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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-17
(45)【発行日】2024-06-25
(54)【発明の名称】ポリエチレンテレフタレートの酵素分解法
(51)【国際特許分類】
C08J 11/10 20060101AFI20240618BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240618BHJP
【ＦＩ】
C08J11/10 ZAB
C12N15/55 ZNA
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021523510
(86)(22)【出願日】2019-11-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 EP2019080253
(87)【国際公開番号】W WO2020094646
(87)【国際公開日】2020-05-14
【審査請求日】2022-09-16
(31)【優先権主張番号】1860222
(32)【優先日】2018-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】514245373
【氏名又は名称】キャルビオス
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＢＩＯＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】マルティ，アラン
【審査官】森 健一
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１９８７８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０１１２８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５０５６５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－２９０１３０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｊ １１／１０
Ｃ１２Ｎ １５／５５
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＥＴを、前記ＰＥＴを解重合することができる酵素と接触させることによるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素的解重合のための方法であって、－ＰＥＴが、最大２５％の初期結晶化度を有し、
－解重合工程が、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、
－酵素は、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように選択され、ここで、時間ｔＤは、前記温度Ｔで前記酵素が少なくとも８０％解重合するために前記酵素に必要な時間を表し、
時間ｔＲは、前記温度Ｔで最大で３５％の結晶化度に到達するために前記ＰＥＴに必要な時間を表し、そして
選択された酵素が配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に対してＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、またはＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇから選択される少なくとも１つの変異の組み合わせを含む、
ことを特徴とする、前記方法。
【請求項2】
温度Ｔが、ＰＥＴのＴｇ－１０℃とＴｇ＋５℃との間に含まれることを特徴とする、請求項１記載の解重合方法。
【請求項3】
温度Ｔが、６６℃から８０℃の間、優先的には６８℃から７３℃の間に含まれることを特徴とする、請求項１又は２記載の解重合方法。
【請求項4】
前記ＰＥＴのサンプルについて、解重合工程の前に、ＰＥＴの結晶化時間が測定されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項5】
選択された酵素が、２０時間以下の時間ｔＤを有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項6】
酵素が、温度Ｔよりも厳密に高い融解温度（Ｔｍ）を有する酵素から選択されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項7】
酵素が、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的にはＴ＋２０℃以上のＴｍを有する酵素から選択されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項8】
２５％未満の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項9】
ＰＥＴの初期結晶化度が、２０％未満であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項10】
解重合時間（ｔＤ）が、１時間から１６時間の間、優先的には１時間から１０時間の間に含まれることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項11】
前記ＰＥＴが、解重合工程の前にアモルファス化工程に供されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項12】
時間ｔＤは、前記温度Ｔで前記酵素が前記ＰＥＴの少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで最大３０％の結晶化度に到達するために必要な時間を表すことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項13】
－ＰＥＴが、最大２５％の初期結晶化度、及び６５℃±１℃と８０℃±１℃との間に含まれるＴｇを有し－解重合ステップが、７２℃±１℃の温度Ｔで実行され、
－酵素が、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短いように選択され、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するために必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記温度Ｔで最大で３５％の結晶化度に到達するために前記ＰＥＴが必要な時間を表す
ことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項記載の解重合方法。
【請求項14】
－プラスチック材料が、最大２５％の初期結晶化度及び６０℃±１℃と７５℃±１℃との間に含まれるＴｇを有するＰＥＴを含む布及び／又は繊維及び／又は布地廃棄物から選択され、
－解重合ステップが、６５℃±１℃の温度Ｔで実行され、及び
－ＰＥＴを分解することができる酵素が、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように選択され、ここで、時間ｔＤは、前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するために選択された酵素に必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記温度Ｔで最大３５％の結晶化度に到達するために前記ＰＥＴが必要な時間を表す
ことを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項記載の解重合のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の技術分野
本発明は、特にプラスチック材料に含まれるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素的解重合の方法に関する。本発明によるプロセスは、特に、工業規模または半工業規模で実施することができる。
本発明は、特にプラスチック材料に含まれるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素的解重合の方法に関する。本発明によるプロセスは、特に、工業規模または半工業規模で実施することができる。
【0002】
背景技術
プラスチック製品は耐久性があり安価な素材であり、さまざまな用途（食品包装、衣料用繊維など）のさまざまな製品の製造に使用できる。その結果、プラスチックの生産はここ数十年で劇的に増加した。ほとんどが短期間の用途に使用されるため、プラスチック廃棄物が蓄積し、その処理が必要になる。これらのプラスチックを構成するさまざまなポリマーには、テレフタル酸とエチレングリコールから製造された芳香族ポリエステルであるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が含まれる。これは、食品包装（ボトル、フラスコ、ジャー、トレイ、ポーチ）、衣類、装飾（カーペット）、家庭用リネンなどのテキスタイルの製造などの多くの用途で使用される。
プラスチック製品は耐久性があり安価な素材であり、さまざまな用途（食品包装、衣料用繊維など）のさまざまな製品の製造に使用できる。その結果、プラスチックの生産はここ数十年で劇的に増加した。ほとんどが短期間の用途に使用されるため、プラスチック廃棄物が蓄積し、その処理が必要になる。これらのプラスチックを構成するさまざまなポリマーには、テレフタル酸とエチレングリコールから製造された芳香族ポリエステルであるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が含まれる。これは、食品包装（ボトル、フラスコ、ジャー、トレイ、ポーチ）、衣類、装飾（カーペット）、家庭用リネンなどのテキスタイルの製造などの多くの用途で使用される。
【0003】
廃棄物の蓄積という環境的および経済的問題に対処するために、リサイクルまたはエネルギー回収技術が開発されてきた。機械的リサイクルプロセスは今日でも最も一般的に使用されているが、多くの欠点がある。確かに、それは実装するために洗練された費用のかかる選別を必要とし、より低い価値（より低い分子量、添加剤の制御されていない存在）の用途を目的とした品質の低下した再生プラスチックの生産につながる。さらに、これらの再生プラスチックは、石油由来のバージンプラスチックと競合しない。
【0004】
最近、プラスチック製品の酵素的リサイクルのための革新的なプロセスが開発され、特に特許出願ＷＯ２０１４／０７９８４４、ＷＯ２０１５／０９７１０４、ＷＯ２０１５／１７３２６５、およびＷＯ２０１７／１９８７８６に記載されている。従来の機械的リサイクルプロセスとは異なり、これらの酵素プロセスは、プラスチックに含まれるポリマーの酵素的解重合によって、ポリマーの主成分（モノマー）に戻ることを可能にする。次に、得られたモノマーを精製し、新しいポリマーを再重合するために使用することができる。これらの酵素プロセスは、酵素の特異性を介して、コストのかかるプラスチックの選別を回避することを可能にするだけでなく、油由来のポリマーと同等の品質のリサイクルポリマーをもたらす無限のリサイクルを提案することも可能にする。特に、これらのプロセスにより、ＰＥＴからテレフタル酸とエチレングリコールを製造することが可能になる。
【0005】
発明の概要
出願人は、ＰＥＴの酵素的解重合のプロセスに取り組むことにより、ＰＥＴを含むプラスチックをこのＰＥＴのＴｇに近い温度で酵素的に解重合するための最適化されたプロセスを開発し、ポリマーの鎖にアクセスしやすくすることに成功した。解重合酵素により、解重合速度が向上する。
出願人は、ＰＥＴの酵素的解重合のプロセスに取り組むことにより、ＰＥＴを含むプラスチックをこのＰＥＴのＴｇに近い温度で酵素的に解重合するための最適化されたプロセスを開発し、ポリマーの鎖にアクセスしやすくすることに成功した。解重合酵素により、解重合速度が向上する。
【0006】
そのようなプロセスを達成するために、発明者はアンチノミック問題に取り組む必要があった。実際、ポリマーを解重合できる酵素は、半結晶性ポリマーよりもアモルファスポリマーに対してほとんど活性がある。ポリマーのＴｇに近い温度での解重合プロセスは、このポリマー鎖の移動度の増加を介して、解重合される前記ポリマー鎖への酵素のアクセス可能性を理論的には改善することができるが、ポリマーがＴｇに近いかそれ以上の温度に付されると、後者はより急速に再結晶化する傾向があるため、ポリマーが酵素の解重合をより困難にする。
【0007】
したがって、本発明者は、一方で、解重合前にＰＥＴの結晶化度が十分に低いことを確実にすることにより、前記ＰＥＴのＴｇに近いまたはそれを超える温度でＰＥＴ解重合プロセスを実行することが可能であることを実証した。他方、このＰＥＴを、酵素解重合と両立しない結晶化度に到達するのに必要な時間よりも短い解重合時間で解重合することができる酵素を選択することによって、本発明者によって開発されたプロセスは、工業規模の実施と互換性のある反応器内で解重合速度を維持することを可能にする。一例として、本発明者は、７２℃の温度、１０時間未満で９０％を超えるＰＥＴを解重合することに成功した。有利には、本発明のプロセスは、ＰＥＴを含むプラスチックの解重合および／またはリサイクルのために実施することができる。
【0008】
したがって、本発明は、その目的として、前記ＰＥＴが最大２５％の初期結晶化度を有することを特徴とする、前記ＰＥＴを解重合することができる酵素と接触させることによるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の酵素解重合のためのプロセスを有する。解重合工程は、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、酵素は、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が結晶化時間よりも厳密に短くなるように選択される、ここで、時間ｔＤは、前記酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔでほとんど３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
【0009】
解重合工程は、６６℃から８０℃、優先的には６８℃から７３℃を含む温度Ｔで優先的に実施され、時間ｔＤは２０時間以下、優先的には１６時間未満である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】異なる温度での前記材料のインキュベーション中のプラスチック材料に含まれるＰＥＴの再結晶動態である。
【0011】
発明の詳細な説明
定義
本発明の文脈において、「プラスチック材料」という表現は、プラスチック製品（シート、トレイ、フィルム、チューブ、ブロック、繊維、布など）およびプラスチック製品を製造するために使用されるプラスチック組成物を指す。プラスチック材料は、アモルファスおよび／または半結晶性ポリマーで構成されていることが好ましい。プラスチック材料は、ポリマーに加えて、可塑剤、鉱物または有機充填剤、染料などの追加の物質または添加剤を含み得る。したがって、本発明の文脈において、プラスチック材料は、任意のプラスチック製品を指し、及び／又は半結晶性及び／又はアモルファス形態の少なくとも１つのポリマー、より具体的には少なくとも１つのＰＥＴを含むプラスチック組成物を指す。
定義
本発明の文脈において、「プラスチック材料」という表現は、プラスチック製品（シート、トレイ、フィルム、チューブ、ブロック、繊維、布など）およびプラスチック製品を製造するために使用されるプラスチック組成物を指す。プラスチック材料は、アモルファスおよび／または半結晶性ポリマーで構成されていることが好ましい。プラスチック材料は、ポリマーに加えて、可塑剤、鉱物または有機充填剤、染料などの追加の物質または添加剤を含み得る。したがって、本発明の文脈において、プラスチック材料は、任意のプラスチック製品を指し、及び／又は半結晶性及び／又はアモルファス形態の少なくとも１つのポリマー、より具体的には少なくとも１つのＰＥＴを含むプラスチック組成物を指す。
【0012】
プラスチック製品には、硬質または柔軟な包装（フィルム、ボトル、トレイ）、農業用フィルム、バッグ、使い捨て物体、繊維、布地、不織布、床材、プラスチック廃棄物または繊維廃棄物などの製造プラスチック製品が含まれる。
【0013】
「ポリマー」という用語は、その構造が、化学共有結合によって連結された複数の繰り返し単位（すなわち、「モノマー」）からなる化合物を指す。本発明の文脈において、「ポリマー」という用語は、より具体的には、プラスチック材料の組成物に使用されるそのような化合物を指す。
【0014】
「ポリエステル」という用語は、その構造の主鎖にエステル官能基を含むポリマーを指す。エステル官能基は、炭素と他の３つの原子との間の結合：別の炭素原子との単結合、酸素との二重結合、および別の酸素原子との単結合によって特徴付けられる。単結合によって炭素に結合している酸素は、それ自体が単結合によって別の炭素に結合している。ポリエステルは、１つのタイプのモノマー（つまり、ホモポリマー）のみ、または少なくとも２つの異なるモノマー（つまり、コポリマー）で作ることができる。ポリエステルは、芳香族、脂肪族、または半芳香族にすることができる。例として、ポリエチレンテレフタレートは、テレフタル酸とエチレングリコールの２つのモノマーで構成される半芳香族共重合体である。
【0015】
本発明の文脈において、「半結晶性ポリマー」という用語は、結晶性領域と非晶性領域が共存する部分的に結晶性のポリマーを指す。半結晶性ポリマーの結晶化度は、さまざまな分析方法で推定でき、一般に１０％から９０％に含まれる。結晶化度が１０％未満のポリマーは、アモルファスと見なすことができる。
【0016】
ポリマーまたはプラスチック材料に関する「解重合プロセス」は、ポリマーまたはプラスチック材料の少なくとも１つのポリマーが、モノマーおよび／またはオリゴマーなどのより小さな分子に分解されるプロセスを指す。本発明の場合、ＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料を解重合するためのプロセスは、ＰＥＴがテレフタル酸及び／又はエチレングリコールなどのモノマー及び／又はテレフタル酸ジメチル（ＤＭＴ）、メチル-２-ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）、ビス（２-ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）などのオリゴマーに分解されるプロセスを指す。
【0017】
ＰＥＴの選択
本発明による解重合プロセスは、前記ＰＥＴを、それを解重合することができる少なくとも１つの酵素と接触させることによる、ＰＥＴの酵素的解重合に基づく。 より具体的には、本発明者は、最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴから出発し、前記ＰＥＴのＴｇ－１０℃とＴｇ＋１０℃との間に含まれる温度Ｔで実施される解重合工程を含む、ＰＥＴの酵素的解重合のためのプロセスを開発した。また、本発明の特定の実施形態によれば、ＰＥＴは、後者が最大２５％の初期結晶化度を有するように選択される。
本発明による解重合プロセスは、前記ＰＥＴを、それを解重合することができる少なくとも１つの酵素と接触させることによる、ＰＥＴの酵素的解重合に基づく。 より具体的には、本発明者は、最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴから出発し、前記ＰＥＴのＴｇ－１０℃とＴｇ＋１０℃との間に含まれる温度Ｔで実施される解重合工程を含む、ＰＥＴの酵素的解重合のためのプロセスを開発した。また、本発明の特定の実施形態によれば、ＰＥＴは、後者が最大２５％の初期結晶化度を有するように選択される。
【0018】
本発明によれば、解重合工程に供されるＰＥＴは、解重合工程の開始時にアモルファスおよび／または半結晶性のＰＥＴであり、その初期結晶化度は２５％以下である。「初期結晶化度」とは、解重合工程の開始時、すなわち、前記ＰＥＴが解重合酵素と接触する前の、ＰＥＴの結晶化度を意味する。したがって、ＰＥＴが１つまたは複数の前処理ステップ（アモルファス化、微粉化）を受ける場合、「初期結晶化度」は、これらの前処理ステップ後の結晶化度に対応する。
【0019】
半結晶性ポリマーの結晶化度は、さまざまな分析方法で推定でき、一般に１０％から９０％に含まれる。たとえば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）またはＸ線回折を使用して、ポリマーの結晶化度を決定できる。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）や広角Ｘ線散乱（ＷＡＸＳ）や赤外分光法など、他の手法もポリマーの結晶化度を決定するのに適しているが、信頼性は低くなる。本出願では、結晶化度は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定される。より具体的には、ＤＳＣ実験は、以下のプロトコルを使用して実施された：少量のプラスチック材料（数ｍｇ）が、室温または室温より低い温度から溶融温度（Ｔｍ）を超える温度まで一定の加熱速度で加熱される。ポリマーの。熱流束データが収集され、温度の関数としてプロットされる。パーセンテージ（％）で表される結晶化度（Ｘｃ）は、次の式に従って計算される。
【化1】
【0020】
その理解について：
－ΔＨｆは融解エンタルピーであり、吸熱融解ピークを積分することで決定でき、
－ΔＨｃｃは低温結晶化エンタルピーであり、発熱性の低温結晶化ピークを積分することによって決定され、
－ｗｔは、プラスチック中のポリエステルの重量分率を表し、そして
－ΔＨｆ１００％は、完全に結晶性のポリマーの融解エンタルピーに対応し、文献に記載されている。たとえば、ＰＥＴのΔＨｆ１００％は、文献では１２５．５Ｊ／ｇに対応する（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄａｔａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｊａｍｅｓ Ｅ． Ｍａｒｋ編、ＯＸＦＯＲＤ、２００９年）。
－ΔＨｆは融解エンタルピーであり、吸熱融解ピークを積分することで決定でき、
－ΔＨｃｃは低温結晶化エンタルピーであり、発熱性の低温結晶化ピークを積分することによって決定され、
－ｗｔは、プラスチック中のポリエステルの重量分率を表し、そして
－ΔＨｆ１００％は、完全に結晶性のポリマーの融解エンタルピーに対応し、文献に記載されている。たとえば、ＰＥＴのΔＨｆ１００％は、文献では１２５．５Ｊ／ｇに対応する（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄａｔａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｊａｍｅｓ Ｅ． Ｍａｒｋ編、ＯＸＦＯＲＤ、２００９年）。
【0021】
結晶化度の測定における許容誤差は約１０％である。したがって、２５％と評価された結晶化度は、２２．５％から２７．５％の間に含まれる結晶化度に対応する。
【0022】
プロセスの一実施形態によれば、２５％±１０％未満の結晶化度を有するＰＥＴが選択される。好ましい実施形態では、ＰＥＴは、２０％±１０％未満の初期結晶化度を有する。別の好ましい実施形態では、解重合工程に供されるＰＥＴは、アモルファスＰＥＴであり、すなわち、結晶化度が１０％±１０％未満である。
【0023】
本発明によれば、２５％以下の初期結晶化度を達成するように、当業者に知られている任意の手段によって、解重合工程の上流でＰＥＴアモルファス化工程を実施することが可能である。そのようなアモルファス化ステップは、特に出願ＷＯ ２０１７／１９８７８６に記載されている。
【0024】
特定の実施形態では、本発明による解重合プロセスは、少なくともＰＥＴを含むプラスチック材料を用いて実施される。好ましい実施形態では、ＰＥＴは、前記プラスチック材料の少なくとも８０重量％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％を表す。
【0025】
本発明の特定の文脈において、「プラスチック材料」という用語は、繊維、布、不織布、糸などの繊維の形態の任意のプラスチック製品を指す。したがって、特定の実施形態では、プラスチック材料は布、および／または繊維および／または繊維廃棄物から選択される。ＰＥＴは、前記プラスチック材料の総重量に基づいて少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を示す。
【0026】
特定の実施形態では、プラスチック材料は、ＰＥＴとポリ乳酸（ＰＬＡ）の混合物、ＰＥＴとポリエチレン（ＰＥ）の混合物、ＰＥＴとポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）の混合物、ＰＥＴとポリアミド（ＰＡ）の混合物、またはＰＥＴと綿の混合物を含む。
【0027】
有利なことに、反応器で使用されるプラスチック材料は、プラスチック廃棄物または繊維廃棄物である。この廃棄物は、リサイクルを目的とした収集チャネルから発生する可能性があるが、生産チャネルまたはリサイクルチャネルからの廃棄物である可能性もあるため、プラスチック廃棄物以外の化合物が含まれる可能性がありる。これは、ＰＥＴをこれらのフローに存在する他の要素（紙、ボール紙、アルミニウム、接着剤など）と組み合わせてリアクターで使用できることを意味する。特定の実施形態では、解重合工程が実施される反応器は、プラスチック材料の総重量に基づいて、少なくとも８０重量％、優先的に少なくとも８５％、９０％、９５％重量％のＰＥＴを優先的に含有する、少なくともＰＥＴを含むいくつかのプラスチック材料を充填される。
【0028】
本発明によれば、ＰＥＴは、すなわち、前記ＰＥＴが解重合酵素と接触させられる前のその初期ガラス転移温度（Ｔｇ）によって、特徴付けられる。したがって、ＰＥＴが前処理ステップ（アモルファス化、微粉化）を受ける場合、ＰＥＴはこれらの前処理ステップ後のＴｇによって特徴付けられる。この温度は、さまざまな分析方法で推定できる。たとえば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または示差熱分析（ＤＴＡ）を使用して、ポリマーのＴｇを決定できる。この説明では、Ｔｇは、例に示されているように、最初の温度スキャン中にＤＳＣによって測定されたガラス転移温度に対応する。一般に、Ｔｇの測定における許容誤差は約２℃である。
【0029】
本発明の特定の実施形態では、ＰＥＴの初期Ｔｇは、６０℃から９０℃の間、好ましくは６０℃から８５℃の間に含まれる。別の特定の実施形態では、ＰＥＴの初期Ｔｇは、６５℃±１℃と８０℃±１℃との間に含まれる。別の特定の実施形態では、ＰＥＴの初期Ｔｇは、６５℃±２℃と８０℃±２℃との間に含まれる。別の特定の実施形態では、ＰＥＴの初期Ｔｇは、６０℃±２℃と７０℃±２℃との間に含まれる。
【0030】
本発明によれば、ポリエステル解重合工程の前に、解重合工程の上流にＰＥＴ前処理工程、特に、ＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料を粉砕する工程を実施することが可能である。好ましい実施形態では、ＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料は、当業者に知られている任意の適切な手段によって粉末形態にされる。この特定の場合、ＰＥＴ、またはＰＥＴを含むプラスチック材料は、粉末形態に変換されるように有利に微粉化される。
【0031】
特定の実施形態では、反応器に導入されたＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料は、２ｍｍ未満の平均粒子サイズ（ｄ５０）、好ましくは１ｍｍ未満の粒子サイズを有する粉末の形態である。別の実施形態では、反応器で使用されるＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料は、５００μｍ未満の平均粒子サイズ（ｄ５０）を有する粉末の形態である。
【0032】
特定の実施形態では、解重合プロセスは、ＰＥＴをアモルファス化するステップと、それに続く、ＰＥＴ解重合ステップの前に、ＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料を粉砕および／または微粉化するステップとを含む。
【0033】
特定の実施形態では、解重合プロセスは、ＰＥＴを解重合するステップの前に、ＰＥＴを非晶質化するステップを含み、ＰＥＴ又はＰＥＴを含むプラスチック材料は、非晶質化のために使用される押出機から顆粒の形態で反応器に係合される。したがって、ＰＥＴまたはＰＥＴを含むプラスチック材料は、２ｍｍより小さい、優先的には１ｍｍより小さい顆粒の形態で係合される。
【0034】
酵素の選択
本発明によれば、解重合プロセスは、ＰＥＴを解重合することができる酵素を用いて実施される。より詳細には、酵素は、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に小さくなるように選択される。
本発明によれば、解重合プロセスは、ＰＥＴを解重合することができる酵素を用いて実施される。より詳細には、酵素は、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に小さくなるように選択される。
【0035】
本発明によれば、ＰＥＴの結晶化時間「（ｔＲ）」は、初期結晶化度Ｘｃの前記ＰＥＴが温度Ｔにおいて３５％以下の結晶化率、または結晶化度に到達するのに要する時間として定義される。この時間は、材料の性質および／またはポリマーの性質（すなわち、添加剤および／またはコモノマーの存在）、分子量、Ｔｇ、さらに熱履歴（非晶質化または微粉化などの冷却および／または加熱を伴う先行処理）に依存する。この時間は、温度Ｔが調節され、測定中の攪拌および／またはｐＨの影響を受けない条件下で測定される。本発明によれば、ＰＥＴを含むプラスチック材料をこの温度Ｔでインキュベートし、異なる時間間隔で採取したサンプルの結晶化度を（ＤＳＣによって）定期的に測定することによって、温度ＴにおけるＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）を測定することが可能である。
【0036】
本発明によれば、解重合時間「（ｔＤ）」は、ポリマー分解酵素が温度Ｔで前記ポリマーの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表す。特定の実施形態では、この時間は、酵素の至適ｐＨおよび飽和酵素濃度、すなわち酵素の添加によって反応速度が改善されない濃度以上で決定される。したがって、時間ｔＤは、酵素がポリマー中に存在するモノマーの８０％を放出するのに必要な時間に相当する。本発明の特定の場合、時間ｔＤは、酵素とＰＥＴを接触させた後、ＰＥＴ中に存在するテレフタル酸（ＴＡ）当量の８０％を得るのに必要な時間に相当し、ＴＡ当量は、遊離ＴＡおよびＢＨＥＴおよびＭＨＥＴオリゴマー中に存在するＴＡに相当する。本発明の別の具体例では、時間ｔＤは、酵素とＰＥＴを接触させた後、ＰＥＴ中のモノエチレングリコール（ＭＥＧ）当量の８０％（遊離ＭＥＧおよびＢＨＥＴおよびＭＨＥＴオリゴマー中に存在するＭＥＧに相当するＭＥＧ当量）を得るのに必要な時間に相当する。
【0037】
時間ｔＤとｔＲの測定は、同じ温度Ｔで行われることが規定されている。
【0038】
本発明によれば、酵素は、解重合工程が実施される温度Ｔよりも厳密に高い融解温度（Ｔｍ）を有する酵素から有利に選択される。
【0039】
本発明の文脈では、温度Ｔｍは特に、検討中の酵素の半分の量がアンフォールディングまたはミスフォールディングされ、正しくフォールディングされた酵素の活性と比較して、その活性の全部または一部が失われる温度に対応する。特に、Ｔｍは対象とする酵素の耐熱性を推定することを可能にする。Ｔｍは、当業者に公知の任意の手段、特に示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）によって測定することができる。あるいは、Ｔｍは、円偏光二色性法を用いたタンパク質フォールディング解析によって評価することもできる。好ましくは、Ｔｍは、実験セクションに記載されるように、ＤＳＦを用いて測定される。
【0040】
好ましい実施形態では、酵素は、ＴｍがＴ＋１０℃以上、優先的にはＴ＋１５℃以上、より優先的にはＴ＋２０°以上である酵素から選択される。
【0041】
ポリマーに対する酵素の解重合活性は、当業者に公知の任意の手段によって評価することができる。例えば、ポリマーの質量の損失、またはポリマーの解重合速度の測定、すなわち、ある期間にわたって生成されるモノマーおよび／またはオリゴマーの量によって評価することができる。したがって、本発明の文脈において、ＰＥＴ分解酵素の解重合活性は、特定の温度およびｐＨ条件下で、ＰＥＴまたはＰＥＴ含有プラスチック材料を前記酵素と接触させることによって放出されるオリゴマー（ＢＨＥＴおよび／またはＭＨＥＴ）および／またはモノマー（テレフタル酸および／またはエチレングリコールおよび／またはＤＭＴ）の量を測定することによって評価することができる。解重合活性は、解重合反応中の塩基の添加をモニターすることによっても評価することができる。塩基の添加は、実際、解重合により生成したテレフタル酸を中和し、ｐＨを調整するために行われる。また、反応中に添加される塩基の量によって、反応中に生成したテレフタル酸の量を測定することが可能になる。好ましくは、反応液を酵素の至適ｐＨに維持するように塩基性溶液を添加する。
【0042】
有利には、前記酵素は、前記ＰＥＴを分解するクチナーゼ、リパーゼ及びエステラーゼから選択される。特に、前記酵素は、前記ＰＥＴを分解するエステラーゼから選択される。
【0043】
例えば、酵素は、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｔｙｃａ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ａｌｂａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのエントリーＡ０Ａ０７５Ｂ５Ｇ４のものなど）、Ｓｉｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｉｇｅｎｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａおよびＴｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のクチナーゼ、またはそれらの変異体から選択され得る。
【0044】
別の態様では、クチナーゼは、Ｓｕｌａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１２に記載されているＬＣ－Ｃｕｔｉｎａｓｅのようなメタゲノムライブラリー由来のクチナーゼ、またはその変異体から選択される。
【0045】
別の例では、酵素はリパーゼであり、好ましくは Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ 由来のものである。あるいは、酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍ ５１０３２のような市販の酵素またはこれらの酵素の変異体から選択することができる。
【0046】
もちろん、反応器に複数の酵素、特に上記の酵素のうち少なくとも２種類を添加することも可能である。
【0047】
特定の態様において、酵素（又は酵素）は、配列番号１及び／又は配列番号２及び／又は配列番号３及び／又は配列番号４及び／又は配列番号５と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＥＴ解重合活性を有する酵素から選択される。特定の態様において、酵素は、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＥＴ解重合活性を有する酵素から選択される。
【0048】
特定の実施態様において、酵素は、ポリマーをオリゴマーに解重合することができ、この場合、それは、有利には、前記オリゴマーをモノマーに解重合することができる酵素と会合される。特定の例において、２つの酵素は、配列番号４および／または配列番号５と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素から選択される。
【0049】
本発明者は、選択された酵素が配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１に対してＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、またはＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇから選択される少なくとも１つの変異の組み合わせを含む特定の場合に、本発明のプロセスが特に適していることを同定した。
【0050】
有利なことに、時間ｔＤは２０時間以下、優先的には１８時間以下、１６時間以下、１４時間以下、１２時間以下、１０時間以下である。
【0051】
特定の実施形態において、時間ｔＲは、２５％以下の初期結晶化度を有する前記ＰＥＴが、前記温度Ｔにおいて３０％以下の結晶化度に達するのに必要な時間に対応する。
【0052】
したがって、特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ 前記ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度を有する；
－ 前記解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３０％、または３０％未満の結晶化度に到達するのに必要な時間を表す。
－ 前記ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度を有する；
－ 前記解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３０％、または３０％未満の結晶化度に到達するのに必要な時間を表す。
【0053】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0054】
したがって、特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に小さくなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３０％、または３０％未満の結晶化度に達するのに必要な時間を表す；および
－ 前記ＰＥＴの酵素的解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで、前記ＰＥＴを前記酵素と接触させることによって実施される。
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に小さくなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３０％、または３０％未満の結晶化度に達するのに必要な時間を表す；および
－ 前記ＰＥＴの酵素的解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで、前記ＰＥＴを前記酵素と接触させることによって実施される。
【0055】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0056】
好ましい実施形態において、時間ｔＤは、前記酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも８５％、優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間に相当する。
【0057】
したがって、好ましい実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度を有する；
－ 解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８５％、優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％、優先的には多くとも３０％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度を有する；
－ 解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８５％、優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％、優先的には多くとも３０％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
【0058】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0059】
好ましい実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを解重合することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が、前記温度Ｔで、前記ＰＥＴの少なくとも８５％を、優先的には少なくとも９０％解重合するのに必要な時間を表す、 時間ｔＲは、前記温度Ｔにおいて、前記ＰＥＴが多くとも３５％、優先的には多くとも３０％の結晶化度に達するのに必要な時間を表し、および
－ 前記ＰＥＴを解重合するステップは、前記酵素を、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで前記ＰＥＴと接触させることによって実施される。
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを解重合することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が、前記温度Ｔで、前記ＰＥＴの少なくとも８５％を、優先的には少なくとも９０％解重合するのに必要な時間を表す、 時間ｔＲは、前記温度Ｔにおいて、前記ＰＥＴが多くとも３５％、優先的には多くとも３０％の結晶化度に達するのに必要な時間を表し、および
－ 前記ＰＥＴを解重合するステップは、前記酵素を、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで前記ＰＥＴと接触させることによって実施される。
【0060】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0061】
より一般的には、本発明によるＰＥＴ酵素解重合プロセスは、以下のステップからなる：
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、前記酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３５％以下の結晶化度に達するのに必要な時間を表す
－ 前記解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで、前記酵素を前記ＰＥＴと接触させることによって実施される。
－ 最大２５％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、前記酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３５％以下の結晶化度に達するのに必要な時間を表す
－ 前記解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで、前記酵素を前記ＰＥＴと接触させることによって実施される。
【0062】
解重合ステップ
本発明による解重合ステップは、有利には、体積が５００ミリリットル（ｍＬ）より大きく、１リットル（Ｌ）より大きく、優先的には２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌより大きい反応器中で実施される。特定の実施形態において、本発明のプロセスは、工業的および／または半工業的規模で実施することができる。従って、容積が１００Ｌ、１５０Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、４００，０００Ｌより大きい反応器を使用することが可能である。
本発明による解重合ステップは、有利には、体積が５００ミリリットル（ｍＬ）より大きく、１リットル（Ｌ）より大きく、優先的には２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌより大きい反応器中で実施される。特定の実施形態において、本発明のプロセスは、工業的および／または半工業的規模で実施することができる。従って、容積が１００Ｌ、１５０Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、４００，０００Ｌより大きい反応器を使用することが可能である。
【0063】
本発明によれば、解重合工程を実施するための反応器に直接ＰＥＴを装入するか、少なくともＰＥＴを含むプラスチック材料を装入することが可能である。
【0064】
本発明によれば、解重合ステップ中に関与する酵素の量は、有利には、工業規模の実施に適合する反応時間で、前記ＰＥＴの全解重合または準全解重合（すなわち、関与する前記ＰＥＴの重量に基づいて少なくとも８０重量％までの分解）を可能にするのに十分である。
【0065】
実施形態において、係合した酵素の量と係合したＰＥＴの量との重量比は、０．０１：１０００と３：１０００との間で構成される。好ましくは、係合した酵素の量と係合したＰＥＴの量の比は、０．５：１０００と２．５：１０００の間、より好ましくは１：１０００と２：１０００の間で構成される。特定の態様において、係合した酵素の量は、酵素の飽和濃度を達成するのに必要な酵素の量以上である。特定の態様において、酵素は、酵素賦形剤に加えて、生化学において一般的に使用される緩衝剤、保存剤、および／または安定化剤から選択され得る賦形剤を含む組成物の形態で従事され得る。酵素の量は、有利には、賦形剤を含まない酵素の量を意味する。
【0066】
本発明によれば、ＰＥＴ解重合ステップは、前記ＰＥＴのＴｇ±１０℃に等しい温度Ｔで実施され、Ｔｇは解重合ステップ前の前記ＰＥＴのＴｇである。有利には、温度は、酵素の不活性化温度未満に維持される。特定の実施形態において、ＰＥＴ解重合ステップは、ＰＥＴのＴｇ－１０℃とＴｇ＋５℃との間で構成される温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態において、解重合ステップは、ＰＥＴのＴｇ－８℃とＴｇ＋２℃との間で構成される温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態では、解重合ステップは、ＰＥＴのＴｇ－１０℃とＴｇ－５℃との間で構成される温度Ｔで実施される。
【0067】
特定の実施形態では、ＰＥＴは７８℃±２℃のＴｇを有し、解重合ステップは７０℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態において、ＰＥＴは７８℃±２℃のＴｇを有し、解重合ステップは７２℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態において、ＰＥＴは７５℃±２℃のＴｇを有し、解重合ステップは６８℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態において、ＰＥＴは７５℃±２℃のＴｇを有し、解重合ステップは７０℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態では、ＰＥＴは７０℃±２℃と７５℃±２℃の間のＴｇを有し、解重合ステップは６５℃±２℃と７２℃±２℃の間で構成される温度Ｔで実施される。
【0068】
特定の実施形態では、ＰＥＴは、繊維および／または繊維および／または繊維廃棄物から選択されるプラスチック材料に由来し、６０℃±１℃と７５℃±１℃との間で構成されるＴｇを有し、解重合ステップは、６５℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態では、ＰＥＴは、繊維および／または繊維および／または繊維廃棄物から選択されるプラスチック材料から誘導され、６０℃±１℃と７０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有し、解重合ステップは、６０℃±２℃に等しい温度Ｔで実施される。
【0069】
特定の実施形態において、解重合ステップは、６６℃と８０℃の間、優先的には６８℃と７３℃の間で構成される温度Ｔで実施される。特定の実施形態において、解重合ステップは、７２℃±１℃の温度Ｔで実施される。別の特定の実施形態では、解重合ステップは７０℃±１℃の温度Ｔで実施される。
【0070】
したがって、特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度と、６５℃±１℃と８０℃±１℃の間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、６６℃と８０℃の間、優先的には６８℃と７３℃の間で構成される温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３５％以下の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度と、６５℃±１℃と８０℃±１℃の間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、６６℃と８０℃の間、優先的には６８℃と７３℃の間で構成される温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで３５％以下の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
【0071】
有利には、多くとも２５％、優先的には多くとも２０％の初期結晶化度を有するＰＥＴが選択される。特定の実施形態において、ＰＥＴは、多くとも２５％の初期結晶化度と、６５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇとを有するものが選択される。
【0072】
別の特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度、および６５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、７２℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素は、前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように選択され、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度、および６５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、７２℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素は、前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように選択され、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。
【0073】
好ましくは、ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで最大３０％の結晶化度に達するのに要する時間を表す。
【0074】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0075】
別の特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ 最大２５％の初期結晶化度と、７５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇとを有するＰＥＴが選択される；
－ 解重合ステップは、７２℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで最大３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。より優先的には、ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３０％の結晶化度に達するのに要する時間を表す。
－ 最大２５％の初期結晶化度と、７５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇとを有するＰＥＴが選択される；
－ 解重合ステップは、７２℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで最大３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。より優先的には、ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３０％の結晶化度に達するのに要する時間を表す。
【0076】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0077】
別の特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（PET）酵素的解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度、および６５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、７０℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
－ ＰＥＴは、最大２５％の初期結晶化度、および６５℃±１℃と８０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有する；
－ 解重合ステップは、７０℃±１℃の温度Ｔで実施され、そして
－ 前記酵素による前記ＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、前記酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0078】
従って、有利には、この実施形態において、最大２５％の初期結晶化度と６５℃±１℃と８０℃±１℃の間で構成されるＴｇとを有するＰＥＴが選択され、解重合ステップは７０℃±１℃の温度Ｔで実施される。
【0079】
別の特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ プラスチック材料が、最大２５％の初期結晶化度及び６０℃±１℃と７５℃±１℃との間で構成されるＴｇを有するＰＥＴからなる繊維及び／又は繊維及び／又は繊維廃棄物から選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３５％の結晶化度に到達するのに必要な時間を表し、そして
－ 前記ＰＥＴ解重合ステップは、前記酵素を前記プラスチック材料と６５℃±１℃の温度Ｔで接触させることによって実施される。
－ プラスチック材料が、最大２５％の初期結晶化度及び６０℃±１℃と７５℃±１℃との間で構成されるＴｇを有するＰＥＴからなる繊維及び／又は繊維及び／又は繊維廃棄物から選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３５％の結晶化度に到達するのに必要な時間を表し、そして
－ 前記ＰＥＴ解重合ステップは、前記酵素を前記プラスチック材料と６５℃±１℃の温度Ｔで接触させることによって実施される。
【0080】
有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、優先的には温度Ｔ＋１５℃以上、より優先的には温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0081】
別の特定の実施形態において、本発明によるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）酵素解重合プロセスは、以下を特徴とする：
－ プラスチック材料が、最大２５％の初期結晶化度及び６０℃±１℃と７０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有するＰＥＴからなる繊維及び／又は繊維及び／又は繊維廃棄物から選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表し、そして
－ 前記ＰＥＴ解重合ステップは、前記酵素を６０℃±１℃の温度Ｔで前記プラスチック材料と接触させることによって実施される。
－ プラスチック材料が、最大２５％の初期結晶化度及び６０℃±１℃と７０℃±１℃との間で構成されるＴｇを有するＰＥＴからなる繊維及び／又は繊維及び／又は繊維廃棄物から選択される；
－ 前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が、前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように、ＰＥＴを分解することができる酵素が選択され、ここで、時間ｔＤは、選択された酵素が前記温度Ｔで前記ＰＥＴの少なくとも８０％、優先的には少なくとも８５％、より優先的には少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間を表し、時間ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで多くとも３５％の結晶化度に達するのに必要な時間を表し、そして
－ 前記ＰＥＴ解重合ステップは、前記酵素を６０℃±１℃の温度Ｔで前記プラスチック材料と接触させることによって実施される。
【0082】
好ましくは、ｔＲは、前記ＰＥＴが前記温度Ｔで最大３０％の結晶化度に達するのに必要な時間を表す。有利には、酵素は、温度Ｔ＋１０℃以上、好ましくは温度Ｔ＋１５℃以上、より好ましくは温度Ｔ＋２０°以上のＴｍを有する酵素から選択される。
【0083】
特定の実施形態では、ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）は、解重合ステップの前に、前記ＰＥＴのサンプルで測定される。
【0084】
本発明によれば、酵素は、前記酵素によるＰＥＴの解重合時間（ｔＤ）が前記ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）よりも厳密に短くなるように選択される。優先的には、酵素は、時間ｔＤが、前記酵素が前記温度Ｔにおいて前記ＰＥＴの少なくとも９０％を解重合するのに必要な時間に対応し、時間ｔＲが、前記ＰＥＴが前記温度Ｔにおいて多くとも３０％の結晶化度に達するのに必要な時間に対応するように選択される。特定の実施形態において、時間ｔＤは２０時間未満、優先的には１８時間未満、１６時間未満、１４時間未満、１２時間未満、１０時間未満である。
【0085】
本発明によれば、ＰＥＴ解重合ステップは、前記ＰＥＴと前記選択された酵素とを温度Ｔで接触させることにより行われる。
【0086】
有利には、ｐＨは、モノマー／オリゴマーの溶解度の関数として解重合プロセスの収率を最適化するように調節される。特に、ｐＨは６．５と９の間に維持されるように調節される。特定の実施形態において、ｐＨは、解重合ステップの間、６．５と８．５の間、優先的には７と８の間に調節される。別の特定の実施形態では、ｐＨは７．５と８．５の間に調節される。
【0087】
本発明によれば、反応器の内容物は、解重合ステップの間、撹拌下に維持される。攪拌速度は、反応器内に係合するプラスチック／ポリエステル材料の懸濁、温度の均一性、およびｐＨ調節の精度を可能にするのに十分であるように、当業者によって調節される。例えば、攪拌速度は５０ｒｐｍと５００ｒｐｍの間、特に８０ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、２５０ｒｐｍ、３００ｒｐｍ、３５０ｒｐｍ、４００ｒｐｍ、４５０ｒｐｍ、５００ｒｐｍに維持される。
【0088】
実施例
実施例１：ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
１．１ プラスチック材料からのＰＥＴの非晶質化
解重合プロセスは、ＰＥＴ廃棄物リサイクル産業から得られる着色・洗浄されたプラスチックフレークを使用して実施される。これらのプラスチック材料は、９８％ｍ／ｍ（重量比）のＰＥＴからなり、平均結晶化度は３４％で、押出工程を経て、その後急冷して廃棄物に含まれるＰＥＴを非晶質化した。非晶質化に使用した押出機は、ギアポンプ、フィルター交換装置、ダイおよびオーバーヘッドウォーターカットシステムを備えたＫＭＢ ＺＥ ６０Ａ二軸押出機であった。調整温度は、エクストルーダーゾーンで２６５℃、ギアポンプで２８０℃、フィルターチェンジャーゾーンで２８０℃、ダイで３６０℃であった。造粒システムで使用される水は８０℃に調節された。フレークを導入するために、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ社から販売されている重量式注入システムを使用した。
実施例１：ＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
１．１ プラスチック材料からのＰＥＴの非晶質化
解重合プロセスは、ＰＥＴ廃棄物リサイクル産業から得られる着色・洗浄されたプラスチックフレークを使用して実施される。これらのプラスチック材料は、９８％ｍ／ｍ（重量比）のＰＥＴからなり、平均結晶化度は３４％で、押出工程を経て、その後急冷して廃棄物に含まれるＰＥＴを非晶質化した。非晶質化に使用した押出機は、ギアポンプ、フィルター交換装置、ダイおよびオーバーヘッドウォーターカットシステムを備えたＫＭＢ ＺＥ ６０Ａ二軸押出機であった。調整温度は、エクストルーダーゾーンで２６５℃、ギアポンプで２８０℃、フィルターチェンジャーゾーンで２８０℃、ダイで３６０℃であった。造粒システムで使用される水は８０℃に調節された。フレークを導入するために、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ社から販売されている重量式注入システムを使用した。
【0089】
流量は１５０ｋｇ／ｈを使用した。造粒には、直径０．８ｍｍの穴１２０個からなるダイを使用した。切断速度は４５００ｒｐｍであった。非晶質化の結果、１ｍｍ以下の顆粒が得られ、結晶化度は１６％（ＤＳＣによる）であった。この顆粒は、ディスクパルベライザーを用いて粉末化工程を経た。この粉末を４００μｍのふるいにかけて、より小さな粉末のみを回収した。この粉末の結晶化度は、以下の実施例１．２に従って１６％と決定された。
【0090】
１．２ ＰＥＴのＴｇと結晶化度の測定
ＤＳＣ分析には、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３装置を乾燥空気流で使用した。実施例１．１の粉末試料を用いて、ＰＥＴ粉末の熱特性、特にガラス転移温度（Ｔｇ）と初期結晶化度を測定するために、最初の温度スキャンのみを実施した。昇温は、４０μＬのアルミニウムるつぼを用い、約１０ｍｇの試料を用いて、１０℃／分の昇温速度で２５℃から２８０℃まで行った。
ＤＳＣ分析には、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３装置を乾燥空気流で使用した。実施例１．１の粉末試料を用いて、ＰＥＴ粉末の熱特性、特にガラス転移温度（Ｔｇ）と初期結晶化度を測定するために、最初の温度スキャンのみを実施した。昇温は、４０μＬのアルミニウムるつぼを用い、約１０ｍｇの試料を用いて、１０℃／分の昇温速度で２５℃から２８０℃まで行った。
【0091】
Ｔｇは、メトラー・トレドのＳＴＡＲｅソフトウエアを用いて、サンプルのサーモグラムに示されたガラス転移の中間点で決定され、初期結晶化度は明細書に詳述されている式に従って決定された。
【0092】
実施例１．１で製造したＰＥＴパウダーのＴｇを７８．４℃で評価した。
【0093】
１．３ プラスチック材料のＰＥＴの結晶化速度論の測定
実施例１．１（ＰＥＴを含むプラスチック材料）の粉末５ｇと水２０ｍｌを４０ｍｌのボトルに入れて混合した。密閉したボトルを、所望のインキュベーション温度Ｔに設定したウォーターバスに浸した。採取した粉末を吸水紙上に置き、少なくとも１２時間風乾した。その後、実施例１．２に示したように、結晶化度を評価するために、およそ１０ｍｇの試料についてＤＳＣ分析を行った。
実施例１．１（ＰＥＴを含むプラスチック材料）の粉末５ｇと水２０ｍｌを４０ｍｌのボトルに入れて混合した。密閉したボトルを、所望のインキュベーション温度Ｔに設定したウォーターバスに浸した。採取した粉末を吸水紙上に置き、少なくとも１２時間風乾した。その後、実施例１．２に示したように、結晶化度を評価するために、およそ１０ｍｇの試料についてＤＳＣ分析を行った。
【0094】
図１は、異なる温度：６５℃、７０℃、７２℃、７５℃における、時間の関数としてのＰＥＴ結晶化度の変化を示している。
【0095】
６５℃では、実施例１．１のパウダー中のＰＥＴの結晶化度はほとんど変化せず、６５℃で７２時間経過しても結晶化度は２０％以下のままである（データは示さず）。これは６５℃以下の温度でも同様である。
【0096】
７０℃、７２℃、７５℃では、ＰＥＴはそれぞれ１７．５時間後、１１．５時間後、５時間後に３５％の結晶化度に達する。７０℃、７２℃、７５℃では、ＰＥＴはそれぞれ１６時間後、１０時間後、４．３時間後に３０％の結晶化度に達する。
【0097】
実施例２：酵素の融解温度（Ｔｍ）の評価
２．１ 酵素生産
遺伝子は、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中で、ＺＹＭ自己誘導性培地（Ｓｔｕｄｉｅｒら，２００５ － Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．４１， ２０７－２３４）中、２１℃で２３時間培養することにより発現させた。大腸菌細胞を遠心分離（６０００ｘｇ、１０分、４℃）で回収し、溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞を氷上で超音波処理して破砕し、溶解液を遠心分離（４℃で、１０，０００ｘｇ，３０ｍｉｎ）で清澄化した。可溶性画分をＴＡＬＯＮ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）にかけた。１０ｍＭのイミダゾールを加えた溶解バッファーで結合していないタンパク質を洗浄した後、結合したタンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭイミダゾール）で溶出した。最終的に透析により保存用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ）に交換した。精製タンパク質の濃度は、２８０ ｎｍで計算したモル消衰係数に基づいて決定した。
２．１ 酵素生産
遺伝子は、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中で、ＺＹＭ自己誘導性培地（Ｓｔｕｄｉｅｒら，２００５ － Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．４１， ２０７－２３４）中、２１℃で２３時間培養することにより発現させた。大腸菌細胞を遠心分離（６０００ｘｇ、１０分、４℃）で回収し、溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁した。細胞を氷上で超音波処理して破砕し、溶解液を遠心分離（４℃で、１０，０００ｘｇ，３０ｍｉｎ）で清澄化した。可溶性画分をＴＡＬＯＮ金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）にかけた。１０ｍＭのイミダゾールを加えた溶解バッファーで結合していないタンパク質を洗浄した後、結合したタンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍＭイミダゾール）で溶出した。最終的に透析により保存用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ）に交換した。精製タンパク質の濃度は、２８０ ｎｍで計算したモル消衰係数に基づいて決定した。
【0098】
２．２ Ｔｍの評価
ＤＳＦは、使用した酵素の融解温度（Ｔｍ）を評価するために使われた。
ＤＳＦは、使用した酵素の融解温度（Ｔｍ）を評価するために使われた。
【0099】
タンパク質サンプルは１４μΜ（０．４ ｍｇ／ｍＬ）の濃度で調製し、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，３００ ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液に保存した。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ Ｄｙｅ ５０００Ｘ ＤＭＳＯストック溶液をまず水で２５０倍に希釈した。タンパク質サンプルを９６ウェルＰＣＲプレート（Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏ－Ｒａｄ、フランス、ｃａｔ＃ ＨＳＰ９６０１）にロードした。各ウェルのタンパク質とＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素の最終濃度は、それぞれ５μΜ（０．１４ｍｇ／ｍｌ）と１０Ｘであった。１ウェルあたりの添加量は、バッファー１５μＬ、０．４ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液９μＬ、２５０倍に希釈したＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液１μＬであった。ＰＣＲプレートを光学用粘着テープでシールし、２０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心した。その後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムをＦＲＥＴチャンネルに設定し、４５０／４９０励起および５６０／５８０発光フィルターを用いてＤＳＦ実験を行った。サンプルは２５℃から１００℃まで１℃／分の速度で加熱した。蛍光測定は０．３℃ごとに行った。融解温度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いて、融解曲線の一次導関数のピークから決定した。Ｔｍ値は３回の測定の平均値である。
【0100】
【表1】
【0101】
実施例３：リアクター解重合工程
５００ｍｌのＭｉｎｉｂｉｏバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で行った。８０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）で調製した０．６９μｍｏｌ～１．１０μｍｏｌの精製タンパク質（実施例２．１．に従って製造）を、実施例１に従って調製した２０ｇのＰＥＴ含有粉末（Ｘｃ＝１６％、Ｔｇ＝７８．４℃）と合わせた。温度調節はウォーターバスに浸漬して行い、２５０ｒｐｍで一定の撹拌を維持するためにシングルマリンタービンを使用した。ｐＨは６Ｎ ＮａＯＨで８に調節し、ｍｙ－Ｃｏｎｔｒｏｌバイオ制御システム（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給し、プロセス中のベースライン消費量を記録した。
５００ｍｌのＭｉｎｉｂｉｏバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で行った。８０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）で調製した０．６９μｍｏｌ～１．１０μｍｏｌの精製タンパク質（実施例２．１．に従って製造）を、実施例１に従って調製した２０ｇのＰＥＴ含有粉末（Ｘｃ＝１６％、Ｔｇ＝７８．４℃）と合わせた。温度調節はウォーターバスに浸漬して行い、２５０ｒｐｍで一定の撹拌を維持するためにシングルマリンタービンを使用した。ｐＨは６Ｎ ＮａＯＨで８に調節し、ｍｙ－Ｃｏｎｔｒｏｌバイオ制御システム（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｌｆｔ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給し、プロセス中のベースライン消費量を記録した。
【0102】
ＰＥＴの解重合速度の特性評価は、定期的にサンプルを採取して超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）にかけ、以下に述べるように生成したテレフタル酸当量量を測定することで達成した。生成したテレフタル酸の量は、反応中に培地に加えた塩基の量によっても推定できる。
【0103】
ＴＡ相当濃度はクロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）で測定した。１５０μＬのメタノールと６．５μＬの６Ｎ塩酸を１５０μＬのサンプルまたは希釈液に加えた。ホモジナイズし、０．４５μｍシリンジフィルターで濾過した後、２０μＬのサンプルを、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃で恒温化されたカラムオーブン、２４０ｎｍのＵＶ検出器からなるＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に注入した。テレフタル酸（ＴＡ）および生成分子（ＭＨＥＴおよびＢＨＥＴ）は、プレカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ， Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）を備えたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）を通して、１ｍ／分で１ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中メタノール（３０％～９０％）のグラジエントを用いて分離した。ＴＡ、ＭＨＥＴ、ＢＨＥＴは、市販のＴＡ、ＢＨＥＴおよび自社で合成したＭＨＥＴから調製した標準曲線に従って測定した。ＴＡ当量は、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴおよびＢＨＥＴに含まれるＴＡの合計に相当する。
【0104】
実施例２の酵素を異なる温度（７０℃±１℃および７２℃±１℃）で試験し、これらの異なる温度で本発明のプロセスを実施するためにどの酵素を選択できるかを評価した。このようにして、酵素は飽和濃度で試験された。６０℃の温度での試験も実施した。６０℃の温度は、従来技術の解重合プロセスで使用されてきた温度に相当する（ネガティブコントロール）。
【0105】
備考として、実施例１．１のＰＥＴの結晶化度３０％および３５％に達するまでの結晶化時間ｔＲは、それぞれ７０℃で１６時間および１７．５時間、７２℃で１０時間および１１．５時間である。
【0106】
以下の表２、３、４、５は、それぞれ異なる温度における酵素Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の時間ｔＤの測定を示す。
【0107】
【表2】
【0108】
Ｅ１の場合、ｔＤは７２℃においてｔＲより高い。したがって、この酵素は、本発明のプロセスの実施には選択できない。その理由の一つは、ＰＥＴが３０％以上の結晶化度に達する前に８０％の転化率に達するには、安定性および／または活性が十分でないからである。
【0109】
【表3】
【0110】
酵素Ｅ２は、本発明のプロセスを７２℃で実施するために選択することができ、６０℃のプロセスと比較して収率の大幅な改善を可能にする（９０％解重合に達するまでの時間が２．３倍短縮）。Ｅ２は、十分に高いＴｍ（＞Ｔ＋２０℃）と十分に低いｔＤの両方を有し、ＰＥＴが７２℃で過剰な結晶化度（３０％の結晶化度に達するまでのｔＲ＝１０時間）に達する前に８０％の解重合に達する。
【0111】
【表4】
【0112】
Ｅ２と同様に、Ｅ３は７２℃で本発明のプロセスを実施するために選択することができる。
【表5】
【0113】
Ｅ２およびＥ３と同様に、Ｅ４を選択して７０℃および７２℃で本発明のプロセスを実施することもでき、６０℃のプロセスと比較して収率の大幅な改善を可能にする。
【0114】
実施例４：ＰＥＴからなる繊維廃棄物からのプラスチック材料の分解プロセス
４．１ 繊維廃棄物からのＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
４．１．１ 繊維廃棄物からのプラスチック材料の非晶質化とＰＥＴの結晶化度の測定
この解重合プロセスは、ウォータージェット製織工程から排出される製造廃棄物を使用して実施され、その材料は連続した糸クラスター状で、ＰＥＴを約１００％含む。これらの繊維材料は、６０℃で１６時間の乾燥工程を経た後、押出工程を経て、廃棄物に含まれるＰＥＴの非晶質化を可能にするために急冷された。非晶質化に使用した押出機はＬｅｉｓｔｒｉｔｚ ＺＳＥ １８ ＭＡＸＸ二軸押出機である。加熱ゾーンの温度は、以下のプロファイルに従って設定した：
２６５℃－２６５℃－２６５℃－２５５℃－２５５℃－２５０℃－２５０℃－２４５℃－２４５℃－２４５℃
４．１ 繊維廃棄物からのＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
４．１．１ 繊維廃棄物からのプラスチック材料の非晶質化とＰＥＴの結晶化度の測定
この解重合プロセスは、ウォータージェット製織工程から排出される製造廃棄物を使用して実施され、その材料は連続した糸クラスター状で、ＰＥＴを約１００％含む。これらの繊維材料は、６０℃で１６時間の乾燥工程を経た後、押出工程を経て、廃棄物に含まれるＰＥＴの非晶質化を可能にするために急冷された。非晶質化に使用した押出機はＬｅｉｓｔｒｉｔｚ ＺＳＥ １８ ＭＡＸＸ二軸押出機である。加熱ゾーンの温度は、以下のプロファイルに従って設定した：
２６５℃－２６５℃－２６５℃－２５５℃－２５５℃－２５０℃－２５０℃－２４５℃－２４５℃－２４５℃
【0115】
スクリュー速度は１５０ｒｐｍに調節した。材料の押出機への導入は手動で行った。押出機のヘッドに到着したロッドは、直ちに１０℃の水浴に浸した。得られたロッドを造粒し、次いでマイクロナイザー（１ｍｍグリッド）を用いて微粉末にした。次に、この粉末を５００μｍのふるいにかけて、このサイズより小さい粉末のみを回収した。粉末の結晶化度を実施例１．２に従って測定したところ、１０％未満であった。
【0116】
４．１．２ プラスチック材料の ＰＥＴ の結晶化動力学の測定
繊維廃棄物由来のＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定は、実施例１．３と同じプロトコルで行った。６８℃では、実施例４．１で得られた粉末中のＰＥＴの結晶化度はほとんど変化せず、６８℃で２９時間後、結晶化度は２０％以下のままであった。６０℃でも同様である。
繊維廃棄物由来のＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定は、実施例１．３と同じプロトコルで行った。６８℃では、実施例４．１で得られた粉末中のＰＥＴの結晶化度はほとんど変化せず、６８℃で２９時間後、結晶化度は２０％以下のままであった。６０℃でも同様である。
【0117】
４．１．３ ＰＥＴのＴｇ測定
ＰＥＴのＴｇ測定は、実施例１．２と同じプロトコルで行った。実施例４．１．１で製造したＰＥＴ粉末のＴｇは、７５．７℃で評価した。
ＰＥＴのＴｇ測定は、実施例１．２と同じプロトコルで行った。実施例４．１．１で製造したＰＥＴ粉末のＴｇは、７５．７℃で評価した。
【0118】
４．２ 繊維廃棄物からのＰＥＴプラスチック材料のリアクター解重合プロセスによる酵素選択。
解重合試験には、総容量５Ｌの皿底リアクター（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ社製）を使用した。リアクターには温度プローブとｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＥａｓｙＦｅｒｍ ＨＢ ＢｉｏＡｒｃ ３２５）を取り付けた。これら２つのパラメーターの設定値への調節は、Ｃ－ｂｉｏソフトウェア（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ）に内蔵されたＰＩＤコントローラーによって行われた。直径５．５ｃｍの海洋パドルを３００ｒｐｍで回転する中央シャフトに取り付け、反応液の攪拌を行った。
解重合試験には、総容量５Ｌの皿底リアクター（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ社製）を使用した。リアクターには温度プローブとｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＥａｓｙＦｅｒｍ ＨＢ ＢｉｏＡｒｃ ３２５）を取り付けた。これら２つのパラメーターの設定値への調節は、Ｃ－ｂｉｏソフトウェア（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ）に内蔵されたＰＩＤコントローラーによって行われた。直径５．５ｃｍの海洋パドルを３００ｒｐｍで回転する中央シャフトに取り付け、反応液の攪拌を行った。
【0119】
すべての試験において、２０％ ｍ．ｍ．水酸化ナトリウムを添加してｐＨを８．０に調整した。酵素Ｅ４は、従事するＰＥＴの量に対して１：１０００の重量比で添加した。これは、液体培地中での組換え微生物の発酵によって生産された。
【0120】
以下の表６は、４．１．１で定義されたプラスチック材料における酵素Ｅ４の時間ｔＤの測定を、それぞれ異なる温度で示したものである。
【0121】
【表6】
【0122】
ｔＤが６８℃でｔＲより低いままであることから、Ｅ４は、４．１．１で定義されたプラスチック材料に６８℃で本発明のプロセスを実施するために選択され、同時に６０℃のプロセスと比較して収率の大幅な改善を可能にする。
【0123】
実施例５：プラスチック廃棄物からプラスチックを分解するプロセス。選択とスケールアップ。
５．１ プラスチック廃棄物からのＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
５．１．１ プラスチック廃材からのＰＥＴの非晶質化とＰＥＴの結晶化度の測定
非晶質化に使用した押出機は、ギアポンプ、フィルター交換装置、ダイおよびオーバーヘッドウォーターカットシステムを備えたＫＭＢ ＺＥ ６０Ａ二軸押出機である。温度は、押出ゾーンで２６５℃、ギアポンプで２７５℃、フィルター交換ゾーンで２７５℃、ダイで３５０℃に調節した。スクリューの回転速度は１６０ｒｐｍであった。造粒システムで使用する水は８０℃に調節した。フレークを導入するために、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ社から販売されている２つの重量式注入システムを使用した。流量は３００ｋｇ／ｈを使用した。造粒には、直径０．７５ｍｍの穴２４０個からなるダイを使用した。切断速度は３８００穴／分であった。非晶質化の結果、１ｍｍ以下の顆粒が得られ、結晶化度は１２％であった（ＤＳＣによる）。この顆粒は、ディスクパルベライザーを用いて粉末化工程を経た。粉末は５００μｍのふるいにかけられ、より小さな粉末のみが回収された。粉末の結晶化度は実施例１．２に従い、１６．５％（ＤＳＣ）であった。
５．１ プラスチック廃棄物からのＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定
５．１．１ プラスチック廃材からのＰＥＴの非晶質化とＰＥＴの結晶化度の測定
非晶質化に使用した押出機は、ギアポンプ、フィルター交換装置、ダイおよびオーバーヘッドウォーターカットシステムを備えたＫＭＢ ＺＥ ６０Ａ二軸押出機である。温度は、押出ゾーンで２６５℃、ギアポンプで２７５℃、フィルター交換ゾーンで２７５℃、ダイで３５０℃に調節した。スクリューの回転速度は１６０ｒｐｍであった。造粒システムで使用する水は８０℃に調節した。フレークを導入するために、Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ社から販売されている２つの重量式注入システムを使用した。流量は３００ｋｇ／ｈを使用した。造粒には、直径０．７５ｍｍの穴２４０個からなるダイを使用した。切断速度は３８００穴／分であった。非晶質化の結果、１ｍｍ以下の顆粒が得られ、結晶化度は１２％であった（ＤＳＣによる）。この顆粒は、ディスクパルベライザーを用いて粉末化工程を経た。粉末は５００μｍのふるいにかけられ、より小さな粉末のみが回収された。粉末の結晶化度は実施例１．２に従い、１６．５％（ＤＳＣ）であった。
【0124】
５．１．２ ＰＥＴのＴｇ測定
ＰＥＴのＴｇ測定は、実施例１．２と同じプロトコルで行った。実施例５．１．１で製造したＰＥＴ粉末のＴｇは、７５．２℃で評価した。
ＰＥＴのＴｇ測定は、実施例１．２と同じプロトコルで行った。実施例５．１．１で製造したＰＥＴ粉末のＴｇは、７５．２℃で評価した。
【0125】
５．１．３ プラスチック材料の ＰＥＴ の結晶化速度論の測定
プラスチック材料のＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定は、実施例１．３と同じプロトコールに従って実施した。６０℃および６６℃では、実施例５．１で得られた粉末中のＰＥＴの結晶化度はほとんど変化せず、６０℃または６６℃で３０時間後、結晶化度は２２％以下のままである。７２℃では、１８時間で３０％に達する（ｔＲ）。
プラスチック材料のＰＥＴの結晶化時間（ｔＲ）の測定は、実施例１．３と同じプロトコールに従って実施した。６０℃および６６℃では、実施例５．１で得られた粉末中のＰＥＴの結晶化度はほとんど変化せず、６０℃または６６℃で３０時間後、結晶化度は２２％以下のままである。７２℃では、１８時間で３０％に達する（ｔＲ）。
【0126】
５．２ プラスチック廃棄物からのＰＥＴプラスチック材料のリアクター解重合プロセスによる酵素選択。
試験Ａでは、総容量５００ ｍＬの平底攪拌リアクター（ＭｉｎｉＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ、Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ社製）を使用した。温度プローブとｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＥＡｓｙＦｅｒｍ ＨＢ ＢｉｏＡｒｃ １２０）を装備した。これら２つのパラメーターの設定値への調節は、Ｃ－ｂｉｏソフトウェア（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ）の内部ＰＩＤコントローラーによって確実に行われた。３００ｒｐｍで回転する中央シャフトに固定された直径３ｃｍの海洋パドルが反応液の攪拌を行った。
試験Ａでは、総容量５００ ｍＬの平底攪拌リアクター（ＭｉｎｉＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ、Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ社製）を使用した。温度プローブとｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＥＡｓｙＦｅｒｍ ＨＢ ＢｉｏＡｒｃ １２０）を装備した。これら２つのパラメーターの設定値への調節は、Ｃ－ｂｉｏソフトウェア（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ）の内部ＰＩＤコントローラーによって確実に行われた。３００ｒｐｍで回転する中央シャフトに固定された直径３ｃｍの海洋パドルが反応液の攪拌を行った。
【0127】
試験ＢおよびＣでは、実施例４．２に記載したように、総容量５Ｌの皿底反応器（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ社製）を使用した。
【0128】
すべての試験において、２０％ ｍ．ｍ．水酸化ナトリウムを添加してｐＨを８．０に調整した。酵素Ｅ４は、従事するＰＥＴの量に対して１：１０００の重量比で添加した。これは、液体培地中での組換え微生物の発酵によって生産された。
【0129】
以下の表７は、それぞれ異なる温度における酵素Ｅ４の時間ｔＤの測定値を示している。
【0130】
【表7】
【0131】
ｔＤはｔＲより低いままであるため、Ｅ４は、５．１．１で定義したプラスチック材料に対して、これら２つの温度で本発明のプロセスを実施するために選択することができる。６６℃および７２℃でのＥ４の使用は、６０℃でのプロセスと比較して収率の大幅な改善を可能にするはずであることに留意されたい。
【0132】
５．３ スケーリングの検証
前述のステップにより、酵素Ｅ４が選択できることが検証されたので、本発明に従ってプロセスを実施することができる。
前述のステップにより、酵素Ｅ４が選択できることが検証されたので、本発明に従ってプロセスを実施することができる。
【0133】
この試験（Ｄ）では、総容量１０００ Ｌの平底リアクターを使用した。反応器には温度プローブとｐＨプローブ（Ｉｎ Ｐｒｏ３１００／ＳＧ／３２５、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）を取り付けた。反応液の攪拌には直径可変のマリンパドルを使用した。酵素Ｅ４は、ＰＥＴの量に対して２：１０００の重量比で添加した。これは、液体培地中での組換え微生物の発酵によって生産された。
【0134】
６６℃の温度で行われた分解は、上記と同じ方法に従って追跡される。
【0135】
したがって、分解率は１４時間後に８０％、２４時間後に９０％となる。
【0136】
準工業用容積で得られた結果は、酵素の選択時に得られた結果と一致している。より大きな容積を使用することで、より良い攪拌が可能になり、収率が向上することに留意されたい。
【図1】
【配列表】