する。
前記抗体は、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変領域と、
を含み、スタビロン改変体に特異的に結合する。
一態様において、本発明は、スタビロン改変体に特異的に結合する抗体、又は、その抗原結合フラグメントを提供する。
前記抗体は、
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｆ）配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変領域と、
を含み、スタビロン改変体に特異的に結合する。
【0014】
スタビロンは、主として酸性アミノ酸からなるアミノ酸配列を有するタンパク質分解阻害モチーフである。スタビロンは、好ましくは、ＤＰ－１タンパク質（ヒトＤＰ－１の例：ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００７１１１．５）のＣ末端側の酸性アミノ酸領域の全部又は一部のアミノ酸配列からなるか、又はこれを含む、タンパク質分解阻害モチーフである。スタビロン配列は、スタビロンが有するアミノ酸配列である。
具体的には、スタビロンは、ＤＰ－１タンパク質のＣ末端側の領域である３９５～４１０位のアミノ酸配列領域から成る分解阻害モチーフである。典型的には、スタビロンは、下記アミノ酸配列を含む。
ＥＤＤＥＥＤＤＤＦＮＥＮＤＥＤＤ（配列番号１１）
Ｅ：グルタミン酸
Ｄ：アスパラギン酸
Ｎ：アスパラギン
Ｆ：フェニルアラニン
具体的には、スタビロンは、ＤＰ－１タンパク質のＣ末端側の領域である３９５～４１０位のアミノ酸配列領域から成る分解阻害モチーフである。典型的には、スタビロンは、下記アミノ酸配列を含む。
ＥＤＤＥＥＤＤＤＦＮＥＮＤＥＤＤ（配列番号１１）
Ｅ：グルタミン酸
Ｄ：アスパラギン酸
Ｎ：アスパラギン
Ｆ：フェニルアラニン
【0015】
本明細書において、「スタビロン改変体」とは、上記スタビロン配列の改変体を意味する。具体的には、スタビロン改変体は、配列番号１１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を有する。スタビロン改変体は、好ましくは下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列を含む。
Ｘｐ（ＸＦＤＸＮ）ｍＸｑ（ＸＦＤＸＮ）ｎＸｒ （Ｉ）
（ＸはＥ又はＤを表し；ｐは０～１０の整数を表し；ｑは０～２０の整数を表し；ｒは０～１０の整数を表し；ｍは０～３の整数を表し；ｎは０～３の整数を表す。但し、ｐ＋ｑ＋ｒ≧４である。）
Ｘｐ（ＸＦＤＸＮ）ｍＸｑ（ＸＦＤＸＮ）ｎＸｒ （Ｉ）
（ＸはＥ又はＤを表し；ｐは０～１０の整数を表し；ｑは０～２０の整数を表し；ｒは０～１０の整数を表し；ｍは０～３の整数を表し；ｎは０～３の整数を表す。但し、ｐ＋ｑ＋ｒ≧４である。）
【0016】
スタビロン改変体は、天然には存在しないアミノ酸配列からなることが好ましい。スタビロン改変体としては、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
【0017】
本明細書において、「天然に存在しないアミノ酸配列」とは、天然に存在するタンパク質内に存在しないアミノ酸配列を意味する。天然に存在しないアミノ酸配列は、例えば、対象のアミノ酸配列をクエリーとして、タンパク質データベースを検索し、相同性の高い（例えば、配列同一性が６０％以上、７０％以上、又は８０％以上）天然タンパク質がヒットしないアミノ酸配列である。タンパク質データベースとしては、例えば、ＮＣＢＩが提供するＮｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｎｒ）データベースが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸配列は、例えば、ｎｒデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／）を、ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎs）プログラムを用いて検索した結果、アライメントスコアが８０以下、より好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下のタンパク質しかヒットしないアミノ酸配列であってもよい。
【0018】
本明細書において、抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を意味する。本実施形態の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を意味する。本実施形態の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【0019】
本明細書において、抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、当該抗体が特異的に結合する標的タンパク質（抗原）に特異的に結合するものを意味する。抗原結合フラグメントは、通常、抗体の６つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１～３、ＣＤＲ－Ｌ１～３）のいずれかを含む。抗原結合フラグメントは、６つのＣＤＲの全てを含むことが好ましい。抗原結合フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【0020】
本明細書において、「特異的に結合する」とは、抗体が標的タンパク質（抗原）に高い結合性を示し、他の抗原に対する結合性が認められないか、極めて低いことを意味する。抗体の抗原に対する結合性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける抗体の抗原への結合を定量することにより評価することができる。前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、例えば、精製抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ等）等が挙げられる。抗原に対する抗体の結合親和性は、ｋａ（結合速度定数：抗体－抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、及び解離定数ＫＤ（ｋｄ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の解離定数（ＫＤ）は、１０－８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０－１３ｍｏｌ／Ｌ以上１０－９ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。
【0021】
本明細書中において「アミノ酸が欠失されている」とは、アミノ酸配列の任意の位置のアミノ酸が欠損していることを意味する。
【0022】
本明細書中において「アミノ酸が置換されている」とは、アミノ酸配列の任意の位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換していることを意味する。アミノ酸が置換される場合、元のアミノ酸の側鎖と置換されたアミノ酸の側鎖は、化学的性質が類似することが好ましい。
化学的性質が類似するアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、アミノ酸は、側鎖の種類により、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸（炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン））等に分類することができる。
化学的性質が類似するアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、アミノ酸は、側鎖の種類により、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸（炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン））等に分類することができる。
【0023】
本明細書中において、「アミノ酸が付加されている」とは、アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にアミノ酸が付加されること、又はペプチドの任意の位置にアミノ酸が挿入されることを意味する。
【0024】
前記（ａ）～（ｆ）において、欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸の数は、特に限定されないが、例えば、１～４個、１～３個、１個～２個、又は１個が好ましい。
【0025】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、中でも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域、及び、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域を有することが好ましい。本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域、及び、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域を有することが好ましい。
本明細書において、「ＣＤＲ」は相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。本明細書において、抗体の重鎖可変領域が有する３つのＣＤＲをＮ末端側から順に、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と記載する。本明細書において、抗体の軽鎖可変領域が有する３つのＣＤＲをＮ末端側から順に、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３と記載する。
本明細書において、「ＣＤＲ」は相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を意味する。本明細書において、抗体の重鎖可変領域が有する３つのＣＤＲをＮ末端側から順に、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と記載する。本明細書において、抗体の軽鎖可変領域が有する３つのＣＤＲをＮ末端側から順に、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３と記載する。
【0026】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、スタビロン改変体に特異的に結合し、且つスタビロンに結合しないことが好ましい。
すなわち、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、且つ配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しないことがより好ましい。
すなわち、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合し、且つ配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しないことがより好ましい。
【0027】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法としては、特に限定されず、公知の抗体製造方法を用いることができる。公知の抗体製造方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法等が挙げられる。
【0028】
ハイブリドーマ法としては、例えば、ケーラー及びミルスタインにより開発された方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５，１９７５． 参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、ハイブリドーマの培養液から取得する方法、または、ハイブリドーマを移植した哺乳動物の腹水から取得する方法等が挙げられる。
【0029】
組換えＤＮＡ法としては、例えば本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸（ＤＮＡ）を適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントを組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、「Ｐ． Ｊ． Ｄｅｌｖｅｓ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９７ ＷＩＬＥＹ」、「Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ」、「Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９２ ： ７６７－７７５ （１９９０）」参照）。本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡは、これらを産生するハイブリドーマ又はＢ細胞等からクローニングしてもよく、ホスホロアミダイト法等により化学合成してもよい。
本実施形態の抗体をコードするＤＮＡは、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡをそれぞれ別の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい。あるいは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントは、上記のように形質転換された宿主細胞を培養することにより、宿主細胞に産生させることができる。産生された抗体又は抗原結合フラグメントは、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体又は抗原結合フラグメントの分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。
本実施形態の抗体をコードするＤＮＡは、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡをそれぞれ別の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい。あるいは、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントは、上記のように形質転換された宿主細胞を培養することにより、宿主細胞に産生させることができる。産生された抗体又は抗原結合フラグメントは、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体又は抗原結合フラグメントの分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。
【0030】
トランスジェニック動物を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
【0031】
本実施形態の抗体は、例えば、腸骨リンパ法によって作製することができる。
マウス腸骨リンパ節法としては、日本国特許第４０９８７９６号公報に記載の方法を用いることができる。マウス腸骨リンパ節法は、免疫をしたマウスの腸骨リンパ節を使用する。抗原免疫注射は、マウスの尾根部への１回のみとし、抗体免疫注射後２～３週間後に細胞融合を行う。その後、ＥＬＩＳＡスクリーニングを行い、ハイブリドーマのクローニングを行う。
マウス腸骨リンパ節法としては、日本国特許第４０９８７９６号公報に記載の方法を用いることができる。マウス腸骨リンパ節法は、免疫をしたマウスの腸骨リンパ節を使用する。抗原免疫注射は、マウスの尾根部への１回のみとし、抗体免疫注射後２～３週間後に細胞融合を行う。その後、ＥＬＩＳＡスクリーニングを行い、ハイブリドーマのクローニングを行う。
【0032】
本実施形態の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むことが好ましい。
【0033】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、スタビロン改変体に特異的に結合できるものであれば、アミノ酸配列変異体であってもよい。具体的には、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むものであってもよい。重鎖可変領域又は軽鎖可変領域において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、例えば、１～２０個が挙げられ、１～１０個が好ましく、１～５個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１又は２個が特に好ましい。あるいは、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域と、を含むものであってもよい。前記配列同一性は、９５％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【0034】
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列において改変される部位は、改変される前の抗体と同等の抗原結合活性を有する限り、特に限定されない。改変部位は、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、「ＰＮＡＳ， １０２ ： ８４６６－８４７１（２００５）」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１ ： ４８５－４９３ （２００８）」、国際公開第２００２／０５１８７０号、「Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８０ ： ２４８８０－２４８８７ （２００５）」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２１ ： ３４５－３５１ （２００８）」参照）。
【0035】
アミノ酸配列変異体は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域において、ＣＤＲのアミノ酸配列が改変されてもよく、フレームワーク領域のアミノ酸配列が改変されてもよい。
重鎖可変領域における改変の割合は、ＣＤＲ以外の重鎖可変領域（すなわち４つのフレームワーク領域）のアミノ酸配列全体を１００％として、１５％以下が好ましく、１２％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましく、５％以下、３％以下、２％以下又は１％以下が特に好ましい。軽鎖可変領域における改変の割合は、ＣＤＲ以外の軽鎖可変領域（すなわち４つのフレームワーク領域）のアミノ酸配列全体を１００％として、１５％以下が好ましく、１２％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましく、５％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下が特に好ましい。改変は、ＣＤＲ以外の領域（フレームワーク領域）で行われることが好ましい。
重鎖可変領域における改変の割合は、ＣＤＲ以外の重鎖可変領域（すなわち４つのフレームワーク領域）のアミノ酸配列全体を１００％として、１５％以下が好ましく、１２％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましく、５％以下、３％以下、２％以下又は１％以下が特に好ましい。軽鎖可変領域における改変の割合は、ＣＤＲ以外の軽鎖可変領域（すなわち４つのフレームワーク領域）のアミノ酸配列全体を１００％として、１５％以下が好ましく、１２％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましく、５％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下が特に好ましい。改変は、ＣＤＲ以外の領域（フレームワーク領域）で行われることが好ましい。
【0036】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメント（上述のアミノ酸配列変異体等も含む）のスタビロン改変体への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法、プラズモン共鳴アッセイ等により評価することができる。
【0037】
本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、スタビロン改変体を含むペプチド又はタンパク質を検出するために用いることができる。また、本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、スタビロン改変体を含むペプチド又はタンパク質を単離及び／又は精製するために用いることができる。
本明細書において、スタビロン改変体を含むペプチド又はタンパク質を「スタビロン改変体タグ融合タンパク質」又は「スタビロン改変体タグ融合ペプチド」という場合がある。
本明細書において、スタビロン改変体を含むペプチド又はタンパク質を「スタビロン改変体タグ融合タンパク質」又は「スタビロン改変体タグ融合ペプチド」という場合がある。
【0038】
＜抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸＞
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述した抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、まとめて「抗スタビロン改変体抗体」ともいう）をコードする。本実施形態の核酸を、適切な宿主細胞に導入して発現させることにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述した抗体又はその抗原結合フラグメント（以下、まとめて「抗スタビロン改変体抗体」ともいう）をコードする。本実施形態の核酸を、適切な宿主細胞に導入して発現させることにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
【0039】
本実施形態の核酸としては、例えば、上述した抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする遺伝子、及び上述した抗体の重鎖可変領域を含む重鎖をコードする遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の核酸としては、例えば、前記抗体と同じ抗原結合性を有する抗原結合フラグメントをコードする遺伝子が挙げられる。
本実施形態の核酸の好適な例としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗体又はその抗体フラグメントをコードする核酸が挙げられる。配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号１２に記載の塩基配列が挙げられる。前記核酸の具体例としては、例えば、重鎖可変領域をコードする塩基配列として配列番号１２に記載の塩基配列を含み、及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列として配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸が挙げられる。
本実施形態の核酸としては、例えば、前記抗体と同じ抗原結合性を有する抗原結合フラグメントをコードする遺伝子が挙げられる。
本実施形態の核酸の好適な例としては、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む抗体又はその抗体フラグメントをコードする核酸が挙げられる。配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号１２に記載の塩基配列が挙げられる。前記核酸の具体例としては、例えば、重鎖可変領域をコードする塩基配列として配列番号１２に記載の塩基配列を含み、及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列として配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸が挙げられる。
【0040】
＜ベクター＞
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述した核酸を含む。本実施形態のベクターは、発現ベクターであってもよい。本実施形態のベクターを適切な宿主に導入することにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述した核酸を含む。本実施形態のベクターは、発現ベクターであってもよい。本実施形態のベクターを適切な宿主に導入することにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
【0041】
発現ベクターとしては、導入対象の細胞中でベクターが含む上述の核酸がコードする抗体又は抗原結合フラグメントを発現可能なものであれば特に限定されない。発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージベクター；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルスベクター；及びこれらを改変したベクター等が挙げられる。
【0042】
本明細書において、「発現ベクター」とは、対象核酸を含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象核酸を発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを意味する。「発現可能な状態」とは、対象核酸が導入された細胞内で、対象核酸が転写され得る状態にあることを意味する。
発現ベクターは、上述の核酸に加えて、他の塩基配列を含んでもよい。他の塩基配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、マーカー遺伝子、複製開始点等が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターを含むことが好ましく、プロモーターに上述の核酸（遺伝子）が機能的に連結されていることが好ましい。核酸（遺伝子）がプロモーターに機能的に連結されているとは、当該核酸が、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
発現ベクターは、上述の核酸に加えて、他の塩基配列を含んでもよい。他の塩基配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、マーカー遺伝子、複製開始点等が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターを含むことが好ましく、プロモーターに上述の核酸（遺伝子）が機能的に連結されていることが好ましい。核酸（遺伝子）がプロモーターに機能的に連結されているとは、当該核酸が、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
【0043】
＜形質転換体＞
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、上述した核酸又はベクターを含む。本実施形態の形質転換体が微生物又は培養細胞である場合、適切な培地で培養することにより、スタビロン改変体に特異的に結合する抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。形質転換体が植物体又は動物体である場合、当該植物体又は動物体を生育させ、当該植物体又は動物体から抗スタビロン改変体抗体を抽出、精製することにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
本発明の一実施形態に係る形質転換体は、上述した核酸又はベクターを含む。本実施形態の形質転換体が微生物又は培養細胞である場合、適切な培地で培養することにより、スタビロン改変体に特異的に結合する抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。形質転換体が植物体又は動物体である場合、当該植物体又は動物体を生育させ、当該植物体又は動物体から抗スタビロン改変体抗体を抽出、精製することにより、抗スタビロン改変体抗体を製造することができる。
【0044】
形質転換体としては、例えば、上述した核酸又はベクターが導入された、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；上述した核酸又はベクターが導入された、カイコ等の昆虫生体；上述した核酸又はベクターが導入された、タバコ等の植物体；乳中、卵中に上述した抗スタビロン改変体抗体を発現するように遺伝子改変された、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ等の動物等が挙げられる。
【0045】
＜溶出ペプチド＞
本発明の一実施形態に係るペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列（ＥＦＮＤＮＤＥ）を含み、アミノ酸数が１５以下である。
本発明の一実施形態に係るペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列（ＥＦＮＤＮＤＥ）を含み、アミノ酸数が１５以下である。
【0046】
本実施形態のペプチドは、スタビロン改変体のアミノ酸配列（例えば、配列番号９又は１０）の一部（ＥＦＮＤＮＤＥ：配列番号２０）を含む。本実施形態のペプチドは、上述の抗スタビロン改変体抗体のエピトープを含む。本実施形態のペプチドは、スタビロン改変体タグ融合タンパク質と抗スタビロン改変体抗体との抗原抗体複合体と接触させることにより、前記抗原抗体複合体から、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を解離させることができる。
【0047】
本実施形態のペプチドに含まれるアミノ酸数は、７～１５個である。本実施形態のペプチドのアミノ酸数は、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、又は７個が好ましい。アミノ酸数が７個であるペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【0048】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列に付加されるアミノ酸の種類は、特に限定されない。アミノ酸の付加は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列のＮ末端側であってもよく、Ｃ末端側であってもよく、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方であってもよい。
【0049】
本実施形態のペプチドは、例えば、抗スタビロン改変体抗体結合レジンに、抗スタビロン改変体抗体を介して捕捉されたスタビロン改変体タグ融合タンパク質を溶出するために用いることができる。例えば、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を含む細胞抽出液等を抗スタビロン改変体抗体結合担体に接触させて、抗スタビロン改変体抗体によりスタビロン改変体タグ融合タンパク質を捕捉させる。次いで、適宜、抗スタビロン改変体抗体結合担体を洗浄した後、本実施形態のペプチドを抗スタビロン改変体抗体結合担体に接触させる。これにより、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を抗スタビロン改変体抗体結合担体から溶出することができる。したがって、本実施形態のペプチドを、抗スタビロン改変体抗体と共に用いることにより、細胞抽出液等のタンパク質混合物から、スタビロン改変体タグ融合タンパク質を単離及び精製することができる。
【0050】
抗スタビロン改変体抗体を結合させる担体としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ等の免疫グロブリン結合タンパク質を結合させた担体が挙げられる。免疫グロブリン結合タンパク質を結合させた担体に、抗スタビロン改変体抗体を接触させることにより、抗スタビロン改変体抗体結合担体を作製することができる。担体としては、特に限定されないが、例えば、樹脂ビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、アガロースビーズ等）、磁気ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0051】
＜スタビロン改変体検出キット＞
本発明の一実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、上述の抗体又はその抗原結合フラグメント（抗スタビロン改変体抗体）を含む。本実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、抗スタビロン改変体抗体に加えて、他の構成を含んでいてもよい。他の構成としては、例えば、上述の溶出ペプチド、スタビロン改変体をコードする塩基配列を含むベクター等が挙げられる。また、本実施形態のキットは、さらに、抗スタビロン改変抗体結合用担体、各種バッファー類、細胞溶解液、及び使用説明書等を含んでいてもよい。本実施形態のキットにおいて、抗スタビロン改変体抗体は、担体に結合されていてもよい。担体としては、前記＜溶出ペプチド＞で挙げたものと同様のものが挙げられる。
本発明の一実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、上述の抗体又はその抗原結合フラグメント（抗スタビロン改変体抗体）を含む。本実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、抗スタビロン改変体抗体に加えて、他の構成を含んでいてもよい。他の構成としては、例えば、上述の溶出ペプチド、スタビロン改変体をコードする塩基配列を含むベクター等が挙げられる。また、本実施形態のキットは、さらに、抗スタビロン改変抗体結合用担体、各種バッファー類、細胞溶解液、及び使用説明書等を含んでいてもよい。本実施形態のキットにおいて、抗スタビロン改変体抗体は、担体に結合されていてもよい。担体としては、前記＜溶出ペプチド＞で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【0052】
≪スタビロン改変体をコードする塩基配列を含むベクター≫
本実施形態のキットは、抗スタビロン改変体抗体に加えて、スタビロン改変体をコードする塩基配列（以下、「スタビロン改変体遺伝子」ともいう）を含むベクターを含んでもよい。スタビロン改変体をコードする塩基配列は、スタビロン改変体をコードする限り、特に限定されない。スタビロン改変体は、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２２に記載の塩基配列が挙げられる。配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２３に記載の塩基配列が挙げられる。
本実施形態のキットは、抗スタビロン改変体抗体に加えて、スタビロン改変体をコードする塩基配列（以下、「スタビロン改変体遺伝子」ともいう）を含むベクターを含んでもよい。スタビロン改変体をコードする塩基配列は、スタビロン改変体をコードする限り、特に限定されない。スタビロン改変体は、配列番号９又は１０に記載のアミノ酸配列を含むことが好ましい。配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２２に記載の塩基配列が挙げられる。配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号２３に記載の塩基配列が挙げられる。
【0053】
ベクターは、任意のペプチド又はタンパク質（以下、「被験ペプチド」ともいう）をコードする塩基配列を含む核酸（以下、「被験ペプチド遺伝子」ともいう）の挿入サイトを含むことが好ましい。ベクターは、前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、スタビロン改変体と被験ペプチドとの融合タンパク質を発現し得る構造を有することが好ましい。
ベクターは、例えば、スタビロン改変体遺伝子の上流に前記挿入サイトを有してもよい。前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、スタビロン改変体遺伝子と被験ペプチド遺伝子とがインフレームで連結されることが好ましい。この場合、Ｎ末端側にスタビロン改変体タグが融合された被験ペプチドを発現させることができる。
あるいは、ベクターは、例えば、スタビロン改変体遺伝子の下流に前記挿入サイトを有してもよい。前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、被験ペプチド遺伝子とスタビロン改変体遺伝子とがインフレームで連結されることが好ましい。この場合、前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、Ｃ末端側にスタビロン改変体タグが融合された被験ペプチドを発現させることができる。
ベクターは、例えば、スタビロン改変体遺伝子の上流に前記挿入サイトを有してもよい。前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、スタビロン改変体遺伝子と被験ペプチド遺伝子とがインフレームで連結されることが好ましい。この場合、Ｎ末端側にスタビロン改変体タグが融合された被験ペプチドを発現させることができる。
あるいは、ベクターは、例えば、スタビロン改変体遺伝子の下流に前記挿入サイトを有してもよい。前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、被験ペプチド遺伝子とスタビロン改変体遺伝子とがインフレームで連結されることが好ましい。この場合、前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子を挿入することで、Ｃ末端側にスタビロン改変体タグが融合された被験ペプチドを発現させることができる。
【0054】
ベクターは、スタビロン改変体遺伝子と前記挿入サイトとの間に、任意のプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含んでもよい。プロテアーゼ認識配列は、プロテアーゼに認識されて、切断されるアミノ酸配列である。プロテアーゼとしては、例えば、トロンビンや、ＴＥＶプロテアーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターが、プロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含むことで、前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子が挿入された場合に、スタビロン改変体タグと被験ペプチドとの間にプロテアーゼ認識配列を有する融合タンパク質を発現させることができる。これにより、必要に応じて、プロテアーゼにより前記プロテアーゼ認識配列を切断し、スタビロン改変体タグと被験ペプチドとを分離することができる。
【0055】
ベクターの種類は、特に限定されず、＜ベクター＞の項で挙げたものと同様のものを用いることができる。ベクターは、さらに、プロモーター、エンハンサー、マーカー遺伝子、複製開始点等を含んでもよい。ベクターは、例えば、前記挿入サイトに被験ペプチド遺伝子が挿入されることにより形成されるスタビロン改変体遺伝子／被験ペプチド遺伝子の融合遺伝子に対して、その発現を制御するプロモーターを含むことが好ましい。
【0056】
≪スタビロン改変体の検出方法≫
本実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、スタビロン改変体の検出に有効に用いることができる。
スタビロン改変体の検出方法は、抗スタビロン改変体抗体をタグ抗体として用いることを特徴としている。具体的には、スタビロン改変体を結合又は融合させた被験物質と、抗スタビロン改変体抗体との抗原抗体反応を利用して、被験物質を検出することができる。スタビロン改変体の検出方法は、以下の工程を含むことができる。
本実施形態に係るスタビロン改変体検出キットは、スタビロン改変体の検出に有効に用いることができる。
スタビロン改変体の検出方法は、抗スタビロン改変体抗体をタグ抗体として用いることを特徴としている。具体的には、スタビロン改変体を結合又は融合させた被験物質と、抗スタビロン改変体抗体との抗原抗体反応を利用して、被験物質を検出することができる。スタビロン改変体の検出方法は、以下の工程を含むことができる。
【0057】
（１）抗スタビロン改変体抗体をタグ抗体として用いて、スタビロン改変体で標識された被験物質と抗原抗体反応を行う工程。
（２）タグ抗体が結合した抗原抗体複合体を指標として、被験物質を検出する工程。
（２）タグ抗体が結合した抗原抗体複合体を指標として、被験物質を検出する工程。
【0058】
「スタビロン改変体で標識された被験物質」としては、スタビロン改変体をエピトープタグとして融合した被験ペプチド（以下、「スタビロン改変体タグ融合ペプチド」ともいう）が挙げられる。スタビロン改変体タグ融合ペプチドは、公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、スタビロン改変体遺伝子と被験ペプチド遺伝子とを含む融合遺伝子を作製し、前記融合遺伝子を適切な発現系（細胞発現系、又は無細胞発現系）で発現させることにより、スタビロン改変体タグ融合ペプチドを調製することができる。具体的には、例えば、スタビロン改変体をコードする塩基配列を有し、スタビロン改変体タグを被験ペプチドの末端等に融合した状態で発現することが可能な「融合ペプチド発現用ベクター」を用いてもよい。この場合、まず被験ペプチドをコードする塩基配列を有する核酸を融合ペプチド発現用ベクターに組み込み、前記ベクターをそれに適した発現系に供してスタビロン改変体タグ融合ペプチドを発現させる。このように発現産生されたスタビロン改変体タグ融合ペプチドは、抗スタビロン改変体抗体とスタビロン改変体タグとの親和性を利用したアフィニティー精製法により単離回収することができる。この際に、上述の溶出ペプチドを用いて、スタビロン改変体タグ融合ペプチドを溶出してもよい。
【0059】
タグ融合ペプチドは、スタビロン改変体タグと被験ペプチドとの間に任意のプロテアーゼ認識配列を含んでもよい。プロテアーゼ認識配列を有するスタビロン改変体タグ融合ペプチドは、必要に応じて、精製した後に、プロテアーゼを用いてプロテアーゼ認識配列を切断することにより、スタビロン改変体タグと被験ペプチドとを分離することができる。スタビロン改変体タグ及び消化されなかったスタビロン改変体タグ融合ペプチドは、抗スタビロン改変体抗体を用いたアフィニティー精製法により回収又は除去することができる。これにより、被験ペプチドを単離回収することができる。
【0060】
抗原抗体反応に採用される条件は、抗スタビロン改変体抗体がスタビロン改変体タグ融合タンパク質のスタビロン改変体タグを認識し結合し得る条件であればよく、特に制限されない。抗原抗体反応は、タグ融合タンパク質を発現させた細胞内の生体環境条件下で実施してもよい。この場合、所望のタンパク質の発現プロファイリング等に応用することもできる。
【0061】
被験物質（スタビロン改変体タグ融合ペプチド）の検出は、抗原抗体反応により生成した抗原抗体複合体を指標として行うことができる（免疫染色）。この場合、抗スタビロン改変体抗体を標識物質で標識して用いてもよい。標識物質としては、例えば、放射性同位体、非放射性同位体、蛍光色素、酵素等が挙げられるが、これらに限定されない。抗原抗体複合体は、抗スタビロン改変体抗体の標識に用いられた標識物質を指標として検出することができる。
【0062】
以上の通り、本実施形態のスタビロン改変体検出キットによれば、スタビロン改変体、および抗スタビロン改変体抗体を用いることにより、スタビロン改変体で標識された被験物質を特異的に検出することができる。そのため、所望のペプチド又はタンパク質の精製、及び細胞内での所望のペプチド又はタンパク質の発現解析又は動態解析等に使用することができる。
【実施例】
【0063】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0064】
［１］ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体の作製は、株式会社アイティーエム（ＩＴＭ社）に委託して行った。ＩＴＭ社では、マウス腸骨リンパ節法（特許第４０９８７９６号公報、参照。重井医学研究所からのライセンス許諾により実施。）を用いて、ハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体の作製を行った。抗原としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体の合成ペプチド混合液を用いた。抗原性向上の観点から、これらのペプチドのＮ末側にはシステイン（Ｃｙｓ）を配置し、ＫＬＨコンジュゲートとした。
ハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体の作製は、株式会社アイティーエム（ＩＴＭ社）に委託して行った。ＩＴＭ社では、マウス腸骨リンパ節法（特許第４０９８７９６号公報、参照。重井医学研究所からのライセンス許諾により実施。）を用いて、ハイブリドーマの樹立及びモノクローナル抗体の作製を行った。抗原としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体の合成ペプチド混合液を用いた。抗原性向上の観点から、これらのペプチドのＮ末側にはシステイン（Ｃｙｓ）を配置し、ＫＬＨコンジュゲートとした。
【0065】
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングで、ハイブリドーマ２株を選択した。これらのハイブリドーマは、抗原ペプチドに対する力価が高い抗体を産生すると予想された。得られた２株のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」と命名した。
【0066】
［２］抗体精製
抗体「２３－２Ｅ」及び「２４－８Ｇ－４Ｇ」を産生する各ハイブリドーマ株をギット培地（和光純薬工業；６３７－２５７１５）で培養した。７５ｃｍ２フラスコ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ；１５６８００－Ｎｕｎｃ Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ Ｔ７５ ＥａｓｙＦｌａｓｋ， Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｐ）を用いて、ハイブリドーマを４日間培養した。その後、３０００ｒｐｍ，５分間の遠心分離を行い、細胞と上清とを分離した。上清を新しいチューブに移し、プロテインＧセファロース（ＧＥ ヘルスケア）を加えた。１時間４℃で反応後、プロテインＧセファロースをＴＮＥ－Ｔで洗浄し、グリシンバッファー（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出後は直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を加えて中和し、セントリコン（アミコンウルトラ－１５；メルクミリポア）で抗体を濃縮した。
抗体「２３－２Ｅ」及び「２４－８Ｇ－４Ｇ」を産生する各ハイブリドーマ株をギット培地（和光純薬工業；６３７－２５７１５）で培養した。７５ｃｍ２フラスコ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ；１５６８００－Ｎｕｎｃ Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ Ｔ７５ ＥａｓｙＦｌａｓｋ， Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｐ）を用いて、ハイブリドーマを４日間培養した。その後、３０００ｒｐｍ，５分間の遠心分離を行い、細胞と上清とを分離した。上清を新しいチューブに移し、プロテインＧセファロース（ＧＥ ヘルスケア）を加えた。１時間４℃で反応後、プロテインＧセファロースをＴＮＥ－Ｔで洗浄し、グリシンバッファー（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出後は直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を加えて中和し、セントリコン（アミコンウルトラ－１５；メルクミリポア）で抗体を濃縮した。
【0067】
＜試験例１：ウエスタンブロット解析＞
抗原タンパク質の発現プラスミドとして、表１に示す６種の発現プラスミドを用いたウエスタンブロット解析を行った。表１において、「／」の左側は抗原タンパク質を示す。「／」の右側はプラスミドの種類を示す。Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎは、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体を示す。Ｎｏ．１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体を示す。Ｎｏ．０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ（ＤＰ－１ Ｓｔａｂｉｌｏｎ）は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるスタビロンを示す。
抗原タンパク質の発現プラスミドとして、表１に示す６種の発現プラスミドを用いたウエスタンブロット解析を行った。表１において、「／」の左側は抗原タンパク質を示す。「／」の右側はプラスミドの種類を示す。Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎは、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体を示す。Ｎｏ．１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるスタビロン改変体を示す。Ｎｏ．０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ（ＤＰ－１ Ｓｔａｂｉｌｏｎ）は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるスタビロンを示す。
【0068】
【表1】
【0069】
上記Ａ～Ｆの６種の発現プラスミドは、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、アンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ＭＡＸＩ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
【0070】
次に、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（以下、「ＨＥＫ２９３Ｔ細胞」ともいう。）を培養した。培地は、Ｄ－ＭＥＭ液体培地（和光純薬）に、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清、及び、１／１００希釈ストレプトマイシンペニシリン（和光純薬）を混合した培地を使用した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、６０％コンフルエントになったところで、リン酸カルシウム法でＡ～Ｆのいずれかの発現プラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドを培地に添加してから、８時間後に、１ｍｌの培地を追加し、更に２４時間後に培地を除去し、細胞抽出を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに播種し、６０％コンフルエントになったところで、リン酸カルシウム法でＡ～Ｆのいずれかの発現プラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドを培地に添加してから、８時間後に、１ｍｌの培地を追加し、更に２４時間後に培地を除去し、細胞抽出を行った。
【0071】
細胞抽出は、１ｗｅｌｌ当たり８０μｌのＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ７．９］，１／１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を用いて、ピペッティングで行った。破砕した細胞残渣は、高速遠心（１４０００ｒｐｍ、５分間、４℃）で分離した。高速遠心後、上清６０μｌを別チューブに移し、更に６０μｌの２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］，４％ ＳＤＳ，２０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０１％ ＢＰＢ，１０％ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を加え、９８℃で２分間煮沸した。ウエスタンブロット解析には、前記のように調製したサンプルを各々４μｌ用いた。
【0072】
電気泳動は通常のＳＤＳ－ＰＡＧＥで行い、１０％アクリルアミド濃度の分離ゲルを使用した。泳動後、ゲル板から分離ゲルを外し、トランファーバッファーに浸し、セミドライトランスファー装置（ＢｉｏＲＡＤ；Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ）でイモビロン；ＰＶＤＦメンブレン（メルクミリポア）に移した。５％スキムミルク／ＴＢＳＴでブロッキングした後、１ｘＴＢＳＴで４回洗浄した。
【0073】
１枚目のメンブレンには、抗Ｆｌａｇ抗体であるＭ２抗体－ＨＲＰ標識マウス宿主抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｍ２－ＨＲＰ；Ａ８５９２）を１μｌ添加し、１時間室温で震盪しながら反応させた。その後、前記メンブレンを１ｘＴＢＳＴで４回洗浄した。
【0074】
２枚目のメンブレンには、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を１μｌ添加し、１時間室温で震盪しながら反応させた。このメンブレンを１ｘＴＢＳＴで４回洗浄した後、２次抗体としてＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ融合（ジャクソンリサーチ社；１１５－０３５－００３）を１μｌ添加し、１時間室温で震盪しながら反応させた。その後、当該メンブレンを１ｘＴＢＳＴで４回洗浄した。
【0075】
洗浄が終わった１枚目及び２枚目のメンブレンは、ハイブリバックに移し、ケミルミワンＬ（ナカライテスク）を加え、暗室でＨｙｐｅｒＦｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア）に感光した。ウエスタンブロット解析の結果を図１に示す。
【0076】
２枚目のメンブレン（抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を使用）では、Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎタグ融合のｈＲＡＲα及びＮｏ．１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎタグ融合のｈＲＡＲαに特異的な結合が見られた（図１のレーンＤ，Ｅ参照）。
この結果より、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、抗Ｆｌａｇ抗体であるＭ２抗体と同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液中の夾雑タンパク質には結合せず、目的のペプチドモチーフ（Ｎｏ９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ，Ｎｏ１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ）のみに極めて特異的に結合することが判明した。
この結果より、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、抗Ｆｌａｇ抗体であるＭ２抗体と同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出液中の夾雑タンパク質には結合せず、目的のペプチドモチーフ（Ｎｏ９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ，Ｎｏ１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ）のみに極めて特異的に結合することが判明した。
【0077】
＜試験例２：抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列解析＞
Ｉｏｓｇｅｎ（ニッポンジーン）を用い、ギット培地で培養した抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」のハイブリドーマからＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡから、ＩｇＧ１抗体の可変領域のｃＤＮＡを合成し、クローニングした。ｃＤＮＡ合成には、ＳＭＡＲＴｅｒ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ）を用いた。
Ｉｏｓｇｅｎ（ニッポンジーン）を用い、ギット培地で培養した抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」のハイブリドーマからＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ ＲＮＡから、ＩｇＧ１抗体の可変領域のｃＤＮＡを合成し、クローニングした。ｃＤＮＡ合成には、ＳＭＡＲＴｅｒ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ）を用いた。
【0078】
反応１：逆転写用プライマーのアニーリング
軽鎖用と重鎖用とに分けて、逆転写用プライマーのアニーリングを行った。軽鎖用の反応液の組成を表２に示す。重鎖用の反応液の組成を表３に示す。表２及び表３に示す試薬をそれぞれ混合した後、７２℃で２分間、４２℃で２分間インキュベートし、反応液を得た。
軽鎖用と重鎖用とに分けて、逆転写用プライマーのアニーリングを行った。軽鎖用の反応液の組成を表２に示す。重鎖用の反応液の組成を表３に示す。表２及び表３に示す試薬をそれぞれ混合した後、７２℃で２分間、４２℃で２分間インキュベートし、反応液を得た。
【0079】
【表2】
【0080】
【表3】
【0081】
反応２：逆転写反応とＳＭＡＲＴｅｒ ｏｌｉｇｏのアニーリング
上記反応１で得られた軽鎖用及び重鎖用の反応液に、表４に示す混合液を分注して加え、４２℃で１時間、逆転写反応を行った。さらに７０℃で１０分間反応させた後、４０μｌのＴＥを加えた。
上記反応１で得られた軽鎖用及び重鎖用の反応液に、表４に示す混合液を分注して加え、４２℃で１時間、逆転写反応を行った。さらに７０℃で１０分間反応させた後、４０μｌのＴＥを加えた。
【0082】
【表4】
【0083】
反応３：ＰＣＲ増幅
表５に示す反応液を作製し、ＰＣＲ反応を行った。表５中、「ＲＴ産物」は反応２で得られた逆転写反応産物を示す。ＰＣＲ反応は、（１）９８℃、８秒、及び（２）７２℃、１分を１サイクルとし、３５サイクル繰り返した。
表５に示す反応液を作製し、ＰＣＲ反応を行った。表５中、「ＲＴ産物」は反応２で得られた逆転写反応産物を示す。ＰＣＲ反応は、（１）９８℃、８秒、及び（２）７２℃、１分を１サイクルとし、３５サイクル繰り返した。
【0084】
【表5】
【0085】
ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲルで４００－５００ｂｐ付近のサイズのＤＮＡ断片の増幅を確認した。
【0086】
反応４：Ａ付加反応
ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでは、ＰＣＲ産物の３’末端へＡ（アデニン）が付加されない。そのため、上記反応３で増幅がみられた産物をフェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿し、更にＥｘ－Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでＡ付加反応を行った。反応液を表６に示す。反応は、７２℃で１分行った。
ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでは、ＰＣＲ産物の３’末端へＡ（アデニン）が付加されない。そのため、上記反応３で増幅がみられた産物をフェノールクロロホルム処理後、エタノール沈殿し、更にＥｘ－Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでＡ付加反応を行った。反応液を表６に示す。反応は、７２℃で１分行った。
【0087】
【表6】
【0088】
Ａ付加反応後、フェノールクロロホルム処理し、エタノール沈殿した。これにより、Ａ付加反応産物を得た。
【0089】
Ａ付加反応産物は、Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（ｐＭＤ２０）にＬｉｇａｔｉｏｎした。その後、大腸菌に形質転換し、青白選択（ポンドプレートにＸ－ｇａｌとＩＰＴＧを添加）を行った。白いコロニーのみを選択し、３ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地で終夜震盪培養後、集菌を行い、アルカリＳＤＳ法でプラスミドのミニプレップを行った。
【0090】
精製したプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ消化を行い、５００ｂｐ付近にバンドが出るクローンを確認した。
これらのクローンに関して、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｅｒを使用した配列解析を行い、塩基配列を解読した。解読した塩基配列のうち、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒの直後が定常領域であるものをクローン化できたと判断し、各々フレームを合わせアミノ酸配列に翻訳した。これらを軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域のアミノ酸配列とした。得られた重鎖可変領域のアミノ酸配列及び塩基配列、並びにＫａｂａｔの定義により特定したＣＤＲを表７に示す。得られた軽鎖可変領域のアミノ酸配列、塩基配列、及びＫａｂａｔの定義により特定したＣＤＲを表８に示す。
これらのクローンに関して、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｅｒを使用した配列解析を行い、塩基配列を解読した。解読した塩基配列のうち、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒの直後が定常領域であるものをクローン化できたと判断し、各々フレームを合わせアミノ酸配列に翻訳した。これらを軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域のアミノ酸配列とした。得られた重鎖可変領域のアミノ酸配列及び塩基配列、並びにＫａｂａｔの定義により特定したＣＤＲを表７に示す。得られた軽鎖可変領域のアミノ酸配列、塩基配列、及びＫａｂａｔの定義により特定したＣＤＲを表８に示す。
【0091】
【表7】
【0092】
【表8】
【0093】
尚、抗体「２３－２Ｅ」のハイブリドーマ株及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」のハイブリドーマ株が産生したＩｇＧ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、共に同じアミノ酸配列であったが、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の方がウエスタンブロット解析の結果が明瞭であった。
【0094】
＜試験例３（１）：抗原タンパク質の調製＞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍデュッシュに４０％コンフレントになるように播種した。リン酸カルシウム法により、Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－ＳｔａｂｉｌｏｎＮｏ９／ｐｃＤＮＡ３（表１のＤのプラスミド）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。８時間後に培地（Ｄ－ＭＥＭ低グルコース、１０％ ＦＢＳ、１／１００希釈ペニシリンストレプトマイシン含有）交換し、さらに１２時間後に細胞をピペッティングにより剥離した。別の新しい１．５ｍｌエッペンチューブに細胞を移し、１ｘＰＢＳで２回洗浄した。回収した細胞に１ｍｌのＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ７．９］，１／１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ピペッティングで細胞を破砕した。細胞破砕液の高速遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）後、上清を得た。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍデュッシュに４０％コンフレントになるように播種した。リン酸カルシウム法により、Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－ＳｔａｂｉｌｏｎＮｏ９／ｐｃＤＮＡ３（表１のＤのプラスミド）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。８時間後に培地（Ｄ－ＭＥＭ低グルコース、１０％ ＦＢＳ、１／１００希釈ペニシリンストレプトマイシン含有）交換し、さらに１２時間後に細胞をピペッティングにより剥離した。別の新しい１．５ｍｌエッペンチューブに細胞を移し、１ｘＰＢＳで２回洗浄した。回収した細胞に１ｍｌのＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．８］，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ７．９］，１／１００ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を加え、ピペッティングで細胞を破砕した。細胞破砕液の高速遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）後、上清を得た。
【0095】
＜試験例３（２）：免疫沈降サンプルの調製＞≪抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル≫
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗体「２３－２Ｅ」を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗体「２３－２Ｅ」を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
【0096】
≪抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル≫
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
【0097】
≪抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル≫
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗Ｆｌａｇ抗体を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、抗Ｆｌａｇ抗体を１０μｌ加え、１時間、４℃で反応させた。更に、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
【0098】
≪抗体非添加サンプル≫
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
試験例３（１）で得られた上清２３０μｌをチューブに分注し、平衡化済みＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）を加え、１時間、４℃で反応させた。その後、ＴＮＥ－Ｎ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、沈殿したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅに、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９８℃で、２分間煮沸した。
【0099】
＜試験例３（３）：ウエスタンブロット解析＞
試験例３（１）で得た上清５０μｌに、５０μｌの２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９０℃で、２分間煮沸し、Ｌｙｓａｔｅサンプルを調製した。ウエスタンブロット解析には、前記Ｌｙｓａｔｅサンプル、及び試験例３（２）で調製した免疫沈降サンプル（抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル、抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル）を用いた。検出用の抗体には、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｍ２－ＨＲＰ；Ａ８５９２）を用い、試験例１と同様の条件でウエスタンブロット解析を行った。解析結果を、図２に示す。
試験例３（１）で得た上清５０μｌに、５０μｌの２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９０℃で、２分間煮沸し、Ｌｙｓａｔｅサンプルを調製した。ウエスタンブロット解析には、前記Ｌｙｓａｔｅサンプル、及び試験例３（２）で調製した免疫沈降サンプル（抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル、抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル）を用いた。検出用の抗体には、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｍ２－ＨＲＰ；Ａ８５９２）を用い、試験例１と同様の条件でウエスタンブロット解析を行った。解析結果を、図２に示す。
【0100】
図２に示す通り、Ｌｙｓａｔｅサンプルには、Ｆｌａｇ－ＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎの薄いバンドが観察された。抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル（ＩＰ；Ｆｌａｇ）には、Ｆｌａｇ－ＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎの濃いバンドが観察された。抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２３）、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２４）にも、Ｆｌａｇ－ＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎの濃いバンドが観察された。これらの結果から、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅを利用した免疫沈降に使用可能であることが確認された。
【0101】
＜試験例３（４）：ＣＢＢ染色＞
ＢｌｕｅＳｔａｒマーカー、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル（ＩＰ；Ｆｌａｇ）、抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２３）、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２４）、および抗体非添加サンプル（ＩＰ；ＰｒｏＧ）のアクリルアミドゲル電気泳動を行い、電気泳動後のアクリルアミドゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色した。
ＣＢＢ染色は、泳動後のアクリルアミドゲルを、０．２５％ ＣＢＢ溶液（０．２５％ ＣＢＢ－Ｒ２５０、５０％ メタノール、１０％酢酸）に１時間程度浸漬することにより行った。アクリルアミドゲルに付着した染色液を除去した後、アクリルアミドゲルを脱色液（１０％酢酸）に浸し、キムワイプを入れて、バンド像がはっきりするまで脱色した。アクリルアミドゲルの脱色後、脱色液をＨ２０に置き換えた。
ＣＢＢ染色の結果を図３に示す。図３中、アスタリスク２つ（＊＊）は抗体の重鎖、アスタリスク１つ（＊）は抗体の軽鎖を示す。
ＢｌｕｅＳｔａｒマーカー、抗Ｆｌａｇ抗体免疫沈降サンプル（ＩＰ；Ｆｌａｇ）、抗体「２３－２Ｅ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２３）、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」免疫沈降サンプル（ＩＰ；２４）、および抗体非添加サンプル（ＩＰ；ＰｒｏＧ）のアクリルアミドゲル電気泳動を行い、電気泳動後のアクリルアミドゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色した。
ＣＢＢ染色は、泳動後のアクリルアミドゲルを、０．２５％ ＣＢＢ溶液（０．２５％ ＣＢＢ－Ｒ２５０、５０％ メタノール、１０％酢酸）に１時間程度浸漬することにより行った。アクリルアミドゲルに付着した染色液を除去した後、アクリルアミドゲルを脱色液（１０％酢酸）に浸し、キムワイプを入れて、バンド像がはっきりするまで脱色した。アクリルアミドゲルの脱色後、脱色液をＨ２０に置き換えた。
ＣＢＢ染色の結果を図３に示す。図３中、アスタリスク２つ（＊＊）は抗体の重鎖、アスタリスク１つ（＊）は抗体の軽鎖を示す。
【0102】
＜試験例４：免疫染色＞
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をボトムグラスデュッシュに４０％コンフレントになるように播種した。リン酸カルシウム法により、Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ／ｐｃＤＮＡ３（表１のＤのプラスミド）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。８時間後に培地（Ｄ－ＭＥＭ低グルコース、１０％ ＦＢＳ、１／１００希釈ペニシリンストレプトマイシン含有）交換し、さらに１２時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。
１％ＢＳＡ／１ｘＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ ＋ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロッキング後、１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄した。次いで、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を添加して細胞と反応させた。１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄し、Ａｌｅｘａ５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して細胞と反応させた。１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＡＰＩ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）で退色防止を行った。前記のように調製したサンプルを、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０００－Ｄ（ＯＬＹＮＰＵＳ）で観察した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をボトムグラスデュッシュに４０％コンフレントになるように播種した。リン酸カルシウム法により、Ｆｌａｇ－ｈＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ／ｐｃＤＮＡ３（表１のＤのプラスミド）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。８時間後に培地（Ｄ－ＭＥＭ低グルコース、１０％ ＦＢＳ、１／１００希釈ペニシリンストレプトマイシン含有）交換し、さらに１２時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。
１％ＢＳＡ／１ｘＰＢＳＴ（１ｘＰＢＳ ＋ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロッキング後、１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄した。次いで、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を添加して細胞と反応させた。１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄し、Ａｌｅｘａ５９４標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して細胞と反応させた。１ｘＰＢＳＴで細胞を４回洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＡＰＩ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）で退色防止を行った。前記のように調製したサンプルを、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０００－Ｄ（ＯＬＹＮＰＵＳ）で観察した。
【0103】
免疫染色の結果を図４に示す。図４に示す通り、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」により、核に移行したＦｌａｇ－ｈＲＡＲα－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎを検出することができた。この結果から、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、免疫染色法においても高い特異性を発揮することが確認された。
【0104】
＜試験例５：溶出ペプチドとエピトープ部位の検証＞
上記試験例から、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」が、極めて特異的にスタビロン改変体（Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ、Ｎｏ．１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ）を認識することが確認された。
上記試験例から、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」が、極めて特異的にスタビロン改変体（Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ、Ｎｏ．１０－Ｓｔａｂｉｌｏｎ）を認識することが確認された。
【0105】
この様な抗原モチーフをタグのシステムとして実用化する場合、生理的にマイルドな条件（生理活性を阻害しない条件）で抗体レジンから抗原モチーフ融合タンパク質を剥離させることが可能な溶出用ペプチドが有用である。
【0106】
そこで、Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ（配列番号９）の前半部（ペプチドＡ：ＥＦＮＤＮＤＥ（配列番号２０））と後半部（ペプチドＢ：ＥＦＮＤＮＥＤ（配列番号２１））の合成ペプチドを作製し（ユーロフィンジェノミクス）、溶出効率の検証を行った。
【0107】
ペプチドＡ及びペプチドＢの合成は、９０％以上の純度（ＨＰＬＣ）保証で、１ｍｇ合成系にて実施した。
大腸菌発現系により、下記（１）及び（２）のタンパク質を得た。
（１）６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＳｏｘ２－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬ
（２）６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳ
大腸菌発現系により、下記（１）及び（２）のタンパク質を得た。
（１）６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＳｏｘ２－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬ
（２）６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳ
【0108】
前記（１）及び（２）のタンパク質を発現する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ＬのＬＢカナマイシン培地を用いて、３７℃で一晩培養した。
【0109】
大腸菌のＯ．Ｄ．６００値が０．５に達したところで、培養液にＩＰＴＧを添加（終濃度０．１ｍＭ）した。大腸菌は、更に２５℃で３時間発現誘導後、遠心分離で集菌した。集菌した大腸菌は、１ｘＴＢＳＴに懸濁後、超音波破砕し、高速遠心分離（１４，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）を行った。上清を別チューブに移した後にＮｉレジンを加えた。Ｎｉレジンを加えた上清は、１ｘＰＢＳＴで５回洗浄後、５ｍＭイミダゾール含有１ｘＰＢＳＴで１回洗浄した。
【0110】
Ｎｉレジンを加えた上清は、更に５００ｍＭイミダゾール含有１ｘＰＢＳＴで溶出し、溶出タンパク質を得た。得られた２種の溶出タンパク質に抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を加え、４℃で１時間震盪しながら反応させて、反応液を得た。反応液に、更に１ｘＰＢＳＴで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加え、４℃で１時間震盪しながら反応させた。１ｘＰＢＳＴで４回洗浄後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジンを各々３本の１．５ｍｌマイクロチューブに分けた。
【0111】
３本のチューブに、ペプチドＡ、ペプチドＢ、又は０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０）を２０μｌ加え、ペプチド溶出を行った。ペプチド溶出は４℃で１時間、Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒは４℃で５分間行った。ペプチド溶出後は、低速遠心分離（２，０００ｒｐｍ，１分間，４℃）し、上清を別チューブに分けた。Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ溶出上清には１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を加え中和し、溶出画分を得た。
【0112】
得られた溶出画分に、２ｘＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを等量加え、９８℃で２分間煮沸した。これらを１０％アクリルアミドゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥし、抗Ｆｌａｇ抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。
【0113】
結果を図５に示す。図５に示す通り、（１）のタンパク質（図５中の「Ｓｏｘ２」及び（２）のタンパク質（図５中の「Ｏｃｔ４」）のいずれにおいても、ペプチドＡによる溶出効率は良好であった。この結果から、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」のエピトープはＮｏ．９ ＳｔａｂｉｌｏｎのＮ末端寄りの「ＥＦＮＤＮＤＥ」であると推測された。また、ペプチドＡにより、抗体［２４－８Ｇ－４Ｇ］からのスタビロン改変体タグ融合タンパク質の解離が可能であることが確認された。
【0114】
＜試験例６：大腸菌発現系での利用可能性の検証＞
工業的スケールでの発現系として、大腸菌発現系がよく利用される。そこで、大腸菌発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性の検討を行った。
上述の６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳをｌａｃプロモーター制御下で発現する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ＩＰＴＧ誘導を行った菌体（ＩＰＴＧ（＋））、及びＩＰＴＧ誘導を行わなかった菌体（ＩＰＴＧ（－））の菌体抽出液を調製した。これらの菌体抽出液に対する抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の反応性をウエスタンブロット解析にて確認した。比較として、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２；Ｆｌａｇ－ＨＲＰ；Ｓｉｇｍａ）、抗Ｈｉｓ抗体（クローン２Ｄ８；ＭＢＬ）、及び抗体「２３－２Ｅ」を用いたウエスタンブロット解析も行った。抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」、抗Ｈｉｓ抗体、及び抗体「２３－２Ｅ」を用いたウエスタンブロット解析では、２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ融合；ジャクソンリサーチ社；１１５－０３５－００３）を用いた。
工業的スケールでの発現系として、大腸菌発現系がよく利用される。そこで、大腸菌発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性の検討を行った。
上述の６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳをｌａｃプロモーター制御下で発現する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ＩＰＴＧ誘導を行った菌体（ＩＰＴＧ（＋））、及びＩＰＴＧ誘導を行わなかった菌体（ＩＰＴＧ（－））の菌体抽出液を調製した。これらの菌体抽出液に対する抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の反応性をウエスタンブロット解析にて確認した。比較として、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２；Ｆｌａｇ－ＨＲＰ；Ｓｉｇｍａ）、抗Ｈｉｓ抗体（クローン２Ｄ８；ＭＢＬ）、及び抗体「２３－２Ｅ」を用いたウエスタンブロット解析も行った。抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」、抗Ｈｉｓ抗体、及び抗体「２３－２Ｅ」を用いたウエスタンブロット解析では、２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ融合；ジャクソンリサーチ社；１１５－０３５－００３）を用いた。
【0115】
ウエスタンブロット解析結果を図６に示す。図６に示す通り、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳのみを検出し、その他の大腸菌の非特異的タンパク質には結合しなかった（図６の１番右のパネル；Ｓｔａｂｉｌｏｎ：２４）。この高い特異性は、市販の抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（図６の１番左のパネル；Ｍ２）、および抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（図６の左から２番目のパネル；Ｈｉｓ）と同様であった。抗体「２３－２Ｅ」も、６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳのみを検出したが、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」と比較して、バンドは薄かった（図６の右から２番目のパネル；Ｓｔａｂｉｌｏｎ：２３）。
【0116】
＜試験例７：各種発現系における利用可能性の検証＞
植物及び昆虫の発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性の検討を行った。発現系として、イチゴ、コセンダングサの葉（葉の発現系の代表として用いた）、トマト、シャインマスカット、及びカイコを検討した。これらは、発現系として利用価値があると考えられる。これらの抽出液に対する抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の反応性を、ウエスタンブロット解析により確認した。
植物及び昆虫の発現系における、スタビロン改変体タグ及び抗スタビロン改変体抗体の利用可能性の検討を行った。発現系として、イチゴ、コセンダングサの葉（葉の発現系の代表として用いた）、トマト、シャインマスカット、及びカイコを検討した。これらは、発現系として利用価値があると考えられる。これらの抽出液に対する抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」の反応性を、ウエスタンブロット解析により確認した。
【0117】
上記生物種の抽出液５ｍｇをそのまま（－）、又は前記抽出液５ｍｇに上述の６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳのニッケルレジン精製タンパク質２０ｎｇを加えたもの（＋）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動した。
抗Ｆｌａｇ抗体、抗Ｈｉｓ抗体、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。抗Ｈｉｓ抗体、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いた場合、２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ融合）を用いた。
抗Ｆｌａｇ抗体、抗Ｈｉｓ抗体、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。抗Ｈｉｓ抗体、抗体「２３－２Ｅ」、及び抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いた場合、２次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ融合）を用いた。
【0118】
ウエスタンブロット解析の結果を図７に示す。図７中、Ｆｌａｇ（各反応系における１番左のパネル）は抗Ｆｌａｇ抗体、Ｈｉｓ（各反応系における左から２番のパネル）は抗Ｈｉｓ抗体、２３（各反応系における右から２番目のパネル）は抗体「２３－２Ｅ」、及び２４（各反応系における１番右のパネル）は抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を用いた結果を示す。（－）は抽出液そのままを用いたレーンであり、（＋）は抽出液に６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳを添加したものを用いたレーンである。図７に示す通り、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」を使用したウエスタンブロット解析では、コセンダングサの葉、キウイ、トマト、シャインマスカット、及びカイコ抽出液では、（－）でバンドは観察されなかった。この結果から、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、これらの抽出物中のタンパク質には結合しないことが確認された。一方、（＋）では、いずれの発現系でも６ｘＨｉｓ－Ｆｌａｇ－Ｎｏ．９－Ｓｔａｂｉｌｏｎ－ｈＯｃｔ４－Ｓ１９－ＴＡＴ－ＮＬＳのバンドが確認された。
【0119】
以上の結果より、抗体「２４－８Ｇ－４Ｇ」は、植物及び昆虫の発現系においても、スタビロン改変体タグ融合タンパク質のみを特異的に検出可能であることが判明した。
【0120】
以上、本発明を適用した実施例によれば、スタビロン配列に特異的に認識する抗体又はその抗原結合フラグメント、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸、ベクター、形質転換体、及び、スタビロン改変体検出キットを提供することができる。
【0121】
以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】