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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-18
(45)【発行日】2024-06-26
(54)【発明の名称】Ｖａｎｉｎ－１阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/165 20060101AFI20240619BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240619BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240619BHJP
【ＦＩ】
A61K31/165
A61P9/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021204876
(22)【出願日】2021-12-17
(65)【公開番号】P2023090096
(43)【公開日】2023-06-29
【審査請求日】2024-01-22
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】502437894
【氏名又は名称】学校法人大阪医科薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】細畑 圭子
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼井 真司
(72)【発明者】
【氏名】米山 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】金 徳男
(72)【発明者】
【氏名】宇佐美 吉英
【審査官】新留 素子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３５８３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０３６４２３３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１５２７２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１５２７２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ACS Chem. Biol.，2013年，Vol.8，pp.530-534
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
【化1】
前記フッ素原子を含む置換基は、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルキル基、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルコキシ基、及びフッ素原子を含む炭素数１～４のアルキルチオ基からなる群から選択される、パントテインケトン誘導体を有効成分として含むＶａｎｉｎ－１阻害剤。
【請求項2】
前記フッ素原子を含む置換基は、－ＣＦ３、－ＯＣＦ３、及び－ＳＣＦ３からなる群から選択される請求項１に記載のＶａｎｉｎ－１阻害剤。
【請求項3】
前記Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内いずれか１つのみがフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表す請求項１に記載のＶａｎｉｎ－１阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤に関し、特にパントテインケトン誘導体を有効成分として含むＶａｎｉｎ－１阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｖａｎｉｎ－１は塩基ドメインとニトリラーゼドメインとからなる５１３アミノ酸のＧＰＩアンカー型タンパク質であり、パンテテインからパントテン酸及びシステアミンへの加水分解反応を触媒する酵素である。Ｖａｎｉｎ－１は主に酸化ストレスと炎症の調節に関与することが知られている。
【0003】
Ｖａｎｉｎ－１阻害剤としては、例えばＲＲ６が非特許文献１に開示されている。パンテテインとＲＲ６の構造式を以下に示す。
【0004】
【化1】
【0005】
パンテテインは生体内に広く分布する細胞外酵素Ｖａｎｉｎ－１の基質である。上記構造式から分かるように、ＲＲ６はパンテテインとの共通構造を有している。
【0006】
具体的には、非特許文献１において、ＲＲ６がｉｎ ｖｉｖｏ試験においてＶａｎｉｎ－１阻害剤として機能することが開示されており、その阻害活性はＩＣ５０＝０．７８μＭであることが開示されている（非特許文献１の図３Ｂ参照）。
【0007】
非特許文献２には、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤であるＲＲ６を用いる治療により、ラット大動脈移植後の血管内膜肥厚抑制効果を示すことが開示されている（非特許文献２のＡｂｓｔｒａｃｔ参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【文献】P. A. M. Jansen, J. A. Diepen, B. Ritzen, P. L. J. M. Zeeuwen, I. Cacciatore, C. Cornacchia, I. M. J. J. Vlijmen-Willems, E. Heuvel, P. N. M. Botman, R. H. Blaauw, P. H. H. Hermkens, F. P. J. T. Rutjes and J. Schalkwijk, Discovery of small molecule vanin inhibitors: new tools to study metabolism and disease. ACS Chem Biol. 8: 530-534, 2013.
【文献】Wedel J, Jansen PA, Botman PN, Rutjes FP, Schalkwijk J, Hillebrands JL. Pharmacological Inhibition of Vanin Activity Attenuates Transplant Vasculopathy in Rat Aortic Allografts. Transplantation. 100: 1656-1666, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記の通り、ＲＲ６はＶａｎｉｎ－１阻害剤として機能すること及びＲＲ６を用いる治療によりラット大動脈移植後の血管内膜肥厚抑制効果を示すことが、非特許文献１及び２に開示されている。しかし、非特許文献２に記載の通り、ＲＲ６をＶａｎｉｎ－１阻害剤として十分に機能させるためには、ＲＲ６を有効成分として３ｍｇ／ｍＬの用量で飲水投与する必要がある。そのため、高用量のＲＲ６を使用しなければならない点で問題があった。このため、Ｖａｎｉｎ－１の阻害活性が高く、低用量でＶａｎｉｎ－１を十分に阻害できる阻害剤が求められていた。
【0010】
本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的はＲＲ６のＶａｎｉｎ－１阻害活性（ＩＣ５０＝０．７８μＭ）を上回るＶａｎｉｎ－１阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、ＲＲ６のＶａｎｉｎ－１阻害活性（ＩＣ５０＝０．７８μＭ）を上回る新規Ｖａｎｉｎ－１阻害剤の開発を試みた。具体的にはＲＲ６をリード化合物として、各種置換基の種類及び配置の異なる化合物の合成を行い、活性評価を行った。その結果、ＲＲ６のベンゼン環上にフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を少なくとも１つ導入することで、ＲＲ６のＶａｎｉｎ－１阻害活性を上回るＶａｎｉｎ－１阻害剤を提供できることを見出して本発明を完成した。
【0012】
具体的に、本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤は、下記一般式（Ｉ）［式中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は独立して水素原子、フッ素基、及びフッ素原子を含む置換基から選択されたものを表し、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内少なくとも１つはフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表す］により表されるパントテインケトン誘導体を有効成分として含むＶａｎｉｎ－１阻害剤であることを特徴とする。
【0013】
【化2】
【0014】
本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤によると、従来のＶａｎｉｎ－１阻害剤であるＲＲ６のＶａｎｉｎ－１阻害活性よりも強い阻害活性を示すＶａｎｉｎ－１阻害剤を提供することができる。従って、低用量のＶａｎｉｎ－１阻害剤であってもＶａｎｉｎ－１を十分に阻害することができ、強力な阻害活性を有するＶａｎｉｎ－１阻害剤として幅広く利用することができる。
【0015】
本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤において、パントテインケトン誘導体のフッ素原子を含む置換基は、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルキル基、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルコキシ基、及びフッ素原子を含む炭素数１～４のアルキルチオ基からなる群から選択することができる。
【0016】
本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤において、パントテインケトン誘導体のフッ素原子を含む置換基は、－ＣＦ３、－ＯＣＦ３、及び－ＳＣＦ３からなる群から選択することができる。
【0017】
本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤において、パントテインケトン誘導体のＸ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内いずれか１つのみがフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表すことを特徴とする。
【発明の効果】
【0018】
本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤によると、従来のＶａｎｉｎ－１阻害剤であるＲＲ６のＶａｎｉｎ－１阻害活性よりも強い阻害活性を示すＶａｎｉｎ－１阻害剤を提供することができる。従って、低用量のＶａｎｉｎ－１阻害剤であってもＶａｎｉｎ－１を十分に阻害することができ、強力な阻害活性を有するＶａｎｉｎ－１阻害剤として幅広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】実施例１～２及び比較例１、８～９に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を示す図である。
【図2】実施例１～５及び比較例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を示す図である。
【図3】比較例１～５に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を示す図である。
【図4】比較例１、６～７に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を示す図である。
【図5】実施例１及び比較例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を示し、（ａ）は血清中におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性（ｂ）は腎臓組織抽出液におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0021】
本実施形態に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤について以下説明する。
【0022】
上述したように、Ｖａｎｉｎ－１は、パンテテインからパントテン酸及びシステアミンへの加水分解反応を触媒する酵素である。本明細書において「Ｖａｎｉｎ－１阻害」とは、Ｖａｎｉｎ－１の酵素活性の阻害を意味する。
【0023】
本発明の一実施形態は、下記一般式（Ｉ）により表されるパントテインケトン誘導体を有効成分として含むＶａｎｉｎ－１阻害剤である。
【0024】
【化3】
【0025】
上記一般式（Ｉ）中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は独立して水素原子、ハロゲン基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキルアミノ基、及びフッ素原子を含む置換基から選択されたものを表し、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内少なくとも１つはフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表す。
【0026】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′のハロゲン基としては、フッ素基、塩素基、臭素基、ヨウ素基等が挙げられる。
【0027】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の置換されていてもよい炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。
【0028】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の置換されていてもよい炭素数１～４のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基等が挙げられる。
【0029】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の置換されていてもよい炭素数１～４のアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基等が挙げられる。
【0030】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′のフッ素原子を含む置換基としては、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルキル基、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルコキシ基、フッ素原子を含む炭素数１～４のアルキルチオ基等が挙げられる。好ましくは、トリフルオロメチル基（－ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ基（－ＯＣＦ３）、トリフルオロメチルチオ基（－ＳＣＦ３）が挙げられる。
【0031】
Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内少なくとも１つはフッ素基又はフッ素原子を含む置換基であることを要するが、当該置換基の上限数は特に限定されない。残りの置換基については、独立して上記の置換基群から適宜選択することができる。また、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内いずれか１つのみがフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表すものであってもよい。この場合にも、残りの置換基は独立して上記の置換基群から適宜選択することができる。
【0032】
＜一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体の具体例＞
一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体の具体例としては、例えば、下記化合物が挙げられる。
一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体の具体例としては、例えば、下記化合物が挙げられる。
【0033】
【化4】
【0034】
本実施形態において、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤は一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体を有効成分として含むものであればよく、その含有量は特に制限されない。
【0035】
本実施形態において、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤の剤形は特に制限されず、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、水剤、若しくは舌下剤等の経口剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、坐剤、又はエアゾール剤等とすることができる。
【0036】
本実施形態において、製剤化は公知の製剤技術により行うことができ、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤は適当な製剤添加物を含むことができる。製剤添加物としては、賦形剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤、ｐＨ調節剤、及び香料等が挙げられるが、これに制限されず、当技術分野で使用されているものは適宜使用することができる。
【0037】
＜一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体の製造方法＞
本実施形態に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の有効成分であるパントテインケトン誘導体の製造方法は、特に制限されるものではなく、従来公知の方法を適宜利用することができる。以下、パントテインケトン誘導体の製造方法の一実施形態について説明する。
本実施形態に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の有効成分であるパントテインケトン誘導体の製造方法は、特に制限されるものではなく、従来公知の方法を適宜利用することができる。以下、パントテインケトン誘導体の製造方法の一実施形態について説明する。
【0038】
本実施形態において、一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体は、例えば以下の工程１～４により製造することができる。
【0039】
【化5】
【0040】
（工程１）
パンテテイン酸をアセトン溶媒中で濃硫酸等の酸触媒と共に室温で反応させて化合物（ＩＩ）を製造する。
パンテテイン酸をアセトン溶媒中で濃硫酸等の酸触媒と共に室温で反応させて化合物（ＩＩ）を製造する。
【0041】
（工程２）
化合物（ＩＩ）を文献記載の方法（Schalkwijk, J. et al., ACS Chem. Biol., 2013, 8, 530-534.）に準じてジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン等、又はそれらの混合溶媒中、０℃から２５０℃の範囲で、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、ＤＢＵ（ジアザビシクロウンデセン）等の塩基存在下、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン及びその塩酸塩と共に、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の脱水縮合剤を用いて反応させて化合物（ＩＩＩ）を製造する。
化合物（ＩＩ）を文献記載の方法（Schalkwijk, J. et al., ACS Chem. Biol., 2013, 8, 530-534.）に準じてジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン等、又はそれらの混合溶媒中、０℃から２５０℃の範囲で、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、ＤＢＵ（ジアザビシクロウンデセン）等の塩基存在下、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン及びその塩酸塩と共に、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の脱水縮合剤を用いて反応させて化合物（ＩＩＩ）を製造する。
【0042】
（工程３）
化合物（ＩＩＩ）を化合物（ＩＶ）（式中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は独立して水素原子、ハロゲン基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキルアミノ基、及びフッ素原子を含む置換基から選択されたものを表し、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内少なくとも１つはフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表す）とジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン等、又はそれらの混合溶媒中、－７８℃から２００℃の範囲で反応させて化合物（Ｖ）を製造する。
化合物（ＩＩＩ）を化合物（ＩＶ）（式中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は独立して水素原子、ハロゲン基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、置換されていてもよい炭素数１～４のアルキルアミノ基、及びフッ素原子を含む置換基から選択されたものを表し、Ｘ、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′の内少なくとも１つはフッ素基又はフッ素原子を含む置換基を表す）とジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、トルエン、ジオキサン等、又はそれらの混合溶媒中、－７８℃から２００℃の範囲で反応させて化合物（Ｖ）を製造する。
【0043】
（工程４）
化合物（Ｖ）のアセタール基を脱保護して一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体を製造する。
化合物（Ｖ）のアセタール基を脱保護して一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体を製造する。
【0044】
このようにして製造された一般式（Ｉ）で表されるパントテインケトン誘導体は、カラムクロマトグラフィー等の精製手段により単離精製して使用することができる。しかし、パントテインケトン誘導体の精製手段は特に制限されず、当技術分野で知られている精製手段であれば適宜使用することができる。
【実施例】
【0045】
以下に、本発明に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤について詳細に説明するための実施例を示す。
【0046】
実施例１
一般式（Ｉ）（式中、Ｘは－ＯＣＦ３を表し、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－７）を以下のように製造した。
一般式（Ｉ）（式中、Ｘは－ＯＣＦ３を表し、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－７）を以下のように製造した。
【0047】
（Ｒ）－３－（２，２，５，５－テトラメチル－１，３－ジオキサン－４－カルボキシアミド）プロパノイックアシッドの製造
文献記載の方法（Schalkwijk, J. et al., ACS Chem. Biol., 2013, 8, 530-534.）に準じて、（Ｒ）－パンテテイン酸カルシウム塩２５ｇを１Ｎ塩酸水溶液１２０ｍＬに溶解し、食塩を飽和するまで加え、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られたパンテテイン酸をアセトン５００ｍＬに溶解し、濃硫酸０．５ｍＬを加え、室温にて１５時間撹拌を行った。重曹を加えて反応を止めた後、ろ過を行い、ろ液を溶媒留去し、標題化合物を得た。
スペクトルデータ：1H-NMR (CDCl3):δ0.99 (S, 3H), 1.05 (S, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 2.63 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.30 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 3.56 (m, 2H), 3.71 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.13 (s, 1H), 7.07 (t, 1H, J = 6.0 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ 18.7, 18.8, 22.0, 29.4, 32.9, 33.9, 34.1, 71.4, 77.1, 99.1, 170.2, 176.7.
文献記載の方法（Schalkwijk, J. et al., ACS Chem. Biol., 2013, 8, 530-534.）に準じて、（Ｒ）－パンテテイン酸カルシウム塩２５ｇを１Ｎ塩酸水溶液１２０ｍＬに溶解し、食塩を飽和するまで加え、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、得られたパンテテイン酸をアセトン５００ｍＬに溶解し、濃硫酸０．５ｍＬを加え、室温にて１５時間撹拌を行った。重曹を加えて反応を止めた後、ろ過を行い、ろ液を溶媒留去し、標題化合物を得た。
スペクトルデータ：1H-NMR (CDCl3):δ0.99 (S, 3H), 1.05 (S, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 2.63 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.30 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 3.56 (m, 2H), 3.71 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.13 (s, 1H), 7.07 (t, 1H, J = 6.0 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ 18.7, 18.8, 22.0, 29.4, 32.9, 33.9, 34.1, 71.4, 77.1, 99.1, 170.2, 176.7.
【0048】
（Ｒ）－Ｎ－｛３－［メトキシ（メチル）アミノ］－３－オキソプロピル｝－２，２，５，５－テトラメチル－１，３－ジオキサン－４－カルボキシアミドの製造
得られた化合物４．１ｇをジクロロメタン５０ｍＬに溶解し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４．５ｇとＮ，Ｏジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩２．３ｇとジメチルアミノピリジン１．０ｇとＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８ｍＬを加え、室温にて２０時間撹拌を行った。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止めた後、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物４．４ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.96 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 2.76-2.59 (m, 2H), 3.18 (s, 3H), 3.27 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 3.64-3.48 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.68 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.07 (s, 1H), 7.13 (t, 1H, J = 5.7 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ18.7, 18.8, 22.1, 29.4, 31.8, 32.1, 33.0, 34.0, 61.2, 71.5, 77.1, , 99.0, 169.9, 172.9.
得られた化合物４．１ｇをジクロロメタン５０ｍＬに溶解し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩４．５ｇとＮ，Ｏジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩２．３ｇとジメチルアミノピリジン１．０ｇとＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン８ｍＬを加え、室温にて２０時間撹拌を行った。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止めた後、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物４．４ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.96 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 2.76-2.59 (m, 2H), 3.18 (s, 3H), 3.27 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 3.64-3.48 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.68 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.07 (s, 1H), 7.13 (t, 1H, J = 5.7 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ18.7, 18.8, 22.1, 29.4, 31.8, 32.1, 33.0, 34.0, 61.2, 71.5, 77.1, , 99.0, 169.9, 172.9.
【0049】
（Ｒ）－２，２，５，５－テトラメチル－Ｎ－［３－オキソ－４－（４－トリフルオロメトキシフェニル）ブチル］－１，３－ジオキサン－４－カルボキシアミドの製造
得られた化合物０．９ｇをＴＨＦ３０ｍＬに溶解し、４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミド２．５ｇと削状マグネシウム０．３ｇを加え、室温にて２時間撹拌を行った。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止めた後、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物１．０ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.87 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 2.68-2.83 (m, 2H), 3.26 (d, 1H, J = 11.6 Hz), 3.39-3.59 (m, 2H), 3.67 (d, 1H, J = 11.6 Hz), 3.71 (s, 2H), 4.04 (s, 1H), 6.90 (br, 1H), 7.18 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.8 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ18.6, 18.7, 22.0, 29.4, 32.9, 33.2, 41.6, 49.1, 71.4, 99.0, 120.4 (quartet, J = 257 Hz), 121.3, 130.7, 132.3, 148.3, 169.8, 206.6.
得られた化合物０．９ｇをＴＨＦ３０ｍＬに溶解し、４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミド２．５ｇと削状マグネシウム０．３ｇを加え、室温にて２時間撹拌を行った。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止めた後、酢酸エチルにて抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物１．０ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.87 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 2.68-2.83 (m, 2H), 3.26 (d, 1H, J = 11.6 Hz), 3.39-3.59 (m, 2H), 3.67 (d, 1H, J = 11.6 Hz), 3.71 (s, 2H), 4.04 (s, 1H), 6.90 (br, 1H), 7.18 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.22 (d, 2H, J = 8.8 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ18.6, 18.7, 22.0, 29.4, 32.9, 33.2, 41.6, 49.1, 71.4, 99.0, 120.4 (quartet, J = 257 Hz), 121.3, 130.7, 132.3, 148.3, 169.8, 206.6.
【0050】
（Ｒ）－２，４－ジヒドロキシ－３，３－ジメチル－Ｎ－［３－オキソ－４－（４－トリフルオロメトキシフェニル）ブチル］ブタンアミド（ＯＭＰ－７）の製造
得られた化合物１．０ｇをアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、塩化ビスマス（ＩＩＩ）０．１ｇと水１ｍＬを加え、室温にて１４時間撹拌した。反応混合液を珪藻土に吸収させ、余分な溶媒を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物（ＯＭＰ－７）０．７ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.83 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 2.76 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.42-3.58 (m, 4H), 3.72 (s, 2H), 3.95 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 4.02 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 9.2 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ20.1, 21.0, 21.1, 33.6, 39.2, 41.6, 49.0, 71.1, 120.4 (quartet, J = 257 Hz), 121.2, 130.8, 132.1, 148.3, 173.2, 206.9.
得られた化合物１．０ｇをアセトニトリル２０ｍＬに溶解し、塩化ビスマス（ＩＩＩ）０．１ｇと水１ｍＬを加え、室温にて１４時間撹拌した。反応混合液を珪藻土に吸収させ、余分な溶媒を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、淡黄色油状化合物として標題化合物（ＯＭＰ－７）０．７ｇを得た。
1H-NMR (CDCl3):δ0.83 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 2.76 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.42-3.58 (m, 4H), 3.72 (s, 2H), 3.95 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 4.02 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.21 (d, 2H, J = 9.2 Hz); 13C-NMR (CDCl3):δ20.1, 21.0, 21.1, 33.6, 39.2, 41.6, 49.0, 71.1, 120.4 (quartet, J = 257 Hz), 121.2, 130.8, 132.1, 148.3, 173.2, 206.9.
【0051】
実施例２
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘはフッ素基を表し、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１０）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘはフッ素基を表し、Ｙ、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１０）を得た。
【0052】
実施例３
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘは水素原子を表し、Ｙは－ＯＣＦ３を表し、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１１）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘは水素原子を表し、Ｙは－ＯＣＦ３を表し、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１１）を得た。
【0053】
実施例４
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘは水素原子を表し、Ｙはフッ素基を表し、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１３）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘは水素原子を表し、Ｙはフッ素基を表し、Ｙ′、Ｚ、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１３）を得た。
【0054】
実施例５
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて２－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′は水素原子を表し、Ｚはフッ素基を表し、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１４）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて２－フルオロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、一般式（Ｉ）（式中、Ｘ、Ｙ、Ｙ′は水素原子を表し、Ｚはフッ素基を表し、Ｚ′は水素原子を表す）で表されるパントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１４）を得た。
【0055】
比較例１
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えてベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＲＲ６）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えてベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＲＲ６）を得た。
【0056】
比較例２
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－クロロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－クロロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－１）を得た。
【0057】
比較例３
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－メトキシベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－２）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－メトキシベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－２）を得た。
【0058】
比較例４
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－メチルベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－３）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて４－メチルベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－３）を得た。
【0059】
比較例５
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３、４－ジクロロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－４）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて３、４－ジクロロベンジルブロミドを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－４）を得た。
【0060】
比較例６
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて２－（ブロモメチル）ナフタレンを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－５）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて２－（ブロモメチル）ナフタレンを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－５）を得た。
【0061】
比較例７
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて１－（ブロモメチル）ナフタレンを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－６）を得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて１－（ブロモメチル）ナフタレンを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－６）を得た。
【0062】
比較例８
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて（３－ブロモ－１－プロピニル）トリメチルシランを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－８）をＯＭＰ－９の副生成物として得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて（３－ブロモ－１－プロピニル）トリメチルシランを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－８）をＯＭＰ－９の副生成物として得た。
【0063】
比較例９
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて（３－ブロモ－１－プロピニル）トリメチルシランを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－９）をＯＭＰ－８と共に得た。
４－（トリフルオロメトキシ）ベンジルブロミドに代えて（３－ブロモ－１－プロピニル）トリメチルシランを加えたこと以外は実施例１と同様にして、パントテインケトン誘導体（ＯＭＰ－９）をＯＭＰ－８と共に得た。
【0064】
実施例１～５、比較例１～９で得られたパントテインケトン誘導体を表１にまとめた。
【0065】
【表1】
【0066】
［ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性測定］
実施例１～５、比較例１～９で得られたパントテインケトン誘導体をＶａｎｉｎ－１阻害剤として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性を以下のように測定した。
実施例１～５、比較例１～９で得られたパントテインケトン誘導体をＶａｎｉｎ－１阻害剤として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性を以下のように測定した。
【0067】
（材料）
アッセイバッファーはリン酸緩衝液粉末９ｇ／袋（１／１５ｍｏｌＬ－１＝６６ｍＭ：和光純薬）を１Ｌの蒸留水に溶解して作製した。基質であるＰａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣはAnalytical Biochemistry 2010;399: 284-292に記載されるプロトコルに従って合成した。ヒト血清はＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯから「正常ヒト血清」（品番：１２１８１２１１）を購入して使用した。
アッセイバッファーはリン酸緩衝液粉末９ｇ／袋（１／１５ｍｏｌＬ－１＝６６ｍＭ：和光純薬）を１Ｌの蒸留水に溶解して作製した。基質であるＰａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣはAnalytical Biochemistry 2010;399: 284-292に記載されるプロトコルに従って合成した。ヒト血清はＫＯＨＪＩＮ ＢＩＯから「正常ヒト血清」（品番：１２１８１２１１）を購入して使用した。
【0068】
（ヒト血清を用いるスクリーニング）
下記１～８の手順でＶａｎｉｎ－１阻害活性を測定した。
１．ブラック９６穴ウェルに７９μＬのアッセイバッファーを入れた。
２．アッセイバッファーが入ったウェルにヒト血清を１０μＬを入れた。
３．［２．］のウェルに各Ｖａｎｉｎ－１阻害剤（１０－７Ｍ～１０－２Ｍ ｉｎ ＤＭＳＯ） １μＬ又はＤＭＳＯ １μＬを入れた。
４．［３．］のウェルに１ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣ １０μＬを入れた。
５．インキュベート前にＥｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
６．３０分間、３７℃でインキュベートした。
７．Ｅｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
８．インキュベート３０分後の蛍光光度からインキュベート０分の蛍光光度を引き、ＤＭＳＯを１００％として各阻害剤のＶａｎｉｎ－１阻害活性を％として示した。
下記１～８の手順でＶａｎｉｎ－１阻害活性を測定した。
１．ブラック９６穴ウェルに７９μＬのアッセイバッファーを入れた。
２．アッセイバッファーが入ったウェルにヒト血清を１０μＬを入れた。
３．［２．］のウェルに各Ｖａｎｉｎ－１阻害剤（１０－７Ｍ～１０－２Ｍ ｉｎ ＤＭＳＯ） １μＬ又はＤＭＳＯ １μＬを入れた。
４．［３．］のウェルに１ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣ １０μＬを入れた。
５．インキュベート前にＥｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
６．３０分間、３７℃でインキュベートした。
７．Ｅｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
８．インキュベート３０分後の蛍光光度からインキュベート０分の蛍光光度を引き、ＤＭＳＯを１００％として各阻害剤のＶａｎｉｎ－１阻害活性を％として示した。
【0069】
（結果）
上記の手順で測定したＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を図１～４に示す。図１では実施例１～２及び比較例１、８～９のＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図１に示すように、実施例１、２のパントテインケトン誘導体は比較例１のパントテインケトン誘導体よりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えており、Ｖａｎｉｎ－１阻害活性が非常に高いことが分かった。具体的には、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．０３５μＭ、実施例２のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．１２μＭであり、比較例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．７８μＭであることが分かった。従って、実施例１のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１の約２０倍であり、実施例２のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１の約６倍であることが分かった。これにより、従来のＶａｎｉｎ－１阻害剤であるＲＲ６のベンゼン環上にフッ素基又はトリフルオロメトキシ基を導入することでＶａｎｉｎ－１阻害活性が大幅に向上することが分かった。一方、比較例８、９のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１よりも低いことが分かった。従って、パントテインケトン誘導体におけるベンゼン環の存在は、良好なＶａｎｉｎ－１阻害活性のために必要であることが分かった。
上記の手順で測定したＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を図１～４に示す。図１では実施例１～２及び比較例１、８～９のＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図１に示すように、実施例１、２のパントテインケトン誘導体は比較例１のパントテインケトン誘導体よりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えており、Ｖａｎｉｎ－１阻害活性が非常に高いことが分かった。具体的には、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．０３５μＭ、実施例２のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．１２μＭであり、比較例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性はＩＣ５０＝０．７８μＭであることが分かった。従って、実施例１のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１の約２０倍であり、実施例２のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１の約６倍であることが分かった。これにより、従来のＶａｎｉｎ－１阻害剤であるＲＲ６のベンゼン環上にフッ素基又はトリフルオロメトキシ基を導入することでＶａｎｉｎ－１阻害活性が大幅に向上することが分かった。一方、比較例８、９のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１よりも低いことが分かった。従って、パントテインケトン誘導体におけるベンゼン環の存在は、良好なＶａｎｉｎ－１阻害活性のために必要であることが分かった。
【0070】
図２では実施例１～５及び比較例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図２に示すように、実施例１～５のＶａｎｉｎ－１阻害剤のいずれもが比較例１のＶａｎｉｎ－１阻害活性よりも高いことが分かった。従って、本実施例に係るパントテインケトン誘導体のベンゼン環上のトリフルオロメトキシ基又はフッ素基の位置はパラ位に限定されることなく、オルト位やメタ位にあっても良好なＶａｎｉｎ－１阻害活性を示すことが分かった。
【0071】
図３では比較例１～５のＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図３に示すように、比較例１～５のＶａｎｉｎ－１阻害活性は、いずれも大きな差は見られないことが分かった。従って、パントテインケトン誘導体のベンゼン環上における少なくとも１つのフッ素基又はフッ素原子を含む置換基の存在は、良好なＶａｎｉｎ－１阻害活性のために必要であることが分かった。
【0072】
図４では比較例１、６～７のＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図４に示すように、比較例６、７のＶａｎｉｎ－１阻害活性については比較例１よりも低いことが分かった。従って、パントテインケトン誘導体の芳香環部分はベンゼン環が好適であることが分かった。
【0073】
上記の結果から、実施例１～５のパントテインケトン誘導体は比較例１～９のパントテインケトン誘導体よりもｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力な阻害活性を有するＶａｎｉｎ－１阻害剤であることが分かった。
【0074】
［ｉｎ ｖｉｖｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性測定］
実施例１及び比較例１で得られたパントテインケトン誘導体をＶａｎｉｎ－１阻害剤として使用し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性を以下のように測定した。
実施例１及び比較例１で得られたパントテインケトン誘導体をＶａｎｉｎ－１阻害剤として使用し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＶａｎｉｎ－１阻害活性を以下のように測定した。
【0075】
（材料）
アッセイバッファー及び基質は、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性測定と同様のものを用いた。また、ハムスターは日本ＳＬＣより６週齢雄性シリアンハムスターを購入して使用した。
アッセイバッファー及び基質は、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性測定と同様のものを用いた。また、ハムスターは日本ＳＬＣより６週齢雄性シリアンハムスターを購入して使用した。
【0076】
（ハムスターを用いる血清及び腎臓組織中の阻害活性測定）
実施例１のパントテインケトン誘導体１０ｍｇ／ｋｇと比較例１のパントテインケトン誘導体１０ｍｇ／ｋｇを、別のハムスターの背部にそれぞれ皮下注射して投与した後、１時間および４時間の時点において麻酔下で採血および腎臓摘出を行った。正常ハムスターの血液および腎臓をＮｏｒｍａｌとした。血液は一晩４℃で冷蔵後、４℃で２０分間３０００回転し、その上清液を血清として用いた。腎臓は組織重量の１０倍量のアッセイバッファーにてホモジネートし、４℃で３０分間８０００回転し、その上清液を腎臓組織抽出液として用いた。腎臓組織の蛋白定量は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
実施例１のパントテインケトン誘導体１０ｍｇ／ｋｇと比較例１のパントテインケトン誘導体１０ｍｇ／ｋｇを、別のハムスターの背部にそれぞれ皮下注射して投与した後、１時間および４時間の時点において麻酔下で採血および腎臓摘出を行った。正常ハムスターの血液および腎臓をＮｏｒｍａｌとした。血液は一晩４℃で冷蔵後、４℃で２０分間３０００回転し、その上清液を血清として用いた。腎臓は組織重量の１０倍量のアッセイバッファーにてホモジネートし、４℃で３０分間８０００回転し、その上清液を腎臓組織抽出液として用いた。腎臓組織の蛋白定量は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
【0077】
下記１～７の手順でＶａｎｉｎ－１阻害活性を測定した。
１．ブラック９６穴ウェルに８０μＬのアッセイバッファーを入れた。
２．アッセイバッファーが入ったウェルに血清または腎臓組織抽出液を１０μＬを入れた。
３．［２．］のウェルに１ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣ １０μＬを入れた。
４．インキュベート前にＥｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
５．３０分間、３７℃でインキュベートした。
６．Ｅｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
７．インキュベート３０分後の蛍光値からインキュベート０分の蛍光光度を引き、４０μＭ ＡＭＣの蛍光値をスタンダードとして１分間あたりに産生されるＡＭＣ量を指標としてＵを算出した。なお、腎臓組織抽出液中のＶａｎｉｎ－１活性は、さらに蛋白濃度で補正して算出した。
１．ブラック９６穴ウェルに８０μＬのアッセイバッファーを入れた。
２．アッセイバッファーが入ったウェルに血清または腎臓組織抽出液を１０μＬを入れた。
３．［２．］のウェルに１ｍＭ Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ－ＡＭＣ １０μＬを入れた。
４．インキュベート前にＥｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
５．３０分間、３７℃でインキュベートした。
６．Ｅｘ＝３９０ｎｍ、Ｅｘ＝４６５ｎｍで測定した。
７．インキュベート３０分後の蛍光値からインキュベート０分の蛍光光度を引き、４０μＭ ＡＭＣの蛍光値をスタンダードとして１分間あたりに産生されるＡＭＣ量を指標としてＵを算出した。なお、腎臓組織抽出液中のＶａｎｉｎ－１活性は、さらに蛋白濃度で補正して算出した。
【0078】
（結果）
上記の手順で測定した、実施例１及び比較例１のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を図５に示し、図５ａは血清中におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図５ａに示すように、実施例１及び比較例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の投与後１時間の血清においては、いずれもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。特に、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害剤は比較例１よりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。また、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤の投与後４時間の血清では、比較例１の場合にはＮｏｒｍａｌの活性値まで戻っていたが、実施例１の場合にはＮｏｒｍａｌよりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。従って、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害剤はハムスターへの投与４時間後においても血清におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性が維持されることが分かった。
上記の手順で測定した、実施例１及び比較例１のパントテインケトン誘導体のＶａｎｉｎ－１阻害活性の結果を図５に示し、図５ａは血清中におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図５ａに示すように、実施例１及び比較例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の投与後１時間の血清においては、いずれもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。特に、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害剤は比較例１よりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。また、Ｖａｎｉｎ－１阻害剤の投与後４時間の血清では、比較例１の場合にはＮｏｒｍａｌの活性値まで戻っていたが、実施例１の場合にはＮｏｒｍａｌよりもＶａｎｉｎ－１活性を低く抑えることが分かった。従って、実施例１のＶａｎｉｎ－１阻害剤はハムスターへの投与４時間後においても血清におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性が維持されることが分かった。
【0079】
図５ｂは腎臓組織抽出液におけるＶａｎｉｎ－１阻害活性を示す。図５ｂに示すように、比較例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の投与後１時間及び４時間の腎臓組織においては、Ｖａｎｉｎ－１活性はＮｏｒｍａｌと同様の値を示し、Ｖａｎｉｎ－１を阻害できていないことが分かった。一方、実施例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤では、該阻害剤の投与後１時間の腎臓組織においてＶａｎｉｎ－１を阻害できていることが分かった。実施例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤の投与後４時間の腎臓組織ではＮｏｒｍａｌ値に戻ってしまうことも分かったが、実施例１に係るＶａｎｉｎ－１阻害剤のＶａｎｉｎ－１阻害活性は比較例１よりも遥かに高いことが分かった。
【0080】
上記の結果から、実施例１のパントテイン誘導体は比較例１のパントテインケトン誘導体よりもｉｎ ｖｉｖｏでの強力な阻害活性を有するＶａｎｉｎ－１阻害剤であることが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
