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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-19
(45)【発行日】2024-06-27
(54)【発明の名称】ポリペプチド、その調製方法およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/165 20060101AFI20240620BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240620BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240620BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240620BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240620BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240620BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240620BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240620BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240620BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240620BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240620BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240620BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240620BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/4965 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/472 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/426 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/34 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/4706 20060101ALI20240620BHJP
A61K 31/4045 20060101ALI20240620BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20240620BHJP
【ＦＩ】
C07K14/165 ZNA
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12P21/02 C
A61K38/16
A61P31/14
A61K45/00
A61K47/54
A61K47/60
A61K9/10
A61K9/08
A61K9/127
A61K9/14
A61K9/19
A61K9/20
A61K9/48
A61K31/4965
A61K31/472
A61K31/505
A61K31/426
A61K31/34
A61K31/675
A61K31/4706
A61K31/4045
C12N15/50
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022545338
(86)(22)【出願日】2021-01-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-24
(86)【国際出願番号】 CN2021071078
(87)【国際公開番号】W WO2021155733
(87)【国際公開日】2021-08-12
【審査請求日】2022-07-26
(31)【優先権主張番号】202010080751.4
(32)【優先日】2020-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】522112755
【氏名又は名称】山西錦波生物医薬股▲フェン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】陸 路
(72)【発明者】
【氏名】姜 世勃
(72)【発明者】
【氏名】夏 帥
(72)【発明者】
【氏名】楊 霞
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】XIA, S., et al.，A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike，SCIENCE ADVANCES，2019年04月10日，5(4)，p. 1-15，doi: 10.1126/sciadv.aav4580
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ０７Ｋ １４／００
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｋ ３８／１６
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１または配列番号２のポリペプチド誘導体であって、該誘導体は、ポリペプチドのパルミトイル化修飾またはコレステロール修飾により得られ、該ポリペプチドは、Ｃ末端でリンカーを介して、パルミトイル化修飾されたリシンまたはコレステロール修飾されたシステインに連結され、該リンカーは、ＰＥＧ化されたものである、ポリペプチド誘導体。
【請求項2】
前記リンカーが、（ＧＳＧ）ｎまたは（ＧＳＧＳＧ）ｎを含み、ここで、ｎは１または２である、請求項１に記載のポリペプチド誘導体。
【請求項3】
前記リンカーが、－（ＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－または－（ＧＳＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－である、請求項２に記載のポリペプチド誘導体。
【請求項4】
前記のポリペプチド誘導体は、ＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－（ＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－Ｋ－パルミチン酸、またはＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－（ＧＳＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－Ｃ－コレステロールであり、ここで、ｎは１または２である、請求項１に記載のポリペプチド誘導体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体を含む、組成物。
【請求項6】
前記組成物が、外用剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記外用剤が、外用塗布剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記外用塗布剤が、外用ゲル剤または外用浸潤製剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
コロナウイルスを阻害するための医薬品、またはコロナウイルスに起因する疾患を治療および/または予防するための医薬品をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項10】
前記医薬品は、ファビピラビル、ネルフィナビル、アルビドール、ロピナビル、リトナビル、クロロキンリン酸塩、ダルナビルまたはレムデシビルからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記組成物は、薬学的に許容される担体を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項12】
コロナウイルスを阻害するため、またはコロナウイルスによって引き起こされる疾患を治療および/または予防するための医薬品の製造における請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体または請求項５～１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項13】
前記コロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶであり、および/または前記疾患は、コロナウイルス肺炎である、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記医薬品の剤形が、錠剤、カプセル剤、滴丸剤、エアゾール剤、丸剤、粉剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、リポソーム、経皮製剤、坐剤、または凍結乾燥製剤である、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項15】
前記医薬品は、注射、腔内投与、呼吸器内投与、粘膜投与、または局所投与により投与される、請求項１４に記載の使用
【請求項16】
前記医薬品は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および腹腔内注射、大槽内注射または注入、直腸内投与、膣内投与、舌下投与、または鼻腔内投与により、投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項17】
インビトロでコロナウイルスを阻害する方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体、または請求項５～１１のいずれか１項に記載の組成物を用いて、2019-nCoV、Rs3367-CoVまたはWIV1-CoVを阻害することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
本願は、２０２０年０２月０５日に出願された出願番号が２０２０１００８０７５１．４である中国特許出願（発明の名称：ポリペプチド、その調製方法およびその使用）の優先権を主張するものであり、その全体を参照により本出願の一部をなすものそして引用する。
本願は、２０２０年０２月０５日に出願された出願番号が２０２０１００８０７５１．４である中国特許出願（発明の名称：ポリペプチド、その調製方法およびその使用）の優先権を主張するものであり、その全体を参照により本出願の一部をなすものそして引用する。
【0002】
本発明は、ポリペプチド医薬品分野、特にコロナウイルスを阻害するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【0003】
新型コロナウイルスは、動物によってヒトに感染する可能性がある。この病原体はすぐに新規のコロナウイルスとして同定され、世界保健機関はそれを２０１９－ｎＣｏＶ［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２０２０．９２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｖ．２５６７８］と名付けた。その後、国際ウイルス分類委員会は、この新型コロナウイルスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と名付けた。
【0004】
したがって、このウイルスの拡散を効果的に防止や制御すること、および特効薬を開発することは、早急に解決すべき重要な課題になっている。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）の感染を阻害する効果を有するポリペプチドを開示する。本発明者らは、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質のＳ２領域におけるＨＲ１標的に基づいて、２０１９－ｎＣｏＶ感染のみを阻害することができるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を見出した。また、これらは、ＳＡＲＳ様ウイルス（Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶ）などのヒトに感染する可能性のある他のコロナウイルスに対しても優れた阻害効果を発揮することができる。本発明は、現在も流行している２０１９－ｎＣｏＶおよび将来発生する可能性のあるＳＡＲＳ様ウイルスに対して優れた予防および治療の候補医薬品を提供することができる。
【0006】
一局面では、本発明は、以下のポリペプチドを提供する。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド；或いは
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド；或いは
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド。
【0007】
また、一局面では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、融合タンパク質またはコンジュゲートを提供する。
【0008】
また、一局面では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【0009】
また、一局面では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【0010】
また、一局面では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0011】
また、一局面では、本発明は、以下の工程を含む、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を調製する方法を提供する。
（１）本発明のベクターを宿主細胞に導入すること；
（２）適切な培地で前記の宿主細胞を培養すること；および
（３）ポリペプチドまたは融合タンパク質を収集して単離すること。
（１）本発明のベクターを宿主細胞に導入すること；
（２）適切な培地で前記の宿主細胞を培養すること；および
（３）ポリペプチドまたは融合タンパク質を収集して単離すること。
【0012】
また、一局面では、本発明は、以下の（１）～（３）のいずれか１項に記載のポリペプチドのパルミトイル化修飾またはコレステロール修飾された誘導体である、ポリペプチド誘導体を提供する。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド；或いは
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド；或いは
（３）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９４％または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つコロナウイルスに対して阻害活性を有するポリペプチド。
【0013】
一実施形態では、パルミトイル化修飾またはコレステロール修飾は、ポリペプチドのＣ末端で行われた。
【0014】
一実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端でリンカーを介してパルミチン酸またはコレステロールの部分に連結されている。
【0015】
一実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ化されている。例えば、リンカーは、ｄＰＥＧでＰＥＧ化される。
【0016】
一実施形態では、ポリペプチドは、Ｃ末端でリンカーを介して、パルミトイル化修飾されたリシンまたはコレステロール修飾されたシステインに連結されている。言い換えれば、ポリペプチドは、リンカーを介してリシンまたはシステインを経由してパルミチン酸またはコレステロールの部分に連結されている。
【0017】
一実施形態では、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎまたは（ＧＳＧＳＧ）ｎを含み、ここで、ｎは任意の整数であってもよい。例えば、ｎは、１、２、３、４または５である。
【0018】
一実施形態では、リンカーは、－（ＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－または－（ＧＳＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－であり、ここで、ｎは任意の整数であってもよい。例えば、ｎは、１、２、３、４または５である。
【0019】
一実施形態では、ポリペプチド誘導体は、ＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－（ＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－Ｋ－パルミチン酸、またはＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－（ＧＳＧＳＧ）ｎ－ＤＰＥＧ４－Ｃ－コレステロールである。ｎは任意の整数であってもよい。例えば、ｎは、１、２、３、４または５である。
【0020】
一実施形態では、ポリペプチド誘導体は、ＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－ＧＳＧ－ＤＰＥＧ４－Ｋ－パルミチン酸、またはＳＬＤＱＩＮＶＴＦＬＤＬＥＹＥＭＫＫＬＥＥＡＩＫＫＬＥＥＳＹＩＤＬＫＥＬ－ＧＳＧＳＧ－ＤＰＥＧ４－Ｃ－コレステロールである。
【0021】
また、一局面では、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチド誘導体を含む組成物を提供する。
【0022】
一実施形態では、組成物は外用剤である。一実施形態では、組成物は外用塗布剤である。一実施形態では、組成物は、外用ゲル剤または外用浸潤製剤（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）である。
【0023】
一実施形態では、組成物は、コロナウイルスを阻害するための医薬品、或いはコロナウイルスによる疾患を治療および／または予防するための医薬品をさらに含む。前記の医薬品は、ファビピラビル、ネルフィナビル、アルビドール、ロピナビル、リトナビル、ダルナビル、クロロキンリン酸塩、またはレムデシビルからなる群から選択される。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【0024】
一局面では、本発明は、コロナウイルスを阻害するための医薬品、或いはコロナウイルスによる疾患を治療および／または予防するための医薬品の調製における、本発明のポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド誘導体、または組成物の使用を提供する。
【0025】
一実施形態では、コロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶおよび／またはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0026】
一実施形態では、医薬品の剤形は、錠剤、カプセル剤、滴丸剤、エアゾール剤、丸剤、粉剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、リポソーム、経皮製剤、坐剤、または凍結乾燥製剤である。
【0027】
一実施形態では、医薬品は、好ましくは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および腹腔内注射、大槽内注射または注入などを含む注射投与、直腸、膣および舌下などの腔内投与、鼻腔などの呼吸器内投与；粘膜投与、または局所投与によって投与される。
【0028】
一局面では、本発明は、本発明のポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド誘導体、或いは組成物を適用することを含む、インビトロでコロナウイルスを阻害する方法を提供する。
【0029】
一実施形態では、コロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0030】
本明細書には、コロナウイルスによる疾患は、コロナウイルス肺炎、特に新型コロナウイルス肺炎ＣＯＶＩＤ－１９であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
ヒトコロナウイルスが標的細胞に感染する過程において、そのスパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）は重要な役割を果たす。Ｓタンパク質はＳ１サブユニットとＳ２サブユニットに分けることができる。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）と受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の２つの機能ドメインを含み、両者はともにウイルスが宿主細胞の受容体と結合する役割を担っている。また、それらは、中和抗体およびワクチンの開発の標的であるいくつかのコンフォメーション中和エピトープを含む。Ｓ２サブユニットは、融合ペプチド（ＦＰ）および２つのヘプタッドリピート領域（ＨＲ）－ＨＲ１とＨＲ２の３つの機能ドメインを含む。Ｓ１のＲＢＤが受容体に結合した後、Ｓ２サブユニットはＦＰを宿主細胞膜に挿入することによってコンフォメーションを変化させ、次にＨＲ１およびＨＲ２領域は６ヘリックスバンドル（６－ＨＢ）を形成し、ウイルス膜と細胞膜との融合を引き起こし、ウイルスの遺伝物質は融合穴を介して標的細胞に入り、複製して新しいウイルス粒子を生成する。Ｓタンパク質のＳ２領域は、ドラッグデザインの重要なターゲットである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質のＨＲ２ドメインに由来するポリペプチド（ＳＣ－１）は、ウイルスのＳタンパク質のＨＲ１領域と相互作用して、異種６－ＨＢを形成することで、ＨＲ１とＨＲ２ドメインの間の相同６－ＨＢの形成を阻害することにより、ウイルスと宿主細胞の融合を阻止する。しかしながら、このポリペプチドは、活性が非常に低く（ＩＣ５０は２０μＭ）、医薬品としてさらに開発することが困難である。一方、同じメカニズムを持つポリペプチドでは、エイズウイルス（ＨＩＶ）の治療に承認されている医薬品がすでにある。例えば、米国ＦＤＡによって承認された世界初のポリペプチド系ＨＩＶ侵入阻害剤であるエンフビルタイド（Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ、Ｆｕｚｅｏｎ、Ｔ２０としても知られている）は、現在、エイズの臨床治療に使用されている。姜世勃教授（本願の発明者の一人）は、エンフビルタイドのプロトタイプポリペプチド（米国特許第５，４４４，０４４号）の発明者である。
【0033】
今まで流行している２０１９－ｎＣｏＶについては、現在、Ｓ２領域に対するポリペプチド系阻害剤を含む、このウイルスを標的とする特異的な医薬品はまだない。本発明は、このウイルスのＳ２領域におけるＨＲ１標的部位の配列の特徴および重要なアミノ酸部位が比較的保存されているという現象に基づいて、この領域を標的とする一連のポリペプチド阻害剤を初めて設計した。実験結果は、これらのポリペプチドが上記のウイルスの膜融合およびシュードウイルスの感染を効果的に阻害することができ、非常に効果的な抗２０１９－ｎＣｏＶ特異性医薬品として開発する可能性があることを示した。同時に、設計されたポリペプチドがコウモリに由来するさまざまなＳＡＲＳ様ウイルスを効果的に阻害できることも発見した。したがって、本発明は、まだ流行している２０１９－ｎＣｏＶおよび将来発生する可能性のあるＳＡＲＳ様ウイルスに対して優れた予防および治療の候補医薬品を提供することができる。
【0034】
本発明の目的は、２０１９－ｎＣｏＶおよびＳＡＲＳ様ウイルスの感染に対する阻害機能を有する一連のポリペプチド系侵入阻害剤を提供することである。前記のポリペプチド系侵入阻害剤は、２０１９－ｎＣｏＶおよびＳＡＲＳ様ウイルスのＳ２タンパク質におけるＨＲ１領域に結合し、ウイルスの６ＨＢの形成プロセスを妨害することにより、ウイルスの融合および感染のプロセスを阻害する。この一連のポリペプチドの具体的な配列を表４に示し、また、ポリペプチド配列リストにも詳細に示す。本発明の重要な革新的ポイントは、ポリペプチドが新たに発生した２０１９－ｎＣｏＶに対して阻害活性を有し、しかも一部のポリペプチドの阻害活性が予想外に高いレベルに達していることである。
【0035】
本発明の目的の１つは、コロナウイルスを阻害するポリペプチドまたはポリペプチド誘導体、或いはコロナウイルスの感染に対する阻害機能を有するポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を提供することである。これは、コロナウイルスのＳ２タンパク質におけるＨＲ１領域に結合することによって達成される。なお、コロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、ＳＡＲＳ様ウイルスＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶであってもよい。
【0036】
本明細書において、ポリペプチドは、配列番号１または２を含むポリペプチドまたはそのバリアントであってもよい。
【0037】
例えば、ポリペプチドは、配列番号１または２に示すアミノ酸配列において１個または複数個、好ましくは２個、３個、４個または５個のアミノ酸残基が置換、付加、欠失、または挿入されたアミノ酸配列を含んでもよい。
【0038】
アミノ酸の付加とは、ポリペプチドがコロナウイルスに対して阻害活性を有する限り、例えば配列番号１または２などのアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端へのアミノ酸の付加を指す。
【0039】
アミノ酸の置換とは、ポリペプチドがコロナウイルスに対して阻害活性を有する限り、例えば配列番号１または２などのアミノ酸配列におけるある位置にある特定のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置き換えられたことを指す。
【0040】
アミノ酸の挿入とは、ポリペプチドがコロナウイルスに対して阻害活性を有する限り、例えば配列番号１または２などのアミノ酸配列における適切な位置にアミノ酸残基を挿入することを指す。なお、挿入されたアミノ酸残基は、全体的または部分的に互いに隣接していてもよく、または互いに隣接していなくてもよい。
【0041】
アミノ酸の欠失とは、ポリペプチドがコロナウイルスに対して阻害活性を有する限り、例えば配列番号１または２などのアミノ酸配列から１個、２個または３個以上のアミノ酸を除去することを指す。
【0042】
本発明において、置換は、保存的アミノ酸置換であってもよい。これは、配列番号１または２のアミノ酸配列と比較して、好ましくは３個、より好ましくは２個のアミノ酸または１個のアミノ酸が、類似した性質を有するアミノ酸によって置換されてペプチドを形成することを意味する。これらの保存的変異ペプチドは、表１にしたがってアミノ酸を置換することによって生成することができる。
【0043】
本明細書において、保存的置換は、以下の３つの表のうちの１つ以上に反映されるアミノ酸カテゴリ内の置換に基づいて定義することができる：
【0044】
表１：保存的置換のアミノ酸残基のカテゴリ
【表1】
【0045】
表２：保存的アミノ酸残基置換のカテゴリの候補
【表2】
【0046】
表３：アミノ酸残基の物理的および機能的分類の候補
【表3-1】
【表3-2】
【0047】
本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅら、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）、好ましくはバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムを利用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）により２つのアミノ酸配列間の配列同一性を決定する。使用されるパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長の同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、次のように計算される。
【0048】
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントのギャップの総数）。
【0049】
また、本発明は、融合タンパク質またはコンジュゲートが本発明のポリペプチドのコロナウイルス阻害活性を有する限り、例えば配列番号１または２などの本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質またはコンジュゲートを提供する。当業者は、融合タンパク質またはコンジュゲートの調製方法を完全に理解している。例えば、本発明のポリペプチドは、リンカーを介して直接的または間接的に別の機能的部分に融合またはコンジュゲートすることができる。別の機能的部分は、コレステロール部分、パルミチン酸部分、担体タンパク質、活性タンパク質、マーカータンパク質などであってもよい。ポリペプチドは、ミリストイル化修飾、またはステアリン酸修飾、またはパルミチン酸修飾、またはコレステロール修飾、アミド化修飾、またはイソプレニル化修飾を行うことができる。
【0050】
本発明のポリペプチドは、合成により生成されたものであってもよく、または細胞によって発現されたものであってもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、化学的手段によって合成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、組換え細胞で発現される。細胞の種類は限定されなく、例えば、細胞は真核細胞または原核細胞であってもよい。真核細胞は、例えば、酵母細胞などの真菌細胞、或いは昆虫細胞またはマウス細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。原核細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞であってもよい。
【0051】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、使用される宿主細胞に応じてコドン最適化することができる。この核酸は、適切な発現ベクターにクローンした後、発現ベクターを宿主細胞に導入して発現することができる。発現ベクターのタイプは限定されておらず、当業者にはよく知られている。
【0052】
また、本発明は、ポリペプチドまたは融合タンパク質の調製方法を提供する。この方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入した後、適切な培地で培養し、次いで、上清からポリペプチドまたは融合タンパク質を収集または単離することを含み、または細胞内で発現する場合、宿主細胞を収集した後、細胞を溶解して、これらのポリペプチドまたは融合タンパク質を収集することを含む。ポリペプチドまたは融合タンパク質の場合、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、適切なシグナルペプチドに連結することができる。上記のシグナルペプチドは、収集した後に切断されてもよく、切断されなくてもよい。これらの技術は、当業者にはよく知られている。
【0053】
本発明のポリペプチドは、誘導体として調製することができる。例えば、ポリペプチドは、パルミトイル化修飾またはコレステロール修飾を行うことができる。パルミトイル化修飾またはコレステロール修飾の方法は周知のものである。一実施形態では、パルミトイル化修飾またはコレステロール修飾は、ポリペプチドがＣ末端でパルミチン酸またはコレステロールの部分に連結されるように、ポリペプチドのＣ末端で実施することができる。この連結は、直接に連結してもよく、リンカーを介して連結してもよい。
【0054】
リンカーの種類および長さは、さまざまである。例えば、リンカーは、（ＧＳＧ）ｎまたは（ＧＳＧＳＧ）ｎであってもよい。ここで、ｎは、例えは１、２、３、４、５、６などの任意の整数であってもよい。
【0055】
リンカーはＰＥＧ化されていてもよい。ＰＥＧ化修飾の方法は、当業者に知られている。本明細書において、ＰＥＧ化リンカーという用語は、１つまたは複数のＰＥＧが結合したリンカーを指す。ここで、ＰＥＧ化リンカーは、ＰＥＧ化された（ＧＳＧ）ｎまたは（ＧＳＧＳＧ）ｎであってもよい。ｎは、例えば１、２、３、４、５、６などの任意の整数であってもよい。
【0056】
本明細書において、「ＤＰＥＧ」とは、離散型ポリエチレングリコール（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）を指す。ＤＰＥＧ４は、繰返しエチレングリコール残基の数が４であることを示す。
【0057】
本明細書において、コロナウイルスは、任意のコロナウイルスであってもよい。好ましくは、コロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0058】
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は、単独でまたは組み合わせて使用してもよく、或いは抗コロナウイルス活性またはコロナウイルス阻害活性を有する他の医薬品と併用してもよい。例えば、これらの医薬品は、例えば、ファビピラビル、ネルフィナビル、アルビドール、ロピナビル、リトナビル、クロロキンリン酸塩、ダルナビル、またはレムデシビルなどの、コロナウイルスに対する阻害活性を有するか、またはコロナウイルス肺炎などのコロナウイルスによる疾患に対する治療効果を有することが報告されている医薬品であってもよい。
【0059】
本明細書において、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は、２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１、ＥＫ１－ｐｌａｍ、およびＥＫ１－ｃｈｏｌを含んでもよい。それらは、組成物として適用することができる。組成物は、薬学的に許容される担体などの適切な担体を含んでもよい。このような組成物は、例えば、外用剤、外用ゲル剤または外用浸潤製剤などの外用塗布剤として、外部使用のために使用することができる。このような組成物は、例えば、マスク、ティッシュ、手袋、防護服などの衣類などのウイルスを阻害する必要がある物品にコーティングすることができる。或いは、それらは、有効成分として手指消毒剤、シャワージェルなどの手洗い用品に添加することができる。このようなポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を使用して、インビトロでコロナウイルスを阻害し、ウイルス感染を予防および／または低減することができる。このようなポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は、被験者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患を予防または治療するために使用することができる。
【0060】
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は、医薬品または医薬組成物に調製することができる。このような医薬品は、錠剤、カプセル剤、滴丸剤、エアゾール剤、丸剤、粉剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、リポソーム、経皮製剤、坐剤、または凍結乾燥製剤であってもよい。これらの医薬品または医薬組成物は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射および腹腔内注射、大槽内注射または注入などを含む注射投与、直腸、膣および舌下などの腔内投与、鼻腔などの呼吸器内投与；粘膜投与、または局所投与などの様々な投与経路によって適用される。
【0061】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を投与することを含む、被験者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患を予防または治療する方法を提供する。また、本発明は、被験者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患を予防または治療することに使用されるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を提供する。
【0062】
また、本発明は、被験者／患者に、本発明のポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体或いは組成物を投与することを含む、被験者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患を予防または治療する方法に関する。
【0063】
好ましくは、前記のコロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0064】
また、本発明は、被験者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患の予防または治療に使用するための、ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体或いは組成物に関する。好ましくは、前記のコロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0065】
さらに、本発明は、被験者／患者におけるコロナウイルス感染またはコロナウイルスによる疾患の予防または治療に使用するための、ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート、核酸、ベクター、宿主細胞、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体或いは組成物、医薬組成物、およびキットに関する。好ましくは、前記のコロナウイルスは、２０１９－ｎＣｏＶ、Ｒｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶである。
【0066】
実施例
【0067】
以下、実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの実施例または組み合わせは、本発明の範囲または実施形態を限定するものとして理解されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定される。また、本明細書および当分野の常識と組み合わせることにより、当業者は、特許請求の範囲によって限定される範囲を明確に理解することができる。さらに、当業者は、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明の技術構成に任意の修正または変更を加えることができ、このような修正および変更も本発明の範囲に含まれる。
【0068】
実験材料：
ポリペプチド：
本発明者らは、ヒト感染性コロナウイルスのスパイクタンパク質におけるＨＲ１およびＨＲ２の配列の相同性を比較することにより、ＨＲ２領域に由来する３つの人工ポリペプチドを設計した。これらのポリペプチドは、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）と略称する。これらのポリペプチドの具体的な配列と構造を表１に示す。これらは、ＳｈａｎｇｈａｉＳｙｎＰｅｐｔｉｄｅ社によって合成され、純度が９５％を超える。
ポリペプチド：
本発明者らは、ヒト感染性コロナウイルスのスパイクタンパク質におけるＨＲ１およびＨＲ２の配列の相同性を比較することにより、ＨＲ２領域に由来する３つの人工ポリペプチドを設計した。これらのポリペプチドは、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）と略称する。これらのポリペプチドの具体的な配列と構造を表１に示す。これらは、ＳｈａｎｇｈａｉＳｙｎＰｅｐｔｉｄｅ社によって合成され、純度が９５％を超える。
【0069】
表４．実施例で使用されたポリペプチドの具体的な配列：
【表4】
【0070】
ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ－２０１９－ｎＣｏＶ－Ｓにおける２０１９－ｎＣｏＶ－Ｓのアミノ酸配列（挿入の制限部位はＢａｍＨＩとＸｈｏＩ）は次のとおりである。
【0071】
【表5】
【0072】
ヌクレオチド配列は次のとおりである。
【0073】
【表6-1】
【表6-2】
【0074】
ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰプラスミドマップを図８に示す。ｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰは、米国のａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入された。
【0075】
ｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｓプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｒｓ３３６７－ＣｏＶ－Ｓプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１－ＷＩＶ１－ＣｏＶ－ＳプラスミドおよびｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥプラスミドは、米国のニューヨーク血液センターのＤｕ Ｌａｎｙｉｎｇ博士から寄贈された。２０１９－ｎＣｏＶ－ＳをｐｃＤＮＡ３．１に挿入する制限部位は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩである。
【0076】
ヒト感染性コロナウイルスの受容体を発現する標的細胞であるＨｕＨ７細胞は、中国科学院の細胞バンクから購入された。
【0077】
実施例１：２０１９－ｎＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶシュードウイルスの調製。
実験方法：
１．トランスフェクションの２４ｈ前に、２９３Ｔ細胞を消化し、１０ｃｍの組織培養皿（２×１０６／ｄｉｓｈ）にプレーティングした。
２．トランスフェクションの２ｈ前に、培地を新しい予熱したＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳを含む）と交換した。
３．トランスフェクションにおいて、２本の１．５ｍＬのＥＰチューブを使用した。ＥＰチューブ１に、ｐｃＤＮＡ３．１－プラスミド（またはｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ＳプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３．１－Ｒｓ３３６７－ＣｏＶ－ＳプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３．１－ＷＩＶ１－ＣｏＶ－Ｓプラスミド）とｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥプラスミド（これらのプラスミドはニューヨーク血液センターのＤｕ Ｌａｎｙｉｎｇ博士から寄贈された。関連情報は、Ｘｉａ，Ｓ．＃，Ｙａｎ，Ｌ．＃，Ｘｕ，Ｗ．＃，Ａｇｒａｗａｌ，Ａ．Ｓ．，Ａｌｓａｉｓｓｉ，Ａ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｄｕ，Ｌ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．＊，Ｊｉａｎｇ，Ｓ．＊，Ｙａｎｇ，Ｂ．＊，Ｌｕ，Ｌ．＊（２０１９）．Ａ ｐａｎ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＲ１ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１９ Ａｐｒ １０；５（４）：ｅａａｖ４５８０を参照）とをそれぞれ２０μｇ含む、５００μＬの０．９％ＮａＣｌ溶液を添加した。ＥＰチューブ２に、５００μＬの０．９％ＮａＣｌを添加した後、さらにトランスフェクション試薬ｖｉｇｏｆｅｃｔを１０μＬ加えた。両方のチューブを５分間放置した。
４．ＥＰチューブ２中の５００μＬ溶液を、ＥＰチューブ１に滴下しながら、ピペットチップで十分に混合し、室温で１５ｍｉｎ放置した。
５．上記の混合液１ｍＬを、あらかじめ２９３Ｔ細胞をプレーティングした培養皿に滴下して均一にした。
６．トランスフェクトした８～１０ｈ後に、培地を、１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの新しいＤＭＥＭ培地と交換した。
７． ４８ｈ後に、シュードウイルスを含む上清を収集した。
８． ４０００ｒｐｍで４ｍｉｎ遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過し、－８０℃で分注して保管した。
実験方法：
１．トランスフェクションの２４ｈ前に、２９３Ｔ細胞を消化し、１０ｃｍの組織培養皿（２×１０６／ｄｉｓｈ）にプレーティングした。
２．トランスフェクションの２ｈ前に、培地を新しい予熱したＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳを含む）と交換した。
３．トランスフェクションにおいて、２本の１．５ｍＬのＥＰチューブを使用した。ＥＰチューブ１に、ｐｃＤＮＡ３．１－プラスミド（またはｐｃＤＮＡ３．１－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ＳプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３．１－Ｒｓ３３６７－ＣｏＶ－ＳプラスミドまたはｐｃＤＮＡ３．１－ＷＩＶ１－ＣｏＶ－Ｓプラスミド）とｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．ＲＥプラスミド（これらのプラスミドはニューヨーク血液センターのＤｕ Ｌａｎｙｉｎｇ博士から寄贈された。関連情報は、Ｘｉａ，Ｓ．＃，Ｙａｎ，Ｌ．＃，Ｘｕ，Ｗ．＃，Ａｇｒａｗａｌ，Ａ．Ｓ．，Ａｌｓａｉｓｓｉ，Ａ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｄｕ，Ｌ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．＊，Ｊｉａｎｇ，Ｓ．＊，Ｙａｎｇ，Ｂ．＊，Ｌｕ，Ｌ．＊（２０１９）．Ａ ｐａｎ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＲ１ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１９ Ａｐｒ １０；５（４）：ｅａａｖ４５８０を参照）とをそれぞれ２０μｇ含む、５００μＬの０．９％ＮａＣｌ溶液を添加した。ＥＰチューブ２に、５００μＬの０．９％ＮａＣｌを添加した後、さらにトランスフェクション試薬ｖｉｇｏｆｅｃｔを１０μＬ加えた。両方のチューブを５分間放置した。
４．ＥＰチューブ２中の５００μＬ溶液を、ＥＰチューブ１に滴下しながら、ピペットチップで十分に混合し、室温で１５ｍｉｎ放置した。
５．上記の混合液１ｍＬを、あらかじめ２９３Ｔ細胞をプレーティングした培養皿に滴下して均一にした。
６．トランスフェクトした８～１０ｈ後に、培地を、１０％ＦＢＳを含む１０ｍＬの新しいＤＭＥＭ培地と交換した。
７． ４８ｈ後に、シュードウイルスを含む上清を収集した。
８． ４０００ｒｐｍで４ｍｉｎ遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過し、－８０℃で分注して保管した。
【0078】
実施例２：ヒトコロナウイルスのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ）の阻害実験
【0079】
実験方法：
１．ヒトコロナウイルスのＳタンパク質をコードするプラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、３６－４８ｈ培養し、エフェクター細胞とした。具体的に、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質をコードするプラスミドｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－２０１９－ｎＣｏＶ－Ｓを使用して、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２９３Ｔ／２０１９／ＥＧＦＰ細胞と呼ばれるトランスフェクトされた細胞を得た。空ベクタープラスミドｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２９３Ｔ／ＥＧＦＰ細胞を取得し、陰性対照細胞とした。
２．０．０２％のＥＤＴＡで２９３Ｔ／２０１９／ＥＧＦＰ細胞および２９３Ｔ／ＥＧＦＰ細胞を消化し、遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度を２×１０５個／ｍＬに調整した。５０μＬを取り出して、段階希釈した各試験ポリペプチド医薬品（５０μＬ）に添加し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。医薬品を添加しなかったものを陽性対照細胞とした。
３．細胞／医薬品混合液１００μＬを、９６ウェルプレートにプレーティングされた標的細胞Ｈｕｈ－７に添加した。５％ＣＯ２、３７℃で２－４時間培養し、蛍光顕微鏡の緑色蛍光チャネルにより、細胞の融合状態を観察し、記録した。
阻害活性の計算式：阻害率＝（陽性孔ウェルの融合細胞数－医薬孔ウェルの融合数）／（陽性孔ウェルの融合細胞数－陰性ウェルの融合数）＊１００
１．ヒトコロナウイルスのＳタンパク質をコードするプラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、３６－４８ｈ培養し、エフェクター細胞とした。具体的に、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質をコードするプラスミドｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ－２０１９－ｎＣｏＶ－Ｓを使用して、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２９３Ｔ／２０１９／ＥＧＦＰ細胞と呼ばれるトランスフェクトされた細胞を得た。空ベクタープラスミドｐＡＡＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２９３Ｔ／ＥＧＦＰ細胞を取得し、陰性対照細胞とした。
２．０．０２％のＥＤＴＡで２９３Ｔ／２０１９／ＥＧＦＰ細胞および２９３Ｔ／ＥＧＦＰ細胞を消化し、遠心分離し、１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度を２×１０５個／ｍＬに調整した。５０μＬを取り出して、段階希釈した各試験ポリペプチド医薬品（５０μＬ）に添加し、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。医薬品を添加しなかったものを陽性対照細胞とした。
３．細胞／医薬品混合液１００μＬを、９６ウェルプレートにプレーティングされた標的細胞Ｈｕｈ－７に添加した。５％ＣＯ２、３７℃で２－４時間培養し、蛍光顕微鏡の緑色蛍光チャネルにより、細胞の融合状態を観察し、記録した。
阻害活性の計算式：阻害率＝（陽性孔ウェルの融合細胞数－医薬孔ウェルの融合数）／（陽性孔ウェルの融合細胞数－陰性ウェルの融合数）＊１００
【0080】
結果と考察：
図２に示すように、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１は、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合に対して非常に優れた阻害効果を示す。その結果、これらの２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドは２０１９－ｎＣｏＶを阻害できることがわかった。２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合では、ＥＫ１と比較して、その誘導体ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌの阻害活性が大幅に増強され、ポリペプチド２０１９－ＨＲ２Ｐは、かなりの阻害活性を持つ。
図２に示すように、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１は、２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合に対して非常に優れた阻害効果を示す。その結果、これらの２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドは２０１９－ｎＣｏＶを阻害できることがわかった。２０１９－ｎＣｏＶのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合では、ＥＫ１と比較して、その誘導体ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌの阻害活性が大幅に増強され、ポリペプチド２０１９－ＨＲ２Ｐは、かなりの阻害活性を持つ。
【0081】
実施例３：２０１９－ｎＣｏＶなどのコロナウイルスのシュードウイルスに対するポリペプチドの阻害活性の測定
【0082】
実験方法：
１．ＤＭＳＯで試験ポリペプチド医薬品を溶解し、ポリペプチド濃度を測定した。
２．ヒト感染性コロナウイルス受容体を発現する標的細胞であるＨｕＨ７細胞の懸濁液を調製し、細胞濃度を調整した後、ウェルあたり１０４個の細胞を添加した。
３．９６ウェルプレートに、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２倍の勾配で希釈されたポリペプチド医薬品をウェルあたり５０μＬで使用した。
４．一定の力価の２０１９－ｎＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶシュードウイルスを、医薬品希釈プレートに５０μＬ／ウェルで添加した。室温で３０ｍｉｎインキュベートして、医薬品をウイルスと十分に作用させた。上清を除去した各ウェルの標的細胞に、医薬品とウイルスとの混合液１００μＬを添加し、３７℃で１２ｈ培養した後、１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地に交換した。
５．７２ｈ後に、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを測定し、阻害率曲線を作成し、医薬品の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。
阻害活性の計算式：阻害率＝（ウイルス対照ウェルの値－医薬品ウェルの値）／（ウイルス対照ウェルの値－細胞ウェルの値）＊１００％；ここで、ウイルス対照ウェルは、医薬品を添加しなかったウェルであり、細胞ウェルは、ウイルスを添加しなかったウェルである。
１．ＤＭＳＯで試験ポリペプチド医薬品を溶解し、ポリペプチド濃度を測定した。
２．ヒト感染性コロナウイルス受容体を発現する標的細胞であるＨｕＨ７細胞の懸濁液を調製し、細胞濃度を調整した後、ウェルあたり１０４個の細胞を添加した。
３．９６ウェルプレートに、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で２倍の勾配で希釈されたポリペプチド医薬品をウェルあたり５０μＬで使用した。
４．一定の力価の２０１９－ｎＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶシュードウイルスを、医薬品希釈プレートに５０μＬ／ウェルで添加した。室温で３０ｍｉｎインキュベートして、医薬品をウイルスと十分に作用させた。上清を除去した各ウェルの標的細胞に、医薬品とウイルスとの混合液１００μＬを添加し、３７℃で１２ｈ培養した後、１０％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地に交換した。
５．７２ｈ後に、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを測定し、阻害率曲線を作成し、医薬品の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。
阻害活性の計算式：阻害率＝（ウイルス対照ウェルの値－医薬品ウェルの値）／（ウイルス対照ウェルの値－細胞ウェルの値）＊１００％；ここで、ウイルス対照ウェルは、医薬品を添加しなかったウェルであり、細胞ウェルは、ウイルスを添加しなかったウェルである。
【0083】
結果と考察：
２０１９－ｎＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶシュードウイルスシステムにおいて、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドの抗ウイルス活性を再度に検出した。結果を図３～６および表５に示す。２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１ポリペプチドは、いずれも良好な抗ウイルス活性を示し、上記の細胞－細胞融合実験の結果と一致した。さらに、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性は、ＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、約数十倍まで高くなった。
２０１９－ｎＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＲｓ３３６７－ＣｏＶまたはＷＩＶ１－ＣｏＶシュードウイルスシステムにおいて、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドの抗ウイルス活性を再度に検出した。結果を図３～６および表５に示す。２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１ポリペプチドは、いずれも良好な抗ウイルス活性を示し、上記の細胞－細胞融合実験の結果と一致した。さらに、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性は、ＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、約数十倍まで高くなった。
【0084】
表５．複数種類のヒトコロナウイルスシュードウイルスに対する２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドの阻害活性：
【表7】
【0085】
実施例４：生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスの感染に対するポリペプチドの阻害活性の測定
実験方法：
この研究は、中国科学院武漢ウイルス研究所の研究室（バイオセーフティーレベル３）に委託した。具体的に、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスによるプラーク法により、２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１の阻害活性を検出した。異なる濃度の上記の各ポリペプチドを、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルス（ウイルス力価は１００ＰＦＵ）と３０分間インキュベートした後、それらを単層のＶＥＲＯ－Ｅ６細胞に添加した。３７℃で１時間培養した後、培養上清を除去した。次に、０．９％のメチルセルロースを添加して細胞を覆った。７２時間後、細胞を染色してプラークの数を観察し、カウントした。阻害活性の計算式：阻害率＝（ウイルス対照ウェルのプラーク数－医薬品ウェルのプラーク数）／ウイルス対照ウェルのプラーク数＊１００％。
実験方法：
この研究は、中国科学院武漢ウイルス研究所の研究室（バイオセーフティーレベル３）に委託した。具体的に、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスによるプラーク法により、２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１の阻害活性を検出した。異なる濃度の上記の各ポリペプチドを、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルス（ウイルス力価は１００ＰＦＵ）と３０分間インキュベートした後、それらを単層のＶＥＲＯ－Ｅ６細胞に添加した。３７℃で１時間培養した後、培養上清を除去した。次に、０．９％のメチルセルロースを添加して細胞を覆った。７２時間後、細胞を染色してプラークの数を観察し、カウントした。阻害活性の計算式：阻害率＝（ウイルス対照ウェルのプラーク数－医薬品ウェルのプラーク数）／ウイルス対照ウェルのプラーク数＊１００％。
【0086】
結果と考察：
生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスにおいて、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドの抗ウイルス活性を検出した。結果を図７に示す。２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１ポリペプチドは、いずれも生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスに対する阻害活性を示したが、対照ポリペプチド（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、阻害活性を示さなかった。さらに、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性は、ＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、それぞれ５倍および６７倍まで高くなった。具体的に、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスシステムにおいて、ＥＫ１のＩＣ５０は２４６８ｎＭであり、ＥＫ１－ＰｌａｍのＩＣ５０は４３５．８ｎＭであり、ＥＫ１－ｃｈｏｌのＩＣ５０は３６．５ｎＭである。
生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスにおいて、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドの抗ウイルス活性を検出した。結果を図７に示す。２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１－Ｐｌａｍ、ＥＫ１－ｃｈｏｌおよびＥＫ１ポリペプチドは、いずれも生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスに対する阻害活性を示したが、対照ポリペプチド（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、阻害活性を示さなかった。さらに、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性は、ＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、それぞれ５倍および６７倍まで高くなった。具体的に、生きている２０１９－ｎＣｏＶウイルスシステムにおいて、ＥＫ１のＩＣ５０は２４６８ｎＭであり、ＥＫ１－ＰｌａｍのＩＣ５０は４３５．８ｎＭであり、ＥＫ１－ｃｈｏｌのＩＣ５０は３６．５ｎＭである。
【0087】
実施例５：ＨＲ２ポリペプチドの抗ウイルスメカニズムに関する研究
２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドを代表とし、ＥＫ１ポリペプチドを対照とし、ポリペプチドと、２０１９－ｎＣｏＶ ＨＲ１領域に由来するポリペプチド２０１９－ＨＲ１Ｐとの間の相互作用を検出し、２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドの抗ウイルスメカニズムをさらに調査した。
２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドを代表とし、ＥＫ１ポリペプチドを対照とし、ポリペプチドと、２０１９－ｎＣｏＶ ＨＲ１領域に由来するポリペプチド２０１９－ＨＲ１Ｐとの間の相互作用を検出し、２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドの抗ウイルスメカニズムをさらに調査した。
【0088】
実験方法：
１．非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎ－ＰＡＧＥ）。ＨＲ１シリーズのポリペプチド２０１９－ＨＲ１Ｐを、ＨＲ２シリーズのポリペプチド２０１９－ＨＲ２ＰまたはＥＫ１とそれぞれ混合（それぞれ最終濃度は３０μＭ）し、３７℃で３０分間インキュベートした。高ｐＨの５ｘローディングバッファーを４倍量のペプチド混合物と混合し、１８％非変性ゲル（Ｔｉａｎｄｚ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）にロード（ウェルあたり２５μｌ）し、室温、１２５Ｖ定電圧で２時間電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。
２．円二色性分光法によるポリペプチドの二次構造の決定。５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液を利用して、遊離したポリペプチドまたはポリペプチド混合物を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌに希釈した。分光偏光計（Ｊ－８１５型、Ｊａｓｃｏ Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）により円二色性スペクトルを測定した。検出温度は４℃、帯域幅は５．０ｎｍ、分解能は０．１ｎｍ、光路は０．１ｃｍ、反応時間は４．０ｓ、スキャン速度は５０ｎｍ／ｍｉｎであった。２２２ｎｍにおいて、５℃／分の温度勾配でポリペプチドの熱変性をモニターした。緩衝液のブランク対照を引いて、スペクトル値を補正した。融解曲線を平滑化し、Ｊａｓｃｏで熱解離転移の中点温度、すなわちＴｍ値を算出した。
１．非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎ－ＰＡＧＥ）。ＨＲ１シリーズのポリペプチド２０１９－ＨＲ１Ｐを、ＨＲ２シリーズのポリペプチド２０１９－ＨＲ２ＰまたはＥＫ１とそれぞれ混合（それぞれ最終濃度は３０μＭ）し、３７℃で３０分間インキュベートした。高ｐＨの５ｘローディングバッファーを４倍量のペプチド混合物と混合し、１８％非変性ゲル（Ｔｉａｎｄｚ、Ｂｅｉｊｉｎｇ）にロード（ウェルあたり２５μｌ）し、室温、１２５Ｖ定電圧で２時間電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。
２．円二色性分光法によるポリペプチドの二次構造の決定。５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液を利用して、遊離したポリペプチドまたはポリペプチド混合物を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌに希釈した。分光偏光計（Ｊ－８１５型、Ｊａｓｃｏ Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）により円二色性スペクトルを測定した。検出温度は４℃、帯域幅は５．０ｎｍ、分解能は０．１ｎｍ、光路は０．１ｃｍ、反応時間は４．０ｓ、スキャン速度は５０ｎｍ／ｍｉｎであった。２２２ｎｍにおいて、５℃／分の温度勾配でポリペプチドの熱変性をモニターした。緩衝液のブランク対照を引いて、スペクトル値を補正した。融解曲線を平滑化し、Ｊａｓｃｏで熱解離転移の中点温度、すなわちＴｍ値を算出した。
【0089】
結果と解析：
１．２０１９－ＨＲ２Ｐを２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドと混合した後、６ヘリックスバンドル複合体である可能性のある新しいバンド（図８ａ、凡例：１、２、３レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ＋２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ２Ｐ；４レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ２Ｐ；５レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ）は生成した。ＥＫ１もｐ同様の効果を示し、システムの安定性およびＥＫ１による６ヘリックスバンドル複合体（図８ａ、凡例：６レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ；７レーンはＥＫ１；８、９、１０レーンはＥＫ１＋２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ）の形成を証明した。
２．単独のポリペプチドは低らせん構造を持つ。２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドを２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドと混合した後、高らせん構造が現れた。この結果は、６ヘリックスバンドル（６－ＨＢ）構造のＣＤスペクトルと一致した。また、そのＴｍ値は、その熱安定性を示す。ＥＫ１も同様の効果を示し、システムの安定性およびＥＫ１による６ヘリックスバンドル複合体の形成を証明した。
１．２０１９－ＨＲ２Ｐを２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドと混合した後、６ヘリックスバンドル複合体である可能性のある新しいバンド（図８ａ、凡例：１、２、３レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ＋２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ２Ｐ；４レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ２Ｐ；５レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ）は生成した。ＥＫ１もｐ同様の効果を示し、システムの安定性およびＥＫ１による６ヘリックスバンドル複合体（図８ａ、凡例：６レーンは２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ；７レーンはＥＫ１；８、９、１０レーンはＥＫ１＋２０１９－ｎＣｏＶ－ＨＲ１Ｐ）の形成を証明した。
２．単独のポリペプチドは低らせん構造を持つ。２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドを２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドと混合した後、高らせん構造が現れた。この結果は、６ヘリックスバンドル（６－ＨＢ）構造のＣＤスペクトルと一致した。また、そのＴｍ値は、その熱安定性を示す。ＥＫ１も同様の効果を示し、システムの安定性およびＥＫ１による６ヘリックスバンドル複合体の形成を証明した。
【0090】
考察
以上のことにより、本発明は、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）が２０１９－ｎＣｏＶに対して良好な阻害活性を有することを初めて発見した。そのメカニズムは、ウイルスのＨＲ１領域に結合することにより、安定した異種６ＨＢを形成し、ウイルス自体のＨＲ２とＨＲ１トリマーとの結合を阻止し、相同６ＨＢの形成を防ぎ、それによってウイルスと細胞膜の融合を妨害し、ウイルス感染を遮断する。さらに、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）は、いずれもＳＡＲＳウイルスおよびＳＡＲＳ様ウイルス（Ｒｓ３３６７－ＣｏＶおよびＷＩＶ１－ＣｏＶ）に対して優れた阻害活性を有することも判明した。なお、ＥＫ１－ＰｌａｍとＥＫ１－ｃｈｏｌの活性がＥＫ１の活性よりも大幅に高く、数十倍まで高くなることは初めて発見された。
以上のことにより、本発明は、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ１、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）が２０１９－ｎＣｏＶに対して良好な阻害活性を有することを初めて発見した。そのメカニズムは、ウイルスのＨＲ１領域に結合することにより、安定した異種６ＨＢを形成し、ウイルス自体のＨＲ２とＨＲ１トリマーとの結合を阻止し、相同６ＨＢの形成を防ぎ、それによってウイルスと細胞膜の融合を妨害し、ウイルス感染を遮断する。さらに、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチド（２０１９－ＨＲ２Ｐ、ＥＫ、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌ）は、いずれもＳＡＲＳウイルスおよびＳＡＲＳ様ウイルス（Ｒｓ３３６７－ＣｏＶおよびＷＩＶ１－ＣｏＶ）に対して優れた阻害活性を有することも判明した。なお、ＥＫ１－ＰｌａｍとＥＫ１－ｃｈｏｌの活性がＥＫ１の活性よりも大幅に高く、数十倍まで高くなることは初めて発見された。
【0091】
本発明において、本発明者らは、図２に示すように、２０１９－ｎＣｏＶおよびＳＡＲＳ様ウイルスのＳタンパク質によって媒介される細胞－細胞融合システムを確立することにより、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドが、対応するウイルス融合プロセスに対する阻害活性を検出した。２０１４年、Lｕ ｌ．（陸路、本願の発明者の一人である）らは、ウイルスのＳタンパク質とＧＦＰを共発現させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶなどの細胞－細胞融合システムを構築した。また、この知られているウイルス感染をシミュレートするシステムに基づいて、より優れた活性を持つ一連のポリペプチド侵入阻害剤の設計と評価に成功した。これらの結果は、Ｎａｔｕｒｅ ＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓおよびＳｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓに掲載された。本発明では、同様の方法を使用して、本発明者らは、２０１９－ｎＣｏＶ Ｓタンパク質によって媒介される膜融合システムを世界で初めて確立し、現在最高の活性を有するポリペプチド侵入阻害剤ＥＫ１を対照として、２０１９－ｎＣｏＶおよびＳＡＲＳ様ウイルスに対する、発明された一連のポリペプチドの膜融合阻害効果をそれぞれ検出した（参考文献：Ｌｕ，Ｌ．，Ｑ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚｈｕ，Ｋ．Ｈ．Ｃｈａｎ，Ｌ．Ｑｉｎ，Ｙ．Ｌｉ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｎ，Ｌ．Ｄｕ，Ｆ．Ｙｕ，Ｃ．Ｍａ，Ｓ．Ｙｅ，Ｋ．Ｙ．Ｙｕｅｎ，Ｒ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ Ｓ．Ｊｉａｎｇ．２０１４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３０６７．およびＸｉａ，Ｓ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｗ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ａ．Ｓ．，Ａｌｓａｉｓｓｉ，Ａ．，Ｔｓｅｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｄｕ，Ｌ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．，Ｊｉａｎｇ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｌｕ，Ｌ．Ａ ｐａｎ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＲ１ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１９ Ａｐｒ １０；５（４）：ｅａａｖ４５８０）。２０１９－ｎＣｏＶの細胞－細胞融合実験において、２０１９－ＨＲ２ＰシリーズポリペプチドおよびＥＫ１ポリペプチドは、いずれも良好な阻害効果を示し、また、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性はＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、約１０～１００倍まで高くなった（図２）。陰性対照である２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドは活性を示さなかった。
【0092】
同時に、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の阻害活性をさらに確認するために、本発明者らはまた、別のよく知られている抗ウイルス医薬品の活性を評価するモデルであるシュードウイルス感染モデルを使用した。本発明者らは、２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルス感染システムを世界で初めて確立した後、シュードウイルスに対する２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドおよび対照ＥＫ１ポリペプチドの阻害効果を検出した。図３に示すように、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドは、２０１９－ｎＣｏＶシュードウイルスと生きているウイルスの両方に対して良好な阻害効果を示し、また、ＥＫ１－ＰｌａｍおよびＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの阻害活性は、ＥＫ１ポリペプチドよりも明らかに優れ、約６～１２０倍まで高くなった（図３および表２）。この結果は、上記のＭＥＲＳ－ＣｏＶ細胞－細胞融合実験の結果と一致した。同様の結果は、ＳＡＲＳウイルスおよびＳＡＲＳ様ウイルスのシュードウイルス阻害実験でも得られた（図４、５、６および７）。一方、陰性対照である２０１９－ＨＲ１Ｐポリペプチドは活性を示さなかった。
【0093】
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体は、非常に効果的な抗２０１９－ｎＣｏＶ活性を示すだけでなく、２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドを代表としてそれらの具体的な抗ウイルスメカニズムも明確に示す。図８ａに示すＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ実験において、２０１９－ＨＲ２ＰポリペプチドおよびＥＫ１ポリペプチドを、２０１９－ｎＣｏＶ ＨＲ１領域に由来する２０１９－ＨＲ１Ｐと混合した後、いずれも６ヘリックスバンドである新しいバンドが現れた。さらに、ポリペプチドの二次構造の検出は、２０１９－ＨＲ２ＰポリペプチドおよびＥＫ１ポリペプチドを、２０１９－ＨＲ１Ｐと混合した後、高度のらせん構造が現れたことを示した。この結果は、６ヘリックスコア構造のＣＤスペクトルと一致し、また、そのＴｍ値はその熱安定性を示した（図８ｂ）。このことから、２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドの抗ウイルスメカニズムは、主に２０１９－ｎＣｏＶウイルスのＨＲ１領域に結合して、ウイルス自体の６ＨＢの形成を妨害することにより、ウイルスの融合および侵入のプロセスを阻害することが分かった。
【0094】
以上のことにより、２０１９－ＨＲ２Ｐシリーズポリペプチドは、２０１９－ｎＣｏＶ、ＳＡＲＳウイルス、ＳＡＲＳ様ウイルスに対して優れた阻害活性を示し、今でも流行している２０１９－ｎＣｏＶおよび将来発生する可能性のあるＳＡＲＳ様ウイルスに対して優れた予防および治療の候補医薬品を提供する。さらに、２０１９－ＨＲ２Ｐポリペプチドの明確な抗ウイルスメカニズムは、その適用の安全性と最適化アプローチの明確さを保証することができ、将来のさらなる開発に有利である。
【0095】
実施例６：ヒト腸由来細胞株ＣａＣＯ２における生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対するＥＫ１およびＥＫ１－ｃｈｏｌの阻害
【0096】
（一）実験方法：
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。
２．感染の１２時間前に、ＣａＣＯ２細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００００細胞）にプレーティングした。
３．無血清ＤＭＥＭを使用し、系が５０μＬの容量になるように、ポリペプチド阻害剤を段階希釈した後、５０μＬのウイルス希釈液（７５０ｐｆｕ／ｍｌ）を加えて混合した後、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
４．ウイルス／医薬品混合物１００μＬを、９６ウェルプレートにプレーティングされた標的細胞に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートした。
５．各ウェルの上清を収集し、上清中のウイルスＲＮＡの含有量を定量的に検出して、阻害率を測定した。
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。
２．感染の１２時間前に、ＣａＣＯ２細胞を９６ウェルプレート（ウェルあたり１００００細胞）にプレーティングした。
３．無血清ＤＭＥＭを使用し、系が５０μＬの容量になるように、ポリペプチド阻害剤を段階希釈した後、５０μＬのウイルス希釈液（７５０ｐｆｕ／ｍｌ）を加えて混合した後、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
４．ウイルス／医薬品混合物１００μＬを、９６ウェルプレートにプレーティングされた標的細胞に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートした。
５．各ウェルの上清を収集し、上清中のウイルスＲＮＡの含有量を定量的に検出して、阻害率を測定した。
【0097】
結果：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトの腸組織に効果的に感染することができるため、ヒト腸由来細胞株を使用してポリペプチドＥＫ１、ＥＫ１－ｃｈｏｌを評価することは非常に重要である。結果は、図１０に示すように、ＥＫ１、ＥＫ１－ｃｈｏｌのポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して非常に効果的な阻害効果を示し、それらの半数阻害濃度がそれぞれ５７３．２ｎＭおよび５．５ｎＭであった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトの腸組織に効果的に感染することができるため、ヒト腸由来細胞株を使用してポリペプチドＥＫ１、ＥＫ１－ｃｈｏｌを評価することは非常に重要である。結果は、図１０に示すように、ＥＫ１、ＥＫ１－ｃｈｏｌのポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して非常に効果的な阻害効果を示し、それらの半数阻害濃度がそれぞれ５７３．２ｎＭおよび５．５ｎＭであった。
【0098】
実施例７：生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染されたトランスジェニックマウスに対するポリペプチドＥＫ１のインビボ保護効果。
（一）実験方法：
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。ｈ－ＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ社から購入した。マウス系統：Ｔｇｔｎ（ＣＡＧ－ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）。
２．各マウスを３００００ｐｆｕ（３０μＬ）のウイルスでチャレンジした。
３．チャレンジした３０分間前、またはチャレンジした３０分間後に、鼻腔内投与経路により２００μｇのＥＫ１／マウスの用量で投与した。
４．感染させた４日目にマウスを安楽死させ、各群のマウスの肺および腸組織のウイルス量を検出した。
（一）実験方法：
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。ｈ－ＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ社から購入した。マウス系統：Ｔｇｔｎ（ＣＡＧ－ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）。
２．各マウスを３００００ｐｆｕ（３０μＬ）のウイルスでチャレンジした。
３．チャレンジした３０分間前、またはチャレンジした３０分間後に、鼻腔内投与経路により２００μｇのＥＫ１／マウスの用量で投与した。
４．感染させた４日目にマウスを安楽死させ、各群のマウスの肺および腸組織のウイルス量を検出した。
【0099】
（二）結果：
ＥＫ１ポリペプチドの治療的経鼻投与は、マウスの肺（Ａ）および腸（Ｂ）におけるウイルス量（図１１）を大幅に減少させることができ、ＥＫ１がインビボでより良好な保護効果を有することを示した。
ＥＫ１ポリペプチドの治療的経鼻投与は、マウスの肺（Ａ）および腸（Ｂ）におけるウイルス量（図１１）を大幅に減少させることができ、ＥＫ１がインビボでより良好な保護効果を有することを示した。
【0100】
実施例８：生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染されたトランスジェニックマウスに対するポリペプチドＥＫ１－ｃｈｏｌのインビボ保護効果
（一）実験方法：
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。ｈ－ＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ社から購入した。マウス系統：Ｔｇｔｎ（ＣＡＧ－ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）。
２．各マウスを３００００ｐｆｕ（３０μＬ）のウイルスでチャレンジした。
３．チャレンジした３０分間前、またはチャレンジした３０分間後に、鼻腔内投与経路により１０μｇのＥＫ１Ｃ４／マウスの用量で投与した。
４．感染させた４日目にマウスを安楽死させ、各群のマウスの肺および腸組織のウイルス量を検出した。
（一）実験方法：
１．本実験は、復旦大学の研究室（バイオセーフティーレベル３）で実施され、使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、この研究室で分離されたｎＣｏＶ－ＳＨ０１株であった。ｈ－ＡＣＥ２トランスジェニックマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ社から購入した。マウス系統：Ｔｇｔｎ（ＣＡＧ－ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２－ＩＲＥＳ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）。
２．各マウスを３００００ｐｆｕ（３０μＬ）のウイルスでチャレンジした。
３．チャレンジした３０分間前、またはチャレンジした３０分間後に、鼻腔内投与経路により１０μｇのＥＫ１Ｃ４／マウスの用量で投与した。
４．感染させた４日目にマウスを安楽死させ、各群のマウスの肺および腸組織のウイルス量を検出した。
【0101】
（二）結果：
ＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの治療的経鼻投与は、マウスの肺（Ａ）および腸（Ｂ）におけるウイルス量（図１２）を大幅に減少させることができ、ＥＫ１－ｃｈｏｌがインビボでより良好な保護効果を有することを示した。
ＥＫ１－ｃｈｏｌポリペプチドの治療的経鼻投与は、マウスの肺（Ａ）および腸（Ｂ）におけるウイルス量（図１２）を大幅に減少させることができ、ＥＫ１－ｃｈｏｌがインビボでより良好な保護効果を有することを示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】