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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-19
(45)【発行日】2024-06-27
(54)【発明の名称】インフルエンザウイルスを標的とするＤＮＡモノクローナル抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240620BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240620BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240620BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240620BHJP
C07K 16/08 20060101ALN20240620BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240620BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 S
A61K48/00
A61P31/16
C07K16/08
C12N15/63 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2019510570
(86)(22)【出願日】2017-05-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-08-08
(86)【国際出願番号】 US2017031213
(87)【国際公開番号】W WO2017192946
(87)【国際公開日】2017-11-09
【審査請求日】2020-05-01
【審判番号】
【審判請求日】2022-05-11
(31)【優先権主張番号】62/332,381
(32)【優先日】2016-05-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/376,162
(32)【優先日】2016-08-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500429103
【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア
(73)【特許権者】
【識別番号】516142001
【氏名又は名称】ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー
(73)【特許権者】
【識別番号】509320254
【氏名又は名称】イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100092624
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴田 準一
(74)【代理人】
【識別番号】100114018
【弁理士】
【氏名又は名称】南山 知広
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【氏名又は名称】胡田 尚則
(72)【発明者】
【氏名】デイビッド ウェイナー
(72)【発明者】
【氏名】サラ エリオット
(72)【発明者】
【氏名】アミ パテル
(72)【発明者】
【氏名】チエン イェン
【合議体】
【審判長】長井 啓子
【審判官】天野 貴子
【審判官】加々美 一恵
(56)【参考文献】
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６年０５月０１日，Ｖｏｌ．２４，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐｐ．Ｓ１７１－Ｓ１７２，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ： ４３３，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｔｈｅｒａｐｙ－ｆａｍｉｌｙ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｔｈｅｒａｐｙ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ／Ｓ１５２５－００１６（１６）３３２４２－７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N15/00-90, C07K16/00-46
A61K48/00, A61P31/00-22
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、ａ）ＦｌｕＡ抗体又はＦｌｕＢ抗体（抗－インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）合成抗体）をコードするヌクレオチド配列、
ｂ）ＦｌｕＡ抗体又はＦｌｕＢ抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる抗－インフルエンザＨＡ合成抗体をコードするヌクレオチド配列、及び
ｃ）ＦｌｕＡ抗体、ＦｌｕＢ抗体、又は、前記ｂ)の抗－インフルエンザＨＡ合成抗体の機能的断片をコードするヌクレオチド配列、
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、
前記抗－インフルエンザＨＡ合成抗体が、配列番号１～８に対して少なくとも９０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記核酸分子。
【請求項2】
前記抗－インフルエンザＨＡ合成抗体が、インフルエンザＨＡの球状頭部に結合する抗体、及び、インフルエンザＨＡの融合サブドメインに結合する抗体、からなる群より選択される請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記核酸分子が、配列番号１～８により示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む抗－インフルエンザＨＡ合成抗体をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記核酸分子が、配列番号９～１６に対して少なくとも９０％同一である配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項5】
第１の抗－インフルエンザＨＡ合成抗体をコードする第１のヌクレオチド配列、及び、第２の抗－インフルエンザＨＡ合成抗体をコードする第２のヌクレオチド配列からなる群から選択される、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、前記第１の抗－インフルエンザＨＡ合成抗体が、配列番号１～８に対して少なくとも９０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして、
前記第２の抗－インフルエンザＨＡ合成抗体が、配列番号１～８に対して少なくとも９０％同一である配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項6】
開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項7】
抗－インフルエンザＨＡ合成抗体の可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項8】
ヒトＩｇＧ１κの定常重鎖領域、及び、定常軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項9】
抗－インフルエンザＨＡ合成抗体の可変重鎖領域、ヒトＩｇＧ１κの定常重鎖領域、開裂ドメイン、抗－インフルエンザＨＡ合成抗体の可変軽鎖領域、及び、ＩｇＧ１κの定常軽鎖領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記ヌクレオチド配列が、リーダー配列をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項11】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物。
【請求項13】
医薬として許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
対象におけるインフルエンザ感染を予防又は処置する方法において使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項１２～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
前記インフルエンザ感染が、Ａ型インフルエンザ感染、及び、Ｂ型インフルエンザ感染から選択される、請求項１４に記載の核酸分子又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月５日に出願された米国仮出願第６２／３３２，３８１号、及び、２０１６年８月１７日に出願された米国仮出願第６２／３７６，１６２号の優先権を主張し、各出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
本出願は、２０１６年５月５日に出願された米国仮出願第６２／３３２，３８１号、及び、２０１６年８月１７日に出願された米国仮出願第６２／３７６，１６２号の優先権を主張し、各出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【0002】
本発明は、抗－インフルエンザヘマグルチニン抗体、及び、その機能的断片を含む、１つ以上の合成抗体をインビボで生成するための組換え核酸配列を含む組成物、及び、当該組成物を投与することによって、対象における疾患を、予防、及び／または、処置する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
有望な技術革新をよそに、インフルエンザワクチン、及び、抗ウイルス薬は、季節性感染症に対する完全な保護をもたらしておらず、かつ、新規で潜在的な流行性ウイルス株に対する保護はほとんどされていない。非常に多様なインフルエンザウイルスに対する保護を提供する目的で、広範に交差保護的なモノクローナル抗体が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
したがって、当該技術分野において、インフルエンザの処置のための改善された組成物、及び、方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子に関するものであり、当該核酸分子は、ａ）抗－インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、及び、ｂ）抗－ＨＡ合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【0006】
ある実施形態において、当該抗－ＨＡ合成抗体は、インフルエンザＨＡの球状頭部に結合する抗体、及び、インフルエンザＨＡの融合サブドメインに結合する抗体、からなる群より選択される。
【0007】
ある実施形態において、当該核酸分子は、第１の抗－ＨＡ抗体をコードする第１のヌクレオチド配列、及び、第２の抗－ＨＡ抗体をコードする第２のヌクレオチド配列からなる群から選択された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【0008】
ある実施形態において、当該核酸分子は、開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0009】
ある実施形態において、当該核酸分子は、抗－ＨＡの可変重鎖領域、及び、可変軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0010】
ある実施形態において、当該核酸分子は、ヒトＩｇＧ１κの定常重鎖領域、及び、定常軽鎖領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0011】
ある実施形態において、当該核酸分子は、抗－ＨＡの可変重鎖領域、ヒトＩｇＧ１κの定常重鎖領域、開裂ドメイン、抗－ＨＡの可変軽鎖領域、及び、ＩｇＧ１κの定常軽鎖領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0012】
ある実施形態において、当該核酸分子は、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0013】
ある実施形態において、当該核酸分子は、発現ベクターを含む。
【0014】
ある実施形態において、本発明は、当該核酸分子を含む組成物を提供する。ある実施形態において、当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含む。
【0015】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載の当該核酸または組成物を対象に投与することを含む、対象におけるインフルエンザ感染を予防または処置する方法を提供する。ある実施形態において、当該インフルエンザ感染は、Ａ型インフルエンザ感染である。ある実施形態において、当該インフルエンザ感染は、Ｂ型インフルエンザ感染である。
【0016】
ある実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞、または、ウイルスベクターにおいて、モノクローナル抗体を生産するための新規な配列を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図3】図３は、図３Ａ及び３Ｂを含んでおり、ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡ構築物が、２９３Ｔ細胞で発現することを実証する実験の結果を示す。図３Ａは、上清及び溶解物ヒトＩｇＧ１κ発現を、定量的ＥＬＩＳＡ（Ｎ＝３ トランスフェクション反復、平均値±ＳＥＭ）で決定をしたＥＬＩＳＡの結果を示す。図３Ｂは、上清、及び、溶解重鎖、及び、軽鎖ペプチド開裂を示す代表的なウエスタンブロットを示す。
【図4】図４は、図４Ａ及び４Ｂを含んでおり、筋肉内にＤＮＡ電気穿孔をした後に、マウス血清にＤＭＡｂが発現することを実証する実験の結果を示す。マウスに、５Ｊ８またはＦＩ６プラスミドＤＮＡを注射し、続いて、筋肉内の電気穿孔を行った。マウス血清でのヒトＩｇＧ１κ抗体レベルを、定量的ＥＬＩＳＡで決定した。図４Ａは、抗－インフルエンザＤＭＡｂを、５３ｎｇ／ｍｌ～１．１μｇ／ｍｌで発現しており、ＢＡＬＢ／ｃマウスに送達して７日後には、ベースラインとなる０日目のプレ－ブリードのレベルよりも有意に高いことを実証する結果を示している。部位送達、及び、製剤の最適化戦略は、ＤＭＡｂの発現を、＞３倍にまで増強した。図４Ｂは、ヌードマウスにおけるＤＮＡ用量増大の結果を示す。３００μｇのプラスミドＤＮＡを免疫不全ヌードマウスに送達した後に、ピークＦＩ６発現は、２．６μｇ／ｍｌに達した。ＤＭＡｂの発現は、１０週間にわたって持続した。（Ｎ＝５、平均±ＳＥＭ。）
【図5】図５は、マウス血清由来のＤＭＡｂが、ヘマグルチニン抗原に結合する能力を有することを実証する実験の結果を示す。ヌードマウスは、筋肉内電気穿孔で、ＦＩ６（３００μｇ）プラスミドＤＮＡを取り込んだ。４週間後に、組換えＡ型インフルエンザＨ１ヘマグルチニン抗原に対する血清ＤＭＡｂの結合を、ＥＬＩＳＡで測定した。（Ｎ＝５、平均±ＳＥＭ。）
【図7】図７は、Ａ型及びＢ型インフルエンザに関して単離されたヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、広域交差反応性を有することを実証する実験の結果を示す。Ａ型インフルエンザ特異的ＦｌｕＡモノクローナル抗体は、グループ１及び２の両方において、季節性及び流行性ウイルスを広範に中和する。ＦｌｕＢモノクローナル抗体は、Ｂ型インフルエンザの双方の系統に由来するウイルスを強力に中和する。
【図10】図１０は、ＦｌｕＡ、及び、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂ血清発現、及び、機能性を実証する実験の結果を示す。ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ（上段）、及び、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂ（下段）のＥＰの５日後に血清を回収し、そして、ヒトＩｇＧ発現、種々のＨＡタンパク質への結合活性、及び、中和活性を評価した。
【図11】図１１は、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂが、０．３ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＡ ＩｇＧと同様のレベルの致命的Ａ型インフルエンザ感染からマウスを保護することを実証する実験の結果を示す。感染時の精製ＩｇＧに対するＤＭＡｂの血清濃度。体重減少、及び、致命的Ａ型インフルエンザ感染での接種した後の生存率、＊ｌｏｇ－ｒａｎｔ検定によって、コントロールＤＭＡｂと比較した、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂの有意な生存利益、ｐ＜０．０００１。
【図12】図１２は、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂが、１ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＢ ＩｇＧと同様のレベルで、致命的なＢ型インフルエンザ感染からマウスを保護することを実証する実験の結果を示す。感染時の精製ＩｇＧに対するＤＭＡｂの血清濃度。体重減少、及び、致命的Ｂ型インフルエンザ感染での接種した後の生存率、＊ｌｏｇ－ｒａｎｔ検定によって、コントロールＤＭＡｂと比較した、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂの有意な生存利益、ｐ＜０．０００１。
【図13】図１３は、ＦｌｕＡとＦｌｕＢ ＤＭＡｂとを併用投与した場合に、致命的Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ感染のいずれかから、マウスを保護することを実証する実験の結果を示す。感染時の精製ＩｇＧの組み合わせについてのＦｌｕ ＤＭＡｂの併用血清濃度。Ａ型またはＢ型インフルエンザに特異的な定量は、併用ＤＭＡｂ処置が、単独投与の場合で認められたのと同様のレベルの発現を生じることを示す。致命的Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ感染での接種後の生存率、＊Ｌｏｇ－ｒａｎｔ検定によって、コントロールＤｍＡｂと比較した、ＦｌｕＡ＋ＦｌｕＢ ＤＭＡｂの有意な生存利益、ｐ＜０．０００１。
【図14】図１４は、図１４Ａ～図１４Ｆを含んでおり、ＤＮＡでコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）構築物のインビトロ及びインビボでの発現を実証する実験の結果を示す。図１４Ａは、細胞上清（左）及び溶解物（右）におけるヒトＩｇＧ発現を、ＥＬＩＳＡで定量化したものを示す。２９３Ｔ細胞を、ＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド構築物、または、空のプラスミド（ｐＶａｘ１）でトランスフェクトした。（ｎ＝３、±ＳＥＭ）。図１４Ｂは、低下したＤＭＡｂ－トランスフェクト２９３Ｔ細胞上清（Ｓ）、及び、溶解物（Ｌ）（左）、及び、精製タンパク質モノクローナル抗体ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ（ＩｇＧ、右）におけるヒトＩｇＧ重鎖、及び、軽鎖ペプチドのウエスタンブロットを示す。図１４Ｃは、１００～３００μｇのＦｌｕＡプラスミドＤＮＡを筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）（０日目）した後のＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｃｒヌードマウス血清でのＤＭＡｂヒトＩｇＧを示す。（ｎ＝５、±ＳＥＭ）。図１４Ｄは、１００～３００μｇのＦｌｕＢプラスミドＤＮＡを筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）（０日目）した後のＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｃｒヌードマウス血清でのＤＭＡｂヒトＩｇＧを示す。（ｎ＝５、±ＳＥＭ）。図１４Ｅは、１００～３００μｇのＦｌｕＡプラスミドＤＮＡを投与して５日後のＢＡＬＢ／ｃマウス血清でのＤＭＡｂヒトＩｇＧのレベルを示す。点線は、検出限界（ＬＯＤ）を示す。（ｎ＝５、±ＳＥＭ）。図１４Ｆは、１００～３００μｇのＦｌｕＢプラスミドＤＮＡを投与して５日後のＢＡＬＢ／ｃマウス血清でのＤＭＡｂヒトＩｇＧのレベルを示す。点線は、検出限界（ＬＯＤ）を示す。（ｎ＝５、±ＳＥＭ）。
【図15】図１５は、図１５Ａ～図１５Ｃを含んでおり、血清ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂが機能的である、ことを実証する実験の結果を示す。１００～３００μｇのＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡで処置をした５日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清に対して機能アッセイを行った。図１５Ａは、グループ１（Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ Ｈ１Ｎ１、Ｈ２ Ａ／Ｍｉｓｓｏｕｒｉ／２００６ Ｈ２Ｎ３、Ｈ５ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１、Ｈ６ Ａ／ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７ Ｈ６Ｎ１、Ｈ９ Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／１９９７ Ｈ９Ｎ２）、及び、グループ２（Ｈ３ Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９ Ｈ３Ｎ２、Ｈ７ Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３ Ｈ７Ｎ７）から得たＡ型インフルエンザＨＡタンパク質に対する個々のマウス血清試料についてのＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０値（レシプロカル希釈）を示す。図１５Ｂは、Ｙａｍａｇａｔａ（Ｙａｍ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）、及び、Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｖｉｃ Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８）系統から得たＢ型インフルエンザＨＡタンパク質に対する個々のマウス血清試料についてのＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０値（レシプロカル希釈）を示す。図１５Ｃは、Ｙａｍ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、及び、Ｖｉｃ Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ウイルスに対する個々のマウス血清試料についての中和ＩＣ５０値（レシプロカル希釈）を示す。（ｎ＝５、±ＳＤ）。
【図16】図１６は、図１６Ａ～図１６Ｆを含んでおり、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂが、多様な致命的Ａ型インフルエンザ接種からマウスを保護することを実証する実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１（Ａ－Ｃ）、または、再分類したｒＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／８／６８ｘＰＲ８ Ｈ３Ｎ１（Ｄ－Ｆ）で鼻腔内感染させる４～５日前に、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡ（塗り潰し記号）で処置をした。感染の１日前に、各マウスに、０．０３～１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡタンパク質モノクローナル抗体を腹腔内投与した。（白抜き記号）。３００μｇの無関係のＤＭＡｂ（ＤＶＳＦ－３）、または、１ｍｇ／ｋｇの非特異的タンパク質モノクローナル抗体（Ｒ３４７）で処置をしたマウスを、コントロールとして用いた。図１６Ａは、インフルエンザ感染時のマウス血清でのヒトＩｇＧを示す。図１６Ｂは、Ａ型インフルエンザを接種したＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。（ｎ＝１０）。図１６Ｃは、Ａ型インフルエンザを接種した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を示す。点線は、２５％の最大減量を示す。（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。図１６Ｄは、インフルエンザ感染時のマウス血清でのヒトＩｇＧを示す。図１６Ｅは、Ａ型インフルエンザを接種した後のＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。（ｎ＝１０）。図１６Ｆは、Ａ型インフルエンザを接種した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を示す。点線は、２５％の最大減量を示す。（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。
【図17】図１７は、図１７Ａ～図１７Ｆを含んでおり、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂが、多様な致命的Ｂ型インフルエンザ接種からマウスを保護することを示す実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ａ－Ｃ）、または、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６ Ｙａｍａｇａｔａ（Ｄ－Ｆ）系統ウイルスで感染させる５日前に、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡで処置をした。感染の１日前に、各群のマウスに、０．０３～１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＢタンパク質モノクローナル抗体を腹腔内投与した。図１７Ａは、感染時のマウス血清でのヒトＩｇＧを示す。点線は、ＬＯＤを示す。（ｎ＝１０、±ＳＤ）。図１７Ｂは、Ｂ型インフルエンザを接種したＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。（ｎ＝１０）。図１７Ｃは、Ｂ型インフルエンザを接種した後のＢＡＬＢ／Ｃマウスの体重を示す。点線は、２５％の最大減量を示す。（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。図１７Ｄは、感染時のマウス血清でのヒトＩｇＧを示す。点線は、ＬＯＤを示す。（ｎ＝１０、±ＳＤ）。図１７Ｅは、Ｂ型インフルエンザを接種したＢＡＬＢ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。（ｎ＝１０）。図１７Ｆは、Ｂ型インフルエンザを接種した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重を示す。点線は、２５％の最大減量を示す。（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。
【図18】図１８は、図１８Ａ～図１８Ｆを含んでおり、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの同時投与が、致命的Ａ型／Ｂ型インフルエンザ接種及び相同性再接種からマウスを保護することを実証する実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの双方を受けた。各マウスを、ＦｌｕＡ＋ＦｌｕＢタンパク質モノクローナル抗体で処置をした。マウスを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、または、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のいずれかのインフルエンザで初期感染させた。図１８Ａは、感染時のマウス血清での全ヒトＩｇＧレベルを示す。（ｎ＝８±ＳＤ）。図１８Ｂは、ＨＡ結合ＥＬＩＳＡによって定量化した感染時のマウス血清でのＡ型及びＢ型インフルエンザ特異的ヒトＩｇＧを示す。（ｎ＝８、±ＳＤ）。図１８Ｃは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９で初期感染した後のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。図１８Ｄは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６で初期感染した後のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。図１８Ｅは、初期感染の２８日後に、生存しているマウスに対して同種のインフルエンザを再感染させた実験を示す。ＤＭＡｂ／ＩｇＧ処置も、初期感染もしていない（ナイーブ）マウスと比較をした、再感染後のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。図１８Ｆは、初期感染の２８日後に、生存しているマウスに対して同種のインフルエンザを再感染させた実験を示す。ＤＭＡｂ／ＩｇＧ処置も、初期感染もしていない（ナイーブ）マウスと比較をした、再感染後のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。
【図19】図は、インビボでのＤＭＡｂ発現の増強を実証する実験の結果を示す。２００μｇのＦｌｕＢプラスミドＤＮＡの連続修正投与を受けたマウスでの５日後の血清ＤＭＡｂヒトＩｇＧ発現。筋肉内電気穿孔のみ（ＩＭ－ＥＰ）、または、ヒアルロニダーゼ製剤を用いたＩＭ－ＥＰ（Ｈｙａ＋ＩＭ－ＥＰ）を介して、プラスミドＤＮＡを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに送達した。さらに、プラスミド導入遺伝子挿入配列を、発現を強めるために、ＤＮＡコドン最適化、及び、ＲＮＡ最適化した（Ｏｐｔ＋Ｈｙａ＋ＩＭ－ＥＰ）。その他のすべての研究は、Ｏｐｔ＋Ｈｙａ＋ＩＭ－ＥＰで行った。（群当たりｎ＝５の動物、平均±ＳＥＭ）。
【図20】図２０は、マウス血清でのＦｌｕＡ ＤＭＡｂが、Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ１０に結合することを示す実験の結果を示す。１００～３００μｇのＦｌｕＡ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡで処置をして５日後に回収したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を連続希釈し、そして、Ａ型インフルエンザグループ２の組換えＨ１０抗原（Ａ／Ｊｉａｎｇｘｉ－Ｄｏｎｇｈｕ／３４６／２０１３ Ｈ１０Ｎ８）（ＩＢＴ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ）で被覆した９６ウェルプレートに添加した。ＨＲＰ結合二次抗体ロバ抗ヒトＩｇＧ（１：５，０００）でＤＭＡｂ結合を検出し、そして、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて発色させた。４５０ｎｍで、吸光度を測定した。未処置（ナイーブ）マウス由来の血清を、コントロールとして用いた。（群当たりｎ＝５、平均±ＳＤ）。
【図21】図２１は、図２１Ａ及び図２１Ｂを含んでおり、インビボで発現したＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂが、精製ＩｇＧと同様のレベルで機能性ＩｇＧを産生することを実証する実験の結果を示す。図２１Ａは、ＦｌｕＡプラスミドＤＮＡ、精製抗－インフルエンザＩｇＧタンパク質、または、無関係なコントロールＤＭＡｂ（ＤＶＳＦ－３）で処置をした動物由来の血清試料でのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１から得た精製Ｈ１ ＨＡタンパク質に対する反応性を示す。インフルエンザ感染の当日に血清を採取し、そして、ＥＬＩＳＡに結合させることで、ＨＡ反応性を試験した。図２１Ｂは、ＦｌｕＢプラスミドＤＮＡ、精製抗－インフルエンザＩｇＧタンパク質、または、無関係なコントロールＤＭＡｂ（ＤＶＳＦ－３）で処置をした動物由来の血清試料でのＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ６０／２００８Ｖｉｃｔｏｒｉａから得た精製Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統ＨＡタンパク質に対する反応性を示す。インフルエンザ感染の日に血清を採取し、そして、ＥＬＩＳＡに結合させることで、ＨＡ反応性を試験した。
【図22】図２２は、図２２Ａ及び図２２Ｂを含んでおり、ＦｌｕＢが、肺におけるＢ型インフルエンザウイルス負荷を有意に低下させることを実証する実験の結果を示す。感染の５日前に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２００μｇのＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡ、または、無関係のＤＭＡｂコントロール（ＤＶＳＦ－３）で処置した。感染の１日前に、それぞれの群に対して、０．０３～１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＢ精製ＩｇＧタンパク質、または、無関係のコントロールＩｇＧ Ｒ３４７を腹腔内投与した。図２２Ａは、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０８／２００４で感染をして５日後の肺ウイルス力価を示す。図２２Ｂは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６で感染をして５日後の肺ウイルス力価を示す。（ｎ＝４、±ＳＥＭ）。点線は、ＬＯＤを示す。＊スチューデントｔ検定によって、コントロールＤＭＡｂ ＤＶＳＦ－３群と比較をした、ウイルス力価の有意な減少。
【図23】図２３は、図２３Ａ～図２３Ｄを含んでおり、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの同時投与が、致命的なインフルエンザ接種、及び、相同性再接種からマウスを保護することを実証する実験の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの双方を受けた。感染の１日前に、それぞれの群を、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢタンパク質ＩｇＧの組み合わせの０．１～１ｍｇ／ｋｇで処置をした。図２３Ａは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９を感染させた動物の体重減少を示す（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。図２３Ｂは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を感染させた動物の体重減少を示す（ｎ＝１０、±ＳＥＭ）。図２３Ｃは、初期感染の２８日後に、生存しているマウスに対してＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９で相同インフルエンザを再接種した後の体重減少を示す。図２３Ｄは、初期感染の２８日後に、生存しているマウスに対してＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６で相同インフルエンザを再接種した後の体重減少を示す。
【図24】図２４は、図２４Ａ～図２４Ｄを含んでおり、感染させて２１日後のＤＭＡｂで処置したマウスの血清反応性を実証する実験の結果を示す。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、または、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６で感染をさせて２１日後に生存していたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を用いて、機能アッセイを実施した。図２４Ａは、感染ウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９に対する赤血球凝集阻害活性（レシプロカル希釈）を示す。図２４Ｂは、Ａ型インフルエンザ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ＨＡタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０値（レシプロカル希釈）を示す。図２４Ｃは、感染ウイルスＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に対する赤血球凝集阻害活性（レシプロカル希釈）を示す。図２４Ｄは、Ｂ型インフルエンザＨＡタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０値（レシプロカル希釈）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、インビボでの発現、及び、インフルエンザ抗原に対する合成抗体の形成を促すために、それを必要とする対象に投与することができる。
【0019】
特に、組換え核酸配列から発現した重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てることができる。当該重鎖ポリペプチド及び当該軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することができ、本明細書に記載のようにして組み立てられていない抗体に比べて免疫原性がさらに強く、かつ、抗原に対して免疫応答を惹起、もしくは、誘導することが可能な合成抗体の組み立てができるように、互いに相互作用することができる。
【0020】
さらに、これらの合成抗体は、当該対象において、抗原免疫誘導性免疫応答に応答して産生される抗体よりも迅速に生成される。当該合成抗体は、ある範囲の抗原に対して効果的に結合し、そして、中和することができる。当該合成抗体は、当該標的に対して高度に特異的である。当該合成抗体はまた、疾患から効果的に保護をし、及び／または、疾患での延命を図ることができる。
【0021】
１．定義
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び、他の引用文献は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。なお、本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書に記載したものと同様または同等の方法及び材料を用いることはできるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び、他の引用文献は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する。なお、本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【0022】
本明細書で使用する用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及び、その変形は、付加的な行為または構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または、単語であることを意図している。単数形である「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上断りの無い限りは、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」その他の実施形態も企図する。
【0023】
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、または、ＩｇＥの抗体、または、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、ならびに、その一本鎖抗体、及び、誘導体を意味し得る。当該抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、または、これらの混合物のうち、所望のエピトープ、または、それに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【0024】
本明細書で互換的に使用する、「抗体断片」または「抗体の断片」は、抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部分のことを指す。この部分は、完全抗体のＦｃ領域のある特定の重鎖領域（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、及び、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
【0025】
「抗原」は、宿主において免疫応答を生成する能力を有するタンパク質のことを指す。抗原は、抗体によって認識され、そして、結合され得る。抗原は、体内または外部環境から生じ得る。場合によっては、抗原は、インフルエンザ抗原である。
【0026】
本明細書で使用する「コード配列」または「コード核酸」とは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）のことを意味し、同核酸は、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。当該コード配列は、当該核酸の投与を受ける個体または哺乳動物の細胞内での発現を指示することができるプロモーターやポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナルと終止シグナルとをさらに含み得る。当該コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
【0027】
本明細書で使用する「相補体」または「相補的」とは、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間に、ワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）、または、フーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
【0028】
本明細書で使用する「定電流」とは、組織、または、当該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容する、または、経験する電流を定義する。当該電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、当該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは、瞬間的フィードバックを有しているフィードバック素子を具備しているからである。当該フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または、細胞）の抵抗を測定し、及び、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ようにすることができるので、同組織での電流は、電気パルスの間ずっと（マイクロ秒のオーダーで）、及び、パルス間において、一定であり続ける。幾つかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
【0029】
本明細書で使用する「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に使用されており、及び、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、使用者が予め設定する。電気穿孔装置内の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または、組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御器によって達成され得る。当該フィードバックループは、瞬時のものであり得るものであり、それは、フィードバックループが、アナログ閉ループフィードバックであるからである。
【0030】
本明細書で使用する「分散電流」とは、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得るものであり、これらのパターンは、電気穿孔される組織のあらゆる領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または、好ましくは、消失させる。
【0031】
本明細書で互換的に使用する「電気穿孔」、「電気透過処理」、または「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、及び、水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【0032】
本明細書で使用する「内因性抗体」とは、体液性免疫応答を誘導するのに有効な量で存在する、抗原を投与されている対象内で生成される抗体のことを指し得る。
【0033】
本明細書で使用する「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（または、ファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、及び／または、送達後の）所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは、電流と比較して、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスのことを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
【0034】
「断片」は、機能、すなわち、所望の標的に結合でき、かつ、全長抗体と同じ意図した効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、シグナルペプチド、及び／または、第１位のメチオニンを有していても、欠いていても、いずれの場合にも、Ｎ末端、及び／または、Ｃ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠けている以外は、全長と１００％同一であってもよい。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いて、特定の全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。当該断片は、当該抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上同一であり、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニン、または、異種シグナルペプチドをさらに含むポリペプチドの断片を含む。さらに、断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドは、抗体の断片に結合し得る。
【0035】
抗体をコードする核酸配列の断片は、シグナルペプチド、及び／または、第１位のメチオニンをコードする配列を有していても、または、欠いていても、いずれの場合にも、５’末端、及び／または、３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドが欠けている以外は、全長と１００％同一とし得る。断片は、付加されたあらゆる異種シグナルペプチドを除いた特定の全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。当該断片は、抗体に対して９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上同一であり、かつ、同一率を計算する際に含まれないＮ末端メチオニン、または、異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに任意に含むポリペプチドをコードする断片を含み得る。さらに、断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのＮ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドに対するコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニン、及び／または、シグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に結合し得る。
【0036】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のことを指しており、同分子は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。当該コード配列は、当該核酸の投与を受ける個体の細胞内での発現を指示することができるプロモーターやポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナルと終止シグナルとを含む。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」とは、当該個体の細胞内に存在する場合に、当該コード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に連結された必須の調節エレメントを含む遺伝子構築物のことを指す。
【0037】
本明細書において、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が、指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、２つの配列を好適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、双方の配列間で同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致した位置の個数を指定領域の合計位置数で割り、計算結果に１００を掛けることで、配列同一性のパーセント値を算出し得る。２つの配列の長さが異なるか、あるいは、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じて、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を、計算の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなし得る。同一性は、筆算で求めてもよく、あるいは、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して計算することもできる。
【0038】
本明細書で使用する「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に利用し得るものであり、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較が可能である。
【0039】
本明細書で使用する「免疫応答」とは、１つ以上の核酸、及び／または、ペプチドの導入に応答して、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性応答または体液性応答、または、その両方であり得る。
【0040】
本明細書で使用する「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することで、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所定の核酸として同一目的で使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸、及び、その相補体も含む。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも含む。
【0041】
核酸は、一本鎖または二本鎖とするか、あるいは、二本鎖及び一本鎖配列の双方の一部を含み得る。当該核酸は、ゲノム及びｃＤＮＡの双方のＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ハイブリッドとすることができ、当該核酸は、デオキシリボヌクレオチド、及び、リボヌクレオチドの組み合わせ、及び、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及び、イソグアニンなどの塩基の組み合わせを含み得る。用語の核酸とは、核酸類似体、及び、非天然核酸も含む。例えば、当該核酸を、修飾してもよく、例えば、１つ以上の修飾核酸塩基、または、修飾した糖部分を含み得る。当該核酸の主鎖は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）におけるように、１つ以上のペプチド結合を含み得る。当該核酸は、非プリン、または、非ピリミジン類似体、または、ヌクレオチド類似体などの塩基類似体を含み得る。核酸は、化学合成法、または、組換え法によって取得し得る。
【0042】
本明細書で使用する「作動可能に連結した」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。当該プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において当該プロモーターを制御する遺伝子とプロモーターとの間の距離とほぼ同一とし得る。当該技術分野で周知の通り、プロモーター機能を喪失させずに、この距離の変化に適応し得る。
【0043】
本明細書で使用する「ペプチド」、「タンパク質」、または、「ポリペプチド」とは、アミノ酸の結合配列のことを意味することができ、天然、合成、または、天然及び合成の修飾、あるいは、それらの組み合わせとすることができる。
【0044】
本明細書で使用する「プロモーター」とは、核酸の細胞での発現を、実現し、活性化し、または、増強することのできる合成分子または天然由来分子のことを意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、及び／または、空間的発現、及び／または、その一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このものは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び、動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を調節し得るものであり、発現が起こる細胞、組織、もしくは、臓器、あるいは、発現が起こる発生段階については、恒常的もしくは差次的に、または、例えば、生理的ストレス、病原体、金属イオン、あるいは、誘発剤などの外部刺激に応答して同発現を調節し得る。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及び、ＣＭＶ ＩＥプロモーターなどがある。
【0045】
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用されており、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列のことを指す。一般的に、シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くする。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質、別名、成熟タンパク質の残余から開裂されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に結合する。
【0046】
本明細書で使用する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする際の条件のことを意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況に応じて変化する。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔｍ）より約５～１０℃低くなるように選択される。このＴｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、及び、核酸濃度下で）標的に対して相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度のことである（この標的配列は、過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３において、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または、その他の塩）であり、及び、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）では、低くとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超えるもの）では、低くとも約６０℃とし得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加しても実現し得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下の条件を含む。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び、１％ＳＤＳを用いて、４２℃でのインキュベート、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて、６５℃でのインキュベートと、０．２×ＳＳＣ、及び、０．１％ＳＤＳを用いて、６５℃での洗浄を含む。
【0047】
本明細書で互換的に使用する「対象」及び「患者」とは、あらゆる脊椎動物を指すものであって、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及び、マウス）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、もしくは、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、及び、ヒトなどがあるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、当該対象は、ヒトあるいは非ヒトとし得る。当該対象あるいは患者は、その他の形態の処置を受け得る。
【0048】
本明細書で使用する「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一であること、あるいは、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【0049】
本明細書で使用する「実質的に同一」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、または、それ以上の個数のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、当該第１の配列が、当該第２の配列の相補体と実質的に相補的であることを意味し得る。
【0050】
本明細書で使用する「合成抗体」とは、本明細書に記載の組換え核酸配列によってコードされ、そして、対象において生成される抗体のことを指す。
【0051】
本明細書で使用する「処置」または「処置する」は、疾患の予防、抑制、抑圧、または、完全排除の手段を介して、対象を疾患から保護するものと意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後であって、その疾患の臨床的出現の前に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、当該対象に対して、本発明のワクチンを投与することを含む。
【0052】
核酸に関して本明細書で使用する「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）基準核酸またはその相補体と実質的に同一の核酸、または、（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、または、それらと実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸のことを意味し得る。
【0053】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または、保存的置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものを意味し得る。また、変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、類似する特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び、分布）の別のアミノ酸に置換することは、当該技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当該技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水親水度指数を検討することで、部分的に同定できる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水親水度指数は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水親水度指数を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持する、ことが当該技術分野において公知である。ある態様において、±２の疎水親水度指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することで、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性と免疫原性に対して良好に相関すると報告された有用な尺度となる。本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば、免疫原性などの生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸の置換とは、当該アミノ酸の相対的類似性、特に、当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、このことは、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び、その他の特性から明らかになる。
【0054】
変異体は、当該完全遺伝子配列、または、その断片の全長にわたって、実質的に同一である核酸配列とし得る。当該核酸配列は、遺伝子配列、または、その断片の全長と、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一とし得る。変異体は、当該アミノ酸配列、または、その断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列とし得る。当該アミノ酸配列は、アミノ酸配列、または、その断片の全長と、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一とし得る。
【0055】
本明細書で使用する「ベクター」は、複製開始点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とし得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、または、ＲＮＡベクターとし得る。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクター、または、宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかとし得る。
【0056】
本明細書における数値範囲の記載については、同程度の精度で、その間に入る各数を、明示的に企図している。例えば、６～９という範囲の場合、６及び９に加えて、７及び８という数を企図しており、６．０～７．０という範囲の場合、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び、７．０という数を明示的に企図している。
【0057】
２．組成物
本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、それを必要とする対象に投与する場合、当該対象において合成抗体を生成することができる。当該合成抗体は、当該対象に存在する標的分子（すなわち、インフルエンザ抗原）に結合することができる。そのような結合は、抗原を、中和して、別の分子、例えば、タンパク質、または、核酸による当該抗原の認識をブロックし、そして、当該抗原に対する免疫応答を惹起または誘導することができる。
本発明は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。当該組成物は、それを必要とする対象に投与する場合、当該対象において合成抗体を生成することができる。当該合成抗体は、当該対象に存在する標的分子（すなわち、インフルエンザ抗原）に結合することができる。そのような結合は、抗原を、中和して、別の分子、例えば、タンパク質、または、核酸による当該抗原の認識をブロックし、そして、当該抗原に対する免疫応答を惹起または誘導することができる。
【0058】
ある実施形態において、当該組成物は、合成抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該組成物は、第１の合成抗体をコードする第１のヌクレオチド配列、及び、第２の合成抗体をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、開裂ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0059】
ある実施形態において、当該核酸分子は、抗－ＨＡ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、抗－ＨＡ抗体をコードする当該ヌクレオチド配列は、抗－ＨＡの可変ＶＨ、及び、ＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、抗－ＨＡ抗体をコードする当該ヌクレオチド配列は、ヒトＩｇＧ１κのＣＨ及びＣＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。
【0060】
ある実施形態において、当該核酸分子は、ＦｌｕＡ重鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、ＦｌｕＡ軽鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、ＦｌｕＡ重鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列、及び、ＦｌｕＡ軽鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、ＦｌｕＢ重鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列、及び、ＦｌｕＢ軽鎖抗－ＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0061】
ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、インフルエンザＨＡの球状頭部に結合する。ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、ＦＪ８である。ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、インフルエンザＨＡの融合サブドメインに結合する。ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、ＦＩ６である。ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、ＦｌｕＡ Ｈ５、及び、Ｈ７ ＨＡタンパク質に対して交差反応性を示す。ある実施形態において、当該抗－ＨＡ抗体は、ＦｌｕＢ ＨＡタンパク質に反応性を示す。
【0062】
ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号１～８から選択されるアミノ酸配列、または、その変異体、または、その断片を含む抗－ＨＡ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、抗－ＨＡ抗体をコードする当該核酸は、配列番号９～１２のいずれかのヌクレオチド配列、または、その変異体、または、その断片を含む。ある実施形態において、抗－ＨＡ抗体をコードする当該核酸は、配列番号９～１２のいずれかのＤＮＡ配列、または、その変異体、または、その断片から転写されたＲＮＡ分子を含む。
【0063】
ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号１～８から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるアミノ酸配列を含む抗－ＨＡ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号１～８から選択されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるアミノ酸配列を含む抗－ＨＡ抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0064】
ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号９～１６から選択されるヌクレオチド配列の全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号９～１６から選択されるヌクレオチド配列の全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるヌクレオチド配列の断片を含む。
【0065】
ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号９～１６から選択されるＤＮＡの全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ配列を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号９～１６から選択されるＤＮＡの全長と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、少なくとも約９５％が同一であるＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ配列の断片を含む。
【0066】
ある実施形態において、抗－ＨＡ抗体をコードする当該ヌクレオチド配列は、抗－ＨＡの可変ＶＨ、及び、ＶＬ領域をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ＶＨ領域は、配列番号５、７、９または１０のアミノ酸配列、または、その変異体、または、その断片を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ＶＨ領域は、配列番号５、７、９または１０、または、その断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または、少なくとも９５％以上が相同であるアミノ酸を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ＶＬ領域は、配列番号６～１０の１つのアミノ酸配列、または、その変異体、または、その断片を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ヌクレオチド配列可変ＶＨ領域は、配列番号１３または１５のヌクレオチド配列、または、その変異体、または、その断片を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ヌクレオチド配列可変ＶＨ領域は、配列番号１３または１５、または、その変異体、または、その断片と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または、少なくとも９５％以上が相同であるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ヌクレオチド配列可変ＶＬ領域は、配列番号１４、１５または１６、または、その変異体、または、その断片を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ヌクレオチド配列可変ＶＬ領域は、配列番号１４、１５または１６、その断片に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または、少なくとも９５％以上が相同であるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、ＨＡの当該ヌクレオチド配列可変ＶＬ領域は、配列番号１４、１５または１６のいずれかのＤＮＡ配列、または、その変異体、またはは、その断片から転写されたＲＮＡ分子を含む。
【0067】
ある実施形態において、当該組成物は、少なくとも２つの核酸分子を含む。ある実施形態において、当該核酸分子は、ＦｌｕＡ重鎖抗－ＨＡをコードする核酸、ＦｌｕＡ軽鎖抗－ＨＡをコードする核酸、ＦｌｕＡ抗－ＨＡをコードする核酸、及び、ＦｌｕＢ抗－ＨＡをコードする核酸から選択される。ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号１～８の１つをコードする核酸から選択される。ある実施形態において、当該核酸分子は、配列番号１～８と少なくとも９０％が相同であるペプチドをコードする核酸から選択される。ある実施形態において、当該組成物は、配列番号１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、かつ、配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。ある実施形態において、当該組成物は、配列番号９を含むヌクレオチド配列を含む核酸と、配列番号１０を含むヌクレオチド配列を含む核酸とを含む。
【0068】
本発明の組成物は、あらゆるインフルエンザ感染症に対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。特定の実施形態において、当該組成物は、Ａ型インフルエンザ感染症に対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。特定の実施形態において、当該組成物は、グループＨ１またはグループＨ３のＡ型インフルエンザウイルスに対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。別の実施形態において、当該Ａ型インフルエンザウイルスは、ｐｍＨ１インフルエンザウイルスである。その他の実施形態において、当該組成物は、Ｂ型インフルエンザ感染症に対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。
【0069】
合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患に対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。抗原に結合することで、当該合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患に対して、処置、予防、及び／または、保護をすることができる。当該合成抗体は、当該組成物を投与した対象における疾患生存率を改善することができる。ある実施形態において、当該合成抗体は、当該合成抗体の投与を受けていない同じ疾患を有する対象において予測された生存期間にわたって、当該疾患を有する対象の延命を可能にする。様々な実施形態において、当該合成抗体は、当該組成物の非存在下で予測される生存期間にわたって、当該組成物の投与を受けた当該疾患を有する対象の生存について、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％の改善を示すことができる。ある実施形態において、当該合成抗体は、当該対象における疾患に対する保護を示しており、当該合成抗体の投与を受けていない対象において予期される保護を超えるものである。様々な実施形態において、当該合成抗体は、当該組成物の投与を受けた対象の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または、１００％において疾患に対する保護を示しており、当該組成物の非存在下で予測される保護を超えるものである。
【0070】
当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または、６０時間以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または、１０日以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、当該対象に当該組成物を投与した後、約１時間～約６日、約１時間～約５日、約１時間～約４日、約１時間～約３日、約１時間～約２日、約１時間～約１日、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、または、約１時間～約６時間以内に、その対象にて当該合成抗体を生成することができる。
【0071】
当該組成物は、それを必要とする対象に投与した場合に、抗原の投与を受けて体液性免疫応答を誘発する対象において内因性抗体を生成する場合よりも迅速に、当該対象において当該合成抗体を生成することができる。当該組成物は、抗原の投与を受けて体液性免疫応答を誘発する対象において内因性抗体を生成する少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または、１０日前に、当該合成抗体を生成することができる。
【0072】
本発明の組成物は、安全であるなど、有効な組成物に必要とされる特徴を有しているため、当該組成物は、病気や死亡に至らしめるものではなく、病気から保護をして、そして、投与が容易で、副作用もほぼ皆無であり、生物学的に安定で、また、用量当たりのコストも削減する。
【0073】
３．組換え核酸配列
上記したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、当該抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細については、後述する。
上記したように、当該組成物は、組換え核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列は、当該抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体の詳細については、後述する。
【0074】
当該組換え核酸配列を、異種核酸配列とすることができる。当該組換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列、または、１つ以上の異種核酸配列を含むことができる。
【0075】
当該組換え核酸配列を、最適化した核酸配列とすることができる。そのような最適化は、当該抗体の免疫原性を、強化または改変し得る。また、最適化は、転写、及び／または、翻訳を改善することもできる。最適化には、以下の１つ以上を取り入れることができる。低ＧＣ含量リーダー配列によって、転写を増大させること。ｍＲＮＡの安定性とコドン最適化。コザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）を追加して、翻訳を増進させる。シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列を追加する。そして、シス作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）を可能な限り取り除くこと。
【0076】
ａ．組換え核酸配列構築物
当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、その詳細については、後述する。
当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素を含むことができ、その詳細については、後述する。
【0077】
当該組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ、または、ペプチダーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列も含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができ、各リーダー配列は、シグナルペプチドをコードする。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終止領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終止コドンまたは停止コドン、及び／または、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。また、当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカーまたはタグ配列も含むことができる。当該タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。
【0078】
（１）重鎖ポリペプチド
当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域、及び／または、少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの当該定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、定常重鎖領域３（ＣＨ３）、及び／または、ヒンジ領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域、及び／または、少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含むことができる。少なくとも１つの当該定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、定常重鎖領域３（ＣＨ３）、及び／または、ヒンジ領域を含むことができる。
【0079】
幾つかの実施形態において、当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、及び、ＣＨ１領域を含むことができる。他の実施形態において、当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及び、ＣＨ３領域を含むことができる。
【0080】
当該重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。このＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドのＮ－末端から開始して、これらのＣＤＲを、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と命名する。当該重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、当該抗原に対する結合、または、抗原の認識に寄与することができる。
【0081】
（２）軽鎖ポリペプチド
当該組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域、及び／または、定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードする異種核酸配列を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域、及び／または、定常軽鎖（ＣＬ）領域を含むことができる。
【0082】
当該軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含むことができる。このＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含むことができる。当該軽鎖ポリペプチドのＮ－末端から開始して、これらのＣＤＲを、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と命名する。当該軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３は、当該抗原に対する結合、または、抗原の認識に寄与することができる。
【0083】
（３）プロテアーゼ開裂部位
当該組換え核酸配列構築物は、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。当該プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。このプロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとすることができ、例えば、フーリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び、ペプシンなどがあるが、これらに限定されない。このプロテアーゼを、フーリンとすることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または、内部ペプチド結合を開裂する（すなわち、Ｎ－末端またはＣ－末端ペプチド結合を開裂しない）あらゆるプロテアーゼとすることができる。
当該組換え核酸配列構築物は、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする異種核酸配列を含むことができる。当該プロテアーゼ開裂部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。このプロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼとすることができ、例えば、フーリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び、ペプシンなどがあるが、これらに限定されない。このプロテアーゼを、フーリンとすることができる。他の実施形態において、このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または、内部ペプチド結合を開裂する（すなわち、Ｎ－末端またはＣ－末端ペプチド結合を開裂しない）あらゆるプロテアーゼとすることができる。
【0084】
当該プロテアーゼ開裂部位は、開裂の効率を改善または増大する１つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。１つ以上の当該アミノ酸配列は、個別のポリペプチドの形成または生成の効率を改善または増大することができる。１つ以上の当該アミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含むことができる。
【0085】
（４）リンカー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。当該リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を、空間的に分離、または、連結することができる。他の実施形態において、当該リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離、または、連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含むことができる。当該リンカー配列は、本明細書に記載の１つ以上の構成要素を、空間的に分離、または、連結することができる。他の実施形態において、当該リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離、または、連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
【0086】
（５）プロモーター
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。１つ以上の当該プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ、調節することが可能なあらゆるプロモーターとし得る。かようなプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを経由する転写に必要とされるシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。当該プロモーターは、その自然環境における転写開始部位から由来しているため、当該組換え核酸配列構築物の当該転写開始からほぼ同じ距離で位置し得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに、適合し得る。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。１つ以上の当該プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ、調節することが可能なあらゆるプロモーターとし得る。かようなプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを経由する転写に必要とされるシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。当該プロモーターは、その自然環境における転写開始部位から由来しているため、当該組換え核酸配列構築物の当該転写開始からほぼ同じ距離で位置し得る。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに、適合し得る。
【0087】
当該プロモーターは、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列に作動可能に連結され得る。当該プロモーターは、真核細胞での発現に有効であることが示されたプロモーターとし得る。当該コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、及び、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターなど、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、または、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどとし得る。また、当該プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトポリヘドリン、または、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターとし得る。
【0088】
当該プロモーターは、宿主細胞が何らかの特定の外的刺激に曝された場合にのみ転写を開始する、構成的プロモーター、または、誘導性プロモーターとすることができる。多細胞生物の場合、当該プロモーターを、特定の組織、または、器官、または、発生段階に特異的にすることもできる。また、当該プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、筋肉または皮膚特異的プロモーター、天然または合成のものとし得る。かようなプロモーターの例は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国特許出願公開公報第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。
【0089】
当該プロモーターは、エンハンサーと関連することができる。当該エンハンサーは、当該コード配列の上流に位置することができる。当該エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、または、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、または、ＥＢＶに由来するウイルスエンハンサーとし得る。ポリヌクレオチド機能増強は、本明細書の一部を構成するものとしてそれぞれの全内容を援用する米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、及び、第ＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。
【0090】
（６）イントロン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位、及び、機能的スプライスアクセプター部位を含むことができる。当該イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。当該イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のイントロンを含むことができる。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位、及び、機能的スプライスアクセプター部位を含むことができる。当該イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含むことができる。当該イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。
【0091】
（７）転写終止領域
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含むことができる。当該転写終止領域は、効率的な終止を提供するためにコード配列の下流とすることができる。当該転写終止領域は、上記したプロモーターと同じ遺伝子から取得することができ、あるいは、１つ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終止領域を含むことができる。当該転写終止領域は、効率的な終止を提供するためにコード配列の下流とすることができる。当該転写終止領域は、上記したプロモーターと同じ遺伝子から取得することができ、あるいは、１つ以上の異なる遺伝子から取得することもできる。
【0092】
（８）開始コドン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。当該開始コドンは、当該コード配列の上流に位置させることができる。当該開始コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該開始コドンは、効率的な翻訳開始のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位と関連することができるが、これに限定されることはない。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含むことができる。当該開始コドンは、当該コード配列の上流に位置させることができる。当該開始コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該開始コドンは、効率的な翻訳開始のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができ、例えば、リボソーム結合部位と関連することができるが、これに限定されることはない。
【0093】
（９）終止コドン
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。当該終止コドンは、当該コード配列の下流とすることができる。当該終止コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該終止コドンは、効率的な翻訳終止のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができる。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終止または停止コドンを含むことができる。当該終止コドンは、当該コード配列の下流とすることができる。当該終止コドンは、当該コード配列と共にインフレームにすることができる。当該終止コドンは、効率的な翻訳終止のために必要な１つ以上のシグナルと関連することができる。
【0094】
（１０）ポリアデニル化シグナル
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該転写の効率的なポリアデニル化のために必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該コード配列の下流に位置させることができる。当該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルとし得る。当該ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルとし得る。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該転写の効率的なポリアデニル化のために必要な１つ以上のシグナルを含むことができる。当該ポリアデニル化シグナルは、当該コード配列の下流に位置させることができる。当該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、または、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルとし得る。当該ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルとし得る。
【0095】
（１１）リーダー配列
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。当該リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。当該シグナルペプチドを、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドとすることができ、例えば、ＩｇＧシグナルペプチド、及び、ＩｇＥシグナルペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含むことができる。当該リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。当該シグナルペプチドを、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドとすることができ、例えば、ＩｇＧシグナルペプチド、及び、ＩｇＥシグナルペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
【0096】
ｂ．組換え核酸配列構築物の配置
上記したように、当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、当該組換え核酸配列構築物の各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。１つ以上の当該構成要素とは、先に詳述した通りである。１つ以上の当該構成要素が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いにあらゆる順序で配置し得る。幾つかの実施形態において、１つ以上の当該構成要素は、後述するようにして、当該組換え核酸配列構築物に配置することができる。
上記したように、当該組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含むことができ、当該組換え核酸配列構築物の各々は、１つ以上の構成要素を含むことができる。１つ以上の当該構成要素とは、先に詳述した通りである。１つ以上の当該構成要素が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いにあらゆる順序で配置し得る。幾つかの実施形態において、１つ以上の当該構成要素は、後述するようにして、当該組換え核酸配列構築物に配置することができる。
【0097】
（１）配置１
ある配置において、第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができ、かつ、第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。
ある配置において、第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができ、かつ、第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。
【0098】
当該第１の組換え核酸配列構築物は、ベクターに配置することができる。当該第２の組換え核酸配列構築物は、第２のベクター、または、他のベクターに配置することができる。当該組換え核酸配列構築物のベクターへの配置の詳細を、後述する。
【0099】
当該第１の組換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、及び／または、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該第１の組換え核酸配列構築物は、当該リーダー配列が、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５‘）に位置する当該リーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該リーダー配列によってコードされる当該シグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該重鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0100】
当該第２の組換え核酸配列構築物は、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及び、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該第２の組換え核酸配列構築物は、当該リーダー配列が、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に位置する当該リーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該リーダー配列によってコードされる当該シグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該軽鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0101】
したがって、配置１の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチドをコードする当該第１のベクター（したがって、第１の組換え核酸配列構築物）、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該第２のベクター（したがって、第２の組換え核酸配列構築物）を含むことができる。配置１の第２の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチドをコードする当該第１のベクター（したがって、第１の組換え核酸配列構築物）、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該第２のベクター（したがって、第２の組換え核酸配列構築物）を含むことができる。
【0102】
（２）配置２
第２の配置において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。あるいは、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。
第２の配置において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列は、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。あるいは、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または５’）に配置することができる。
【0103】
当該組換え核酸配列構築物のベクターへの配置の詳細を、後述する。
【0104】
当該組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ開裂部位、及び／または、リンカー配列をコードする当該異種核酸配列を含むことができる。当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置することができる。したがって、当該プロテアーゼ開裂部位は、発現時に、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを、異なるポリペプチドに分離させる。他の実施形態において、当該リンカー配列が当該組換え核酸配列構築物に含まれる場合、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置することができる。
【0105】
当該組換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終止領域、開始コドン、終止コドン、及び／または、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含むことができる。当該組換え核酸配列構築物は、第１のプロモーターが、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と会合することができ、かつ、当該第２のプロモーターが、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と会合できるような、２つのプロモーターを含むことができる。さらに他の実施形態において、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列に関連する１つのプロモーターを含むことができる。
【0106】
当該組換え核酸配列構築物は、第１のリーダー配列を、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に配置し、かつ、第２のリーダー配列を、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列の上流（または、５’）に配置している、２つのリーダー配列をさらに含むことができる。したがって、当該第１のリーダー配列によってコードされる第１のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該重鎖ポリペプチドに連結することができ、かつ、当該第２のリーダー配列によってコードされる第２のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって当該軽鎖ポリペプチドに連結することができる。
【0107】
したがって、配置２の一例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含む。
【0108】
配置２の第２の例は、ＶＨ及びＣＨ１を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0109】
配置２の第３の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該リンカー配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0110】
配置２の第４の例は、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、及び、ＣＨ３を含む当該重鎖ポリペプチド、及び、ＶＬ及びＣＬを含む当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該ベクター（したがって、組換え核酸配列構築物）を含むことができ、当該プロテアーゼ開裂部位をコードする当該異種核酸配列は、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列と当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列との間に配置する。
【0111】
ｃ．組換え核酸配列構築物からの発現
上記したように、当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素に、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。したがって、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
上記したように、当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素に、当該重鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドをコードする当該異種核酸配列を含むことができる。したがって、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
【0112】
上記した配置１を用いる場合、当該第１の組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチドの発現を促すことができ、かつ、当該第２の組換え核酸配列構築物は、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促すことができる。上記した配置２を用いる場合、当該組換え核酸配列構築物は、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドの発現を促す。
【0113】
発現時に、例えば、細胞、生物、または、哺乳動物に限らず、それらおいて、当該重鎖ポリペプチド及び当該軽鎖ポリペプチドから、合成抗体を組み立てることができる。特に、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、組み立てることで、当該抗原に結合することが可能な当該合成抗体をもたらすように、互いに相互作用することができる。他の実施形態において、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載したようにして組み立てていない抗体と比較して、免疫原性が強い合成抗体を組み立てられるように、互いに相互作用することができる。さらに別の実施形態において、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドは、当該抗原に対して免疫応答を惹起または誘導することができる合成抗体を組み立てられるように、互いに相互作用することができる。
【0114】
ｄ．ベクター
上記した当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上の当該ベクターは、複製起点を含むことができる。１つ以上の当該ベクターを、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とすることができる。１つ以上の当該ベクターを、自己複製染色体外ベクター、または、宿主ゲノムに組み込まれるベクターとすることができる。
上記した当該組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上の当該ベクターは、複製起点を含むことができる。１つ以上の当該ベクターを、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または、酵母人工染色体とすることができる。１つ以上の当該ベクターを、自己複製染色体外ベクター、または、宿主ゲノムに組み込まれるベクターとすることができる。
【0115】
ベクターとして、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなど、あらゆる形態などあるが、これらに限定されない。「ベクター」は、細胞を、感染、トランスフェクション、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターを、裸の核酸、または、タンパク質または脂質と複合体を形成した核酸とすることが認識されるであろう。当該ベクターは、ウイルスまたは細菌の核酸、及び／または、タンパク質、及び／または、膜（例えば、細胞膜、ウイルス性脂質エンベロープなど）を任意に含む。ベクターとして、ＤＮＡの断片が付着して複製され得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）などがあるが、これらに限定されない。したがって、ベクターとして、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）などあり、また、発現プラスミドと非発現プラスミドの双方もあるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、当該ベクターは、線状ＤＮＡ、酵素ＤＮＡ、または、合成ＤＮＡを含む。組換え微生物または細胞培養物が、「発現ベクター」を宿しているとの記載がある場合、それは、宿主染色体に取り込まれたＤＮＡ、及び、染色体外の環状及び線状ＤＮＡの双方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、当該ベクターは、有糸分裂中に自律的構造として安定に複製されるか、あるいは、宿主のゲノム内に組み込まれ得る。
【0116】
１つ以上の当該ベクターは、異種発現構築物とすることができ、それは、一般的には、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために使用されるプラスミドである。当該発現ベクターが細胞内に一旦入ると、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドは、当該細胞転写、及び、翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。１つ以上の当該ベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、及び、故に、タンパク質を発現することができる。
【0117】
（１）発現ベクター
１つ以上の当該ベクターは、環状プラスミド、または、線状核酸とすることができる。当該環状プラスミド、及び、線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。当該組換え核酸配列構築物を含む１つ以上の当該ベクターは、キメラとすることができ、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、その他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味している。
１つ以上の当該ベクターは、環状プラスミド、または、線状核酸とすることができる。当該環状プラスミド、及び、線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。当該組換え核酸配列構築物を含む１つ以上の当該ベクターは、キメラとすることができ、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、その他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味している。
【0118】
（２）プラスミド
１つ以上の当該ベクターを、プラスミドとすることができる。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物で細胞をトランスフェクトするために有用であり得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物を当該対象に導入するために有用であり得る。また、当該プラスミドは、当該プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。
１つ以上の当該ベクターを、プラスミドとすることができる。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物で細胞をトランスフェクトするために有用であり得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物を当該対象に導入するために有用であり得る。また、当該プラスミドは、当該プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適合し得る調節配列を含み得る。
【0119】
当該プラスミドは、当該プラスミドを染色体外で維持し、かつ、細胞内で当該プラスミドの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点をも含み得る。当該プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸ、ｐＣＥＰ４、または、ｐＲＥＰ４とすることができ、それらは、エプスタインバーウイルス起点複製、及び、核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得るものであり、組み込みをしなくとも、高コピーエピソーム複製を生じ得る。当該プラスミドの主鎖を、ｐＡＶ０２４２とすることができる。このプラスミドを、複製欠損型アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドとし得る。
【0120】
当該プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。また、当該プラスミドは、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐ ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。また、当該プラスミドは、昆虫細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のものとし得る。また、当該プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし得る。
【0121】
（３）ＲＮＡ
ある実施形態において、当該核酸は、ＲＮＡ分子である。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、本明細書に記載したＤＮＡ配列から転写される。例えば、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号９～１６のいずれか１つによってコードされる。別の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、配列番号９～１６のポリペプチド配列、または、その変異体、または、その断片をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。したがって、ある実施形態において、本発明は、１つ以上のＤＭＡｂをコードするＲＮＡ分子を提供する。当該ＲＮＡは、プラス鎖とし得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、当該ＲＮＡのインビボでの翻訳を改善することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子の当該５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップしたＲＮＡにおいて、このものは、５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結し得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリ－Ａテイルを有し得る。それは、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）も、３’末端の近傍に有する。本発明に有用なＲＮＡ分子は、一本鎖とし得る。本発明に有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。
ある実施形態において、当該核酸は、ＲＮＡ分子である。ある実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、本明細書に記載したＤＮＡ配列から転写される。例えば、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、配列番号９～１６のいずれか１つによってコードされる。別の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、配列番号９～１６のポリペプチド配列、または、その変異体、または、その断片をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。したがって、ある実施形態において、本発明は、１つ以上のＤＭＡｂをコードするＲＮＡ分子を提供する。当該ＲＮＡは、プラス鎖とし得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該ＲＮＡ分子は、逆転写などの介在性複製ステップを必要とせずに、細胞によって翻訳することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、当該ＲＮＡのインビボでの翻訳を改善することができる。本発明に有用なＲＮＡ分子の当該５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップしたＲＮＡにおいて、このものは、５’から５’への架橋を介して７－メチルグアノシンに連結し得る。ＲＮＡ分子は、３’ポリ－Ａテイルを有し得る。それは、ポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）も、３’末端の近傍に有する。本発明に有用なＲＮＡ分子は、一本鎖とし得る。本発明に有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。
【0122】
（４）環状及び線状ベクター
１つ以上の当該ベクターを、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、あるいは、染色体外に存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）とし得る。当該ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
１つ以上の当該ベクターを、細胞ゲノムへの組み込みによって標的細胞を形質転換し得るか、あるいは、染色体外に存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）とし得る。当該ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
【0123】
電気穿孔によって対象に対して効率的に送達され、及び、当該組換え核酸配列によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も提供する。このＬＥＣは、あらゆるリン酸主鎖を欠いた線状ＤＮＡとし得る。このＬＥＣは、抗生物質耐性遺伝子、及び／または、リン酸主鎖を含まなくともよい。このＬＥＣは、所望の遺伝子発現と無関係の他の核酸配列を含有していなくともよい。
【0124】
当該ＬＥＣは、線状化することができるあらゆるプラスミドに由来し得る。当該プラスミドは、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができる。当該プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）、または、ｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）とし得る。当該プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、または、ｐｒｏｖａｘ、または、当該組換え核酸配列構築物によってコードされる当該重鎖ポリペプチド、及び／または、当該軽鎖ポリペプチドを発現することができるあらゆる他の発現ベクターとし得る。
【0125】
当該ＬＥＣを、ｐｃｒＭ２とすることができる。当該ＬＥＣを、ｐｃｒＮＰとすることができる。ｐｃｒＮＰ、及び、ｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）、及び、ｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）から誘導することができる。
【0126】
（５）ウイルスベクター
ある実施形態において、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ある実施形態において、本明細書において、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターを提供する。当該発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学のマニュアルに記載がされている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスなどがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【0127】
（６）ベクターの調製方法
本明細書では、当該組換え核酸配列構築物が配置された１つ以上のベクターを調製する方法を提供する。最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターを用いて、当該技術分野で周知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を接種することができる。
本明細書では、当該組換え核酸配列構築物が配置された１つ以上のベクターを調製する方法を提供する。最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターを用いて、当該技術分野で周知の方法を用いて、大規模発酵タンクに細胞培養物を接種することができる。
【0128】
他の実施形態において、最後のサブクローニング工程の後に、当該ベクターは、１つ以上の電気穿孔（ＥＰ）装置と共に使用することができる。このＥＰ装置の詳細は、後述する。
【0129】
１つ以上のベクターは、公知の装置、及び、技術の組み合わせを利用して製剤または製造することができるが、好ましくは、それらを、２００７年５月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されたプラスミド製造技術を用いて製造する。幾つかの例において、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤することができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置、及び、プロトコルをも含み、かつ、取り入れている。上記した参照出願及び特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号、及び、米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する。
【0130】
４．抗体
上記したように、当該組換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体は、抗原に結合できるか、あるいは、抗原と反応することができ、その詳細は、後述する。
上記したように、当該組換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該抗体は、抗原に結合できるか、あるいは、抗原と反応することができ、その詳細は、後述する。
【0131】
当該抗体は、重鎖及び軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含んでいてもよく、それぞれは、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いにＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖及び軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に介在する。当該ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ－末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び、「ＣＤＲ３」と命名する。したがって、抗原結合部位は、各々が重鎖及び軽鎖Ｖ領域からなるＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。
【0132】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に開裂して、幾つかの断片を生じさせ、その内の２つの（Ｆ（ａｂ）断片）は、それぞれ、無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。当該酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を開裂して、双方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ‘）２断片を含めた幾つかの断片を供することができる。したがって、当該抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２とすることができる。当該Ｆａｂは、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを含むことができる。当該Ｆａｂの当該重鎖ポリペプチドは、当該ＶＨ領域、及び、当該ＣＨ１領域を含むことができる。当該Ｆａｂの軽鎖は、当該ＶＬ領域、及び、当該ＣＬ領域を含むことができる。
【0133】
当該抗体を、免疫グロブリン（Ｉｇ）とすることができる。当該Ｉｇを、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及び、ＩｇＧとすることができる。当該免疫グロブリンは、当該重鎖ポリペプチド、及び、当該軽鎖ポリペプチドを含むことができる。当該免疫グロブリンの当該重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及び、ＣＨ３領域を含むことができる。当該免疫グロブリンの当該軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域及びＣＬ領域を含むことができる。
【0134】
当該抗体を、ポリクローナル抗体、または、モノクローナル抗体とすることができる。当該抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または、完全ヒト抗体とすることができる。当該ヒト化抗体を、非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含む、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体とすることができる。
【0135】
当該抗体を、以下に詳述するような二重特異性抗体とすることができる。当該抗体は、以下にさらに詳述するような二機能性抗体とすることができる。
【0136】
上記したように、当該対象に当該組成物を投与すると、当該対象において、当該抗体を生成することができる。当該抗体は、当該対象内で半減期を有し得る。幾つかの実施形態において、当該抗体は、当該対象内でその半減期を延長または短縮するように改変され得る。そのような改変の詳細は、後述する。
【0137】
当該抗体は、その詳細を後述するように、脱フコシル化することができる。
【0138】
当該抗体は、その詳細を後述するように、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性増強（ＡＤＥ）を、緩和または防止するように修飾し得る。
【0139】
ａ．二重特異性抗体
当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、その詳細を後述する抗原の２つと結合または反応することができる。当該二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体の２つの断片から構成することができ、それにより、当該二重特異性抗体は、２つの所望の標的分子との結合または反応が可能となり、それら標的分子は、その詳細を後述する抗原、受容体に対するリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド－受容体複合体、及び、がんマーカーを含むマーカーを含み得る。
当該組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、その詳細を後述する抗原の２つと結合または反応することができる。当該二重特異性抗体は、本明細書に記載の抗体の２つの断片から構成することができ、それにより、当該二重特異性抗体は、２つの所望の標的分子との結合または反応が可能となり、それら標的分子は、その詳細を後述する抗原、受容体に対するリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド－受容体複合体、及び、がんマーカーを含むマーカーを含み得る。
【0140】
ｂ．二機能性抗体
当該組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二機能性抗体は、後述する抗原と結合するか、または、反応することができる。当該二官能性抗体は、当該抗原の認識及び抗原への結合を超えて、当該抗体に対して付加的な機能性を付与するように改変することもできる。そのような改変として、因子Ｈ、または、その断片へのカップリングを含むことができるが、これらに限定されない。因子Ｈは、補体活性化の可溶性調節因子であり、また、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与し得る。
当該組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。当該二機能性抗体は、後述する抗原と結合するか、または、反応することができる。当該二官能性抗体は、当該抗原の認識及び抗原への結合を超えて、当該抗体に対して付加的な機能性を付与するように改変することもできる。そのような改変として、因子Ｈ、または、その断片へのカップリングを含むことができるが、これらに限定されない。因子Ｈは、補体活性化の可溶性調節因子であり、また、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介した免疫応答に寄与し得る。
【0141】
ｃ．抗体半減期の延長
上記したように、当該抗体を、当該対象における当該抗体の半減期を延長または短縮するように改変し得る。当該改変は、当該対象での当該血清に含まれる当該抗体の当該半減期を延長または短縮し得る。
上記したように、当該抗体を、当該対象における当該抗体の半減期を延長または短縮するように改変し得る。当該改変は、当該対象での当該血清に含まれる当該抗体の当該半減期を延長または短縮し得る。
【0142】
当該改変は、当該抗体の定常領域に存在し得る。当該改変を、当該抗体の定常領域における１つ以上のアミノ酸の置換としてもよく、１つ以上の当該アミノ酸の置換を含有しない抗体の半減期と比較して、当該抗体の当該半減期を延長する。当該改変を、当該抗体のＣＨ２ドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換としてもよく、１つ以上の当該アミノ酸の置換を含有しない抗体の半減期と比較して、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0143】
幾つかの実施形態において、当該定常領域における１つ以上の当該アミノ酸の置換として、当該定常領域のメチオニン残基をチロシン残基で置換すること、当該定常領域のセリン残基をスレオニン残基で置換すること、当該定常領域のスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換すること、または、それらのあらゆる組み合わせを含み得るものであって、それにより、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0144】
他の実施形態において、当該定常領域における１つ以上の当該アミノ酸の置換として、当該ＣＨ２ドメインのメチオニン残基をチロシン残基で置換すること、当該ＣＨ２ドメインのセリン残基をスレオニン残基で置換すること、当該ＣＨ２ドメインのスレオニン残基をグルタミン酸残基で置換すること、または、それらのあらゆる組み合わせを含み得るものであって、それにより、当該抗体の当該半減期を延長する。
【0145】
ｄ．脱フコシル化
当該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体、または、非フコシル化抗体）、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、当該糖フコースの分子への付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及び、糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは、当該定常領域の当該炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化が欠如すると、当該フコシル化抗体と比較して、当該抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合、及び、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。
当該組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体、または、非フコシル化抗体）、その断片、その変異体、または、それらの組み合わせをコードすることができる。フコシル化は、当該糖フコースの分子への付加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及び、糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体では、フコースは、当該定常領域の当該炭水化物鎖に結合していない。次に、このフコシル化が欠如すると、当該フコシル化抗体と比較して、当該抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合、及び、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、幾つかの実施形態において、当該非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。
【0146】
当該抗体を改変して、当該抗体のフコシル化を予防または阻害し得る。幾つかの実施形態において、そのような改変抗体は、未改変の当該抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加を示し得る。当該改変は、重鎖、軽鎖、または、それらの組み合わせとし得る。当該改変は、当該重鎖における１つ以上のアミノ酸の置換、当該軽鎖における１つ以上のアミノ酸の置換、または、それらの組み合わせとし得る。
【0147】
ｅ．ＡＤＥ応答の低下
当該抗体を改変して、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は抑制または防止するが、当該抗原は依然として中和し得る。
当該抗体を改変して、当該抗原に関連する疾患の抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は抑制または防止するが、当該抗原は依然として中和し得る。
【0148】
幾つかの実施形態において、当該抗体を改変して、ＦｃｙＲｌａに対する当該抗体の結合を抑制または予防する１つ以上のアミノ酸の置換を含むようにし得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域に存在し得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域でのロイシン残基をアラニン残基で置換すること、すなわち、本明細書でＬＡ、ＬＡ変異、または、ＬＡ置換として示した置換を含み得る。１つ以上の当該アミノ酸の置換は、当該抗体の当該定常領域での２つのロイシン残基を、それぞれ、アラニン残基で置換すること、すなわち、本明細書でＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ変異、または、ＬＡＬＡ置換として示した置換を含み得る。当該ＬＡＬＡ置換の存在は、ＦｃｙＲ１ａに対する抗体の結合を予防またはブロックし得るものであって、したがって、当該改変抗体は、当該抗原に関連する疾患のＡＤＥを増強または惹起せずに、当該抗原は依然として中和し得る。
【0149】
５．抗原
当該合成抗体は、その抗原、または、その断片または変異体に関する。当該抗原を、核酸配列、アミノ酸配列、または、それらの組み合わせとすることができる。当該核酸配列を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該アミノ酸配列を、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。
当該合成抗体は、その抗原、または、その断片または変異体に関する。当該抗原を、核酸配列、アミノ酸配列、または、それらの組み合わせとすることができる。当該核酸配列を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。当該アミノ酸配列を、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせとすることができる。
【0150】
幾つかの実施形態において、当該抗原は、自己抗原である。ある実施形態において、当該抗原は、インフルエンザＨＡである。ある実施形態において、当該抗原は、インフルエンザＨＡの球状頭部である。ある実施形態において、当該抗原は、インフルエンザＨＡの融合サブドメインである。
【0151】
ａ．外来抗原
幾つかの実施形態において、当該抗原は、外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することができるあらゆる非自己物質（すなわち、当該対象の外部由来のもの）である。
幾つかの実施形態において、当該抗原は、外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することができるあらゆる非自己物質（すなわち、当該対象の外部由来のもの）である。
【0152】
（１）ウイルス抗原
当該外来抗原を、ウイルス抗原、または、その断片、または、その変異体とすることができる。
当該外来抗原を、ウイルス抗原、または、その断片、または、その変異体とすることができる。
【0153】
ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含み得る。当該インフルエンザ抗原とは、１つ以上のインフルエンザ血清型に対して、哺乳動物で免疫応答を惹起できる抗原である。当該抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、その変異体、その断片、または、それらの組み合わせを含むことができる。当該インフルエンザヘマグルチニン抗原は、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ１、血清型Ｈ２の複数株、Ａ型インフルエンザ血清型Ｈ１の複数株の異なる型から誘導したハイブリッド配列、または、Ｂ型インフルエンザの複数株から誘導することができる。当該インフルエンザヘマグルチニン抗原を、Ｂ型インフルエンザ由来のものとすることができる。
【0154】
当該インフルエンザ抗原は、免疫応答を誘発することができる特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的である少なくとも１つの抗原エピトープを含むことができる。当該抗原には、無傷のインフルエンザウイルス内に存在する免疫原性部位及びエピトープの全てのレパートリーを供し得る。当該抗原を、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン抗原配列から誘導し得る。当該抗原を、２つの異なるヘマグルチニン抗原配列、または、その一部分との組み合わせに由来するハイブリッドヘマグルチニン抗原配列とし得る。２つの異なるヘマグルチニン抗原配列の各々を、血清型Ｈ１の複数のＡ型インフルエンザウイルス株など、１つの血清型の複数のＡ型インフルエンザウイルス株の異なるセットに由来するものとし得る。当該抗原を、複数のＢ型インフルエンザウイルス株に由来するヘマグルチニン抗原配列から誘導したヘマグルチニン抗原配列とし得る。
【0155】
幾つかの実施形態において、当該インフルエンザ抗原を、Ｈ１ ＨＡ、Ｈ２ ＨＡ、Ｈ３ ＨＡ、Ｈ５ ＨＡ、または、ＢＨＡ抗原とすることができる。
【0156】
ｂ．自己抗原
幾つかの実施形態において、当該抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な当該対象自身の身体の構成要素としてもよい。幾つかの実施形態において、自己抗原は、当該対象が、疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
幾つかの実施形態において、当該抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な当該対象自身の身体の構成要素としてもよい。幾つかの実施形態において、自己抗原は、当該対象が、疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
【0157】
自己抗原として、サイトカイン、ＨＩＶ、及び、デング熱を含む上掲のウイルスに対する抗体、がんの進行、または、発生に影響を及ぼす抗原、及び、細胞表面受容体、または、膜貫通タンパク質などがあるが、これらに限定されない。
【0158】
６．組成物の賦形剤及び他の成分
当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤を、ビヒクル、担体、または、希釈剤としての機能的分子とすることができる。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含むことができる、トランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤とすることができる。
当該組成物は、医薬として許容される賦形剤をさらに含み得る。医薬として許容される当該賦形剤を、ビヒクル、担体、または、希釈剤としての機能的分子とすることができる。医薬として許容される当該賦形剤を、界面活性剤を含むことができる、トランスフェクション促進剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤とすることができる。
【0159】
当該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩であり、かつ、当該ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で当該組成物に存在し得る。当該トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡなどのＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、及び、スクアレン及びスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、そして、ヒアルロン酸を用いて、当該組成物と共に投与もし得る。当該組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）などの当該技術分野で周知のその他のリポソームなどのリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、または、ナノ粒子、または、その他の公知のトランスフェクション促進剤も含み得る。当該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸塩（ＬＧＳ）など、または、脂質である。当該ワクチンでの当該トランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または、０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【0160】
当該組成物は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載の遺伝的助長因子をさらに含み得る。
【0161】
当該組成物は、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、または、好ましくは、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、または、より好ましくは、約１ｍｇ～約２ｍｇの量のＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、約５ｎｇ～約１０００μｇのＤＮＡを含む。幾つかの好ましい実施形態において、組成物は、約１０ｎｇ～約８００μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約０．１～約５００μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約１～約３５０μｇのＤＮＡを含むことができる。幾つかの好ましい実施形態において、当該組成物は、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇ、約１ｎｇ～１００ｍｇ、約１μｇ～約１０ｍｇ、約０．１μｇ～約１０ｍｇ、約１ｍｇ～約２ｍｇ、約５ｎｇ～約１０００μｇ、約１０ｎｇ～約８００μｇ、約０．１～約５００μｇ、約１～約３５０μｇ、約２５～約２５０μｇ、約１００～約２００μｇのＤＮＡを含むことができる。
【0162】
当該組成物は、用いられる投与様式にしたがって製剤することができる。注射可能な医薬組成物は、滅菌された発熱物質不含のもの、及び、微粒子不含のものとすることができる。等張性製剤または溶液を用いることができる。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及び、ラクトースがある。当該組成物は、血管収縮剤を含むことができる。当該等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含むことができる。当該組成物は、ゼラチンやアルブミンなどの安定化剤をさらに含むことができる。当該安定剤、ＬＧＳ、または、ポリカチオン、または、ポリアニオンなどは、製剤を、室温または周囲温度で、長時間安定にすることができる。
【0163】
７．合成抗体の生成方法
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。当該方法は、その詳細を後述する送達方法を用いて、それを必要とする当該対象に対して当該組成物を投与することを含むことができる。したがって、当該組成物を当該対象に投与した際に、当該合成抗体は、対象内またはインビボで生成される。
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。当該方法は、その詳細を後述する送達方法を用いて、それを必要とする当該対象に対して当該組成物を投与することを含むことができる。したがって、当該組成物を当該対象に投与した際に、当該合成抗体は、対象内またはインビボで生成される。
【0164】
また、当該方法は、当該組成物を、１つ以上の細胞に導入することを含むことができ、したがって、当該合成抗体を、１つ以上の細胞において生成または製造することができる。さらに、当該方法は、当該組成物を、例えば、皮膚、及び、筋肉に限らず、それら組織の１つ以上に対して導入することを含むことができ、したがって、当該合成抗体は、１つ以上の組織において生成または製造することができる。
【0165】
８．抗体の同定方法またはスクリーニング方法
さらに、本発明は、上記した抗原に反応または結合する上記した抗体の同定またはスクリーニングの方法に関する。当該抗体を同定またはスクリーニングする当該方法を、当業者に周知の方法論における抗原に用いて、抗体を同定またはスクリーニングすることができる。そのような手法として、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）由来の当該抗体の選択、及び、動物の免疫処置、続いて、当該抗体の単離、及び／または、精製があるが、これらに限定されない。
さらに、本発明は、上記した抗原に反応または結合する上記した抗体の同定またはスクリーニングの方法に関する。当該抗体を同定またはスクリーニングする当該方法を、当業者に周知の方法論における抗原に用いて、抗体を同定またはスクリーニングすることができる。そのような手法として、ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ）由来の当該抗体の選択、及び、動物の免疫処置、続いて、当該抗体の単離、及び／または、精製があるが、これらに限定されない。
【0166】
９．組成物の送達方法
また、本発明は、当該組成物を、それを必要とする当該対象に対して送達する方法に関する。当該送達方法は、当該組成物を、当該対象に対して投与することを含む、ことができる。投与としては、インビボ電気穿孔を利用する、及び、同電気穿孔を利用しないＤＮＡ注入、リポソーム介在送達、及び、ナノ粒子促進送達などがあるが、これらに限定されない。
また、本発明は、当該組成物を、それを必要とする当該対象に対して送達する方法に関する。当該送達方法は、当該組成物を、当該対象に対して投与することを含む、ことができる。投与としては、インビボ電気穿孔を利用する、及び、同電気穿孔を利用しないＤＮＡ注入、リポソーム介在送達、及び、ナノ粒子促進送達などがあるが、これらに限定されない。
【0167】
当該組成物の送達を受ける当該哺乳動物を、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、及び、ニワトリとし得る。
【0168】
当該組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、頬側投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、及び、関節内、または、それらの組み合わせなどの異なる経路で投与し得る。獣医学的使用については、通常の獣医学的実施に従って、当該組成物を、適切に許容しうる製剤として投与し得る。獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投与計画、及び、投与経路を、容易に決定することができる。当該組成物を、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または、その他の物理的方法、例えば、電気穿孔法（ＥＰ）、「流体力学的方法」、または、超音波によって投与し得る。
【0169】
ａ．電気穿孔
電気穿孔による当該組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び、電極アセンブリ、または、ハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、または、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にし得る。
電気穿孔による当該組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得るものであり、及び、好ましくは、当該エネルギーパルスは、使用者が入力したプリセット電流に近い定電流である。当該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント、及び、電極アセンブリ、または、ハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリーコンポーネント、電源、及び、電源スイッチなどの当該電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、及び、組み込み得る。当該電気穿孔は、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、または、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にし得る。
【0170】
当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つの要素として機能し得るものであり、及び、その他の要素は、当該電気穿孔コンポーネントと連絡する別々の要素（または、コンポーネント）である。当該電気穿孔コンポーネントは、当該電気穿孔装置の１つを超える個数の要素として機能し得るものであり、当該電気穿孔コンポーネントとはなおも別の当該電気穿孔装置のその他の要素とも連絡し得る。１つの電気機械的、または、機械的装置の一部として存在する当該電気穿孔装置の要素は、それらの要素が、１つの装置として、または、互いに連絡する別の要素として機能することができるものに限定しなくともよい。当該電気穿孔コンポーネントは、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達し得るものであり、及び、フィードバック機構を含む。当該電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含み得るものであり、当該電極アセンブリは、当該電気穿孔コンポーネントからエネルギーパルスを受け、そして、電極を介して所望の組織に向けて同パルスを送達する。複数の当該電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達期間ではニュートラルであり、及び、所望の組織でのインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを、当該電気穿孔コンポーネントに連絡する。当該フィードバック機構は、測定された当該インピーダンスを受けてもよく、また、当該電気穿孔コンポーネントによって送達されたエネルギーパルスを調整して、当該定電流を維持することができる。
【0171】
複数の電極は、分散パターンでエネルギーパルスを送達し得る。複数の当該電極は、プログラムされたシーケンス下の当該電極の制御を介して、当該分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、そして、プログラムされたシーケンスは、使用者によって、電気穿孔コンポーネントに入力される。プログラムされた当該シーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数の当該パルスの各々のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極によって送達されており、複数の当該パルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を備えた少なくとも２つの活性電極の異なる１つによって送達される。
【0172】
当該フィードバック機構は、ハードウェア、または、ソフトウェアのいずれかで実施し得る。当該フィードバック機構は、アナログ閉回路によって実施し得る。当該フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または、１μｓごとに起こるが、好ましくは、実時間フィードバック、または、瞬時（すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術によって決定した実質的な瞬時）である。当該ニュートラル電極で、所望の組織でのインピーダンスを測定してもよく、そして、そのインピーダンスをフィードバック機構に連絡し、次いで、当該フィードバック機構が同インピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、及び、プリセット電流と同様の値の定電流を維持する。当該フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達期間内に定電流を連続的かつ瞬時的に維持し得る。
【0173】
本発明の組成物の送達を促進しうる電気穿孔装置及び電気穿孔法の例として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたものがある。当該組成物の送達を促進するために用い得るその他の電気穿孔装置及び電気穿孔法として、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、２００６年１０月１７日に出願した米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号、及び、２００７年１０月１０日に出願した同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願した、同時係属中で、かつ、共有にかかる米国特許出願第１１／８７４０７２号で提供されたものがある。
【0174】
Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．，の米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システム、及び、その使用が記載している。このモジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクタ、及び、電源を含み得る。使用者は、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、そして、体内または植物内の選択された組織に同電極をしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な当該定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを、複数の針電極に印加する。印加された当該定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞内への生体分子の導入を促進する。本明細書の一部を構成するものとして米国特許第７，２４５，９６３号の全内容を援用する。
【0175】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，が出願した米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために用い得る電気穿孔装置が記載されている。当該電気穿孔装置は、その操作が、ソフトウェアまたはファームウェアで指定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。このＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、そして、電流波形データの保存と取得を可能にする。当該電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、及び、取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。本明細書の一部を構成するものとして米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容を援用する。
【0176】
米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけでなく、その他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合し得る。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、標的臓器にも完全に挿入され、そして、電極によって、あらかじめ描かれた領域の標的組織に対して垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号、及び、米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍで、２１ゲージのものである。
【0177】
加えて、電気穿孔装置、及び、その使用を組み込んだ幾つかの実施形態で予期されるように、以下の特許、１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、及び、２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いてＤＮＡを送達することに関係している２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、及び、ＤＮＡ注入の方法に関する２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に開示された発明を含む特許は、本明細書において企図している。本明細書の一部を構成するものとして上記した全特許の内容を援用する。
【0178】
１０．処置の方法
本明細書でさらに提供されるものは、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対して保護、及び／または、予防をする方法であり、合成抗体を当該対象内で生成する。当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含むことができる。当該対象への当該組成物の投与は、上記した送達の方法を用いて行うことができる。
本明細書でさらに提供されるものは、それを必要とする対象において、疾患の処置、疾患に対して保護、及び／または、予防をする方法であり、合成抗体を当該対象内で生成する。当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含むことができる。当該対象への当該組成物の投与は、上記した送達の方法を用いて行うことができる。
【0179】
特定の実施形態において、本発明は、インフルエンザ感染、または、インフルエンザ感染に関連する疾患または障害から保護をする、及び／または、予防をする方法を提供する。例えば、ある実施形態において、本方法は、Ａ型インフルエンザを、処置、保護、及び／または、予防をする。ある実施形態において、本方法は、呼吸器感染症を、処置、保護、及び／または、予防をする。本発明の組成物の投与によって処置または予防される疾患または障害の例として、ウイルス性または細菌性肺炎、脱水、及び、耳感染症、及び、鼻腔感染症などがあるが、これらに限定されない。
【0180】
当該対象内で合成抗体が生成されると、当該合成抗体は、当該抗原と、結合または反応することができる。かかる結合により、当該抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、そして、当該抗原に対する免疫応答を惹起または誘発し、それにより、当該対象での抗原と関連する疾患に対して、処置、保護、及び／または、予防をすることができる。
【0181】
当該組成物の用量は、１μｇ～１０ｍｇ有効成分／体重ｋｇ／時間とすることができ、及び、２０μｇ～１０ｍｇ有効成分／体重ｋｇ／時間とすることもできる。当該組成物を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または、３１日おきに投与することができる。効果的な処置のための組成物の投与回数を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または、１０回とすることができる。
【0182】
本発明は、複数の態様を有しており、その具体例を以下に示すが、これらに限定されることはない。
【実施例】
【0183】
１１．実施例
以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。
以下の例において、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであって、例示目的のみで記載しているものと理解すべきである。上記した説明、及び、これらの実施例から、当業者であれば、本発明に必須の特徴を確認することができ、また、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な変更や改変を加えて、様々な用途や条件に適合させることができる。したがって、本明細書で説明した発明に加えて、本発明に対して様々な改変を加えることが当業者に自明であることは、上記した説明からも明らかである。そのような改変も、特許請求の範囲に属していることも意図をしている。
【実施例1】
【0184】
本明細書で提示した研究は、プラスミドＤＮＡの筋肉内電気穿孔を介した機能性抗－ＩＬ－６、及び、抗－ＣＤ１２６「ＤＮＡモノクローナル抗体」（ＤＭＡｂ）の生成を実証する。抗－ＩＬ－６モノクローナル抗体、及び、抗－ＣＤ１２６モノクローナル抗体に由来するコドン最適化可変領域ＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１定常ドメインに合成した。抗体をコードするプラスミドＤＮＡを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに送達した（図１）。この研究は、既存の生物学的療法の代替としてのＤＭＡｂを支持しており、かつ、免疫病理における、インビボでの、ＩＬ－６シグナル伝達の役割をさらに定義する新規な方法を提供する。
【0185】
当該方法及び材料について説明をする。
【0186】
抗ＤＮＡ抗体及びクローニング
抗－インフルエンザ５Ｊ８及びＦＩ６抗体クローン配列は、すでに公開されている（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊ ｖｉｒｏｌ ８５（２０）：１０９０５－８；Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４４）：８５０－６）。可変領域ＤＮＡ配列をコドン最適化し、そして、定常ヒトＩｇＧ１κ主鎖へと合成した。構築体を、改変したｐＶａｘ－１哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。フーリン／２Ａペプチド開裂部位を、重鎖及び軽鎖ペプチドの分離のために取り込んだ。（図１）。
抗－インフルエンザ５Ｊ８及びＦＩ６抗体クローン配列は、すでに公開されている（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｊ ｖｉｒｏｌ ８５（２０）：１０９０５－８；Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４４）：８５０－６）。可変領域ＤＮＡ配列をコドン最適化し、そして、定常ヒトＩｇＧ１κ主鎖へと合成した。構築体を、改変したｐＶａｘ－１哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。フーリン／２Ａペプチド開裂部位を、重鎖及び軽鎖ペプチドの分離のために取り込んだ。（図１）。
【0187】
トランスフェクション
１×１０６個の２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、０．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞上清、及び、全溶解物を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。
１×１０６個の２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、０．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞上清、及び、全溶解物を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。
【0188】
ＤＭＡｂ電気穿孔
大腿四頭筋へ筋肉内送達して１００～３００μｇのプラスミドＤＮＡを与え、次いで、先述したようにして、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ＰＡ）で電気穿孔した（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２９（５）：１２６１６；Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，９（１０）：２２５３－６２）。
大腿四頭筋へ筋肉内送達して１００～３００μｇのプラスミドＤＮＡを与え、次いで、先述したようにして、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ＰＡ）で電気穿孔した（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２９（５）：１２６１６；Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，９（１０）：２２５３－６２）。
【0189】
ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット
ヒトＩｇＧ１κを、抗－ヒト－Ｆｃ断片を用いて捕捉し、そして、ヒトＩｇＧ１κ標準抗体に対する定量を使って、抗－κ－軽－鎖－ＨＲＰ結合抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）で検出した。組換えＨＡ（Ｉｍｍｕｎｅ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する結合を、ＨＲＰ－結合抗－ヒト－ＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出した。ウエスタンブロットを、結合抗－ヒトＩｇＧ ８００ｎｍ抗体（Ｌｉｃｏｒ）を用いて行った。
ヒトＩｇＧ１κを、抗－ヒト－Ｆｃ断片を用いて捕捉し、そして、ヒトＩｇＧ１κ標準抗体に対する定量を使って、抗－κ－軽－鎖－ＨＲＰ結合抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）で検出した。組換えＨＡ（Ｉｍｍｕｎｅ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する結合を、ＨＲＰ－結合抗－ヒト－ＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で検出した。ウエスタンブロットを、結合抗－ヒトＩｇＧ ８００ｎｍ抗体（Ｌｉｃｏｒ）を用いて行った。
【0190】
実験の結果について説明をする。
【0191】
抗－インフルエンザ抗体をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内電気穿孔は、インビボでモノクローナル抗体を生成する
モノクローナル抗体の可変ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を、ＤＮＡコドン最適化した。当該コドン最適化ＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１κ抗体定常ＣＨ及びＣＬ領域ＤＮＡ配列を用いて合成した。改変した当該ＤＮＡ配列を、改変したｐＶａｘ－１発現ベクターにクローニングした。当該プラスミド構築物を筋肉内注射し、続いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて電気穿孔した。インビボで産生されたヒトＩｇＧ１ ＤＭＡｂの発現及び機能を測定した。
モノクローナル抗体の可変ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を、ＤＮＡコドン最適化した。当該コドン最適化ＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１κ抗体定常ＣＨ及びＣＬ領域ＤＮＡ配列を用いて合成した。改変した当該ＤＮＡ配列を、改変したｐＶａｘ－１発現ベクターにクローニングした。当該プラスミド構築物を筋肉内注射し、続いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて電気穿孔した。インビボで産生されたヒトＩｇＧ１ ＤＭＡｂの発現及び機能を測定した。
【0192】
ＤＭＡｂ構築物は、公開された抗－インフルエンザモノクローナル抗体由来の可変領域を含む
当該ＤＭＡｂ構築物は、抗－インフルエンザモノクローナル抗体５Ｊ８（抗－ＨＡ ５Ｊ８）、及び、ＦＩ６（抗－ＨＡ ＦＩ６）由来の可変領域を含む。ＦＪ８は、可変球状頭部の受容体結合ポケットに結合し、そして、複数のＡ型インフルエンザ型Ｈ１ウイルスと交差反応をする。ＦＩ６は、比較的に保存が良好な融合サブドメインに結合し、そして、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスを広範に中和する（図２）。
当該ＤＭＡｂ構築物は、抗－インフルエンザモノクローナル抗体５Ｊ８（抗－ＨＡ ５Ｊ８）、及び、ＦＩ６（抗－ＨＡ ＦＩ６）由来の可変領域を含む。ＦＪ８は、可変球状頭部の受容体結合ポケットに結合し、そして、複数のＡ型インフルエンザ型Ｈ１ウイルスと交差反応をする。ＦＩ６は、比較的に保存が良好な融合サブドメインに結合し、そして、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスを広範に中和する（図２）。
【0193】
ＤＭＡｂ構築物は、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から発現及び分泌される
実験を行って、ＤＭＡｂ構築物によってコードされた抗－インフルエンザ－ＨＡ抗体５Ｊ８及びＦＩ６の発現及び分泌を評価した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、５Ｊ８またはＦＩ６構築物を保有するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。空のプラスミドを、陰性コントロールとして用いた。ヒトＩｇＧ１κ発現を、定量的ＥＬＩＳＡによって決定し、そして、ウエスタンブロットを実施して、上清及び溶解物の重鎖及び軽鎖ペプチドの開裂及び発現を検出した（図３Ａ～図３Ｂ）。図３Ｂに示したように、抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６は、ＨＥＫ ２９３Ｔ上清及びＨＥＫ ２９３Ｔ溶解物で認められており、このことは、抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６の発現及び分泌を誘導する当該ＤＭＡｂ構築物の能力を実証している。
実験を行って、ＤＭＡｂ構築物によってコードされた抗－インフルエンザ－ＨＡ抗体５Ｊ８及びＦＩ６の発現及び分泌を評価した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、５Ｊ８またはＦＩ６構築物を保有するプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。空のプラスミドを、陰性コントロールとして用いた。ヒトＩｇＧ１κ発現を、定量的ＥＬＩＳＡによって決定し、そして、ウエスタンブロットを実施して、上清及び溶解物の重鎖及び軽鎖ペプチドの開裂及び発現を検出した（図３Ａ～図３Ｂ）。図３Ｂに示したように、抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６は、ＨＥＫ ２９３Ｔ上清及びＨＥＫ ２９３Ｔ溶解物で認められており、このことは、抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６の発現及び分泌を誘導する当該ＤＭＡｂ構築物の能力を実証している。
【0194】
筋肉内ＤＮＡ電気穿孔した後の安定した血清レベルのＤＮＡモノクローナル抗体
実験を行って、ＤＭＡｂが、インビボで、抗－ＨＡ ５Ｊ８、及び、抗－ＨＡ ＦＩ６の発現を誘導するか否かを評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５Ｊ８またはＦＩ６プラスミドＤＮＡを注射し、続いて、電気穿孔を行った。７日後に、血清ヒトＩｇＧ１κ抗体レベルを、ＥＬＩＳＡで決定した。図３Ａ及び図３Ｂに示したように、高レベルの抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６抗体が、筋肉のＤＮＡ電気穿孔をした後に、マウス血清で産生されている。
実験を行って、ＤＭＡｂが、インビボで、抗－ＨＡ ５Ｊ８、及び、抗－ＨＡ ＦＩ６の発現を誘導するか否かを評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５Ｊ８またはＦＩ６プラスミドＤＮＡを注射し、続いて、電気穿孔を行った。７日後に、血清ヒトＩｇＧ１κ抗体レベルを、ＥＬＩＳＡで決定した。図３Ａ及び図３Ｂに示したように、高レベルの抗－ＨＡ ５Ｊ８及び抗－ＨＡ ＦＩ６抗体が、筋肉のＤＮＡ電気穿孔をした後に、マウス血清で産生されている。
【0195】
筋肉内ＤＮＡ電気穿孔後に生成したＤＮＡモノクローナル抗体は、多様な標的ＨＡ抗原に結合する能力を保持している
実験を行って、発現した抗－ＨＡ ＦＩ６の機能性を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに３００μｇのプラスミドＤＮＡを注射し、続いて、筋肉内の電気穿孔を行った。４週間後に、組換えＡ型インフルエンザＨ１ ＨＡ抗原に結合するＤＭＡｂを、ＥＬＩＳＡで決定した。図５に示したように、発現した当該抗体は、標的Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９標的に結合する。
実験を行って、発現した抗－ＨＡ ＦＩ６の機能性を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに３００μｇのプラスミドＤＮＡを注射し、続いて、筋肉内の電気穿孔を行った。４週間後に、組換えＡ型インフルエンザＨ１ ＨＡ抗原に結合するＤＭＡｂを、ＥＬＩＳＡで決定した。図５に示したように、発現した当該抗体は、標的Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９標的に結合する。
【0196】
本明細書に記載した実験は、コドン最適化した抗体可変配列を発現するプラスミドＤＮＡ構築物の筋肉内電気穿孔の後に、抗－ＨＡ ５Ｊ８抗体及び抗－ＨＡ ＦＩ６ ＤＮＡモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）を、マウス血清において、インビボで、高レベルで発現していることを実証している。インビボで筋肉細胞から産生された抗体は、インビトロで、機能的に結合する。ＤＭＡｂは、インフルエンザＨＡを標的とする精製タンパク質モノクローナル抗体療法に対して、安全で、経済的で、実用的な代替物を提供する。
【0197】
ＤＭＡｂは、精製タンパク質モノクローナル抗体、及び、ウイルスベクターよりも有利な点が幾つかある。タンパク質モノクローナル抗体については、ＤＭＡｂは、比較的に低コストで製造することができ、熱安定性があり、流通が容易であり、改変可能であり、そして、頻回投与を必要とせずに持続的発現を誘導する。ウイルスベクターに関しては、ＤＭＡｂは、安全かつ非組み込み型であり、非免疫原性であり、繰り返し流通することができ、既存の血清学には存在しておらず、及び、迅速な投与のための急性発現を誘導する。潜在的かつ持続的なＤＭＡｂの発現は、がんや自己免疫疾患など、潜在的に再投与の必要がある慢性疾患の治療で実質的な利益をもたらす。低価格のＤＮＡベクターの生産と流通は、特に、開発途上国で、また、恒常的に需要がある場合に、入手しやすい価格を提供する。上記した詳細な説明及び付随する実施例は、例示目的に過ぎず、添付した特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解される。
【実施例2】
【0198】
本明細書で提示した研究は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに対する完全長のヒト広範中和抗体を、インビボでの合成プラスミドＤＮＡ（ＤＭＡｂ）の電気穿孔を介してもたらす、代替的受動ワクチンアプローチの目下の改良について実証をしている。
【0199】
方法及び材料について説明をする。
【0200】
抗－Ａ型またはＢ型インフルエンに特異的なヒト抗体配列を、遺伝子学的に最適化し、そして、プラスミドｐＧＸ００１にクローニングした。各候補を筋肉注射して、続いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）を行った。インビボで抗体発現をモニターし、そして、ＨＡ結合及びウイルス中和によって、機能的活性を確認した。ＩＭ－ＥＰを行った後の様々な時点で、Ｈ１またはＨ３ Ａ型インフルエンザ亜型、または、双方の系統のそれぞれに由来するＢ型インフルエンザウイルスの致死量をマウスに接種をした。感染させた動物の生存及び体重減少について、モニターをした。
【0201】
ＩｇＧ定量及びＨＡタンパク質結合
マウス血清でのヒトＩｇＧの量を、ＥＬＩＳＡで決定した。ＨＡ結合ＥＬＩＳＡは、種々のＡ型インフルエンザ亜型、及び、Ｂ型インフルエンザ系統に由来する精製された組換え三量体ＨＡタンパク質で行った。
マウス血清でのヒトＩｇＧの量を、ＥＬＩＳＡで決定した。ＨＡ結合ＥＬＩＳＡは、種々のＡ型インフルエンザ亜型、及び、Ｂ型インフルエンザ系統に由来する精製された組換え三量体ＨＡタンパク質で行った。
【0202】
マイクロ中和アッセイ
ＭＤＣＫ細胞を使用し、そして、Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６に記載されたのと同様にしてノイラミニダーゼ活性を測定することで、インフルエンザウイルスのパネルに対してマイクロ中和活性をアッセイした。
ＭＤＣＫ細胞を使用し、そして、Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６に記載されたのと同様にしてノイラミニダーゼ活性を測定することで、インフルエンザウイルスのパネルに対してマイクロ中和活性をアッセイした。
【0203】
インビボでの有効性
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＤＭＡｂプラスミド（複数可）の筋肉内注射を行い、その直後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐ適応定電流デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた、電気穿孔を行った。４日後に、致死量のＡ型インフルエンザ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ ３×ＬＤ５０，７：１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４：Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８ ７×ＬＤ５０）を、あるいは、５日後に、致死量のＢ型インフルエンザ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ １０×ＬＤ５０、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６ ７×ＬＤ５０）を、マウスに接種した。ＩｇＧと比較をするために、接種の１日前に、マウスの群に対して、精製モノクローナル抗体を腹腔内に注射して等級づけをした。感染当日に、血清試料を採取した。体重減少及び生存を、感染後の１２日間、モニターをした。マウスの体重が当初よりも２５％減量したところで、安楽死させた。
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＤＭＡｂプラスミド（複数可）の筋肉内注射を行い、その直後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐ適応定電流デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた、電気穿孔を行った。４日後に、致死量のＡ型インフルエンザ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ ３×ＬＤ５０，７：１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４：Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８ ７×ＬＤ５０）を、あるいは、５日後に、致死量のＢ型インフルエンザ（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４ １０×ＬＤ５０、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６ ７×ＬＤ５０）を、マウスに接種した。ＩｇＧと比較をするために、接種の１日前に、マウスの群に対して、精製モノクローナル抗体を腹腔内に注射して等級づけをした。感染当日に、血清試料を採取した。体重減少及び生存を、感染後の１２日間、モニターをした。マウスの体重が当初よりも２５％減量したところで、安楽死させた。
【0204】
Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ． Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、及び、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、及び、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ‘ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｓが定めたガイドラインに従って、動物実験の承認を受け、そして、同実験を実施した。
【0205】
実験の結果について説明をする。
【0206】
ＤＮＡがコードした抗体（ＤＭＡｂ）は、インビボで産生して、機能的ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢモノクローナル抗体を発現する
血清におけるＤＭＡｂの定量（図８）は、ＩｇＧ発現を確認し、そして、当該タンパク質が、機能的であることを示している。ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの電気穿孔をして５日後に、血清を回収し（図９）、そして、ヒトＩｇＧ発現、様々なＨＡタンパク質への結合活性、及び、中和活性について評価をした。ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ－ＤＭＡｂの双方で処置をした動物に由来する血清抗体は、同等のＩｇＧ濃度においてインビトロで産生をしたモノクローナル抗体と同様のＨＡ結合活性とウイルス中和活性とを示しており、このことは、当該筋肉細胞が産生したＤＭＡｂは、インビボで発現されており、かつ、機能的であったことを示している（図１０）。
血清におけるＤＭＡｂの定量（図８）は、ＩｇＧ発現を確認し、そして、当該タンパク質が、機能的であることを示している。ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの電気穿孔をして５日後に、血清を回収し（図９）、そして、ヒトＩｇＧ発現、様々なＨＡタンパク質への結合活性、及び、中和活性について評価をした。ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ－ＤＭＡｂの双方で処置をした動物に由来する血清抗体は、同等のＩｇＧ濃度においてインビトロで産生をしたモノクローナル抗体と同様のＨＡ結合活性とウイルス中和活性とを示しており、このことは、当該筋肉細胞が産生したＤＭＡｂは、インビボで発現されており、かつ、機能的であったことを示している（図１０）。
【0207】
抗－Ａ型及びＢ型インフルエンザモノクローナル抗体を改変して得たＤＭＡｂは、精製ＩｇＧモノクローナル抗体と同程度で、致命的インフルエンザ感染から保護をする
Ａ型インフルエンザ接種試験において、ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂの投与は、無関係のコントロールＤＭＡｂと比較して、マウスを致命的ウイルス感染から有意に保護しており、そして、体重減少を抑制した。ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂは、０．３ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＡ ＩｇＧと同様のレベルで、致命的なＡ型インフルエンザ感染からマウスを保護していた（図１１）。同様に、マウスにＦｌｕＢ－ＤＭＡｂを与えた後に致命的Ｂ型インフルエンザを感染させた場合、当該ＦｌｕＢ－ＤＭＡｂは、いずれかの系統に由来するＢ型インフルエンザウイルスによる致命的感染に対して、１００％を生存させていた。同様に、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂは、１ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＢ ＩｇＧと同様のレベルで、致命的Ｂ型インフルエンザ感染からマウスを保護している（図１２）。
Ａ型インフルエンザ接種試験において、ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂの投与は、無関係のコントロールＤＭＡｂと比較して、マウスを致命的ウイルス感染から有意に保護しており、そして、体重減少を抑制した。ＦｌｕＡ－ＤＭＡｂは、０．３ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＡ ＩｇＧと同様のレベルで、致命的なＡ型インフルエンザ感染からマウスを保護していた（図１１）。同様に、マウスにＦｌｕＢ－ＤＭＡｂを与えた後に致命的Ｂ型インフルエンザを感染させた場合、当該ＦｌｕＢ－ＤＭＡｂは、いずれかの系統に由来するＢ型インフルエンザウイルスによる致命的感染に対して、１００％を生存させていた。同様に、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂは、１ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＢ ＩｇＧと同様のレベルで、致命的Ｂ型インフルエンザ感染からマウスを保護している（図１２）。
【0208】
ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの併用療法は、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザのいずれからも保護をする
ＦｌｕＡとＦｌｕＢ ＤＭＡｂとを組み合わせて投与すると、Ａ型及びＢ型インフルエンザの双方の感染から保護をする。ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの併用投与は、Ａ型インフルエンザＩｇＧ及びＢ型インフルエンザＩｇＧ血清発現をもたらした。Ａ型またはＢ型インフルエンザのいずれかの致命的感染から動物は保護されている（図１３）。
ＦｌｕＡとＦｌｕＢ ＤＭＡｂとを組み合わせて投与すると、Ａ型及びＢ型インフルエンザの双方の感染から保護をする。ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの併用投与は、Ａ型インフルエンザＩｇＧ及びＢ型インフルエンザＩｇＧ血清発現をもたらした。Ａ型またはＢ型インフルエンザのいずれかの致命的感染から動物は保護されている（図１３）。
【0209】
まとめると、これらの研究は、広範に中和をする抗－インフルエンザモノクローナル抗体を改変して得たＤＭＡｂは、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの致命的感染をマウスにおいて予防するのに十分なレベルで、インビボで、完全に機能的である抗体を発現することを実証している。これらの結果は、完全長ＩｇＧモノクローナル抗体の合成ＤＮＡ送達が、普遍的なインフルエンザ免疫予防のための実行可能なプラットフォーム戦略であり得ること、そして、交差反応性モノクローナル抗体を特徴とするその他の感染性病原体にも適応可能であることを示唆している。
【実施例3】
【0210】
本明細書で提示した研究は、２つの新規で広範に交差保護的なモノクローナル抗体をコードする合成プラスミドＤＮＡの生成を実証している。プラスミドＤＮＡでコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）構築物のインビボでの電気穿孔は、マウス血清におけるＡ型及びＢ型インフルエンザに対する高レベルの機能的抗体を生成した。Ａ型インフルエンザＤＭＡｂで処置された動物は、致命的グループ１及びグループ２でＡ型インフルエンザを接種しても生存しており、また、Ｂ型インフルエンザＤＭＡｂで処置された動物は、致命的Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ系統Ｂ型インフルエンザの罹患率及び死亡率から保護された。２つのＤＭＡｂを同時に投与した場合に、この技術の普遍的で交差保護的な特性はさらに高まり、重篤なＡ型及びＢ型インフルエンザ感染症から動物を首尾良く保護できた。さらに、抗－インフルエンザＤＭＡｂの送達は、インフルエンザ接種に対する即時保護は認められなかったが、インフルエンザに対する保護的な宿主免疫は阻害しなかった。インビボで産生されたＤＭＡｂ、及び、腹腔内に送達されたタンパク質モノクローナル抗体は、致命的なインフルエンザ感染に対して同様の保護を示しており、このことは、重篤なインフルエンザ感染に対する免疫予防のための実用的な代替物としてのＤＭＡｂを提示している。
【0211】
方法及び材料について説明をする。
【0212】
ＤＮＡがコードしたモノクローナル抗体構築物
モノクローナル抗体は、先述したのと同様の方法論（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，１６６：５９６－６０８；Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ５１６：４１８－２２；Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：８７１－５）を用いて単離をした。当該交差反応性Ａ型インフルエンザモノクローナル抗体（ＦｌｕＡ）は、Ｈ５及びＨ７ ＨＡタンパク質（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，１６６：５９６－６０８）に対する交差反応性結合に基づいて単離し、そして、Ｂ型インフルエンザモノクローナル抗体（ＦｌｕＢ）は、異なる系統のＢ型インフルエンザに対する中和活性に基づいて単離をした。可変遺伝子配列を、ＲＴ－ＰＣＲによって、交差反応性クローンから単離し、クローニングを行い、そして、さらに改変を行って、非必須非生殖細胞系構成アミノ酸変化を戻した。全長ヒトＩｇＧ１κをＣＨＯ細胞で一過的に発現させ、そして、インビボでの研究に供するために精製した。プラスミドＤＮＡがコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）構築物を、先述したようにして改変をした（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４：３６９－７８；Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６）。ＤＭＡｂ構築物は、ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂを完全にコードした。抗体のアミノ酸配列を、ヒト／マウスでの発現のために、ＤＮＡコドン最適化及びＲＮＡ最適化を行い、そして、得られたＤＮＡ導入遺伝子を、デノボで合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｃａｓｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。合成導入遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター下で、改変したｐＶａｘ１哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に制限クローニングした。細胞のプロセッシング及び分泌のために、ＩｇＥ重鎖及び軽鎖リーダー配列を添加した。最初の研究（図１４～図１７）において、導入遺伝子は、フーリン／ピコルナウイルス－２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド開裂部位配列によって分離された抗体重鎖及び軽鎖配列から構成されており、そこでは、インシスで、単一プラスミドからの重鎖及び軽鎖ペプチドの発現が認められる。ＦｌｕＡとＦｌｕＢ ＤＭＡｂの同時投与（図１８）を行った後出の研究では、重鎖または軽鎖ＦｌｕＡペプチドを個別に発現する２つのＦｌｕＡ ＤＭＡｂ構築物を、イントランスで、別々のプラスミドに由来する重鎖及び軽鎖ＦｌｕＡペプチドの発現のために混合をした。
モノクローナル抗体は、先述したのと同様の方法論（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，１６６：５９６－６０８；Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ５１６：４１８－２２；Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：８７１－５）を用いて単離をした。当該交差反応性Ａ型インフルエンザモノクローナル抗体（ＦｌｕＡ）は、Ｈ５及びＨ７ ＨＡタンパク質（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，１６６：５９６－６０８）に対する交差反応性結合に基づいて単離し、そして、Ｂ型インフルエンザモノクローナル抗体（ＦｌｕＢ）は、異なる系統のＢ型インフルエンザに対する中和活性に基づいて単離をした。可変遺伝子配列を、ＲＴ－ＰＣＲによって、交差反応性クローンから単離し、クローニングを行い、そして、さらに改変を行って、非必須非生殖細胞系構成アミノ酸変化を戻した。全長ヒトＩｇＧ１κをＣＨＯ細胞で一過的に発現させ、そして、インビボでの研究に供するために精製した。プラスミドＤＮＡがコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）構築物を、先述したようにして改変をした（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４：３６９－７８；Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６）。ＤＭＡｂ構築物は、ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂを完全にコードした。抗体のアミノ酸配列を、ヒト／マウスでの発現のために、ＤＮＡコドン最適化及びＲＮＡ最適化を行い、そして、得られたＤＮＡ導入遺伝子を、デノボで合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｃａｓｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。合成導入遺伝子を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター下で、改変したｐＶａｘ１哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に制限クローニングした。細胞のプロセッシング及び分泌のために、ＩｇＥ重鎖及び軽鎖リーダー配列を添加した。最初の研究（図１４～図１７）において、導入遺伝子は、フーリン／ピコルナウイルス－２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド開裂部位配列によって分離された抗体重鎖及び軽鎖配列から構成されており、そこでは、インシスで、単一プラスミドからの重鎖及び軽鎖ペプチドの発現が認められる。ＦｌｕＡとＦｌｕＢ ＤＭＡｂの同時投与（図１８）を行った後出の研究では、重鎖または軽鎖ＦｌｕＡペプチドを個別に発現する２つのＦｌｕＡ ＤＭＡｂ構築物を、イントランスで、別々のプラスミドに由来する重鎖及び軽鎖ＦｌｕＡペプチドの発現のために混合をした。
【0213】
トランスフェクション及びウエスタンブロット
ヒト２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。トランスフェクションの１日前に、０．２５×１０６細胞／ウェルで、１２ウェルプレートに細胞を接種し、そして、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、０．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。４８時間後に上清を回収し、そして、接着細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解した。約５０μｇの総上清／溶解物タンパク質、及び、１０μｇのタンパク質ＩｇＧを、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２プレ染色タンパク質標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、プレキャスト４～１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して流し込み、そして、ｉＢｌｏｔ ２ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｉｉｐｏｒｅ）へと移した。重鎖、及び、軽鎖のペプチドは、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：１０，０００）を用いて同定をした。蛍光ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でスキャンをした。
ヒト２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。トランスフェクションの１日前に、０．２５×１０６細胞／ウェルで、１２ウェルプレートに細胞を接種し、そして、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、０．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。４８時間後に上清を回収し、そして、接着細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解した。約５０μｇの総上清／溶解物タンパク質、及び、１０μｇのタンパク質ＩｇＧを、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２プレ染色タンパク質標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、プレキャスト４～１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して流し込み、そして、ｉＢｌｏｔ ２ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ ＰＶＤＦ膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｉｉｐｏｒｅ）へと移した。重鎖、及び、軽鎖のペプチドは、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：１０，０００）を用いて同定をした。蛍光ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でスキャンをした。
【0214】
定量的ＥＬＩＳＡ
図１４及び図１９における細胞溶解物、細胞上清、及び、マウス血清での全ヒトＩｇＧ１κの定量のために、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、一晩、４℃で、コーティングした。プレートを、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳでブロックした。試料を、１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で希釈し、次いで、プレートに１時間にわたって添加した。精製ヒトＩｇＧ１κ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、標準曲線を作成した。プレートを、ＨＲＰ結合二次抗体ヤギ抗－ヒトκ軽鎖（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：２０，０００）で１時間かけて染色し、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて発色させ、そして、２Ｎ硫酸で停止した。吸光度４５０ｎｍを、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。
図１４及び図１９における細胞溶解物、細胞上清、及び、マウス血清での全ヒトＩｇＧ１κの定量のために、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、一晩、４℃で、コーティングした。プレートを、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳでブロックした。試料を、１×ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で希釈し、次いで、プレートに１時間にわたって添加した。精製ヒトＩｇＧ１κ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、標準曲線を作成した。プレートを、ＨＲＰ結合二次抗体ヤギ抗－ヒトκ軽鎖（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：２０，０００）で１時間かけて染色し、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて発色させ、そして、２Ｎ硫酸で停止した。吸光度４５０ｎｍを、Ｓｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）で測定した。
【0215】
マウス接種研究におけるヒトＩｇＧの定量を、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を、４℃で、一晩、コーティングをした３８４－ウェルブラックＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）を用いて行った。プレートを、カゼインブロッカー（Ｔｈｅｒｍｏ）でブロックし、そして、血清試料と標準曲線（１０μｇ／ｍｌのＣｈｒｏｍＰｕｒｅヒトＩｇＧ、全分子）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）とを連続希釈した。プレートを洗浄し、そして、ロバ抗－ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）（１：４，０００）で染色し、そして、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて視覚化した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎを用いて、発光を測定した。
【0216】
マウスの血清における特異的Ａ型またはＢ型インフルエンザヒトＩｇＧの定量を、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来する３μｇ／ｍｌのＨＡタンパク質、または、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ）に由来する３μｇ／ｍｌのＨＡをコーティング試薬として用いて、上記したようにして行った。ＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ精製タンパク質ＩｇＧを、それぞれ、Ａ型及びＢ型インフルエンザアッセイの標準として使用した。
【0217】
結合ＥＬＩＳＡ
組換えヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を、上記したようにして、発現及び精製をした（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：６７４３－５０）。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／１９９７（Ｈ９Ｎ２）、及び、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する５μｇ／ｍｌの精製ＨＡタンパク質、または、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２００３（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／Ｍｉｓｓｏｕｒｉ／２００６（Ｈ２Ｎ３）、及び、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ）に由来する３μｇ／ｍｌの精製ＨＡタンパク質でコーティングをした３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロックし、そして、連続希釈した抗体を、室温で、１時間、インキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合マウス抗－ヒトＩｇＧ抗体（ＫＰＬ）（１：１０，０００）を用いて検出し、続いて、ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）で発色させ、４５０ｎｍのＯＤで、吸光度測定を行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗－マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）（１：５，０００）の二次抗体の他は、ＨＡに対するマウス血清反応性を上記したようにして行った。
組換えヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を、上記したようにして、発現及び精製をした（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：６７４３－５０）。Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／１９９７（Ｈ９Ｎ２）、及び、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する５μｇ／ｍｌの精製ＨＡタンパク質、または、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２００３（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／Ｍｉｓｓｏｕｒｉ／２００６（Ｈ２Ｎ３）、及び、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ）に由来する３μｇ／ｍｌの精製ＨＡタンパク質でコーティングをした３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を用いて、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロックし、そして、連続希釈した抗体を、室温で、１時間、インキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合マウス抗－ヒトＩｇＧ抗体（ＫＰＬ）（１：１０，０００）を用いて検出し、続いて、ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ）で発色させ、４５０ｎｍのＯＤで、吸光度測定を行った。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗－マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）（１：５，０００）の二次抗体の他は、ＨＡに対するマウス血清反応性を上記したようにして行った。
【0218】
ウイルスストック、インビトロでの中和及び赤血球凝集阻害
野生型インフルエンザ株は、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから入手し、あるいは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。逆遺伝学によって産生した再分類したＨ３ウイルス（ｒＡ／ＨＫ／６８）は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３ ＨＡ、及び、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に由来する残りの７つの遺伝子セグメントを含んでおり、そして、このウイルスのＨＡは、ネズミの病原性を増強するＮ１６５Ｓ変異も含んでいた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０６：１８－２４）。すべてのウイルスは、孵化鶏卵において増殖しており、そして、ウイルス力価を、ミリリットル当たり平均５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）で決定した。微量中和アッセイを、先述したようにして行った（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：６７４３－５０）。簡潔に説明すると、０．７５μｇ／ｍｌのＮ－トシル－Ｌ－フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有する完全ＭＥＭ培地が入った３８４ウェルプレートに、２連のウェルに入れられた、血清の３倍連続希釈物、または、ナイーブ血清で希釈した精製ＦｌｕＢ抗体に対して、６０ＴＣＩＤ５０のウイルス／ウェルを加えた。３３℃で、かつ、５％ＣＯ２で、１時間インキュベートした後に、２×１０４個のＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞／ウェルを、プレートに対して加えた。プレートを、３３℃で、かつ、５％ＣＯ２で、約４０時間インキュベートし、そして、３７℃で、１時間かけて、蛍光標識基質メチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵ－ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルに加えて、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性を測定した。ＮＡ活性が示すウイルス複製を、以下の設定を用いて蛍光を読み取ることで定量した。励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ、ウェル当たり１０回の点滅。赤血球凝集阻害アッセイを、先述したようにして、感染の２１日後に回収した血清について行った。
野生型インフルエンザ株は、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎから入手し、あるいは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。逆遺伝学によって産生した再分類したＨ３ウイルス（ｒＡ／ＨＫ／６８）は、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３ ＨＡ、及び、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に由来する残りの７つの遺伝子セグメントを含んでおり、そして、このウイルスのＨＡは、ネズミの病原性を増強するＮ１６５Ｓ変異も含んでいた（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０６：１８－２４）。すべてのウイルスは、孵化鶏卵において増殖しており、そして、ウイルス力価を、ミリリットル当たり平均５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）で決定した。微量中和アッセイを、先述したようにして行った（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：６７４３－５０）。簡潔に説明すると、０．７５μｇ／ｍｌのＮ－トシル－Ｌ－フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有する完全ＭＥＭ培地が入った３８４ウェルプレートに、２連のウェルに入れられた、血清の３倍連続希釈物、または、ナイーブ血清で希釈した精製ＦｌｕＢ抗体に対して、６０ＴＣＩＤ５０のウイルス／ウェルを加えた。３３℃で、かつ、５％ＣＯ２で、１時間インキュベートした後に、２×１０４個のＭａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞／ウェルを、プレートに対して加えた。プレートを、３３℃で、かつ、５％ＣＯ２で、約４０時間インキュベートし、そして、３７℃で、１時間かけて、蛍光標識基質メチルウンベリフェリル－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵ－ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルに加えて、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性を測定した。ＮＡ活性が示すウイルス複製を、以下の設定を用いて蛍光を読み取ることで定量した。励起３５５ｎｍ、発光４６０ｎｍ、ウェル当たり１０回の点滅。赤血球凝集阻害アッセイを、先述したようにして、感染の２１日後に回収した血清について行った。
【0219】
筋肉内ＤＮＡ電気穿孔
ＤＮＡ電気穿孔の３０分前に、メスのＢＡＬＢ／Ｃ、及び、ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｃｒｌマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に対して、１２単位（３０μｌ）のヒアルロニダーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を筋肉内（ｉｍ）注射して、各送達部位での前処置をした。最初の研究（図１４～図１７）では、１００μｇ（３０μｌ）のＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドのいずれかを、前脛骨（ＴＡ）、及び／または、大腿四頭（Ｑ）筋に対して筋肉注射を行い、マウスに対して、１箇所（ＴＡ）で１００μｇのＤＮＡ、２箇所（右のＴＡ＋左のＴＡ）で２００μｇのＤＮＡ、あるいは、３箇所（右のＴＡ＋左のＴＡ＋Ｑ）で３００μｇのＤＮＡを与えた。後出の同時投与研究（図１８）では、マウスに対して、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの双方のＤＭＡｂ構築物を与えた。当該ＦｌｕＡ構築物のデザインを改変して、重鎖及び軽鎖ペプチドを別々のプラスミドに発現させて、１つのプラスミドデザインよりも少ない注入部位から同等の血清レベルのＦｌｕＡ ＩｇＧを生成した。この場合、ＦｌｕＡ重鎖及び軽鎖プラスミドの１００μｇの１：１（重量：重量）混合物を、２箇所（右のＴＡ＋右のＱ）に送達し、そして、前述したようにして、２箇所（左のＴＡ＋左のＱ）に向けて、２００μｇのプラスミドＦｌｕＢを送達した。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐ適応定電流デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた各ＤＮＡを注入した直後に、筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）を行った。
ＤＮＡ電気穿孔の３０分前に、メスのＢＡＬＢ／Ｃ、及び、ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｃｒｌマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に対して、１２単位（３０μｌ）のヒアルロニダーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を筋肉内（ｉｍ）注射して、各送達部位での前処置をした。最初の研究（図１４～図１７）では、１００μｇ（３０μｌ）のＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドのいずれかを、前脛骨（ＴＡ）、及び／または、大腿四頭（Ｑ）筋に対して筋肉注射を行い、マウスに対して、１箇所（ＴＡ）で１００μｇのＤＮＡ、２箇所（右のＴＡ＋左のＴＡ）で２００μｇのＤＮＡ、あるいは、３箇所（右のＴＡ＋左のＴＡ＋Ｑ）で３００μｇのＤＮＡを与えた。後出の同時投与研究（図１８）では、マウスに対して、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの双方のＤＭＡｂ構築物を与えた。当該ＦｌｕＡ構築物のデザインを改変して、重鎖及び軽鎖ペプチドを別々のプラスミドに発現させて、１つのプラスミドデザインよりも少ない注入部位から同等の血清レベルのＦｌｕＡ ＩｇＧを生成した。この場合、ＦｌｕＡ重鎖及び軽鎖プラスミドの１００μｇの１：１（重量：重量）混合物を、２箇所（右のＴＡ＋右のＱ）に送達し、そして、前述したようにして、２箇所（左のＴＡ＋左のＱ）に向けて、２００μｇのプラスミドＦｌｕＢを送達した。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ３Ｐ適応定電流デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた各ＤＮＡを注入した直後に、筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）を行った。
【0220】
致命的インフルエンザの接種
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して、感染の４～５日前に、ＩＭ－ＥＰを介して、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂ、または、無関係なコントロールＤＭＡｂ（ＤＶＳＦ－３、すでに説明した（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６））を与えた。感染の１日前に、プラスミドＤＭＡｂによってコードされるものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質ＩｇＧモノクローナル抗体を、０．０３ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、マウスの別々の群に対して腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。コントロールのマウスに対して、非特異的タンパク質ＩｇＧ Ｒ３４７を腹腔内投与した。３×ＬＤ５０のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（９．５×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）、７×ＬＤ５０のｒＡ／ＨＫ／６８（Ｈ３）（１．２×１０５ ＴＣＩＤ５０／マウス）、１０×ＬＤ５０のＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（３．６×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）、または、７×ＬＤ５０のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ）（７．０×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）でマウスを鼻腔内感染させた。すべてのマウスについて、毎日、体重減少と生存について、１２日間、モニターをした（２５％以上の体重減少を示すマウスは、安楽死させた）。感染の当日に血液を採取して、血清でのヒトＩｇＧの量を評価した。肺のウイルス量を評価するために、別のマウスを、感染の５日後に安楽死させた。全肺を、１０％（重量／体積）滅菌Ｌ１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でホモジナイズし、そして、ＭＤＣＫ細胞で滴定して、組織のＴＣＩＤ５０／ｇを決定した。同種再感染試験では、最初の感染の２１日後にすべての生存マウスから血液試料を採取して、ヒトＩｇＧのクリアランス及び非存在を確認した。最初の感染の２８日後に、マウスに対して、最初の感染と同一のウイルス株を、致死量でもってして再接種した。
６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して、感染の４～５日前に、ＩＭ－ＥＰを介して、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂ、または、無関係なコントロールＤＭＡｂ（ＤＶＳＦ－３、すでに説明した（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６））を与えた。感染の１日前に、プラスミドＤＭＡｂによってコードされるものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質ＩｇＧモノクローナル抗体を、０．０３ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、マウスの別々の群に対して腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。コントロールのマウスに対して、非特異的タンパク質ＩｇＧ Ｒ３４７を腹腔内投与した。３×ＬＤ５０のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）（９．５×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）、７×ＬＤ５０のｒＡ／ＨＫ／６８（Ｈ３）（１．２×１０５ ＴＣＩＤ５０／マウス）、１０×ＬＤ５０のＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（Ｖｉｃｔｏｒｉａ）（３．６×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）、または、７×ＬＤ５０のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ）（７．０×１０４ ＴＣＩＤ５０／マウス）でマウスを鼻腔内感染させた。すべてのマウスについて、毎日、体重減少と生存について、１２日間、モニターをした（２５％以上の体重減少を示すマウスは、安楽死させた）。感染の当日に血液を採取して、血清でのヒトＩｇＧの量を評価した。肺のウイルス量を評価するために、別のマウスを、感染の５日後に安楽死させた。全肺を、１０％（重量／体積）滅菌Ｌ１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でホモジナイズし、そして、ＭＤＣＫ細胞で滴定して、組織のＴＣＩＤ５０／ｇを決定した。同種再感染試験では、最初の感染の２１日後にすべての生存マウスから血液試料を採取して、ヒトＩｇＧのクリアランス及び非存在を確認した。最初の感染の２８日後に、マウスに対して、最初の感染と同一のウイルス株を、致死量でもってして再接種した。
【0221】
すべての動物収容設備及び動物実験は、ＮＩＨ、ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ． Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｐｅｒｅｌｍａｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、及び、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが定めたガイドラインに沿った承認を受けており、そして、実施をした。すべてのネズミの接種研究は、ａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）が認証した施設を使って行われており、また、引き続いて実施されている。
【0222】
分析と統計
標準曲線とグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて調製した。ＥＣ５０値及びＩＣ５０値は、ｌｏｇ（レシプロカル血清希釈）と応答との非線形回帰を用いて、計算した。生存データは、ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって計算されたｐ値を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いて表した。
標準曲線とグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて調製した。ＥＣ５０値及びＩＣ５０値は、ｌｏｇ（レシプロカル血清希釈）と応答との非線形回帰を用いて、計算した。生存データは、ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって計算されたｐ値を用いたＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いて表した。
【0223】
これら実験の結果について、説明をする。
【0224】
ＤＮＡがコードしたモノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）は、インフルエンザウイルスに対するものであって、インビトロ及びインビボで発現される
Ａ型インフルエンザ（ＦｌｕＡ）、及び、Ｂ型インフルエンザ（ＦｌｕＢ）を広範に中和するモノクローナル抗体を、先述したようにして、ヒト記憶Ｂ細胞から単離した（Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６：４１８－２２；Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４、Ｎａｔ Ｍｅｄ，１０：８７１－８７５）。ＦｌｕＡモノクローナル抗体は、最近公開された広範に中和するモノクローナル抗体と密接に関連しており、同抗体は、ＨＡ幹への結合に起因する広範囲のＨＡ交差反応性を示し、そして、グループ１及びグループ２の双方に由来するＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる（平均ＩＣ５０は、２．５６μｇ／ｍｌ、データは示さず）（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，Ｃｅｌｌ，６７４３－５０）。ＦｌｕＢモノクローナル抗体は、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａの双方の系統に属するＢ型インフルエンザウイルスを強力に中和する能力に基づいて、同定及び選択をした（平均ＩＣ５０は、０．６４μｇ／ｍｌ、データは示さず）。この抗体は、Ｂ型インフルエンザＨＡの球状頭部に保存された領域に結合し、そして、赤血球のウイルス赤血球凝集を阻害することができる。重症のインフルエンザ感染を防ぐためのＤＭＡｂ送達の有用性を試験するために、ヒトＩｇＧ ＦｌｕＡまたはＦｌｕＢのいずれかをコードする合成ＤＮＡ導入遺伝子をデノボで合成し、そして、哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。ＤＮＡコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び、プラスミドＤＮＡの製剤などのＤＭＡｂ発現を増強するために、複数の改変を行った（図１９）（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４：３６９－７８；Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６）。ＤＭＡｂ構築物でトランスフェクトされたヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞の溶解物及び上清でのヒトＩｇＧの定量的ＥＬＩＳＡは、組み立てられたＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ抗体の細胞内発現及び細胞外分泌を確認した（図１４Ａ）。また、ヒトＩｇＧウエスタンブロットは、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清及び溶解物に抗体重鎖及び軽鎖が存在することを示した（図１４Ｂ）。
Ａ型インフルエンザ（ＦｌｕＡ）、及び、Ｂ型インフルエンザ（ＦｌｕＢ）を広範に中和するモノクローナル抗体を、先述したようにして、ヒト記憶Ｂ細胞から単離した（Ｐａｐｐａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６：４１８－２２；Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４、Ｎａｔ Ｍｅｄ，１０：８７１－８７５）。ＦｌｕＡモノクローナル抗体は、最近公開された広範に中和するモノクローナル抗体と密接に関連しており、同抗体は、ＨＡ幹への結合に起因する広範囲のＨＡ交差反応性を示し、そして、グループ１及びグループ２の双方に由来するＡ型インフルエンザウイルスを中和することができる（平均ＩＣ５０は、２．５６μｇ／ｍｌ、データは示さず）（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，Ｃｅｌｌ，６７４３－５０）。ＦｌｕＢモノクローナル抗体は、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａの双方の系統に属するＢ型インフルエンザウイルスを強力に中和する能力に基づいて、同定及び選択をした（平均ＩＣ５０は、０．６４μｇ／ｍｌ、データは示さず）。この抗体は、Ｂ型インフルエンザＨＡの球状頭部に保存された領域に結合し、そして、赤血球のウイルス赤血球凝集を阻害することができる。重症のインフルエンザ感染を防ぐためのＤＭＡｂ送達の有用性を試験するために、ヒトＩｇＧ ＦｌｕＡまたはＦｌｕＢのいずれかをコードする合成ＤＮＡ導入遺伝子をデノボで合成し、そして、哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。ＤＮＡコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び、プラスミドＤＮＡの製剤などのＤＭＡｂ発現を増強するために、複数の改変を行った（図１９）（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４：３６９－７８；Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６）。ＤＭＡｂ構築物でトランスフェクトされたヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞の溶解物及び上清でのヒトＩｇＧの定量的ＥＬＩＳＡは、組み立てられたＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ抗体の細胞内発現及び細胞外分泌を確認した（図１４Ａ）。また、ヒトＩｇＧウエスタンブロットは、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清及び溶解物に抗体重鎖及び軽鎖が存在することを示した（図１４Ｂ）。
【0225】
ＤＭＡｂの送達及び発現を増強するためのヒアルロニダーゼを配合した筋肉内電気穿孔（ＩＭ－ＥＰ）を利用して、ＦｌｕＡまたはＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミドＤＮＡを、１００μｇ～３００μｇの用量で筋肉内注射して、無胸腺ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｃｒｌヌードマウスに投与した（図１９）。ヌードマウス血清でのピーク発現レベルは、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂのそれぞれについて、平均１０．０μｇ／ｍｌ（±２．６ＳＥＭ）、及び、３１．８μｇ／ｍｌ（±８．１ＳＥＭ）に達しており、ＤＭＡｂ送達の１０週間後には、有意なヒトＩｇＧ発現が観察され（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）、そして、その域も超えた。
【0226】
次に、抗－インフルエンザＤＭＡｂの発現を、確立されたインフルエンザ接種モデルである免疫コンピテントＢＡＬＢ／ｃマウス（図１４Ｅ及び１４Ｆ）において定義した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＩＭ－ＥＰを介して、１００μｇ～３００μｇのプラスミドＤＮＡを与えた。当該ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ構築物は、送達の５日後に測定したところ、ＢＡＬＢ／ｃマウス血清に適度なレベルのヒトＩｇＧを生成した（３００μｇプラスミド平均１．８μｇ／ｍｌ±０．３ＳＥＭ）。ヌードマウスでの観察と同様に、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂ発現は、送達の５日後のＦｌｕＡ ＤＭＡｂ発現よりも強力であった（２００μｇ平均５．４μｇ／ｍｌ±０．６ＳＥＭ、３００μｇ平均１０μｇ／ｍｌ±１．９ＳＥＭ）。ヌードマウスで観察された安定した発現とは異なり、ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清ＤＭＡｂレベルは、おそらくは、発現されたＤＭＡｂに対するマウス適応性抗－ヒト－ＩｇＧ応答が故に、送達１０日後には検出できなかった。まとめると、これらのデータは、ＤＭＡｂヒトＩｇＧが、プラスミド構築物を投与した後にインビボで実質的なレベルで産生されたことを明示した。
【0227】
インビボで発現したインフルエンザＤＭＡｂは、機能的に活性であり、かつ、広範な交差反応性を示す
インビボで生成されたＤＭＡｂの機能性を試験するために、ＤＭＡｂで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清を、インビトロ結合活性について試験をした。季節性（Ｈ１、Ｈ３）及び潜在的流行性（Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９）インフルエンザ分離株に由来する組換え三量体ＨＡ（図１５Ａ）、ならびに、組換え単量体ＨＡ Ｈ１０（図２０）など、ヒトに感染することが公知のウイルスに由来する広範囲のＡ型インフルエンザグループ１及びグループ２ ＨＡ抗原に、血清由来のＦｌｕＡ ＤＭＡｂは結合した。マウス血清でのＦｌｕＢ ＤＭＡｂは、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａの双方の系統のウイルスに由来するＢ型インフルエンザＨＡに結合した（図１５Ｂ）。レシプロカル血清希釈の半数効果濃度（ＥＣ５０）は、３００μｇ対１００μｇのプラスミドＤＮＡで処置したマウスの血清において、より高い結合活性を反映しており、このことは、より多くのプラスミドＤＮＡを与えた動物でのＤＭＡｂ発現が大きいことを反映している。
インビボで生成されたＤＭＡｂの機能性を試験するために、ＤＭＡｂで処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血清を、インビトロ結合活性について試験をした。季節性（Ｈ１、Ｈ３）及び潜在的流行性（Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９）インフルエンザ分離株に由来する組換え三量体ＨＡ（図１５Ａ）、ならびに、組換え単量体ＨＡ Ｈ１０（図２０）など、ヒトに感染することが公知のウイルスに由来する広範囲のＡ型インフルエンザグループ１及びグループ２ ＨＡ抗原に、血清由来のＦｌｕＡ ＤＭＡｂは結合した。マウス血清でのＦｌｕＢ ＤＭＡｂは、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａの双方の系統のウイルスに由来するＢ型インフルエンザＨＡに結合した（図１５Ｂ）。レシプロカル血清希釈の半数効果濃度（ＥＣ５０）は、３００μｇ対１００μｇのプラスミドＤＮＡで処置したマウスの血清において、より高い結合活性を反映しており、このことは、より多くのプラスミドＤＮＡを与えた動物でのＤＭＡｂ発現が大きいことを反映している。
【0228】
当該親ＦｌｕＢモノクローナル抗体での強力なインビトロ中和能力は、中和活性試験を可能にしたが、当該ＦｌｕＡモノクローナル抗体の効力は、ミクロ中和アッセイにおけるマウス血清の非特異的干渉からの分化を可能にしなかった。ＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド構築物を与えたマウスに由来する血清は、結合アッセイで認められるのと同様の反応性のパターンで、インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａの双方の系統のＢ型インフルエンザウイルスを効果的に中和した（図１５Ｃ）。各試料でのヒトＩｇＧ濃度を標準化した後に、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６については０．０１５μｇ／ｍｌであり、かつ、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６については０．０３０μｇ／ｍｌ）で処理したマウスで計算した半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、精製タンパク質ＦｌｕＢモノクローナル抗体（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６については０．０１１μｇ／ｍｌであり、かつ、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４については０．０４７μｇ／ｍｌ）で得た半数阻害濃度と同様であり、この細胞ベースのアッセイの総合誤差の範囲内であった。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド構築物の投与を受けたマウスにおけるＨＡ結合ヒトＩｇＧの存在、及び、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド構築物で処置したマウスにおける中和力価は、機能的ＤＭＡｂのインビボでの発現を確認し、そして、これらの新規抗－インフルエンザＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ抗体の顕著に広範な交差反応性を実証した。
【0229】
インフルエンザのＤＭＡｂは、多様なＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの致命的接種からマウスを保護する
この技術のインビボでの有用性を評価するために、ＤＭＡｂで処置した動物を、致命的インフルエンザ接種モデルで評価した。ＩＭ－ＥＰを介して、３００μｇのＦｌｕＡ ＤＭＡｂ、または、無関係なＤＭＡｂコントロール（ＤＶＳＦ－３（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６））を動物に投与し、次いで、電気穿孔の４日後に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１）の致死量を接種した（図１６）。ＤＭＡｂとタンパク質ＩｇＧとを直接にインビボで比較するために、感染の１日前に、ＦｌｕＡタンパク質モノクローナル抗体の一連の希釈物を腹腔内に投与して、マウスのグループ分けを行った。感染時に全ての動物から得た血清試料は、０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡタンパク質ＩｇＧで処置したマウスに認められるのと同様の平均ヒトＩｇＧ濃度及びＨＡ結合活性を、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置がもたらす、ことを示した（図１６Ａ及び図２１）。致死量のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１）を接種した場合に、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置が、９０％の生存利益をもたらしたのに対して、デング熱ウイルス（ＤＶＳＦ－３）に対するコントロールＤＭＡｂで処置をした全ての動物は、感染により死亡した（図１６Ｂ）。ヒトＩｇＧ発現レベルに対応して、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置、及び、０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡ精製タンパク質は、致命的で、かつ、インフルエンザ誘発性である体重減少に対して、同様の保護をもたらした（図１６Ｃ）。
この技術のインビボでの有用性を評価するために、ＤＭＡｂで処置した動物を、致命的インフルエンザ接種モデルで評価した。ＩＭ－ＥＰを介して、３００μｇのＦｌｕＡ ＤＭＡｂ、または、無関係なＤＭＡｂコントロール（ＤＶＳＦ－３（Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６））を動物に投与し、次いで、電気穿孔の４日後に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１）の致死量を接種した（図１６）。ＤＭＡｂとタンパク質ＩｇＧとを直接にインビボで比較するために、感染の１日前に、ＦｌｕＡタンパク質モノクローナル抗体の一連の希釈物を腹腔内に投与して、マウスのグループ分けを行った。感染時に全ての動物から得た血清試料は、０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡタンパク質ＩｇＧで処置したマウスに認められるのと同様の平均ヒトＩｇＧ濃度及びＨＡ結合活性を、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置がもたらす、ことを示した（図１６Ａ及び図２１）。致死量のＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１）を接種した場合に、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置が、９０％の生存利益をもたらしたのに対して、デング熱ウイルス（ＤＶＳＦ－３）に対するコントロールＤＭＡｂで処置をした全ての動物は、感染により死亡した（図１６Ｂ）。ヒトＩｇＧ発現レベルに対応して、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ処置、及び、０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡ精製タンパク質は、致命的で、かつ、インフルエンザ誘発性である体重減少に対して、同様の保護をもたらした（図１６Ｃ）。
【0230】
これらの結果を、別の臨床的に関連するＡ型インフルエンザ型ウイルスにまで広げて、ＤＭＡｂ投与の５日後に、ｒＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８ Ｈ３Ｎ１（ｒＡ／ＨＫ／６８ Ｈ３）の致命的接種をして、同様の研究を行った。再び、感染時に、ヒト抗体レベルは、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ、及び、０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡタンパク質ＩｇＧを、同様の濃度で示した（図１６Ｄ）。致命的ｒＡ／ＨＫ／６８ Ｈ３を接種した後、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂで処置した動物は、ＤＭＡｂコントロールと比較して、有意な生存利益を有していた（ＦｌｕＡ ＤＭＡｂで８０％の生存率であるの対して、コントロールＤＭＡｂでの生存率は０％である）（図１６Ｅ）。これらの結果は、ヒトにおいて疾患を引き起こすことが知られている臨床的に関連するＨ１及びＨ３亜型による致命的Ａ型インフルエンザ感染を予防し、そして、ＤＭＡｂプラットフォームを介して生成したＦｌｕＡ抗体が、腹腔内に送達した精製ＦｌｕＡ抗体と同様のインビボ機能を持つことを明確に実証している。
【0231】
ＤＭＡｂ技術の予防可能性をさらに調べるために、同様の致命的接種研究を行って、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂの活性を評価した。これらの研究では、２００μｇのＦｌｕＢ ＤＭＡｂプラスミド構築物、または、コントロールのＤＭＡｂを、ＩＭ－ＥＰを介して、マウスに投与し、次いで、５日後に、Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｂ／Ｍａｌａｙａｉｓａ／２５０６／２００４（Ｂ／Ｍａｌ／０４））、または、Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ／Ｆｌａ／０６））に由来する致死量のウイルスを接種した（図１７）。再度、ＤＭＡｂと精製タンパク質とを直接に比較するために、感染の１日前に、精製ＦｌｕＢモノクローナル抗体を腹腔内投与して、マウスのグループ分けを行った。Ｂ／Ｍａｌ／０４を接種した時点でマウスの血清に存在するヒトＩｇＧの定量は、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂが、１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＢタンパク質を腹腔内投与して処置した動物で認められたのと同様の平均ヒトＩｇＧ濃度とＨＡ結合活性とを示した。（図１７Ａ及び図２１）。意外にも、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂで処置したマウスの１００％は、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａの双方で致命的Ｂ型インフルエンザ接種をしても生存していたが、非特異的ＤＭＡｂコントロールは、８日目までに、双方の感染によって完全に死亡していた（図１７Ｂ及び１７Ｅ）。さらに、ＦｌｕＢは、Ｂ型インフルエンザ関連病的状態からマウスを保護しており、処置をした動物では 体重減少が、ほとんど、または、全く認められない（図１７Ｃ及び１７Ｆ）。加えて、ＦｌｕＢで処置したマウスは、コントロールマウスよりも有意に低い肺ウイルス負荷を示した（図２２）。ＦｌｕＢ ＤＭＡｂで処置をしたマウスの生存、体重減少、肺ウイルス負荷、及び、血清でのインビトロの結合活性は、１ｍｇ／ｋｇの精製ＦｌｕＢタンパク質ＩｇＧを与えられたマウスでの同じパラメーターとほぼ同等であり、このことは、ＤＭＡｂ、及び、精製されたタンパク質モノクローナル抗体のインビボでの機能的等価性を改めて確認している。
【0232】
ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂの同時投与は、Ａ型及びＢ型インフルエンザの接種、及び、相同的再接種からマウスを保護する
Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスは、共循環し、そして、季節性感染症に対する包括的な免疫予防戦略は、双方のインフルエンザを標的とすべきである。ＤＭＡｂプラットフォームが、この役割を果たす能力を試験するために、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して同時投与した。感染の５日前に、マウスに対してＦｌｕＢ ＤＭＡｂを投与し、次いで、翌日に、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂを投与した。比較群の動物には、感染の１日前に、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ精製タンパク質モノクローナル抗体の混合物を腹腔内に投与した。Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１またはＢ／Ｆｌａ／０６のいずれかの致死量を、マウスに接種した。感染時の血清試料は、ＤＭＡｂで処置した動物が、全ヒトＩｇＧが平均で３μｇ／ｍｌであることを示した（図１８Ａ）。Ａ型及びＢ型インフルエンザに特異的なＥＬＩＳＡは、双方のＤＭＡｂが、以前に観察されたものと同様の発現レベルを示しており（図１８Ｂ）、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂの血清レベルは、腹腔内に送達した０．３ｍｇ／ｋｇ ＦｌｕＡタンパク質ＩｇＧの血清レベルに近似しており、かつ、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂの血清レベルは、腹腔内に送達した１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＢタンパク質ＩｇＧに近似している。接種研究において、ＦｌｕＡ＋ＦｌｕＢ ＤＭＡｂを与えた全てのマウスは、致命的感染から保護されたが、コントロールのＤＭＡｂで処置したマウスの９０％と１００％は、それぞれ、Ａ型インフルエンザとＢ型インフルエンザ感染で死亡した（図１８Ｃ及び１８Ｄ）。ＤＭＡｂ投与及びタンパク質ＩｇＧの送達は、改めて、生存率及び体重減少の双方において明確に同様の保護レベルを示した（図２３）。
Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスは、共循環し、そして、季節性感染症に対する包括的な免疫予防戦略は、双方のインフルエンザを標的とすべきである。ＤＭＡｂプラットフォームが、この役割を果たす能力を試験するために、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して同時投与した。感染の５日前に、マウスに対してＦｌｕＢ ＤＭＡｂを投与し、次いで、翌日に、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂを投与した。比較群の動物には、感染の１日前に、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ精製タンパク質モノクローナル抗体の混合物を腹腔内に投与した。Ａ／ＣＡ／０９ Ｈ１またはＢ／Ｆｌａ／０６のいずれかの致死量を、マウスに接種した。感染時の血清試料は、ＤＭＡｂで処置した動物が、全ヒトＩｇＧが平均で３μｇ／ｍｌであることを示した（図１８Ａ）。Ａ型及びＢ型インフルエンザに特異的なＥＬＩＳＡは、双方のＤＭＡｂが、以前に観察されたものと同様の発現レベルを示しており（図１８Ｂ）、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂの血清レベルは、腹腔内に送達した０．３ｍｇ／ｋｇ ＦｌｕＡタンパク質ＩｇＧの血清レベルに近似しており、かつ、ＦｌｕＢ ＤＭＡｂの血清レベルは、腹腔内に送達した１ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＢタンパク質ＩｇＧに近似している。接種研究において、ＦｌｕＡ＋ＦｌｕＢ ＤＭＡｂを与えた全てのマウスは、致命的感染から保護されたが、コントロールのＤＭＡｂで処置したマウスの９０％と１００％は、それぞれ、Ａ型インフルエンザとＢ型インフルエンザ感染で死亡した（図１８Ｃ及び１８Ｄ）。ＤＭＡｂ投与及びタンパク質ＩｇＧの送達は、改めて、生存率及び体重減少の双方において明確に同様の保護レベルを示した（図２３）。
【0233】
最初の感染から２１日後に、生存しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清は、検出不可能なレベルのヒトＩｇＧを有しており（データは示さず）、このことは、ＤＭＡｂ及び組換えタンパク質が、もはや存在しないことを示している。血清赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）、及び、感染性インフルエンザ株に対するマウス抗－ＨＡ結合抗体は、マウスで、感染に対する宿主免疫応答が高まっていたことを確認した（図２４）。ＤＭＡｂで処置したマウスは、精製したＩｇＧで処置した動物と同程度にまで、ウイルスに対する宿主免疫応答を高めることができた。
【0234】
重大なことに、インビボでのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの存在は、接種ウイルスに対する保護的な宿主免疫応答を阻害しなかった。最初の感染から２８日後に、致死量の相同インフルエンザウイルスを、生存していた全てのマウス（最初のＡ／ＣＡ／０９ Ｈ１感染で生存していた１匹のＤＭＡｂコントロールマウスを含む）に再接種して、マウス宿主免疫応答のレベルが保護的であったことを確認した。先に接種をした全てのマウスは、実質的な体重減少を招かずに、致命的な同種再接種でも生存したが、感染しておらず、未処置で、年齢が一致するマウスの８０～９０％は、生存しなかった（図１８Ｅ、図１８Ｆ、及び、図２３）。これらの結果は、保護的宿主抗－インフルエンザ応答が、インビボでＤＭＡｂとして発現した、または、タンパク質モノクローナル抗体として送達された、保護レベルのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢ抗体の存在下で生じることを実証しており、このことは、ＤＭＡｂが、互いに拮抗するものではなく、または、インフルエンザに対する宿主免疫応答に拮抗しない、ことを実証している。
【0235】
考察
季節性インフルエンザ感染は、米国だけで、年平均で１００億ドルの直接医療費と、８００億ドルの経済的負担を招いている（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：５０８６－９６）。インフルエンザワクチン及び抗ウイルス薬が入手可能であるにもかかわらず、大きな亜集団は、季節性インフルエンザ感染に起因する合併症の影響を受けやすい。米国での季節性インフルエンザに起因する死亡者の９０％近くは、６５歳以上の成人であり（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１０， ＭＭＷＲ ５９）、この集団では、抗原連続変異が顕著な年のワクチン有効性が推定で３６％にまで低下する。季節性感染症の持続的な危険性に加えて、流行性インフルエンザの発生は、ワクチンデザインを撹乱する可能性がある。したがって、インフルエンザ感染に対する革新的普遍的介入が不可欠である。
季節性インフルエンザ感染は、米国だけで、年平均で１００億ドルの直接医療費と、８００億ドルの経済的負担を招いている（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：５０８６－９６）。インフルエンザワクチン及び抗ウイルス薬が入手可能であるにもかかわらず、大きな亜集団は、季節性インフルエンザ感染に起因する合併症の影響を受けやすい。米国での季節性インフルエンザに起因する死亡者の９０％近くは、６５歳以上の成人であり（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１０， ＭＭＷＲ ５９）、この集団では、抗原連続変異が顕著な年のワクチン有効性が推定で３６％にまで低下する。季節性感染症の持続的な危険性に加えて、流行性インフルエンザの発生は、ワクチンデザインを撹乱する可能性がある。したがって、インフルエンザ感染に対する革新的普遍的介入が不可欠である。
【0236】
普遍的なインフルエンザワクチンを作成する現在の努力の大部分は、交差保護的な抗－インフルエンザ抗体の成熟を促す免疫原として作用できる組換え抗原のデザインに向かっている（Ｙａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１：１０６５－７０；Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９：１３０１－６；Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ＰＮＡＳ １０７：１３７０１－６）。そこでは、免疫を回避し、そして、インビボで直接的に交差保護的な免疫を生成することが求められていた。致命的なＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの接種に対して有意に保護をする２つのＨＡ標的抗体をコードするプラスミドＤＮＡ構築物の筋肉内電気穿孔の後に、マウスの血清に機能的交差保護的な抗－インフルエンザ抗体を生成した。
【0237】
多量のタンパク質モノクローナル抗体は、自己免疫疾患、がん、及び、その他の慢性病態の処置のために市販されているが、生物学的製剤の投与に要する費用と、それらの半減期が限られているが故に、感染性疾患の標的に対する予防には、わずか１つのタンパク質モノクローナル抗体しか汎用されていない（Ｇｒｏｕｐ， １９９８， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １０２：５３１－７）。ＤＭＡｂ技術は、優れた送達代替物であり、インビボで筋肉細胞から産生されたＤＭＡｂ、及び、インビトロで精製されたタンパク質モノクローナル抗体は、マウスにおける致命的インフルエンザ感染と同じレベルで保護をする。プラスミドＤＮＡは、既存の抗－ベクター血清学がもたらす制限を受けることもなく、また、ＤＭＡｂプラットフォームは、ウイルス回避に対処するためのさらなる抗－インフルエンザ抗体、または、全く異なる病原体を目標とする抗体を送達するために、繰り返し利用し得る（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１４：３６９－７８；Ｆｌｉｎｇａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１２６１６）。また、プラスミドＤＮＡは、ゲノム組込みのリスクがほとんどなく、そして、同様のプラスミドデザインは、ＤＮＡワクチンのヒト臨床研究において安全性を実証している。
【0238】
モノクローナル抗体のＤＮＡプラスミドベースの送達は、サプライチェーンの各段階でのタンパク質療法の実現可能な代替物である。生産においては、ＤＮＡ複製が哺乳動物細胞培養を必要としないため、ＤＭＡｂは、タンパク質モノクローナル抗体（及び、ウイルスベクター）と比べても安価である。流通では、低温流通システムが不要であり、このことは、開発途上国では実用上の大きな利点である。ＤＮＡはスケールアップが容易であり、かつ、貯蔵時にも安定しており、このことは、物資が限られている状況では特に重要な検討事項である。長期にわたるＤＭＡｂ発現の可能性は、組換え抗体の頻繁な注射の必要性を解消し得るものであり、新生抗体の半減期延長技術とも関係している。送達において、タンパク質モノクローナル抗体は、一般的には、インビボでの半減期が短いが、持続的なＤＭＡｂ発現は、抗体の頻繁な注射の必要性を解消し得るものであり、ヌードマウスへＤＭＡｂを送達してから数ヵ月の単位で、強力なＤＭＡｂの発現が認められた。重大なことに、ＤＭＡｂで処置したマウスは、同一源で再感染しても生存しており、このことは、ＦｌｕＡ ＤＭＡｂ及びＦｌｕＢ ＤＭＡｂで処置した後もなお、インフルエンザ感染に対する宿主免疫応答が完全であることを示している。おそらくは、これらのインフルエンザ特異的ＤＭＡｂは、ワクチンの推奨を広めるために使用することができ、このことは、重篤なインフルエンザ感染に対して即時予防をもたらし、そして、適切なワクチン誘発免疫応答の成熟を可能にする。また、ＤＭＡｂは、重度の免疫障害があり、抗体応答を取り込むことができない個体に、生命維持に必須の選択肢を提供し得る。ＤＭＡｂ技術は、プラスミドＤＮＡを用いて強力な機能性抗体を送達することで、治療可能性が非常に広範なプラットフォームを提供する。
【実施例4】
【0239】
ペプチド核酸配列識別表示を以下に示す。
【表1】
【0240】
開示した実施形態に対する様々な変更や修正は、当業者にとって明白のことであろう。そのような変更や修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに実施し得るものであり、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または、使用方法に関するものなどがあるが、これらに限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】