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特許7506443ナノ複合体、並びにその製造方法と使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-18

(45)【発行日】2024-06-26

(54)【発明の名称】ナノ複合体、並びにその製造方法と使用

(51)【国際特許分類】

A61K 9/127 20060101AFI20240619BHJP

A61K 38/00 20060101ALI20240619BHJP

A61K 47/36 20060101ALI20240619BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20240619BHJP

A61K 47/24 20060101ALI20240619BHJP

A61K 47/42 20170101ALI20240619BHJP

A61K 47/28 20060101ALI20240619BHJP

A61K 38/38 20060101ALI20240619BHJP

A61K 31/409 20060101ALI20240619BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240619BHJP

A61K 38/18 20060101ALI20240619BHJP

A61K 38/43 20060101ALI20240619BHJP

【ＦＩ】

A61K9/127

A61K38/00

A61K47/36

A61K45/00

A61K47/24

A61K47/42

A61K47/28

A61K38/38

A61K31/409

A61K39/395 M

A61K38/18

A61K38/43

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2023542742

(86)(22)【出願日】2022-01-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-21

(86)【国際出願番号】 CN2022071526

(87)【国際公開番号】W WO2022152145

(87)【国際公開日】2022-07-21

【審査請求日】2023-09-06

(31)【優先権主張番号】202110040371.2

(32)【優先日】2021-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】522179390

【氏名又は名称】上海交通大学医学院

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カオ、シアオリン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン、チアリン

(72)【発明者】

【氏名】チアン、カン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、チンシアン

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ホンチョアン

【審査官】大島彰公

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３２４５９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１０－１７３９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５１６５３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２５６２２４（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノ複合体であって、
前記ナノ複合体は０～６０％のタンパク質薬物、０．０３～１５％のヒアルロン酸、及び０．１～２０％のプロタミン、３５～９５％の脂質成分と２．５～４０％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」を含み、前記脂質成分は電気的に中性の脂質とアニオン性脂質を含み、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計投与量は０．０３～１５％であり、百分率は、前記ナノ複合体に対する各成分の質量百分率であることを特徴とする、ナノ複合体。

【請求項2】

前記ナノ複合体はカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含まなく、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は１０～２５５ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の等電点は４～１１であり、
及び／又は、前記電気的に中性の脂質は、両親媒性脂質、非イオン性脂質、コレステロールおよびそれらの誘導体の中の１つまたは複数を含み、
及び／又は、前記アニオン性脂質はアニオン性リン脂質であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＣ－Ｉ、ＡｐｏＣ－ＩＩ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＢおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＪおよびその模倣ペプチドの中の１つ又は複数であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は１～４３％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は０．０３～５％であり；
及び／又は、前記プロタミンの使用量は０．２～１６％であり；
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は２．８５％～２５％であり、
及び／又は、前記脂質成分の使用量は、３５～９０％であり、
及び／又は、前記アニオン性脂質の使用量は、１４～４０％であり、
或いは、前記電気的に中性の脂質の使用量は２２～６０％であり、
或いは、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は０．２～１４％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は１０～１０００ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－７０～－１５ｍＶであることを特徴とする、請求項１に記載のナノ複合体。

【請求項3】

前記タンパク質薬物の分子量は、１０～１６ｋＤａ、１５～４０ｋＤａ、３０～５０ｋＤａ、６０～８０ｋＤａ、１４０～１８０ｋＤａ、２００～２５５ｋＤａ、又は２１０～２５５ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の等電点は４～５．３、３．７～５．７、４．４～６．４、６～８．５、７～９、８．３～１０．３、又は９．３～１１であり、
及び／又は、前記電気的に中性の脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンの中の１つまたは複数を含み、
及び／又は、前記アニオン性脂質はアニオン性リン脂質であり、前記アニオン性リン脂
質は、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、カルジオリピン、リゾリン脂質、およびガングリオシドの中の１つ又は複数を含み、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＡ－Ｉ模倣ペプチドであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、１．５％、１．７８％、２．２％、３％、４％、４．８％、５％、６％、８％、８．５％、９％、１０％、１１％、１２．０６％、１５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．７３％、１９％、２０％、２２％、２８．０８％、２８．６８％、２９．３１％、３０％、３１．５％、３２％、３０．９％、３３％、３３．０７％、３４％、３４．５％、又は４１％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．２％、０．２４％、０．２５％、０．３％、０．３３％、０．３５％、０．４１％、０．４３％、０．４４％、０．４５％、０．４７％、０．５％、０．６％、０．７８％、０．８％、０．９％、１．５３％、２．１％、０．２％、２．１％、２．５％、又は３％であり
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、０．１％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．８％、０．８３％、１％、１．３％、１．５％、１．６％、１．７％、２％、２．３４％、２．３９％、２．４４％、３％、３．２６％、３．３％、３．５％、３．７％、４％、４．３％、４．５％、４．８５％、５％、５．１％、５．５％、５．５３％、６％、６．５％、７％、１３％、又は１４％であり
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、２．９２％、３％、３．５％、３．８２％、３．９４％、４％、４．１％、４．１２％、４．４３％、４．５％、４．６５％、４．６８％、４．７８％、４．８３％、４．８９％、５％、５．４％、５．８％、６％、６．３５％、６．５２％、７．２１％、１０．３５％、１６．５％、１６．３７％、１９．２９％、又は２０％であり、
及び／又は、前記アニオン性脂質の使用量は、１６％、１７．６４％、２２％、２４％、２４．０４％、２４．７８％、２４．８％、２５％、２５．６６％、２６％、２６．１％、２７％、２７．２２％、２７．５％、２９．７９％、２９％、３０％、３０．５％、３０．６６％、３１％、３１．０８％、３１．１１％、３２％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．０６％、３３．１２％、３３．６％、３４％、３４．４４％、３５％、３５．０７％、３６％、３７．２２％、３７．７２％、３７．８％、３８％、又は３９％であり、
及び／又は、前記電気的に中性の脂質の使用量は、２３．５％、２４．３６％、３０％、３０．９４％、３２％、３３％、３４．２％、３４．２２％、３５％，３６．０９％、３７％、３７．４４％、３７．５％、３８．２５％、３９．０８％、３９．９１％、４１％、４１．２１％、４２％、４２．３４％、４２．９２％、４３．５％、４４％、４５％、４５．６１％、４６％、４６．４％、４７％、４７．５６％、４８．４３％、５０％、５２．１７％、５２．２％、５３％、５４％、５４．５％、５５．３２％、５６％、又は５７％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は、０．３％、０．５％、０．６４％、０．８％、０．８５％、０．９７％、１％、１．０８％、１．１５％、１．２％、１．５％、１．６３％、１．７１％、１．７９％、２％、２．１５％、２．３５％、２．５８％、２．６３％、２．６８％、３．２％、３．５％、４％、４．１７％、５％、５．０８％、５．５％、５．６％、５．９６％、６．３８％、６．５％、７％、８％、又は８．６％、１３．０６％、又は１３．５％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は１０～１０００ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－６５、－６４．８７±３．３０、－６３．７±２．６６、－５８．８７±４．９０、－５７．３３±２．３１、－５６．３３±３．２６、－５５．２０±１０．７４、－５２．０７±２．１５、－５０．１０±３．１８、－４８．８７±１．９５、－４５．２０±２．１５、－４４．８７±０．４５ｍＶ、－４３．９３±１４．０３、－４３．８７±９．６８、－４３．２０±２．７５ｍＶ、
－４０．２３±６．９２、－３８．２７±１３．１０、－３６．８３±２．７１、－３１．５７±４．６７、－３０、－２５，－２０、－２１．０３±２．４７、又は－１９．４３±１．９６ｍＶである、請求項２に記載のナノ複合体。

【請求項4】

前記タンパク質薬物の分子量は、１０～１４ｋＤａ、２０～３３ｋＤａ、３５～４５ｋＤａ、６０～８０ｋＤａ、１５０～１７０ｋＤａ、２２０～２５０ｋＤａ、又は２２０～２５０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の等電点は、４～４．８、４．２～５．５、４．９～５．９、６．５～８、７．５～８．５、８．８～９．８、又は９．８～１０．８であり、
及び／又は、前記ホスファチジルコリンは、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジパルミトイルホスファチジルコリンＤＰＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリンＤＳＰＣ、ジオレオイルホスファチジルコリンＤＯＰＣ、ジラウロイルホスファチジルコリンＤＬＰＣ、ジエルコイルホスファチジルコリンＤＥＰＣ、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリンＰＯＰＣ、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加大豆リン脂質ＨＳＰＣおよびそれらの誘導体の中の一つ又は複数であり、
及び／又は、前記ホスファチジルエタノールアミンは、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンＤＭＰＥ、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンＤＳＰＥ、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンＤＰＰＥ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール２０００、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール５０００、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール２０００、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコールジオール５０００、およびそれらの誘導体の中の一つ又は複数であり、
及び／又は、前記ホスファチジルグリセロールは、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ、ジステアロイルホスファチジルグリセロールＤＳＰＧ、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールＤＰＰＧ、ジオレオイルホスファチジルグリセロールＤＯＰＧ、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセリンナトリウムＰＯＰＧ－Ｎａ、卵黄ホスファチジルグリセロールＥＰＧおよびそれらの誘導体の中の一つ又は複数であり、
及び／又は、前記ホスファチジン酸は、ジミリストイルホスファチジン酸ＤＭＰＡ、ジステアロイルホスファチジン酸ＤＳＰＡ、ジパルミトイルホスファチジン酸ＤＰＰＡ、ジオレオイルホスファチジン酸ＤＯＰＡ及びそれらの誘導体の中の１つ又は複数であり、
及び／又は、前記ホスファチジルセリンは、ジオレオイルホスファチジルセリンＤＯＰＳおよび／またはジパルミトイルホスファチジルセリンＤＰＰＳであり、
及び／又は、前記リゾリン脂質は、ステアロイルリゾホスファチジルコリンＳ－ｌｙｓｏＰＣ、ミリストイルリゾホスファチジルコリンＭ－ＬｙｓｏＰＣ、パルミトイルリゾホスファチジルコリンＰ－ＬｙｓｏＰＣ、およびそれらの誘導体の中の１つまたは複数であり、
及び／又は、前記ガングリオシドは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は１２～９５ｎｍである、請求項３に記載のナノ複合体。

【請求項5】

前記タンパク質薬物の分子量は、１２．４ｋＤａ、２６ｋＤａ、４０ｋＤａ、６９．３ｋＤａ、１６０ｋＤａ、又は２４０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の等電点は、４．３、４．７、５．４、７．２、８、９．３、又は１０．３であり、
及び／又は、前記ホスファチジルコリンは、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、卵黄レシチン、および水素添加大豆リン脂質ＨＳＰＣの中の一つ又は複数であり、
及び／又は、前記ホスファチジン酸は、ジオレオイルホスファチジン酸ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、２０．３０±５．８９ｎｍ、２３．７９±７．９１ｎｍ、２５ｎｍ、２６．５２±４．３１ｎｍ、２７．３１±１０．８４ｎｍ、２７．３８±７．８３ｎｍ、２７．５５±６．９９ｎｍ、３７．９８±１４．２９ｎｍ、２８．９６±８．７４ｎｍ、３１．１１±３．４４ｎｍ、３６．３０±６．４１ｎｍ、３７．２２±７．２８ｎｍ、３７．５５±１３．７３ｎｍ、３７．６３±４．２０ｎｍ、３７．６８±２．２０ｎｍ、３８ｎｍ、３９．１２±４．８４ｎｍ、４０．５５±７．６６ｎｍ、５５ｎｍ、５５．７５±７．６９ｎｍ、５７ｎｍ、６０ｎｍ、６３．６２±１．９７ｎｍ、７０ｎｍ、７４．２０±１４．２３ｎｍ、又は７５．２９±１４．５３ｎｍである、請求項４に記載のナノ複合体。

【請求項6】

前記電気的に中性の脂質がジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣと卵黄レシチンとの混合物である場合、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣと卵黄レシチンとの質量比は２０：（８～１２）であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質がホスファチジン酸とガングリオシドとの混合物である場合、ガングリオシドとホスファチジン酸の質量比は３０．０７：（３～７）であ
る、請求項３に記載のナノ複合体。

【請求項7】

前記タンパク質薬物の等電点が４～５．７であり、分子量が６０～８０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は０～３０％のタンパク質薬物、０．１５～２．１％のヒアルロン酸、１～６．５％のプロタミン、４．６５～７％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３０～５３．５％の電気的に中性のリン脂質と、２３．５～３８．５％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は１～９％である、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項8】

前記タンパク質薬物の等電点は４．２～５．５であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、６０～８０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、ウシ血清アルブミンであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、０％、９％、１６％、２２％、２８．０８％、２８．６８％、２９．３１％、又は３０％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．１５％、０．２４％、０．３３％、０．３５％、０．４７％、又は２．１％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、１％、２％、２．３４％、２．３９％、２．４４％、３．２６％、３．７％、又は６．５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、４．６５％、４．６８％、４．７８％、４．８３％、４．８９％、５．４％、６．３５％、又は６．５２％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性の脂質は、ＤＭＰＣ及び／又は卵黄レシチン、或いは、ＤＭＰＣ及び／又は水素添加大豆リン脂質であり；
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、３０．９４％、３７％、３７．４４％、３８．２５％、３９．０８％、４３．５％、又は４８．４３％、又は５２．１７％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ガングリオシドおよび／またはホスファチジン酸であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、２４．０４％、２５．６６％、２６％、２７．２２％、３１．５％、３３．０６％、３５．０７％、又は３７．７２％であり、
前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、１．１５％、２．３５％、２．５８％、２．６３％、２．６８％、４．１７％、又は８．６％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、２０～９５ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－７０～－２０ｍＶである、請求項７に記載のナノ複合体。

【請求項9】

前記ホスファチジン酸は、ジオレオイルホスファチジン酸ＤＯＰＡであり、前記ガングリオシドは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１であり、
前記アニオン性リン脂質がモノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１とＤＯＰＡとの混合物である場合、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１とＤＯＰＡの質量比は、３０．０７：（３～７）である、請求項８に記載のナノ複合体。

【請求項10】

前記タンパク質薬物の等電点が４～５．３であり、分子量が２００～２５５ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は４～１７％のタンパク質薬物、０．０５～０．２５％のヒアルロン酸、１～３．３％のプロタミン、４～１６．５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、４２～５３％の電気的に中性のリン脂質と、３１～３８％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は、１～３．５％である、請求項１～９のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項11】

前記タンパク質薬物の等電点は、４～４．８であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、２２０～２５０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物はフィコエリトリンであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、４．８％、８％、８．５％、１１％、又は１６％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．０８％、０．１３％、０．１５％、又は０．２％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、１％、１．５％、又は３％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、４．１２％、５．８％、１０．３５％、又は１６．３７％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、４２．９２％、４３．５％、４６．４％、４７．５６％、又は５２．２％であり
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、３１．０８％、３１．５％、３３．６％、３４．４４％、又は３７．８％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、１．０８％、１．１５％、１．２％、１．６３％、又は３．２％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、１２～６０ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－６５～－３０ｍＶである、請求項１０に記載のナノ複合体。

【請求項12】

前記タンパク質薬物の等電点が９．３～１１であり、分子量が８～１６ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は３１．５～３４．５％のタンパク質薬物、０．２５～０．４５％のヒアルロン酸、０．１～０．３５％のプロタミン、３～５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３５～３７．５％の電気的に中性のリン脂質と、２５～２７．５％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は０．５～０．８５％である、請求項１～１１のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項13】

前記タンパク質薬物の等電点は、９．８～１０．８であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、１０～１４ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、シトクロムＣであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、３２～３４％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．３～０．５％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、０．１～０．３％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、３．５～４．５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、３５～３７％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、２５～２７％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、０．５～０．８％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、２５～３８ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－２５～－１５である、請求項１２に記載のナノ複合体。

【請求項14】

前記タンパク質薬物の等電点が７～９であり、分子量は１４０～１８０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は５～４３％のタンパク質薬物、０．０４～０．９％のヒアルロン酸、１～１４％のプロタミン、２．５～２０％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、２３．５～４６％の電気的に中性のリン脂質と、１６～３２％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸とプロタミンの合計使用量は１～１３．５％である、請求項１～１３のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項15】

前記タンパク質薬物の等電点は、７．５～８．５であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、１５０～１７０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、ＩｇＧ抗体であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、６％、２０％、３３％、又は４１％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．０６％、０．０９％、０．１５％、０．４１％、又は０．７８％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、１．３％、１．７％、２％、４．３％、又は１３％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、２．８５％、２．９２％、３．９４％、７．２１％、１９．２９％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥ、又はＡｐｏＡ－Ｉの模倣ペプチドであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、２４．３６％、３４．２２％、４１．２１％、４２．３４％、又は４５％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、１７．６４％、２４．７８％、２９．７９％、３０％、又は３０．６６％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、１．７１％、１．７９％、２．１５％、５．０８％、又は１３．０６％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、１５～９５ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－７０～－２０ｍＶである、請求項１
４に記載のナノ複合体。

【請求項16】

前記タンパク質薬物の等電点が８．３～１０．３であり、分子量が１５～４０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１～３％のタンパク質薬物、０．２～０．６％のヒアルロン酸、４．５～６．５％のプロタミン、２．５～５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、５４～５７％の電気的に中性のリン脂質と、３２～３５％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は５～７％である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項17】

前記タンパク質薬物の等電点は、８．８～９．８であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、２０～３３ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、神経成長因子β－ＮＧＦであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、１．５～２．２％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．３～０．５％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、５～６％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、３～４．５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、５４．５～５６％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、３２．５～３４％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、５．５～６．５％である、請求項１６に記載のナノ複合体。

【請求項18】

前記タンパク質薬物の等電点が６～８．５であり、分子量が３０～５０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１５～２０％のタンパク質薬物、０．０５～０．８％のヒアルロン酸、０．８～１．６％のプロタミン、３～６％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、４４～４７％の電気的に中性のリン脂質と、２９～３３０％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．３～２％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のナノ複合体。

【請求項19】

前記タンパク質薬物の等電点は、６．５～８であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、３５～４５ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、活性型酵素タンパク質薬物ＨＲＰであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、１６．５～１９％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．１～０．３％であり、
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、０．８～１．５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、４～５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、４５～４６％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、３０．５～３２％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は、０．５～１．５％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、２０～５７ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－５５～－１５である、請求項１８に記載のナノ複合体。

【請求項20】

前記タンパク質薬物の等電点が４．４～６．４であり、分子量が２１０～２５５ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１０～３３％のタンパク質薬物、０．２～３％のヒアルロン酸、３．５～７％のプロタミン、３～６％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３２～４２％の電気的に中性のリン脂質と、２２～３９％のアニオン性リン脂質とを含み、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は４～８％である、請求項１に記載のナノ複合体。

【請求項21】

前記タンパク質薬物の等電点は、４．９～５．９であり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の分子量は、２２０～２５０ｋＤａであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物は、カタラーゼＣＡＴであり、
及び／又は、前記タンパク質薬物の使用量は、１１～３２％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸の使用量は、０．３～２．５％であり
及び／又は、前記プロタミンの使用量は、４～５．５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は、４～５％であり、
及び／又は、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、
及び／又は、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は、３３～４１％であり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質は、ＤＯＰＡであり、
及び／又は、前記アニオン性リン脂質の使用量は、２４～３８％であり、
及び／又は、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの使用量は、５～７％であり、
及び／又は、前記ナノ複合体の粒径は、５５～７０ｎｍであり、
及び／又は、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は、－２５～－１５ｍＶである、請求項２０に記載のナノ複合体。

【請求項22】

下記の方法１または方法２により製造されることを特徴とする、請求項１～２１のいずれか１項に記載のナノ複合体の製造方法であって、
方法一：
Ｓ１．前記タンパク質薬物、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンとを混合してナノゲルを形成させ、
Ｓ２．前記脂質成分を従来の方法でリポソームに製造し、
Ｓ３．前記ナノゲルと前記リポソームとを共培養して、ナノゲル含有リポソームを形成させ、
Ｓ４．前記ナノゲル含有リポソームと「前記アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の混合物を、自己集合によりナノ複合体を形成させ、
方法二：
Ｓ１．前記タンパク質薬物、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンとを混合してナノゲルを形成させ、
Ｓ２．前記脂質成分を従来の方法でリポソームに製造し、
Ｓ３．前記ナノゲルと前記リポソームを、マイクロ流体チップを通じてナノゲル含有リポソームに調製し、限外濾過により溶媒を除去した後、タンパク質薬物封入リポソームを製造し、
Ｓ４．前記タンパク質薬物封入リポソームと「前記アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の混合物を、自己集合によりナノ複合体を形成される。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は出願日が２０２１年１月１３日である中国特許出願２０２１１００４０３７１２の優先権を主張する。本出願は前記中国特許出願の全文を引用する。

【0002】

本発明は、バイオテクノロジー及び化学医薬分野に関し、具体的には、タンパク質薬物送達に使用されるナノ複合体、及びその製造方法、並びにタンパク質薬物送達担体としての使用に関する。

【背景技術】

【0003】

細胞機能の実行者として、タンパク質は細胞代謝、遺伝子調節、シグナル伝達、及び免疫応答などの病態生理学的プロセスにおいて非常に重要な役割を果たしている。タンパク質薬物療法は、正常なタンパク質薬物を患者の特定の組織又は細胞に導入して、機能不全または機能を失われたタンパク質を修復し、それにより治療目的を達成することを目的とする。タンパク質薬物は、従来の低分子医薬品と比較して、高い生物学的活性、強い特異性、明確な生物学的機能という利点があり、タンパク質薬物は、遺伝子治療と比較して、より迅速かつ安全であり、特定の部位で生物学的特性を直接に発揮することができ、遺伝子配列の変化は伴わない。近年、タンパク質薬物は医療分野で最も注目されているホットスポットとなり、数年間世界の売れ筋医薬品トップ１０を占めている。しかし、効果的なタンパク質薬物送達方法が存在しないため、市販されているタンパク質薬物は主に抗体などの細胞外で機能する分子に限定されており、タンパク質薬物の大規模な開発と使用は大きく制限されている。

【0004】

現在、タンパク質の送達方法には主に２つ種類がある。１つ目の方法は、例えば、膜透過ペプチド、標的分子などを結合して標的細胞によるタンパク質薬物の取り込みを促進するなどの、標的タンパク質とエンドサイトーシスを促進する分子を直接共有結合または融合させる方法である。当該方法は効率よくタンパク質を細胞内に送達することができるが、細胞内に入ったタンパク質はエンドソームから逃れる能力を欠いていることが多く、タンパク質が機能を果たす前にエンドソームによって分解されてしまい、同時に、当該方法は複雑な合成と精製を必要とし、タンパク質の構造と機能がその過程で破壊される可能性がある。２つ目の方法は、担体材料を使用して分子間特異的認識またはカチオン性キャリア材料を介してタンパク質を送達する方法である。タンパク質送達担体材料は、担体材料とタンパク質の結合の仕方の違いにより、大きく２つに分類され、第１類の担体材料は通常、分子間に存在する特定の認識（例えば、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）とアビジン（ａｖｉｄｉｎ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ－ｔａｇ）と金属イオン、転写因子とプロモーターの間の認識）または化学反応（例えば、アミノとアジド、テトラジン（Ｔｚ）とシクロアルキン（ＴＣＯ）との反応）を通じてタンパク質に結合する。これらの担体材料はタンパク質との結合力が強いが、その調製過程には複雑なタンパク質の修飾プロセスと担体材料の合成・修飾プロセスが必要であり、同時に、タンパク質の特異的な分子標識及びそれと担体材料との共有結合は、いずれもタンパク質の構造と機能を破壊する可能性がある。従って、現在の研究のほとんどは、静電、疎水性相互作用を通じて標的タンパク質に直接結合する、第２類の担体材料、即ちカチオン性担体材料に焦点を当てている。タンパク質分子は複雑な三次元構造を有しているため、その表面電荷と親水性基と疎水性基は均一に分布していなく、ほとんどのタンパク質は、表面に部分的に疎水性で負に帯電した領域を持っているため、カチオン性担体を直接に使用して、静電相互作用または疎水性相互作用を介して結合および送達できる。例えば、Ｃｈｅｎｇの研究グループは、カチオン材料ライブラリを直接に構築し、異なるフッ素含有低分子化合物をポリエチレンイミンにグラフトしてフッ素含有ポリマー材料ライブラリを取得し、ライブラリー内の高分子材料のタンパク質送達性能をさらにスクリーニングして、２種類の高性能のフッ素含有高分子材料を取得することに成功した。これらのフッ素含有高分子は、ウシ血清アルブミン、β－ガラクトシダーゼ、サポリンなどを含むさまざまなタンパク質分子をさまざまな細胞に効率的に送達でき、且つ、これらのタンパク質又は小さなペプチドの生物学的活性を維持することができるが、カチオン材料のｉｎｖｉｖｏ毒性を考慮すると、そのような担体はほとんどｉｎｖｉｔｒｏタンパク質トランスフェクションに限定される。正に帯電したタンパク質の場合、研究者はタンパク質を超負に帯電させて全体を負に帯電させ、静電相互作用によってカチオン性担体材料と電荷を運ぶことができる。例えば、Ｒｏｔｅｌｌｏの研究グループは、正に帯電したＣａｓ９タンパク質が十分な負に帯電した領域を持つように、さまざまな長さの小さなポリグルタミン酸ペプチドをＣａｓ９タンパク質のＮ末端に挿入し、当該タンパク質をｓｇＲＮＡと共培養して負に帯電した複合体を形成させ、前記複合体は、静電作用を通じてアルギニン修飾金ナノ粒子と共培養して、自己集合してナノ複合体を形成し、実験により、当該複合体はコレステロール依存性の膜融合を介してＨｅＬａ細胞に効率的に取り込まれ、ＡＡＶＳ１とＰＴＥＮの２つの遺伝子の効率的な編集が達成されることが判明された。しかし、超負電荷変換の適用は、異なる荷電特性を持つタンパク質の送達を達成できるが、これもタンパク質の比較的複雑な生物学的または化学的合成プロセスを必要とし、タンパク質の構造と機能が変換プロセス中に破壊される可能性がある。効率的なタンパク質薬物の装填および生体内送達を達成するための便利で普遍的な方法が依然として不足していることが分かる。

【0005】

組換えリポタンパク質は、天然のナノ構造であるリポタンパク質を模倣したナノ粒子であり、広く使用されているナノ薬物担体として開発されており、その：［１］生体適合性が良く、体内で完全に代謝され、免疫原性がないこと；［２］体内循環時間が長いこと；［３］マルチモーダルな薬物充填；［４］生体内での標的特性と言ったメリットを持っている。組換えリポタンパク質ナノキャリアは、一部の疎水性薬物、両親媒性薬物、および少量のポリペプチド、核酸薬物などの親水性薬物の効果的な送達に適用することに成功した。例えば、当研究グループは、α－ヘリックスペプチド融合技術の確立により、β－アミロイドが凝集するアルツハイマー病の中心病変への神経保護ペプチドの標的脳内送達を実現し（ＡＣＳＮａｎｏ，２０１５）；疎水性共沈殿技術の開発を提案して、リン酸カルシウムコアを組換えリポタンパク質コアに導入して、効率的な核酸薬物のローディングと神経膠腫の標的送達を実現した（ＮａｔＣｏｍｍｕｎ，２０１７＆２０２０；ＡｄｖＳｃｉ，２０２０）。しかし、タンパク質薬物の活性はその複雑な高次構造に大きく依存するため、既存の疎水性共沈「ハードコア」薬物ローディング法では外部環境からタンパク質の物理的障壁を実現することしかできず、沈殿条件下での内部コアタンパク質の構造破壊と活性の損失は回避できない。従って、タンパク質薬物を効率的に標的に送達するためには、タンパク質薬物に適したローディング方法の開発が急務となっている。

【0006】

これまでの研究で、ＬｅａｆＨｕａｎｇ教授のカチオン性リポソーム－ポリカチオン－ヒアルロン酸と呼ばれるナノ複合体を発明し、ＰＥＧ化リン脂質分子の末端に標的基を結合させることで腫瘍に対する特異性認識を実現して、腫瘍細胞への遺伝子医薬品の標的送達を実現した。ヒアルロン酸、プロタミンの複合体は核酸薬物送達に使用され、シェルによりカチオン性脂質、ＰＥＧ化リン脂質を含むリポソームをコーティングすることができ、ｉｎｖｉｖｏでの送達に使用できる。しかし、上記のシステムはタンパク質の薬物送達に直接使用することはできず、非特異的な細胞毒性やアレルギー反応の誘発などのリスクがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術における適切なタンパク質薬物の担持輸送方法の欠如を克服して、効率的な細胞内および生体内標的送達を達成するための、ナノ複合体並びにその製造方法と使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、下記の技術的解決策によって上記の技術的課題を解決する。

【0009】

本発明の第１の目的は、０～６０％のタンパク質薬物、０．０３～１５％のヒアルロン酸、及び０．１～２０％のプロタミン、３５～９５％の脂質成分と２．５～４０％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」を含むナノ複合体を提供することである。

【0010】

前記脂質成分は電気的に中性な脂質とアニオン性脂質を含み、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．０３～１５％である。

【0011】

前記百分率は、前記ナノ複合体に対する各成分それぞれの質量百分率である。

【0012】

本発明において、タンパク質薬物の含有量が０％である場合、前記ナノ複合体はタンパク質薬物を担持していない空の担体である。タンパク質薬物の含有量が０ではない場合、前記ナノ複合体はタンパク質薬物を担持したナノ複合体である。

【0013】

本発明において、前記ナノ複合体はカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含まないことが好ましい。

【0014】

本発明において、前記タンパク質薬物は、当該技術分野における従来のタンパク質薬物であってもよい。

【0015】

本発明において、前記タンパク質薬物の分子量は１０～２５５ｋＤａであってもよく、例えば、１０～１６ｋＤａ、１５～４０ｋＤａ、３０～５０ｋＤａ、６０～８０ｋＤａ、１４０～１８０ｋＤａ、２００～２５５ｋＤａ、又は２１０～２５５ｋＤａであり、好ましくは、１０～１４ｋＤａ、２０～３３ｋＤａ、３５～４５ｋＤａ、６０～８０ｋＤａ、１５０～１７０ｋＤａ、２２０～２５０ｋＤａ、２２０～２５０ｋＤａであり、また例えば、１２．４ｋＤａ、２６ｋＤａ、４０ｋＤａ、６９．３ｋＤａ、１６０ｋＤａ、又は２４０ｋＤａである。

【0016】

本発明において、前記タンパク質薬物の等電点は４～１１であってもよく、例えば、４～５．３、３．７～５．７、４．４～６．４、６～８．５、７～９、８．３～１０．３、又は９．３～１１であり、好ましくは、４～４．８、４．２～５．５、４．９～５．９、６．５～８、７．５～８．５、８．８～９．８、又は９．８～１０．８であり、また例えば、４．３、４．７、５．４、７．２、８、９．３、又は１０．３である。

【0017】

本発明において、前記タンパク質薬物の等電点は、更に、４～６、６～８、又は８～１０．５であってもよい。

【0018】

本発明の好ましい実施形態では、下記タンパク質薬物を使用することができる。

【0019】

【表1】

【0020】

本発明において、前記電気的に中性の脂質とは、一般に溶液の中で正イオンと負イオンのバランスが取れており、溶液全体が外側に帯電する性質を示さない脂質を指し、好ましくは、両親媒性脂質、非イオン性脂質、コレステロールおよびそれらの誘導体の中の１つまたは複数を含む。より好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンの中の１つまたは複数を含む。

【0021】

ここで、前記ホスファチジルコリンは、好ましくは、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジエルコイルホスファチジルコリンＤＥＰＣ、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリンＰＯＰＣ、卵黄レシチン、大豆リン脂質、水素添加大豆リン脂質ＨＳＰＣおよびそれらの誘導体の中の一つ又は複数であり、より好ましくは、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、卵黄レシチンおよび水素添加大豆リン脂質ＨＳＰＣの中の一つ又は複数であり、例えば、ＤＭＰＣと卵黄レシチン、またはＤＭＰＣと水素添加大豆リン脂質である。

【0022】

前記ホスファチジルエタノールアミンは、好ましくは、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール２０００、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール５０００、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコール２０００、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン―ポリエチレングリコールジオール５０００およびそれらの誘導体の中の一つ又は複数である。

【0023】

前記ホスファチジルグリセロールは、好ましくは、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルグリセリンナトリウム（ＰＯＰＧ－Ｎａ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）およびそれらの誘導体の中の一つ又は複数である。

【0024】

好ましくは、前記電気的に中性の脂質がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）と卵黄レシチンとの混合物である場合、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）と卵黄レシチンとの質量比は２０：（８～１２）であってもよく、例えば２０：１０．９４である。

【0025】

本発明において、前記アニオン性脂質とは一般的に、溶液中の負電荷が正電荷よりも大きく、溶液全体が外側に負電荷性を示す脂質を総称し、好ましくは、アニオン性リン脂質である。ここで、前記アニオン性リン脂質は、好ましくは、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、カルジオリピン、リゾリン脂質およびガングリオシドの中の１つ又は複数を含み、より好ましくは、ホスファチジン酸および／またはガングリオシドである。

【0026】

ここで、前記ホスファチジン酸は、好ましくは、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）及びそれらの誘導体の中の１つ又は複数であり、より好ましくは、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）又はジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）である。

【0027】

前記ホスファチジルセリンは、好ましくは、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）および／またはジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）である。

【0028】

前記リゾリン脂質は、好ましくは、ステアロイルリゾホスファチジルコリンＳ－ｌｙｓｏＰＣ、ミリストイルリゾホスファチジルコリンＭ－ＬｙｓｏＰＣ、パルミトイルリゾホスファチジルコリンＰ－ＬｙｓｏＰＣ、およびそれらの誘導体の中の１つまたは複数である。

【0029】

前記ガングリオシドは、好ましくは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である。

【0030】

好ましくは、前記アニオン性リン脂質がホスファチジン酸とガングリオシドとの混合物である場合、ガングリオシドとホスファチジン酸の質量比は３０．０７：（３～７）であってもよく、例えば、３０．０７：５である。

【0031】

本発明において、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」は、ＡｐｏＥおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＣ－Ｉ、ＡｐｏＣ－ＩＩ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＢおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＪおよびその模倣ペプチドの中の１つ又は複数であってもよく、例えば、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＡ－Ｉ模倣ペプチドである。

【0032】

本発明において、前記タンパク質薬物の使用量は１～４３％あってもよく、例えば、１．５％、１．７８％、２．２％、３％、４％、４．８％、５％、６％、８％、８．５％、９％、１０％、１１％、１２．０６％、１５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．７３％、１９％、２０％、２２％、２８．０８％、２８．６８％、２９．３１％、３０％、３１．５％、３２％、３０．９％、３３％、３３．０７％、３４％、３４．５％、又は４１％である。

【0033】

本発明において、前記ヒアルロン酸の使用量は０．０３～５％あってもよく、例えば、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．２％、０．２４％、０．２５％、０．３％、０．３３％、０．３５％、０．４１％、０．４３％、０．４４％、０．４５％、０．４７％、０．５％、０．６％、０．７８％、０．８％、０．９％、１．５３％、２．１％、０．２％、２．１％、２．５％、又は３％である。

【0034】

本発明において、前記プロタミンの使用量は０．２～１６％あってもよく、例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．８％、０．８３％、１％、１．３％、１．５％、１．６％、１．７％、２％、２．３４％、２．３９％、２．４４％、３％、３．２６％、３．３％、３．５％、３．７％、４％、４．３％、４．５％、４．８５％、５％、５．１％、５．５％、５．５３％、６％、６．５％、７％、１３％、又は１４％である。

【0035】

本発明において、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は２．８５％～２５％あってもよく、例えば、２．９２％、３％、３．５％、３．８２％、３．９４％、４％、４．１％、４．１２％、４．４３％、４．５％、４．６５％、４．６８％、４．７８％、４．８３％、４．８９％、５％、５．４％、５．８％、６％、６．３５％、６．５２％、７．２１％、１０．３５％、１６．５％、１６．３７％、１９．２９％、又は２０％である。

【0036】

本発明において、前記脂質成分の使用量は、好ましくは、３５～９０％である。

【0037】

本発明において、前記アニオン性脂質の使用量は１４～４０％あってもよく、例えば、１６、１７．６４％、２２％、２４％、２４．０４％、２４．７８％、２４．８％、２５％、２６％、２５．６６％、２６．１％、２７％、２７．２２％、２７．５％、２９．７９％、２９％、３０％、３０．５％、３０．６６％、３１％、３１．０８％、３１．１１％、３２％、３１．５％、３２％、３２．５％、３３％、３３．０６％、３３．１２％、３３．６％、３４％、３４．４４％、３５％、３５．０７％、３６％、３７．２２％、３７．７２％、３７．８％、３８％、又は３９％である。

【0038】

本発明において、前記電気的に中性の脂質の使用量は２２～６０％あってもよく、例えば、２３．５％、２４．３６％、３０％、３０．９４％、３２％、３３％、３４．２％、３４．２２％、３５％，３６．０９％、３７％、３７．４４％、３７．５％、３８．２５％、３９．０８％、３９．９１％、４１％、４１．２１％、４２％、４２．３４％、４２．９２％、４３．５％、４４％、４５％、４５．６１％、４６％、４６．４％、４７％、４７．５６％、４８．４３％、５０％、５２．１７％、５２．２％、５３％、５４％、５４．５％、５５．３２％、５６％、又は５７％である。

【0039】

本発明において、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．２～１４％あってもよく、例えば、０．３％、０．５％、０．６４％、０．８％、０．８５％、０．９７％、１％、１．０８％、１．１５％、１．２％、１．５％、１．６３％、１．７１％、１．７９％、２％、２．１５％、２．３５％、２．５８％、２．６３％、２．６８％、３．２％、３．５％、４％、４．１７％、５％、５．０８％、５．５％、５．６％、５．９６％、６．３８％、６．５％、７％、８％又は８．６％、１３．０６％、又は１３．５％である。

【0040】

本発明において、前記ナノ複合体の粒径は１０～１０００ｎｍであってもよく、好ましくは、１０～１００ｎｍである。例えば、１２～９５ｎｍであり、また例えば、２０．３０±５．８９ｎｍ、２３．７９±７．９１ｎｍ、２５ｎｍ、２６．５２±４．３１ｎｍ、２７．３１±１０．８４ｎｍ、２７．３８±７．８３ｎｍ、２７．５５±６．９９ｎｍ、３７．９８±１４．２９ｎｍ、２８．９６±８．７４ｎｍ、３１．１１±３．４４ｎｍ、３６．３０±６．４１ｎｍ、３７．２２±７．２８ｎｍ、３７．５５±１３．７３ｎｍ、３７．６３±４．２０ｎｍ、３７．６８±２．２０ｎｍ、３８ｎｍ、３９．１２±４．８４ｎｍ、４０．５５±７．６６ｎｍ、５５ｎｍ、５５．７５±７．６９ｎｍ、５７ｎｍ、６０ｎｍ、６３．６２±１．９７ｎｍ、７０ｎｍ、７４．２０±１４．２３ｎｍ、又は７５．２９±１４．５３ｎｍである。

【0041】

本発明において、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－７０～－１５ｍＶであってもよく、例えば、－６５、－６４．８７±３．３０、－６３．７±２．６６、－５８．８７±４．９０、－５７．３３±２．３１、－５６．３３±３．２６、－５５．２０±１０．７４、－５２．０７±２．１５、－５０．１０±３．１８、－４８．８７±１．９５、－４５．２０±２．１５、－４４．８７±０．４５ｍＶ、－４３．９３±１４．０３、－４３．８７±９．６８、－４３．２０±２．７５ｍＶ、－４０．２３±６．９２、－３８．２７±１３．１０、－３６．８３±２．７１、－３１．５７±４．６７、－３０、－２５，－２０、－２１．０３±２．４７、又は－１９．４３±１．９６ｍＶである。

【0042】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が４～５．７であり、分子量が６０～８０ｋＤａのである場合、前記ナノ複合体は０～３０％のタンパク質薬物、０．１５～２．１％のヒアルロン酸、１～６．５％のプロタミン、４．６５～７％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３０～５３．５％の電気的に中性のリン脂質、および２３．５～３８．５％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１～９％である。

【0043】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は４．２～５．５であってもよく、例えば、４．７である。

【0044】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は６０～８０ｋＤａであってもよく、例えば、６９．３ｋＤａである。

【0045】

ここで、前記タンパク質薬物はウシ血清アルブミンであってもよい。

【0046】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は０％、９％、１６％、２２％、２８．０８％、２８．６８％、２９．３１％、又は３０％であってもよい。

【0047】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．１５％、０．２４％、０．３３％、０．３５％、０．４７％、又は２．１％であってもよい。

【0048】

ここで、前記プロタミンの使用量は１％、２％、２．３４％、２．３９％、２．４４％、３．２６％、３．７％、又は６．５％であってもよい。

【0049】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は４．６５％、４．６８％、４．７８％、４．８３％、４．８９％、５．４％、６．３５％、又は６．５２％であってもよい。

【0050】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」はＡｐｏＥおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＣ－Ｉ、ＡｐｏＣ－ＩＩ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩおよびそれらの模倣ペプチドの中の１つ又は複数であってもよく、例えば、ＡｐｏＥである。

【0051】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質は、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、卵黄レシチンおよび水素添加大豆リン脂質ＨＳＰＣの中の１つまたは複数であってもよく、例えば、ＤＭＰＣおよび卵黄レシチン、またはＤＭＰＣおよび水素添加大豆リン脂質である。

【0052】

電気的に中性のリン脂質がジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣと卵黄レシチンの混合物である場合、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣと卵黄レシチンの質量比は２０：（８～１２）であってもよく、例えば、２０：１０．９４である。

【0053】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は３０．９４％、３７％、３７．４４％、３８．２５％、３９．０８％、４３．５％、４８．４３％、又は５２．１７％であってもよい。

【0054】

ここで、前記アニオン性リン脂質は、ホスファチジン酸および／またはガングリオシドであってもよい。前記ホスファチジン酸は、好ましくは、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）またはジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）である。前記ガングリオシドは、好ましくは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）である。

【0055】

アニオン性リン脂質がモノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１とＤＯＰＡの混合物である場合、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１とＤＯＰＡの質量比は３０．０７：（３～７）であってもよく、例えば、３０．０７：５である。

【0056】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は２４．０４％、２５．６６％、２６％、２７．２２％、３１．５％、３３．０６％、３５．０７％、又は３７．７２％であってもよい。

【0057】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１．１５％、２．３５％、２．５８％、２．６３％、２．６８％、４．１７％、又は８．６％であってもよい。

【0058】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は２０～９５ｎｍであってもよく、例えば、２７．５５±６．９９ｎｍ、３６．３０±６．４１ｎｍ、３７．６３±４．２０ｎｍ、３７．６８±２．２０ｎｍ、３９．１２±４．８４ｎｍ、４０．５５±７．６６ｎｍ、５５．７５±７．６９ｎｍ、又は７５．２９±１４．５３ｎｍである。

【0059】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－７０～－２０ｍＶであってもよく、例えば、－６３．７±２．６６、－６４．８７±３．３０、－５２．０７±２．１５、－４５．２０±２．１５、－４４．８７±０．４５ｍＶ、－４３．２０±２．７５ｍＶ、－４０．２３±６．９２、又は－３８．２７±１３．１０ｍＶである。

【0060】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が４～５．３であり、分子量が２００～２５５ｋＤａのである場合、前記ナノ複合体は４～１７％のタンパク質薬物、０．０５～０．２５％のヒアルロン酸、１～３．３％のプロタミン、４～１６．５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、４２～５３％の電気的に中性のリン脂質、および３１～３８％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１～３．５％である。

【0061】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は４～４．８であってもよく、例えば、４．３である。

【0062】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は２２０～２５０ｋＤａであってもよく、例えば、２４０ｋＤａである。

【0063】

ここで、前記タンパク質薬物はフィコエリトリンであってもよい。

【0064】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は４．８％、８％、８．５％、１１％、又は１６％であってもよい。

【0065】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．０８％、０．１３％、０．１５％、又は０．２％であってもよい。

【0066】

ここで、前記プロタミンの使用量は１％、１．５％、又は３％であってもよい。

【0067】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は４．１２％、５．８％、１０．３５％、又は１６．３７％であってもよい。

【0068】

【0069】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0070】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は４２．９２％、４３．５％、４６．４％、４７．５６％、又は５２．５％であってもよい。

【0071】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0072】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は３１．０８％、３１．５％、３３．６％、３４．３３％、又は３７．８％であってもよい。

【0073】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１．０８％、１．１５％、１．２％、１．６３％、又は３．２％であってもよい。

【0074】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は１２～６０ｎｍであってもよく、例えば、２０．３０±５．８９ｎｍ、２３．７９±７．９１ｎｍ、２７．３１±１０．８４ｎｍ、２８．９６±８．７４ｎｍ、又は３７．５５±１３．７３ｎｍである。

【0075】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－６５～－３０ｍＶであってもよく、例えば、－５８．８７±４．９０Ｍｖ、－５０．１０±３．１８Ｍｖ、－４３．９３±８．７４Ｍｖ、又は－３６．８３±２．７１Ｍｖである。

【0076】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が９．３～１１であり、分子量が８～１６ｋＤａのであ場合、前記ナノ複合体は３１．５～３４．５％のタンパク質薬物、０．２５～０．２４％のヒアルロン酸、０．１～０．３５％のプロタミン、３～５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３５～３７．５％の電気的に中性のリン脂質、および２５～２７．５％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．５～０．８５％である。

【0077】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は９．８～１０．８であってもよく、例えば、１０．３である。

【0078】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は１０～１４ｋＤａであってもよく、例えば、１２．４ｋＤａである。

【0079】

ここで、前記タンパク質薬物はシトクロムCであってもよい。

【0080】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は３２～３４％であってもよく、例えば、３３．７％である。

【0081】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．３～０．５％であってもよく、例えば、０．４４％である。

【0082】

ここで、前記プロタミンの使用量は０．１～０．３％であってもよく、例えば、０．２％である。

【0083】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は３．５～４．５％であってもよく、例えば、４．１％である。

【0084】

【0085】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0086】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は３５～３７％であってもよく、例えば、３６．０９％である。

【0087】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0088】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は２５～２７％であってもよく、例えば、２６．１％である。

【0089】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．５～０．８％であってもよく、例えば、０．６４％である。

【0090】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は２５～３８ｎｍであってもよく、例えば、３１．１１±３．４４ｎｍである。

【0091】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－２５～－１５ｍＶであってもよく、例えば、２１．０３±２．４７ｍＶである。

【0092】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が７～９であり、分子量が１４０～１８０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は５～４３％のタンパク質薬物、０．０４～０．９％のヒアルロン酸、１～１４％のプロタミン、２．５～２０％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、２３．５～４６％の電気的に中性のリン脂質、および１６～３２％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１～１３．５％である。

【0093】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は７．５～８．５であってもよく、例えば、８である。

【0094】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は１５０～１７０ｋＤａであってもよく、例えば、１６０ｋＤａである。

【0095】

ここで、前記タンパク質薬物はIgG抗体であってもよい。

【0096】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は６％、２０％、３３％、又は４１％であってもよい。

【0097】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．０６％、０．０９％、０．１５％、０．４１％、又は０．７８であってもよい。

【0098】

ここで、前記プロタミンの使用量は１．３％、１．７％、２％、４．３％、又は１３％であってもよい。

【0099】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は２．８５％、２．９２％、３．９４％、７．２１％、又は１９．２９％であってもよい。

【0100】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」はＡｐｏＥおよびその模倣ペプチド、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶおよびそれらの模倣ペプチド、ＡｐｏＣ－Ｉ、ＡｐｏＣ－ＩＩ、ＡｐｏＣ－ＩＩＩおよびそれらの模倣ペプチドの中の１つ又は複数であってもよく、例えば、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＡ－Ｉ模倣ペプチドである。

【0101】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0102】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は２４．３６％、３４．２２％、４１．２１％、４２．３４％、又は４５％であってもよい。

【0103】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0104】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は１７．６４％、２４．７８％、２９．７９％、３０％、又は３０．６６％であってもよい。

【0105】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１．７１％、１．７９％、２．１５％、５．０８％、又は１３．０６％であってもよい。

【0106】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は１５～９５ｎｍであってもよく、例えば、２６．５２±４．３１ｎｍ、２７．３８±７．８３ｎｍ、３７．９８±１４．２９ｎｍ、又は７４．２０±１４．２３ｎｍである。

【0107】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－７０～－２０ｍＶであってもよく、例えば、－５７．３３±２．３１ｍＶ、－５５．２０±１０．７４ｍＶ、－４３．８７±９．６８ｍＶ、又は－３１．５７±４．６７ｍＶである。

【0108】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が８．３～１０．３であり、分子量が１５～４０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１～３％のタンパク質薬物、０．２～０．６％のヒアルロン酸、４．５～６．５％のプロタミン、２．５～５％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、５４～５７％の電気的に中性のリン脂質、および３２～３５％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は５～７％である。

【0109】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は８．８～９．８であってもよく、例えば、９．３である。

【0110】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は２０～３３ｋＤａであってもよく、例えば、２６ｋＤａである。

【0111】

ここで、前記タンパク質薬物は神経成長因子β－ＮＧＦであってもよい。

【0112】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は１．５～２．２％であってもよく、例えば、１．７８％である。

【0113】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．３～０．５％であってもよく、例えば、０．４３％である。

【0114】

ここで、前記プロタミンの使用量は５～６％であってもよく、例えば、５．５３％である。

【0115】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は３～４．５％であってもよく、例えば、３．８２％である。

【0116】

【0117】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0118】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は５４．５～５６％であってもよく、例えば、５５．３２％である。

【0119】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0120】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は３２．５～３４％であってもよく、例えば、３３．１２％である。

【0121】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は１５．５～６．５％であってもよく、例えば、５．９６％である。

【0122】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が６～８．５であり、分子量が３０～５０ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１５～２０％のタンパク質薬物、０．０５～０．８％のヒアルロン酸、０．８～１．６％のプロタミン、３～６％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、４４～４７％の電気的に中性のリン脂質、および２９～３３％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．３～２％である。

【0123】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は６．５～８であってもよく、例えば、７．２である。

【0124】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は３５～４５ｋＤａであってもよく、例えば、４０ｋＤａである。

【0125】

ここで、前記タンパク質薬物は活性型酵素タンパク質薬物ＨＲＰであってもよい。

【0126】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は１６．５～１９２％であってもよく、例えば、１７．７３％である。

【0127】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．１～０．３％であってもよく、例えば、０．１４％である。

【0128】

ここで、前記プロタミンの使用量は０．８～１．５％であってもよく、例えば、０．８３％である。

【0129】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は４～５％であってもよく、例えば、４．５８％である。

【0130】

【0131】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0132】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は４５～４６％であってもよく、例えば、４５．６１％である。

【0133】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0134】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は３０．５～３２％であってもよく、例えば、３３．１１％である。

【0135】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は０．５～１．５％であってもよく、例えば、０．９７％である。

【0136】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は２０～５７ｎｍであってもよく、例えば、３７．２２±７．２８ｎｍである。

【0137】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－５５～－１５ｍＶであってもよく、例えば、－４８．８７±１．９５Ｍｖである。

【0138】

一つの好ましい実施形態として、前記タンパク質薬物の等電点が４．４～６．４であり、分子量が２１０～２５５ｋＤａである場合、前記ナノ複合体は１０～３３％のタンパク質薬物、０．２～３％のヒアルロン酸、３．５～７％のプロタミン、３～６％の「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」、３２～４２％の電気的に中性のリン脂質、および２２～３９％のアニオン性リン脂質を含み、ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は４～８％である。

【0139】

ここで、前記タンパク質薬物の等電点は４．９～５．９であってもよく、例えば、５．４である。

【0140】

ここで、前記タンパク質薬物の分子量は２２０～２５０ｋＤａであってもよい。

【0141】

ここで、前記タンパク質薬物はカタラーゼ（ＣＡＴ）であってもよい。

【0142】

ここで、前記タンパク質薬物の使用量は１１～３２％であってもよく、例えば、１２．０６％、又は３０．９％である。

【0143】

ここで、前記ヒアルロン酸の使用量は０．３～２．５％であってもよく、例えば、０．５％、又は１．５３％である。

【0144】

ここで、前記プロタミンの使用量は４～５．５％であってもよく、例えば、４．８５％、又は５．１％である。

【0145】

ここで、前記「アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の使用量は４～５％であってもよく、例えば、４．４３％、又は４．５％である。

【0146】

【0147】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質はホスファチジルコリンであってもよい。前記ホスファチジルコリンは好ましくは、ＤＭＰＣである。

【0148】

ここで、前記電気的に中性のリン脂質の使用量は３３～４１％であってもよく、例えば、３４．２％、又は３９．９１％である。

【0149】

ここで、前記アニオン性リン脂質はＤＯＰＡであってもよい。

【0150】

ここで、前記アニオン性リン脂質の使用量は２４～３８％であってもよく、例えば、２４．８％、又は３７．２２％である。

【0151】

ここで、前記ヒアルロン酸と前記プロタミンの合計使用量は５～７％であってもよく、例えば、５．６％、又は６．３８％である。

【0152】

ここで、前記ナノ複合体の粒径は５５～７０ｎｍであってもよく、例えば、６３．６２±１．９７ｎｍである。

【0153】

ここで、前記ナノ複合体のＺｅｔａ電位は－２５～－１５ｍＶであってもよく、例えば、－１９．４３±１．９６Ｍｖである。

【0154】

本発明の第２の目的は、下記の方法１または方法２により製造される前記ナノ複合体の製造方法を提供することである。
方法１：
Ｓ１．前記タンパク質薬物、前記ヒアルロン酸及び前記プロタミンを混合してナノゲルを形成させる；
Ｓ２．前記脂質成分を従来の方法でリポソームに調製する；
Ｓ３．前記ナノゲルと前記リポソームとを共培養して、ナノゲル含有リポソームを形成させる；
Ｓ４．前記ナノゲル含有リポソームと「前記アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の混合物を、自己集合によりナノ複合体を形成させる；
方法２：
Ｓ１．前記タンパク質薬物、前記ヒアルロン酸及び前記プロタミンを混合してナノゲルを形成させる；
Ｓ２．前記脂質成分を従来の方法でリポソームに調製する；
Ｓ３．前記ナノゲルと前記リポソームを、マイクロ流体チップを通じてナノゲル含有リポソームに調製し、限外濾過により溶媒を除去した後、タンパク質薬物封入リポソームを調製する；
Ｓ４．前記タンパク質薬物封入リポソームと「前記アポリポタンパク質および／またはその模倣ペプチド」の混合物を、自己集合によりナノ複合体を形成させる。

【0155】

方法１又は方法２のＳ１において、前記混合の作業および方法は、当技術分野における従来のものであってもよい。

【0156】

方法１又は方法２のＳ２において、前記従来の方法は、薄膜水和法（バンガム法）、注入法、再構成法、溶融法、または凍結乾燥法などの当技術分野の通常のリポソーム調製方法であり得る。

【0157】

一つの好ましい実施形態として、方法１のＳ２において、前記リポソームは次のステップで調製できる。前記脂質成分を有機溶媒に溶解させ、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させて溶媒を除去し、脂質成分が装置の壁に薄い膜を形成した後、適量の緩衝液を加えて振とうして十分に水和分散させ、リポソームを得る。リポソームの粒径は、ソニケータープローブを用いた超音波処理によってさらに小さくすることができる。

【0158】

一つの好ましい実施形態として、方法２のＳ２において、前記リポソームは次のステップで調製できる。前記脂質成分をエタノールに溶解させてリポソームを形成させる。

【0159】

方法１のＳ３中において、前記培養の作業および方法は、当技術分野において従来のものであり得る。

【0160】

方法１又は方法２のＳ４において、前記自己集合の作業および方法は、当技術分野における従来のものであり得、例えば、混合物を振盪シェーカー上で１２０ｒｐｍおよび３７℃で３６時間培養することができる。

【0161】

方法２のＳ３において、前記ナノゲルと前記リポソームを用いてマイクロ流体チップを介してナノゲル含有リポソームを製造する方法は、当技術分野における従来の方法であってもよい。

【0162】

本発明の第３の目的は、前記タンパク質薬物の送達における前記ナノ複合体の使用を提供することである。

【0163】

一つの好ましい実施形態として、前記ナノ複合体は、タンパク質薬物の細胞内送達に使用できる。

【0164】

一つの好ましい実施形態として、前記ナノ複合体は、タンパク質薬物の体内送達に使用できる。

【0165】

一つの好ましい実施形態として、前記ナノ複合体は、タンパク質薬物の脳内送達に使用できる。

【0166】

本発明において、特に説明しない限り、「％」は質量百分率を意味する。

【0167】

上記の各好ましい条件は、当分野の常識に違反しない限り、任意に組み合わせることができ、即ち、本発明の各好ましい例を得ることができる。

【0168】

本発明で使用する試薬および原料はいずれも市販されている。

【発明の効果】

【0169】

本発明の積極的な進歩効果：
本発明のナノ複合体は、特定の使用量のタンパク質薬物、ヒアルロン酸、プロタミンおよび組換えリポタンパク質を含み、それは、適切な比率のヒアルロン酸、プロタミンによりタンパク質薬物に適した微小環境を構成し、組換えリポタンパク質により、タンパク質薬物の効率的な細胞内、生体内、さらには脳内への送達を実現する。

【0170】

本発明のナノ複合体は、異なる物理化学的特性（例えば、分子量が１０－２５５ＫＤａ及びＰＩ４－１１である）を有するタンパク質薬物に共用できる担体を提供して、効率的な細胞内、生体内、乃至脳内への送達を実現し、利用された技術は普遍性を有し、タンパク質薬物（分子量、PIが実施例を超えるタンパク質薬物）のin vivoおよびin vitro輸送が不十分であるという現在の問題を効果的に解決することができる。

【図面の簡単な説明】

【0171】

【図1】異なる配合のフィコエリトリンに対するＨｅｌａ細胞の取り込みの蛍光分布図である。

【図2】異なる配合のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧに対するＨＴ２２細胞の取り込みの蛍光分布図である。

【図3】異なる配合のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ担持ナノ複合体に対するＣ６細胞の取り込みの蛍光分布図である。

【図4】神経成長因子（ＮＧＦ）担持ナノ複合体がＰＣ１２細胞の分化を促進することを示している。図４Ａは、さまざまな製剤がＰＣ１２細胞分化を促進するシナプスの長さの統計である；図４Ｂは、さまざまな製剤がＰＣ１２細胞分化を促進する神経突起分岐点の統計である；図４Ｃは、さまざまな製剤がＰＣ１２細胞分化を促進する形態図である。

【図5】異なる配合のカタラーゼに対するＢＶ２細胞の取り込みの蛍光分布図である。

【図6】ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬが細胞内のカタラーゼレベルを効果的に増加させ（図６Ａ）、Ｈ_２Ｏ_２によって引き起こされる細胞内のＲＯＳレベルの増加を効果的に減少させることを示す（図６Ｂ）。

【図7】ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬが、Ｈ_２Ｏ_２によって誘発される細胞膜損傷を効果的に阻害し（図７Ａ）、細胞生存率を効果的に改善できることを示す（図７Ｂ）。

【図8】Ｃ５７マウスの皮質損傷モデルにおいて、蛍光色素ＤｉＲ標識のヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴを担持した組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）およびヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴを担持したリポソーム（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を尾静脈を介して投与し、投与４時間後、マウスの臓器を採取して生体内イメージングを実行して、分析した製剤の生体内分布および脳への侵入である。

【図9】ＣＸ３ＣＲ１－ＧＦＰマウスの皮質損傷モデルを構築し、蛍光色素ＤｉＩ標識の異なる製剤を尾静脈を介して投与し、投与４時間後のマウスの脳を採取して凍結切片し、脳ミクログリアによるＣＡＴを担持したナノ複合体のｉｎｖｉｖｏでの取り込みの状況を評価した。

【図10】Ｃ５７マウスの皮質損傷モデルを構築し、Ｓｈａｍ群は偽損傷対照群であり、モデル化後、薬物を１週間連続投与し、モリス水迷路実験を使用して調査した、ＣＣＩモデルマウスの潜伏時間、プラットフォームを横切る時間、および標的象限内の時間に対するＣＡＴを担持したさまざまな製剤の影響である。

【図11】ＳＯＤマウスモデルを適用して連続投与し、同時にロータロッドテスト、グラブバーテスト、および後肢握力実験などのマウスの運動能力で評価した、ＳＯＤトランスジェニックマウスの運動能力に対するＣＡＴを担持したさまざまな製剤の効果である。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0172】

下記の実施例で使用される機器：
ロータリーエバポレーター（ＲＥ－５２ＣＳ－１、ＳｈａｎｇｈａｉＹａｒｏｎｇＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＦａｃｔｏｒｙ、中国）
超音波装置（ＪＹ９２－ＩＩ、ＮｉｎｇｂｏＸｉｎｚｈｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．Ｌｔｄ．、中国）
透過型電子顕微鏡（Ｈ－７６５０、日立、日本）
クライオ電子顕微鏡（ＦＥＩＴｅｃｎａｉＦ２０、Ｈｏｌｌａｎｄ）
レーザー粒度計（ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ９０ＺＥＮ３５９０、Ｍａｌｖｅｒｎ、イギリス）
マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、アメリカ）
レーザー共焦点顕微鏡（ＴＣＳＳＰ８、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）。

【0173】

実施例１ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体の調製、特性評価および細胞内タンパク質送達
（１）調製：
［１］ウシ血清アルブミン、ヒアルロン酸及びプロタミンを異なる質量比に従って共培養してアポタンパク質複合体（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させた。
［２］薄膜水和法によるリポソームの調製：脂質（中性リン脂質ＤＭＰＣおよび／またはレシチンｌｅｃｉｔｈｉｎ、カチオン性リン脂質ＤＯＴＡＰ、およびアニオン性リン脂質ＤＯＰＡおよび／またはアニオン性スフィンゴ脂質モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドＧＭ１および／またはＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）を秤量し、５００ｍＬの丸底フラスコに入れ、エチルエーテル２ｍＬを加え、蒸発乾燥させてリン脂質の水分を除去し、更にクロロホルム溶液２ｍＬを加え、ロータリーエバポレーターで１時間減圧させた。０．０１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加え、薄膜水和し剥離させてリポソームが得られるまで、４０℃の水浴中で１０分間断続的に振盪した。超音波プローブを用いた超音波で、リポソームの粒径をさらに小さくしてリポソームを得た。
［３］リポソームとＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭとをさまざまな比率で共培養して、タンパク質薬物担持リポソーム（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）（表１－２）を形成させ、アポリポタンパク質（ＡｐｏＥ）を前記リポソーム溶液に加え、穏やかに混合し、１２０ｒｐｍで、振とうシェーカーに置き、３７℃で３６時間培養して、ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得、ここで、アニオン性脂質ＤＯＰＡを、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、またはＤＳＰＡで置き換えて、ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体を得、それぞれＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－１、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－２、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－３であった。

【0174】

（２）特性評価
ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質薬物へのウシ血清アルブミン担持ナノ複合体のカプセル化効率および薬物担持量を検出した。

【0175】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体の細胞内タンパク質送達を、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ヒト子宮頸がん細胞Ｈｅｌａ細胞を共焦点皿に５０，０００／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬの緑色蛍光標識タンパク質を担持した各タンパク質薬物を加えた。

【0176】

実験群：ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）の組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）。

【0177】

対照群はそれぞれ：［１］遊離のＦＩＴＣ－ＢＳＡタンパク質、［２］ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ複合体（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）、即ち、工程（１）ステップ［１］の調製方法で調製されたタンパク質担持複合体、［３］ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＢＳＡ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ｒＨＤＬ）、その調製方法は、ヒアルロン酸、プロタミンを添加しないことを除いてステップ（１）と同じ、［４］ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ担持リポソーム（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）、その調製方法は、アポリポタンパク質を添加しないこと以外は工程（１）ステップ［１］［２］と同じ、［５］ＦＩＴＣ－ＢＳＡ＋市販タンパク質トランスフェクション試薬（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－Ｐｕｌｓｉｎ）、［６］様々なアニオンを有するウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ－ＢＳＡ）を含む組換えリポタンパク質ナノ複合体、その調製方法は、ＤＯＰＡをそれぞれＤＭＰＡ、またはＤＰＰＡ、またはＤＳＰＡに置き換えたこと以外にＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬと同じであり、それぞれウシ血清アルブミン担持ナノ複合体ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－１、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－２、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ－３が得られた。実験群と対照群（ＦＩＴＣ－ＢＳＡタンパク質の量に応じて計算し、２０μｇ／ｍＬの濃度で投与）をそれぞれ３７℃で４時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＦＩＴＣ－ＢＳＡの取り込みの半定量分析を実行した。

【0178】

結果は、適切な比率のＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの粒径はいずれも１００ｎｍ以下であり、製剤が生体内でバイオフィルムバリアを通過するのに有益であることを示し、一方、タンパク質と、ＨＡ、ＰＲＴＭの複合体ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭは粒径が比較的に大きく（１９８．０±３．１０ｎｍ）、時間が経つと（４℃で一晩放置）さらに凝集し、比較的深刻な沈殿が発生し、粒径を検出したところ、検出装置が検出要件を満たしていないことを示し、効果的に検出できなかった。ＦＩＴＣ－ＢＳＡ、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ｒＨＤＬ、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯと比較して、最適化されたＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤は、ＢＳＡをより効率的に細胞に送達し（細胞取り込みの平均光学密度がより高い）、細胞質により均一に分布した（表１に示される通りである）。対照的に、市販のタンパク質トランスフェクション製剤群は、より強い細胞関連蛍光強度を示したが、蛍光シグナルのほとんどは細胞の外側に分布していた。同時に、異なるアニオン性脂質ＤＭＰＡまたはＤＰＰＡまたはＤＳＰＡによって形成されるタンパク質ナノ複合体は、いずれもタンパク質を細胞の細胞質に効率的に送達することができた。予想外なことに、ＦＩＴＣ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ配合では、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ含有配合（製剤１）は、アニオン性脂質含有配合よりもタンパク質の細胞取り込みが低かった（表２）。

【0179】

【表2】

【0180】

【表3】

【0181】

表２から、製剤３～６において、製剤６の細胞取り込みの平均光学濃度値が最も大きいことが分かり、これはその細胞取り込み効率が最も高く、効果が最も優れていることを意味する。

【0182】

実施例２フィコエリトリン封入ナノ複合体の調製、特性評価および細胞内タンパク質送達
（１）調製：
［１］フィコエリトリン（ＰＥ）とヒアルロン酸およびプロタミンとを様々な質量比で共培養してアポタンパク質複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させ。
［２］適量のリン脂質（両性リン脂質ＤＭＰＣ及びアニオン性リン脂質ＤＯＰＡ）の組み合わせを秤量し、エタノール相に溶解させてリポソームを得；
［３］適量のＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭを秤量し、前記リポソームと一緒にマイクロ流体チップを介してタンパク質担持リポソーム（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を調製し、限外濾過してエタノール溶液を除去し、エタノールを除去した後のリポソームにリポタンパク質および／またはその模倣ペプチドをロードさせて自己集合して、ヒアルロン酸、プロタミン、および組換えリポタンパク質で構成されるＰＥ担持ナノ複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得た。

【0183】

（２）特性評価
ＰＥ担持ナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質薬物へのＰＥ担持ナノ複合体のカプセル化効率および薬物ロード量を検出した。

【0184】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
ＰＥ担持ナノ複合体の細胞内タンパク質送達状況をレーザー共焦点顕微鏡で観察した。ヒト子宮頸がん細胞Ｈｅｌａ細胞、又は神経膠腫細胞Ｃ６を共焦点皿に５００００／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬのＰＥ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を加えた。対照群はそれぞれ遊離ＰＥ；ヒアルロン酸、プロタミンおよびＰＥ複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＰＥ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＰＥ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＰＥ複合体担持リポソーム（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）及びＰＥ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＰＥ－Ｐｕｌｓｉｎ）であり（ＰＥの質量で計算し、１０μｇ／ｍＬの濃度で投与）、３７℃で４時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＦＩＴＣ－ＰＥの取り込みの半定量分析を実行した。

【0185】

結果は、適切な比率のＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの粒径は１００ｎｍ以下であり（表３～４）、一方、ヒアルロン酸、プロタミン、ＰＥから構成されるタンパク質担持複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）は粒径が大きく（７８８．１±６０．９８ｎｍ）、時間が経つと（４℃で一晩放置）さらに凝集し、より深刻な沈殿が発生し、粒径を検出したところ、検出装置は粒子が検出要件を満たしていないことを示し、効果的に検出できなった。ＰＥ、ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ、ＰＥ－ｒＨＤＬ、ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯと比較して、最適化されたＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤は、ＰＥをより効率的に細胞に送達し、かつ、細胞質により均一に分布していた（表３、図１に示される通りである）。同じように、市販のタンパク質トランスフェクション製剤群は、より強い細胞関連蛍光強度を示したが、蛍光シグナルのほとんどは細胞の外側に分布していた（図１）。同様に、ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤では、カチオン性脂質含有製剤は、アニオン性脂質含有製剤よりもタンパク質の細胞取り込みが低かった。

【0186】

【表4】

【0187】

図１は、さまざまな配合のフィコエリトリンに対するＨｅｌａ細胞の取り込みを示している。フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒアルロン酸、プロタミン、ＰＥ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）、ヒアルロン酸、プロタミン、ＰＥ複合体（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）、ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＰＥ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＰＥ－ｒＨＤＬ）、ヒアルロン酸、プロタミン、ＰＥ担持リポソーム（ＰＥ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）及びＰＥ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＰＥ－Ｐｕｌｓｉｎ）。

【0188】

【表5】

【0189】

表４から、製剤３～７の中で、製剤７の細胞取り込みの平均光学濃度値が最も大きいことが分かり、これはその細胞取り込み効率が最も高く、効果が最も優れていることを意味する。

【0190】

実施例３シトクロムＣ封入ナノ複合体の調製、特性評価および細胞内タンパク質送達
（１）調製：
［１］蛍光標識されたシトクロムＣと、ヒアルロン酸およびプロタミンとを様々な質量比で共培養して、アポタンパク質複合体（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させた。
［２］薄膜水和法によるリポソームの調製：脂質（中性リン脂質ＤＭＰＣおよびアニオン性リン脂質ＤＯＰＡの組み合わせ）を秤量し、５００ｍＬの丸底フラスコに置き、エチルエーテル２ｍＬを加え、蒸発乾燥させてリン脂質の水分を除去し、更にクロロホルム溶液を加え、ロータリーエバポレーターで１時間減圧させた。０．０１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加え、薄膜水和して剥離させてリポソームが得られるまで、４０℃の水浴中で１０分間断続的に振盪した。超音波プローブを用いた超音波で、リポソームの粒径をさらに小さくしてリポソームを得た。
［３］上記で調製されたリポソームをさまざまな比率で共培養して、タンパク質薬物担持リポソーム（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を形成させ、ＡｐｏＥをナノ複合体溶液に加え、穏やかに混合し、１２０ｒｐｍで、振とうシェーカーに置き、３７℃で３６時間培養して、シトクロムＣ担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得た。

【0191】

（２）特性評価
シトクロムＣ担持ナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質薬物へのシトクロムＣ担持ナノ複合体のカプセル化効率および薬物ロード量を検出した。

【0192】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
シトクロムＣ担持ナノ複合体の細胞内タンパク質送達を、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。神経膠腫細胞株Ｕ８７細胞を共焦点皿に５０，０００個／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬの緑色蛍光タンパク質で標識したシトクロムＣ（ＦＩＴＣ－ＣＣ）担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を加え、対照群はそれぞれ遊離ＦＩＴＣ－ＣＣタンパク質；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＣリポソーム（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＣＣリポタンパク質担持組換えナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＣのリポソーム（ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）とＦＩＴＣ－ＣＣ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＦＩＴＣ－ＣＣ－Ｐｕｌｓｉｎ）（ＦＩＴＣ－ＣＣタンパク質の量に応じて計算し、２０μｇ／ｍＬの濃度で投与）をそれぞれ３７℃で６時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＦＩＴＣ－ＢＳＡの取り込みの半定量分析を実行した。

【0193】

結果は、適切な比率のＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの粒径は１００ｎｍ以下であることを示している。ＦＩＴＣ－ＣＣ、ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ、ＦＩＴＣ－ＣＣ－ｒＨＤＬ、ＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ及び市販のタンパク質トランスフェクション試薬と比較して、最適化されたＦＩＴＣ－ＣＣ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤は、ＣＣをより効率的に細胞に送達し、細胞質により均一に分布したことが分かる（表５）。

【0194】

【表6】

【0195】

実施例４ＩｇＧ抗体封入ナノ複合体の調製、特性評価およびその細胞内タンパク質送達
（１）調製：
［１］蛍光標識抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧをと、ヒアルロン酸およびプロタミンとを、様々な質量比で共培養して、アポタンパク質複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させた。
［２］薄膜水和法によるリポソームの調製：脂質（両性リン脂質ＤＭＰＣ、カチオン性リン脂質ＤＯＴＡＰ、及びアニオン性リン脂質ＤＯＰＡの組み合わせ）を秤量し、５００ｍＬの丸底フラスコに置き、エチルエーテル２ｍＬを加え、蒸発乾燥させてリン脂質の水分を除去し、更にクロロホルム溶液を加え、ロータリーエバポレーターで１時間減圧させた。０．０１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加え、薄膜水和し剥離させてリポソームが得られるまで、４０℃の水浴中で１０分間断続的に振盪した。超音波プローブにより、リポソームの粒径をさらに小さくしてリポソームを得た。
［３］上記で調製したリポソームとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭとを様々な比率で共培養してタンパク質薬物担持リポソーム（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を形成させ、ＡｐｏＥ又はＡｐｏＡＩ模倣ペプチド（Ａｃ－ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ）を前記タンパク質担持リポソーム溶液に加え、穏やかに混合し、１２０ｒｐｍで、振とうシェーカーに置き、３７℃で３６時間培養して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ抗体担持ナノ複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得た。

【0196】

（２）特性評価
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ抗体担持ナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質薬物へのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ抗体担持ナノ複合体のカプセル化効率および薬物ロード量を検出した。

【0197】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ抗体担持ナノ複合体の細胞内タンパク質送達を、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ヒト子宮頸がん細胞Ｈｅｌａ細胞を共焦点皿に５００００／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ）担持組換えリポタンパク質ナノ複合体(Alexa Fluor488-IgG-HA-PRTM-rHDL)を加え、対照群はそれぞれ遊離ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧタンパク質；ヒアルロン酸、プロタミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ担持リポソーム（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－Ｐｕｌｓｉｎ）（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧタンパク質の量に応じて計算し、１０μｇ／ｍＬの濃度で投与）をそれぞれ３７℃で６時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧの取り込みの半定量分析を実行した。

【0198】

結果は、適切な比率のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧの粒径はいずれも１００ｎｍ以下であり；一方、ヒアルロン酸、プロタミン、抗体から構成される複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）は粒径が６３．４８±５．２０ｎｍであり、時間が経つと（４℃で一晩放置）凝集し、比較的に深刻な沈殿が発生し、粒径を検出したところ、検出装置が検出要件を満たしていないことを示し、効果的に検出できなかった。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ｒＨＤＬ及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯと比較して、最適化されたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧをより効率的に細胞に送達し、細胞質により均一に分布したことが分かる（表６、図２に示される通りである）。それと比較して、市販のタンパク質トランスフェクション調製群は、より強い細胞関連蛍光強度を示したが、蛍光シグナルのほとんどは細胞の外側に分布していた。

【0199】

【表7】

【0200】

図２は、ＨＴ２２細胞による様々な配合のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧの取り込み蛍光分布図である。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ；ヒアルロン酸、プロタミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧの組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ複合体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸とプロタミンを含まないＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ組換えリポタンパク質担持ナノ複合材料（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ担持リポソーム（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ－Ｐｕｌｓｉｎ）。

【0201】

【表8】

【0202】

表において、製剤５は対照群であり、製剤１～４はいずれも本発明の実施例である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１は製剤５とは有意な差がある。

【0203】

図３は様々な製剤のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ＩｇＧ担持ナノ複合体のＣ６細胞取り込みの蛍光分布図である。

【0204】

実施例５ β－ＮＧＦ担持ナノ複合体のＰＣ１２細胞の分化促進能力の評価
β－ＮＧＦを神経栄養性タンパク質薬物の研究モデルとして選択し、実施例１と同じ調製方法で、それぞれ実験群であるβ－ＮＧＦ担持ナノ複合体と対照群を調製し、実験群と対照群の製剤は表８に示される通りである。

【0205】

初代マウスニューロンまたはＰＣ１２細胞を選択して９６ウェルプレートに接種し、β－ＮＧＦの投与濃度は１００ｎｇ／ｍＬであり、様々な担体タンパク質薬物と細胞を８時間共培養し、ｉｎｃｕｃｙｔｅリアルタイム動的細胞イメージング技術の使用してβ－ＮＧＦがＰＣ１２細胞のニューロンへの分化を誘発する過程を検出し、ＰＣ１２細胞によって誘発されるニューロン分岐点とシナプス長の動的変化を半定量的に解析した。

【0206】

【表9】

【0207】

実験結果は図４に示される通り、ＮＧＦ担持ナノ複合体は、ＰＣ１２細胞のニューロンへの分化を迅速かつ効率的に促進し、ニューロンの分岐点とシナプスの長さが有意に増加し、形態的にはニューロンに似ていた。

【0208】

図４は神経成長因子（ＮＧＦ）担持ナノ複合体がＰＣ１２細胞の分化を促進することを示している。図４Ａは、様々な製剤がＰＣ１２細胞分化を促進するシナプスの長さの統計である；図４Ｂは、様々な製剤がＰＣ１２細胞分化を促進する神経突起分岐点の統計である；図４Ｃは、様々な製剤がＰＣ１２細胞分化を促進する形態図である。ヒアルロン酸、プロタミン、ＮＧＦの組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＮＧＦ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）とＰＣ１２細胞を８時間共培養し；対照群は遊離のＮＧＦ；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＮＧＦ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＮＧＦ－ｒＨＤＬ）；ブランクリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）及び培地ブランク対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）であった。

【0209】

実施例６ＨＲＰ担持ナノ複合体の細胞内酵素活性の評価
ＨＲＰを活性型酵素タンパク質薬物の研究モデルとして選択し、実施例１と同じ調製方法で、それぞれ実験群であるＨＲＰ担持ナノ複合体と対照群を調製し、実験群と対照群の製剤は表９に示される通りである。

【0210】

Ｈｅｌａ細胞を選択して９６ウェルプレートに接種し、ＨＲＰの投与濃度は１００ｕｇ／ｍＬであり、様々なタンパク質担持薬物と細胞を６時間共培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌのＴＭＢ発色溶液を各ウェルに加え、予想される深さまで色が発色するまで暗所、室温で３～３０分間培養し、６５０ｎｍでの吸光度値を測定し、即ち、細胞内ＨＲＰ酵素活性のレベルを示していた。

【0211】

実験結果は表９に示される通り、遊離ＨＲＰを与えた群の細胞内の西洋わさびペルオキシダーゼのレベルは最も低く、ヒアルロン酸、プロタミン、ＨＲＰ担持リポソームは、ＨＲＰ酵素を部分的に細胞に送達して細胞内酵素活性を向上させることができたが、ヒアルロン酸、プロタミン、ＨＲＰ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＨＲＰ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）は、細胞内の西洋わさびペルオキシダーゼの活性を大幅に増加させた。

【0212】

【表10】

【0213】

実施例７カタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体の調製、特性評価および細胞内タンパク質送達

【0214】

（１）調製
［１］カタラーゼ（ＣＡＴ）と、ヒアルロン酸およびプロタミンとを様々な質量比で共培養してアポタンパク質複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させた。
［２］膜水和法によるリポソームの調製：脂質（中性リン脂質ＤＭＰＣ及びカチオン性リン脂質ＤＯＴＡＰの組み合わせ）を秤量し、５００ｍＬの丸底フラスコに入れ、エチルエーテル２ｍＬを加え、蒸発乾燥させてリン脂質の水分を除去し、更にクロロホルム溶液２ｍＬを加え、ロータリーエバポレーターで１時間減圧させた。０．０１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加え、薄膜水和し剥離させてリポソームが得られるまで、４０℃の水浴中で１０分間断続的に振盪した。超音波プローブを用いた超音波で、リポソームの粒径をさらに小さくしてリポソームを得た。
［３］上記で調製したリポソームとＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭとを様々な比率で共培養してヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ担持リポソーム（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を形成させ；ＡｐｏＥを前記リポソーム溶液に加え、穏やかに混合し、１２０ｒｐｍで、振とうシェーカーに置き、３７℃で３６時間培養して、カタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得た。

【0215】

（２）特性評価
カタラーゼ担持ナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質薬物へのシトクロムＣ担持ナノ複合体のカプセル化効率および薬物ロード量を検出した。

【0216】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
カタラーゼ担持ナノ複合体の細胞内タンパク質送達を、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ミクログリアＢＶ２細胞を共焦点皿に５０，０００個／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬの緑色蛍光タンパク質で標識したカタラーゼ（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ）の組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を加え、対照群はそれぞれ遊離ＦＩＴＣ－ＣＡＴタンパク質；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＣＡＴ組換えリポタンパク質担持複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ担持リポソーム（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）とＦＩＴＣ－ＣＡＴ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－Ｐｕｌｓｉｎ）（ＦＩＴＣ－ＣＡＴタンパク質の量に応じて計算し、２０μｇ／ｍＬの濃度で投与）をそれぞれ３７℃で６時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＦＩＴＣ－ＣＡＴの取り込みの半定量分析を実行した。

【0217】

結果は、適切な比率のＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの粒径は１００ｎｍ以下である、一方、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭは粒径が比較的に大きく（５３０．９０±３１１．００ｎｍ）、時間が経つと（４℃で一晩放置）さらに凝集し、比較的深刻な沈殿が発生し、粒径を検出したところ、検出装置が検出要件を満たしていないことを示し、効果的に検出できなかった。ＦＩＴＣ－ＣＡＴ、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ｒＨＤＬ、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ及び市販のプロテイントランスフェクション製剤群と比較して、最適化されたＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤は、ＣＡＴをより効率的に細胞に送達し、細胞質により均一に分布したことが分かる（表１０、図５）。

【0218】

【表11】

【0219】

図５は、ＢＶ２細胞による様々な製剤のカタラーゼの取り込み蛍光分布図である。緑色蛍光タンパク質標識カタラーゼ（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ）；ヒアルロン酸、プロタミンを含まないＦＩＴＣ－ＣＡＴ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ｒＨＤＬ）；ヒアルロン酸、プロタミン、ＦＩＴＣ－ＣＡＴ担持リポソームＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）及びＦＩＴＣ－ＣＡＴ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬（ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－Ｐｕｌｓｉｎ）。

【0220】

実施例８ＨＴ２２細胞に対するカタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体のトランスフェクション能力、抗酸化能力、および細胞生存率に対する評価
カタラーゼ（ＣＡＴ）をタンパク質薬物の研究モデルとして選択し、調製方法は実施例７と同様にして、カタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体をそれぞれ調製し、製剤は表１１に示される通りである。

【0221】

カタラーゼ検出キットを使用して、ＨＴ２２細胞対するＣＡＴ担持ナノ複合体のトランスフェクション能力を検出し、反応原理は、過酸化水素が比較的十分な場合、カタラーゼが過酸化水素を触媒して水と酸素を生成できることである。残りの過酸化水素はペルオキシダーゼの触媒作用により発色基質を酸化させて、赤色生成物を生成し、最大吸収波長は５２０ｎｍであった。標準過酸化水素を用いて標準曲線を作成し、これによって、単位時間、単位体積あたりの、試料におけるカタラーゼが触媒して水と酸素に変化させた過酸化水素の量を計算することにより、試料におけるカタラーゼの酵素活性を計算することができる。具体的な実験プロトコルは、ＨＴ２２細胞を１２ウェルプレートに播種し、二酸化炭素インキュベーター内で２４時間培養した後、ヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴを含む組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を含むＣＡＴ担持タンパク質の様々な製剤、及びそれぞれ未処理群（コントロール）、遊離ＣＡＴタンパク質群、およびＣＡＴ＋市販のタンパク質トランスフェクション試薬群（ＣＡＴ－Ｐｕｌｓｉｎ）である対照群を投与し（ＣＡＴタンパク質量で計算し、投与濃度は２０μｇ／ｍＬである）、３７℃で６時間培養した。細胞を溶解させ、取扱説明書に従って細胞内におけるカタラーゼのレベルを検出した。

【0222】

結果は図６Ａに示される通りであり、未処理の対照群と遊離ＣＡＴを投与した群は、細胞内カタラーゼレベルが最も低く、市販のタンパク質トランスフェクション試薬Ｐｕｌｓｉｎは、ＣＡＴタンパク質を部分的に細胞に送達して、細胞内の酵素活性を高めることができるが、ヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴを含む組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）は、細胞内カタラーゼの活性を大幅に増加させた。

【0223】

【表12】

【0224】

ＣＡＴタンパク質には抗酸化機能があるため、過酸化水素を用いて細胞内酸化ストレスレベルの上昇を誘導し、ＣＡＴ担持ナノ複合体の細胞内酸化ストレスレベルの制御効果を評価した。具体的な実験プロトコルは、ＨＴ２２細胞を９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスが７０％に達した時点で、様々なＣＡＴタンパク質担持製剤を投与し、投与４時間後に製剤溶液を廃棄し、蛍光プローブＤＣＦＨ－ＤＡを加えて細胞と３０分間共培養し、その後、プローブ溶液を廃棄し、４００μＭの過酸化水素を加えて細胞と１５分間共培養してその酸化損傷を誘導し、マイクロプレートリーダーで定量分析を実行した。結果は図６に示される通りであり、対照群は、完全に未処理群の細胞内活性酸素種のレベルを示し、細胞内ＲＯＳレベルは、過酸化水素単独投与によって誘導された後に急上昇し、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの投与は、過酸化水素によって誘発される細胞ＲＯＳレベルの増加を大幅に減少させた。

【0225】

図６．ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬは細胞内カタラーゼのレベルを効果的に増加させ（図６Ａ）、Ｈ_２Ｏ_２によって引き起こされる細胞内ＲＯＳレベルの増加を効果的に減少させる（図６Ｂ）。

【0226】

乳酸脱水素酵素細胞毒性検出キットは、主に細胞膜の完全性を評価し、細胞の状態を評価する指標の１つでもあり、細胞投与手順は上記と同じであり、投与の４時間後に製剤溶液を廃棄し、過酸化水素を加えて細胞と共培養してその酸化的損傷を誘導し、予定検出時間の１時間前に、細胞培養プレートを細胞培養インキュベーターから取り出し、キット付属のＬＤＨ放出試薬を「試料の最大酵素活性対照ウェル」に元の培養液体積の１０％の量で加えた。ＬＤＨ放出試薬を加えた後、数回ピペッティングしてよく混合し、その後、細胞培養インキュベーター内で培養を続け、事前に設定した時間後、細胞培養プレートをマルチウェルプレート遠心分離機で４００ｇで５分間遠心分離した。各ウェルからそれぞれ上清溶液１２０μｌを採取し、新しい９６ウェルプレートの対応するウェルに加え、直ちに試料の測定を実行した。ＣＣＫ８の操作ステップは基本的に上記と同じであり、まずは、様々なタンパク質製剤を加えて細胞と４時間共培養し、その後製剤溶液を廃棄し、過酸化水素を加えて細胞と培養してその酸化損傷を誘導し、細胞生存率を検出するために、事前に設定した検出時点でＣＣＫ８試薬を加えた。実験結果は図７に示される通りであり、細胞ＲＯＳレベルの増加により、過酸化水素によって誘発される細胞膜損傷が大幅に減少し、細胞生存率のレベルが増加した。

【0227】

図７．ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬは、Ｈ_２Ｏ_２によって誘発される細胞膜損傷を効果的に阻害し（図７Ａ）、細胞生存率を効果的に改善した（図７Ｂ）。

【0228】

実施例９マウスにおけるカタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体のｉｎｖｉｖｏ分布および脳分布の評価
蛍光プローブＤｉＲおよびＤｉＩで標識されたヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴ組換えリポタンパク質担持ナノ複合体（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）（即ち、実施例７の実験群ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）及びヒアルロン酸、プロタミン、ＣＡＴ担持リポソーム（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を調製した。同時に、制御された皮質損傷のマウスモデル（ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＣｏｒｔｉｃａｌＩｎｊｕｒｙ、ＣＣＩ）を構築した。マウスを５％抱水クロラールの腹腔内注射により麻酔した後、脳定位固定装置に固定し、頭皮を無菌条件下で切開して右頭頂骨を露出させ、右冠状縫合糸とヘリンボーン縫合糸の間、正中線の横に丸い頭蓋窓を開けて硬膜を露出させ、様々な程度の皮質損傷モデルをシミュレートするために、様々な打撃パラメータを設定した。衝撃パラメータ：速度：１．５ｍ／ｓ、深度：１ｍｍ、衝撃ヘッド直径：２ｍｍ、接触時間：１００ｍｓで中等度の損傷をシミュレートし、日常的な脳損傷実験に使用した。損傷後、頭蓋骨は閉じ、皮膚を縫合した。偽損傷群のマウスは、頭皮のみを切開して右頭頂骨を露出させ、打撲傷は与えなかった。製剤のｉｎｖｉｖｏ分布実験では、ＤｉＲ標識製剤を尾静脈より投与し（リン脂質ＤＭＰＣ投与濃度で計算して２０ｍｇ／ｋｇである）、投与４時間後に心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び脳組織を採取し、生理食塩水ですすいだ後、小動物用生体内画像装置に設置して画像を収集し、体内におけるナノ複合体の分布と脳への輸送の動的な変化を観察した。実験結果は図８に示される通りであり、生理食塩水を与えた群の脳には蛍光製剤の分布が全くないが、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ脳の蛍光強度は有意で、右脳のＣＣＩ損傷部位に高度に集中していて、これは、本発明で構築されたナノ複合体が標的タンパク質を脳内に効率的に送達し、損傷部位への分布を標的にすることができることを示した。

【0229】

図８．Ｃ５７マウスの皮質損傷モデルにおいて、蛍光色素ＤｉＲ標識のヒアルロン酸、プロタミン、およびＣＡＴ担持組換えリポタンパク質ナノ複合体（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）とヒアルロン酸、プロタミン、およびＣＡＴ担持リポソーム（ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を尾静脈を介して投与、投与４時間後のマウスの臓器を採取してｉｎｖｉｖｏイメージングを実行し、ｉｎｖｉｖｏでの製剤の分布と脳への進入を評価した。

【0230】

実施例１０マウスの脳におけるカタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体（即ち、実施例７の実験群ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）の分布の評価
さらに、本発明は、緑色蛍光タンパク質に形質転換されたミクログリア細胞を有するＣＸ３ＣＲ１－ＧＦＰトランスジェニックマウスを選択してＣＣＩモデルを構築し、同じように、ＤｉＩ標識蛍光製剤をＣＣＩ後に尾静脈に投与し、ＣＣＩマウスの脳内におけるＤｉＩ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤の分布とミクログリア細胞による製剤の取り込みを脳スライス実験により評価し、尾静脈投与の３時間後、マウスを麻酔して心臓灌流のために固定し、腫瘍担持マウスの完全な脳を得、４％のパラホルムアルデヒドで２４時間固定した後、ＰＢＳですすぎ、順次に１５％および３０％のスクロース溶液で乾燥させて沈殿させ、次に続いてＯ．Ｃ．Ｔ．で包埋し、－２０℃で凍結して連続凍結冠状切片を作製し、スライスの厚さは１４μｍで、ＰＢＳですすぎ、１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＰＩで１０分間染色し、ＰＢＳですすぎ、水垢を拭き取り、グリセロールリン酸でスライドをマウントし、レーザー共焦点顕微鏡で脳内のＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬの分布を観察した。実験結果は図９に示される通りであり、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬは、脳内のミクログリアによって効率的に取り込まれることができる。

【0231】

図９．ＣＸ３ＣＲ１－ＧＦＰマウスの皮質損傷モデルを構築し、様々な蛍光色素ＤｉＩ標識製剤を尾静脈より投与し、投与４時間後にマウスの脳を採取して凍結切片し、脳ミクログリアによるＣＡＴ担持ナノ複合体のｉｎｖｉｖｏ取り込みを評価した。

【0232】

実施例１１ＣＣＩマウスの空間学習および記憶能力に対するカタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体（即ち、実施例７の実験群ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）の影響
マウス中等度ＣＣＩ脳損傷モデルを構築し、様々なＣＡＴ担持製剤を尾静脈から投与し（ＣＡＴによって計算された投与量濃度は１３３００単位／ｋｇである）、７日間の連続投与後、マウスをモリス水迷路で行動学トーニングし、テストした。水迷路は、円形プール、プラットフォーム及び記録システムの３つの部分で構成され；プールは直径１５０ｃｍ、高さ５０ｃｍであり、プールは４つの象限（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ象限）に分かれており、深さ３０ｃｍで水を満たし、マウスがプラットフォームとプールの底を直接見ることができないように、白い食品着色料を加えて水を不透明にし；水温は約２５℃に保たれた。マウスがプラットフォームの位置を見つけて記憶することができるように、空間参照オブジェクト（ドア、カメラ、壁の標識など）をプールの周囲に設置し、それらの位置は変化しないようにした。円筒形のプラットフォームは直径９ｃｍ、高さ２９ｃｍで、無反射の黒い布で包まれ、水面下１ｃｍに面が沈むように象限ＩＶに配置した。プールの中央上に一つのカメラを設置して、動物の水泳画像を自動的に収集し、収集した信号をコンピュータに直接入力し、モリス水迷路ビデオ解析システム２．０を使用してマウスの遊泳軌跡を監視および記録した。隠しプラットフォームテスト（Ｈｉｄｄｅｎｐｌａｔｆｏｒｍｔｅｓｔ）はマウスに７日間連続投与した後に開始し、５日間継続し；各トレーニングの入水ポイントは無作為で４つの象限に配置し、毎回異なるマウスを同じ位置に置き、プールの壁に面して水に入れ、入水順序は隣接する２日ごとに変え、マウスが入水してから黒いプラットフォームを見つけて登るまでの経路と所要時間（潜伏期間）をコンピュータで監視・記録した。各マウスは１日４回トレーニングを受け、各トリーニングに設定された潜伏期間は６０秒であり、マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけられない場合は、マウスをプラットフォームに誘導し、そこに１０秒間滞在させ、この時、潜伏期間は６０秒と記録され、各マウスの２つのトレーニング間隔は３０秒である。空間探査実験（Ｐｒｏｂｅｔｒｉａｌ）は５日間の測位航法試験後、６日目にプラットフォームを撤去し、それぞれ象限ＩＩ、ＩＩＩ象限の水入点からプールの壁に面してマウスを水の中に入れ、６０秒以内のマウスがターゲット象限（プラットフォームが配置されている象限）で費やす時間の割合と、プラットフォームを検索するマウスの軌跡を記録した。実験結果は図１０に示される通りであり、トレーニング時間が増加するにつれて、マウスの潜伏期間は徐々に短くなり、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬはマウスのプラットフォームを見つけるまでの時間を有意に短縮させ；同時に、空間探査実験により、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬを与えたマウスのプラットフォームを横切る回数とターゲットプラットフォームに滞在する時間が大幅に増加したことが示され、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬは、ＣＡＴタンパク質を脳損傷部位に効率的に送達し、脳損傷による酸化ストレスレベルの上昇を緩和し、マウスの空間学習と記憶の能力を向上させることが示唆された。

【0233】

図１０．Ｃ５７マウスの皮質損傷モデルを構築し、Ｓｈａｍ群を偽損傷対照群とし、モデリング後１週間投与を継続し、モリス水迷路実験を行って、ＣＣＩモデルマウスの潜伏期間、プラットフォームを横切る回数、標的象限に滞在する時間への影響等に対する様々なＣＡＴ担持製剤の効果を調査した。

【0234】

実施例１２ＳＯＤマウスの運動能力と生存期に対するカタラーゼ（ＣＡＴ）担持ナノ複合体（即ち、実施例７の実験群ＦＩＴＣ－ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）の影響
実施例１０と同様に、トランスジェニックマウスにＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ（筋萎縮性側索硬化症モデル）ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬを投与し、その中で、生理食塩水および遊離ＣＡＴタンパク質投与群を対照群とし、ＳＯＤマウスには生後３ヶ月から投与し始め、毎日継続的に投与すると同時に、ロータロッドテスト、グラブバーテスト及び後肢食いしばりテストなどのマウスの運動能力評価実験を実施した。ロータロッド実験の具体的なステップ：最初の週はマウスを３回トリーニングし、ロータロッドの回転速度は１４ｒｐｍであり、この速度でロータロッド上に１８０秒間留まったマウスを無症候性と定義し、マウスがロータロッド上に留まる時間が１８０秒未満の場合、臨床発症時間として定義され、マウスは１週間のトリーニング後に実験する。ロッドグラブテストは、マウスが上肢に頼ってロッドを掴む時間を記録するもので、総検出時間は６０秒であり、６０秒以内のマウスの落下潜時を記録し；後肢食いしばりテストでは、マウスの尻尾を持ってマウスを逆さまに吊り下げ、１５秒間のビデオを録画して、１５秒以内のマウスの後肢を食いしばり状況を記録し、スコアは０～３であり、マウスの後肢の食いしばりの程度を評価した（硬直の重症度に正比例する）。実験結果は図１１に示される通りであり、ロータロッド実験の初期段階では、各群のマウスは同様の時間でロータロッド上に留まったが、時間の延長（４℃で一晩放置）に伴い、ＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬを投与したマウスのロータロッド上での時間は有意に延長し、ロッドグラブテストのＣＡＴ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ群のマウスのロッドグラブ時間は対照群よりも有意に延長され、後肢の食いしばりの程度が弱くなっており、ＳＯＤマウスの麻痺の病理学的過程を軽減することを証明した。

【0235】

図１１．ＳＯＤマウスモデルを用いて、継続投与し、同時にマウスの運動能力を評価して、様々なＣＡＴ担持製剤がＳＯＤトランスジェニックマウスの運動能力に及ぼす影響をロータロッドテスト、グラブバーテスト、後肢食いしばりテストにより調査した。

【0236】

実施例１３タンパク質を含まないブランクナノ複合体の調製、特性評価と細胞取り込み効率、並びに脳内分布

【0237】

（１）調製：
［１］ヒアルロン酸とプロタミンを様々な質量比で共培養してアポタンパク質複合体（ＨＡ－ＰＲＴＭ）を形成させた。
［２］薄膜水和法によるリポソームの調製：脂質（中性リン脂質ＤＭＰＣ、およびアニオン性リン脂質ＤＯＰＡ）と赤色蛍光色素ＤｉＩを秤量し、５００ｍＬの丸底フラスコに置き、エチルエーテル２ｍＬを加え、蒸発乾燥させてリン脂質の水分を除去し、更にクロロホルム溶液２ｍＬを加え、ロータリーエバポレーターで１時間減圧させた。０．０１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）４ｍＬを加え、薄膜水和し剥離させてリポソームが得られるまで、４０℃の水浴中で１０分間断続的に振盪した。超音波プローブを用いた超音波で、リポソームの粒径をさらに小さくして赤色蛍光プローブ担持リポソーム（ＤｉＩ－ＬＩＰＯ）を得た。
［３］リポソームとＨＡ－ＰＲＴＭとを様々な比率で共培養して、タンパク質薬物を含まないブランクリポソーム（ＤｉＩ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ＬＩＰＯ）を形成させ；アポリポタンパク質（ＡｐｏＥ）を前記リポソーム溶液に加え、穏やかに混合し、１２０ｒｐｍで、振とうシェーカーに置き、３７℃で３６時間培養して、ウシ血清アルブミン担持ナノ複合体（ＤｉＩ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）を得た。

【0238】

（２）特性評価
タンパク質薬物を含まないナノ複合体をリンタングステン酸でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で形態を観察した。さらにサンプリングした後、クライオ電子顕微鏡を使用して構造を観察した。レーザー粒度分析装置を使用して、粒径と表面電位を測定した。

【0239】

（３）細胞内タンパク質送達効率の評価
タンパク質薬物を含まないナノ複合体の細胞内タンパク質送達を、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ヒト子宮頸がん細胞Ｈｅｌａ細胞を共焦点皿に５０，０００個／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。吸引して元の培養液を廃棄し、５００μＬの赤色蛍光プローブで標識されたタンパク質薬物を含まないナノ複合体を加えた。

【0240】

実験群：赤色蛍光プローブで標識されたタンパク質薬物を含まないナノ複合体（ＤｉＩ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）。対照群：赤色蛍光プローブで標識されたＢＳＡ含有タンパク質薬剤担持ナノ複合体（ＤｉＩ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）であり、調製方法は実施例１と同じである。実験群と対照群（リン脂質ＤＭＰＣの量に応じて計算し、１０μｇ／ｍＬの濃度で投与）をそれぞれ３７℃で４時間培養した。次に、３．７％のホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、核をＨｏｅｃｈｅｓｔで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点イメージングを使用して定性的観察し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞によるＦＩＴＣ－ＢＳＡの取り込みの半定量分析した。

【0241】

（３）脳内のナノ複合体の分布の評価
Ｃ５７マウスを利用してＣＣＩモデルを構築し、同じように、ＣＣＩ後、尾静脈にＤｉＩ標識蛍光製剤を投与し、脳スライス実験によりＣＣＩマウスの脳におけるＤｉＩ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ及びＤｉＩ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ製剤の分布状況を評価し、尾静脈投与の３時間後、マウスを麻酔して心臓灌流のために固定し、腫瘍担持マウスの完全な脳を採取し、４％のパラホルムアルデヒドで２４時間固定し、ＰＢＳですすいだ後、１５％および３０％のグルコース溶液で沈むまで脱水し、続いてＯ．Ｃ．Ｔ．を使用して包埋し、－２０℃で凍結し、厚さ１４μｍの連続凍結冠状切片を作製し、ＰＢＳですすいだ後、１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＰＩで１０分間染色し、ＰＢＳですすぎ、水垢を拭き取り、グリセロールリン酸でスライドをマウントし、レーザー共焦点顕微鏡で脳内の二つの製剤の分布を観察した。

【0242】

結果は、ＢＳＡ含有タンパク質薬物のナノ複合体（ＤｉＩ－ＢＳＡ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）とタンパク質薬物を含有しないブランク担体（ＤｉＩ－ＨＡ－ＰＲＴＭ－ｒＨＤＬ）の粒径はいずれも１００ｎｍ以下であり、製剤が体内の生体膜関門を通過することに有利であり、細胞に効率よく取り込まれることができ；同時に、マウス皮質損傷モデルでは、タンパク質を含有しないナノ複合体とタンパク質を含有するナノ複合体の両方が脳損傷部位を効率的に標的化して分布できる。これらの発見は、タンパク質の担持の有無は細胞取り込みおよび脳内の標的分布に影響を及ぼさず、担体自体とタンパク質担持製剤がｉｎｖｉｖｏで同様の細胞取り込みおよび分布挙動を示すことを示唆した。

【0243】

【表13】