特許 7506600 高分解能共焦点顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-18

(45)【発行日】2024-06-26

(54)【発明の名称】高分解能共焦点顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20240619BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240619BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

G02B21/36

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020518535

(86)(22)【出願日】2018-09-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-10

(86)【国際出願番号】 EP2018075991

(87)【国際公開番号】W WO2019068519

(87)【国際公開日】2019-04-11

【審査請求日】2021-08-10

(31)【優先権主張番号】102017122858.6

(32)【優先日】2017-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】513072123

【氏名又は名称】カール・ツァイス・マイクロスコピー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ－Ｚｅｉｓｓ－Ｐｒｏｍｅｎａｄｅ １０， ０７７４５ Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100110423

【弁理士】

【氏名又は名称】曾我 道治

(74)【代理人】

【識別番号】100111648

【弁理士】

【氏名又は名称】梶並 順

(74)【代理人】

【識別番号】100212657

【弁理士】

【氏名又は名称】塚原 一久

(72)【発明者】

【氏名】バーテ、ヴォルフガング

(72)【発明者】

【氏名】カリニン、シュタニスラフ

【審査官】堀井 康司

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３－２５５２３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】独国特許出願公開第１０２０１５１１１７０２（ＤＥ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１８０４０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００９－２６４７５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０２Ｂ １９／００－２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６－２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料（Ｐ）の高分解能走査顕微鏡検査の方法において、
－前記試料（Ｐ）は照明放射で、前記照明放射（Ｂ）が前記試料（Ｐ）の中又は表面のある点に集束されて回折限界照明スポット（１４）を形成するような方法で照明され、
－前記点は、ピクセル（３１）を有する２Ｄ検出器（１７）上に、回折像（１８）への回折限界で結像され、そのピクセル（３１）により、前記２Ｄ検出器（１７）は、前記回折像（１８）の回折構造（１８ａ）を分解する空間分解能を有し、
－前記点は、異なる走査位置へと、前記照明スポット（１４）の直径より小さいインクリメントで前記試料（Ｐ）に関して移動され、
－前記２Ｄ検出器（１７）が読み取られ、前記２Ｄ検出器（１７）のデータから、及び前記データに割り当てられた前記走査位置から前記試料（Ｐ）の画像が生成され、前記画像は、結像のための分解限界より高められた分解能を有し、
－前記２Ｄ検出器（１７）の前記ピクセル（３１）は、光軸上にある中央の群（３２）と、前記中央の群（３２）をリング状に取り囲む別の群（３３）を含む群（３２、３３）に分割され、
－各群（３２、３３）について前処理原画像が計算され、
－前記前処理原画像が合成され、デコンボリューションが行われて、前記試料（Ｐ）の前記画像が生成され、
前記前処理原画像は、２次元デコンボリューションが各群（３２、３３）について行われることにより計算される
ことを特徴とする方法。

【請求項2】

試料（Ｐ）の高分解能走査顕微鏡検査の方法において、
－前記試料（Ｐ）は照明放射で、前記照明放射（Ｂ）が前記試料（Ｐ）の中又は表面のある点に集束されて回折限界照明スポット（１４）を形成するような方法で照明され、
－前記点は、ピクセル（３１）を有する２Ｄ検出器（１７）上に、回折像（１８）への回折限界で結像され、そのピクセル（３１）により、前記２Ｄ検出器（１７）は、前記回折像（１８）の回折構造（１８ａ）を分解する空間分解能を有し、
－前記点は、異なる走査位置へと、前記照明スポット（１４）の直径より小さいインクリメントで前記試料（Ｐ）に関して移動され、
－前記２Ｄ検出器（１７）が読み取られ、前記２Ｄ検出器（１７）のデータから、及び前記データに割り当てられた前記走査位置から前記試料（Ｐ）の画像が生成され、前記画像は、結像のための分解限界より高められた分解能を有し、
－前記２Ｄ検出器（１７）の前記ピクセル（３１）は、光軸上にある中央の群（３２）と、前記中央の群（３２）をリング状に取り囲む別の群（３３）を含む群（３２、３３）に分割され、
－前記データに含まれている原画像信号から各群（３２、３３）について前処理原画像が計算され、
前記データに含まれる個別の前記原画像信号間の横方向の相対移動が計算され、前記原画像信号が横方向の相対移動を補償するために押し戻されて、補償された前記原画像信号が得られ、同じ前記群に属する前記補償された原画像信号が加算されて、この群の前記前処理原画像が計算され、
前記前処理原画像が合成され、デコンボリューションが行われて、前記試料（Ｐ）の前記画像が生成される
ことを特徴とする方法。

【請求項3】

前記前処理原画像は、２次元デコンボリューションが各群（３２、３３）について行われることにより計算されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記前処理原画像について３次元でのデコンボリューションが行われ、前記試料の３Ｄ画像が生成されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記中央の群（３２）をリング状に取り囲む別の群（３３）は、少なくとも２つのリング状の群を含み、各リング状の群は前記中央の群（３２）から個別の距離を有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

４つ又は５つの群が提供されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

各ピクセル（３１）は前記群（３２、３３）のうちの正確に１つに割り当てられることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

試料（Ｐ）の高分解能走査顕微鏡検査のための顕微鏡において、
－前記試料（Ｐ）を照明放射（Ｂ）で、前記照明放射が前記試料（Ｐ）の中又は表面のある点に集束されて回折限界照明スポット（１４）を形成するような方法で照明する照明ビーム経路と、
－ピクセル（３１）を有する２Ｄ検出器（１７）上に、前記点を回折像（１８）への回折限界で結像する結像ビーム経路であって、そのピクセル（３１）により、前記２Ｄ検出器（１７）は、前記回折像（１８）の回折構造（１８ａ）を分解する空間分解能を有するような、結像ビーム経路と、
－前記点を、異なる走査位置へと、前記照明スポット（１４）の直径より小さいインクリメントで前記試料（Ｐ）に関して移動させる走査装置（１０）と、
－前記２Ｄ検出器（１７）のデータから、及び前記データに割り当てられた前記走査位置から前記試料（Ｐ）の画像を生成する評価装置（Ｃ）であって、前記画像は、前記画像の分解限界より高められた分解能を有するような、評価装置（Ｃ）と、
を含み、
－前記２Ｄ検出器（１７）の前記ピクセル（３１）は、光軸上にある中央の群（３２）と、前記中央の群（３２）をリング状に取り囲む別の群（３３）を含む群（３２、３３）に分割され、
－前記評価装置（Ｃ）は、各群（３２、３３）について前処理原画像を計算するように構成され、
－前記評価装置はさらに、前記前処理原画像を合成し、デコンボリューションを行うことによって、前記試料（Ｐ）の前記画像を生成するように構成され、
前記評価装置（Ｃ）はさらに、前記各群（３２、３３）について２次元デコンボリューションを行うことにより前記各前処理原画像を計算するように構成される
ことを特徴とする顕微鏡。

【請求項9】

前記評価装置（Ｃ）は、前記前処理原画像の３次元でのデコンボリューションを行うことによって、前記試料（Ｐ）の前記画像を生成するように構成されることを特徴とする、請求項８に記載の顕微鏡。

【請求項10】

前記中央の群（３２）をリング状に取り囲む別の群（３３）は、少なくとも２つのリング状の群を含み、各リング状の群は前記中央の群（３２）から個別の距離を有することを特徴とする、請求項８又は９に記載の顕微鏡。

【請求項11】

４つ又は５つの群（３２、３３）が提供されることを特徴とする、請求項８～１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。

【請求項12】

各ピクセル（３１）は前記群（３２、３３）のうちの正確に１つに割り当てられることを特徴とする、請求項８～１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料の高分解能走査顕微鏡検査の方法に関し、試料は照明放射で、照明放射が試料の中又は表面のある点に集束されて回折限界照明スポットを形成するような方法で照明され、この点はピクセルを有する２Ｄ検出器上に、回折像への回折限界（ｉｎ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｍａｇｅ）で結像され、そのピクセルにより２Ｄ検出器は回折像の回折構造を分解する空間分解能を有し、この点は、異なる走査位置へと、照明スポットの直径より小さいインクリメントで試料に関して移動され、２Ｄ検出器が読み取られ、試料の３Ｄ画像が２Ｄ検出器のデータから、及び前記データに割り当てられた走査位置から生成され、前記画像は、画像生成のための分解限界より高くされた分解能を有する。

【0002】

本発明はさらに、試料の高分解能走査顕微鏡検査のための顕微鏡に関し、これは、試料を照明放射で、照明放射が試料の中又は表面のある点に集束されて回折限界照明スポットを形成するような方法で照明する照明ビーム経路と、ピクセルを有する２Ｄ検出器上に、この点を回折像への回折限界で結像する結像ビーム経路であって、そのピクセルにより２Ｄ検出器は回折像の回折構造を分解する空間分解能を有するような結像ビーム経路と、点を異なる走査位置へと、照明スポットの直径より小さいインクリメントで試料に関して移動させる走査装置と、２Ｄ検出器のデータから、及び前記データに割り当てられた走査位置から試料の３Ｄ画像を生成する評価装置であって、画像は、画像の分解限界より高くされた分解能を有するような評価装置と、を含む。

【背景技術】

【0003】

光学顕微鏡の典型的な実装例はレーザ走査顕微鏡（略してＬＳＭともいう）であり、これは共焦点検出装置を使って、試料（ｓａｍｐｌｅ）のうち、対物レンズの焦点面内にある平面だけを画像化する。光学断面が得られ、その厚さは共焦点ピンホールの大きさに依存する。試料の異なる深さでの複数の光学断面を得ることにより、試料の３次元画像の生成が可能となり、これはその後異なる光学断面で構成される。したがって、レーザ走査顕微鏡は厚い標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）を検査するのに適している。

【0004】

原理上、ＬＳＭのそれを含む光学顕微鏡の光学分解能は、物理的法則により回折限界を有する。ここで、「高分解能」という用語は、回折限界を超える分解能について使用される。回折限界の克服は、エアリスキャン顕微鏡法として知られるものにより達成され、これは例えば（特許文献１）に記載されている。この文献では、その図５に示され、説明されている実施形態の中で、試料の回折限界照明と２Ｄ検出器とが組み合わされており、走査装置は、照明スポットで照明された点の回折像が２Ｄ検出器上に載るように構成される。この配置は、いわゆる「デスキャン（ｄｅ－ｓｃａｎｎｅｄ）」検出器配置と呼ばれる。これは典型的に、ビーム経路を偏向させるスキャナを、試料と、照明装置と結像装置の結合点（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）との間に設置することによって実現される。このようなスキャナは、照明スポットと、照明スポットで照明された点の結像との両方に作用し、その結果、スキャナの下流にある結像方向のビーム経路が静的となる。このようなスキャナの代替案は、試料を移動させる可動式試料ステージの使用である。それでも、回折像は２Ｄ検出器上で静的である。（特許文献１）のコンセプトによれば、２Ｄ検出器には、回折像の構造の分解を可能にする空間分解能が提供される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】欧州特許出願公開第２３１７３６２号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、画像取得が加速されるように、この種の方法及び顕微鏡を開発することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、特許請求項１及び６において定義される。

【0008】

本発明は、エアリスキャンの原理による試料の高分解能走査顕微鏡検査の方法を提供する。試料は照明放射で照明される。プロセス中、照明放射は試料の中又は表面にある点に集束されて回折限界照明スポットを形成する。この点は、２Ｄ検出器上に、回折像への回折限界で結像される。２Ｄ検出器はピクセルを有し、その結果、回折像の回折構造を分解する空間分解能を有する。点は、異なる走査位置へと、試料に関して移動される。連続する走査位置間のインクリメントはここで、照明スポットの直径より小さく、それによって試料の各点は、複数回（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｍｅｓ）、異なる位置の照明スポットと回折像の一部となる。２Ｄ検出器が読み取られる。プロセス中に得られたデータから、及び前記データに割り当てられた走査位置から、試料の画像が生成される。画像は、結像の分解限界より高くされた、エアリスキャン原理による分解能を有する。その結果、回折限界が克服される。

【0009】

データは、プロセスをスピードアップするために２段階で評価される。２Ｄ検出器のデータはピクセルのデータ、すなわちピクセルの各々の信号に対応する。このために、２Ｄ検出器のピクセルは少なくとも２つの群に分割される。群は、光軸上にある中央の群を含む。それゆえ、中央の群は中央区域をカバーする。他の群は、中央の群をリング状に取り囲む。このリング形の周囲の群に割り当てられた区域はそれゆえ、中央の群の区域をリング状に取り囲む。各群について、前処理された原画像が計算される。前処理原画像についてまとめてデコンボリューションが行われて（ａｒｅ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）、試料の高分解能画像が生成される。評価プロセスはしたがって、方法を加速させるために２段階で行われ、まず、それぞれの群又は、２Ｄ検出器の、それに割り当てられた区域について個別に行われ、次に群レベルで行われる。これにより、画像評価が加速される。

【0010】

本方法と同様のものとして、対応する顕微鏡が提供され、これは、試料を前記特性で照明する照明ビーム経路と、点を、２Ｄ検出器上にそのピクセルで、回折像への回折限界で結像する結像ビーム経路とを含む。２Ｄ検出器のデータとこのデータに割り当てられた走査位置から試料の画像を生成する評価装置はさらに、２Ｄ検出器のピクセルを上述の群に分割して、評価を２段階で、すなわち、まず各群について個別に、次に群レベルで行うように構成される。

【0011】

検出器の各ピクセルの信号が個別に処理される「従来の」エアリスキャンと同等のｚ方向への分解能を実現するためには、複数のリング形の群を形成する必要があり得る。データの処理は、群の数の増加と共に減少するが、いずれにしても従来の計算より大幅に速い。したがって、リング形の周囲群を１つだけ使用するのではなく、それを複数使用することが好ましく、リング形の群の各々の中央の群からの距離は異なる。その後、次々に取り囲むリング形の群の系が提供され、前記系は中央の群の周囲に配置される。４つ又は５つの群が特に好ましい。

【0012】

さらに、好ましくは各ピクセルが群の正確に１つに割り当てられるようになされる。

【0013】

好ましい実施形態において、各群の前処理原画像は、各群に関する２Ｄ検出器のデータの２次元デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行うことによって計算される。その後、２段階評価は、各群についての初期２Ｄデコンボリューション、次に群レベルでの３Ｄデコンボリューションを提供する。

【0014】

特に、方法又は顕微鏡の中で、試料は照明によって励起されて蛍光放射を発する。その後、照明ビーム経路が励起ビーム経路として形成される。

【0015】

下記の文は顕微鏡検査方法の態様を説明するが、前記態様は、対応する方法ステップを実行するように適当に構成される評価装置に等しく関係する。装置は、適正なソフトウェア又は適正なプログラムコードで実装されるコンピュータであってよい。反対に、顕微鏡及びその操作に基づいて説明される態様は、顕微鏡検査方法に等しく関係する。

【0016】

上述の特徴及び以下に説明する特徴は、明記された組合せでしか使用できないのではなく、他の組合せでも、又は単独でも使用でき、それも本発明の範囲から逸脱しないと理解されたい。

【0017】

以下に本発明を実施形態に基づいてさらに詳しく説明し、それと共に同様に本発明に不可欠な特徴を開示している添付の図面を参照する。これらの実施形態は例示にすぎず、限定的と解釈されるべきではない。例えば、複数の要素又は構成部品を備える実施形態の説明は、これらの要素又は構成部品のすべてが実装に必要であることを意味していると解釈されるべきではない。むしろ、他の実施形態には、代替的な要素及び構成部品、それより少ない要素若しくは構成部品、又は追加の要素若しくは構成部品が含まれていてもよい。異なる実施形態の要素又は構成部品は、特に別段の断りがないかぎり、相互に組み合わせることができる。実施形態のうちの１つについて説明された改変や変更は、他の実施形態にも当てはめることができる。反復を避けるために、異なる図中の同じ要素又は対応する要素は、同じ参照符号で示され、何度も説明されない。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】高分解能顕微鏡検査用顕微鏡の略図を示す。

【図2a】図１の顕微鏡の検出器のピクセルの配置の略図を示す。

【図2b】図１の顕微鏡の検出器のピクセルの配置の略図を示す。

【図3】顕微鏡検査方法のための信号伝搬図を示す。

【図4】高分解能共焦点顕微鏡のデータ処理の実施形態を示す。

【図5】図４のそれに対する代替的なデータ処理を示す。

【図6a】使用される顕微鏡のオブジェクト伝達関数のミーン伝達関数を示す。

【図6b】使用される顕微鏡のオブジェクト伝達関数のミーン伝達関数を示す。

【図6c】使用される顕微鏡のオブジェクト伝達関数のミーン伝達関数を示す。

【図7】検出器のピクセルの群への分割の図式的表現を示す。

【図8】第一の信号評価例による、高分解能化された前処理画像の信号伝搬図を示す。

【図9】第二の信号評価例による、図８と同様の図を示す。

【図10a】各種の評価方式のためのミーン伝達関数を示す。

【図10b】各種の評価方式のためのミーン伝達関数を示す。

【図10c】各種の評価方式のためのミーン伝達関数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

図１は、高分解能、すなわち、例えば欧州特許出願公開２３１７３６２Ａ１号明細書から知られている、いわゆるエアリスキャンの原理による回折限界より高くされた分解能を有する共焦点顕微鏡２０を概略的に示す。これは、試料Ｐを照明スポット１４で照明する光源６を有する。照明光Ｂは、ビーム整形手段７及びミラー８を介してビームスプリッタ９へと案内される。ビームスプリッタ９は、照明光Ｂのできるだけ多くを反射して、それをスキャナ１０へと案内するように構成される。スキャナ１０から、照明光Ｂは、別のビーム整形光学ユニット１１及び１２を介して対物レンズ１３へと案内される。対物レンズ１３は、照明光Ｂを試料Ｐに、照明スポット１４へと集束させる。

【0020】

試料により照明スポットＢにおいて生成される試料光Ｄは、対物レンズ１３により集光されて、照明光Ｂに関して逆の経路でビームスプリッタ９に案内される。ビームスプリッタ９は、試料光Ｄのできるだけ多くの部分を透過させるように構成される。このようにしてビームスプリッタ９を透過した試料光Ｄは、別のフィルタ１５及び別のビーム整形光学ユニット１６を介して検出器１７へと送られる。検出器１７は、試料光Ｄを検出し、そこから電気信号を生成して、これらを、導体２３、２４、２５を介して制御及び評価装置Ｃ、例えばコンピュータへと送る。このようにして回折像１８が得られ、この像は、回折構造１８ａが示すように、回折限界である。

【0021】

試料Ｐの画像を得るために、照明スポット１４はスキャナ１０によって試料Ｐ全体にわたり点で移動される。このようにして得られた点に関する試料の信号から、制御及び評価装置Ｃは画像を構成し、これは例えばモニタを使って表示できる。この設定では、スキャナ１０により２次元画像を得ることができ、これは横方向に、すなわち対物レンズの光軸に垂直な平面内に延びる。３次元画像を得るために、対物レンズ２６と試料Ｐとの間の距離が変えられ、各距離において試料Ｐの２次元画像が撮影される。評価ユニットは、このようにして得られた信号を合成して、３次元画像を形成することができる。

【0022】

図２ａ及び２ｂは、共焦点顕微鏡の検出器を概略的に示している。図２ａは、１つの感光面３０を有する従来の検出器を示す。高分解能を実現するために、共焦点顕微鏡２０の検出器１７は、図２ｂに示されるように複数の検出素子、すなわちピクセル３１を有する。素子には番号が付けられており、この配置は例として３２個のピクセルを有する。

【0023】

ピクセル３１の大きさは、検出器１７上に生成される回折像１８より大幅に小さいピクセルを有するように選択される。それと同時に、ピクセル３１の数と、その結果として検出器１７の全範囲は、試料光Ｄの実質的な部分が回折像１８のために検出できるように選択される。

【0024】

比較として、図２ａは１つの素子３０のみを有する検出器を示しており、これは従来の分解能を有する共焦点顕微鏡に使用されるであろう。別の表現をすれば、検出器の全範囲が回折像１８の大部分をカバーする。「従来の分解能（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」という用語は、アッベ限界（Ａｂｂｅ ｌｉｍｉｔ）がこの場合に実現される分解能に当てはまることを意味すると理解すべきである。これに対して、より高い分解能を有する共焦点顕微鏡２０では、照明及び検出が協働して、理論上、２倍高い分解能を実現できる。実際には、分解能の増大幅は若干小さく、それは、分解限界付近の構造は非常に低いコントラストでしか送信できないからである。現実的に、アッベ限界の最大１．７倍の分解能を実現できる。

【0025】

各走査点

【数1】

について、高分解能の共焦点顕微鏡２０の検出器１７は、検出器の素子３１の数に対応する多くの検出信号

【数2】

を捕捉する。

【数3】

は横方向の試料位置を示し、ｚは軸方向の試料位置を示し、指数ｈは検出器の素子（ピクセル）を示す。以下の説明は３２個のピクセルを前提としているが、その他の数のピクセルも使用できる。

【0026】

検出器の素子３１の各々は試料Ｐからの原画像信号を捕捉し、これは信号

【数4】

からなる。原画像信号は相互に異なり、その差は、検出器のそれぞれの素子により検出される試料領域に関する照明光スポットの横方向の距離により特定される。原画像信号は、検出器のそれぞれの素子ｈの点広がり関数（ＰＳＦ：ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）

【数5】

を用いる「実際の」試料画像

【数6】

のコンボリューションにより数学的に説明される：

【数7】

【0027】

すべての

【数8】

を、試料の原型

【数9】

に対応する画像

【数10】

へとできるだけ正確に合成することは、評価ユニットＣの機能である。これは、デコンボリューション（ＤＣＶ）と、このようにデコンボリューションが行われた原画像信号のその後の合成とにより実現され、デコンボリューションと合成のプロセスは、処理の点で相互に併合できる。

【0028】

図３は、信号伝搬図の全ステップを示している。開始点はＰＳＦ

【数11】

（４０）と原画像信号

【数12】

（４１）である。ＰＳＦは、光学システムの特性によってわかる。これらは、システムパラメータから計算することも、一度測定し、保存することもできる。信号はライン１４０、１４１を介して評価５０に送信され、これはすべての原画像信号のそれぞれ対応するデコンボリューションと合成を行って、試料の原型

【数13】

に対応する試料の画像

【数14】

（４２）をできるだけ正確に出力する。

【0029】

図３及び他のすべての信号伝搬図は、送信されるデータの量を矢印１４０、１４１、１５１の太さにより示す。３２の原画像信号

【数15】

と３２のＰＳＦ

【数16】

がある。評価により、試料の画像

【数17】

を生成し、前記画像内のデータの量は全原画像信号の３２分の１である。これは、細い矢印１５１により象徴される。同様に、１つの画像に関するデータの量の係数は矢印のところに示される。すなわち、原画像信号及びＰＳＦに関する／／３２と、試料の画像に関する／／１である。

【0030】

破線６０は共焦点顕微鏡２０の全体のドメインを分離し、それらの間で原画像信号のデータが送信されなければならない。この場合、ドメインＬＳＭ（レーザ走査顕微鏡）は共焦点顕微鏡のハードウェア関連セクタ、すなわち光学系、機械系、及び電気系であり、それによってＰＣドメインへのデータ転送が容易となる。ドメインＰＣは制御及び評価装置Ｃ及び、その結果、共焦点顕微鏡２０の制御、その後の処理、及びデータの表示に必要なすべてを構成する。通常、パーソナルコンピュータＣがこのドメインの中核である。具体的には、すべての原画像信号のデータは、ＬＳＭからＰＣに転送されなければならない。これにはパワフルなインタフェースが必要であり、データ転送速度は、提供されるインタフェースにより限定され得る。

【0031】

図４は、高分解能の共焦点顕微鏡２０におけるデータ処理の、より具体的な実施形態を示す。ここで、評価ユニット５０ａは、いわゆるウィナフィルタリング(Ｗｉｅｎｅｒ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ)
を実行する。このために、原画像信号

【数18】

は、局所座標で表され、まずフーリエ変換が行われて、原画像信号は空間周波数座標

【数19】

で与えられる。同じことがＰＳＦについても行われる。すでにフーリエ空間で変換されたＰＳＦ

【数20】

は、オブジェクト伝達関数ＯＴＦと呼ばれる。

【0032】

５０ａのデコンボリューション式を理解するためには、２つの態様が重要である：
１．原画像信号は、前述のように、システムＰＳＦとのコンボリューションが行われる試料に対応する：
２．実空間内のコンボリューションは、フーリエ空間での乗算に対応する。それゆえ、原画像信号は、フーリエ空間においては、試料とＯＴＦとの積として表すことができる：

【数21】

【0033】

【数22】

のための式がデコンボリューション式に挿入されると、

【数23】

が得られ、

【数24】

は共役複素相のＯＴＦ（ＯＴＦ ｗｉｔｈ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ－ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｈａｓｅ）を示し、次に（原（ｏｒｉｇｉｎａｌ））ＯＴＦとの積でその絶対値の二乗が得られる。

【0034】

ｗは正の実数であり、この場合はウィナパラメータとして示されるものとする。ウィナパラメータが

【数25】

に関して小さいと、端数は１に近付き、

【数26】

は試料の原型

【数27】

にほぼ対応する。他方で、ｗが小さすぎなければ、端数は確実に、

【数28】

の小さいときの点

【数29】

で発散しない。このような発散は、原画像信号

【数30】

に必ず存在し、ここでは図示されていないノイズを極端（ｂｅｙｏｎｄ ａｌｌ ｍｅａｓｕｒｅ）に増大させ、結果として得られる画像

【数31】

は使用に適さないものとなる。

【0035】

画像を表示できるようにするために、空間周波数座標で与えられる画像

【数32】

は、逆フーリエ変換を使って実空間に再び変換されなければならない。実際のデコンボリューション５０ａは比較的簡単な計算ステップ（加算と乗算のみ）で構成されるものの、全体としてのデコンボリューションプロセスは複雑である。特に、すべての原画像信号

【数33】

のフーリエ変換は計算集約的であるため、時間がかかる。

【0036】

原画像信号の処理のための１つの代替案が図５に示されている。原画像信号のこの代替的処理は、個々の原画像信号が実質的に、移動によって相互に横方向、すなわち

【数34】

方向にのみ異なる点を利用する。この移動ｓ_ｈ ５１は、ＰＳＦ

【数35】

の関数であり、比較的わずかな労力で計算できる。するとこれは、近似により処理ルートを開放する（Ｔｈｉｓ ｎｏｗ ｏｐｅｎｓ ａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｒｏｕｔｅ ｂｙ ｗａｙ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ:）。原画像信号は移動ｓ_ｈのために押し戻され、その後、加算される５３。このような移動は、原画像信号のすべての平面ｚについて同様に行われる。その結果、前処理原画像

【数36】

が得られる。前処理ＰＳＦ

【数37】

５２も同様に計算される。別のステップ５０ｂで、前処理原画像について前処理ＰＳＦでのデコンボリューションが行われ、試料のデコンボリューション後の原画像

【数38】

が得られる。この処理ルートの利点は、第一に、前処理（５３）が非常に簡単で、したがって素早いことにある。これによって、前処理はデータをＰＣに転送する１５３前に実行でき、したがって３２枚ではなく１枚の画像だけを転送すればよい。これは、ＬＳＭとＰＣとの間のインタフェースから負荷を取り除く。第二に、画像取得後にデコンボリューションが必要なのは前処理原画像だけである。これも同様に、１回のフーリエ変換だけでよいため、及びデコンボリューションの中で加算が不要となるため、はるかに迅速に行われる。全体として、前処理の全部に、事前に必要な時間のうちのわずかしか使われない。

【0037】

しかしながら、処理ルートのこの利点は、重大な欠点により打ち消される。その理由は、前処理はｚに関する原画像信号の特性を全く考慮しておらず、その結果、ｚ方向への分解能が従来の共焦点顕微鏡で実現される程度まで低くなる。このことは図６に示されている。示されている図表ａ～ｃは「ミーン伝達関数」ＭＴＦ（ｍｅａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）であり、これはＯＴＦの絶対値と定義される。横方向の空間周波数がｘ軸に沿ってプロットされ、軸方向の空間周波数がｙ軸に沿ってプロットされている。どちらの軸も、ワイドフィールドシステムのそれぞれ横及び軸方向の限界周波数に関して正規化されている。ＭＴＦの振幅は等高線としてプロットされ、これは

【数39】

での振幅に関して正規化されている。ＭＴＦの振幅が大きいことは、画像のコントラストが高いことを意味し、又はＤＣＶによる補正後に、ＭＴＦの振幅が高いことは、特に低ノイズの画像であることを意味する。図６ａは、図２ａに示されるような１つの検出器を備える従来の共焦点システムのＭＴＦを示す。このようなシステムの横方向の分解能は、ワイドフィールド顕微鏡のそれにほぼ対応しており、すなわち

【数40】

の方向への最大範囲が約１に近付く。軸方向では、ワイドフィールドシステムよりすでに分解能が増大している。しかしながら、軸方向の分解能は軸上の

【数41】

で急減している。これは、図６ａの矢印７１により示されている。これに対して、図６ｃは、原画像が図３又は４により説明したように前処理された場合に、高分解能化された共焦点顕微鏡２０により実現され得るＭＴＦを示す。横方向の分解能は約１．５倍に増大し、ｋ_ｚ方向への軸上のＭＴＦの急減７１はなくなっている。原画像が図５による高速計算近似を使って前処理された場合、分解能の増大は横方向においては依然として実現される。しかしながら、軸方向でｋ_ｚ方向への急減は克服されない。これは図６ｂに示されている。

【0038】

高速処理の利益を実現しながら、ｚ分解能がより低いという欠点を容認せずに済むようにするには、評価を特殊な方法で、すなわち２段階で行うようにする。

【0039】

そのために、まず図７を考える。ここで、図２ｂの検出器が再び示されている。照明光スポット１４は通常、検出器１７の中央にある。別の表現をすれば、照明光スポット１４のセントロイド（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）は第一のピクセル３２のセントロイドと一致する。光軸に関して対称（特に回転対称）のＰＳＦの場合、軸（ｋ_ｚ）方向の分解能は、照明光スポット１４に関するピクセル３２の距離のみに依存し、照明光スポット１４に関するピクセル３２の方向には依存しない。その後、これは、軸方向に同じ特性のＰＳＦを有する検出器上にリング形の区域３３があることを意味する。この効果はまず、リング内のすべてのピクセルのデータを２次元で前処理するために利用される。ここで、前処理されたＰＳＦは軸方向に制限されず、それは、軸方向に同じ特性を有するからである。このように得られた前処理原画像は次のステップで最終的に合成されて、デコンボリューションが行われ、このステップでは前処理原画像のｚ特性を考慮に入れることができ、それゆえ、ｚ方向にも最大分解能を実現できる。

【0040】

この２段階評価の利点は、画像の前処理の計算集約性が格段に低いことであり、これは特に、それが２次元で行われる場合、すなわち、図３による直接３次元前処理が生成するような深さ情報をまったく生成しない場合に当てはまる。その後、最終的な、より複雑な、３Ｄ計算は数の減った前処理原画像についてのみ行えばよく、相応に素早く行われる。

【0041】

この方法の経済性に関して、図７を再び考える。この例示的な検出器は、例えば４つのリング区域ｃに分割できる。リング区域Ｉは中央の検出器素子１のみを含み、リング区域ＩＩは素子２．．．６を含み、リング区域ＩＩＩは素子７～１９を含み、リング区域ＩＶは最後に素子２０～３２を含む。それゆえ、４つの前処理原画像が当初の３２個の原画像から生成でき、この前処理原画像は当初のデータ量の１／８しか含んでいない。

【0042】

図８は、共焦点顕微鏡２０のための前処理を概略的に示す。第一の評価例では、第一のステップですべての原画像Ｄ_ｈが合成されて、前処理原画像

【数42】

５５が形成される。合成は、有利には、横方向への分解能の損失が生じないような方法で実行される。例えば、すべての原画像について、まず、それらの２次元ＰＳＦ

【数43】

に関してデコンボリューションを行うことができる。その後、検出器１７のリング区域ｃの各々に対して合成５５が行われる。前処理原画像の数は原画像信号の数より有意に少ない。この例では３２個の原画像信号があるが、前処理原画像は４つのみである。したがって、データの量は８分の１に減る。これによって、また、ＬＳＭからＰＣへと最終処理５０ｃのために転送されるべきデータ１５５の量も８分の１に減る。最終的なＤＣＶは、前処理原画像のデコンボリューションと合成を含む。そのために、システムは、前処理原画像のためのＰＳＦ

【数44】

を特定し、これらのＰＳＦで前処理原画像のデコンボリューションを行う。最後に、試料の、デコンボリューションが行われた画像

【数45】

が得られ、この画像は試料に非常に正確に対応し、従来の手段により表示できる。

【0043】

図９は、共焦点顕微鏡２０のための第二の評価例に関する。これは、個別の原画像信号が実質的に、移動により相互に横方向、すなわち

【数46】

方向にのみ異なることを利用する。移動ｓ_ｈ ５１は、ＰＳＦ

【数47】

の関数であり、比較的わずかな労力で計算できる。前処理されたデータの入手のために、原画像信号の移動は補償される。その後、検出器のリング区域のすべての原画像信号がこのように移動され、５３ａに加算される。これらの計算ステップは、非常に高速で、さらに画像取得中に行うことができる。前処理原画像５２ａのＰＳＦも同様に計算される。前処理原画像は１５３ａで最終計算５０ｄへと供給され、その後、デコンボリューションと加算が行われる。この例では、図４のステップ５０ａで述べたようにウィナデコンボリューションが利用される。ウィナデコンボリューション５０ｄは、前処理原画像の数が減ったことにより、はるかに高速で行うことができる。特に、本発明のこの例では、３２個ではなく、４つになった画像のみにフーリエ変換を行えばよい。ウィナデコンボリューションにより最終的な３Ｄ画像が提供され、これは従来の手段で表示できる。

【0044】

図１０ａ及び１０ｂは、共焦点顕微鏡２０のＭＴＦを示す。比較のために、従来の評価を行うシステムにより提供されるＭＴＦが図１０ｃに示されている。図１０ａは、図９による第二の評価例のＭＴＦを示す。図６ｂにおいて生じるような、ｋ_ｚ方向の

【数48】

におけるＭＴＦの急減は完全に回避される。図１０ｂは、前処理で２Ｄ ＤＣＶが使用された第一の評価例のＭＴＦを示す。第二の評価例の非常に高速な方法と比較して、空間周波数≒１で幾分大きい横方向のＭＴＦ振幅がある。これは、比較線６５ａにより可視化されている。図１０ｂにおいて、この線は０．０５ＭＴＦの等高線と接触しており、図１０ａでは、この等高線は幾分中央にある。異なる表現をすれば、比較線６５ａ上のＭＴＦは、図１０ｂより幾分低い。どちらの実施形態も、横方向の空間周波数の高い領域においても、等しく良好な効果を示す。これは、比較線６５ｂにより明確となる。これは、０．００２の等高線が両方の図で同じ寸法に達することを示している。

【0045】

留意すべき点として、２つの評価例間の差はまた、システムのパラメータにも依存する。すべてのシミュレーションに、エアリ回折ディスクの直径の１．５倍に対応する検出器範囲の合計の直径を使用した。差は直径が小さいほど小さいことがわかった。パラメータの選択によって、異なる評価形態が有利になる可能性があり、また、１つのシステムの中に、パラメータの選択に応じて使用される複数の評価形態を提供することも想定される。

【0046】

先行技術との比較のために、図３による先行技術の評価を行ったＭＴＦが図１０ｃに示されている。これは実際には、図１０ｂのＭＴＦと違わない。そのため、２段階評価は、実質的により短い計算時間で同等に良好な結果が達成される。

【0047】

これは、具体的に説明された実施形態に限定されない。異なるマトリクスのリング領域、例えば正方形のマトリクスのリング領域を有する検出器でも、ｚ方向に十分に類似したＰＳＦを有するピクセルを特定し、これらのピクセルを一緒に前処理することが可能となる。区域の数は変えることもでき、例えば２、３又は５、６である。

【0048】

同様に、異なる前処理及び最終処理も、これらが高分解能化の利益をほとんど保持できるかぎり、想定可能である。例えば、反復的デコンボリューションプロセスも使用でき、これはウィナデコンボリューションの特定の欠点を回避する。ケースバイケースで、それほど良好な結果を生じない、すなわちＭＴＦがわずかに低くなるが、計算コストは少なくて済む方法も使用できる。また、システムＰＳＦについてまったくわからなくてもよいデコンボリューション方法（いわゆるブラインドデコンボリューション）も使用できる。

【0049】

前処理原画像が最終処理に転送されるフォーマットは重大ではない。例えば、空間周波数空間における前処理を実行しながら、前処理原画像は実際の空間に再び変換されず、空間周波数データとして転送されることも想定される。これは、最終処理も同様に空間周波数空間内で行われる場合に特に有利である。この場合、最終処理はｚに関しては依然としてデータを変換しなければならないが、横座標については不要である。その結果、時間がさらに節約される。

【0050】

前処理と最終処理が行われる場所は、その方法にとって重大ではない。それゆえ、初めに原画像信号のすべてをライン１４１を介して送信して、２段階評価を完全にＰＣ上で実行することもできる。その場合、より少ない／より高速のデータ転送の利点はなくなるが、計算コスト全体が減少するため、依然として加速（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）がある。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図10c】