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▶ チルドレンズ ホスピタル メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-18
(45)【発行日】2024-06-26
(54)【発明の名称】肝胆膵組織およびその作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240619BHJP
C12N 5/073 20100101ALI20240619BHJP
A61K 35/413 20150101ALI20240619BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20240619BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20240619BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240619BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240619BHJP
C07K 14/50 20060101ALN20240619BHJP
C07K 14/495 20060101ALN20240619BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20240619BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12N5/073
A61K35/413
A61K35/39
A61K35/407
A61P1/16
A61P1/18
C07K14/50
C07K14/495
C12M1/00 A
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2021503897
(86)(22)【出願日】2019-07-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 US2019041985
(87)【国際公開番号】W WO2020023245
(87)【国際公開日】2020-01-30
【審査請求日】2022-07-15
(31)【優先権主張番号】62/703,559
(32)【優先日】2018-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500469235
【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】武部 貴則
(72)【発明者】
【氏名】小池 博之
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１９３４２１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０４８１９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Stem Cell Reports，2018年03月13日，Vol. 10，pp. 780-793
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
境界オルガノイドを作製する方法であって、ａ）融合スフェロイドを形成するのに十分な第１の期間、前腸スフェロイドを後腸スフェロイドと接触させる工程であって、前記接触させる工程は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む腸成長培地で行われる、接触させる工程と、
ｂ）前腸と中腸の境界を有する境界オルガノイドを形成するのに十分な第２の期間、前記融合スフェロイドを培養する工程であって、前記融合スフェロイドを培養する工程は、前記融合スフェロイドを基底膜マトリックスに包埋する工程と、ＲＯＣＫ阻害剤を含む腸成長培地中で培養する工程とを含む、培養する工程と、
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の期間は１日である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記第２の期間は１日～３日である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記前腸スフェロイドを形成するために、第１の胚体内胚葉を、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させる工程と、前記後腸スフェロイドを形成するために、第２の胚体内胚葉を、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記前腸スフェロイドが、ＳＲＹボックス２（ＳＯＸ２）を発現する細胞を含み、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）発現細胞を実質的に含まず、および前記後腸スフェロイドが、ＰＤＸ１およびＣａｕｄａｌ型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現する細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記境界オルガノイドが、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）を発現する細胞、造血的に発現されるホメオボックスタンパク質（ＨＨＥＸ）を発現する細胞、ならびにＰｒｏｓｐｅｒｏ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）を発現する細胞を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＰＲＯＸ１陽性領域を前記境界オルガノイドから切除し、前記切除された境界オルガノイドを培養して、陥入上皮および分岐構造を形成させることをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記境界オルガノイドが、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２、ＨＨＥＸ、およびＰＤＸ１の発現によって特徴付けられる胆膵原基を含み、前記ＰＤＸ１発現が、前記境界オルガノイドの境界領域に局在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記境界オルガノイドを気液界面における前記腸成長培地で培養して、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」）を形成させる工程をさらに含み、前記ＨＢＰＯが、胆組織および膵組織を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＨＢＰＯが、肝組織、膵組織、胆管組織、および腸組織を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＨＢＰＯが、内胚葉および中胚葉を含む多器官三次元オルガノイドである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＨＢＰＯを、人工多能性幹細胞から誘導される内皮細胞と培養する工程をさらに含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＨＢＰＯとの前記培養の前に、前記内皮細胞が、内皮細胞（ＥＣ）スフェロイドに形成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＨＢＰＯを、人工多能性幹細胞から誘導される間葉細胞と培養する工程をさらに含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＨＢＰＯとの前記培養の前に、前記間葉細胞が、間葉細胞（ＭＣ）スフェロイドに形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって生産された境界オルガノイド。
【請求項18】
請求項１０～１６のいずれか一項に記載の方法によって生産されたＨＢＰＯ。
【請求項19】
胆炎症性疾患および膵炎症性疾患の１つまたはそれ以上の処置のための対象の潜在的な治療剤を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法であって、前記対象の潜在的な治療剤を、請求項１７に記載の前記境界オルガノイドおよび／または請求項１８の前記ＨＢＰＯと接触させる工程と、器官活性の測定値を検出する工程と、前記対象の潜在的な治療剤が、前記疾患の前記測定値を改善するか否かを決定する工程と、を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法。
【請求項20】
疾患を有する個体の治療に使用の請求項１７に記載の境界オルガノイドまたは請求項１８に記載のＨＢＰＯ。
【請求項21】
前記疾患が、肝疾患、膵疾患、または胆疾患から選択される、請求項２０に記載の使用のための境界オルガノイドまたはＨＢＰＯ。
【請求項22】
肝疾患、膵疾患、または胆疾患の治療のための薬剤の製造に使用の請求項１８に記載のＨＢＰＯ。
【請求項23】
前記肝疾患が肝不全である、請求項２１または２２に記載の境界オルガノイドまたはＨＢＰＯ。
【請求項24】
前記膵疾患が糖尿病である、請求項２１または２２に記載の境界オルガノイドまたはＨＢＰＯ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２６日に出願された「ヒトの前腸と中腸の境界からの肝胆膵器官形成のモデリング」と題する６２／７０３，５５９の優先権および利益を主張し、その内容はすべての目的のためにその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月２６日に出願された「ヒトの前腸と中腸の境界からの肝胆膵器官形成のモデリング」と題する６２／７０３，５５９の優先権および利益を主張し、その内容はすべての目的のためにその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
器官形成は複雑で相互に関連したプロセスであり、複数の境界組織の相互作用によって調整される１－７。しかし、今日まで、個々の隣接する成分がどのように協調して統合された多器官構造を確立するかは不明確である。したがって、幹細胞培養における多器官統合は、重大な、満たされていない課題である。具体的には、２つ以上の組織型を有する構造的および機能的に統合されたオルガノイドを取得することは、当技術分野において満たされていないニーズである。より具体的には、肝胆膵（ＨＢＰ）系のパターン形成、およびバランスの取れた器官形成は、技術的な複雑さのために組織培養でうまくモデル化されておらず、詳細な機構研究を妨げている１６，１７。本開示は、当技術分野における前述のニーズの１つ以上に対処しようとする。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２００８／０１９３４２１号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１７／０４８１９３号
（特許文献３） 国際公開第２０１９／０７４７９３号
（特許文献４） 国際公開第２０１７／１３６４７９号
（特許文献５） 米国特許出願公開第２０１７／０２４０８６６号明細書
（特許文献６） 米国特許出願公開第２０１２／０２６４２０９号明細書
（特許文献７） 米国特許出願公開第２０１６／０３１２１９１号明細書
（特許文献８） 国際公開第２０１８／１９７５４４号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＳＨＥＲＷＯＯＤ ｅｔ ａｌ．"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，" Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，１８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００８ （１８．１２．２００８），Ｖｏｌ．２３８，Ｉｓｓ．１，Ｐｇｓ．２９－４２．ｅｎｔｉｒｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ
（非特許文献２） ＬＩＮ ｅｔ ａｌ．"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，" Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｔｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１７（１２．１０．２０１７），Ｖｏｌ．３７； Ｎｏ．１１，Ｐｇｓ．２０１４－２０２５．ｅｎｔｉｒｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 米国特許出願公開第２００８／０１９３４２１号明細書
（特許文献２） 国際公開第２０１７／０４８１９３号
（特許文献３） 国際公開第２０１９／０７４７９３号
（特許文献４） 国際公開第２０１７／１３６４７９号
（特許文献５） 米国特許出願公開第２０１７／０２４０８６６号明細書
（特許文献６） 米国特許出願公開第２０１２／０２６４２０９号明細書
（特許文献７） 米国特許出願公開第２０１６／０３１２１９１号明細書
（特許文献８） 国際公開第２０１８／１９７５４４号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＳＨＥＲＷＯＯＤ ｅｔ ａｌ．"Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，" Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，１８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００８ （１８．１２．２００８），Ｖｏｌ．２３８，Ｉｓｓ．１，Ｐｇｓ．２９－４２．ｅｎｔｉｒｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ
（非特許文献２） ＬＩＮ ｅｔ ａｌ．"Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，" Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｔｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１７（１２．１０．２０１７），Ｖｏｌ．３７； Ｎｏ．１１，Ｐｇｓ．２０１４－２０２５．ｅｎｔｉｒｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ
【発明の概要】
【0003】
本明細書には、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」または「ＨＢＰオルガノイド」）組成物、および肝胆膵オルガノイド組成物を作製および使用する方法が開示される。開示される組成物は、肝組織機能、胆組織機能、外分泌膵機能、および内分泌膵組織機能から選択される２つ以上の機能を有し得る。肝胆膵オルガノイド組成物を使用して個体を処置する方法も、開示される。
【図面の簡単な説明】
【0004】
当業者は、以下に記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、いかなる方法でも本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【0005】
【図1A-1G】境界オルガノイドは、多内胚葉ドメインを生成する。１Ａ．ｉＰＳＣから肝胆膵（ＨＢＰ）オルガノイド（「ＨＢＰＯ」）を確立するための概略図。ヒトＰＳＣを、前腸細胞または後腸細胞に分化させた。細胞を単一の細胞に解離させ、再凝集させて前／後腸スフェロイドを形成させ、前部と後部の境界オルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌで生成させた。Ｍａｔｒｉｇｅｌ包埋は、多器官スペシフィケーションおよび境界オルガノイドからの陥入を開始させた。１Ｂ．ＳＯＸ２＋前部およびＣＤＸ２＋後腸スフェロイドの融合による境界オルガノイドの生成。ＳＯＸ２およびＣＤＸ２発現を、ＳＯＸ２について赤で、ＣＤＸ２について緑で、およびＤＡＰＩについて白でホールマウント免疫染色によって、入口数として示される各集団のパーセンテージについてのフローサイトメトリー、およびｑＰＣＲによって確認した。データは平均±ｓｄ、ｎ＝３回の独立した実験である。対応のない両側スチューデントのｔ検定。１Ｃ．８日目から１１日目までのヒトｉＰＳＣ由来の前部および後部オルガノイドミックスの追跡。上段：明視野。中段：赤のＳＯＸ２、緑のＰＤＸ１、青のＣＤＸ２、白のＤＡＰＩのホールマウント免疫染色。下段：青のＣＤＸ２、緑のＨＨＥＸ、赤のＰＤＸ１、白のＤＡＰＩのホールマウント免疫染色。矢印：ＰＤＸ１およびＨＨＥＸ陽性領域。１Ｄ．ＰＤＸ１について染色された境界オルガノイド免疫蛍光の各領域で検出されたＰＤＸ１陽性細胞の頻度。１Ｅ．各境界オルガノイドにおけるＰＤＸ１陽性細胞の位置。Ｙ軸は、ＤＡＰＩ染色された全細胞数と比較した各領域のＰＤＸ１陽性細胞のパーセンテージを示した。ｆ．１１日目における種々の組み合わせである、前部－後部（ＡＰ）（ｎ＝４）、前部－前部（ＡＡ）（ｎ＝３）、および後部－後部（ＰＰ）（ｎ＝３）の融合オルガノイドのＨＨＥＸおよびＰＤＸ１陽性細胞のパーセンテージ。Ｙ軸は、ＤＡＰＩ染色された全細胞数と比較した陽性細胞のパーセンテージを示した。データは平均±ｓｄである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；一元配置分散分析。ｇ．８日目（Ｄ８）～１２日目（Ｄ１２）までの時間経過に伴う境界オルガノイドのトランスクリプトーム特徴付け。前部（Ａ）、境界（Ｂ）、および後部（Ｐ）ドメインを解剖し、分離し、左の代表的な画像に示すようにＲＮＡ配列決定に適用した（前腸スフェロイドをＧＦＰで標識し、後腸スフェロイドをＲＦＰで標識した）。前部、境界、および後部のドメインは、それぞれ報告された３１，３２、前部前腸、肝／胆／膵原基、および中腸／後腸のマーカーの遺伝子セットの濃縮を示した。スケールバーは、５０μｍ（１Ｂ）、１００μｍ（１Ｃ）、５０μｍ（１Ｇ）。
【図2A-2I】誘導因子なしでの境界オルガノイドからの肝胆膵前駆体の自己出現。２Ａ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集系によるＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター系の生成。２Ｂ．９日目～１１日目の確立されたＰＲＯＸ１レポーターｉＰＳＣにおけるＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現。２Ｃ．各オルガノイドのＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性面積。ＡＰ、ＡＡ、およびＰＰの組み合わせを評価した。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を、ＡＰ組み合わせの境界オルガノイドの細胞膜で確認した。２Ｄ．マウス肝原基外植片（Ｐｒｏｘ１：：ＧＦＰ）およびヒトｉＰＳＣ由来境界オルガノイド（ＰＲＯＸ１：：ｍ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）における肝陥入。２Ｅ．１３日目のＥ８．７５マウス胚および境界オルガノイドにおけるＰＲＯＸ１の免疫染色。２Ｆ．境界オルガノイドのトランスクリプトーム特徴付け。前部、境界、および後部ドメインを解剖し、分離し、ＲＮＡ配列決定に適用した。ヒートマップは、ＧＯタームカテゴリおよびＫＥＧＧ経路カテゴリから選択されるＦＧＦ、ＢＭＰ、ヘッジホッグ、ＮＯＴＣＨ、およびＲＡシグナル経路に関連する下流の遺伝子発現を示す。ヒートマップは、偏りのない階層的クラスタリングによって８つの詳細な群（Ｃ１～Ｃ８）に分離した。Ｂで高度に発現された遺伝子の独特な発現パターンを示したＣ６は、その他と比較してＲＡ下流遺伝子セットの濃縮を示した。２Ｇ．レチノイン酸、ＢＭＳ４９３、Ｒ－７５２５１、またはＷＩＮ１８４４６の３日間培養による１１日目のＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、ＳＯＸ２、およびＣＤＸ２の遺伝子発現。２Ｈ．元の前腸または後腸スフェロイドからの上皮または間葉細胞におけるＲＡシグナル経路関連遺伝子についての遺伝子発現分析。各腸スフェロイドを、ＲＦＰまたはＧＦＰ標識ｉＰＳＣを使用して区別し、境界形成後に単一細胞に解離させた。前部／後部の分離を、ＲＦＰまたはＧＦＰ発現によって実施し、一方、上皮／間葉分離を、ＥｐＣＡＭ発現によって実施した。２Ｉ．移植された境界オルガノイドのデフォルトの発達能力。中央のパネルは、Ｈ&Ｅ染色および免疫組織化学分析を示し、一方、右のパネルは免疫蛍光分析を示す。スケールバー、５０μｍ（２Ｂ）、２００μｍ（２Ｄ）、１００μｍ（２Ｅ）、１００μｍ（２Ｉ）。
【図3A-3O】ヒト肝胆膵器官形成のモデリング。３Ａ．ＨＢＰオルガノイドからのＰＲＯＸ１陽性領域の解剖の図および解剖前後の画像。３Ｂ．１）浮遊、２）Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に包埋、３）Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に包埋、１３日目からＴｒａｎｓｗｅｌｌで培養、４）解剖、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に包埋、１３日目からＴｒａｎｓｗｅｌｌで培養した、培養系の最適化。左のパネルは、陥入または分岐オルガノイドの分類を示す。３Ｃ．１３日目から２日間の境界オルガノイドの形態形成。３Ｄ．３０日間の気液界面培養系による境界オルガノイドからのＰＲＯＸ１解剖組織の形態形成的変化。３Ｅ．３７日目のオルガノイドの立体顕微鏡画像。３Ｆ．境界オルガノイドは、培養マウスＥ１０．５由来の肝胆膵と同様に、推定膵ドメインに分岐したｔｄＴｏｍａｔｏ発現肝胆組織を有する。左：４日間培養したマウス胚性組織、右：９０日目のＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳＣ。３Ｇ．右：腸に結合された陥入肝、胆管、膵の図。左：９０日目の境界組織のＨ&Ｅ。３Ｈ～３Ｉ．ＣＫ１９、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ９およびＮＧＮ３、およびアルファ－ＳＭＡおよびＳＯＸ１７（３Ｈ）およびＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、およびアルファ－ＳＭＡ（３Ｉ）の組み合わせについての免疫染色。３Ｊ、３Ｋ．ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＧＡＴＡ４、ＤＢＡ、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１（３Ｋ）のホールマウント染色。３Ｌ～３Ｎ．ＮＫＸ６．１およびＨＮＦ１Ｂ（３Ｌ）、アミラーゼおよびＧＡＴＡ４（３Ｍ）、ならびにアミラーゼおよびＣＣＫＡＲ（３Ｎ）の免疫染色。３Ｏ．推定胆構造におけるＣＣＫ処理応答。３Ｐ．ホルモンは、外分泌膵ドメインの分泌機能を誘導した。ＣＣＫ３日前後の境界組織におけるアミラーゼの酵素結合免疫吸着検定。スケールバー、１００μｍ（ａ）、１００μｍ（３Ｂ）、１００μｍ（３Ｃ）、２００μｍ（３Ｄ）、１ｍｍ（３Ｅ）、２００μｍ（３Ｆ）、２００μｍ（３Ｇ）、２００μｍ（３Ｈ）、２００μｍ（３Ｉ）、２００μｍ（３Ｊ）、１００μｍ（３Ｋ'）、２００μｍ（３Ｌ）、１００μｍ（３Ｍ）、５００μｍ（３Ｎ）、５０μｍ（３Ｏ）。
【図4A-4J】ＨＢＰオルガノイドにおけるＨＥＳ１媒介器官分離誤差のモデル化。４Ａ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によるＨＥＳ１ノックアウト（ＫＯ）系の遺伝子標的戦略。４Ｂ．ＷＴおよびＨＥＳ１ＫＯの改変遺伝子配列の確認（Ｄｅｌ＃１１）。４Ｃ．ＨＥＳ１－／－ｉＰＳＣ培養の写真。４Ｄ．２０日目のＨＥＳ１ＫＯｉＰＳＣ由来境界オルガノイドにおけるＨＥＳ１の遺伝子発現。４Ｅ．ＳＯＸ２、ＣＤＸ２、ＰＤＸ１およびＨＨＥＳのホールマウント免疫染色によるＨＥＳ１－／－ｉＰＳ系からの境界オルガノイド形成の確認。肝胆膵前駆体スペシフィケーションは、ＨＥＳ１変異の存在下でも保存された。４Ｆ．１１日目にＨＥＳ１＋／＋およびＨＥＳ１－／－から生成された前部および後部境界スフェロイドにおけるＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現。４Ｇ．ＨＥＳ１＋／＋およびＨＥＳ１－／－ＨＢＰオルガノイドの２２日目の膵関連マーカーのＲＮＡｓｅｑ。４Ｈ．ＨＥＳ１＋／＋、ＨＥＳ１－／－オルガノイド、およびヒト成人膵組織におけるＧＣＧ、ＮＥＵＲＯＧ３、ＩＮＳ、およびＮＫＸ２－２の遺伝子発現。４Ｉ．ＨＥＳ１＋／＋およびＨＥＳ１－／－の境界組織の肉眼的観察。４Ｊ．ＤＢＡおよびＰＤＸ１についてのホールマウント免疫染色は、ＨＥＳ１ＫＯオルガノイドにおけるＰＤＸ１発現の増強およびＤＢＡ染色面積の減少を示す。スケールバー、５００μｍ（４Ｃ）、２００μｍ（４Ｅ）、１００μｍ（４Ｆ）、５００μｍ（４Ｉ）、５００μｍ（４Ｊ）。
【図5】前腸および後腸細胞の特徴付け。ＴｋＤＡヒトｉＰＳＣおよび７２＿３ヒトｉＰＳＣを使用する７日目の前腸および後腸細胞におけるＥｐＣＡＭのフローサイトメトリー。
【図6A-6B】境界オルガノイド形成の再現性。６Ａ．１１日目境界オルガノイドの画像。前腸および後腸スフェロイドを、Ｈ１ＥＳＣまたは１３８３Ｄ６ｉＰＳＣから分化させ、ミックスし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内に移送した。スケールバーは２００μｍである。６Ｂ．Ｈ１ＥＳＣから誘導された境界スフェロイドにおけるＣＤＸ２、上皮マーカーＥＣＡＤ、およびＨＨＥＸの免疫蛍光染色。６Ｃ．７２＿３ｉＰＳから誘導された境界スフェロイドにおけるＰＤＸ１、ＣＤＸ２、ＦＯＸＦ１、およびＨＨＥＸの免疫蛍光染色。
【図7A-7B】細胞間接触依存性ＨＢＰ遺伝子誘導。７Ａ．前腸および後腸スフェロイドを８日目にミックスし、翌日９日目に融合させ、培養し、１２日目に定量ＲＴ－ＰＣＲのために収集した。融合していないスフェロイドも、１２日目に比較のために収集した。７Ｂ．融合、非融合、後腸スフェロイド（８日目）、およびｉＰＳ細胞の条件でのＰＤＸ１およびＨＨＥＸ遺伝子発現。
【図8】種々の前腸および後腸の組み合わせの比較。１２日目でのＡＰ、ＡＡ、およびＰＰスフェロイドの組み合わせにおけるＣＤＸ２、ＨＨＥＸ、およびＰＤＸ１の免疫蛍光染色。スケールバーは２００μｍである。
【図9A-9C】ＨＢＰ前駆体は、後腸細胞から発達する。９Ａ．非標識ｉＰＳ細胞は、前腸スフェロイドに分化し、一方、ＡＡＶＳ１－ＧＦＰ標識ｉＰＳ細胞は、後腸スフェロイドに分化した。上列は、境界オルガノイド形成中の明視野およびＧＦＰ蛍光画像を示した。下列は、１３日目のＨＨＥＸおよびＰＤＸ１のホールマウント免疫染色を示した。ＨＨＥＸ発現は、ＧＦＰ発現と重複した。スケールバーは２００μｍである。９Ｂ．Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ標識および非標識ＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳＣは、それぞれ前腸および後腸スフェロイドに分化した。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現は、非標識の元の後腸スフェロイドでのみで検出された。スケールバーは２００μｍである。９Ｃ．非標識ｉＰＳＣおよびＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳＣを使用して、前腸および後腸スフェロイドを区別した。レポーター細胞誘導前部および非標識細胞後部（左列）、または非標識細胞由来前部およびレポーター細胞由来後腸スフェロイド（右列）の２つの組み合わせを、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現によって調べた。上段：明視野画像、下段：ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光画像。スケールバーは２００μｍである。
【図10】後腸特異的ＢＭＳ４９３におけるＨＨＥＸおよびＰＤＸ１誘導の廃止。ＢＭＳ４９３で前処理した前腸または後腸スフェロイドを融合させて、ＨＢＰアンレージ形成を誘導した。未処理の対照群と比較して、ＢＭＳ４９３で前処理した後腸スフェロイドの群は、境界でＨＨＥＸおよびＰＤＸ１発現を阻害し、このことは、後部側のレチノイン酸受容体機能がＨＢＰ境界オルガノイドを確立するために重要であったことを示唆した。スケールバー：２００μｍ
【図11A-11B】Ｅ９．０ＰＲＯＸ１：：ＧＦＰレポーターマウス胚外植片培養でのＢＭＳ４９３曝露によるＰＲＯＸ１阻害。胚発生日の９．０Ｐｒｏｘ１－ＧＦＰ全胚を、回転型ボトル培養系で２４時間培養した。レチノイン酸受容体拮抗薬ＢＭＳ４９３処置群を、対照（ＤＭＳＯ添加）群と比較した。１１Ａ．培養後の胚の明視野画像およびＧＦＰ蛍光画像。１１Ｂ．ＧＦＰ発現部分の面積を、（ａ）のＧＦＰ画像から定量した。スケールバー：１ｍｍ
【図12】インビトロ培養系の最適化。図３Ａ～３Ｃでは、種々の培養フォーマットを、ＰＲＯＸ１陽性ＨＢＰ前駆体領域の陥入および分岐形態形成などの形態学的変化を増強するために比較した。７日目に、２４時間培養した後、前腸および後腸スフェロイドをミックスして結合させた。結合されたスフェロイドを、Ｍａｔｒｉｇｅｌドロップまたは低結合培養プレートに移送し、ＨＢＰ前駆体の出現中の非浮遊および浮遊条件の間で比較した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ包埋群のオルガノイドは、１１日目にｔｄＴｏｍａｔｏを発現し始めた。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性領域を、蛍光発現に従う顕微鏡下で、手で解剖し、再びＭａｔｒｉｇｅｌドロップまたはＴｒａｎｓｗｅｌｌに移送し、培地中の種々の作動剤および拮抗剤からの効果を比較した。
【図13】オルガノイドのサイズ、ＰＲＯＸ１陽性面積、分岐、および陥入の比較。ＡＰの組み合わせのみが、オルガノイドおよびＰＲＯＸ１発現領域のサイズを増加させた。さらに、ＡＰの組み合わせは、分岐および陥入を有するスフェロイドを示したが、一方、他の２つの組み合わせは示さなかった。スケールバー：５００μｍ
【図14】ＨＢＰオルガノイドの後部領域からは、分岐および陥入しなかった。ＨＢＰオルガノイドはＰｒｏｘ１発現分岐構造を形成したが、一方、ＰＤＸ１発現を含むＨＢＰの後部領域はその構造を形成しなかった。スケールバーは２００μｍである。
【図15A-15C】ＨＢＰオルガノイドにおける器官ドメイン特異的マーカーの発現。１５Ａ．３０日目のＡＦＰ、アルブミン、およびＨＨＥＸの免疫蛍光染色。ＡＦＰおよびアルブミンは同じ領域に発現したが、ＨＨＥＸは発現しなかった。ＨＨＥＸは、後の段階で発現が消失する肝細胞前駆体マーカーであった。１５Ｂ．ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ６．３およびＰＤＸ１の免疫蛍光染色。ＮＫｘ６．３は、膵マーカーＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１発現の領域で発現した。１５Ｃ．ＥｐＣＡＭ、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ９、およびＣＬＦの免疫蛍光染色。スケールバー：１００μｍ
【図17】長期培養オルガノイドの結合構造。ＨＥＳ１－／－およびＨＥＳ１＋／＋オルガノイドにおけるＤＢＡおよびＳＯＸ９のホールマウント染色。ＤＢＡおよびＳＯＸ９は、ＨＥＳ１－／－オルガノイドで消失した。スケールバー：２００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【0006】
定義
特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用し得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用し得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0007】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者などに知られている１つ以上の用量およびその均等物への言及を含む。
【0008】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本願および特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【0009】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉（ＤＥ）細胞」という用語は、原腸陥入のプロセスによって生産される３つの主要な胚葉のうちの１つを意味する。
【0010】
本明細書で使用される場合、「ｗｎｔシグナル伝達経路」という用語は、ｗｎｔ／ベータカテニン経路を意味し、ベータカテニンタンパク質を介して作用するＷｎｔリガンドおよびフリッツルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）細胞表面受容体によって媒介されるシグナル伝達経路である。
【0011】
本明細書で使用される場合、「ｗｎｔ経路」などの経路に関する「活性化剤」という用語は、Ｗｎｔ／ベータカテニン標的が増加するようにＷｎｔ／ベータカテニン経路を活性化する物質を意味する。
【0012】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤」という用語は、ＦＧＦ標的が増加するようにＦＧＦ経路を活性化する物質を意味する。
【0013】
本明細書で使用される場合、「ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤」という用語は、ＢＭＰ経路を干渉し、ＢＭＰ標的を減少させる物質である。
【0014】
本明細書で使用される場合、「成長因子」という用語は、成長、増殖、形態形成または分化を含むがこれらに限定されない細胞プロセスを刺激することができる物質を意味する。
【0015】
本明細書で使用される場合、マーカーの「安定した発現」という用語は、成長環境の改変時に変化しない発現を意味する。
【0016】
本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）という用語は、胚性および胚外細胞型に分化することができる幹細胞である。そのような細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は、卵子および精子細胞の融合から生産される。受精卵の最初の数分割によって生産される細胞も全能性である。
【0017】
本明細書で使用される場合、一般にＰＳ細胞としても知られる「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、ほぼすべての細胞、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかから誘導される細胞に分化することができる任意の細胞を包含する。ＰＳＣは、胚（胚性生殖細胞を含む）から誘導される、または特定の遺伝子の発現を強制することによって成体体細胞などの非多能性細胞の誘導を通じて取得される全能性細胞の子孫であることができる。
【0018】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、成体体細胞などの、通常は非多能性細胞から人工的に誘導される一種の多能性幹細胞を言及する。
【0019】
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、本明細書に記載の方法で使用することができる任意の細胞を包含し、それを通じて、１つ以上の前駆細胞は、それ自体を再生するか、１つ以上の専門化された細胞型に分化する能力を獲得する。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性であるか、または多能性になる能力を有する。いくつかの態様において、前駆細胞は、外部因子（例えば、成長因子）の処理の対象となり、多能性を獲得する。いくつかの態様において、前駆細胞は、全能性幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞（誘導または非誘導性）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、および単能性幹細胞であることができる。いくつかの態様において、前駆細胞を、胚、乳児、子供、または成人から形成することができる。いくつかの態様において、前駆細胞は、遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して多能性が付与されるような処理の対象となる体細胞であることができる。
【0020】
発生生物学では、細胞分化は、より専門化されていない細胞がより専門化された細胞型になるプロセスである。本明細書で使用される場合、「有向分化」という用語は、より専門化されていない細胞が特定の専門化された標的細胞型になるプロセスを記載する。専門化された標的細胞型の特殊性を、最初の細胞の運命を定義または変更するために使用することができる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法には、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、および核酸処理が含まれるが、これらに限定されない。
【0021】
本明細書には、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」または「ＨＢＰオルガノイド」）組成物が開示される。開示されるＨＢＰＯ組成物は、いくつかの態様において、肝組織機能、胆組織機能、外分泌膵機能、および内分泌膵組織機能から選択される２つ以上の機能を有し得る。一態様において、本明細書に開示されるＨＢＰＯは、交換可能に「多器官三次元オルガノイド」と言及され得、前部領域、後部領域、および境界領域を含み得る。一態様において、境界領域は、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）および造血的に発現されるホメオボックスタンパク質（ＨＨＥＸ）を発現し得る。一態様において、ＨＢＰＯは、胆管組織および膵組織を含み得る。一態様において、胆管組織および膵組織は、ＨＢＰＯにおいて結合され得る。一態様において、ＨＢＰＯは、肝細胞、膵細胞、胆管細胞、および腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）細胞を含み得る。
【0022】
一態様において、ＨＢＰＯは、内皮細胞、間葉細胞、または内皮細胞および間葉細胞の両方を含み得る。ＨＢＰＯは、特定の態様において、内胚葉および中胚葉を含み得る。
【0023】
開示されるＨＢＰＯは、例えば、本明細書の対応する図に示されるように、分岐構造によって特徴付けられ得る。
【0024】
一態様において、本明細書に開示されるＨＢＰＯは、機能性外分泌マーカーの発現によって特徴付けられ得る。一態様において、マーカーはアミラーゼであり得る。一態様において、マーカーは、内分泌マーカー、例えば、インスリンであり得る。
【0025】
特定の態様において、本明細書に開示されるＨＢＰＯは、外因的に投与される薬剤に対する機能性応答によって特徴付けられ得る。例えば、一態様において、ＨＢＰＯは、コレシストキニン（ＣＣＫ）との接触に応答してアミラーゼを分泌し得る。
【0026】
特定の態様において、開示されるＨＢＰＯは、ＨＢＰＯが、粘膜下腺、移行帯、血管系、免疫細胞、または粘膜下層のうちの１つ以上を実質的に含み得ない点によって特徴付けられ得る。このような特徴は、三次元オルガノイド構造を、ヒトまたは他の哺乳動物に内因的に見られる天然組織の構造と区別する。
【0027】
一態様において、ＨＢＰＯを、上記で定義された１つ以上の前駆細胞、例えば、個体から取得されるｉＰＳＣの拡張によって取得する。
【0028】
本明細書には、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」または「ＨＢＰオルガノイド」）を作製する方法も開示される。この態様において、この方法は、第１の胚体内胚葉を、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤、およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と接触させて、前腸スフェロイドを形成させることと、第２の胚体内胚葉をＷｎｔシグナル伝達経路活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、後腸スフェロイドを形成させることと、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドが融合して前腸と中腸の境界を有する境界オルガノイドを形成するまで、前腸スフェロイドを後腸スフェロイドと接触させることと、前腸と中腸の境界を有する境界オルガノイドを培養してＨＢＰＯを形成させることとを含み得、ＨＢＰＯは胆組織および膵組織を含む。（例えば、図１２を参照）一態様において、開示される方法は、肝組織、膵組織、胆管組織、および腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）組織を含み得るＨＢＰＯの生産を可能とし得る。
【0029】
本明細書で使用される場合、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」または「ＨＢＰオルガノイド」）という用語は、一般に、多器官ドメイン（肝、胆および膵器官ドメイン）が分離される段階のオルガノイドを言及し、通常３０日目頃に発生する。「境界オルガノイド」という用語に関して、これは、まだ組織スペシフィケーションを有しないオルガノイド組成物を含む、７日目の後のオルガノイドを含み得る。
【0030】
一態様において、前腸スフェロイドは、ＳＲＹボックス２（ＳＯＸ２）を発現する細胞を含み得る。一態様において、前腸スフェロイドは、ＳＲＹボックス２（ＳＯＸ２）の発現によって特徴付けられ得る。一態様において、前腸スフェロイドは、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）発現細胞を実質的に含み得ない。一態様において、後腸スフェロイドは、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）を発現する細胞を含む。一態様において、後腸スフェロイドは、ＣＤＸ２を発現し得る。一態様において、後腸スフェロイドは、Ｃａｕｄａｌ型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）発現によって特徴付けられ得る。一態様において、後腸スフェロイドは、Ｃａｕｄａｌ型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）を発現する細胞を含み得る。一態様において、ＨＢＰＯは、膵および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）を発現する細胞、造血的に発現されるメオボックスタンパク質（ＨＨＥＸ）を発現する細胞、およびプロスペロ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）を発現する細胞を含み得る。一態様において、融合した前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドは、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２、ＨＨＥＸ、およびＰＤＸ１の発現によって特徴付けられる胆膵原基を含み得、ＰＤＸ１発現は、融合した前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドの境界領域に局在する。
【0031】
一態様において、ＨＢＰＯを、形態形成因子、好ましくは、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの基底膜マトリックス内に包埋し得る。この方法は、ＰＲＯＸ１陽性領域をＨＢＰＯから切除し、切除されたＨＢＰＯを培養して、陥入上皮および分岐構造を形成させることをさらに含み得る。
【0032】
一態様において、ＨＢＰＯを、例えば、本明細書に開示される方法を使用して、回転培養し得る。
【0033】
一態様において、開示される方法を使用して、本明細書に記載のＨＢＰＯ、特に内胚葉および中胚葉を含むＨＢＰＯを取得し得る。
【0034】
一態様において、胚体内胚葉は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、および後腸細胞から選択される前駆細胞、好ましくは多能性幹細胞から誘導される胚体内胚葉、より好ましくは胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞から誘導される胚体内胚葉から誘導し得る。
【0035】
一態様において、胚体内胚葉を、多能性幹細胞を、成長因子のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのＢＭＰサブグループであるＡｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子と接触させることから誘導し得る。
【0036】
一態様において、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤を、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫβ阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、すなわち「ＣＨＩＲＯＮ」）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ－２１６７６３、リチウム、ヤマアラシ阻害剤ＩＷＰ、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ－３１６６０６、ベータカテニン活性化剤ＤＣＡからなる群から選択される１つ以上の分子から選択し得る。
【0037】
一態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤を、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、およびそれらの組み合わせ、好ましくはＦＧＦ４またはＦＧＦ１０、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子から選択し得る。
【0038】
一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ－１、およびそれらの組み合わせから選択し得、好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＮｏｇｇｉｎである。
【0039】
一態様において、開示される方法を、インビトロで実施し得る。特定の態様において、この方法の少なくとも１つの工程を、固体支持体上で実行し得る。例えば、固体支持体を、コラーゲン、基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、またはそれらの組み合わせから選択し得る。
【0040】
一態様において、内皮を有するＨＢＰＯを作製するための方法が開示される。この態様において、この方法は、ＨＢＰＯを、人工多能性幹細胞から誘導される内皮細胞と、本明細書に開示される方法に従って培養する工程を含み得る。内皮細胞を、ＨＢＰＯと培養する前に、内皮細胞（ＥＣ）スフェロイドに形成し得る。例えば、内皮細胞（ＥＣ）分化のために、ヒトｉＰＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して解離させ、Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を使用したＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）で種々の最適密度（細胞株に依存する）でＬａｍｉｎｉｎ ５１１ Ｅ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（商標），Ｎｉｐｐｉ，Ｉｎｃ．によって提供される）にプレートし得る。翌日から、Ｂ２７培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）と１％Ｇｌｕｔａｍａｘの１：１混合物および１％Ｂ２７（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＷｎｔ活性化剤および骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を有するプライミング培地を３日間使用して、最初に中胚葉に分化させ得る。次に、プライミング培地を、ＥＣ誘導培地である、ＶＥＧＦおよびフォルスコリンを補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に交換し得る。誘導培地を毎日更新し得る。分化の７日目に、ＥＣを解離させ、ＦＡＣＳ分析の対象とする。ｉＰＳＣ由来ＥＣは、ＣＤ１４４とＣＤ３１の接合部局在化を伴う典型的な内皮形態を示すはずである。ＥＣを、ＶＥＧＦ－Ａを補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４ＳＦＭからなるＥＣ拡張培地に、５０，０００細胞ｃｍ－２の密度でフィブロネクチンをコーティングした皿に再プレートし得る。ＥＣ拡張培地を、１日おきに交換し得る。分化したＥＣを単一細胞に解離させ、本明細書に記載される、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドのスフェロイド形成プロトコルを使用してスフェロイドに形成し得る。次に、ＥＣを、腸成長培地中９６ウェル丸底超低付着プレート上で、融合した前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドと２４時間ミックスして、融合されたＥＣスフェロイド、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドを形成し得る。
【0041】
一態様において、間葉を有するＨＢＰＯを作製するための方法が開示される。この態様において、この方法は、ＨＢＰＯを、人工多能性幹細胞から誘導される間葉細胞と、本明細書に開示される方法に従って培養する工程を含み得る。間葉細胞を、ＨＢＰＯと培養する前に、間葉細胞（ＭＣ）スフェロイドに形成し得る。開示される多器官三次元オルガノイドおよび間葉細胞または間葉スフェロイドを一緒に培養して、多器官三次元オルガノイドの成長および成熟を改善し得る。例えば、間葉（ＭＳＣ）分化のために、ヒトｉＰＳＣを中胚葉に分化させ得る。次に、中胚葉細胞を、３日間追加のＡｃｔｉｖｉｎ ＡおよびＰＤＧＦＢＢに曝露し得る。次に、分化したＭＳＣを、単一細胞に解離させ、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドのスフェロイド形成プロトコルを使用してスフェロイドに形成し得る。次に、ＭＳＣスフェロイドを、腸成長培地中９６ウェル丸底超低付着プレート上で、融合した前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドと２４時間ミックスして、融合されたＭＳＣスフェロイド、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドを形成し得る。
【0042】
一態様において、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」）を作製する方法が開示され、この方法は、前腸細胞から前腸スフェロイドを誘導し、後腸細胞から後腸スフェロイドを誘導して、境界オルガノイドを作製することと、境界オルガノイドを腸成長培地で培養してＨＢＰＯを作製することとを含み得る。一態様において、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」）を作製する方法は、前腸細胞および後腸細胞から、前腸スフェロイドを誘導し、後腸スフェロイドを誘導して、誘導因子の非存在下でＨＢＰＯを作製することと、腸成長培地で境界オルガノイドを培養して、ＨＢＰＯを作製することとを含み得る。
【0043】
「誘導因子」とは、分化を指示するために使用される因子、例えば、レチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）、０．１μＭ デキサメタゾン（Ｄｅｘ；Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬ 肝細胞分化のためのオンコスタチンＭ（ＯＳＭ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を意味する。他の多くの誘導因子は、膵および胆についても知られており、当業者によって容易に理解されるであろう。
【0044】
一態様において、肝胆膵オルガノイド（「ＨＢＰＯ」）を作製する方法が開示され、この方法は、腸成長培地中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化された胚体内胚葉（ＤＥ）を培養して、前腸細胞および後腸細胞を作製することと、前腸細胞から前腸スフェロイドを、後腸細胞から後腸スフェロイドを作製し、誘導因子の非存在下で境界オルガノイドを作製することと、（ｉｉｉ）境界オルガノイドを腸成長培地で培養して、ＨＢＰＯを作製することとを含み得る。一態様において、腸成長培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地であり得る。一態様において、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２であり得る。一態様において、成長培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ'ｓ Ｆ－１２）という、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の補充を減らした哺乳動物細胞の培養を可能にする広く使用される基本培地であり、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／１２６３４０１０で入手可能であり、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、Ｎ２、およびＢ２７が添加される。一態様において、この培地は、以下のサイトカイン、すなわちＮｏｇｇｉｎ（ＢＭＰ阻害剤）、ＣＨＩＲ（ＷＮＴ活性化剤）、前腸細胞のためのＦＧＦ４、後腸細胞のためのＣＨＩＲおよびＦＧＦ４（Ｎｏｇｇｉｎなし）の、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭへの添加を含み得る。
【0045】
一態様において、ＨＢＰＯを製造するための機械が本明細書に開示される。この機械は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の存在下または非存在下での、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤を含む腸成長培地、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む腸成長培地を含み得る。
【0046】
一態様において、ＨＢＰＯの生産のための複数の培養培地の使用が開示され、複数の培養培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤、任意選択で、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含む腸成長培地と、ＲＯＣＫ阻害剤を含む腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）成長培地とを含む。
【0047】
一態様において、ＨＢＰＯを、ＨＢＰＯの成長および成熟を増加させるために、ある期間、非ヒト哺乳動物などの哺乳動物に移植し得る。一態様において、ＨＢＰＯを、器官機能不全を救済するために、例えば、それを必要とする個体に移植し得る。一例において、インビトロで生成されたＨＢＰＯを収集し、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの腎臓または小腸の腸間膜の肩甲下部位に移植し得る。オルガノイドの成長の増加を、移植後８週間で観察し得る。生存率および成長を、ヒト－Ａｌｂ、ヒト－Ｃ－ペプチドレベルなどの血液検査に基づいて監視することができる。
【0048】
一態様において、本明細書に記載のＨＢＰＯを移植することを含む、個体を処置する方法が開示される。この態様において、本明細書で使用される方法のいずれかに従って生産されたオルガノイドを、当技術分野で知られている標準的な外科的処置を使用して、それを必要とする個体に移植し得る。一態様において、個体は、肝不全および先天性肝疾患などの肝疾患、糖尿病などの膵疾患、または胆疾患から選択される病状を有し得る。
【0049】
一態様において、胆炎症性疾患および／または膵炎などの膵炎症性疾患から選択される１つ以上の病状の処置を同定する方法が開示される。この態様において、開示されるオルガノイド組成物を、対象の潜在的な治療剤と、本明細書に開示されるオルガノイド組成物と接触し得る。次に、器官活性の測定値を、オルガノイドで検出し得る。この検出の出力に基づいて、対象の潜在的な治療剤が病状の測定値を改善するか否かを決定し得、それによって、ＨＢＰＯで具体化された組織のいずれかの機能不全に関与する病状を処置することに有用である可能性がある治療剤を同定するために使用し得る。
【0050】
胚性細胞から誘導される多能性幹細胞
いくつかの態様において、１つの工程は、多能性であるか、または多能性になるように誘導されることができる幹細胞を取得することを含み得る。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞から誘導され、これは次に、初期哺乳動物胚の全能性細胞から誘導され、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊から誘導される多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は、当技術分野でよく知られている。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な実施形態で使用されるが、本明細書に記載の方法および系は、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解される。
いくつかの態様において、１つの工程は、多能性であるか、または多能性になるように誘導されることができる幹細胞を取得することを含み得る。いくつかの態様において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞から誘導され、これは次に、初期哺乳動物胚の全能性細胞から誘導され、インビトロで無制限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊から誘導される多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は、当技術分野でよく知られている。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９－ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な実施形態で使用されるが、本明細書に記載の方法および系は、任意の幹細胞に適用可能であることが当業者によって理解される。
【0051】
本発明による実施形態で使用することができる追加の幹細胞には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＮＳＣＢ）、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｉ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＩＳＣ ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＷ－ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）のＴｅｃｈｎｉｏｎ、およびＰｒｉｎｃｅｔｏｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって主宰されるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄａｔａｂａｓｅによって主宰されるデータベースによって提供されるか、記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。本発明による実施形態で使用することができる例示的な胚性幹細胞には、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ－１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ－２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ－３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ－４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ－５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ－６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ－０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ－０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ－０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）が含まれるが、これらに限定されない。胚性幹細胞の詳細は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９１）：１１４５－１１４７、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３３：１５２６－１５３０、Ｍａｒｔｉｎ １９８０，"Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，"．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９（４４５８）：７６８－７７６、Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ２９２（５８１９）：１５４－１５６、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００５，"Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ，"Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６３６－１６４１に見出され、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0052】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの態様において、ｉＰＳＣを、特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞などの非多能性細胞内へのトランスフェクションによって誘導する。トランスフェクションを、レトロウイルスなどのウイルスベクターを介して達成し得る。トランスフェクトされる遺伝子には、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることは示唆される。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、通常、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用される場合、ｉＰＳＣには、第１世代のｉＰＳＣ、マウスにおける第２世代のｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、レトロウイルス系を使用して、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを使用して、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の態様において、レンチウイルス系を使用して、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換する。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ－３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、ｉＰＳＣを、特定の幹細胞関連遺伝子の、成体線維芽細胞などの非多能性細胞内へのトランスフェクションによって誘導する。トランスフェクションを、レトロウイルスなどのウイルスベクターを介して達成し得る。トランスフェクトされる遺伝子には、マスター転写調節因子Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることは示唆される。３～４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞は、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と同様になり始め、通常、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質性選択によって単離される。本明細書で使用される場合、ｉＰＳＣには、第１世代のｉＰＳＣ、マウスにおける第２世代のｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、レトロウイルス系を使用して、４つの極めて重要な遺伝子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃを使用して、ヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に形質転換する。別の態様において、レンチウイルス系を使用して、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８で形質転換する。ｉＰＳＣで発現が誘導される遺伝子には、Ｏｃｔ－３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、およびＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーの特定のメンバー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ、およびＮ－ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、およびＬＩＮ２８が含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
いくつかの態様において、ウイルスに基づかない技術を使用して、ｉＰＳＣを生成する。いくつかの態様において、アデノウイルスを使用して、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚および肝細胞のＤＮＡ内に輸送し、胚性幹細胞と同一の細胞をもたらすことができる。アデノウイルスは、それ自身の遺伝子を標的の宿主と組み合わせないため、腫瘍を創出する危険性が排除される。いくつかの態様において、再プログラミングを、非常に低い効率ではあるが、ウイルストランスフェクション系を全く使用せずにプラスミドを介して達成することができる。他の態様において、タンパク質の直接送達を使用して、ｉＰＳＣを生成し、したがってウイルスまたは遺伝子修飾の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの生成は、同様の方法論を使用して可能である。ポリアルギニンアンカーを介して細胞に運ばれる特定のタンパク質による細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの態様において、多能性誘導遺伝子の発現をまた、体細胞を低酸素条件下にＦＧＦ２で処理することによって増加させることができる。
【0054】
胚性幹細胞の詳細については、例えば、Ｋａｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，"Ｖｉｒｕｓ ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７７１－７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，"ｐｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ４５８：７６６－７７０、Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４９－９５３、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００８，"Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３）：９４５－９４９、およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４（５）：３８１－３８４に見出すことができ、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0055】
いくつかの態様において、例示的なｉＰＳ細胞株には、ｉＰＳ－ＤＦ１９－９、ｉＰＳ－ＤＦ１９－９、ｉＰＳ－ＤＦ４－３、ｉＰＳ－ＤＦ６－９、ｉＰＳ（Ｆｏｒｅｓｋｉｎ）、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）、およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）が含まれるがこれに限定されない。
【0056】
ＤＥ発生に関連するシグナル伝達経路の機能の詳細については、例えば、Ｚｏｒｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，２００９，"Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：２２１－２５１、Ｄｅｓｓｉｍｏｚ ｅｔ ａｌ．，２００６，"ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｇｕｔ ｔｕｂｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，"Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １２３：４２－５５、ＭｃＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，"Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"１３４：２２０７－２２１７、Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７：１５６３－１５７２、ｄｅ Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０（７）：１３２２－１３３２に見出すことができ、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0057】
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を生産するための任意の方法は、本明細書に記載の方法に適用可能である。いくつかの態様において、多能性細胞を桑実胚から誘導する。いくつかの態様において、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞には、胚性幹細胞が含まれ得るが、これに限定されない。胚性幹細胞を、胚の内部細胞塊または胚の性腺隆起から誘導することができる。胚性幹細胞または生殖細胞を、ヒトを含む種々の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない種々の動物種から誘導することができる。いくつかの態様において、ヒト胚性幹細胞を使用して、胚体内胚葉を生産する。いくつかの態様において、ヒト胚性生殖細胞を使用して、胚体内胚葉を生産する。いくつかの態様において、ｉＰＳＣ細胞を使用して、胚体内胚葉を生産する。
【0058】
一態様において、胚体内胚葉を、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、および後腸細胞から選択される前駆細胞から誘導し得る。一態様において、胚体内胚葉を、多能性幹細胞から誘導し得る。一態様において、胚体内胚葉を、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞から誘導し得る。一態様において、ＤＥは、ＤＥ単層であり得、ＤＥ単層の９０％より多い細胞は、ＦＯＸＡ２およびＳＯＸ１７を共発現する。
【0059】
一態様において、胚体内胚葉を、多能性幹細胞を成長因子のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのＢＭＰサブグループであるＡｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ Ｂ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子と接触させることから誘導し得る。
【0060】
一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９、ＤＭＨ－１、およびそれらの組み合わせから選択し得る。一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎである。ＢＭＰ阻害剤は、約５０から約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。
【0061】
一態様において、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤を、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫβ阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、すなわち、「ＣＨＩＲＯＮ」）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ－２１６７６３、リチウム、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ－３１６６０６、ベータカテニン活性化剤ＤＣＡからなる群から選択される１つ以上の分子から選択し得る。Ｗｎｔ経路活性化剤の濃度は、例えば、約５０から約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で使用され得る。Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ経路を活性化する方法は多くある（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｕｓｓｅｌａｂ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｗｎｔ／を参照）。適切ないくつかの既存のｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤には、タンパク質に基づく活性化剤が含まれるがこれらに限定されず、これらには、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ８などが含まれるがこれらに限定されないＷｎｔリガンド、活性化Ｗｎｔフリッツルド受容体を含むがこれらに限定されないＷｎｔリガンド活性の修飾剤、（ＬＲＰ）共受容体、Ｒ－スポンジンタンパク質、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔリガンド分泌およびトラフィッキングの調節因子（Ｗｎｔｌｅｓｓ、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）、阻害性ベータカテニンデグレデーションＡＰＣおよびＧＳＫ３ベータ阻害、活性化ベータカテニン、構成的に活性なＴＣＦ／Ｌｅｆタンパク質、および化学活性化剤が含まれるがこれらに限定されず、これらには、Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達を活性化または阻害する２８種を超える既知の化学物質が含まれ得る。いくつかの活性化剤には、ＧＳＫ３－ベータ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲＯＮ）、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ－２１６７６３、リチウム、ＳＦＲＰ阻害剤ＷＡＹ－３１６６０６、ベータカテニン活性化剤ＤＣＡが含まれるが、これらに限定されない。
【0062】
一態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化剤は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、およびそれらの組み合わせ、好ましくはＦＧＦ４またはＦＧＦ１０、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の分子であり得る。一態様において、ＦＧＦ経路活性化剤の濃度は、約５０～約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で使用され得るが、当業者には種々の濃度が使用され得ることが理解されるであろう。ＦＧＦ受容体およびこの受容体の下流のシグナル伝達成分を刺激するタンパク質および化学物質は、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ＥＲＫタンパク質、およびそれらの活性を調節する化学物質を含む。ＦＧＦシグナル伝達を、Ｓｐｒｏｕｔｙタンパク質ファミリーメンバーに含まれるがこれらに限定されないＦＧＦシグナル伝達経路の阻害剤を阻害することによって活性化することができる。
【実施例】
【0063】
以下の非限定的な例は、本明細書に開示される本発明の実施形態をさらに説明するために提供される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが見出されたアプローチを表し、したがって、その実施のための様式の例を構成すると見なされ得ることを当業者は理解すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更をなし得、同様または類似の結果をなおも取得することを理解すべきである。
【0064】
器官形成は、複雑で相互に関連したプロセスであり、複数の境界組織の相互作用によって調整される１－７。しかし、現在のところ、個々の隣接する成分がどのように協調して統合された多器官構造を確立するかは不明である。本明細書には、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）の三次元培養から陥入する、肝、胆および膵構造の連続的なパターン形成および動的な形態形成が開示される。
【0065】
出願人は、ヒトＰＳＣから分化した前腸および後腸スフェロイド間の境界相互作用は、外因性因子の供給の非存在下で前腸と中腸の境界オルガノイドで特定される肝胆膵（ＨＢＰ）器官ドメインの自律的出現を可能にすることを見出した。移植由来組織は、中腸誘導体によって支配された一方、微小解剖されたＨＢＰオルガノイドの長期培養物は、分離された肝膵胆アンレージに発達し、マウスの外植された前腸と中腸の培養から誘導される組織を彷彿させる陥入および３つの異なり結合された組織構造間の分岐を含む初期形態形成事象の要約が続く。ＨＥＳ１の遺伝子変異によって誘導される多器官ドメインの誤分離は、インビボで見られる、培養に潜在する胆スペシフィケーションを廃止する８，９。出願人は、実験的多器官統合モデルが、前腸および中腸組織の並置によって確立されることができ、これがヒトにおける複雑な内胚葉器官形成の研究のための扱いやすく、操作可能で、容易にアクセスし得るモデルとして供し得ることを実証した。
【0066】
ＨＨＥＸ（造血的に発現されるホメオボックスタンパク質）およびＰＤＸ１（膵および十二指腸のホメオボックス１）発現によって境界が定められる肝胆膵（ＨＢＰ）アンレージは、最初に前腸と中腸の間の境界で特定され１０、原始腸から腹側に陥入する上皮小胞を形成する１１－１３。ＢＭＰＲ１Ａ（骨形態形成タンパク質受容体、１Ａ型）１、ＨＬＸ（Ｈ２．０様ホメオボックス）２、ＣＤＸ２（Ｃａｕｄａｌ型ホメオボックス２）３、ＮＫＸ３－２（ＮＫ３ホメオボックス２）４、ＨＨＥＸ５、ＰＤＸ１およびＳＯＸ９（ＳＲＹ－ボックス９）６などのこの領域周辺の境界を定義する遺伝子の破壊は、インビボで胃－ＨＢＰ－腸に沿ったバランスの取れた器官形成を大幅に変化させる１－７。ＨＢＰ系譜のその後の多様化は、後部肝芽細胞のＳＯＸ９を間接的に抑制することによって、それらの境界で隣接する間葉ＢＭＰによって媒介される可能性がある１４。したがって、隣接し（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）動的な器官形成は複雑な環境で発生し、連続し隣接する（ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ）組織の相互作用によって駆動される可能性がある５，６，１５。しかし、ＨＢＰ系のパターン形成およびバランスの取れた器官形成は、技術的な複雑さのために組織培養でうまくモデル化されておらず、このことは、詳細な機構研究を妨げる１６，１７。
【0067】
ここで、出願人は、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）を使用する三次元分化アプローチを使用して、内胚葉および中胚葉の両方で構成される決定的な領域的同一性を有する腸スフェロイドを特定した。出願人は、前部と後部の相互作用が、前腸（ＳＯＸ２、ＳＲＹ－ボックス２によってマークされる）および中腸（ＣＤＸ２によってマークされる）の境界をインビトロで再現し、ヒト肝胆膵系の相互調整されたスペシフィケーションおよび陥入をモデル化することを実証した。
【0068】
前腸と中腸の境界モデルを開発するために、出願人は最初に、以前に記載されたように１８，１９パターン形成された胚体内胚葉細胞を、前腸のためのＢＭＰ拮抗剤Ｎｏｇｇｉｎ存在下で、かつ後腸の同一性ためのＮｏｇｇｉｎの非存在下で、組換えタンパク質ＦＧＦ４および小分子ＣＨＩＲ９９０２１（ＷＮＴ経路を調節する）に曝露させた（図１Ａおよび図５）。７日目（Ｄ７）に、前腸または後腸の細胞を個別に凝集させて、前腸および中腸／後腸の転写因子ＳＯＸ２およびＣＤＸ２をそれぞれ優先的に発現するスフェロイドを形成させた（図１Ｂ）。出願人は次に、前腸スフェロイドに隣接する後腸スフェロイドを移送した。９日目に、２つのスフェロイドは、９４．８％のウェルで融合し、融合したスフェロイドを、形態形成因子、すなわちＭａｔｒｉｇｅｌに包埋した（図１ＡおよびＢ）。驚くべきことに、何らの外因性因子を追加することなく、ＨＢＰ原基は、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドの界面に出現し、マーカーＳＯＸ２、ＣＤＸ２、未成熟肝マーカーＨＨＥＸ、および洞、十二指腸、および膵前駆体マーカーＰＤＸ１を使用する、９日目、１０日目、および１１日目のスフェロイドのホールマウント染色によって証明されるとおりであった（図１Ｃ）。９日目に、前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドは、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１の発現を何ら示さなかった。１０日目に、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１発現が現れ、ＨＨＥＸは前部および後部（ｂＡＰ）オルガノイドの境界でのみ検出可能であった。ＰＤＸ１およびＨＨＥＸ陽性細胞の両方は、１１日目の境界領域で明確に増加した（図１Ｃ）。３つの追加の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）系の使用は、ｂＡＰオルガノイドの境界でＨＨＥＸおよびＰＤＸ１発現細胞を発生させる際の再現性を確認した（図６Ａ－６Ｃ）。ＨＢＰ前駆体の誘導は、前腸および後腸スフェロイドの間の細胞間接触を要する（図３Ａおよび図３Ｂ）。境界部位で検出されたすべてのＰＤＸ１陽性細胞（３０個の染色オルガノイドのうち３０個）（図１Ｄ）のうち、全細胞数あたりのＰＤＸ１陽性細胞のパーセンテージは、境界領域で５％、前部および後部領域でそれぞれ０および１％であった（図１Ｅ）。ＰＤＸ１発現細胞は、Ａ－Ｐオルガノイド、および後腸－後腸（Ｐ－Ｐ）スフェロイドの組み合わせで観察された。対照的に、ＨＨＥＸ陽性細胞は、Ａ－Ｐオルガノイドでのみ検出されたが、前部－前部（Ａ－Ａ）にもＰ－Ｐの組み合わせにも検出されなかった（図１Ｆおよび図８）。このことは、ＨＢＰ前駆体のバランスの取れた誘導がＡ－Ｐ融合に関与することを示す。
【0069】
ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１発現細胞の供給源を追跡するために、ｂＡＰオルガノイドを、非標識前腸およびＧＦＰ標識された後腸スフェロイドを使用して確立した。出願人は、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１発現の両方がＧＦＰと重複することを発見し、このことは、ＨＢＰ前駆体が後腸に起源することを示唆した（図９Ａ）。８日目、９日目、１１日目、および１２日目の微小解剖前部、境界、および後部領域のＲＮＡ配列決定は、１１日目および１２日目の境界組織が、ＨＢＰスペシフィケーションマーカーのアレイを徐々に発現するのに対し、一方、前部または後部領域が前腸または中／後腸の同一性をそれぞれ獲得したことを示した。（図１Ｇ）。注目すべきことに、Ａ－Ｐ組換え実験と一致して、後部組織は境界領域により近い同一性を有する（図１Ｇ）。まとめると、ＡＰ境界戦略は、外因性誘導因子の非存在下に、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１陽性ＨＢＰ前駆体の自律的パターン形成を調整する。
【0070】
出願人はさらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、肝、胆管、および膵の共通前駆体マーカーであるプロスペロ関連ホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）の下でｔｄＴｏｍａｔｏを視覚化することによって、それらの運命を追跡するレポーターヒトｉＰＳＣを確立した（図２Ａ）。ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１と同様に、ＰＲＯＸ１発現は、１０日目の境界で始まり、その後増加した（図２Ｂ）。ＰＲＯＸ１の出現は、Ａ－Ｐオルガノイドに特異的であったが、Ａ－ＡにもＰ－Ｐの組み合わせにも特異的ではなかった（図２Ｃ）。Ａ－Ｐ組換え検定は、ＰＲＯＸ１陽性細胞もまた後腸細胞から起源したことを示した（図９Ｂおよび９Ｃ）。気－液界面培養は、Ｅ８．７５Ｐｒｏｘ１：：ＥＧＦＰマウス胚性肝組織に見られるように、ＰＲＯＸ１陽性領域の追加の成長を誘導した（図２Ｄ）。ＰＲＯＸ１免疫染色は、ｂＡＰオルガノイドから誘導された形態学的に陥入した組織がＥ８．５－８．７５のマウスの境界領域と類似したことを確認した（図２Ｅ）。
【0071】
ＨＢＰ前駆体の自己誘導メカニズムを描写するために、出願人は、既知の誘導性シグナル伝達経路の境界特異的発現プロファイルを評価した。ＦＧＦ、ＢＭＰ、ＨＨ（ヘッジホッグ）、ＮＯＴＣＨおよびＲＡ（レチノイン酸）シグナルの中で、ＲＮＡｓｅｑは、ＲＡの下流のシグナルが境界領域で顕著に活性化されたが、１１日目の前部または後部領域では活性化されなかったことを同定した（図２Ｆおよび表１）。
【表1-1】
【0072】
補強として、出願人は、９日目のｂＡＰオルガノイドを種々のＲＡシグナル伝達作動剤または拮抗剤に曝露した。ＲＡ受容体拮抗剤ＢＭＳ４９３は、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１の両方の遺伝子発現を強く抑制した（図２Ｇ）。動物実験は、ＲＡシグナル伝達が肝胆膵系への系譜スペシフィケーションにおいて重要な役割を果有することを示唆する２０，２１。側板中胚葉集団は、インビボのスペシフィケーションの間にＲＡシグナル伝達の活性化剤として機能する２２－２４。モデル系におけるＲＡの細胞供給源を示唆するために、ＲＡシグナル伝達関連遺伝子を、単離された上皮および非上皮細胞集団で評価した。ＦＡＣＳ分析は、前腸細胞に９０．３％の上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）陽性上皮細胞があったのに対し、一方、後腸細胞には９４．８％のＥｐＣＡＭ陽性があったことを示した（図５）。興味深いことに、前部非上皮細胞は、他の集団ではなく、以前のインビボ動物モデル研究と同様に、ＲＡ合成遺伝子アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２（ＡＬＤＨ１Ａ２）を高度に発現した（図２Ｈ）。これを補完するために、融合前に、前腸スフェロイドではなく後腸スフェロイドのみをＢＭＳ４９３に曝露すると、ＨＨＥＸおよびＰＤＸ１のタンパク質レベル誘導が抑制された（図１０）。ＢＭＳ４９３との全胚培養系で培養されたＥ９．０ＰＲＯＸ１：：ＧＦＰレポーターマウス胚も、２日後にＰＲＯＸ１発現細胞の有意な阻害を示した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。まとめると、境界オルガノイドモデル系の後部領域から誘導されるＨＢＰ前駆体自己スペシフィケーションは、ＲＡシグナルによって調節され、前部の非上皮性、おそらく間葉の系譜を共分化させることによってサポートされ得る。
【0073】
幹細胞由来胚性内胚葉細胞は高度に可塑性であり、通常は腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）組織を生成することが注目されてきた１８，２５。インビボで前駆体からＨＢＰ組織を形成する能力があるか否かを調べるために、免疫不全マウス内へのヒトＰＲＯＸ１発現オルガノイドの移植を実施した。１ヶ月の移植由来組織は、小腸組織マーカーケラチン２０（ＣＫ２０）、ＣＤＸ２、およびＥｐＣＡＭを示したが、他のＨＢＰマーカーの発現はごくわずかであった（図２Ｉ）。さらに、十二指腸メーカー受容体アクセサリータンパク質６（ＲＥＥＰ６／ＤＰ１Ｌ１）およびＳＯＸ９発現パターンは、これらのヒト組織が十二指腸組織に最も類似することを示した（図２Ｉ）。これらの結果は、ＨＢＰ前駆体の存在にもかかわらず、異所的に移植されたオルガノイドが、インビボで腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）組織を発達させる傾向にあることを示した。
【0074】
ＨＢＰオルガノイドは、インビボで十二指腸組織を卓越して生成したため、出願人は次に、ＰＲＯＸ１陽性領域を１３日目の境界オルガノイドから切除し、それらを種々のフォーマットで培養して、ＨＢＰ器官形成を効果的にモデル化した（図３ＡおよびＢ）。驚くべきことに、種々の試験培養条件（図１２）の中で、切除された組織を、特定の成長因子なしで、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上のＭａｔｒｉｇｅｌドロップで２週間培養したところ、ほとんどのＰＲＯＸ１組織は、空間的に組織化された陥入上皮に発達し、分岐構造を形成した（図３ｂ）。対照的に、浮遊条件で培養された少数のＰＲＯＸ１陽性上皮または非解剖オルガノイドのみが陥入した（図３Ｂ）。時間経過画像化は、解剖されたＰＲＯＸ１陽性組織が２日間の培養中に上皮形態からより複雑な構造に変化したことを示した（図３Ｃ）。２５日目頃、オルガノイドのＰＲＯＸ１上皮部分は、陥入し始めた。その後、ＰＲＯＸ１陽性領域は、複数の方向に外側に成長し始め、進行性の陥入を介して分岐構造を形成した（図３ＤおよびＤ）。分岐構造は、Ａ－ＡおよびＰ－Ｐの組み合わせに観察されなかった（図１３）。さらに、最初はＰＤＸ１を発現したが、ｂＡＰオルガノイドから解剖された後腸スフェロイドだけは、陥入構造を成長させることができなかった（図１４）。
【0075】
長期培養がより成熟した組織を生産することができるか否かを決定するために、オルガノイドを９０日目まで培養した。９０日目のオルガノイドは、マウスＥ１４．５外植器官培養物と形態学的に類似した（図３Ｆ）。Ｈ&Ｅ染色は、長期培養オルガノイドが肝、膵、胆管および腸組織を形態学的に含むことを示した（図３Ｇ）。さらに、免疫蛍光染色は、オルガノイドにおける膵マーカーＰＤＸ１およびＮＧＮ３、肝マーカーＰＲＯＸ１、および胆管マーカーＣＫ１９およびＳＯＸ９の発現を検出した（図３Ｈ）。胆嚢組織発達と同様に、Ａｌｐｈａ－ＳＭＡ発現間葉細胞は、胆管ＳＯＸ１７＋細胞の周囲を包んだ２６（図３ｈ）。肝マーカーＡＦＰおよびアルブミン、膵マーカーＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１およびＧＡＴＡ４、および胆管マーカーＤＢＡおよびＳＯＸ９による免疫蛍光およびホールマウント染色は、組織の各系譜が３０日より長い培養後に同じ境界オルガノイドから分離したことを確認した（図３Ｉ－Ｌおよび図１５Ａ－１５Ｂ）。ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ＢおよびＧＡＴＡ４は、ＰＤＸ１陽性領域で差次的に発現し、膵間葉マーカーＮＫＸ６．３の発現が、インビボで発生する膵で見られるように、ＰＤＸ１発現細胞とともに観察された（図３Ｉ－Ｌおよび図１５Ａ－１５Ｃ）。注目すべきことに、ＤＢＡ、ＳＯＸ９、およびＰＤＸ１のホールマウント共染色によって、およびフルオレセイン標識胆汁酸（ＣＬＦ）を組み込む能力によって証明されるように、胆管および膵組織は分岐オルガノイドで直接に結合する（図３Ｋおよび３Ｋ'および図１５Ｃ）。さらに、９０日目に、外分泌マーカーアミラーゼおよびＧＡＴＡ４を発現する膵領域を、オルガノイドにおいて同定した（図３Ｍ）。オルガノイドにおけるコレシストキニンＡ受容体（ＣＣＫＡＲ）発現（図３Ｎ）を考慮して、オルガノイドをＣＣＫに曝露し、膵分泌機能をアミラーゼ酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）で分析した。翌日、管構造は収縮し、ＣＣＫ処理組織は、未処理の対照と比較して、上清中のアミラーゼ分泌を増加させた（図３Ｏおよび３Ｐ）。これらの結果は、境界オルガノイド戦略が複数の器官（ＨＢＰ）組織を生成するだけでなく、膵、特に外分泌系譜および胆管の機能的結合を確立することを示す。
【0076】
ＨＥＳ１（ＨｅｓファミリーｂＨＬＨ転写因子１）は、後腸前腸系譜を調節する転写因子である１５，２７。Ｈｅｓ１ノックアウトげっ歯動物では、膵－胆管器官分離の欠如のため、胆系の膵組織への変換が起こる８，９。ＨＢＰオルガノイドがＨＥＳ１を介した発生プロセスを再現するか否かを解明するために、出願人はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系（図４Ａ－４Ｃ）によってＰＲＯＸ１レポーターｉＰＳＣでＨＥＳ１ＫＯを確立し、２０日目にＨＥＳ１－／－ｉＰＳＣ由来オルガノイドのＨＥＳ１遺伝子発現の非存在を確認した。（図４Ｄ）。ＨＥＳ１－／－オルガノイドは、１１日目にＰＲＯＸ１レポーター活性（図４Ｅ）およびｂＡＰでのＨＨＥＸ／ＰＤＸ１発現（図４Ｆ）を保持した。２２日目のＨＥＳ１－／－およびＨＥＳ１＋／＋オルガノイドのＲＮＡｓｅｑは、ＨＥＳ１＋／＋オルガノイドと比較して、ＨＥＳ１－／－オルガノイドにおけるＨＥＳ１標的としての９，２８、内分泌マーカーを含む報告された膵関連マウス遺伝子の有意な上方調節を示した（図４Ｇおよび図１６）。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＧＣＧ、ＮＥＵＲＯＧ３、ＩＮＳ、およびＮＫＸ２－２のすべての膵遺伝子発現レベルが、ＨＥＳ１＋／＋オルガノイドと比較して、ＨＥＳ１－／－オルガノイドで上方調節されたことを示した（ＧＣＧ：２６４倍；ＮＥＵＲＯＧ３：２９．８倍；ＩＮＳ：２１２倍）。しかし、ＧＣＧ、ＩＮＳの発現レベルは、ＨＥＳ１＋／＋およびＨＥＳ１－／－オルガノイドの両方において、ヒト膵組織よりも依然として低かった（図４Ｈ）。さらに、インビボげっ歯動物研究と一致して、ＨＥＳ１－／－ヒトオルガノイドは、ＨＥＳ１＋／＋オルガノイドと比較して、より少ないＤＢＡおよびＳＯＸ９陽性管組織およびより多いＰＤＸ１陽性膵構造を生産し（図４ＩおよびＪおよび図１７）、このことは、動物モデル研究との表現型関連性を強調した。
【0077】
幹細胞培養における多器官統合は、満たされていない重要な課題である。本開示は、前腸と中腸の境界で発達した構造的および機能的に統合されたＨＢＰオルガノイドにつながるヒトの三次元前部後部境界系の生成を実証する。
【0078】
方法
ＰＳＣの維持
ヒトＰＳＣ系を、以前に記載したとおり維持した。未分化ｈＰＳＣを、１／３０希釈のＭａｔｒｉｇｅｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）または０．２５ｕｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、Ｊａｐａｎ）のいずれかでコーティングされたプレート上で、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）またはＳｔｅｍ Ｆｉｔ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ Ｃｏ，Ｊａｐａｎ）におけるフィーダーフリー条件で、３７℃の５％ ＣＯ２／９５％ 空気のインキュベーター内で維持した。
ＰＳＣの維持
ヒトＰＳＣ系を、以前に記載したとおり維持した。未分化ｈＰＳＣを、１／３０希釈のＭａｔｒｉｇｅｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）または０．２５ｕｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、Ｊａｐａｎ）のいずれかでコーティングされたプレート上で、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）またはＳｔｅｍ Ｆｉｔ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ Ｃｏ，Ｊａｐａｎ）におけるフィーダーフリー条件で、３７℃の５％ ＣＯ２／９５％ 空気のインキュベーター内で維持した。
【0079】
ＰＳＣの前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドへの分化
ｈＰＳＣの胚体内胚葉への分化を、以前に記載された方法１８、１９を変更して使用して誘導した。簡単に説明すると、ｈｉＰＳＣのコロニーを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で単離し、１５０，０００細胞／ｍＬを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートされた組織培養プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））上にプレートした。培地を、１日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および５０ｎｇ／ｍＬ 骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、２日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａおよび０．２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に、３日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａおよび２％ ＦＣＳに変更した。４～７日目で細胞を、前腸細胞誘導のために２００ｎｇ／ｍＬ Ｎｏｇｇｉｎ（ＮＯＧ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５００ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、腸細胞誘導のために５００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を補充した、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む腸成長培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））で培養した。細胞分化のための培養物を、３７℃で５％ ＣＯ２／９５％ 空気の雰囲気中で維持し、培地を毎日交換した。
ｈＰＳＣの胚体内胚葉への分化を、以前に記載された方法１８、１９を変更して使用して誘導した。簡単に説明すると、ｈｉＰＳＣのコロニーを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で単離し、１５０，０００細胞／ｍＬを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートされた組織培養プレート（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））上にプレートした。培地を、１日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および５０ｎｇ／ｍＬ 骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、２日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａおよび０．２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に、３日目に１００ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａおよび２％ ＦＣＳに変更した。４～７日目で細胞を、前腸細胞誘導のために２００ｎｇ／ｍＬ Ｎｏｇｇｉｎ（ＮＯＧ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５００ｎｇ／ｍｌ 線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、腸細胞誘導のために５００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ４および３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を補充した、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮ２（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む腸成長培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））で培養した。細胞分化のための培養物を、３７℃で５％ ＣＯ２／９５％ 空気の雰囲気中で維持し、培地を毎日交換した。
【0080】
前部後部境界スフェロイド形成
７日目に、３７℃でＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートすることによって、前腸または後腸細胞を単一細胞に解離させた。細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを１０μＭのＹ－２７６３２二塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含む腸成長培地に再懸濁した。前腸または後腸細胞懸濁液を、９６ウェル丸底超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）上に１０，０００細胞／ウェルの密度でプレートし、３７℃で２４時間インキュベートしてスフェロイドを形成させた。８日目に、生成された単一の前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドを、腸成長培地における９６ウェル丸底超低不着プレート上で２４時間ミックスして、融合境界スフェロイド（Ａ－Ｐスフェロイド）を形成させた。
７日目に、３７℃でＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートすることによって、前腸または後腸細胞を単一細胞に解離させた。細胞を１０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを１０μＭのＹ－２７６３２二塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を含む腸成長培地に再懸濁した。前腸または後腸細胞懸濁液を、９６ウェル丸底超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）上に１０，０００細胞／ウェルの密度でプレートし、３７℃で２４時間インキュベートしてスフェロイドを形成させた。８日目に、生成された単一の前腸スフェロイドおよび後腸スフェロイドを、腸成長培地における９６ウェル丸底超低不着プレート上で２４時間ミックスして、融合境界スフェロイド（Ａ－Ｐスフェロイド）を形成させた。
【0081】
肝胆膵（ＨＢＰ）オルガノイドの培養および移植
９日目に、Ａ－ＰスフェロイドをＭａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋し、腸成長培地で培養して、多器官ＨＢＰオルガノイドを生成させた。より長期の培養のために、１３日目に、ＨＢＰオルガノイドを解剖し、および／または気液界面培養のためのＴｒａｎｓｗｅｌｌに移送した。スフェロイドの培養物を、３７℃で５％ ＣＯ２／９５％ 空気の雰囲気で維持し、腸成長培地を４日ごとに交換した。１３日目の単一のＨＢＰオルガノイドを、１２週齢の雄の免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの腎臓の被膜下に移植した。すべての実験を、ＣＣＨＭＣの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認の下に実施した（プロトコルＩＡＣＵＣ２０１８－００９６）。
９日目に、Ａ－ＰスフェロイドをＭａｔｒｉｇｅｌドロップに包埋し、腸成長培地で培養して、多器官ＨＢＰオルガノイドを生成させた。より長期の培養のために、１３日目に、ＨＢＰオルガノイドを解剖し、および／または気液界面培養のためのＴｒａｎｓｗｅｌｌに移送した。スフェロイドの培養物を、３７℃で５％ ＣＯ２／９５％ 空気の雰囲気で維持し、腸成長培地を４日ごとに交換した。１３日目の単一のＨＢＰオルガノイドを、１２週齢の雄の免疫不全ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの腎臓の被膜下に移植した。すべての実験を、ＣＣＨＭＣの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認の下に実施した（プロトコルＩＡＣＵＣ２０１８－００９６）。
【0082】
Ｈ&Ｅ染色および免疫組織化学
スフェロイドおよびオルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから収集し、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンに包埋した。切片をＨ&Ｅおよび免疫組織化学的染色の対象とした。一次抗体を表１に示した。免疫組織化学的染色を、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＡＢ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実施した。標本を顕微鏡下で観察した。
スフェロイドおよびオルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから収集し、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンに包埋した。切片をＨ&Ｅおよび免疫組織化学的染色の対象とした。一次抗体を表１に示した。免疫組織化学的染色を、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＡＢ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実施した。標本を顕微鏡下で観察した。
【0083】
ホールマウント免疫組織化学的染色のために、スフェロイドおよびオルガノイドをＭａｔｒｉｇｅｌから収集し、４℃で３０分間細胞回収溶液で処理することによって、残りのＭａｔｒｉｇｅｌを除去した。組織をＰＢＳによって洗浄し、４℃で一晩４％ ＰＦＡで固定した。固定したサンプルを、室温で１５分間、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む４％ ＰＦＡで処理し、室温で１５分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）で透過処理した。サンプルをブロッキング溶液（１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）で室温で１時間処理し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、蛍光色素結合二次抗体を、室温で２時間サンプルに適用した。一次抗体および二次抗体を表１に示す。二次抗体反応後、サンプルを３回洗浄した。核をＤＡＰＩマウンティング溶液で染色した。
【0084】
染色した切片およびホールマウントサンプルを、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒｓｉ倒立共焦点顕微鏡で観察した。
【0085】
ＲＮＡ単離、ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＲＮＡを単離した。逆転写を、ＲＴ－ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行した。ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）でＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。各標的遺伝子のすべてのプライマーおよびプローブ情報を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｑｐｃｒ．ｐｒｏｂｅｆｉｎｄｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｇａｎｉｓｍ．ｊｓｐ）から取得し、表２に示した。
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＲＮＡを単離した。逆転写を、ＲＴ－ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行した。ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）でＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。各標的遺伝子のすべてのプライマーおよびプローブ情報を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｑｐｃｒ．ｐｒｏｂｅｆｉｎｄｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｇａｎｉｓｍ．ｊｓｐ）から取得し、表２に示した。
【0086】
ＲＮＡ配列決定
ＲＮＡ配列決定のサンプル準備を、製造元のユーザーマニュアルに従って、ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実施した。
ＲＮＡ配列決定のサンプル準備を、製造元のユーザーマニュアルに従って、ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して実施した。
【0087】
簡単に説明すると、第１鎖ｃＤＮＡ合成を、３'ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑ ＣＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩ Ａによってプライミングした。転写産物の５'末端のテンプレートスイッチングのためにＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを使用する。ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩ Ａは、３'ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ＣＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ ＩＩＡによって導入されたＳＭＡＲＴ配列からｃＤＮＡを増幅し、ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑｖ４ ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズに固定することによって精製した。次にビーズを、８０％エタノールで洗浄し、ｃＤＮＡを溶出バッファーで溶出させた。増幅したｃＤＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔのＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、キットのユーザーマニュアルに従って検証した。ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇの完全長ｃＤＮＡ出力を、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でプロセッシングした。
【0088】
ＲＮＡプロファイルを、Ｋａｌｌｉｓｔｏソフトウェアでコンパイルし、１００万あたりの転写産物（ＴＰＭ）として表現した。少なくとも１つのサンプルで０より大きい必要があるしきい値でフィルター処理されたデータセットを、最初にＦＧＦ、ＢＭＰ、ヘッジホッグ、ＮＯＴＣＨ、およびＲＡシグナル伝達経路に関連する遺伝子セットに基づく遺伝子機能分類の対象とした。遺伝子セットのリストを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｖｅｒ ６．２）から獲得した。Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０ソフトウェアを使用することによって実施したフィルター処理されたデータセットについての偏りのないクラスター分析。各クラスターに含まれる遺伝子セットの詳細を表３に示した。
【0089】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、前腸細胞をＧＦＰ標識ｉＰＳＣから分化させ、後腸細胞をｍＣｈｅｒｒｙ標識ｉＰＳＣから分化させた。１３日目に、Ａ－Ｐスフェロイドを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓの３７℃１０分間処理によって単一細胞に解離させた。ＰＢＳ洗浄後、単一細胞を、ＢＶ４２１結合ＥｐＣＡＭ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、細胞選別をＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって実施した。分析を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェアおよびＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）によって実施した。
フローサイトメトリーのために、前腸細胞をＧＦＰ標識ｉＰＳＣから分化させ、後腸細胞をｍＣｈｅｒｒｙ標識ｉＰＳＣから分化させた。１３日目に、Ａ－Ｐスフェロイドを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓの３７℃１０分間処理によって単一細胞に解離させた。ＰＢＳ洗浄後、単一細胞を、ＢＶ４２１結合ＥｐＣＡＭ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、細胞選別をＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって実施した。分析を、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェアおよびＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）によって実施した。
【0090】
ＣＲＩＳＰＲ編集
Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰをコードするプラスミドを、ａｄｄｇｅｎｅ（＃４４７１９、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．０３．００６）から獲得した。ＰＲＯＸ１またはＨＥＳ１のＮ末端を標的とするガイドＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、ｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ピューロマイシンベクター（ａｄｄｇｅｎｅ＃５１１３３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８５７）にクローン化し、ＲＶ３ユニバーサルプライマーを使用して配列決定した。ＨＤＲテンプレートを構築するために、ＰＲＯＸ１開始コドンに隣接する相同性アームをゲノムＤＮＡから独立して増幅し、高忠実度ｔａｑポリメラーゼｉＰｒｏｏｆ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用するオーバーラップエクステンションＰＣＲを介してｔｄＴｏｍａｔｏに融合させた。次に、得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、サンガー配列決定によって確認した。
Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰをコードするプラスミドを、ａｄｄｇｅｎｅ（＃４４７１９、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．０３．００６）から獲得した。ＰＲＯＸ１またはＨＥＳ１のＮ末端を標的とするガイドＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、ｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ピューロマイシンベクター（ａｄｄｇｅｎｅ＃５１１３３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８５７）にクローン化し、ＲＶ３ユニバーサルプライマーを使用して配列決定した。ＨＤＲテンプレートを構築するために、ＰＲＯＸ１開始コドンに隣接する相同性アームをゲノムＤＮＡから独立して増幅し、高忠実度ｔａｑポリメラーゼｉＰｒｏｏｆ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用するオーバーラップエクステンションＰＣＲを介してｔｄＴｏｍａｔｏに融合させた。次に、得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、サンガー配列決定によって確認した。
【0091】
製造元の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、ヒトｉＰＳＣに２μｇの各プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＧＦＰ発現によって選別し、陽性にトランスフェクトされた細胞を選択した。クローン性細胞を２週間拡張させ、挿入されたＰＲＯＸ１－ｔｄＴｏｍａｔｏまたは枯渇したＨＥＳ１エクソン１配列についてスクリーニングし、核型決定した。
【0092】
アミラーゼＥＬＩＳＡ
オルガノイドのアミラーゼ分泌レベルを測定するために、２００μＬの培養上清を、Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋されたオルガノイドから収集した。培養後４８時間の時点で培養上清を回収し、使用するまで－８０℃で保存した。上清を１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、破片をペレット化し、得られた上清を製造元の指示に従ってＨｕｍａｎ Ａｍｙｌａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔで検定した。
オルガノイドのアミラーゼ分泌レベルを測定するために、２００μＬの培養上清を、Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋されたオルガノイドから収集した。培養後４８時間の時点で培養上清を回収し、使用するまで－８０℃で保存した。上清を１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、破片をペレット化し、得られた上清を製造元の指示に従ってＨｕｍａｎ Ａｍｙｌａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔで検定した。
【0093】
統計および再現性
統計分析を、対応のない両側スチューデントのｔ検定、Ｄｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆｅ検定、またはＷｅｌｃｈのｔ検定を使用して実施した。結果を平均±ｓｄで示した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であると見なした。Ｎ値は、特記しない限り、生物学的に独立した反復を指す。対になっていない２つのグループ間の比較のために、２つのサンプルが独立し、かつサンプルの分散が等しくない場合に、ノンパラメトリックＢｒｕｎｎｅｒ－Ｍｕｎｚｅｌ検定を実施した。２つより多いサンプル間の比較のために、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定および事後Ｄｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆ検定を実施した。
統計分析を、対応のない両側スチューデントのｔ検定、Ｄｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆｅ検定、またはＷｅｌｃｈのｔ検定を使用して実施した。結果を平均±ｓｄで示した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であると見なした。Ｎ値は、特記しない限り、生物学的に独立した反復を指す。対になっていない２つのグループ間の比較のために、２つのサンプルが独立し、かつサンプルの分散が等しくない場合に、ノンパラメトリックＢｒｕｎｎｅｒ－Ｍｕｎｚｅｌ検定を実施した。２つより多いサンプル間の比較のために、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定および事後Ｄｕｎｎ－Ｈｏｌｌａｎｄ－Ｗｏｌｆ検定を実施した。
【0094】
マウス全胚培養
多器官三次元オルガノイドの培養を、成長が改善された全胚培養系（Ｉｋｅｍｏｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実行し得る。多器官三次元オルガノイドを、培養培地を含む滅菌ガラスローラーボトル内に移送し、フラスコをシリコンプラグによって閉じ得る。移送されるオルガノイドの数は、培養期間に依存する。培養ボトルを、回転子ドラムに取り付け、ガス混合物（主に２０％ Ｏ２、５％ ＣＯ２および７５％ Ｎ２であるが、Ｏ２濃度をＮ２とのバランスで変更することができる）を連続的に供給しながら、暗所で２０ｒｐｍで３７℃で回転させ得る。オルガノイドを数週間培養することができる（最長の試験は１０週間である）。培養培地を、５～７日ごとに変更し、オルガノイドの長さおよびＡｌｂ、Ａｍｙ、Ｃ－ペプチドレベルなどの培地成分に基づいて生存率および成長を監視することができる。
多器官三次元オルガノイドの培養を、成長が改善された全胚培養系（Ｉｋｅｍｏｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実行し得る。多器官三次元オルガノイドを、培養培地を含む滅菌ガラスローラーボトル内に移送し、フラスコをシリコンプラグによって閉じ得る。移送されるオルガノイドの数は、培養期間に依存する。培養ボトルを、回転子ドラムに取り付け、ガス混合物（主に２０％ Ｏ２、５％ ＣＯ２および７５％ Ｎ２であるが、Ｏ２濃度をＮ２とのバランスで変更することができる）を連続的に供給しながら、暗所で２０ｒｐｍで３７℃で回転させ得る。オルガノイドを数週間培養することができる（最長の試験は１０週間である）。培養培地を、５～７日ごとに変更し、オルガノイドの長さおよびＡｌｂ、Ａｍｙ、Ｃ－ペプチドレベルなどの培地成分に基づいて生存率および成長を監視することができる。
【0095】
全胚培養のために、Ｒｏｔａｔｏｒ－ｔｙｐｅ Ｂｏｔｔｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｋｅｍｏｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用した。Ｅ９．０Ｐｒｏｘ１－ＧＦＰマウス胚を解剖し、Ｂ２７およびＮ２を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とともに培養ボトルに移送した。全胚培養系内の温度を３７．０℃に維持した。
【表2】
【表3】
【0096】
参考文献
１ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．& Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｎｋｘ２．５ ｉｎ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｍｉｄｇｕｔ－ｆｏｒｅｇｕｔ ｂｏｕｎｄａｒｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７，３６７１－３６８１（２０００）．
１ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．，Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．& Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｎｋｘ２．５ ｉｎ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｍｉｄｇｕｔ－ｆｏｒｅｇｕｔ ｂｏｕｎｄａｒｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２７，３６７１－３６８１（２０００）．
【0097】
２ Ｈｅｎｔｓｃｈ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｈｌｘ ｈｏｍｅｏ ｂｏｘ ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｎ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｄｒｉｖｅｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｇｕｔ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １０，７０－７９（１９９６）．
【0098】
３ Ｓａｎ Ｒｏｍａｎ，Ａ．Ｋ．& Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．Ａ．Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ，ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，２７１１－２７１８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２０１１．０７．０１１（２０１１）．
【0099】
４ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．，Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｌ．Ｃ．，Ｃｈｙｕｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｌａｓｓａｒ，Ａ．& Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．Ｇｉｚｚａｒｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂａｐｘ１．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２３１，１６４－１７４，ｄｏｉ：１０．１００６／ｄｂｉｏ．２０００．０１５１（２００１）．
【0100】
５ Ｂｏｒｔ，Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｂａｒｂｅｒａ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．& Ｚａｒｅｔ，Ｋ．Ｓ．Ｈｅｘ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，７９７－８０６，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．００９６５（２００４）．
【0101】
６ Ｓｈｉｈ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ Ｐｄｘ１ ａｎｄ Ｓｏｘ９ Ｇｏｖｅｒｎｓ Ｌｉｎｅａｇｅ Ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｇｕｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １３，３２６－３３６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０８．０８２（２０１５）．
【0102】
７ Ｔｅｐａｓｓ，Ｕ．& Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｖ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｉｄｇｕｔ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ａｎｄ ｍｅｓｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０，５７９－５９０（１９９４）．
【0103】
８ Ｆｕｋｕｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ ｐａｎｃｒｅａｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｓ１ －ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ，ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ，ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６，１４８４－１４９３，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２７７０４（２００６）．
【0104】
９ Ｓｕｍａｚａｋｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ Ｈｅｓ１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３６，８３－８７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ１２７３（２００４）．
【0105】
１０ Ｕｄａｇｅｒ，Ａ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ａ．& Ｇｕｍｕｃｉｏ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｂｕｌａｒ ｇｕｔ： ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｐｙｌｏｒｕｓ．Ｐｒｏｇ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ ９６，３５－６２，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８１２８０－３．００００２－６（２０１０）．
【0106】
１１ Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．& Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．Ｓｙｎｄｅｃａｎ４ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｗｎｔ／ＪＮＫ ａｎｄ ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｆｏｒｅｇｕｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４１６，１８７－１９９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２０１６．０５．０２５（２０１６）．
【0107】
１２ ＭｃＬｉｎ，Ｖ．Ａ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．& Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３４，２２０７－２２１７，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．００１２３０（２００７）．
【0108】
１３ Ｎｉｓｓｉｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｕｓｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎｒ５ａ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４１８，１０８－１２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２０１６．０７．０１９（２０１６）．
【0109】
１４ Ｐａｌａｒｉａ，Ａ．，Ａｎｇｅｌｏ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｕｅｒｔｉｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｍａｇｅｒ，Ｊ．& Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｋ．Ｄ．Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏ－ｐａｎｃｒｅａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｂｙ ＢＭＰ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ｂｕｄ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６８，２７４－２８８，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２９７６９（２０１８）．
【0110】
１５ Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｘ１７ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｏｒｇａｎ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｏｒｅｇｕｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １７，６２－７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００９．０５．０１２（２００９）．
【0111】
１６ Ａｍｅｒｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＦＧＦ２ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｈＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｎｔｏ ｆｏｒｅｇｕｔ／ｍｉｄｇｕｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８，４５－５６，ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２４９（２０１０）．
【0112】
１７ Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｇｕｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ Ａｒｅ Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ａｎｄ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｕｔ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，７８０－７９３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１８．０１．００６（２０１８）．
【0113】
１８ Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ ４７０，１０５－１０９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６９１（２０１１）．
【0114】
１９ ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５１６，４００－４０４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８６３（２０１４）．
【0115】
２０ Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｄｏｌｌｅ，Ｐ．，Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｗ．Ｖ．& Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ，Ｋ．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２９７，４３３－４４５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２００６．０５．０１９（２００６）．
【0116】
２１ Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｍｉｎｇ ｉｓ ｅｖｅｒｙｔｈｉｎｇ： Ｒｅｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｗｎｔ，ＢＭＰ ａｎｄ ＲＡ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４３４，１２１－１３２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２０１７．１１．０１８（２０１８）．
【0117】
２２ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｔ．Ｊ．& Ｄｕｅｓｔｅｒ，Ｇ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎ ａｎｄ ｌｉｍｂ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，１１０－１２３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３９３２（２０１５）．
【0118】
２３ Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ－Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃａｓｃａｄｅ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ Ｍｅｓｏｄｅｒｍ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｌｕｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １６，６６－７８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１６．０５．０６０（２０１６）．
【0119】
２４ Ｂａｙｈａ，Ｅ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｅｒｕｐ，Ｐ．& Ｇｒａｐｉｎ－Ｂｏｔｔｏｎ，Ａ．Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｚｅｓ ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｏｒｇａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ａｎｔｅｒｏ－ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ａｘｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４，ｅ５８４５，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５８４５（２００９）．
【0120】
２５ Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０，１３１０－１３１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３７３７（２０１４）．
【0121】
２６ Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４，１９０６－１９１７，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１４７５１２（２０１７）．
【0122】
２７ Ｔｈａｍｍ，Ｋ．& Ｓｅａｖｅｒ，Ｅ．Ｃ．Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｌａｒｖａｌ ａｎｄ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｈａｅｔｅ ａｎｎｅｌｉｄ Ｃａｐｉｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｉ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３２０，３０４－３１８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２００８．０４．０１５（２００８）．
【0123】
２８ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｇ３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ ｃａｕｓｅｓ ｅｃｔｏｐｉｃ ｐａｎｃｒｅａｓ ｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１６３５６８（２０１８）．
【0124】
２９ Ｃａｍｐ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｂｕｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５４６，５３３－５３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２２７９６（２０１７）．
【0125】
３０ Ｔａｋｅｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｆｒｏｍ ａｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｏｒｇａｎ ｂｕｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４９９，４８１－４８４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２２７１（２０１３）．
【0126】
３１ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｃ．，Ｄｉｅｋｍａｎｎ，Ｕ．，Ｂｕｄｄｅ，Ｉ．，Ｄｅｔｅｒｉｎｇ，Ｎ．& Ｎａｕｊｏｋ，Ｏ．Ａｎｔｅｒｉｏｒ－Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ，Ｗｎｔ－，ａｎｄ ＢＭＰ－Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３４，２６３５－２６４７，ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２４２８（２０１６）．
【0127】
３２ Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，２６７－２７２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１７８８（２０１１）．
【0128】
特記しない限り、すべてのパーセンテージおよび比率は重量で計算される。
【0129】
すべてのパーセンテージおよび比率は、特記しない限り、全組成に基づいて計算される。
【0130】
本明細書全体で与えられるすべての最大数値制限は、あたかもそのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように、すべてのより低い数値制限を含むことが理解されるべきである。本明細書全体で与えられるすべての最小数値制限は、あたかもそのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように、すべてのより高い数値制限を含む。本明細書全体で与えられるすべての数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に書かれているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべてのより狭い数値範囲を含む。
【0131】
本明細書に開示される寸法および値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。代わりに、特記しない限り、そのような各寸法は、記載された値およびその値を含む機能的に均等の範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「２０ｍｍ」として開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味することが意図される。
【0132】
相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書で引用されるすべての文書は、明示的に除外または他の方法で制限されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。任意の文書の引用は、それが本明細書に開示または請求される任意の発明に関する先行技術であること、またはそれが単独で、または他の参考文献との任意の組み合わせで、そのような発明を教示、示唆、または開示することを認めるものではない。さらに、本文書の用語の意味または定義が、参照により組み込まれる文書の同じ用語の意味または定義と矛盾する限りにおいて、本文書のその用語に割り当てられた意味または定義が優先するものとする。
【0133】
本発明の特定の実施形態が例示および説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の他の変更および修正を行い得ることは、当業者には自明であろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更および修正を包含することが意図される。
【図1A】
【図1B-A】
【図1B-B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G-A】
【図1G-B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図3K-】
【図3L】
【図3M】
【図3M-】
【図3N】
【図3O】
【図3P】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【配列表】