特許 7507276 タンパク質コロナ解析のための組成物、方法およびシステムならびにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-19

(45)【発行日】2024-06-27

(54)【発明の名称】タンパク質コロナ解析のための組成物、方法およびシステムならびにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240620BHJP

   G01N 23/2273 20180101ALI20240620BHJP

   G01N 23/2251 20180101ALI20240620BHJP

   G01N 23/04 20180101ALI20240620BHJP

   G01N 21/49 20060101ALI20240620BHJP

   G01N 33/553 20060101ALI20240620BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N23/2273

G01N23/2251

G01N23/04 330

G01N21/49 Z

G01N33/553

【請求項の数】 50

(21)【出願番号】P 2023028546

(22)【出願日】2023-02-27

(62)【分割の表示】P 2021525016の分割

【原出願日】2019-11-07

(65)【公開番号】P2023065530

(43)【公開日】2023-05-12

【審査請求日】2023-02-27

(31)【優先権主張番号】62/756,960

(32)【優先日】2018-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/824,278

(32)【優先日】2019-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/874,862

(32)【優先日】2019-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521193452

【氏名又は名称】シアー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ホンウェイ シア

(72)【発明者】

【氏名】リンダル ヘスターバーグ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル フィガ

(72)【発明者】

【氏名】シャオヤン ジャオ

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー トロイアーノ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム マニング

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ブルーム

(72)【発明者】

【氏名】オミッド ファロクザド

(72)【発明者】

【氏名】マシュー マクリーン

(72)【発明者】

【氏名】マーウィン コ

(72)【発明者】

【氏名】クレイグ ストラルチク

(72)【発明者】

【氏名】セオドア プラット

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１７２６９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許第０６５１４４１６（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０００７７２５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表平０６－５００３５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５０９１３２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のタンパク質を同定する方法であって、
粒子パネルを、前記粒子パネルの別個の粒子型に対応する複数の別個の生体分子コロナを形成するために、前記試料とともにインキュベートするステップであって、前記粒子パネルが、２～２０の別個の粒子型を有し、前記別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性で異なり、
前記粒子パネルにおける第１の別個粒子型が、負に荷電され、シリカを含み、前記第１の別個粒子型が前記試料の非存在下で－４０ｍＶ～－２０ｍＶの第１の表面電荷を有し、
前記粒子パネルにおける第２の別個粒子型が、電荷的に中性であり、前記試料の非存在下で－２０ｍＶ～３０ｍＶの第２の表面電荷を有し、かつ
前記粒子パネルにおける第３の別個粒子型が、正に荷電され、前記試料の非存在下で３０ｍＶ～１００ｍＶの第３の表面電荷を有する、ステップ；
前記複数の別個の生体分子コロナにおけるタンパク質を濃縮するために、前記試料中の未結合タンパク質から、前記粒子パネルからの２～２０の別個の粒子型を磁気的に単離するステップ；および
前記濃縮されたタンパク質を同定するために前記複数の別個の生体分子コロナをアッセイするステップであって、前記アッセイが、１０００～１００００タンパク質群を同定できる、ステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記アッセイするステップが、１，０００～５，０００のタンパク質群を同定できる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アッセイするステップが、１，２００～２，２００のタンパク質群を同定できる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記タンパク質群が、７アミノ酸残基の最小長を有するペプチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記アッセイするステップが、１，０００～１０，０００のタンパク質を同定できる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記アッセイするステップが、１，８００～５，０００のタンパク質を同定できる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が、複数の試料を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記複数の試料が、少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記インキュベートするステップが、前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を前記粒子パネルと同時に接触させることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記磁気的に単離するステップが、前記複数の試料の前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中の未結合タンパク質から前記粒子パネルを同時に磁気的に単離することを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記アッセイするステップが、前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中のタンパク質を同時に同定するために前記複数の別個の生体分子コロナをアッセイすることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を繰り返すステップをさらに含み、繰り返された場合、前記インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップが、前記粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、２０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

繰り返された場合、前記インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップが、前記粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、１０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記アッセイするステップが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を同定できる、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記粒子パネルを前記未結合タンパク質から磁気的に単離するステップの後、前記粒子パネルを少なくとも１回または少なくとも２回洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記アッセイするステップの後に、前記複数の別個の生体分子コロナ中の前記タンパク質を溶解するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記複数の別個の生体分子コロナ中の前記タンパク質を消化して、消化されたペプチドを生成するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記消化されたペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記アッセイするステップが、質量分析を使用して前記試料中のタンパク質を同定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記アッセイするステップが、２～４時間以内に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

１～２０時間以内に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

２～１０時間以内に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

４～６時間以内に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

単離するステップは、３０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、または２分以下かかる、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記複数の試料が、少なくとも１０の空間的に隔離されている試料、少なくとも５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２００の空間的に隔離されている試料、少なくとも２５０の空間的に隔離されている試料、または少なくとも３００の空間的に隔離されている試料を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記複数の試料が、少なくとも９６の試料を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記粒子パネルが、少なくとも３つの別個の粒子型、少なくとも４つの別個の粒子型、少なくとも５つの別個の粒子型、少なくとも６つの別個の粒子型、少なくとも７つの別個の粒子型、少なくとも８つの別個の粒子型、少なくとも９つの別個の粒子型、少なくとも１０の別個の粒子型、少なくとも１１の別個の粒子型、少なくとも１２の別個の粒子型、少なくとも１３の別個の粒子型、少なくとも１４の別個の粒子型、または少なくとも１５の別個の粒子型を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記粒子パネルが、少なくとも１０の別個の粒子型を含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記少なくとも２つの空間的に隔離されている試料が、少なくとも１つの物理化学的特性で異なる、請求項８に記載の方法。

【請求項30】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性で異なることによって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性で異なることによって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性で異なることによって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性で異なることによって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項34】

前記物理化学的特性が、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項35】

前記サイズが、動的光散乱、ＳＥＭ、ＴＥＭまたはこれらの任意の組合せによって測定される直径または半径である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、カルボキシレート材料を含み、前記第１の別個の粒子がマイクロ粒子であり、前記第２の別個の粒子型がナノ粒子である、請求項１に記載の方法。

【請求項37】

前記粒子パネルが、負に荷電されているナノ粒子のサブセットを含み、前記サブセットの各粒子が、少なくとも１つの表面化学基で異なる、請求項１に記載の方法。

【請求項38】

前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型、第２の粒子および第３の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型、前記第２の別個の粒子型および前記第３の別個の粒子型が、酸化鉄コア、ポリマーシェルを含み、直径約５００ｎｍ未満であり、前記第１の別個の粒子型が負電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が正電荷を有し、前記第３の別個の粒子型が中性電荷を有し、前記直径が、動的光散乱によって測定された平均直径である、請求項１に記載の方法。

【請求項39】

前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。

【請求項40】

前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、マイクロ粒子である、請求項１に記載の方法。

【請求項41】

前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、超常磁性酸化鉄粒子である、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

前記粒子パネルの各粒子が、酸化鉄材料を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項43】

前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、酸化鉄コアを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項44】

前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項45】

前記粒子パネルの別個の粒子型各々が、超常磁性酸化鉄粒子である、請求項１に記載の方法。

【請求項46】

前記粒子パネルの別個の粒子型各々が、酸化鉄コアを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項47】

前記粒子パネルの各１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項48】

粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、カルボキシル化ポリマー、アミノ化ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項49】

前記粒子パネルの少なくとも１つの粒子型が、シリカシェルコーティングを有する酸化鉄コアを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項50】

前記試料が生体試料であり、前記生体試料が、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙、細胞溶解物、組織溶解物、細胞ホモジネート、組織ホモジネート、乳頭吸引液、糞便試料、滑液および全血、または唾液を含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月７日に出願した米国特許仮出願第６２／７５６，９６０号、２０１９年３月２６日に出願した米国特許仮出願第６２／８２４，２７８号、および２０１９年７月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／８７４，８６２号の優先権、ならびにこれらのからの利益を主張するものであり、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

科学および医学へのプロテオーム情報の広範なインプリメンテーションは、そのような解析のスケーラビリティを制限する複雑なワークフローを必要とする、タンパク質分子それら自体に固有の複雑さのため、大部分がゲノミクスに後れを取っている。プロテオームデータの迅速な処理および疾患に関連する肝要なバイオマーカーの同定のための組成物および方法が、本明細書で開示される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、対象における広範な疾患および障害の検出ならびに病状の判定のためのナノ粒子のパネルを提供する。

【0004】

タンパク質コロナの作出および特徴付けは、当分野でも行われているが、実験の大部分は、非磁性粒子、例えば、リポソームおよび高分子ナノ粒子、または標的薬物送達に使用され得る他の粒子型を用いて行われている。

【0005】

タンパク質コロナ形成および特徴付けのための現行の（概して学究的な）アッセイに伴う問題は、アッセイに使用される粒子をコロナ回収のために単離する必要があるので、それらのアッセイがハイスループットおよび／または自動化形式に適していないことである。タンパク質コロナに使用されるＳＰＭＮＰの利点は、外部から磁場を印加することにより懸濁混合物から容易に分離することができる、それらの迅速な磁気応答である。この種類の磁性粒子は、粒子と血漿タンパク質との相互作用を微調整するのに役立ち得る異なる官能基でのさらなる化学修飾のための良好なプラットフォームである。

【0006】

一部の態様では、本開示は、試料中のタンパク質を同定する方法であって、粒子パネルを、粒子パネルの別個の粒子型に対応する複数の別個の生体分子コロナを形成するために、試料とともにインキュベートするステップ；複数の別個の生体分子コロナにおけるタンパク質を濃縮するために、粒子パネルを試料中の未結合タンパク質から磁気的に単離するステップ；および濃縮されたタンパク質を同定するために複数の別個の生体分子コロナをアッセイするステップを含む方法を提供する。

【0007】

一部の態様では、アッセイするステップは、１～２０，０００のタンパク質群を同定できる。さらなる態様では、アッセイするステップは、１０００～１０，０００のタンパク質群を同定できる。さらなる態様では、アッセイするステップは、１，０００～５，０００のタンパク質群を同定できる。なおさらなる態様では、アッセイするステップは、１，２００～２，２００のタンパク質群を同定できる。一部の態様では、タンパク質群は、７アミノ酸残基の最小長を有するペプチド配列を含む。一部のさらなる場合、アッセイするステップは、１，０００～１０，０００のタンパク質を同定できる。一部のなおさらなる場合、アッセイするステップは、１，８００～５，０００のタンパク質を同定できる。

【0008】

一部の実施形態では、試料は、複数の試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は、少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を含む。さらなる実施形態では、インキュベートするステップは、少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を粒子パネルと同時に接触させることを含む。さらなる実施形態では、磁気的に単離するステップは、複数の試料の少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中の未結合タンパク質から粒子パネルを同時に磁気的に単離することを含む。さらなる実施形態では、アッセイするステップは、少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中のタンパク質を同時に同定するために複数の別個の生体分子コロナをアッセイすることを含む。

【0009】

一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載の方法を繰り返すステップであって、繰り返された場合、インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップが、粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、２０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、繰り返された場合、インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップは、粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、１０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる。一部の実施形態では、アッセイするステップは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を同定できる。

【0010】

一部の実施形態では、方法は、粒子パネルを未結合タンパク質から磁気的に単離するステップの後、粒子パネルを少なくとも１回または少なくとも２回洗浄するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、アッセイするステップの後に、複数の別個の生体分子コロナ中のタンパク質を溶解するステップをさらに含む。

【0011】

一部の実施形態では、方法は、複数の別個の生体分子コロナ中のタンパク質を消化して、消化されたペプチドを生成するステップをさらに含む。

【0012】

一部の実施形態では、方法は消化されたペプチドを精製するステップをさらに含む。

【0013】

一部の実施形態では、アッセイするステップは、質量分析を使用して試料中のタンパク質を同定することを含む。一部の実施形態では、アッセイは、約２～約４時間以内に行われる。一部の実施形態では、方法は、約１～約２０時間以内に行われる。一部の実施形態では、方法は、約２～約１０時間以内に行われる。一部の実施形態では、方法は、約４～約６時間以内に行われる。一部の実施形態では、単離するステップは、約３０分以下、約１５分以下、約１０分以下、約５分以下、または約２分以下かかる。一部の実施形態では、複数の試料は、少なくとも１０の空間的に隔離されている試料、少なくとも５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２００の空間的に隔離されている試料、少なくとも２５０の空間的に隔離されている試料、または少なくとも３００の空間的に隔離されている試料を含む。さらなる実施形態では、複数の試料は、少なくとも９６の試料を含む。

【0014】

一部の実施形態では、粒子パネルは、少なくとも２つの別個の粒子型、少なくとも３つの別個の粒子型、少なくとも４つの別個の粒子型、少なくとも５つの別個の粒子型、少なくとも６つの別個の粒子型、少なくとも７つの別個の粒子型、少なくとも８つの別個の粒子型、少なくとも９つの別個の粒子型、少なくとも１０の別個の粒子型、少なくとも１１の別個の粒子型、少なくとも１２の別個の粒子型、少なくとも１３の別個の粒子型、少なくとも１４の別個の粒子型、少なくとも１５の別個の粒子型、少なくとも２０の別個の粒子型、少なくとも２５の粒子型、または少なくとも３０の別個の粒子型を含む。さらなる実施形態では、粒子パネルは、少なくとも１０の別個の粒子型を含む。さらなる実施形態では、少なくとも２つの空間的に隔離されている試料は、少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なる。

【0015】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。

【0016】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。さらなる実施形態では、物理化学的特性は、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を含む。さらなる実施形態では、サイズは、動的光散乱、ＳＥＭ、ＴＥＭまたはこれらの任意の組合せによって測定される直径または半径である。

【0017】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、カルボキシレート材料を含み、第１の別個の粒子は、マイクロ粒子であり、第２の別個の粒子型は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、０ｍＶおよび－５０ｍＶの表面電荷を有し、第１の別個の粒子型は、２００ｎｍ未満の直径を有し、第２の別個の粒子型は、２００ｎｍより大きい直径を有する。

【0018】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、１００～４００ｎｍの直径を有し、第１の別個の粒子型は、正の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、中性表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、ナノ粒子であり、第１の別個の粒子型は、－２０ｍＶ未満の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、－２０ｍＶより大きい表面電荷を有する。

【0019】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、マイクロ粒子であり、第１の別個の粒子型は、負の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、正の表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルは、負に荷電されているナノ粒子のサブセットを含み、サブセットの各粒子は、少なくとも１つの表面化学基の点で異なる。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型、第２の粒子および第３の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型、第２の別個の粒子型および第３の別個の粒子型は、酸化鉄コア、ポリマーシェルを含み、直径約５００ｎｍ未満であり、第１の別個の粒子型は、負電荷を有し、第２の別個の粒子型は、正電荷を有し、第３の別個の粒子型は、中性電荷を有し、直径は、動的光散乱によって測定された平均直径である。さらなる実施形態では、第１の別個の粒子型は、シリカコーティングを含み、第２の別個の粒子型は、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）を含み、第３の別個の粒子型は、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを含む。

【0020】

一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、マイクロ粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、超常磁性酸化鉄粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルの各粒子は、酸化鉄材料を含む。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、酸化鉄コアを有する。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する。一部の実施形態では、粒子パネルの別個の粒子型各々は、超常磁性酸化鉄粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルの別個の粒子型各々は、酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、粒子パネルの各１つの別個の粒子型は、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、カルボキシル化ポリマー、アミノ化ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの粒子型は、シリカシェルコーティングを有する酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの粒子型は、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの粒子型は、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む。

【0021】

一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、負の表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、正の表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型は、中性表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１０から選択される１つまたは複数の別個の粒子型を含む。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１０から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１２から選択される１つまたは複数の別個の粒子型を含む。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１２から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む。

【0022】

様々な態様では、本開示は、２つまたはそれより多くの物理化学的特性の点で異なる３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型を含む組成物であって、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のサブセットが、２つまたはそれより多くの物理化学的特性のうちの物理化学的特性を共有し、サブセットのそのような粒子型が、異なるタンパク質に結合する、組成物を提供する。

【0023】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のダイナミックレンジにわたって生体試料からのタンパク質を吸着する。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１～２０，０００のタンパク質の群を吸着できる。一部の態様では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１，０００～１０，０００のタンパク質群を吸着できる。さらなる態様では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１，０００～５，０００のタンパク質群を吸着できる。さらなる態様では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１，２００～２，２００のタンパク質群を吸着できる。なおさらなる
態様では、タンパク質群は、７アミノ酸残基の最小長を有するペプチド配列を含む。一部の態様では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１～２０，０００のタンパク質を吸着できる。さらなる態様では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１，０００～１０，０００のタンパク質を吸着できる。なおさらなる実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、生体試料からの１，８００～５，０００のタンパク質を吸着できる。

【0024】

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも４つの別個の磁性粒子型、少なくとも５つの別個の磁性粒子型、少なくとも６つの別個の磁性粒子型、少なくとも７つの別個の磁性粒子型、少なくとも８つの別個の磁性粒子型、少なくとも９つの別個の磁性粒子型、少なくとも１０の別個の磁性粒子型、少なくとも１１の別個の磁性粒子型、少なくとも１２の別個の磁性粒子型、少なくとも１３の別個の磁性粒子型、少なくとも１４の別個の磁性粒子型、少なくとも１５の別個の磁性粒子型、少なくとも２０の別個の磁性粒子型、または少なくとも３０の別個の磁性粒子型を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１０の別個の磁性粒子型を含む。一部の実施形態では、組成物は、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。

【0025】

一部の実施形態では、組成物は、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は異なる。一部の実施形態では、物理化学的特性は、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を含む。さらなる実施形態では、サイズは、動的光散乱、ＳＥＭ、ＴＥＭまたはこれらの任意の組合せによって測定される直径または半径である。

【0026】

一部の実施形態では、組成物は、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、カルボキシレート材料を含み、第１の別個の粒子は、マイクロ粒子であり、第２の別個の粒子型は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、０ｍＶおよび－５０ｍＶの表面電荷を有し、第１の別個の粒子型は、２００ｎｍ未満の直径を有し、第２の別個の粒子型は、２００ｎｍより大きい直径を有する。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、１００～４００ｎｍの直径を有し、第１の別個の粒子型は、正の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、中性表面電荷を有する。

【0027】

一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、ナノ粒子であり、第１の別個の粒子型は、－２０ｍＶ未満の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、－２０ｍＶより大きい表面電荷を有する。一部の実施形態では、粒子パネルは、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型は、マイクロ粒子であり、第１の別個の粒子型は、負の表面電荷を有し、第２の別個の粒子型は、正の表面電荷を有する。一部の実施形態では、組成物は、負に荷電されているナノ粒子のサブセットを含み、サブセットの各粒子型は、少なくとも１つの表面化学基の点で異なる。一部の実施形態では、組成物は、第１の別個の粒子型、第２の別個の粒子および第３の別個の粒子型を含み、第１の別個の粒子型、第２の別個の粒子型および第３の別個の粒子型は、酸化鉄コア、ポリマーシェルを含み、直径約５００ｎｍ未満であり、第１の別個の粒子型は、負電荷を有し、第２の別個の粒子型は、正電荷を有し、第３の別個の粒子型は、中性電荷を有し、直径は、動的光散乱によって測定された平均直径である。さらなる実施形態では、第１の別個の粒子型は、シリカコーティングを含み、第２の別個の粒子型は、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）を含み、第３の別個の粒子型は、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを含む。

【0028】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、マイクロ粒子を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型は、超常磁性酸化鉄粒子である。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型は、酸化鉄材料を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型は、酸化鉄コアを有する。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型は、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する。

【0029】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型の別個の粒子型各々は、超常磁性酸化鉄粒子である。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型の別個の粒子型各々は、酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの各１つの別個の粒子型は、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、ポリマーコーティングを含む。

【0030】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、カルボキシル化ポリマー、アミノ化ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、シリカシェルコーティングを有する酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む。

【0031】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、負の表面電荷を有する。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、正の表面電荷を有する。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、中性表面電荷を有する。

【0032】

一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、表１０の１つまたは複数の粒子型を含む。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１０から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型は、表１２の１つまたは複数の粒子型を含む。一部の実施形態では、粒子パネルは、表１２から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む。

【0033】

一部の態様では、本開示は、対象からの試料の生物学的状態を判定する方法であって、複数のナノ粒子を含むパネルに生体試料を曝露することによって複数のタンパク質コロナを生成するステップ；複数のタンパク質コロナからプロテオームデータを生成するステップ；複数のタンパク質コロナのタンパク質プロファイルを判定するステップ；およびタンパク質プロファイルを生物学的状態に関連付けるステップを含み、パネルが少なくとも２つの異なるナノ粒子を含む、方法を提供する。

【0034】

一部の実施形態では、パネルは、少なくとも３つの異なるナノ粒子を含む。一部の実施形態では、方法は、タンパク質プロファイルを生物学的状態に少なくとも９０％の正確度で関連付ける。一部の実施形態では、複数のナノ粒子は、少なくとも１つの酸化鉄ナノ粒子を含む。

【0035】

一部の態様では、本開示は、タンパク質コロナ解析のためのパネルを選択する方法であって、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する複数のナノ粒子を選択するステップを含む方法を提供する。

【0036】

一部の実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷、表面化学構造、サイズ、および形態からなる群から選択される。一部の実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷を含む。

【0037】

様々な実施形態では、本開示は、試料中のタンパク質を同定する方法であって、複数の粒子型を含むパネルを試料とともにインキュベートして複数のタンパク質コロナを形成するステップ；複数のタンパク質コロナを消化してプロテオームデータを生成するステップ；およびプロテオームデータを定量することにより試料中のタンパク質を同定するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料は、対象からのものである。

【0038】

一部の実施形態では、方法は、同定するステップからの試料のタンパク質プロファイルを判定するステップおよびタンパク質プロファイルを対象の生物学的状態と関連付けるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、複数のタンパク質コロナを消化することによりプロテオームデータを生成すること、複数のタンパク質コロナのタンパク質プロファイルを判定すること、およびタンパク質プロファイルを生物学的状態と関連付けることにより、対象からの試料の生物学的状態を判定するステップをさらに含み、パネルは、少なくとも２つの異なるナノ粒子を含む。一部の実施形態では、関連付けは、訓練された分類器により行われる。

【0039】

一部の実施形態では、パネルは、少なくとも３つの異なる粒子型、少なくとも４つの異なる粒子型、少なくとも５つの異なる粒子型、少なくとも６つの異なる粒子型、少なくとも７つの異なる粒子型、少なくとも８つの異なる粒子型、少なくとも９つの異なる粒子型、少なくとも１０の異なる粒子型、少なくとも１１の異なる粒子型、少なくとも１２の異なる粒子型、少なくとも１３の異なる粒子型、少なくとも１４の異なる粒子型、少なくとも１５の異なる粒子型、または少なくとも２０の異なる粒子型を含む。一部の実施形態では、パネルは、少なくとも４つの異なる粒子型を含む。一部の実施形態では、パネルの少なくとも１つの粒子型は、パネルの第２の粒子型とは異なる物理的特徴を有する。一部の実施形態では、物理的特徴は、サイズ、多分散指数、表面電荷、または形態である。一部の実施形態では、パネル内の複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型のサイズは、１０ｎｍ～５００ｎｍである。

【0040】

一部の実施形態では、パネル内の複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の多分散指数は、０．０１～０．２５である。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の形態は、球状、コロイド状、正方形、ロッド、ワイヤ、円錐、ピラミッド形および楕円形を含む。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷は、正の表面電荷を含む。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷は、負の表面電荷を含む。

【0041】

一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷は、中性表面電荷を含む。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、パネルの第２の粒子型とは異なる化学的特徴を有する。一部の実施形態では、化学的特徴は、表面官能性化学基である。一部の実施形態では、官能性化学基は、アミンまたはカルボキシレートである。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、ポリマー、脂質または金属を含む材料で作製される。

【0042】

さらなる実施形態では、ポリマーは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート（polypropylfumerate）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、またはポリアミン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸、もしくはポリカプロラクトン）、または２つもしくはそれより多くのポリマーのコポリマーを含む。

【0043】

さらなる実施形態では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine）（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、またはコレステロールを含む。

【0044】

一部の実施形態では、金属は、金、銀、銅、ニッケル、コバルト、パラジウム、白金、イリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、レニウム、バナジウム、クロム、マンガン、ニオブ、モリブデン、タングステン、タンタル、鉄またはカドミウムを含む。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、ポリエチレングリコールで官能化された表面である。一部の実施形態では、方法は、タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の正確度、少なくとも７５％の正確度、少なくとも８０％の正確度、少なくとも８５％の正確度、少なくとも９０％の正確度、少なくとも９２％の正確度、少なくとも９５％の正確度、少なくとも９６％の正確度、少なくとも９７％の正確度、少なくとも９８％の正確度、少なくとも９９％の正確度、または１００％の正確度で関連付ける。一部の実施形態では、方法は、タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の感度、少なくとも７５％の感度、少なくとも８０％の感度、少なくとも８５％の感度、少なくとも９０％の感度、少なくとも９２％の感度、少なくとも９５％の感度、少なくとも９６％の感度、少なくとも９７％の感度、少なくとも９８％の感度、少なくとも９９％の感度、または１００％の感度で関連付ける。

【0045】

一部の実施形態では、方法は、タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の特異度、少なくとも７５％の特異度、少なくとも８０％の特異度、少なくとも８５％の特異度、少なくとも９０％の特異度、少なくとも９２％の特異度、少なくとも９５％の特異度、少なくとも９６％の特異度、少なくとも９７％の特異度、少なくとも９８％の特異度、少なくとも９９％の特異度、または１００％の特異度で関連付ける。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１００のユニークタンパク質、少なくとも２００のユニークタンパク質、少なくとも３００のユニークタンパク質、少なくとも４００のユニークタンパク質、少なくとも５００のユニークタンパク質、少なくとも６００のユニークタンパク質、少なくとも７００のユニークタンパク質、少なくとも８００のユニークタンパク質、少なくとも９００のユニークタンパク質、少なくとも１０００のユニークタンパク質、少なくとも１１００のユニークタンパク質、少なくとも１２００のユニークタンパク質、少なくとも１３００のユニークタンパク質、少なくとも１４００のユニークタンパク質、少なくとも１５００のユニークタンパク質、少なくとも１６００のユニークタンパク質、少なくとも１７００のユニークタンパク質、少なくとも１８００のユニークタンパク質、少なくとも１９００のユニークタンパク質、または少なくとも２０００のユニークタンパク質を同定する。一部の実施形態では、複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型は、酸化鉄ナノ粒子を含む。さらなる実施形態では、試料は、体液である。なおさらなる実施形態では、体液は、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙または唾液を含む。

【0046】

様々な実施形態では、本開示は、タンパク質コロナ解析のためのパネルを選択する方法であって、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する複数の粒子型を選択するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷、表面化学構造、サイズ、および形態からなる群から選択される。さらなる実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷を含む。

【0047】

様々な実施形態では、本開示は、粒子のパネルを含む組成物であって、パネルが、複数の粒子型を含み、複数の粒子型が、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する、組成物を提供する。一部の実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷、表面化学構造、サイズ、および形態からなる群から選択される。さらなる実施形態では、異なる物理化学的特性は、表面電荷を含む。

【0048】

様々な実施形態では、本開示は、上記パネルのうちのいずれか１つを含むシステムを提供する。

【0049】

様々な実施形態では、本開示は、パネルを含むシステムであって、パネルが複数の粒子型を含む、システムを提供する。一部の実施形態では、複数の粒子型は、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する。一部の実施形態では、パネルは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２の異なる粒子型を含む。一部の実施形態では、複数の粒子型は、複数のタンパク質コロナを形成するために試料から複数のタンパク質を吸着できる。一部の実施形態では、複数のタンパク質コロナは、タンパク質プロファイルを判定するために消化される。一部の実施形態では、タンパク質プロファイルは、訓練された分類器を使用して生物学的状態と関連付けられる。

【0050】

一部の態様では、試料は、生体試料である。さらなる態様では、生体試料は、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙、細胞溶解物、組織溶解物、細胞ホモジネート、組織ホモジネート、乳頭吸引液、糞便試料、滑液および全血、または唾液である。一部の態様では、試料は、非生体試料である。さらなる態様では、非生体試料は、水、乳、溶媒またはホモジネート試料である。
参照による組み込み

【0051】

本明細書で言及される全ての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0052】

本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される。本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願文献のコピーは、請求して必要料金を支払うと、米国特許商標庁によって提供されるであろう。本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す後続の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】図１は、磁性粒子（ＭＰ）の表面化学構造の例を示す。一部の場合には、磁性粒子は、磁性コアナノ粒子（ＭＮＰ）であり得る。

【0054】

【図2】図２Ａは、粒子上タンパク質コロナの形成を示す。タンパク質コロナのプロファイルは、タンパク質－粒子、タンパク質－タンパク質、およびタンパク質濃度因子に依存する。図２Ｂは、３つの異なる粒子上タンパク質コロナの形成を示す。一部の場合には、粒子は、ナノ粒子であり得る。これらの粒子の特性が、異なるタンパク質コロナプロファイルを生じさせる結果となる。

【0055】

【図3】図３は、粒子型のいくつかの例、および粒子表面を官能化することができるいくつかの方法のいくつかの例を示す。一部の場合には、粒子は、ナノ粒子であり得る。

【0056】

【図4】図４は、残存溶液からの超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）の調製を示す。左側の写真に示されているように、ＳＰＩＯＮは、バイアルの側面に磁石を当てる前または当てると同時に溶液に分散され、ガラスバイアル内の暗色の不透明溶液のように見える。バイアルの側面に磁石を当てて３０秒以内に、右側の写真において磁石の隣の暗色粒子の蓄積および溶液透明性の増大により例証されるように、ＳＰＩＯＮが溶液から分離する。右の画像に示されている分離した溶液を振盪すると、粒子は５秒以内に左側の画像に示されている分散状態に戻る。ＳＰＩＯＮは、応答が速い。

【0057】

【図5】図５は、プロテオームデータを生成するプロセスについてのおよびパネル選択のためのプロセスについての例を提供する。

【0058】

【図6】図６は、粒子の異なる特質についてのおよび粒子を特徴付ける方法についてのいくつかの例を示す。

【0059】

【図7】図７は、動的光散乱により特徴付けられた、ナノ粒子のサイズ分布の例である。図７は、２つの粒子型：両方とも酸化鉄コアを有するＳＰ－００２（フェノール－ホルムアルデヒドコーティングが施されている粒子）およびＳＰ－０１０（カルボキシレート、ＰＡＡコーティングが施されている粒子）、の動的光散乱オーバーレイを示す。動的光散乱を使用して、マイクロ粒子を含む、より大きいサイズの粒子のサイズ分布も測定することができる。

【0060】

【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、コロナ形成前の、異なる官能化を有するナノ粒子の特徴付けを示す。図８Ａは、ＳＰ－００２（フェノール－ホルムアルデヒドコーティングが施されている粒子）の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を示す。図８Ｂは、ＳＰ－３３９（ポリスチレンカルボキシル粒子）のＴＥＭを示す。ＴＥＭを使用して、マイクロ粒子を含む、より大きいサイズの粒子を特徴付けることもできる。

【0061】

【図9】図９は、ＳＰ－３３３（カルボキシレート）、ＳＰ－３３９（ポリスチレンカルボキシレート）、ＳＰ－３５６（シリカアミノ）、ＳＰ－３７４（シリカシラノール）、ＨＸ－２０（ＳＰ－００３）（シリカコーティングが施されている）、ＨＸ－４２（ＳＰ－００６）（シリカコーティングが施されている、アミン）、およびＨＸ－７４（ＳＰ－００７）（ＰＤＭＰＡＰＭＡコーティングが施されている（ジメチルアミン））を含む、様々なナノ粒子からのＦｅ ２ｐ／３スペクトルを示す。スペクトルは、粒子表面の化学的指紋を提供する（表面の様々な元素の％を測定する）、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光分析）から得た。ＸＰＳを使用して、マイクロ粒子を含む、より大きいサイズの粒子のスペクトルを測定することもできる。

【0062】

【図10】図１０は、プロテオーム解析のための本開示のプロセスの例を示す。示されているプロセスは、数時間以内に複数の試料にわたって同時に実行することができる、ハイスループットおよび自動化のために最適化されている。プロセスは、粒子－マトリックス会合、粒子洗浄（×３）、タンパク質コロナの形成、インプレートでの消化、および質量分析を含む。このプロセスを使用すると、９６試料の１バッチ当たり４～６時間しかかからない可能性がある。典型的には、一度に１つの粒子型が試料とともにインキュベートされる。

【0063】

【図11】図１１は、１粒子型～１２粒子型の範囲のパネルサイズについてのタンパク質計数値（コロナ解析から同定されたタンパク質の数）を示す。パネル内の各粒子は、基礎材料、表面官能化、および／または物理的特性（例えば、サイズまたは形状）が特有であり得る。健常対象のプールを代表する単一のプール血漿を使用した。計数値は、約２時間の質量分析（ＭＳ）実行で１２粒子型のパネルにわたって観察されたユニークタンパク質の数である。１２粒子型のパネルサイズを用いて１３１８タンパク質が同定された。本明細書で使用される場合、質量分析により同定される「特徴」は、滞留時間とｍ／ｚ（質量対電荷比）の特異的組合せでのシグナルを含み、各特徴は、関連付けられた強度を有する。一部の特徴は、同定のために第２の質量分析による解析（ＭＳ２）でさらに断片化される。

【0064】

【図12】図１２は、複数日にわたっての血漿中でのインキュベーション後の複数の粒子型のゲル電気泳動分析を表す。個々のアッセイ各々は、典型的には約１時間実行したが、アッセイ精度を実証するために３つの異なる日に異なるオペレーターが三重反復測定を行った。左から右へ、ゲルは、ラダー、ＳＰ－３３９（ポリスチレンカルボキシル）の連続する３列、ＳＰ－３７４（シリカシラノール）の連続する３列、ＤＮＡラダー、およびＨＸ５６（ＳＰ－００７）（シリカアミノ）の連続する３列を示す。

【0065】

【図13】図１３は、１つの粒子型（ＳＰ－３３９、ポリスチレンカルボキシル）の３回の別々のアッセイにわたってのタンパク質同定についての質量分析による解析を示す。３回の別々のアッセイにわたって、１８０のタンパク質が一般に同定された。

【0066】

【図14A】図１４Ａおよび図１４Ｂは、対照と比較してスパイクタンパク質に対する濃度応答を示す。スパイクは、濃度に伴って変化する。内在性タンパク質対照は、濃度に伴って変化しなかった。図１４Ａは、ＣＲＰのスパイク回収率実験からのデータを示す。タンパク質を次の４レベルでスパイクした：２倍、５倍、１０倍および１００倍。ＨＸ－４２（ＳＰ－００６）（左側）およびＨＸ－９７（右側、ＳＰ－００７と同じ）を使用した。図１４Ｂは、スパイクおよび対照についての応答の傾きを示す。回帰モデルからの傾きは、ＭＳ～酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）データとフィットした。

【図14B】図１４Ａおよび図１４Ｂは、対照と比較してスパイクタンパク質に対する濃度応答を示す。スパイクは、濃度に伴って変化する。内在性タンパク質対照は、濃度に伴って変化しなかった。図１４Ａは、ＣＲＰのスパイク回収率実験からのデータを示す。タンパク質を次の４レベルでスパイクした：２倍、５倍、１０倍および１００倍。ＨＸ－４２（ＳＰ－００６）（左側）およびＨＸ－９７（右側、ＳＰ－００７と同じ）を使用した。図１４Ｂは、スパイクおよび対照についての応答の傾きを示す。回帰モデルからの傾きは、ＭＳ～酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）データとフィットした。

【0067】

【図15】図１５は、パネル選択のために粒子型を評価するための比較研究を示す。５６の血漿試料を罹患対象２８名および対照対象２８名から得た。罹患対象は、確定されたステージＩＶ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、併存疾患、および処置、例えば、糖尿病、心血管疾患、高血圧などを有した。対照対象は、偏りを低減させるために罹患対象と年齢および性別をマッチさせた。この研究は、大きな差がある群間の粒子型を評価するために行ったものであり、年齢および性別がマッチしていることを示す。図１６Ａに示されている通りの７つの粒子をこの研究に使用した。

【0068】

【図16A】図１６Ａは、ＳＰ－３３９、ＨＸ７４（ＳＰ－００７）、ＳＰ－３５６、ＳＰ－３３３、ＨＸ２０（ＳＰ－００３）、ＳＰ－３６４およびＨＸ４２（ＳＰ－００６）を含む７粒子型のパネルを使用する試料（罹患者２８名対対照２８名）の比較を示す。１４，４８１のフィルター処理されたＭＳ特徴を比較し、１２０（０．８％）が異なっていた。

【図16B】図１６Ｂは、図１６ＡのＳＰ－３３９からの上位のヒットを示す。検出された差は、コロナによって試料型間を鑑別することができ、最終的には疾患対健常を定義するための分類器を構築することができることを確証する。

【0069】

【図17】図１７Ａは、健常およびがん患者からの試料の採取、試料からの血漿の単離、タンパク質コロナを形成するためのコーティングが施されていないリポソームとのインキュベーション、および選択血漿タンパク質の濃縮を含む、本願のプロセスの概略図を示す。別個の粒子型を有する粒子型パネルを使用して試料中のタンパク質をアッセイして、別個の粒子型上に形成された別個の生体分子コロナにおけるタンパク質を濃縮した。タンパク質コロナ形成は、粒子の物理化学的特性に対して特異的であった。図１７Ｂは、３粒子型パネルについての本開示の実施形態、プロテオグラフ、でのコロナ解析を示す。血漿を対象４５名（神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、骨髄腫および膵臓がんを含む５種のがんの各々から８名、および健常対照５名）から採取した。コロナ解析の出力、プロテオグラフを、３粒子型パネル内の各粒子について作成した。ランダムフォレストモデルを１０００ラウンドの交差検証各々において構築した。これにより、ロバストなコロナ解析シグナルの強力な証拠を得た。最初の予備解析は、３粒子の組合せから検出されたタンパク質に関する主成分分析（ＰＣＡ）によって行った。

【0070】

【図18】図１８Ａおよび図１８Ｂは、早期がんを症状発症の８年前までに分離することができることを示す。ゴレスタンコホートは、２００４年～２００８年の間に健常対象５０，０００名を登録した。図１８Ａに示されているように、登録からの保存血漿を試験した。登録の８年後、患者おおよそ１０００名が、がんを発症した。図１８Ｂは、図１８Ａからの保存血漿の分類を示す。登録日からの保存血漿のコロナ解析は、検査した対象１５名（３種のがん各々について患者５名）のうちの１５名についてがんを正確に分類した。

【0071】

【図19】図１９は、プロテオグラフでの３粒子コロナ解析を使用する９５％の全体正確度での５種のがんのロバストな分類を示す。データは、粒子型多様性を加えることが性能を向上させることを示す。表面の負、中性および正の正味電荷（ｐＨ７．４）を有する３つの異なるリポソームを使用した。

【0072】

【図20】図２０は、粒子バイオセンサー生産のスケーリングの例を示す。このプラットフォームを複数のアッセイおよび試料にわたって使用することができる。

【0073】

【図21】図２１は、本開示の粒子型の例を示す。粒子型は、ナノ粒子（ＮＰ）およびマイクロ粒子を含み得る。

【0074】

【図22A】図２２Ａ～Ｂは、粒子タンパク質コロナの形成（図２２Ａ）、および血漿プロテオーム解析のための多粒子型タンパク質コロナ手法および質量分析に基づく本開示の実施形態、プロテオグラフプラットフォームワークフロー（図２２Ｂ）の、概略図を示す。図２２Ａは、粒子表面での異なるタンパク質コロナ組成物の形成につながる少なくとも１つの物理化学的特性が互いに異なる、３つの別個の粒子型（図の中央に描かれており、上、中間および下の球は、３つの別個の粒子型を表す）を示す。図２２Ｂは、（１）粒子－血漿インキュベーションおよびタンパク質コロナ形成、（２）磁石による粒子タンパク質コロナ精製、（３）コロナタンパク質の消化、および（４）質量分析による解析を含む、プロテオグラフを用いるコロナ解析ワークフローを示す。

【図22B】図２２Ａ～Ｂは、粒子タンパク質コロナの形成（図２２Ａ）、および血漿プロテオーム解析のための多粒子型タンパク質コロナ手法および質量分析に基づく本開示の実施形態、プロテオグラフプラットフォームワークフロー（図２２Ｂ）の、概略図を示す。図２２Ａは、粒子表面での異なるタンパク質コロナ組成物の形成につながる少なくとも１つの物理化学的特性が互いに異なる、３つの別個の粒子型（図の中央に描かれており、上、中間および下の球は、３つの別個の粒子型を表す）を示す。図２２Ｂは、（１）粒子－血漿インキュベーションおよびタンパク質コロナ形成、（２）磁石による粒子タンパク質コロナ精製、（３）コロナタンパク質の消化、および（４）質量分析による解析を含む、プロテオグラフを用いるコロナ解析ワークフローを示す。

【0075】

【図23】図２３は、上から下へ、シリカコーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００３）、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００７）、およびポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－０１１）である、最も左側の第１の列に示されている３つの超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）についての、以下の方法：走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ、画像の第２の列）、動的光散乱（ＤＬＳ、画像の第３の列）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ、画像の第４の列）、高分解能透過型電子顕微鏡法（ＨＲＴＥＭ、第５の列）、およびＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ、第６の列）による特徴付けを、それぞれ示す。ＤＬＳは、各粒子型の３回の反復実験を示す。ＨＲＴＥＭ写真は、個々のＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１粒子型の表面でそれぞれ記録したものであり、矢印は、粒子表面の非晶質ＳｉＯ_２（上のＨＲＴＥＭ画像）コーティングおよび非晶質ＳｉＯ_２／ポリマーコーティング（中間および下のＨＲＴＥＭ画像）の領域を指している。

【0076】

【図24】図２４は、Keshishian et al.（Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi: 10.1074/mcp.M114.046813. Epub 2015 Feb 27.）からのコンパイル済みデータベース（一番上のパネル）との比較により、ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１粒子に対して生血漿で観察されたタンパク質についてのダイナミックレンジを示す。

【0077】

【図25】図２５は、血漿タンパク質に対する粒子コロナタンパク質の最大強度と同じタンパク質の既報の濃度との相関関係を示す。

【0078】

【図26】図２６は、同じ血漿試料を使用して３回の反復実験により実証された、各粒子型（ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１）についての粒子コロナ強度の再現性を示す。

【0079】

【図27】図２７は、ＳＰ－００７粒子を使用する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）パイロット研究において変化した特徴を示す。７つのＭＳ特徴は、ステージＩＶ ＮＳＣＬＣ（関連併存疾患および処置効果を伴う）を有する対象２８名と年齢および性別をマッチさせた見かけ上健常な対象２８名との間で、統計的に有意な差があると同定された。下の表は、５つの公知タンパク質および２つの未知タンパク質を含む、有意な差があった７つのタンパク質のリストである。特徴に関連するＭＳ２データにペプチド－スペクトルがマッチした場合、そのペプチド配列（および変化）および可能性のある親タンパク質が示されており、ＭＳ２マッチが特徴に関連しなかった場合、ペプチドとタンパク質の両方は、「未知」と記されている。

【0080】

【図28】図２８Ａは、ＳＰＩＯＮコアの合成についての概略図を示す。図２８Ｂは、シリカコーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００３）の合成についての概略図を示す。図２８Ｃは、ビニル基官能化ＳＰＩＯＮの合成についての概略図を示す。図２８Ｄは、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００７）の合成についての概略図を示す。図２８Ｅは、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－０１１）の合成についての概略図を示す。

【0081】

【図29】図２９は、５６試料ＮＳＣＬＣ比較研究についての、存在についてフィルター処理され、クラスターの質についてフィルター処理された、中央値正規化ＭＳ特徴強度の分布を示す。各々の線は、罹患試料または対照試料のいずれかについてのｌｏｇ_２特徴強度の密度を表す。０．００～０．１５の密度がｙ軸上にプロットされ、１５～３５のｌｏｇ_２特徴強度がｘ軸上にプロットされている。密度が約０．１３～約０．１７の範囲である約２８のｌｏｇ_２特徴強度の付近に位置する最高ピークにおいて、２つの最高トレースは、対照試料に対応するが、最低トレースは、罹患試料に対応する。残りの対照および罹患トレースは、最高トレースと最低トレースの間に分布している。約２０のｌｏｇ_２特徴強度および約２３のｌｏｇ_２特徴強度に存在する２つのショルダーピークにおいて、２０のｌｏｇ_２特徴強度では、最も高い２つのトレースが対照トレースであり、最も低い２つのトレースが対照トレースであり、２３のｌｏｇ_２特徴強度では、最高トレースが罹患トレースである。

【0082】

【図30】図３０は、４つの異なるペプチドのスパイク回収率実験におけるＳＰ－００７ナノ粒子に関するＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）についての測定の正確度を示す。

【0083】

【図31】図３１は、スパイク回収率実験におけるアンジオゲニンのペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0084】

【図32-1】図３２は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ８のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【図32-2】図３２は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ８のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0085】

【図33-1】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0086】

【図33-2】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0087】

【図33-3】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0088】

【図33-4】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0089】

【図33-5】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0090】

【図33-6】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0091】

【図33-7】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0092】

【図33-8】図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0093】

【図34】図３４は、スパイク回収率実験におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のペプチド特徴の測定の正確度を示す。

【0094】

【図35-1】図３５は、スパイク回収率実験におけるタンパク質特徴の測定の正確度を示す。

【図35-2】図３５は、スパイク回収率実験におけるタンパク質特徴の測定の正確度を示す。

【0095】

【図36】図３６は、ＭＳ強度の５，３０４血漿タンパク質データベースに対する１０の別個の粒子型の粒子パネルのマッチングおよびカバレッジを示す。データベースタンパク質のランク付けされた強度が一番上のパネル（「データベース」）に示されており、単純血漿ＭＳ評価からのタンパク質の強度が、２番目のパネル（「血漿」）に示されており、最適な１０粒子型パネルの強度が残りのパネルに示されている。血漿タンパク質強度データベースは、Keshishian et al. (2015). Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury. Molecular & Cellular Proteomics, 14(9), 2375-2393からのものである。

【0096】

【図37】図３７は、本明細書で開示されるパネルに含まれ得る様々な粒子型を示す。図３７Ａは、中空磁性粒子の概略図を示す。図３７Ｂは、疎水性ポケットを有する粒子の概略図を示す。図３７Ｃは、卵殻－卵黄型ＳＰＩＯＮマイクロゲルハイブリッド粒子の概略図を示す。

【0097】

【図38】図３８は、Mol. Cells 2019, 42(5), 386-396出典の、タンパク質および／またはペプチドを捕捉するために操作された粒子表面の概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0098】

単純かつハイスループット様式で試料中のペプチドおよびタンパク質をアッセイするための組成物およびそれらの使用方法が、本明細書で開示される。本開示は、別個の粒子型の表面に形成される別個の生体分子コロナ上に試料からのタンパク質を濃縮する、複数の別個の粒子型の粒子パネルを提供する。本明細書で開示される粒子パネルをコロナ解析の方法で使用して、数時間で広いダイナミックレンジにわたって何千ものタンパク質を検出することができる。

【0099】

現在のところ、臨床診断に現在使用されているタンパク質ベースのバイオマーカーは小数であり、マーカーの拡大のために血漿プロテオームを分析する甚大な努力にもかかわらず、比較的少数の新しい候補しか臨床的に有用な検査薬として受け入れられていない。血漿プロテオームは、＞１０，０００のタンパク質を含有し、１０桁を超える桁数（ｍｇ／ｍＬ～ｐｇ／ｍＬ）にわたる濃度範囲を有する桁違いに多いタンパク質アイソフォームを含有する可能性がある。これらの特質が、タンパク質解析作業のための従来の分子ツール（例えば、コピー機構または増幅機構）の欠如と相俟って、血漿プロテオームの包括的研究を非常に困難にしている。生体試料中のタンパク質の広いダイナミックレンジを克服するための手法は、いまだに、何千ものユニークタンパク質およびさらにいっそう多くのタンパク質バリアントのバックグラウンドに対するロバストな同定および定量のためのものである。しかし、評価および再現についての確固たる見込みのある適切なサイズの研究を可能にするために、十分なスループットを有しかつ現実的なコストプロファイルを有する形式で、全血漿濃度範囲にわたってタンパク質を同時に測定できる技術は存在しない。これらの課題は、疾患のタンパク質ベースのバイオマーカーの発見を制限するばかりでなく、ゲノムバリアントのプロテオゲノミクスおよびタンパク質アノテーションのより迅速な採用の妨げにもなっている。改善されたデータ解析の開発とともに質量分析（ＭＳ）手法の進歩は、深く広いプロテオーム解析のためのツールをもたらしている。高存在量のタンパク質の枯渇、血漿分画、ペプチド分画およびラベル化定量などの、低存在量タンパク質の検出を実質的に改善するためのいくつかの努力がなされている。しかし、現行の手法は、極めて複雑であり、時間がかかり（数日～数週間）、したがって、タンパク質カバレッジの深度と試料スループットとのトレードオフを必要とする。その結果として、プロテオームに関する利用可能な多くの情報の包括的かつ迅速な解析のための単純かつロバストな戦略は、依然として満たされていない要求である。

【0100】

加えて、疾患が診断されるのが早期であるほど、疾患を治癒してまたは疾患の管理に成功して患者のより良好な予後をもたらすことができる可能性が高い。疾患が早期に処置されると、疾患からの問題を防止するまたは遅らせることができる可能性があり、患者の寿命延長および／または生活の質を含む、患者の転帰を改善する可能性がある。多くの種類のがんをそれらの早期にはうまく処置することができるので、がんの早期診断は、極めて重要である。例えば、乳がん、卵巣がんおよび肺がんの早期診断および処置後の５年生存率は、最も進行した疾患ステージで診断された患者についての１５％、５％および１０％と比較して、それぞれ、９０％、９０％および７０％である。がん細胞がそれらの原発組織を離れると、利用可能な確立された治療法を使用する処置の成功は、極めて可能性が低くなる。がんの徴候の警告を認識し、迅速な対応策を講じることは、早期診断につながり得るが、がんの大部分（例えば、肺）は、がん細胞が既に周囲組織に浸潤して体中に転移してしまった後にしか症状を示さない。例えば、乳がん、肺がん、結腸がんおよび卵巣がんを有する患者の６０％より多くが、彼らのがんが検出されるときには不顕性のまたはさらには転移性のコロニーを有する。したがって、がんの早期検出のための有効な手法を至急開発する必要がある。そのような手法は、様々なステージのがんを同定するための感度、および試験を受ける人物にがんがない場合には陰性結果を与える特異度を有するべきである。がんの早期検出のための方法を開発するための甚大な努力があり、膨大な数のリスク因子およびバイオマーカーが導入されてきたが、広範ながんの早期検出のための広い関連性のあるプラットフォームは、依然として捉えどころがない。様々な種類のがんは、血漿の組成を－それらの早期であっても－変化させ得るので、早期検出のための１つの有望な手法は、バイオマーカーの分子的血液解析である。この戦略は、少数のがんについて既に研究されている（例えば、前立腺がんのためのＰＳＡ）が、大多数のがんの早期検出のための特異的バイオマーカーはまだ存在しない。そのようながん（例えば、肺）については、定義された循環バイオマーカー候補のいずれも臨床的に確証されておらず、非常に少数が後期臨床開発に達している。したがって、非常に早期にがんはもちろん他の疾患も検出する我々の能力を向上させるための新規手法が、至急必要とされている。

【0101】

特定の疾患に関連するタンパク質を非常に早期に検出するために使用することができる、試料中のタンパク質を検出するためのハイスループット、単純アッセイの必要を満たすために、本開示は、単純、迅速かつハイスループット様式で、試料（例えば、複雑な生体試料、例えば血漿）中のペプチドおよびタンパク質についてアッセイするために粒子パネルおよび前記粒子パネルを使用する方法を提供する。詳細には、本開示は、別個の粒子型の表面に形成される別個の生体分子コロナ上に試料からのタンパク質を濃縮する、複数の別個の粒子型の粒子パネルを提供する。本明細書で開示される粒子パネルに含まれる粒子型は、偏りのない方式で広いダイナミックレンジにわたっての多数のタンパク質の濃縮に特によく適している。本開示の粒子パネルへの包含に選択される粒子型の組合せは、それらの物理化学的特性（例えば、サイズ、表面電荷、コア材料、シェル材料、表面化学構造、多孔度、形態、および他の特性）が様々である。しかし、粒子型は、前記物理化学的特性のいくつかを共有することもある。例えば、本明細書で開示される粒子パネルは、第１の粒子型および第２の粒子型を含むことができ、第１の粒子型および第２の粒子型は、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の粒子型および第２の粒子型は異なる。重要なこととして、粒子パネルの第１の粒子型と第２の粒子型の間の少なくとも１つの物理化学的特性の変化は、対応する別個の粒子型上に形成する別個のコロナの形成につながり得る。したがって、本明細書で開示される方法で使用するための粒子パネルへの包含のための粒子型の選択は、試料（例えば、血漿）において広いダイナミックレンジにわたって濃縮され得る多数のタンパク質を可能にする。

【0102】

本開示の粒子パネルは、磁気特性を有する粒子型を含むことができ、この磁気特性によって複雑な生体試料においてインキュベーション後にそれらを容易に分離することが可能になる。例えば、本開示は、ユニークな磁気特性を有し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で生体分子と薬物送達剤と造影剤とを迅速に分離することができる、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）を提供する。超常磁性粒子は、酸化鉄のみのコア（例えば、酸化鉄コア）を有することもあり、ポリスチレンコアに埋め込まれた小さい酸化鉄結晶を有することもある。

【0103】

本開示は、ＳＰＩＯＮの合成のために開発された方法を提供する。一例では、非極性溶媒中のオレイン酸鉄の熱分解を使用して、高結晶性を有する小サイズ（通常は＜３０ｎｍ）の単分散磁性ナノ粒子を合成することができる。これらのナノ粒子は、疎水性であり、配位子交換または化学修飾によって水相に移す必要がある。この方法を使用して生成されたＳＰＩＯＮは、生物医学的使用の要件を満たすことができる。ソルボサーマル法は、エチレングリコールでの塩化鉄（ＩＩＩ）の還元によりＳＰＩＯＮを合成するための別の方法である。クエン酸塩、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの親水性配位子を使用する改良型ソルボサーマル法により、高水分散性ＳＰＭＮＰを合成することができる。粒子表面を、ストーバー法によって官能基を有する異なるシランでさらに修飾することができる。ポリマー複合粒子においてＳＰＭＮＰ＠ｐｏｌｙｍｅｒ複合粒子を形成するための、界面活性剤の非存在下でのシード乳化重合による簡便法によって、表面官能基を獲得することもできる。

【0104】

本開示は、大規模、ハイスループット、効率的かつ対費用効果の高いプロテオームプロファイリングおよび機械学習のための組成物、システム、およびそれらの使用方法を提供する。別個の粒子型を有する粒子パネルを使用して別個の粒子型上に形成される別個の生体分子コロナにおけるタンパク質を濃縮して試料中のタンパク質をアッセイするための、スケーラブルな並行タンパク質同定および定量技術が、本明細書で開示される。本明細書で使用される場合の「生体分子コロナ」は、用語「タンパク質コロナ」を同義的に使用／言及されることがあり、粒子を試料（例えば、血漿）と接触させた後の粒子の表面でのタンパク質の層の形成を指す。この方法は、同義的に、コロナ解析と、または一部の例では、多粒子型タンパク質コロナ戦略と質量分析（ＭＳ）を併用する「プロテオグラフ」解析（図２２に示されている）と、呼ばれることもある。本明細書で開示される粒子パネルに含まれる粒子型は、超常磁性であり、したがって、試料中の粒子のインキュベーション後に試料中の未結合タンパク質（コロナを形成するように粒子の表面に吸着されていないタンパク質）から迅速に分離または単離される。

【0105】

現況では、粒子は、データを交絡させ、再現性および正確度を欠く、タンパク質コロナ中のタンパク質の処理に関するステップ（例えば、コロナタンパク質を遊離血漿タンパク質から分離するための遠心分離または膜による濾過、ならびに緩く結合しているタンパク質を粒子から除去するための洗浄）に起因して、ハイスループット翻訳プロテオーム解析のための特徴付けが不十分である。本明細書で開示されるコロナ解析（例えば「プロテオグラフ」）法は、重複しているが別個の粒子型タンパク質コロナを、大規模な効率的プロテオームプロファイリングおよび機械学習における潜在的使用のために、例えば液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）と統合することができる。この粒子型プラットフォームは、不偏であり得（例えば、所定の分析物に限定されない）、ＭＳデータ収集プラットフォームは、分析物測定の点で不偏であり得、これらの両方が、自動化に適している可能性がある。タンパク質コロナと呼ばれる、血漿との粒子の接触時の粒子の表面でのタンパク質の層の形成（図２２Ａ）が、タンパク質を同定するための方法として本明細書で開示される。コロナタンパク質の組成および量は、粒子型の物理化学的特性に依存し得、これらの操作された特性の変化によって、コロナ中の同一性および／または量の点で異なるタンパク質を再現性よく得ることができる。

【0106】

一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮＳ）であり得る。ＳＰＩＯＮは、別個の表面化学構造を有するように合成されている点で互いに明確に異なり得る。一部の実施形態では、異なる表面化学構造のＳＰＩＯＮを、それらのタンパク質コロナ上に形成されるタンパク質の解析において併用することができる。ＳＰＩＯＮ、他の粒子型、またはこれらの組合せを併用して、試料のプロテオーム解析に使用され得る粒子型のパネルにすることができる。

【0107】

一部の実施形態では、タンパク質コロナの形成のために合成され、使用される、別個の表面化学を有する３粒子型のパネルであって、未結合タンパク質から磁石により迅速に分離することができるパネルが、本明細書で開示される。各粒子型は、高存在量タンパク質と低存在量タンパク質の両方の捕捉により、ユニークタンパク質コロナパターンを再現性よく生成することができる。例えば、少なくとも３つの粒子型から生成される別個のプロテオームプロファイルを統合することにより、単一のプール大腸がん（ＣＲＣ）血漿試料の１，５００より多くのタンパク質を同定することができ、これらのうちの多くが、ＦＤＡの認可／承認を受けたバイオマーカーであり得る。例えば、一部の実施形態では、３つの粒子型のスクリーニングは、１，５００を超えるタンパク質を検出することができ、これらのうちの６５は、ＦＤＡの認可／承認を受けたバイオマーカーである。

【0108】

一部の実施形態では、プロテオグラフを用いるコロナ解析フローワーク（図２２Ｂ）は、ＭＳによる解析のための９６コロナ試料のバッチを調製するために約４～６時間かかり得る。ＣＲＣプールにおけるタンパク質の同定は、各々約１時間の実行で、したがって、合計約３時間のＭＳ時間で解析される、わずか３回の全ＭＳ分画を使用して行うことができる。

【0109】

一部の実施形態では、粒子型コロナ戦略を使用するための本明細書で開示される組成物、システムおよび方法を使用しない５００未満のタンパク質とは対照的に、３つの別個の粒子型を使用して、試料調製およびＬＣ－ＭＳを含めて８時間以内に単一プール血漿から１，５００より多くのタンパク質を同定することができる。

【0110】

このコロナ解析技術を使用して疾患を同定することができる。例えば、本明細書で開示される粒子およびそれらの使用方法を使用して、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する患者ならびに年齢および性別をマッチさせた健常対象からの血清試料を分析することができる。ＮＳＣＬＣ試料と対照試料を区別することができる公知および新規特徴を含むＭＳ特徴を、このプラットフォームを使用して発見することができる。したがって、コロナ解析プラットフォーム技術によって、より大きい、よりロバストな検証および反復研究ができる。さらに、ハイスループットで偏りのないプロテオーム試料抽出のためのコロナ解析のユニークな特性は、ゲノムデータのアノテーションおよび機械学習分類法の応用を可能にし得る。本明細書に記載の多粒子型タンパク質コロナベースのプラットフォーム技術は、バイオマーカー発見および検証のためのより大型の研究を可能にする、効率的かつ包括的なプロテオームプロファイリングを助長することができる。

【0111】

一部の実施形態では、本明細書で開示される組成物およびそれらの使用方法は、血漿試料への漸増濃度の参照、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の添加、およびスパイクされた血漿に対して粒子コロナ中のＣＲＰレベルについて０．９（９５％ＣＩ ０．８１～０．９８）の傾きを示す、タンパク質コロナ中のＣＲＰレベルのその後の検出によって実証されるように、高いアッセイ正確度を示す。一部の実施形態では、アッセイ反復におけるプラットフォームの精度中央値は、３つの別個の粒子型タンパク質コロナから得られた８，７３８の実測ＭＳ特徴にわたって約２４ＣＶ％であり得る。

【0112】

別個の表面化学構造を有するＳＰＩＯＮを、単一のプール血漿試料のタンパク質コロナ解析に応用することができる。例えば、本開示に記載の通り、結果として得られるプロテオームデータは、粒子パネル内の粒子型の数を増加させると、より多くのタンパク質（特に、低存在量タンパク質）が同定される結果となり得ることを実証する。より多くの別個の粒子型を加えることによって、よりいっそう広く深いプロテオームプロファイリングを得ることができる。本明細書で開示される粒子の組成物、および前記異なる粒子型を含む粒子型のパネルを、パネル内の粒子の数および型を変化させることによって異なるレベルの深度および幅－遺伝子シークエンシングにおける異なるレベルのカバレッジに類似している－で、プロテオームをプロファイリングするように調整することができる。

【0113】

本明細書で開示される多粒子型タンパク質コロナベースのアッセイは、血漿プロテオーム解析のためのいくつかの同等に重要な特徴を示している。時間がかかる枯渇および分画フローワークを通常は伴う従来のプロテオーム技法と比較して、本明細書で開示される組成物および使用方法は、それらの複雑なワークフローを回避することができ、はるかに高速であり得る。注目すべきことに、コロナ解析アッセイは、ロバストに自動化することができ、したがってさらに、例えば９６ウェルプレート形式で、試料分析に必要とされる精度を向上させ、時間量を低減させる。コロナ解析プラットフォームは、試料間の差を高感度に測定することができ、その上、それらの比較のダイナミックレンジを低減させ、ひいてはより多くの比較を観察することを可能にする。コロナ解析技術は、タンパク質の所定のセットを標的とせずに新しいバイオマーカーを同定することができる。コロナ解析プラットフォームのスケーラビリティおよび効率を大型プロテオーム研究に使用することができ、これは、疾患および生物学的機序のより深い理解につながり得る。例えば、プロテオームデータをマルチオームデータセットに加えることおよび機械学習解析を行うことにより、新規分類を生成し、一塩基多型（ＳＮＰ）バリアント、ＤＮＡメチル化パターンの変化、およびスプライスバリアントなどの、現在十分に理解されていないコンテクストゲノム疾患情報に入れることができる。加えて、この技術を、プロテオームの迅速で間違いのない正確なプロファイリングのために他の体液、例えば脳脊髄液、細胞溶解物およびさらには組織ホモジネートに拡大することができ、これは、異なる疾患のための新しいバイオマーカーの発見を助長することができる。

【0114】

超常磁性ナノ粒子（ＳＰＭＮＰ）または超常磁性粒子酸化鉄粒子（ＳＰＩＯＮ）を作製する方法が、本明細書で開示される。これらの粒子およびそれらの実施形態をタンパク質コロナアッセイにおいて使用することができる。

【0115】

本開示の方法およびシステムは、試料調製およびＭＳデータ収集を単純化することにより、プロテオーム解析を改善する。方法およびシステムは、約０．２５日以内に約５ステップで試料調製を行い、約１２画分についてのＭＳデータを１試料当たり約０．５日以内に収集する。

【0116】

本開示は、試料をタンパク質についてアッセイするための組成物およびそれらの使用方法を提供する。本明細書に記載の組成物は、１つまたは１つより多くの別個の粒子型を含む、粒子パネルを含む。本明細書に記載の粒子パネルは、粒子型の数、および単一パネル内の粒子型の多様性の点で異なり得る。例えば、パネル内の粒子は、サイズ、多分散性、形状および形態、表面電荷、表面化学構造および官能化、ならびに基礎材料によって異なり得る。パネルを試料とともにインキュベートして、タンパク質およびタンパク質濃度について分析することができる。試料中のタンパク質は、粒子パネル内の異なる粒子型の表面に吸着してタンパク質コロナを形成する。粒子パネル内のある特定の粒子型に吸着するまさにそのタンパク質およびタンパク質濃度は、前記粒子型の組成物、サイズおよび表面電荷に依存し得る。したがって、パネル内の各粒子型は、タンパク質の異なるセットへの吸着、特定のタンパク質の異なる濃度、またはこれらの組合せに起因して、異なるタンパク質コロナを有し得る。パネル内の各粒子型は、相互排他的なタンパク質コロナを有することもあり、重複するタンパク質コロナを有することもある。重複するタンパク質コロナは、タンパク質同定が重複していることもあり、タンパク質濃度が重複していることもあり、または両方が重複していることもある。

【0117】

本開示は、試料型に依存してパネルへの包含のための粒子型を選択するための方法も提供する。パネルに含まれる粒子型は、高存在量のタンパク質の除去のために最適化されている粒子の組合せであり得る。パネルへの包含にも整合する粒子型は、目的の特定のタンパク質を吸着するために選択されたものである。粒子は、ナノ粒子であることがある。粒子は、マイクロ粒子であることもある。粒子は、ナノ粒子とマイクロ粒子の組合せであることもある。

【0118】

本開示は、生体試料（例えば、血漿試料）におけるタンパク質の広いカバレッジを示す粒子パネルを選択するための方法を提供する。粒子は、組合せ手法を使用して粒子パネルへの包含に選択される。広範な物理化学的特性を有する粒子が選択され、例えば、粒子は、サイズ、表面電荷、コア材料、シェル材料、表面化学構造、多孔度、形態および他の特性が異なり得る。しかし、粒子はまた、前記物理化学的特性のいくつかを共有することもある。例えば、本明細書で開示される粒子パネルは、第１の粒子型および第２の粒子型を含むことができ、第１の粒子型および第２の粒子型は、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の粒子型および第２の粒子型は異なる。本明細書で開示される粒子パネルは、第１の粒子型および第２の粒子型を含むことができ、第１の粒子型および第２の粒子型は、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の粒子型および第２の粒子型は異なる。本明細書で開示される粒子パネルは、第１の粒子型および第２の粒子型を含むことができ、第１の粒子型および第２の粒子型は、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、第１の粒子型および第２の粒子型は異なる。物理化学的特性の非限定的な例としては、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を挙げることができる。重要なこととして、粒子パネルの第１の粒子型と第２の粒子型の間の少なくとも１つの物理化学的特性の変化は、対応する別個の粒子型上に形成する、別個のコロナの形成につながり得る。例えば、電荷が異なる第１の粒子型および第２の粒子型は、各々、異なるタンパク質を吸着することもあり、異なる濃度の同じタンパク質を吸着することもあり、または異なるタンパク質と異なる濃度の同じタンパク質の両方を吸着することもある。それ故、第１の粒子型および第２の粒子型は、別個の生体分子コロナを有することになる。サイズは、この結果をもたらすために異なり得る物理化学的特性の一例である。１つまたは１つより多くの物理化学的特性（例えば、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、もしくは表面疎水性、またはこれらの任意の組合せ）が異なって、別個の生体分子コロナを生じさせることができる。パネル用の粒子型の選択のための他の最適化パラメーターは、任意の特定のアノテーションセット、例えば、インタラクトーム、セクレトーム、ＦＤＡマーカー、臨床的に意義のある遺伝子多型を有するタンパク質を含み得る。表１０および表１２で見られるように、これらの粒子の１つより多くはナノ粒子であるが、異なるポリマーコーティングで作製されている。別の例では、表１０および表１２の１つより多くの粒子は、同様の表面電荷および同様のサイズを共有するが、異なる材料で作製されている。別の例では、表１０および表１２の１つより多くの粒子は、多孔質表面を示す。別の例では、表１０および表１２の１つより多くの粒子は、無孔質表面を示す。別の例では、表１０および表１２の１つより多くの粒子は、カルボキシレートコーティングが施されている表面を示す。別の例では、表１０および表１２の１つより多くの粒子は、アミンコーティングが施されている表面を示す。粒子パネル内に存在し得る粒子および粒子型の多くの組合せの全てに関して、本明細書で開示される粒子パネルが、試料（例えば、血漿試料）中の多数のタンパク質（例えば、血漿タンパク質）を偏りのない様式で広いダイナミックレンジにわたって同定でき、高い再現性レベル（例えば、分位正規化変動係数＜２０％）で試料中のタンパク質をアッセイする方法において使用することができたことは、驚くべきことであり、予想外である。

【0119】

本開示は、１００を超える異なる表面化学構造および５０を超える多様な物理的特性を有する、２００を超える別個の粒子型を提供する。詳細には、２３を超える粒子型を、試料中のタンパク質をアッセイする方法における使用のために特徴付けた。これらの粒子型の各々を、目的の特定のタンパク質を最適にアッセイするようにまたは目的の疾患のためのバイオマーカーを最適に同定するように設計されるパネル内で、他の粒子型と組み合わせることができる。パネルは、これらの粒子型の任意の数、または粒子型の任意の組合せを含むことができ、本明細書で開示される様々な粒子型は、様々な物理化学的特性を有する広範なタンパク質のアッセイおよび検出を可能にし得る。

【0120】

一部の実施形態では、本開示は、試料中のタンパク質を同定する方法であって、複数の粒子型を含むパネルを試料とともにインキュベートして複数のタンパク質コロナを形成するステップ；複数のタンパク質コロナを消化してプロテオームデータを生成するステップ；およびプロテオームデータを定量することにより試料中のタンパク質を同定するステップを含む方法を提供する。
粒子材料

【0121】

本明細書で開示される粒子パネルは、様々な異なる材料で作製された粒子型を含み得る。パネルを特異的な粒子型で組み立てて、試料中の広範なタンパク質を同定することまたは目的の特定のタンパク質またはタンパク質のセットについて選択的にアッセイすることができる。粒子型は、例えば、ナノ粒子（ＮＰ）、マイクロ粒子、磁性粒子（ＭＰ）、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）、常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）、または超常磁性ナノ粒子（ＳＰＭＮＰ）を含み得る。本明細書に記載の粒子は、磁性粒子であり得る。本明細書における磁性粒子は、超常磁性粒子（ＳＰＭＰ）、超常磁性ナノ粒子（ＳＰＭＮＰ）、超常磁性酸化鉄粒子（ＳＰＩＯＰ）、または超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）であり得る。一部の場合には、ＳＰＭＮＰは、ＳＰＩＯＮであり得る。磁力は、酸化鉄コアによって付与されることもあり、または粒子にグラフトされた酸化鉄結晶よって付与されることもある。一部の場合には、本発明者らは、本明細書において、磁性粒子であるＳＰＭＮＰに言及する。ＳＰＭＮＰをＳＰＭＰになるように合成することもできる。

【0122】

粒子を様々な材料から作製することができる。例えば、粒子をポリマー、脂質、金属、シリカ、タンパク質、核酸、小分子または大分子で作製することができる。例えば、本開示と整合する粒子材料は、金属、金属酸化物、磁性材料、ポリマーおよび脂質を含む。金属材料の例としては、金、銀、銅、ニッケル、コバルト、パラジウム、白金、イリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、レニウム、バナジウム、クロム、マンガン、ニオブ、モリブデン、タングステン、タンタル、鉄およびカドミウム、または米国特許第７７４９２９９号に記載されている任意の他の材料の、いずれか１つまたは任意の組合せが挙げられる。金属酸化物粒子は、酸化鉄粒子または酸化チタン粒子であり得る。磁性粒子は、酸化鉄ナノ粒子であり得る。

【0123】

ポリマーの例としては、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、またはポリアミン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸、もしくはポリカプロラクトン）、ポリスチレン、または２つもしくはそれより多くのポリマーのコポリマー、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）とポリエステル（例えば、ＰＬＧＡ）のコポリマーの、いずれか１つまたは任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、ポリマーは、末端に脂質を有するポリアルキレングリコール、およびポリエステル、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９５４９９０１号において開示されている任意の他の材料である。

【0124】

本開示の粒子を形成するために使用することができる脂質の例としては、カチオン性脂質、アニオン性脂質、および中性電荷を有する脂質が挙げられる。例えば、粒子は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、およびコレステロール、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９４４５９９４号に収載されている任意の他の材料の、いずれか１つまたは任意の組合せで作製され得る。

【0125】

本明細書で開示される粒子パネルは、試料中に存在する特異的サイズのタンパク質の試料採取に特に適している構造を有する特異的粒子型を含み得る。例えば、粒子パネルは、図３７Ａに示されているような中空磁性粒子を含み得る。中空磁性粒子は、中空コアを有するナノ粒子であって、ナノ粒子シェルが、より小さい酸化鉄一次結晶で作製される、ナノ粒子を含む。中空磁性粒子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるCheng, Wei, et al.（"One-step synthesis of superparamagnetic monodisperse porous
Fe₃O₄ hollow and core-shell spheres." Journal of Materials Chemistry 20.9 (2010): 1799-1805）に記載されているような、ＦｅＣｌ_３、クエン酸塩、ポリアクリルアミドまたはポリアクリル酸ナトリウム、および尿素の水熱処理に基づくオートクレーブ反応により合成され得る。より小さい酸化鉄一次結晶で作製されたナノ粒子シェルは、多孔質であり、サイズ排除効果によってナノ粒子の表面でのタンパク質コロナの生成を可能にする。結合表面は、主として細孔の内部にあり、したがって、大きいタンパク質が粒子内に拡散して結合するのを防止することができる。一部の場合には、大きいタンパク質は、それでもやはり、外部に結合し、全コロナに含まれることがあるが、これらの中空粒子は、より小さいタンパク質をより大きいものより濃縮することができる。これらの中空磁性粒子は、本明細書に記載の任意の粒子パネルに含まれることがあり、やはり、磁石を使用して未結合タンパク質から容易に分離される。

【0126】

別の例では、粒子パネルは、図３７Ｂに示されているような、疎水性ポケットを有するナノ粒子を含み得る。疎水性ポケットを有するナノ粒子は、試料中に存在する、特異的溶解度の分子またはタンパク質（例えば、難溶性タンパク質）の試料採取に特に適している。疎水性ポケットを有するナノ粒子は、超常磁性酸化鉄コアの構造を有し、加えてポリマーコーティングを有する。疎水性ポケットを有するナノ粒子は、本明細書の他の箇所で説明されているようなＳＰＩＯＮコア合成のオートクレーブ反応、続いて、ポリ（グリシジルメタクリレート）コーティングを合成するためのフリーラジカル重合を使用して、合成することができる。この後に、ベンジルアミン部分などの疎水性アミンでの表面の合成後修飾が続き得る。疎水性ポケットを有するこれらのナノ粒子は、メタボロミクスのための小分子の捕捉に特によく適している。ナノ粒子の細孔径を、タンパク質を排除するようにモジュレートして、小分子のみが疎水性ポケットと相互作用するものにすることができる。一部の実施形態では、細孔径を合成中に調整することができる。例えば、合成は、粒子を膨潤させて多孔性を生じさせることを含むことがあり、膨潤度は、細孔径に影響を与え得る。別の例として、腐食技術を使用して、より硬い表面を有する粒子型に異なる細孔を作り出すことができる。疎水性ポケットを有するナノ粒子を使用してタンパク質標的の試料採取を行うこともできる。

【0127】

別の例では、粒子パネルは、図３７Ｃに示されているような、卵殻－卵黄型ＳＰＩＯＮマイクロゲルハイブリッドナノ粒子を含み得る。卵殻－卵黄型ＳＰＩＯＮマイクロゲルハイブリッドナノ粒子は、ＳＰＩＯＮ外側およびマイクロゲル内側の構造を有する。卵殻－卵黄型ＳＰＩＯＮマイクロゲルハイブリッドナノ粒子は、Cheng et al.（"One-step synthesis of superparamagnetic monodisperse porous Fe₃O₄ hollow and core-shell spheres." Journal of Materials Chemistry 20.9 (2010): 1799-1805)およびZou et al.（"Facile synthesis of highly water-dispersible and monodispersed Fe 3 O 4 hollow microspheres and their application in water treatment." RSC Advances 3.45 (2013): 23327-23334）に記載されているような、ＦｅＣｌ_３、クエン酸塩、ポリアクリルアミドまたはポリアクリル酸ナトリウム、および尿素の水熱処理に基づくオートクレーブ反応を使用して、合成することができる。合成の第２のステップで、ヒドロゲルが中空ナノ粒子内に形成される。

【0128】

別の例では、粒子パネルは、タンパク質および／またはペプチドを捕捉するように操作されている粒子表面を含み得る。タンパク質の一次層が、粒子表面に最初のコロナを非共有結合によってまたは共有結合によって形成し得る。粒子表面との直接的な非共有結合性相互作用は、イオン結合、疎水結合および水素結合を含み得る。加えて、小さい化学物質で最初に修飾され得るこれらの粒子は、一次タンパク質コロナの形成後、血漿中の他のタンパク質に結合することができる。粒子の表面に存在する化学修飾のモジュレーションを利用して、粒子表面と試料中のペプチドおよび／またはタンパク質との非共有結合性相互作用を調整することができる。代替的にまたは加えて、溶液相組成物（例えば、ｐＨ）をモジュレートして、粒子と試料中のペプチドおよび／またはタンパク質との非共有結合性相互作用を調整することができる。粒子の表面へのタンパク質および／またはペプチドの共有結合性カップリングは、粒子の表面に反応性基（例えば、ＮＨＳエステル、マレイミド、カルボキシレートなど）を導入することにより行うことができる。それ故、ＮＨＳ－エステルを有する粒子は、溶液中の１つまたは複数のタンパク質の試料採取に特に適している可能性がある。あるいは、複合混合物からタンパク質を試料採取することおよびそのタンパク質に結合することができるカップリング試薬は、所与の波長（例えば、ＵＶ）および強度の光子への曝露後にのみタンパク質と反応することができる光開始反応基であり得る。前記光開始反応性基で官能化された粒子を利用する利点としては、（１）粒子を洗浄するステップ中のタンパク質の喪失および／またはより親和性の高いタンパク質による置換に起因するタンパク質の喪失を伴わずに一次タンパク質コロナ内に固定すること、（２）共有結合性連結を結合プロセス中の任意の時点で確立することができるため中等度の結合親和性でタンパク質を捕捉すること、（３）平衡時に生じることになる表面よりも広範囲の表面を生成すること、ならびに（４）定義されたタンパク質混合物を（血漿の代わりに）結合に使用することによってある特定のタンパク質化学量論比を有する表面を生成することを、これらに限定されないが、挙げることができる。定義されたタンパク質混合物は、組換えにより得られたもしくは作製された、または単離され、次いで定義された化学量論比で混合された、タンパク質の任意の合成的に誘導されたまたは精製された混合物であり得る。例えば、タンパク質－タンパク質相互作用のための目的の特定のタンパク質（例えば、ユビキチン）については、定義されたタンパク質混合物は、そのタンパク質の単純溶液であり得る。別の例として、定義されたタンパク質混合物は、目的のある特定のクラスからのタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質）の精製されたまたは濃縮されたセットであり得る。粒子を修飾してクリックケミストリー反応対の半分で官能化することもでき、試料中の非天然点突然変異タンパク質は、クリックケミストリー反応対の残りの半分を有するアミノ酸を含有する。試料中の粒子および他のタンパク質をクリックケミストリー反応対の半分で官能化することができ、試料中の非天然点突然変異タンパク質は、クリックケミストリー反応対の残りの半分を有するアミノ酸を含有する。化学触媒（例えば、銅）または光（例えば、光開始クリックケミストリー試薬）の存在下で反応が行われ、試料中の非天然点突然変異タンパク質への粒子の連結、および／または試料中の非天然点突然変異タンパク質と試料中の他のタンパク質との連結に至る。例えば、この方法は、試料中に濃縮されている突然変異タンパク質を含有し得るタンパク質の単純溶液で開始し得る。これらのシステムの主な利点は、粒子表面を化学量論比、タンパク質／表面配向、およびタンパク質／タンパク質配向に関して操作することができることである。これにより、本明細書の他の箇所で説明されるアッセイステップ（例えば、大規模洗浄）に耐えることができる耐久性のある表面の操作が可能になる。例えば、タンパク質配列内の目的の位置に特異的非天然アミノ酸を有するタンパク質を、Lee et al.（Mol Cells. 2019 May 31;42(5):386-396. doi: 10.14348/molcells.2019.0078.）に記載されてい
るように導入することができる。タンパク質に導入される非天然アミノ酸は、クリックケミストリー対の半分を有することができ、この半分は、粒子の表面でクリックケミストリー対の残りの半分と反応することができる。このようにして、コロナを形成するために粒子の表面へのタンパク質のランダムな吸着ではなく、これらの修飾タンパク質は、粒子の表面に特定の配向で結合することができる。この結果、粒子型の表面に形成するコロナを、操作されたタンパク質を用いて、制御されている特異的３Ｄ配向で調整することができることになる。この同じ一般方法論を使用して、タンパク質複合体を粒子型の表面に連結させることができる。ここで、複合体の１つまたは複数のサブユニットを修飾して共有結合によって互いに連結させ、次いで、粒子型の表面に、第２の合成ステップで連結させることができ、または後の粒子表面修飾プロセスで果たされ得る異なる化学作用を使用して連結させることができる。概略図が図３８に示されている。タンパク質および／またはペプチドを非共有結合によってまたは共有結合によって捕捉するように操作された表面を有する粒子は、それでもやはりＳＰＩＯＮまたはポリマー修飾ＳＰＩＯＮ粒子であり得、これらは、ソルボサーマル法、配位子交換プロセス、シリカコーティングプロセス、および／または特異的試薬カップリング戦略の起動もしくはインストールによる標準的なＳＰＩＯＮ合成を含む、様々な方法で合成することができる。これらのシステムの利点は、生体表面生成、インタラクトームの利用、および方向付けられたコロナの組立てを含む。

【0129】

別の例では、粒子パネルは、ヒストン捕捉のための官能化粒子を含み得る。例えば、これらの粒子は、アニオン性であり得る。加えてまたは代替的に、試料におけるヒストンを濃縮するためにアッセイ条件を最適化することができ、ヒストンおよび翻訳後修飾の質量分析による検出を改善するために標識法を最適化することができる。ヒストン捕捉のためのこれらの官能化粒子は、ポリマー、シリカ、標的配位子、およびまたはこれらの任意の組合せで作製され得る。官能化粒子は、ソルボサーマル法による標準的なＳＰＩＯＮ合成、配位子交換プロセス、表面開始重合を含む、様々な手法を使用して合成することができる。アニオン性粒子表面は、ポリマー、例えばポリカルボキシレート、様々な配位子、例えば、デンドリマー、分岐型配位子、またはカルボキシレート誘導体、および／またはスルファニルアミド酸で表面を官能化することにより、合成することができる。アッセイ条件の最適化は、結合溶液を緩衝して約９のｐＨにすることを含み得る。多くのタンパク質は、このｐＨでアニオン性表面への結合の減少を示すことになるが、ヒストンは、ｐＩ約１１（例えば、Ｈ４＿ヒトｐＩ約１１．３、Ｈ３＿ヒトｐＩ約１１）を有する一次配列を有する塩基性タンパク質であり、これは、ほぼ完全に正に荷電されている状態を維持することになる。結果として、塩基性ｐＨ条件下で、ヒストンは、イオン結合によって粒子表面と強力に相互作用することができ、しがたって、ヒストンを粒子表面に選択的に濃縮することができる。加えて、ヒストン結合タンパク質で粒子表面を修飾することにより、ヒストンを粒子表面に選択的に濃縮することができる。したがって、本明細書で開示される粒子を使用してヒストンタンパク質コロナを得ることができる。標識最適化方法論は、質量分析データの解釈を単純化するのに役立つことができ、翻訳後修飾（ＰＴＭ）の同定および指定の改善を可能にし得る。ヒストンに対する翻訳後修飾の種類、位置および占有率は、様々であり得、遺伝子発現の調節に役立ち得るので、これらの粒子は、試料中のヒストンの選択的濃縮およびＰＴＭの照合に有用であり得、ひいては試料中の遺伝子がどのように調節されることになるのかについての情報を提供することができる。その結果として、これは、遺伝子発現の調節が異常である様々な病状の情報を提供するのに役立ち得る。

【0130】

本開示と整合する粒子型の例は、図２１におよび下記表１に示されている。

【表1】

粒子の特性

【0131】

本開示と整合する粒子は、体液中でのインキュベーション後に広範なサイズでタンパク質コロナを形成する方法において作成および使用することができる。例えば、本明細書で開示される粒子は、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１１００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１３００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１５００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１７００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ、少なくとも１９００ｎｍ、少なくとも２０００ｎｍ、少なくとも２１００ｎｍ、少なくとも２２００ｎｍ、少なくとも２３００ｎｍ、少なくとも２４００ｎｍ、少なくとも２５００ｎｍ、少なくとも２６００ｎｍ、少なくとも２７００ｎｍ、少なくとも２８００ｎｍ、少なくとも２９００ｎｍ、少なくとも３０００ｎｍ、少なくとも３１００ｎｍ、少なくとも３２００ｎｍ、少なくとも３３００ｎｍ、少なくとも３４００ｎｍ、少なくとも３５００ｎｍ、少なくとも３６００ｎｍ、少なくとも３７００ｎｍ、少なくとも３８００ｎｍ、少なくとも３９００ｎｍ、少なくとも４０００ｎｍ、少なくとも４１００ｎｍ、少なくとも４２００ｎｍ、少なくとも４３００ｎｍ、少なくとも４４００ｎｍ、少なくとも４５００ｎｍ、少なくとも４６００ｎｍ、少なくとも４７００ｎｍ、少なくとも４８００ｎｍ、少なくとも４９００ｎｍ、少なくとも５０００ｎｍ、少なくとも５１００ｎｍ、少なくとも５２００ｎｍ、少なくとも５３００ｎｍ、少なくとも５４００ｎｍ、少なくとも５５００ｎｍ、少なくとも５６００ｎｍ、少なくとも５７００ｎｍ、少なくとも５８００ｎｍ、少なくとも５９００ｎｍ、少なくとも６０００ｎｍ、少なくとも６１００ｎｍ、少なくとも６２００ｎｍ、少なくとも６３００ｎｍ、少なくとも６４００ｎｍ、少なくとも６５００ｎｍ、少なくとも６６００ｎｍ、少なくとも６７００ｎｍ、少なくとも６８００ｎｍ、少なくとも６９００ｎｍ、少なくとも７０００ｎｍ、少なくとも７１００ｎｍ、少なくとも７２００ｎｍ、少なくとも７３００ｎｍ、少なくとも７４００ｎｍ、少なくとも７５００ｎｍ、少なくとも７６００ｎｍ、少なくとも７７００ｎｍ、少なくとも７８００ｎｍ、少なくとも７９００ｎｍ、少なくとも８０００ｎｍ、少なくとも８１００ｎｍ、少なくとも８２００ｎｍ、少なくとも８３００ｎｍ、少なくとも８４００ｎｍ、少なくとも８５００ｎｍ、少なくとも８６００ｎｍ、少なくとも８７００ｎｍ、少なくとも８８００ｎｍ、少なくとも８９００ｎｍ、少なくとも９０００ｎｍ、少なくとも９１００ｎｍ、少なくとも９２００ｎｍ、少なくとも９３００ｎｍ、少なくとも９４００ｎｍ、少なくとも９５００ｎｍ、少なくとも９６００ｎｍ、少なくとも９７００ｎｍ、少なくとも９８００ｎｍ、少なくとも９９００ｎｍ、少なくとも１００００ｎｍ、または１０ｎｍ～５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、４００ｎｍ～４５０ｎｍ、４５０ｎｍ～５００ｎｍ、５００ｎｍ～５５０ｎｍ、５５０ｎｍ～６００ｎｍ、６００ｎｍ～６５０ｎｍ、６５０ｎｍ～７００ｎｍ、７００ｎｍ～７５０ｎｍ、７５０ｎｍ～８００ｎｍ、８００ｎｍ～８５０ｎｍ、８５０ｎｍ～９００ｎｍ、１００ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～３５０ｎｍ、２００ｎｍ～４００ｎｍ、２５０ｎｍ～４５０ｎｍ、３００ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～５５０ｎｍ、４００ｎｍ～６００ｎｍ、４５０ｎｍ～６５０ｎｍ、５００ｎｍ～７００ｎｍ、５５０ｎｍ～７５０ｎｍ、６００ｎｍ～８００ｎｍ、６５０ｎｍ～８５０ｎｍ、７００ｎｍ～９００ｎｍ、もしくは１０ｎｍ～９００ｎｍ、１０～１００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、２００～３００ｎｍ、３００～４００ｎｍ、４００～５００ｎｍ、５００～６００ｎｍ、６００～７００ｎｍ、７００～８００ｎｍ、８００～９００ｎｍ、９００～１０００ｎｍ、１０００～１１００ｎｍ、１１００～１２００ｎｍ、１２００～１３００ｎｍ、１３００～１４００ｎｍ、１４００～１５００ｎｍ、１５００～１６００ｎｍ、１６００～１７００ｎｍ、１７００～１８００ｎｍ、１８００～１９００ｎｍ、１９００～２０００ｎｍ、２０００～２１００ｎｍ、２１００～２２００ｎｍ、２２００～２３００ｎｍ、２３００～２４００ｎｍ、２４００～２５００ｎｍ、２５００～２６００ｎｍ、２６００～２７００ｎｍ、２７００～２８００ｎｍ、２８００～２９００ｎｍ、２９００～３０００ｎｍ、３０００～３１００ｎｍ、３１００～３２００ｎｍ、３２００～３３００ｎｍ、３３００～３４００ｎｍ、３４００～３５００ｎｍ、３５００～３６００ｎｍ、３６００～３７００ｎｍ、３７００～３８００ｎｍ、３８００～３９００ｎｍ、３９００～４０００ｎｍ、４０００～４１００ｎｍ、４１００～４２００ｎｍ、４２００～４３００ｎｍ、４３００～４４００ｎｍ、４４００～４５００ｎｍ、４５００～４６００ｎｍ、４６００～４７００ｎｍ、４７００～４８００ｎｍ、４８００～４９００ｎｍ、４９００～５０００ｎｍ、５０００～５１００ｎｍ、５１００～５２００ｎｍ、５２００～５３００ｎｍ、５３００～５４００ｎｍ、５４００～５５００ｎｍ、５５００～５６００ｎｍ、５６００～５７００ｎｍ、５７００～５８００ｎｍ、５８００～５９００ｎｍ、５９００～６０００ｎｍ、６０００～６１００ｎｍ、６１００～６２００ｎｍ、６２００～６３００ｎｍ、６３００～６４００ｎｍ、６４００～６５００ｎｍ、６５００～６６００ｎｍ、６６００～６７００ｎｍ、６７００～６８００ｎｍ、６８００～６９００ｎｍ、６９００～７０００ｎｍ、７０００～７１００ｎｍ、７１００～７２００ｎｍ、７２００～７３００ｎｍ、７３００～７４００ｎｍ、７４００～７５００ｎｍ、７５００～７６００ｎｍ、７６００～７７００ｎｍ、７７００～７８００ｎｍ、７８００～７９００ｎｍ、７９００～８０００ｎｍ、８０００～８１００ｎｍ、８１００～８２００ｎｍ、８２００～８３００ｎｍ、８３００～８４００ｎｍ、８４００～８５００ｎｍ、８５００～８６００ｎｍ、８６００～８７００ｎｍ、８７００～８８００ｎｍ、８８００～８９００ｎｍ、８９００～９０００ｎｍ、９０００～９１００ｎｍ、９１００～９２００ｎｍ、９２００～９３００ｎｍ、９３００～９４００ｎｍ、９４００～９５００ｎｍ、９５００～９６００ｎｍ、９６００～９７００ｎｍ、９７００～９８００ｎｍ、９８００～９９００ｎｍ、９９００～１００００ｎｍの直径を有することができる。直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によってサイズの間接的尺度として測定され得る。ＤＬＳ測定値は、「強度加重」平均であり得、「強度加重」は、この平均値が算出されるサイズ分布に半径の６乗の重みを加えられ得ることを意味する。これは、本明細書では「ｚ平均」または「強度平均値」と呼ばれることもある。

【0132】

あるいは、本明細書で開示される粒子は、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも１０００ｎｍ、少なくとも１１００ｎｍ、少なくとも１２００ｎｍ、少なくとも１３００ｎｍ、少なくとも１４００ｎｍ、少なくとも１５００ｎｍ、少なくとも１６００ｎｍ、少なくとも１７００ｎｍ、少なくとも１８００ｎｍ、少なくとも１９００ｎｍ、少なくとも２０００ｎｍ、少なくとも２１００ｎｍ、少なくとも２２００ｎｍ、少なくとも２３００ｎｍ、少なくとも２４００ｎｍ、少なくとも２５００ｎｍ、少なくとも２６００ｎｍ、少なくとも２７００ｎｍ、少なくとも２８００ｎｍ、少なくとも２９００ｎｍ、少なくとも３０００ｎｍ、少なくとも３１００ｎｍ、少なくとも３２００ｎｍ、少なくとも３３００ｎｍ、少なくとも３４００ｎｍ、少なくとも３５００ｎｍ、少なくとも３６００ｎｍ、少なくとも３７００ｎｍ、少なくとも３８００ｎｍ、少なくとも３９００ｎｍ、少なくとも４０００ｎｍ、少なくとも４１００ｎｍ、少なくとも４２００ｎｍ、少なくとも４３００ｎｍ、少なくとも４４００ｎｍ、少なくとも４５００ｎｍ、少なくとも４６００ｎｍ、少なくとも４７００ｎｍ、少なくとも４８００ｎｍ、少なくとも４９００ｎｍ、少なくとも５０００ｎｍ、少なくとも５１００ｎｍ、少なくとも５２００ｎｍ、少なくとも５３００ｎｍ、少なくとも５４００ｎｍ、少なくとも５５００ｎｍ、少なくとも５６００ｎｍ、少なくとも５７００ｎｍ、少なくとも５８００ｎｍ、少なくとも５９００ｎｍ、少なくとも６０００ｎｍ、少なくとも６１００ｎｍ、少なくとも６２００ｎｍ、少なくとも６３００ｎｍ、少なくとも６４００ｎｍ、少なくとも６５００ｎｍ、少なくとも６６００ｎｍ、少なくとも６７００ｎｍ、少なくとも６８００ｎｍ、少なくとも６９００ｎｍ、少なくとも７０００ｎｍ、少なくとも７１００ｎｍ、少なくとも７２００ｎｍ、少なくとも７３００ｎｍ、少なくとも７４００ｎｍ、少なくとも７５００ｎｍ、少なくとも７６００ｎｍ、少なくとも７７００ｎｍ、少なくとも７８００ｎｍ、少なくとも７９００ｎｍ、少なくとも８０００ｎｍ、少なくとも８１００ｎｍ、少なくとも８２００ｎｍ、少なくとも８３００ｎｍ、少なくとも８４００ｎｍ、少なくとも８５００ｎｍ、少なくとも８６００ｎｍ、少なくとも８７００ｎｍ、少なくとも８８００ｎｍ、少なくとも８９００ｎｍ、少なくとも９０００ｎｍ、少なくとも９１００ｎｍ、少なくとも９２００ｎｍ、少なくとも９３００ｎｍ、少なくとも９４００ｎｍ、少なくとも９５００ｎｍ、少なくとも９６００ｎｍ、少なくとも９７００ｎｍ、少なくとも９８００ｎｍ、少なくとも９９００ｎｍ、少なくとも１００００ｎｍ、または１０ｎｍ～５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、１００ｎｍ～１５０ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍ、２００ｎｍ～２５０ｎｍ、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、３００ｎｍ～３５０ｎｍ、３５０ｎｍ～４００ｎｍ、４００ｎｍ～４５０ｎｍ、４５０ｎｍ～５００ｎｍ、５００ｎｍ～５５０ｎｍ、５５０ｎｍ～６００ｎｍ、６００ｎｍ～６５０ｎｍ、６５０ｎｍ～７００ｎｍ、７００ｎｍ～７５０ｎｍ、７５０ｎｍ～８００ｎｍ、８００ｎｍ～８５０ｎｍ、８５０ｎｍ～９００ｎｍ、１００ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～３５０ｎｍ、２００ｎｍ～４００ｎｍ、２５０ｎｍ～４５０ｎｍ、３００ｎｍ～５００ｎｍ、３５０ｎｍ～５５０ｎｍ、４００ｎｍ～６００ｎｍ、４５０ｎｍ～６５０ｎｍ、５００ｎｍ～７００ｎｍ、５５０ｎｍ～７５０ｎｍ、６００ｎｍ～８００ｎｍ、６５０ｎｍ～８５０ｎｍ、７００ｎｍ～９００ｎｍ、もしくは１０ｎｍ～９００ｎｍ、１０～１００ｎｍ、１００～２００ｎｍ、２００～３００ｎｍ、３００～４００ｎｍ、４００～５００ｎｍ、５００～６００ｎｍ、６００～７００ｎｍ、７００～８００ｎｍ、８００～９００ｎｍ、９００～１０００ｎｍ、１０００～１１００ｎｍ、１１００～１２００ｎｍ、１２００～１３００ｎｍ、１３００～１４００ｎｍ、１４００～１５００ｎｍ、１５００～１６００ｎｍ、１６００～１７００ｎｍ、１７００～１８００ｎｍ、１８００～１９００ｎｍ、１９００～２０００ｎｍ、２０００～２１００ｎｍ、２１００～２２００ｎｍ、２２００～２３００ｎｍ、２３００～２４００ｎｍ、２４００～２５００ｎｍ、２５００～２６００ｎｍ、２６００～２７００ｎｍ、２７００～２８００ｎｍ、２８００～２９００ｎｍ、２９００～３０００ｎｍ、３０００～３１００ｎｍ、３１００～３２００ｎｍ、３２００～３３００ｎｍ、３３００～３４００ｎｍ、３４００～３５００ｎｍ、３５００～３６００ｎｍ、３６００～３７００ｎｍ、３７００～３８００ｎｍ、３８００～３９００ｎｍ、３９００～４０００ｎｍ、４０００～４１００ｎｍ、４１００～４２００ｎｍ、４２００～４３００ｎｍ、４３００～４４００ｎｍ、４４００～４５００ｎｍ、４５００～４６００ｎｍ、４６００～４７００ｎｍ、４７００～４８００ｎｍ、４８００～４９００ｎｍ、４９００～５０００ｎｍ、５０００～５１００ｎｍ、５１００～５２００ｎｍ、５２００～５３００ｎｍ、５３００～５４００ｎｍ、５４００～５５００ｎｍ、５５００～５６００ｎｍ、５６００～５７００ｎｍ、５７００～５８００ｎｍ、５８００～５９００ｎｍ、５９００～６０００ｎｍ、６０００～６１００ｎｍ、６１００～６２００ｎｍ、６２００～６３００ｎｍ、６３００～６４００ｎｍ、６４００～６５００ｎｍ、６５００～６６００ｎｍ、６６００～６７００ｎｍ、６７００～６８００ｎｍ、６８００～６９００ｎｍ、６９００～７０００ｎｍ、７０００～７１００ｎｍ、７１００～７２００ｎｍ、７２００～７３００ｎｍ、７３００～７４００ｎｍ、７４００～７５００ｎｍ、７５００～７６００ｎｍ、７６００～７７００ｎｍ、７７００～７８００ｎｍ、７８００～７９００ｎｍ、７９００～８０００ｎｍ、８０００～８１００ｎｍ、８１００～８２００ｎｍ、８２００～８３００ｎｍ、８３００～８４００ｎｍ、８４００～８５００ｎｍ、８５００～８６００ｎｍ、８６００～８７００ｎｍ、８７００～８８００ｎｍ、８８００～８９００ｎｍ、８９００～９０００ｎｍ、９０００～９１００ｎｍ、９１００～９２００ｎｍ、９２００～９３００ｎｍ、９３００～９４００ｎｍ、９４００～９５００ｎｍ、９５００～９６００ｎｍ、９６００～９７００ｎｍ、９７００～９８００ｎｍ、９８００～９９００ｎｍ、９９００～１００００ｎｍの半径を有することができる。

【0133】

ある特定の例では、本明細書で開示される粒子は、１００ｎｍ～４００ｎｍの直径を有する。他の例では、本明細書で開示される粒子は、１００ｎｍ～４００ｎｍの半径を有する。粒子サイズは、動的光散乱または電子顕微鏡法（例えば、ＳＥＭ、ＴＥＭ）などのいくつかの技法によって判定され得る。本明細書で開示される粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子であり得る。

【0134】

加えて、粒子は、均一なサイズ分布を有することもあり、または不均一なサイズ分布を有することもある。動的光散乱などの技法によって測定され得る多分散指数（ＰＤＩ）は、サイズ分布の尺度である。低いＰＤＩは、より均一なサイズ分布を示し、より高いＰＤＩは、より不均一なサイズ分布を示す。例えば、本明細書で開示される粒子は、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１５未満、または０．１未満のＰＤＩを有することができる。特定の実施形態では、本明細書で開示される粒子は、０．１未満のＰＤＩを有する。

【0135】

本明細書で開示される粒子は、ある範囲の異なる表面電荷を有することができる。粒子は、負に荷電されていることもあり、正に荷電されていることもあり、または電荷的に中性であることもある。一部の実施形態では、粒子は、－５００ｍＶ～－４５０ｍＶ、－４５０ｍＶ～－４００ｍＶ、－４００ｍＶ～－３５０ｍＶ、－３５０ｍＶ～－３００ｍＶ、－３００ｍＶ～－２５０ｍＶ、－２５０ｍＶ～－２００ｍＶ、－２００ｍＶ～－１５０ｍＶ、－１５０ｍＶ～－１００ｍＶ、－１００ｍＶ～－９０ｍＶ、－９０ｍＶ～－８０ｍＶ、－８０ｍＶ～－７０ｍＶ、－７０ｍＶ～－６０ｍＶ、－６０ｍＶ～－５０ｍＶ、－５０ｍＶ～－４０ｍＶ、－４０ｍＶ～－３０ｍＶ、－３０ｍＶ～－２０ｍＶ、－２０ｍＶ～－１０ｍＶ、－１０ｍＶ～０ｍＶ、０ｍＶ～１０ｍＶ、１０ｍＶ～２０ｍＶ、２０ｍＶ～３０ｍＶ、３０ｍＶ～４０ｍＶ、４０ｍＶ～５０ｍＶ、５０ｍＶ～６０ｍＶ、６０ｍＶ～７０ｍＶ、７０ｍＶ～８０ｍＶ、８０ｍＶ～９０ｍＶ、９０ｍＶ～１００ｍＶ、１００ｍＶ～１１０ｍＶ、１１０ｍＶ～１２０ｍＶ、１２０ｍＶ～１３０ｍＶ、１３０ｍＶ～１４０ｍＶ、１４０ｍＶ～１５０ｍＶ、１５０ｍＶ～２００ｍＶ、２００ｍＶ～２５０ｍＶ、２５０ｍＶ～３００ｍＶ、３００ｍＶ～３５０ｍＶ、３５０ｍＶ～４００ｍＶ、４００ｍＶ～４５０ｍＶ、４５０ｍＶ～５００ｍＶ、－５００ｍＶ～－４００ｍＶ、－４００ｍＶ～－３００ｍＶ、－３００ｍＶ～－２００ｍＶ、－２００ｍＶ～－１００ｍＶ、－１００ｍＶ～０ｍＶ、０ｍＶ～１００ｍＶ、１００ｍＶ～２００ｍＶ、２００ｍＶ～３００ｍＶ、３００ｍＶ～４００ｍＶ、または４００ｍＶ～５００ｍＶの表面電荷を有する。特定の例では、本明細書で開示される粒子は、－６０ｍＶ～６０ｍＶの表面電荷を有する。

【0136】

様々な粒子形態が、本開示のパネル内の粒子型と整合する。例えば、粒子は、球状、コロイド状、立方体形、正方形、ロッド、ワイヤ、円錐、ピラミッド形および楕円形であり得る。本開示の粒子は、固体粒子、多孔質粒子、またはメソ多孔質粒子であり得る。粒子は、小さい表面積を有することもあり、または大きい表面積を有することもある。粒子は、様々な磁気特性を有することがあり、これは、外部場に応じて磁力を決定するＳＱＵＩＤによって測定することができる。一部の場合には、粒子は、コア－シェル構造または卵黄－卵殻構造を有する。
粒子パネル

【0137】

本明細書で開示される粒子パネルを使用して、本明細書に記載のプロテオグラフワークフロー（粒子パネル内の別個の粒子型に対応する別個の生体分子コロナのＭＳ分析）を使用していくつかのタンパク質、ペプチド、またはタンパク質群を同定することができる。特徴強度は、本明細書で開示される場合、試料の質量分析実行からの質量対電荷比の強度に対するプロットに見られる明確に異なるスパイクの強度（「特徴」）を指す。これらの特徴は、ペプチドおよび／またはタンパク質の可変的にイオン化される断片に相当することもある。本明細書に記載のデータ解析方法を使用して、特徴強度をタンパク質群に選別することができる。タンパク質群は、共有ペプチド配列により同定される２つまたはそれより多くのタンパク質を指す。あるいは、タンパク質群は、一意の識別配列を使用して同定される１つのタンパク質を指すこともある。例えば、試料中の、２つのタンパク質（プロテイン１：ＸＹＺＺＸ、およびプロテイン２：ＸＹＺＹＺ）間で共有されるペプチド配列がアッセイされる場合、タンパク質群は、２つのメンバー（タンパク質１およびタンパク質２）を有する「ＸＹＺタンパク質群」であり得る。あるいは、ペプチド配列が、単一のタンパク質（プロテイン１）に特有である場合、タンパク質群は、１つのメンバー（プロテイン１）を有する「ＺＺＸ」タンパク質群であり得るだろう。各タンパク質群は、１つより多くのペプチド配列によって支持され得る。本開示に従って検出または同定されるタンパク質は、試料中の検出される別個のタンパク質（例えば、質量分析を使用して検出される他のタンパク質に対して明確に異なる）を指すことがある。したがって、粒子パネル内の別個の粒子型に対応する別個のコロナ中に存在するタンパク質の分析は、多数の特徴強度をもたらす。この数は、特徴強度が別個のペプチドへと処理されると減少し、さらに、別個のペプチドが別個のタンパク質へと処理されると減少し、さらに、ペプチドがタンパク質群（別個のペプチド配列を共有する２つまたはそれより多くのタンパク質）に群化されると減少する。

【0138】

本明細書で開示される粒子パネルを使用して、少なくとも、少なくとも１００のタンパク質、少なくとも２００のタンパク質、少なくとも３００のタンパク質、少なくとも４００のタンパク質、少なくとも５００のタンパク質、少なくとも６００のタンパク質、少なくとも７００のタンパク質、少なくとも８００のタンパク質、少なくとも９００のタンパク質、少なくとも１０００のタンパク質、少なくとも１１００のタンパク質、少なくとも１２００のタンパク質、少なくとも１３００のタンパク質、少なくとも１４００のタンパク質、少なくとも１５００のタンパク質、少なくとも１６００のタンパク質、少なくとも１７００のタンパク質、少なくとも１８００のタンパク質、少なくとも１９００のタンパク質、少なくとも２０００のタンパク質、少なくとも２１００のタンパク質、少なくとも２２００のタンパク質、少なくとも２３００のタンパク質、少なくとも２４００のタンパク質、少なくとも２５００のタンパク質、少なくとも２６００のタンパク質、少なくとも２７００のタンパク質、少なくとも２８００のタンパク質、少なくとも２９００のタンパク質、少なくとも３０００のタンパク質、少なくとも３１００のタンパク質、少なくとも３２００のタンパク質、少なくとも３３００のタンパク質、少なくとも３４００のタンパク質、少なくとも３５００のタンパク質、少なくとも３６００のタンパク質、少なくとも３７００のタンパク質、少なくとも３８００のタンパク質、少なくとも３９００のタンパク質、少なくとも４０００のタンパク質、少なくとも４１００のタンパク質、少なくとも４２００のタンパク質、少なくとも４３００のタンパク質、少なくとも４４００のタンパク質、少なくとも４５００のタンパク質、少なくとも４６００のタンパク質、少なくとも４７００のタンパク質、少なくとも４８００のタンパク質、少なくとも４９００のタンパク質、少なくとも５０００のタンパク質、少なくとも１００００のタンパク質、少なくとも２００００のタンパク質、少なくとも５００００のタンパク質、少なくとも１０００００のタンパク質、１００～５０００のタンパク質、２００～４７００のタンパク質、３００～４４００のタンパク質、４００～４１００のタンパク質、５００～３８００のタンパク質、６００～３５００のタンパク質、７００～３２００のタンパク質、８００～２９００のタンパク質、９００～２６００のタンパク質、１０００～２３００のタンパク質、１０００～３０００のタンパク質、３０００～４０００のタンパク質、４０００～５０００のタンパク質、５０００～６０００のタンパク質、６０００～７０００のタンパク質、７０００～８０００のタンパク質、８０００～９０００のタンパク質、９０００～１００００のタンパク質、１００００～１１０００のタンパク質、１１０００～１２０００のタンパク質、１２０００～１３０００のタンパク質、１３０００～１４０００のタンパク質、１４０００～１５０００のタンパク質、１５０００～１６０００のタンパク質、１６０００～１７０００のタンパク質、１７０００～１８０００のタンパク質、１８０００～１９０００のタンパク質、１９０００～２００００のタンパク質、２００００～２５０００のタンパク質、２５０００～３００００のタンパク質、１００００～２００００のタンパク質、１００００～５００００のタンパク質、２００００～１０００００のタンパク質、２０００～２００００のタンパク質、１８００～２００００のタンパク質、または１００００～１０００００のタンパク質を同定することができる。

【0139】

本明細書で開示される粒子パネルを使用して、少なくとも、少なくとも１００のタンパク質群、少なくとも２００のタンパク質群、少なくとも３００のタンパク質群、少なくとも４００のタンパク質群、少なくとも５００のタンパク質群、少なくとも６００のタンパク質群、少なくとも７００のタンパク質群、少なくとも８００のタンパク質群、少なくとも９００のタンパク質群、少なくとも１０００のタンパク質群、少なくとも１１００のタンパク質群、少なくとも１２００のタンパク質群、少なくとも１３００のタンパク質群、少なくとも１４００のタンパク質群、少なくとも１５００のタンパク質群、少なくとも１６００のタンパク質群、少なくとも１７００のタンパク質群、少なくとも１８００のタンパク質群、少なくとも１９００のタンパク質群、少なくとも２０００のタンパク質群、少なくとも２１００のタンパク質群、少なくとも２２００のタンパク質群、少なくとも２３００のタンパク質群、少なくとも２４００のタンパク質群、少なくとも２５００のタンパク質群、少なくとも２６００のタンパク質群、少なくとも２７００のタンパク質群、少なくとも２８００のタンパク質群、少なくとも２９００のタンパク質群、少なくとも３０００のタンパク質群、少なくとも３１００のタンパク質群、少なくとも３２００のタンパク質群、少なくとも３３００のタンパク質群、少なくとも３４００のタンパク質群、少なくとも３５００のタンパク質群、少なくとも３６００のタンパク質群、少なくとも３７００のタンパク質群、少なくとも３８００のタンパク質群、少なくとも３９００のタンパク質群、少なくとも４０００のタンパク質群、少なくとも４１００のタンパク質群、少なくとも４２００のタンパク質群、少なくとも４３００のタンパク質群、少なくとも４４００のタンパク質群、少なくとも４５００のタンパク質群、少なくとも４６００のタンパク質群、少なくとも４７００のタンパク質群、少なくとも４８００のタンパク質群、少なくとも４９００のタンパク質群、少なくとも５０００のタンパク質群、少なくとも１００００のタンパク質群、少なくとも２００００のタンパク質群、少なくとも１０００００のタンパク質群、１００～５０００のタンパク質群、２００～４７００のタンパク質群、３００～４４００のタンパク質群、４００～４１００のタンパク質群、５００～３８００のタンパク質群、６００～３５００のタンパク質群、７００～３２００のタンパク質群、８００～２９００のタンパク質群、９００～２６００のタンパク質群、１０００～２３００のタンパク質群、１０００～３０００のタンパク質群、３０００～４０００のタンパク質群、４０００～５０００のタンパク質群、５０００～６０００のタンパク質群、６０００～７０００のタンパク質群、７０００～８０００のタンパク質群、８０００～９０００のタンパク質群、９０００～１００００のタンパク質群、１００００～１１０００のタンパク質群、１１０００～１２０００のタンパク質群、１２０００～１３０００のタンパク質群、１３０００～１４０００のタンパク質群、１４０００～１５０００のタンパク質群、１５０００～１６０００のタンパク質群、１６０００～１７０００のタンパク質群、１７０００～１８０００のタンパク質群、１８０００～１９０００のタンパク質群、１９０００～２００００のタンパク質群、２００００～２５０００のタンパク質群、２５０００～３００００のタンパク質群、１００００～２００００のタンパク質群、１００００～５００００のタンパク質群、２００００～１０００００のタンパク質群、２０００～２００００のタンパク質群、１８００～２００００のタンパク質群、または１００００～１０００００のタンパク質群を同定することができる。

【0140】

本明細書で開示される粒子パネルを使用して、本明細書で開示される別個のタンパク質の数および／または本明細書で開示される特異的タンパク質のいずれかの数を広いダイナミックレンジにわたって同定することができる。例えば、別個の粒子型を含む本明細書で開示される粒子パネルは、試料中のタンパク質を濃縮することができ、これらのタンパク質を、プロテオグラフワークフローを使用して、タンパク質が試料（例えば、血漿試料）中に存在するダイナミックレンジ全体にわたって、同定することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも２のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも３のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも４のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも５のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも６のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも７のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも８のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも９のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１１のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１２のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１３のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１４のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも１５のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、少なくとも２０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、２～１００のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、２～２０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、２～１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、２～５のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、５～１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を濃縮し、同定する。

【0141】

本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、単一のタンパク質またはタンパク質群を濃縮し、同定する。一部の実施形態では、単一のタンパク質またはタンパク質群は、異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を含み得る。例えば、粒子パネル内の第１の粒子型は、第１の翻訳後修飾を有するタンパク質またはタンパク質群を濃縮することができ、粒子パネル内の第２の粒子型は、第２の翻訳後修飾を有する同じタンパク質または同じタンパク質群を濃縮することができ、粒子パネル内の第３の粒子型は、翻訳後修飾を欠いている同じタンパク質または同じタンパク質群を濃縮することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される任意の数の別個の粒子型を含む粒子パネルは、単一のタンパク質またはタンパク質群の異なるドメイン、配列またはエピトープに結合することにより、単一のタンパク質またはタンパク質群を濃縮し、同定する。例えば、粒子パネル内の第１の粒子型は、タンパク質またはタンパク質群の第１のドメインに結合することによりタンパク質またはタンパク質を濃縮することができ、粒子パネル内の第２の粒子型は、タンパク質またはタンパク質群の第２のドメインに結合することにより同じタンパク質または同じタンパク質群を濃縮することができる。

【0142】

一部の実施形態では、粒子パネルは、１つより多くの粒子型を有することができる。パネル内の粒子型の数を増加させることは、所与の試料中で同定され得るタンパク質の数を増加させる方法であり得る。パネルサイズを増加させることが、同定されるタンパク質の数をどの程度増加させ得るのかについての例は、図１１に示されている。例えば、図１１に示されているように、１粒子型のパネルサイズは、４１９のユニークタンパク質を同定し、２粒子型のパネルサイズは、５８８タンパク質を同定し、３粒子型のパネルサイズは、７２７タンパク質を同定し、４粒子型のパネルサイズは、８４４タンパク質を同定し、５粒子型のパネルサイズは、９３４タンパク質を同定し、６粒子型のパネルサイズは、１００８タンパク質を同定し、７粒子型のパネルサイズは、１０７５タンパク質を同定し、８粒子型のパネルサイズは、１１３３タンパク質を同定し、９粒子型のパネルサイズは、１１８４タンパク質を同定し、１０粒子型のパネルサイズは、１２３０タンパク質を同定し、１１粒子型のパネルサイズは、１２７５タンパク質を同定し、１２粒子型のパネルサイズは、１３１８タンパク質を同定した。粒子型は、ナノ粒子型を含み得る。

【0143】

一部の実施形態では、１粒子型のパネルサイズは、２００～６００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、２粒子型のパネルサイズは、３００～７００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、３粒子型のパネルサイズは、５００～９００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、４粒子型のパネルサイズは、６００～１０００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、５粒子型のパネルサイズは、７００～１１００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、６粒子型のパネルサイズは、８００～１２００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、７粒子型のパネルサイズは、８５０～１２５０のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、８粒子型のパネルサイズは、９００～１３００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、９粒子型のパネルサイズは、９５０～１３５０のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、１０粒子型のパネルサイズは、１０００～１４００のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、１１粒子型のパネルサイズは、１０５０～１４５０のユニークタンパク質を同定できる。一部の実施形態では、１２粒子型のパネルサイズは、１１００～１５００のユニークタンパク質を同定できる。粒子型は、ナノ粒子型を含み得る。

【0144】

本開示は、１００を超える異なる表面化学構造および５０を超える多様な物理的特性を有する、２００を超える別個の粒子型を提供する。別個の粒子型は、第１の粒子型と第２の粒子型とで異なる少なくとも１つの物理化学的特性を有する。例えば、本開示は、少なくとも２つの別個の粒子型、少なくとも３つの別個の粒子型、少なくとも４つの別個の粒子型、少なくとも５つの別個の粒子型、少なくとも６つの別個の粒子型、少なくとも７つの別個の粒子型、少なくとも８つの別個の粒子型、少なくとも９つの別個の粒子型、少なくとも１０の別個の粒子型、少なくとも１１の別個の粒子型、少なくとも１２の別個の粒子型、少なくとも１３の別個の粒子型、少なくとも１４の別個の粒子型、少なくとも１５の別個の粒子型、少なくとも２０の別個の粒子型、少なくとも２５の別個の粒子型、少なくとも３０の別個の粒子型、少なくとも３５の別個の粒子型、少なくとも４０の別個の粒子型、少なくとも４５の別個の粒子型、少なくとも５０の別個の粒子型、少なくとも１００の別個の粒子型、少なくとも１５０の別個の粒子型、少なくとも２００の別個の粒子型、少なくとも２５０の別個の粒子型、少なくとも３００の別個の粒子型、少なくとも３５０の別個の粒子型、少なくとも４００の別個の粒子型、少なくとも４５０の別個の粒子型、少なくとも５００の別個の粒子型、２～５００の別個の粒子型、２～５の別個の粒子型、５～１０の別個の粒子型、１０～１５の別個の粒子型、１５～２０の別個の粒子型、２０～４０の別個の粒子型、４０～６０の別個の粒子型、６０～８０の別個の粒子型、８０～１００の別個の粒子型、１００～５００の別個の粒子型、４～１５の別個の粒子型、または２～２０の別個の粒子型を有する、粒子パネルを提供する。粒子型は、ナノ粒子型を含み得る。

【0145】

一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの粒子の別個の型、少なくとも２つの別個の粒子型、少なくとも３つの別個の粒子型、少なくとも４つの別個の粒子型、少なくとも５つの別個の粒子型、少なくとも６つの別個の粒子型、少なくとも７つの別個の粒子型、少なくとも８つの別個の粒子型、少なくとも９つの別個の粒子型、少なくとも１０の別個の粒子型、少なくとも１１の別個の粒子型、少なくとも１２の別個の粒子型、少なくとも１３の別個の粒子型、少なくとも１４の別個の粒子型、少なくとも１５の別個の粒子型、少なくとも１６の別個の粒子型、少なくとも１７の別個の粒子型、少なくとも１８の別個の粒子型、少なくとも１９の別個の粒子型、少なくとも２０の別個の粒子型、少なくとも２５の別個の粒子型、少なくとも３０の別個の粒子型、少なくとも３５の別個の粒子型、少なくとも４０の別個の粒子型、少なくとも４５の別個の粒子型、少なくとも５０の別個の粒子型、少なくとも５５の別個の粒子型、少なくとも６０の別個の粒子型、少なくとも６５の別個の粒子型、少なくとも７０の別個の粒子型、少なくとも７５の別個の粒子型、少なくとも８０の別個の粒子型、少なくとも８５の別個の粒子型、少なくとも９０の別個の粒子型、少なくとも９５の別個の粒子型、少なくとも１００の別個の粒子型、１～５の別個の粒子型、５～１０の別個の粒子型、１０～１５の別個の粒子型、１５～２０の別個の粒子型、２０～２５の別個の粒子型、２５～３０の別個の粒子型、３０～３５の別個の粒子型、３５～４０の別個の粒子型、４０～４５の別個の粒子型、４５～５０の別個の粒子型、５０～５５の別個の粒子型、５５～６０の別個の粒子型、６０～６５の別個の粒子型、６５～７０の別個の粒子型、７０～７５の別個の粒子型、７５～８０の別個の粒子型、８０～８５の別個の粒子型、８５～９０の別個の粒子型、９０～９５の別個の粒子型、９５～１００の別個の粒子型、１～１００の別個の粒子型、２０～４０の別個の粒子型、５～１０の別個の粒子型、３～７の別個の粒子型、２～１０の別個の粒子型、６～１５の別個の粒子型、または１０～２０の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、３～１０の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、４～１１の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、５～１５の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、５～１５の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、８～１２の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は、９～１３の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。特定の実施形態では、本開示は１０の別個の粒子型のパネルサイズを提供する。粒子型は、ナノ粒子型を含み得る。

【0146】

例えば、本開示は、少なくとも２つの別個の粒子型、少なくとも３つの異なる表面化学構造、少なくとも４つの異なる表面化学構造、少なくとも５つの異なる表面化学構造、少なくとも６つの異なる表面化学構造、少なくとも７つの異なる表面化学構造、少なくとも８つの異なる表面化学構造、少なくとも９つの異なる表面化学構造、少なくとも１０の異なる表面化学構造、少なくとも１１の異なる表面化学構造、少なくとも１２の異なる表面化学構造、少なくとも１３の異なる表面化学構造、少なくとも１４の異なる表面化学構造、少なくとも１５の異なる表面化学構造、少なくとも２０の異なる表面化学構造、少なくとも２５の異なる表面化学構造、少なくとも３０の異なる表面化学構造、少なくとも３５の異なる表面化学構造、少なくとも４０の異なる表面化学構造、少なくとも４５の異なる表面化学構造、少なくとも５０の異なる表面化学構造、少なくとも１００の異なる表面化学構造、少なくとも１５０の異なる表面化学構造、少なくとも２００の異なる表面化学構造、少なくとも２５０の異なる表面化学構造、少なくとも３００の異なる表面化学構造、少なくとも３５０の異なる表面化学構造、少なくとも４００の異なる表面化学構造、少なくとも４５０の異なる表面化学構造、少なくとも５００の異なる表面化学構造、２～５００の異なる表面化学構造、２～５の異なる表面化学構造、５～１０の異なる表面化学構造、１０～１５の異なる表面化学構造、１５～２０の異なる表面化学構造、２０～４０の異なる表面化学構造、４０～６０の異なる表面化学構造、６０～８０の異なる表面化学構造、８０～１００の異なる表面化学構造、１００～５００の異なる表面化学構造、４～１５の異なる表面化学構造、または２～２０の異なる表面化学構造を有する、粒子パネルを提供する。

【0147】

本開示は、少なくとも２つの異なる表面化学構造、少なくとも３つの異なる表面化学構造、少なくとも４つの異なる表面化学構造、少なくとも５つの異なる表面化学構造、少なくとも６つの異なる表面化学構造、少なくとも７つの異なる表面化学構造、少なくとも８つの異なる表面化学構造、少なくとも９つの異なる表面化学構造、少なくとも１０の異なる表面化学構造、少なくとも１１の異なる表面化学構造、少なくとも１２の異なる表面化学構造、少なくとも１３の異なる表面化学構造、少なくとも１４の異なる表面化学構造、少なくとも１５の異なる表面化学構造、少なくとも２０の異なる表面化学構造、少なくとも２５の異なる表面化学構造、少なくとも３０の異なる表面化学構造、少なくとも３５の異なる表面化学構造、少なくとも４０の異なる表面化学構造、少なくとも４５の異なる表面化学構造、少なくとも５０の異なる表面化学構造、少なくとも１００の異なる表面化学構造、少なくとも１５０の異なる表面化学構造、少なくとも２００の異なる表面化学構造、少なくとも２５０の異なる表面化学構造、少なくとも３００の異なる表面化学構造、少なくとも３５０の異なる表面化学構造、少なくとも４００の異なる表面化学構造、少なくとも４５０の異なる表面化学構造、少なくとも５００の異なる表面化学構造、２～５００の異なる表面化学構造、２～５の異なる表面化学構造、５～１０の異なる表面化学構造、１０～１５の異なる表面化学構造、１５～２０の異なる表面化学構造、２０～４０の異なる表面化学構造、４０～６０の異なる表面化学構造、６０～８０の異なる表面化学構造、８０～１００の異なる表面化学構造、１００～５００の異なる表面化学構造、４～１５の異なる表面化学構造、または２～２０の異なる表面化学構造を有する、粒子パネルを提供する。

【0148】

本開示は、少なくとも２つの異なる物理的特性、少なくとも３つの異なる物理的特性、少なくとも４つの異なる物理的特性、少なくとも５つの異なる物理的特性、少なくとも６つの異なる物理的特性、少なくとも７つの異なる物理的特性、少なくとも８つの異なる物理的特性、少なくとも９つの異なる物理的特性、少なくとも１０の異なる物理的特性、少なくとも１１の異なる物理的特性、少なくとも１２の異なる物理的特性、少なくとも１３の異なる物理的特性、少なくとも１４の異なる物理的特性、少なくとも１５の異なる物理的特性、少なくとも２０の異なる物理的特性、少なくとも２５の異なる物理的特性、少なくとも３０の異なる物理的特性、少なくとも３５の異なる物理的特性、少なくとも４０の異なる物理的特性、少なくとも４５の異なる物理的特性、少なくとも５０の異なる物理的特性、少なくとも１００の異なる物理的特性、少なくとも１５０の異なる物理的特性、少なくとも２００の異なる物理的特性、少なくとも２５０の異なる物理的特性、少なくとも３００の異なる物理的特性、少なくとも３５０の異なる物理的特性、少なくとも４００の異なる物理的特性、少なくとも４５０の異なる物理的特性、少なくとも５００の異なる物理的特性、２～５００の異なる物理的特性、２～５の異なる物理的特性、５～１０の異なる物理的特性、１０～１５の異なる物理的特性、１５～２０の異なる物理的特性、２０～４０の異なる物理的特性、４０～６０の異なる物理的特性、６０～８０の異なる物理的特性、８０～１００の異なる物理的特性、１００～５００の異なる物理的特性、４～１５の異なる物理的特性、または２～２０の異なる物理的特性を有する、粒子パネルを提供する。

【0149】

一部の実施形態では、タンパク質を最適に同定するおよびバイオマーカーを疾患と最適に関連付けるパネルは、表１に記載の粒子型から選択されるパネルを含む。例えば、タンパク質を最適に同定するおよびバイオマーカーを疾患と最適に関連付けるパネルは、ＳＰ－３３９、ＨＸ７４、ＳＰ－３５６、ＳＰ－３３３、ＨＸ２０、ＳＰ－３７４、ＨＸ４２、ＳＰ－００３、ＳＰ－００７、およびＳＰ－０１１を含むパネルを含む。試料中の多数のタンパク質（例えば、１５００より多くのタンパク質）を同定するのに特に好適な粒子パネルは、アッセイにおける５～１０の別個の粒子型を含む。粒子パネルに含まれる別個の粒子型の数を特異的応用（例えば、タンパク質の特定のサブセットの検出、または特定の疾患に関連するマーカーの群の検出）向けに調整することができる。一部の実施形態では、タンパク質を最適に同定するおよびバイオマーカーを疾患と最適に関連付ける物理化学的に別個の粒子型を有するパネルは、シリカコーティングが施されているＳＰＩＯＮ、アクリルアミドに基づくＳＰＩＯＮ、およびアクリレートに基づくＳＰＩＯＮＳを含む。例えば、本明細書で開示される粒子のパネルであって、高い感度および特異度でバイオマーカーおよび疾患と関連付けることができる情報が豊富なプロテオームデータを、それらのタンパク質コロナによって生成するパネルは、シリカコーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００３）、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００７）、およびポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－０１１）を含む。

【0150】

一部の実施形態では、試料調製およびＬＣ－ＭＳを含む、単一のプール血漿からの全アッセイ時間は、約８時間であり得る。一部の実施形態では、試料調製およびＬＣ－ＭＳを含む、単一のプール血漿からの全アッセイ時間は、約少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、少なくとも５分～１０分、少なくとも１０分～２０分、少なくとも２０分～３０分、少なくとも３０分～４０分、少なくとも４０分～５０分、少なくとも５０分～６０分、少なくとも１時間～１．５時間、少なくとも１．５時間～２時間、少なくとも２時間～２．５時間、少なくとも２．５時間～３時間、少なくとも３時間～３．５時間、少なくとも３．５時間～４時間、少なくとも４時間～４．５時間、少なくとも４．５時間～５時間、少なくとも５時間～５．５時間、少なくとも５．５時間～６時間、少なくとも６時間～６．５時間、少なくとも６．５時間～７時間、少なくとも７時間～７．５時間、少なくとも７．５時間～８時間、少なくとも８時間～８．５時間、少なくとも８．５時間～９時間、少なくとも９時間～９．５時間、または少なくとも９．５時間～１０時間であり得る。
早期検出

【0151】

本明細書に記載のパネルおよびそれらの使用方法は、対象からの試料中の、特定の病状と一致する、マーカーの検出に使用することができる。図１８Ａおよび図１８Ｂに示されているように、早期がんを症状発症の８年前までに分離することができる。ゴレスタンコホートは、２００４年～２００８年の間に健常対象５０，０００名を登録した。図１８Ａに示されているように、登録からの保存血漿を試験した。登録の８年後、患者おおよそ１０００名は、がんを発症した。図１８Ｂは、保存血漿からの３種のがん（脳、肺および膵臓がん）の分類が主成分分析により分類されることを示す。ここでは、コロナ結果は、３つの別個の統計母集団を示す３つの主成分軸に対してプロットされている。登録日からの保存血漿のコロナ解析（複数のタンパク質をプロファイルするために複数の特性の測定を含む）は、検査した対象１５名（３種のがん各々について患者５名）のうちの１５名についてがんを正確に分類した。一部の実施形態では、本開示のパネルを使用して、病状を、その病状の症状の発症の１年前までに、２年前までに、３年前までに、４年前までに、５年前までに、６年前までに、７年前までに、８年前までに、９年前までに、１０年前までに、１５年前までに、２０年前までに、または２５年前までに診断することができる。

【0152】

本開示のパネルを使用して、所与の試料において広範な病状を検出することができる。例えば、本開示のパネルを使用してがんを検出することができる。がんは、脳がん、肺がん、膵臓がん、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、または膵臓がんであり得る。これらのがんのコロナ解析シグナルは、図１７Ｂおよび図１８に示されている。

【0153】

加えて、本開示のパネルを使用して、以下のものを含む他のがん、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｔｙｐｅｓに列挙されているがんのいずれか１つを、検出することができる：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄系白血病（ＡＭＬ）、青年のがん；副腎皮質癌；小児副腎皮質癌；珍しい小児がん；ＡＩＤＳ関連がん；カポジ肉腫（軟部組織肉腫）；ＡＩＤＳ関連リンパ腫（リンパ腫）；原発性ＣＮＳリンパ腫（リンパ腫）；肛門がん；虫垂がん－消化管カルチノイド腫瘍を参照されたい；星細胞腫、小児期（脳がん）；非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児期、中枢神経系（脳がん）；皮膚基底細胞癌－皮膚がんを参照されたい；胆管がん；膀胱がん；小児膀胱がん；骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）；脳腫瘍；乳がん；小児乳がん；気管支腫瘍、小児期；バーキットリンパ腫－非ホジキンリンパ腫を参照されたい；カルチノイド腫瘍（消化管）；小児カルチノイド腫瘍；原因不明の癌；原因不明の小児癌；心臓（cardiac）（心臓（heart））腫瘍、小児期；中枢神経系；非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児期（脳がん）；胚芽腫、小児期（脳がん）；胚細胞腫瘍、小児期（脳がん）；原発性ＣＮＳリンパ腫；子宮頸がん；小児子宮頸がん；小児がん；小児期の珍しいがん；胆管癌－胆管がんを参照されたい；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性新生物；結腸直腸がん；小児結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫、小児期（脳がん）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫－リンパ腫（菌状息肉症およびセザリー症候群）を参照されたい；非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）－乳がんを参照されたい；胚芽腫、中枢神経系、小児期（脳がん）；子宮内膜がん（子宮がん）；上衣腫、小児期（脳がん）；食道がん；小児食道がん；鼻腔神経芽細胞腫（頭頸部がん）；ユーイング肉腫（骨がん）；頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期；性腺外胚細胞腫瘍；眼がん；小児眼球内黒色腫；眼球内黒色腫；網膜芽細胞腫；卵管がん；骨線維性組織球腫、悪性、および骨肉腫；胆嚢がん；胃（gastric）（胃（stomach））がん；小児胃（gastric）（胃（stomach））がん；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）；小児消化管間質腫瘍；胚細胞腫瘍；小児中枢神経系胚細胞腫瘍（脳がん）；小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；精巣がん；妊娠性絨毛性疾患；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；心臓腫瘍、小児期；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん（頭頸部がん）；眼球内黒色腫；小児眼球内黒色腫；膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍；カポジ肉腫（軟部組織肉腫）；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭がん（頭頸部がん）；白血病；口唇および口腔がん（頭頸部がん）；肝臓がん；肺がん（非小細胞および小細胞）；小児肺がん；リンパ腫；男性乳がん；骨悪性線維性組織球腫および骨肉腫；黒色腫；小児黒色腫；黒色腫、眼内（眼）；小児眼球内黒色腫；メルケル細胞癌（皮膚がん）；中皮腫、悪性；小児中皮腫；転移がん；原発不明転移性頸部扁平上皮性がん（頭頸部がん）；ｎｕｔ遺伝子変化を伴う正中線管癌；口のがん（頭頸部がん）；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉症（リンパ腫）；骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；骨髄性白血病、慢性（ｃｍｌ）；骨髄系白血病、急性（ＡＭＬ）；骨髄増殖性新生物、慢性；鼻腔および副鼻腔がん（頭頸部がん）；上咽頭がん（頭頸部がん）；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺がん；口腔がん（oral cancer）、口唇および口腔がん（lip and oral cavity cancer）および中咽頭がん（頭頸部がん）；骨肉腫および骨悪性線維性組織球腫；卵巣がん；小児卵巣がん；膵臓がん；小児膵臓がん；膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）；乳頭腫症（小児咽頭）；傍神経節腫；小児傍神経節腫；副鼻腔および鼻腔がん（頭頸部がん）；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん（頭頸部がん）；褐色細胞腫；小児褐色細胞腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠期乳がん；原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；原発性腹膜がん；前立腺がん；直腸がん；再発がん；腎細胞（腎臓）がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫、小児期（軟部組織肉腫）；唾液腺がん（頭頸部がん）；肉腫；小児横紋筋肉腫（軟部組織肉腫）；小児血管腫瘍（軟部組織肉腫）；ユーイング肉腫（骨がん）；カポジ肉腫（軟部組織肉腫）；骨肉腫（骨がん）；軟部組織肉腫；子宮肉腫；セザリー症候群（リンパ腫）；皮膚がん；小児皮膚がん；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；皮膚扁平上皮癌－皮膚がんを参照されたい；原発不明の扁平上皮性頸部がん、転移性（頭頸部がん）；胃（stomach）（胃（gastric））がん；小児胃（stomach）（胃（gastric））がん；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚－リンパ腫（菌状息肉症およびセザリー症候群）を参照されたい；精巣がん；小児精巣がん；のどのがん（頭頸部がん）；上咽頭がん；中咽頭がん；下咽頭がん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行上皮がん（腎臓（腎細胞）がん）；原因不明の癌；原因不明の小児がん；珍しい小児がん；尿管および腎盂、移行上皮がん（腎臓（腎細胞）がん；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；小児膣がん；血管腫瘍（軟部組織肉腫）；外陰がん；ウィルムス腫瘍および他の小児腎臓腫瘍；または若年成人のがん。さらに、本開示の粒子パネルを使用して他の疾患、例えば、アルツハイマー病および多発性硬化症を検出することができる。
試料

【0154】

本開示のパネルを使用して、タンパク質コロナからプロテオームデータを生成することができ、その後、本明細書に記載の生物学的状態のいずれかと関連付けることができる。本開示と整合する試料は、対象からの生体試料を含む。対象は、ヒトであることもあり、または非ヒト動物であることもある。生体試料は、体液であり得る。例えば、体液は、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙、細胞溶解物、組織溶解物、細胞ホモジネート、組織ホモジネート、乳頭吸引液、糞便試料、滑液および全血、または唾液であり得る。試料はまた、非生体試料、例えば、水、乳、溶媒、または均質化されて流体の状態になる任意のものであり得る。前記生体試料は、複数のタンパク質またはプロテオームデータを含有することができ、これらのデータを、パネル内の様々な粒子型の表面へのタンパク質の吸着およびその後のタンパク質コロナの消化の後に解析することができる。プロテオームデータは、核酸、ペプチドまたはタンパク質を含み得る。本明細書における試料のいずれも、いくつかの異なる分析物を含有することができ、本明細書で開示される組成物および方法を使用してそれらの分析物を分析することができる。分析物は、タンパク質、ペプチド、小分子、核酸、代謝物、脂質、または粒子型の表面と結合もしくは相互作用し得る可能性がある任意の分子であり得る。

【0155】

マルチ－オミクス解析のための組成物および方法が、本明細書で開示される。「マルチ－オミクス」または「マルチオミクス」は、データセットが複数のオーム、例えば、プロテオーム、ゲノム、トランスクリプトーム、リピドームおよびメタボロームである、大規模な生体分子解析の分析手法を指すことができる。マルチ－オミクスデータの非限定的な例としては、プロテオームデータ、ゲノミクスデータ、リピドミクスデータ、グリコミクスデータ、トランスクリプトミクスデータ、またはメタボロミクスデータが挙げられる。「生体分子コロナ」における「生体分子」は、生物有機体により産生され得る、または生物有機体内に存在する、任意の分子または生体成分を指すことができる。生体分子の非限定的な例としては、タンパク質（タンパク質コロナ）、ポリペプチド、多糖類、糖、脂質、リポタンパク質、代謝物、オリゴヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プラスミド、一本鎖核酸、二本鎖核酸）、メタボローム、ならびに小分子、例えば、一次代謝物、二次代謝物、および他の天然産物、またはこれらの任意の組合せが、挙げられる。一部の実施形態では、生体分子は、タンパク質、核酸、脂質およびメタボロームの群から選択される。

【0156】

一部の実施形態では、本開示の試料は、複数の試料であり得る。複数の試料のうちの少なくとも２つの試料は、空間的に隔離されていることがある。空間的に隔離されているとは、別々の体積に含有される試料を指す。例えば、空間的に隔離されている試料は、プレート内の別々のウェルの中にあるまたは別々の管の中にある試料を指すことがある。空間的に隔離されている試料は、プレート内の別々のウェルの中にあるまたは別々の管の中にある試料であって、同じ計器で一緒にアッセイされる試料を指すこともある。一部の実施形態では、本開示は、複数の試料の解析、例えば、少なくとも２つの空間的に隔離されている試料、少なくとも５つの空間的に隔離されている試料、少なくとも１０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１５の空間的に隔離されている試料、少なくとも２０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２５の空間的に隔離されている試料、少なくとも３０の空間的に隔離されている試料、少なくとも３５の空間的に隔離されている試料、少なくとも４０の空間的に隔離されている試料、少なくとも４５の空間的に隔離されている試料、少なくとも５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも５５の空間的に隔離されている試料、少なくとも６０の空間的に隔離されている試料、少なくとも６５の空間的に隔離されている試料、少なくとも７０の空間的に隔離されている試料、少なくとも７５の空間的に隔離されている試料、少なくとも８０の空間的に隔離されている試料、少なくとも８５の空間的に隔離されている試料、少なくとも９０の空間的に隔離されている試料、少なくとも９５の空間的に隔離されている試料、少なくとも９６の空間的に隔離されている試料、少なくとも１００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１２０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１４０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１６０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１８０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２００の空間的に隔離されている試料、少なくとも２２０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２４０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２６０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２８０の空間的に隔離されている試料、少なくとも３００の空間的に隔離されている試料、少なくとも３２０の空間的に隔離されている試料、少なくとも３４０の空間的に隔離されている試料、少なくとも３６０の空間的に隔離されている試料、少なくとも３８０の空間的に隔離されている試料、少なくとも４００の空間的に隔離されている試料、少なくとも４２０の空間的に隔離されている試料、少なくとも４４０の空間的に隔離されている試料、少なくとも４６０の空間的に隔離されている試料、少なくとも４８０の空間的に隔離されている試料、少なくとも５００の空間的に隔離されている試料、少なくとも６００の空間的に隔離されている試料、少なくとも７００の空間的に隔離されている試料、少なくとも８００の空間的に隔離されている試料、少なくとも９００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１０００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１１００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１２００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１３００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１４００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１５００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１６００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１７００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１８００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１９００の空間的に隔離されている試料、少なくとも２０００の空間的に隔離されている試料、少なくとも５０００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１００００の空間的に隔離されている試料、２～１０の空間的に隔離されている試料、２～１００の空間的に隔離されている試料、２～２００の空間的に隔離されている試料、２～３００の空間的に隔離されている試料、５０～１５０の空間的に隔離されている試料、１０～２０の空間的に隔離されている試料、２０～３０の空間的に隔離されている試料、３０～４０の空間的に隔離されている試料、４０～５０の空間的に隔離されている試料、５０～６０の空間的に隔離されている試料、６０～７０の空間的に隔離されている試料、７０～８０の空間的に隔離されている試料、８０～９０の空間的に隔離されている試料、９０～１００の空間的に隔離されている試料、１００～１５０の空間的に隔離されている試料、１５０～２００の空間的に隔離されている試料、２００～２５０の空間的に隔離されている試料、２５０～３００の空間的に隔離されている試料、３００～３５０の空間的に隔離されている試料、３５０～４００の空間的に隔離されている試料、４００～４５０の空間的に隔離されている試料、４５０～５００の空間的に隔離されている試料、５００～６００の空間的に隔離されている試料、６００～７００の空間的に隔離されている試料、７００～８００の空間的に隔離されている試料、８００～９００の空間的に隔離されている試料、９００～１０００の空間的に隔離されている試料、１０００～２０００の空間的に隔離されている試料、２０００～３０００の空間的に隔離されている試料、３０００～４０００の空間的に隔離されている試料、４０００～５０００の空間的に隔離されている試料、５０００～６０００の空間的に隔離されている試料、６０００～７０００の空間的に隔離されている試料、７０００～８０００の空間的に隔離されている試料、８０００～９０００の空間的に隔離されている試料、または９０００～１００００の空間的に隔離されている試料の解析に適合する、粒子パネルおよびそれらの使用方法を提供する。

【0157】

本明細書で開示される方法は、１つのまたは１つより多くの試料から粒子パネル（複数の粒子型を有する）を単離するステップを含む。超常磁性である粒子型を有する粒子パネルは、磁石を使用して試料から迅速に単離または分離することができる。さらに、空間的に隔離されている複数の試料を並行して処理することができる。したがって、本明細書で開示される方法は、磁石を使用することによる、複数の空間的に隔離されているパネル内の未結合タンパク質からの粒子パネルの同時的単離または分離を提供する。例えば、空間的に隔離されている試料各々がウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）のウェル内にある複数の空間的に隔離されている試料とともに粒子パネルをインキュベートすることができる。インキュベーション後、ウェルプレートの各々のウェル内の粒子パネルを、空間的に隔離されている試料中に存在する未結合タンパク質から、プレート全体を磁石上に置くことによって分離することができる。これにより、粒子パネル内の超常磁性粒子が同時に引き落とされる。各ウェル内の上清を除去して、未結合タンパク質を除去することができる。これらのステップ（インキュベートする、磁石を使用して引き落とす）を繰り返して粒子を有効に洗浄し、ひいては、試料中に存在し得る残留バックグラウンド未結合タンパク質を除去することができる。これは一例であるが、当業者は、超常磁性粒子が１つのまたは１つより多くの空間的に隔離されている試料から同時に迅速に単離される、非常に多くの他のシナリオを思い描くことができよう。

【0158】

一部の実施形態では、本開示のパネルは、粒子の表面に形成されるコロナの消化によるプロテオームデータの処理による、生体試料中の特定のタンパク質の同定および測定を提供する。同定および測定され得るタンパク質の例は、高存在量のタンパク質、中等度の存在量のタンパク質、および低存在量のタンパク質を含む。低存在量タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬまたはそれ未満の濃度で試料中に存在し得る。高存在量タンパク質は、約１０μｇ／ｍＬまたはそれより高い濃度で試料中に存在し得る。中等度の存在量のタンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬの間の濃度で試料中に存在し得る。高存在量のタンパク質であるタンパク質の例としては、アルブミン、ＩｇＧ、および存在量の点で上位１４のタンパク質であって、血漿における質量の９５％に寄与するタンパク質が挙げられる。加えて、従来の除去カラムを使用して精製され得る任意のタンパク質を、試料において本明細書で開示される粒子パネルを使用して直接検出することができる。タンパク質の例は、Keshishian et al.（Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi: 10.1074/mcp.M114.046813.Epub 2015 Feb 27.）、Farr et al.（J Proteome
Res. 2014 Jan 3;13(1):60-75. doi: 10.1021/pr4010037.Epub 2013 Dec 6.）、またはPernemalm et al.（Expert Rev Proteomics. 2014 Aug;11(4):431-48. doi: 10.1586/14789450.2014.901157. Epub 2014 Mar 24.）などの、公開データベースに収載されている任意のタンパク質であり得る。

【0159】

一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子パネルを使用して測定および同定することができるタンパク質の例としては、アルブミン、ＩｇＧ、リゾチーム、ＣＥＡ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、膀胱腫瘍抗原、サイログロブリン、アルファ－フェトプロテイン、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ＣＡ １５．３、レプチン、プロラクチン、オステオポンチン、ＩＧＦ－ＩＩ、ＣＤ９８、ファスシン、ｓＰｉｇＲ、１４－３－３エータ、トロポニンＩ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ＢＲＣＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、ＩＬ－６、フィブリノゲン、ＥＧＦＲ、ガストリン、ＰＨ、Ｇ－ＣＳＦ、デスミン、ＮＳＥ、ＦＳＨ、ＶＥＧＦ、Ｐ２１、ＰＣＮＡ、カルシトニン、ＰＲ、ＣＡ１２５、ＬＨ、ソマトスタチン、Ｓ１００、インスリン、アルファ－プロラクチン、ＡＣＴＨ、Ｂｃｌ－２、ＥＲアルファ、Ｋｉ－６７、ｐ５３、カテプシンＤ、ベータカテニン、ＶＷＦ、ＣＤ１５、ｋ－ｒａｓ、カスパーゼ３、ＥＰＮ、ＣＤ１０、ＦＡＳ、ＢＲＣＡ２、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＧＡ、ＣＲＰ、プロトロンビン、ＣＤ４４、ＡＰＥＸ、トランスフェリン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｅ－カドヘリン、ＩＬ－２、Ｂａｘ、ＩＦＮ－ガンマ、ベータ－２－ＭＧ、ＴＮＦアルファ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、トリプシン、サイクリンＤ１、ＭＧ Ｂ、ＸＢＰ－１、ＨＧ－１、ＹＫＬ－４０、Ｓ－ガンマ、ＮＥＳＰ－５５、ネトリン－１、ジェミニン、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＣＤＫ－６、ＣＣＬ２１、ＢｒＭＳ１、１７ベータＨＤＩ、ＰＤＧＦＲＡ、Ｐｃａｆ、ＣＣＬ５、ＭＭＰ３、クローディン－４、およびクローディン－３が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で開示される粒子パネルを使用して測定および同定することができるタンパク質の他の例は、目的の特定の疾患適応症（例えば、前立腺がん、肺がん、またはアルツハイマー病）についてｏｐｅｎ ｔａｒｇｅｔｓデータベースに収載されている任意のタンパク質またはタンパク質群である。
分析方法

【0160】

いくつかの異なる分析技術を使用して、試料のプロテオームデータを同定、測定および定量することができる。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは任意のゲルベースの分離技術を使用してプロテオームデータを解析することができる。ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを使用して、ペプチドおよびタンパク質を同定、測定および定量することもできる。あるいは、質量分析、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、エドマン分解、免疫親和性技術、ＥＰ３５４８６５２、ＷＯ２０１９０８３８５６、ＷＯ２０１９１３３８９２（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において開示されている方法、および他のタンパク質分離技術を使用して、プロテオームデータを同定、測定および定量することができる。
コンピュータ制御システム

【0161】

本開示は、本開示の方法を実行するためにプログラムされるコンピュータ制御システムを提供する。この判定、解析および統計的分類は、例えば、広範な教師ありおよび教師なしデータ解析ならびにクラスタリング手法、例えば、数ある中でも特に、階層的クラスター解析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳＤＡ）、機械学習（ランダムフォレストとしても公知）、ロジスティック回帰、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法、単純ベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰のためのＳＶＭ、Ｋ平均法クラスタリング、および隠れマルコフモデルを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の方法により行われる。コンピュータシステムは、本開示のタンパク質セットまたはタンパク質コロナを分析する様々な態様、例えば、いくつかの試料の生体分子コロナを比較／分析して、統計的有意性を用いてどのようなパターンが個々の生体分子コロナ間に共通するのかを判定して、生物学的状態に関連するタンパク質セットを決定することなどを、行うことができる。コンピュータシステムを使用して、異なるタンパク質またはタンパク質コロナ（例えば、タンパク質コロナの組成に特有のもの）を検出および判別するための分類器を開発することができる。本明細書で開示されるセンサーアレイから収集したデータを使用して、機械学習アルゴリズム、特に、患者からのアレイ測定値を受信して各患者からの特異的生体分子コロナ組成を出力するアルゴリズムを訓練することができる。アルゴリズムを訓練する前に、アレイからの生データのノイズを先ず除去して、個々の変数のばらつきを低減させることができる。

【0162】

機械学習を、学習データセットを経験した後に新しい、まだ見たことがない例／タスクを正確に実行する学習機械の能力として汎化することができる。機械学習は、以下の概念および方法を含み得る。教師あり学習概念は、ＡＯＤＥ；人工ニューラルネットワーク、例えば、誤差逆伝播法、オートエンコーダー、ボルツマンマシン、制限ボルツマンマシン、およびスパイキングニューラルネットワーク；ベイズ統計学、例えば、ベイジアンネットワークおよびベイジアン知識ベース；事例ベース推論；ガウス過程回帰；遺伝子発現プログラミング；グループデータ処理法（ＧＭＤＨ）；帰納論理プログラミング；事例ベース学習；怠惰学習；学習オートマトン；学習ベクトル量子化；ロジスティックモデルツリー；最小メッセージ長（決定木、決定グラフなど）、例えば、最近傍アルゴリズムおよび類推モデリング；確率的で近似的に正しい学習（ＰＡＣ）学習；リップルダウンルール、知識獲得方法論；シンボリック機械学習アルゴリズム；サポートベクターマシン；ランダムフォレスト；分類器のアンサンブル、例えば、ブートストラップ・アグリゲーティング（バギング）およびブースティング（メタアルゴリズム）；順序分類；情報ファジーネットワーク（ＩＦＮ）；条件付き確率場；ＡＮＯＶＡ；線形分類器、例えば、フィッシャー線形判別、線形回帰、ロジスティック回帰、多項ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、サポートベクターマシン；二次分類器；ｋ近傍法；ブースティング；決定木、例えば、Ｃ４．５、ランダムフォレスト、ＩＤ３、ＣＡＲＴ、ＳＬＩＱ、ＳＰＲＩＮＴ；ベイジアンネットワーク、例えば単純ベイズ；ならびに隠れマルコフモデルを含み得る。教師なし学習概念は、期待値最大化アルゴリズム；ベクトル量子化；生成位相マップ；情報ボトルネック法；人工ニューラルネットワーク、例えば、自己組織化マップ；相関ルール学習、例えば、アプリオリアルゴリズム、ＥｃｌａｔアルゴリズムおよびＦＰｇｒｏｗｔｈアルゴリズム；階層的クラスタリング、例えば、最短距離クラスタリングおよび概念クラスタリング；クラスター解析、例えば、Ｋ平均アルゴリズム、ファジークラスタリング、ＤＢＳＣＡＮ、およびＯＰＴＩＣＳアルゴリズム；ならびに外れ値検出、例えば局所外れ値因子法を含み得る。半教師あり学習概念は、生成モデル；低密度分離；グラフベース法；および共訓練を含み得る。強化学習概念は、時間的差分学習；Ｑ学習；学習オートマトン；およびＳＡＲＳＡを含み得る。深層学習概念は、深層信念ネットワーク；深層ボルツマンマシン；深層畳み込みニューラルネットワーク；深層再帰型ニューラルネットワーク；および階層的時間的記憶を含み得る。本明細書に記載の方法を実行するようにコンピュータシステムを構成することができる。システムは、本明細書に記載の方法を実行するようにプログラムされている中央コンピュータサーバーを含む。サーバーは、単一コアプロセッサー、マルチコアプロセッサー、または並列処理用の複数のプロセッサーであり得る、中央処理装置（ＣＰＵ、または「プロセッサー」）を含む。サーバーは、メモリー（例えば、ランダムアクセスメモリー、リードオンリーメモリー、フラッシュメモリー）；電子記憶装置（例えば、ハードディスク）；１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信用インターフェース（例えば、ネットワークアダプター）；ならびにキャッシュ、他のメモリー、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプターを含み得る周辺デバイスも含む。メモリー、記憶装置、インターフェースおよび周辺機器は、マザーボードなどのコミュニケーションバス（実線）を介してプロセッサーとつながっている。記憶装置は、データを格納するためのデータ記憶装置であり得る。サーバーは、通信用インターフェースを活用してコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）に動作可能に結合されている。ネットワークは、インターネット、イントラネットおよび／またはエクストラネット、インターネットとつながっているイントラネットおよび／またはエクストラネット、電気通信ネットワークまたはデータネットワークであり得る。一部の場合のネットワークは、サーバーを活用してピアツーピア・ネットワークを実装することができ、これにより、サーバーに結合されているデバイスは、クライアントまたはサーバーとして動作できるようになり得る。

【0163】

記憶装置は、ファイル、例えば対象レポート、および／または個体についてのデータに関する通信、または本開示に関連するデータの任意の態様を格納することができる。

【0164】

コンピュータサーバーは、１つまたは複数のリモートコンピュータシステムとネットワーク経由で通信することができる。１つまたは複数のリモートコンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、または携帯情報端末であり得る。

【0165】

一部の応用では、コンピュータシステムは、単一のサーバーを含む。他の状況では、システムは、イントラネット、エクストラネットおよび／またはインターネット経由で互いにつながっている複数のサーバーを含む。

【0166】

サーバーを、本明細書で提供されるような測定データもしくはデータベース、対象からの患者情報、例えば病歴、家族歴、人口統計データなど、および／または特定の応用との潜在的関連性についての他の臨床もしくは個人情報を格納するように構成することができる。そのような情報を記憶装置またはサーバーに格納することができ、そのようなデータをネットワーク経由で伝送することができる。

【0167】

本明細書に記載の方法を、例えばメモリーまたは電子記憶装置上などの、サーバーの電子記憶場所に格納された、機械（またはコンピュータプロセッサー）実行可能コード（またはソフトウェア）によって実行することができる。使用中、コードは、プロセッサーにより実行され得る。一部の場合には、プロセッサーによるアクセスを容易にするために、コードを記憶装置から読み出してメモリーに格納することができる。一部の状況では、電子記憶装置を除外することができ、機械実行可能命令はメモリーに格納される。あるいは、コードを第２のコンピュータシステムで実行することができる。

【0168】

サーバーなどの本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで実施することができる。技術の様々な態様は、概して、ある種の機械可読媒体に搭載されているまたはある種の機械可読媒体で実施される機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または関連データの形の、「製品」または「製造物品」と考えることができる。機械実行可能コードを、電子記憶装置、そのようなメモリー（例えば、リードオンリーメモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）またはハードディスクに格納することができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのために任意の時点で非一過性記憶を提供することができる、コンピュータ、プロセッサーもしくは同様のものの有形メモリー、またはその関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブおよび同様のものの、いずれかまたは全てを含み得る。ソフトウェアの全てまたは部分を、ときには、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワーク経由でつなげることができる。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを運ぶことができる別の種類の媒体は、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線および光電話回線ネットワーク経由で、および様々なエアリンクを介して使用されるものなどの、光波、電波および電磁波を含む。有線もしくは無線リンク、光リンクまたは同様のものなどの、そのような波を搬送する物理的素子も、ソフトウェアを運ぶ媒体と見なすことができる。本明細書で使用される場合、非一過性、有形「記憶」媒体に限定されていない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のために命令をプロセッサーに与えることに関与する任意の媒体を指すことができる。

【0169】

本明細書に記載のコンピュータシステムは、本明細書に記載のアルゴリズムまたはアルゴリズムに基づく方法のいずれかを遂行するためのコンピュータ実行可能コードを含み得る。一部の応用では、本明細書に記載のアルゴリズムは、少なくとも１つのデータベースから構成されている記憶装置を使用することになる。

【0170】

本開示に関連するデータを受信者による受信および／または再調査のためにネットワークまたは接続を介して伝送することができる。受信者は、これらに限定されないが、レポートが関係する対象；またはその介護者、例えば、医療提供者、管理者、他の医療専門家、もしくは他の世話係り；分析を行うおよび／または注文する人物または企業であり得る。受信者は、そのようなレポートを選別するためのローカルまたはリモートシステム（例えば、「クラウドコンピューティング」アーキテクチャのサーバーまたは他のシステム）であることもある。一実施形態では、コンピュータ可読媒体は、本明細書に記載の方法を使用する生体試料の分析の結果の伝送に好適な媒体を含む。

【0171】

本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで実施することができる。この技術の様々な態様は、概して、ある種の機械可読媒体に搭載されているまたはある種の機械可読媒体で実施される機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または関連データの形の、「製品」または「製造物品」と考えることができる。機械実行可能コードを、電子記憶装置、例えば、メモリー（例えば、リードオンリーメモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）またはハードディスクに格納することができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのために任意の時点で非一過性記憶を提供することができる、コンピュータ、プロセッサーもしくは同様のものの有形メモリー、またはその関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブおよび同様のものの、いずれかまたは全てを含み得る。ソフトウェアの全てまたは部分を、ときには、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワーク経由でつなげることができる。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを運ぶことができる別の種類の媒体は、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを横断して、有線および光電話回線ネットワーク経由で、および様々なエアリンクを介して使用されるものなどの、光波、電波および電磁波を含む。有線もしくは無線リンク、光リンクまたは同様のものなどの、そのような波を搬送する物理的素子も、ソフトウェアを運ぶ媒体と見なすことができる。本明細書で使用される場合、非一過性、有形「記憶」媒体に限定されていない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のために命令をプロセッサーに与えることに関与する任意の媒体を指す。

【0172】

したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多くの形を取り得る。不揮発性記憶媒体は、例えば、光または磁気ディスク、例えば、図面に示されている、データベース等を実装するために使用され得るものなどのような、任意のコンピュータ内の記憶デバイスのいずれかまたは同様のものを含む。揮発記憶媒体は、ダイナミックメモリー、例えば、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリーを含む。有形伝送媒体は、同軸ケーブル；銅線および光ファイバー、例えば、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤなどを含む。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナルの形、またはラジオ周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信中に発生するものなどの音波もしくは光波の形を取り得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップもしくはカートリッジ、搬送波伝送データもしくは命令、そのような搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形の多くは、実行のためのプロセッサーへの１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスの搬送に関与し得る。
機械学習を使用するタンパク質コロナの分類

【0173】

疾患または障害および／または病状に関連するタンパク質のセットを決定する方法は、少なくとも２つの試料のコロナの解析を含む。この判定、解析または統計的分類は、例えば、広範な教師ありおよび教師なしデータ解析、機械学習、深層学習、およびクラスタリング手法、例えば、数ある中でも特に、階層的クラスター解析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法、単純ベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰のためのＳＶＭ、Ｋ平均法クラスタリング、および隠れマルコフモデルなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の方法により行われる。言い換えると、各試料のコロナ中のタンパク質は、統計的有意性を用いて、どのようなパターンが個々のコロナ間で共通しているのかを判定して、疾患または障害または病状に関連するタンパク質のセットを決定するために、互いに比較／解析される。

【0174】

一般に、機械学習アルゴリズムは、例を説明する入力特徴に基づいて例にクラス標識を正確に指定するモデルを構築するために使用される。一部の場合には、本明細書に記載の方法に機械学習および／または深層学習手法を利用することは有利であり得る。例えば、機械学習を使用して、タンパク質コロナを様々な病状（例えば、無病、疾患の前兆、疾患の早期または後期にあることなど）と関連付けることができる。例えば、一部の場合には、１つまたは複数の機械学習アルゴリズムは、タンパク質コロナおよびそれに由来するタンパク質のセットごとに検出されたおよび得られたデータを解析するために、本発明の方法に関連して利用される。例えば、一実施形態では、機械学習を本明細書に記載のセンサーアレイと連結させて、対象が、がんの前段階にあるのか、がんを有するのか、またはがんを有しても発症してもいないのかを判定することのみならず、がんの種類を区別することもできる。
番号付き実施形態

【0175】

以下の実施形態は、本明細書で開示される特徴の組合せの非限定的順列を記載するものである。特徴の組合せの他の順列も考えられる。特に、これらの番号付き実施形態の各々は、列挙されているそれらの順序とは無関係の、あらゆる前または後の番号が付いている実施形態に従属または関連すると考えられる。１．試料中のタンパク質を同定する方法であって、複数の粒子型を含むパネルを試料とともにインキュベートして複数のタンパク質コロナを形成するステップ、複数のタンパク質コロナを消化してプロテオームデータを生成するステップ、およびプロテオームデータを定量することにより試料中のタンパク質を同定するステップを含む方法。２．試料が、対象からのものである、実施形態１の方法。３．同定するステップからの試料のタンパク質プロファイルを判定するステップおよびタンパク質プロファイルを対象の生物学的状態と関連付けるステップをさらに含む、実施形態２の方法。４．複数のタンパク質コロナを消化することによりプロテオームデータを生成すること、複数のタンパク質コロナのタンパク質プロファイルを判定すること、およびタンパク質プロファイルを生物学的状態と関連付けることにより、対象からの試料の生物学的状態を判定するステップをさらに含み、パネルが少なくとも２つの異なる粒子型を含む、実施形態１の方法。５．関連付けることが、訓練された分類器により行われる、実施形態４の方法。６．パネルが、少なくとも３つの異なる粒子型、少なくとも４つの異なる粒子型、少なくとも５つの異なる粒子型、少なくとも６つの異なる粒子型、少なくとも７つの異なる粒子型、少なくとも８つの異なる粒子型、少なくとも９つの異なる粒子型、少なくとも１０の異なる粒子型、少なくとも１１の異なる粒子型、少なくとも１２の異なる粒子型、少なくとも１３の異なる粒子型、少なくとも１４の異なる粒子型、少なくとも１５の異なる粒子、または少なくとも２０の異なる粒子型を含む、実施形態１～５のいずれか１つの方法。７．パネルが、少なくとも４つの異なる粒子型を含む、実施形態１～６のいずれか１つの方法。８．パネルの少なくとも１つの粒子型が、パネルの第２の粒子型とは異なる物理的特徴を有する、実施形態１～７のいずれか１つの方法。９．物理的特徴が、サイズ、多分散指数、表面電荷、または形態である、実施形態８の方法。１０．パネル内の複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型のサイズが、１０ｎｍ～５００ｎｍである、実施形態１～９のいずれか１つの方法。１１．パネル内の複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の多分散指数が、０．０１～０．２５である、実施形態１～１０のいずれか１つの方法。１２．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の形態が、球状、コロイド状、正方形、ロッド、ワイヤ、円錐、ピラミッド形または楕円形を含む、実施形態１～１１のいずれか１つの方法。１３．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷が、正の表面電荷を含む、実施形態１～１２の方法。１４．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷が、負の表面電荷を含む、実施形態１～１２のいずれか１つの方法。１５．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型の表面電荷が、中性表面電荷を含む、実施形態１～１２のいずれか１つの方法。１６．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、パネルの第２の粒子型とは異なる化学的特徴を有する、実施形態１～１５のいずれか１つの方法。１７．化学的特徴が、表面官能性化学基である、実施形態１６の方法。１８．官能性化学基が、アミンまたはカルボキシレートである、実施形態１７の方法。１９．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、ポリマー、脂質、または金属、シリカ、タンパク質、核酸、小分子または大分子を含む材料で作製される、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。２０．ポリマーが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、またはポリアミン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸、もしくはポリカプロラクトン）、ポリスチレン、または２つもしくはそれより多くのポリマーのコポリマーを含む、実施形態１９の方法。２１．脂質が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、またはコレステロールを含む、実施形態１９の方法。２２．金属が、金、銀、銅、ニッケル、コバルト、パラジウム、白金、イリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、レニウム、バナジウム、クロム、マンガン、ニオブ、モリブデン、タングステン、タンタル、鉄、またはカドミウム、チタン、または金を含む、実施形態１９の方法。２３．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、またはポリアミン、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ポリエステル（例えば、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸、もしくはポリカプロラクトン）、ポリスチレン、または２つもしくはそれより多くのポリマーのコポリマー、ポリエチレングリコールを含むポリマーで、表面官能化されている、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。２４．タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の正確度、少なくとも７５％の正確度、少なくとも８０％の正確度、少なくとも８５％の正確度、少なくとも９０％の正確度、少なくとも９２％の正確度、少なくとも９５％の正確度、少なくとも９６％の正確度、少なくとも９７％の正確度、少なくとも９８％の正確度、少なくとも９９％の正確度、または１００％の正確度で関連付ける、実施形態３～２３のいずれか１つの方法。２５．タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の感度、少なくとも７５％の感度、少なくとも８０％の感度、少なくとも８５％の感度、少なくとも９０％の感度、少なくとも９２％の感度、少なくとも９５％の感度、少なくとも９６％の感度、少なくとも９７％の感度、少なくとも９８％の感度、少なくとも９９％の感度、または１００％の感度で関連付ける、実施形態３～２４のいずれか１つの方法。２６．タンパク質プロファイルを生物学的状態に、少なくとも７０％の特異度、少なくとも７５％の特異度、少なくとも８０％の特異度、少なくとも８５％の特異度、少なくとも９０％の特異度、少なくとも９２％の特異度、少なくとも９５％の特異度、少なくとも９６％の特異度、少なくとも９７％の特異度、少なくとも９８％の特異度、少なくとも９９％の特異度、または１００％の特異度で関連付ける、実施形態３～２５のいずれか１つの方法。２７．少なくとも１００のユニークタンパク質、少なくとも２００のユニークタンパク質、少なくとも３００のユニークタンパク質、少なくとも４００のユニークタンパク質、少なくとも５００のユニークタンパク質、少なくとも６００のユニークタンパク質、少なくとも７００のユニークタンパク質、少なくとも８００のユニークタンパク質、少なくとも９００のユニークタンパク質、少なくとも１０００のユニークタンパク質、少なくとも１１００のユニークタンパク質、少なくとも１２００のユニークタンパク質、少なくとも１３００のユニークタンパク質、少なくとも１４００のユニークタンパク質、少なくとも１５００のユニークタンパク質、少なくとも１６００のユニークタンパク質、少なくとも１７００のユニークタンパク質、少なくとも１８００のユニークタンパク質、少なくとも１９００のユニークタンパク質、または少なくとも２０００のユニークタンパク質を同定する、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。２８．複数の粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、超常磁性酸化鉄ナノ粒子を含む、実施形態１～２７のいずれか１つの方法。２９．試料が、体液である、実施形態１～２８のいずれか１つの方法。３０．体液が、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙または唾液を含む、実施形態２９の方法。３１．タンパク質コロナ解析のためのパネルを選択する方法であって、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する複数の粒子型を選択するステップを含む方法。３２．異なる物理化学的特性が、表面電荷、表面化学構造、サイズ、および形態からなる群から選択される、実施形態３１の方法。３３．異なる物理化学的特性が、表面電荷を含む、実施形態３２の方法。３４．粒子のパネルを含む組成物であって、パネルが、複数の粒子型を含み、複数の粒子型が、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する、組成物。３５．異なる物理化学的特性が、表面電荷、表面化学構造、サイズ、および形態からなる群から選択される、実施形態３５の組成物。３６．異なる物理化学的特性が、表面電荷を含む、実施形態３６の組成物。３７．実施形態１～３４のいずれか１つのパネルを含むシステム。３８．パネルを含むシステムであって、パネルが複数の粒子型を含む、システム。３９．複数の粒子型が、少なくとも３つの異なる物理化学的特性を有する、実施形態３８のシステム。４０．パネルが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２の異なる粒子型を含む、実施形態３




８のシステム。４１．複数の粒子型が、複数のタンパク質コロナを形成するために試料から複数のタンパク質を吸着できる、実施形態３８のシステム。４２．複数のタンパク質コロナが、タンパク質プロファイルを判定するために消化される、実施形態４１のシステム。４３．タンパク質プロファイルが、訓練された分類器を使用して生物学的状態と関連付けられる、実施形態４２のシステム。

【実施例】

【0176】

以下の実施例を、本開示の一部の態様をさらに説明するために含めるが、本発明の範囲を制限するために使用するべきではない。
（実施例１）
ＳＰＮＭＰまたは超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）の合成

【0177】

ＳＰＭＮＰまたはＳＰＩＯＮは、文献（Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875
- 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278）における方法に従うことにより
、アルカリ源としての酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）および静電安定剤としてのクエン酸三ナトリウム（Ｎａ_３Ｃｉｔ）の存在下、エチレングリコール（ＥＧ）でのＦｅＣｌ３の還元による２００℃でのソルボサーマル反応によって合成した。過剰なＥＧが溶媒および還元剤の両方として作用した。

【0178】

出発材料：塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）、ＭＷ２７０．３０、ＣＡＳ番号１００２５－７７－１；酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、ＭＷ８２．０３、ＣＡＳ番号１２７－０９－３；クエン酸三ナトリウム二水和物（Ｎａ_３Ｃｉｔ・２Ｈ_２Ｏ）、ＭＷ２９４．１０、ＣＡ＃６１３２－０４－３；エチレングリコール（ＥＧ）、ＭＷ６２．０７、ＣＡＳ番号１０７－２１－１。

【0179】

ソルボサーマル反応によるＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子のための手順：

【0180】

（１）典型的には、ＦｅＣｌ_３（０．６５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）およびクエン酸ナトリウム（０．２０ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を先ずＥＧ（２０ｍＬ）に溶解し、その後、酢酸ナトリウム（１．２０ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加した。混合物をテフロン（登録商標）裏打ちステンレス鋼オートクレーブ（容量５０ｍＬ）内で３０分間、１６０℃で激しく攪拌し、次いで密封した。（２）オートクレーブを２００℃で加熱し、１２時間維持し、次いで放置して室温に冷却した。（３）黒色生成物を磁石により単離し、ＤＩ水で＞５回洗浄した。（４）最終Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子生成物を６０℃で１２時間、真空で乾燥させてまたは凍結乾燥させて黒色粉末にした。Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２コア／シェルを文献（J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 28 - 29 & J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 4684 - 4691）における方法に従うことにより改良型ストーバー法によって調製した。

【0181】

出発材料：ソルボサーマル反応によって合成したＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子；オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、ＭＷ２０８．３３、ＣＡＳ番号７８－１０－４；アンモニア溶液２５％；臭化セトリモニウム（ＣＴＡＢ）、ＭＷ３６４．４５、ＣＡＳ番号５７－０９－０；（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、ＭＷ２２１．３７、ＣＡＳ番号９１９－３０－２。

【0182】

Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２コア／シェルナノ粒子のための手順：

【0183】

（１）超常磁性Ｆｅ３Ｏ４ ＮＰを、以前に報告されたソルボサーマル反応（Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875 - 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278)）に従って合成した。次いで、得られたＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子を使用して、２ステップコーティング手順によって高アミノ化超常磁性メソ多孔質複合ナノ粒子を調製した。（２）手短に述べると、０．０８ｇのＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子をエタノール（５０ｍＬ）とＤＩ水（１ｍＬ）と濃厚アンモニア水溶液（１．７ｍＬ、２５重量％）との混合物に均一に分散させ、その後、ＴＥＯＳ（１４０μＬ）を添加した。４０℃で６時間攪拌した後、非晶質のシリカコーティングが施されている超常磁性ナノ粒子（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２と表示する）を得、水で５回洗浄した。（３）次いで、テンプレートとしてＣＴＡＢを使用することにより、塩基で触媒されるゾル－ゲルシリカ反応によって高アミノ化メソ多孔質シリカシェルでＦｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２ナノ粒子をコーティングした。典型的には、上記調製Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２ナノ粒子（５ｍｇ）を、ＣＴＡＢ（０．０８ｇ）と、酢酸エチル（０．７ｍＬ）と、ＤＩ水（１１３ｍＬ）と、濃アンモニア（２．４２ｍＬ、２５重量％）とを含有する混合溶液に分散させた。ＴＥＯＳ（０．１８ｍＬ）およびＡＰＴＥＳ（０．２２ｍＬ）を分散液に、３００ｒｐｍの攪拌速度を用いて添加した。室温での３時間の反応の後、生成物を磁石で回収し、水およびエタノールそれぞれで繰り返し洗浄した。

【0184】

（４）細孔生成用テンプレート（ＣＴＡＢ）を除去するために、合成したそのままの材料を６０℃で３時間、継続的に攪拌しながらエタノール（６０ｍＬ）に移入した。界面活性剤抽出ステップを２回繰り返して、ＣＴＡＢを確実に除去した。テンプレート除去生成物をエタノールで２回洗浄し、サンドイッチ構造の高アミノ化超常磁性メソ多孔質複合ナノ粒子（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２＠ｍＳｉＯ_２－ＮＨ_２）を得た。

【0185】

Ｆｅ_３Ｏ_４＠ｐｏｌｙｍｅｒ複合ナノ粒子を界面活性剤の非存在下でのシード乳化重合（Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278）によって合成した。

【0186】

ソルボサーマル反応によって合成したＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子。

【0187】

出発材料：ソルボサーマル反応によって合成したＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子；オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、ＭＷ２０８．３３、ＣＡＳ番号７８－１０－４；３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（ＭＰＳ）、ＭＷ２４８．３５、ＣＡＳ番号２５３０－８５－０；アンモニア溶液２５％；ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、ＭＷ１３０．１９、ＣＡＳ番号１３２１－７４－０；スチレン（Ｓｔ）、ＭＷ１０４．１５、ＣＡＳ番号１００－４２－５；メタクリル酸（ＭＡＡ）、ＭＷ８６．０９、ＣＡＳ番号７９－４１－４；過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、ＭＷ２２８．２０、ＣＡＳ番号７７２７－５４－０。

【0188】

Ｆｅ_３Ｏ_４＠ｐｏｌｙｍｅｒコア／シェル型ナノ粒子のための手順：

【0189】

（１）ＳＰＩＯＮを、以前に報告されたソルボサーマル反応（Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875 - 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278)）に従って合成した。（２）Ｆｅ３Ｏ４＠ＭＰＳを改良型ストーバー法によって調製した。典型的には、１ｇのＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子をエタノール（５０ｍＬ）とＤＩ水（２ｍＬ）と濃厚アンモニア水溶液（２ｍＬ、２５重量％）との混合物に均一に分散させ、その後、ＴＥＯＳ（２００μＬ）およびＭＰＳ（２ｍＬ）を添加した。７０℃で２４時間攪拌した後、ＭＰＳコーティングが施されている超常磁性ＮＰを得、水で５回洗浄し、凍結乾燥させて暗褐色粉末にし、－２０℃で保管した。（３）Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ｐｏｌｙｍｅｒナノ粒子を界面活性剤の非存在下でのシード乳化重合によって合成した。典型的には、１００ｍｇのＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳを１２５ｍＬのＤＩ水に均一に分散させた。３０分間、Ｎ_２でバブリングした後、２ｍＬのＳｔ、０．２ｍＬのＤＶＢおよび０．４ｍＬのＭＡＡをＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳ懸濁液に添加した。０．２ｇのＮａＯＨおよび４０ｍｇのＡＰＳ水溶液５ｍＬの添加後、得られた混合物を一晩、７５℃に加熱した。（４）冷却した後、Ｆｅ_３Ｏ_４＠Ｐ（Ｓｔ－ｃｏ－ＭＡＡ）を得、水で５回洗浄し、凍結乾燥させて暗褐色粉末にした。
（実施例２）
粒子型のパネルの構築

【0190】

この実施例は、粒子型のパネルの構築を説明する。約１７０の全粒子型を含む粒子ライブラリーを構築した。各粒子を生体試料とともにインキュベートすることにより、各粒子型についての生体分子コロナを生成した。タンパク質コロナからのプロテオームデータを各粒子型について解析し、これは、電気泳動に基づく定性的解析、ならびに質量分析データおよびヒートマップに基づく定量的解析を含んだ。粒子およびコロナ特性に基づいてある特定の粒子型を選択することによりパネルを構築した。粒子型が血漿試料中のタンパク質について有したカバレッジの広さに基づいて、粒子パネルのための粒子型を選択した。図５は、プロテオームデータを生成するためのプロセス、およびパネル選択のためのプロセスを示す。図６に示されているように、粒子特性は、サイズ／幾何形状、電荷、表面官能基、磁力を他の特性に加えて含む。これらの特性の各々を、粒子型をパネルに加える前のその粒子型の完全な特徴付けの際に様々な試験によりアッセイすることができる。図７に示されているように、動的光散乱を使用して、２つの粒子型：ＳＰ－００２（フェノール－ホルムアルデヒドコーティングが施されている粒子）およびＳＰ－０１０（カルボキシレート、ＰＡＡコーティングが施されている粒子）のサイズ分布を特徴付けた。図８に示されているように、ＴＥＭを使用して、ＳＰ－００２（フェノール－ホルムアルデヒドコーティングが施されている粒子）（図８Ａ）およびＳＰ－３３９（ポリスチレンカルボキシル粒子）（図８Ｂ）を含む２つの粒子型のサイズおよび形態を特徴付けた。図９に示されているように、ＸＰＳを使用してＳＰ－３３３（カルボキシレート）、ＳＰ－３３９（ポリスチレンカルボキシレート）、ＳＰ－３５６（シリカアミノ）、ＳＰ－３７４（シリカシラノール）、ＨＸ－２０（シリカコーティングが施されている）、ＨＸ－４２（シリカコーティングが施されている、アミン）、およびＨＸ－７４（ＰＤＭＰＡＰＭＡコーティングが施されている（ジメチルアミン））を含む様々な粒子型の表面に存在する化学基を分析した。
（実施例３）
別個の表面化学構造を有する酸化鉄ＮＰの合成および特徴付け

【0191】

この実施例は、別個の表面化学構造を有する酸化鉄ＮＰの合成および特徴付けを説明する。粒子タンパク質コロナを遊離血漿タンパク質から分離するためにおよび緩く結合しているタンパク質を粒子から洗浄除去するために繰り返される遠心分離または膜濾過にも耐えることができるが、それを必要とせずに容易に調製することができる、頑強な粒子の必要性に対処するために、超常磁性酸化鉄ＮＰ（ＳＰＩＯＮ）をタンパク質コロナ形成のために開発した（図２３、最上部）。酸化鉄粒子コアは、磁石を使用する＜３０秒での血漿溶液からの粒子の迅速な分離を助長した（図４）。これは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる解析のための粒子タンパク質コロナの抽出に必要な時間を大幅に短縮させた。さらに、プロテオームのより幅広い照合のためのタンパク質コロナの明確に異なるパターンの生成を助長する様々な表面化学を用いて、ＳＰＩＯＮを頑強に修飾した。

【0192】

別様に表面官能化されている３つのＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１）を合成した（図２８）。オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を使用して改良型ストーバー法によりＳＰ－００３にシリカの薄層のコーティングを施した。ポリ（ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－００７）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（ＳＰ－０１１）の合成のために、先ず、ＴＥＯＳおよび３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを使用して改良型ストーバー法により酸化鉄粒子コアをビニル基で修飾した。次に、ビニル基官能化ＳＰＩＯＮをＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドおよびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレートとのフリーラジカル重合によりそれぞれ表面修飾して、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１を調製した。

【0193】

走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、高分解能ＴＥＭ（ＨＲＴＥＭ）、およびＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）を含む様々な技法を使用して３つのＳＰＩＯＮを特徴付けして、ＳＰＩＯＮのサイズ、形態および表面特性を評価した（図２３）。ＤＬＳ測定の結果は、ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１が、それぞれ、約２３３ｎｍ、約２８３ｎｍおよび約２３８ｎｍの平均サイズを有することを示した。これは、３つ全てのＳＰＩＯＮが２００ｎｍ～３００ｎｍの範囲のサイズを有する球および半球形態を有することを示したＳＥＭ測定と一致した。ＳＰＩＯＮの表面電荷をゼータ電位（ζ）分析により評価し、この分析は、ｐＨ７．４でＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１についてそれぞれ－３６．９ｍＶ、＋２５．８ｍＶおよび－０．４ｍＶのζ電位値を示した（表２～４）。

【表2】

【表3】

【表4】

【0194】

これは、ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１が、図２３の概略図に示されているように各粒子の表面を修飾するために使用したコーティング官能基の電荷と一致する、負、正および中性の表面を有することを示した。ＨＲＴＥＭを使用してコーティングの厚みを評価した。ＳＰ－００３については、完全な非晶質シェルが酸化鉄コアの周囲に１０ｎｍを超える厚みで観察された（図２３、上の第５の列）。ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１については、比較的薄い（＜１０ｎｍ）非晶質特徴が粒子の表面で観察された（図２３中の矢印、中間および下の第５の列）。加えて、表面分析のためにＸＰＳを行い、ＸＰＳは、ＨＲＴＥＭ画像とともに、それぞれの官能基で粒子のコーティング成功を確証した。
（実施例４）
パネルでのタンパク質の検出およびタンパク質プロファイルとがんの関連付け

【0195】

この実施例は、パネルでのタンパク質の検出およびタンパク質プロファイルとがんの関連付けを説明する。粒子のパネルは、様々な表面電荷を有する３つの異なる交差反応性リポソーム（アニオン性（ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）））、カチオン性（ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）－ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン））、および中性（コレステロールを伴うジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）））を含む。

【0196】

図１７Ａは、健常およびがん患者からの試料の採取、試料からの血漿の単離、タンパク質コロナを形成するためのコーティングが施されていないリポソームとのインキュベーション、および選択血漿タンパク質の濃縮を含む、本出願のプロセスの概略図を示す。タンパク質コロナ形成は、粒子の物理化学的特性に基づいて異なり得る。図１７Ｂは、３粒子型パネルについてのコロナ解析シグナルを示す。血漿を対象４５名（神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、骨髄腫および膵臓がんを含む５種のがんの各々から８名、および健常対照５名）から採取した。コロナ解析を３粒子型パネル内の各粒子について作成した。ランダムフォレストモデルを１０００ラウンドの交差検証各々において構築した。ロバストなコロナ解析シグナルの強力な証拠がある。最初の予備解析は、ＰＣＡによって行った。図１８Ａおよび図１８Ｂは、早期がんを症状発症の８年前までに分離することができることを示す。ゴレスタンコホートは、２００４年～２００８年の間に健常対象５０，０００名を登録した。図１８Ａに示されているように、登録からの保存血漿を試験した。登録の８年後、患者おおよそ１０００名ががんを発症した。図１８Ｂは、保存血漿の分類を示す。登録日からの保存血漿のコロナ解析は、検査した対象１５名（３種のがん各々について患者５名）のうちの１５名についてがんを正確に分類した。図１９は、３粒子型コロナ解析を使用する９５％の全体正確度での５種のがんのロバストナ分類を示す。データは、粒子型の多様性の付加が性能を向上させることを示す。表面に負、中性および正の正味電荷（ｐＨ７．４）を有する３つの異なるリポソームを使用した。
（実施例５）
コロナ解析ワークフローによる迅速かつ深いプロテオーム解析

【0197】

この実施例は、コロナ解析ワークフローによる迅速かつ深いプロテオーム解析を説明する。血漿プロテオームの解析のための多粒子型タンパク質コロナ解析プラットフォーム（図２２Ｂ）を評価するために、大腸がん（ＣＲＣ）がん対象８名からの組み合わせたプール血漿試料を用いてＳＰＩＯＮを試験した。これらの３つの粒子型の各々をタンパク質コロナ形成のために、先ず、血漿試料とともに約１時間、約３７℃でインキュベートし、その後、未結合タンパク質からの粒子の磁石に基づく精製を行った（１サイクル当たり６分で３回）。次いで、粒子に結合したタンパク質を溶解し、消化し、精製し、溶出し、これらのステップに併せて約２～４時間かかり、その後、ＭＳにより解析した。注目すべきことに、この調製ワークフローは、９６のコロナ試料の１バッチに合計約４～６時間しか必要としなかった。

【0198】

ＭＳによる解析およびデータ処理後、得られたＭＳ２ペプチド－スペクトルマッチ（ＰＳＭ）を使用して、各粒子型コロナに存在するタンパク質を同定した。並行して、生血漿試料からのタンパク質の、粒子コロナ形成なしの、直接検出も行った。試料からの同定タンパク質をＭＳ測定または推測血漿タンパク質濃度のコンパイル済みデータベースと比較して、粒子コロナまたは血漿によるカバレッジの深度および程度を、既報のタンパク質濃度のデータベース値に対して実測タンパク質をプロットすることにより、調査した（図２４）。先ず、ほぼ１１桁をカバーするデータベースからの１，２５５のタンパク質を最大存在量のタンパク質から最小存在量のタンパク質へ順にプロットした。実験に基づいて評価した試料の各々（生血漿対ＳＰ－００３／ＳＰ－００７／ＳＰ－０１１粒子コロナ）について、データベースとマッチするタンパク質を同様にプロットした。図２４から分かるように、データベースマッチタンパク質についての濃度の範囲により定義した場合、測定血漿プロテオームのダイナミックレンジは、粒子コロナについてのほうが（例えば、ＳＰ－００７について４０ｍｇ／ｍＬ～０．５４ｎｇ／ｍＬ）、生血漿のダイナミックレンジについて（４０ｍｇ／ｍＬ～１．２ｎｇ／ｍＬ）よりも２倍大きく、１００ｎｇ／ｍＬ未満で存在する低存在量のタンパク質の数が１０倍増加した（粒子について８４２および生血漿について８４）。粒子上で検出された最も少ないタンパク質よりも低い濃度に関してアノテーションされているタンパク質は、データベース内に１２しか存在しなかった。加えて、粒子型コロナの各々についてのユニークタンパク質の総数（約１，０００）は、表５で明らかに実証されるように、生血漿について観察されたもの（＜５００）より多かった（＞２倍）。

【表5】

【0199】

加えて、文献ＭＳコンピレーションとの比較により以前には観察されなかったタンパク質の割合は、生血漿（４５％）と比較して粒子についてのほうが大きかった（６１～６４％）。言い換えると、公開データベースにおいて以前のＭＳ濃度に関してアノテーションされていないタンパク質が、生血漿で観察されたものより多く粒子コロナで同定された。データベースと重複する粒子タンパク質同定のプロットは、異なる粒子型が血漿タンパク質の異なるサブセットを選択することを確証する。これは、コロナのタンパク質組成物を主として決定する、３つのＳＰＩＯＮ粒子型の異なる表面特性に起因し得る。

【0200】

測定されるダイナミックレンジを圧縮する粒子の能力を評価するために、測定および同定されたタンパク質特徴強度を同じタンパク質の濃度について既報の値と比較した。先ず、各タンパク質について得られたペプチド特徴（図２４に提示されている通り）を、タンパク質の全ての可能性のある特徴の最大ＭＳ判定強度を用いて（ＯｐｅｎＭＳ ＭＳデータ処理ツールを使用してモノアイソトピックピーク値を抽出して）選択し、次いで、それらの強度をこれらの同じタンパク質についての既報の存在量レベルに対してモデル化した（図２５）。回帰モデルの傾きと測定データの強度スパンを比較すると、粒子コロナは、図２４と同様に、低い存在量（測定量または報告量）のタンパク質を、血漿が含有するよりも多く含有する。血漿測定と比較して粒子測定についてこれらの測定値のダイナミックレンジが圧縮された（回帰モデルの傾きが低減される）。これは、粒子が、得られるコロナの存在量についての測定ダイナミックレンジを血漿における元のダイナミックレンジと比較して有効に圧縮することができるという以前の観察と一致し、タンパク質の絶対濃度と、粒子に対するその結合親和性と、隣接タンパク質とのその相互作用との組合せに起因する可能性があった。上記の結果の全ては、多粒子型タンパク質コロナ戦略が、広範囲の血漿タンパク質、特に、従来のプロテオーム技術では迅速な検出が困難である低存在量のものについての同定を助長したことを示す。

【0201】

粒子コロナＭＳアッセイを使用するタンパク質同定のロバスト性を評価するために、３粒子型パネルを使用して完全アッセイ三重反復を行って、同じプールＣＲＣ血漿試料から個々のタンパク質コロナ試料を作出した。いずれか１つから、２つの全群に、３つの単一群に及ぶ粒子型の各組合せについて、組合せごとに列挙したユニークタンパク質の数を表６に示す。

【表6】

【0202】

「１つのみ」の列におけるタンパク質計数値は、３回の反復の各々を独立して使用すること、次いで組合せ計数値の全てについて平均値および標準偏差を得ることによって得た。表から分かるように、粒子パネル内の粒子型の数が増加すると、より多くのタンパク質が見出され、３粒子型の群では＞１，５００のユニークタンパク質（下記の表７に収載する通り、これらのうちの６５がＦＤＡの認可／承認を受けたバイオマーカーである）が見出された。「いずれか１つ」の反復の列におけるタンパク質計数値は、粒子型反復タンパク質リストの和集合を使用して得た。「３つ全て」の反復の列におけるタンパク質計数値は、粒子型反復タンパク質リストの共通集合を使用して得た。同定タンパク質の粒子反復の重複についてのさらなる尺度として、集合間類似度のメトリックであるジャッカード係数を一対比較各々について算出した。ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１についての値は、それぞれ、０．７４±０．０１８、０．６５±０．０７８、および０．７６±０．０１９（平均±ｓｄ）であった。所与のＭＳ試料中のタンパク質含有量の列挙は、ＭＳ２データ収集の確率的性質に依存し、試料内で示されるまたは試料間で一般に共有されるタンパク質についての過少計上を示すことがある。共有ＭＳ１特徴へのＰＳＭマッピングは、この問題を軽減することができ、将来の解析のために開発されることになる、１つの手法の代表である。

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【0203】

ダイナミックレンジ。３粒子型パネルを、タンパク質濃度の広いダイナミックレンジにわたって試料中のタンパク質をアッセイするその能力について評定した。質量分析により同定したタンパク質に対応する特徴強度を、同じ濃度の同じタンパク質について他のアッセイにより判定した値と比較した。質量分析による解析およびデータ処理の後、ＭＳ２ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を使用して、粒子パネル内の別個の粒子型のコロナに存在するペプチドおよび関連タンパク質を同定した。並行して、プロテオグラフワークフローによるコロナ解析のための３粒子型パネルを使用しない、血漿試料中のペプチドの直接検出も行った。ＯｐｅｎＭＳ ＭＳデータ処理ツールを使用してモノアイソトピックピーク値を抽出して判定して、全ての実測特徴の最大ＭＳ判定強度を有する得られたペプチド特徴を、各タンパク質について選択した。次いで、ＭＳ判定強度を、同じタンパク質についての匹敵する既報の存在量レベルに対してモデル化した。図２５は、血漿タンパク質に対する３粒子型パネル内の各粒子型についての別個のナノ粒子型からの別個のコロナにおけるタンパク質の最大強度と、他のモデルを使用した判定した同じタンパク質の濃度との相関関係を示す。回帰モデルの傾きと測定データの強度スパンによって示されるように、粒子コロナは、より低い存在量のタンパク質ヒットを、血漿が有するよりも多く有した。加えて、それらの測定値のダイナミックレンジは、回帰モデルの傾きの低減により示される通り、血漿測定と比較して粒子測定について圧縮され、したがって、粒子が、血漿中と比較してコロナ中のタンパク質存在量の測定ダイナミックレンジを有効に圧縮したことを示した。これは、絶対タンパク質濃度と、粒子に対するタンパク質結合親和性と、隣接タンパク質とのタンパク質相互作用との組合せに起因し得る。これらの結果は、別個の粒子型に対応する別個のコロナにおけるタンパク質の濃縮のために多粒子型パネルを使用する本明細書で開示する方法が、広範囲の血漿タンパク質、特に、従来のプロテオーム技術では迅速な検出が困難である低存在量のものについての同定を助長したことを示す。
（実施例６）
コロナ解析アッセイの精度

【0204】

この実施例は、コロナ解析アッセイの精度を説明する。アッセイの反復性および再現性の尺度である精度を、同じ条件下での複数の測定値の比較および個々の測定値間のばらつきの判定により評定した。粒子タンパク質コロナ解析プロテオグラフワークフローの再現性を調査するために、３つの粒子型の各々について３回の完全アッセイ反復からペプチドＭＳ特徴強度を抽出し、比較した。ｏｐｅｎＭＳの一連のプログラムからのｍｓｃｏｎｖｅｒｔ．ｅｘｅユーティリティを使用して、各反復の生ＭＳファイルを、標準的な互換性ＭＳファイル形式であるｍｚＭＬ形式に変換した。また、ｏｐｅｎＭＳ処理パイプラインを使用して、滞留時間とｍｚ値を重ね合わせることによりＭＳ１特徴を生データから抽出し、アライメントを行って群にした。３回の反復の各々からの特徴を有する群を選択し、クラスタリングアルゴリズムの品質スコアに基づいてフィルター処理を行って下位１０分の１を除去した（特徴群の９０％をその後の精度解析のために保持した）。ＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１ナノ粒子について、それぞれ合計２，７４４、２，７８５および３，２０９のクラスター化された特徴群を精度解析に使用した。これらの特徴群についての反復の各々についてのｌｏｇ変換した生強度の分布を図２６にプロットし、各粒子型の値を、表示を付けたパネルに提示した。図２６に示されているように、各粒子型の特徴データには非常に再現性があり、この再現性は、高強度特徴と低強度特徴の両方にわたって一貫していた。

【0205】

生データの目視検査よりも定量的に性能を評定するために、群の特徴強度を分位正規化した後に粒子コロナの全体精度を推定した。この正規化法は、比較する全ての分布が同一であるはずであるという仮定に基づくものであったので、比較する分布ごとに強度を調整する。この前提は、粒子型自体の物理的特徴およびこれらの粒子の別の分析（例えば、Ｘ線光電子分光分析、透過型電子顕微鏡法および他の分析法での）からの物理的特徴の再現性を考えると、妥当である。正規化値を用いて、標準偏差を評価し、対数処理データの適切な変換を使用して変動係数（ＣＶ）を決定した。各粒子について、ＣＶ（分位正規化ＣＶのパーセント、すなわちＱＮＣＶ％）中央値を表８に示す。この結果は、粒子により測定されるタンパク質ＭＳ特徴強度が、合理的な小規模研究において比較的小さい差を検出するために観察される何千ものＭＳ特徴強度にわたって十分な精度を有することを実証する。例えば、２５％ＣＶを仮定すると、ボンフェローニ補正有意性を用いて２倍の変化を検出するための検出力はおおよそ１００％であった。

【0206】

比較する全ての分布が同一であるはずであることを事前に仮定し、比較する分布各々についての強度を適切に調整する、分位正規化を使用して、群特徴強度を正規化することによって粒子コロナの全体精度を推定した。正規化値を用いて、標準偏差を評価し、対数処理データの適切な変換を使用して変動係数（ＣＶ）を決定した。各粒子型について、ＣＶ（分位正規化ＣＶのパーセント、すなわちＱＮＣＶ％）中央値を表８に示す。低い変動係数（ＣＶ）は、高度のアッセイ精度を示す。

【表8】

【0207】

この結果は、粒子により測定されるタンパク質ＭＳ特徴強度が、合理的な小規模研究において比較的小さい差を検出するために観察される何千ものＭＳ特徴強度にわたって十分な精度を有することを実証した。
（実施例７）
コロナ解析アッセイの正確度

【0208】

この実施例は、コロナ解析アッセイの正確度を説明する。方法の正確度は、バイオマーカー発見および検証研究において試料の真の群間差を検出するために十分ロバストであるべきである。コロナ解析アッセイの正確度は、コロナ解析アッセイ結果を他の方法によって得た結果と比較することにより判定した。コロナ解析アッセイの正確度を評価するために、ＳＰ－００７ナノ粒子を使用してスパイク回収率研究を行った。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、その内在性レベルの測定値に基づいて解析に選択した。ＣＲＰについて酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により判定した内在性血漿レベルを使用して、既知量の精製タンパク質（「方法」を参照されたい）を、その内在性レベルの試験可能な倍数になるようにスパイクした。スパイクした後のＣＲＰレベルをＥＬＩＳＡによる実験によって判定して、１倍（未スパイク）、２倍、５倍、１０倍および１００倍の試料について、それぞれ、４．１１、７．１０、１１．５、２２．０および２１５．０μｇ／ｍＬであった。ＳＰ－００７粒子を用いてＭＳにより検出した４つの示されているＣＲＰトリプシンペプチドについて、抽出ＭＳ１特徴強度をＣＲＰ濃度に対してプロットした（図１４Ａ）。図３０もまた、４つの異なるペプチドのスパイク回収率実験におけるＳＰ－００７粒子でのＣＲＰタンパク質の測定の正確度を示す。ＣＲＰの未スパイク１倍濃度のペプチドのうちの２つについて、ＭＳ１特徴強度を検出することができなかった。所与の特徴のスパイク強度を使用してフィットした線は線形モデルであった。

【0209】

ＣＲＰトリプシンペプチドの４つ全てに対する回帰モデルのフィッティングにより、ＥＬＩＳＡ血漿レベルに対するコロナＭＳシグナル強度の応答について、完璧な分析性能であると見なされる１の傾きに近い０．９の傾き（９５％ＣＩ ０．８１～０．９８）を得た。対照的に、関連ＭＳ特徴からのシグナルに試料による差が見られないはずである５つの血漿試料のうちの少なくとも４つにおいて同定された１，３０８の他の（非スパイク）ＭＳ特徴にフィットした類似の回帰モデルは、－０．０８６（９５％ＣＩ －０．１～－０．０６８）の傾きを有した。これらの結果は、試料間の差を正確に表すその粒子型の能力が、可能性のあるマーカーを比較研究において定量するのに有用なツールとなることを示した。何らかの因子に起因して試料中のタンパク質レベルが変化した場合、本明細書で開示する方法は、粒子パネルの粒子型に結合しているタンパク質の同様のレベル変化を検出することになり、これは、任意の所与のアッセイにおいて有効であるための本粒子型の非常に重要特性である。さらに、スパイクしたタンパク質のペプチド特徴の応答は、適切な較正により、粒子タンパク質コロナ法を使用して相対定量のみではなく絶対分析物レベルを判定することができたことも示唆する。
（実施例８）
ＮＳＣＬＣ試料および健常対照のプロテオーム解析

【0210】

この実施例は、ＮＳＣＬＣ試料および健常対照のプロテオーム解析を説明する。コロナ解析プラットフォームの潜在的有用性を実証するために、単一の粒子型、ＳＰ－００７と、対象５６名（ステージＩＶ ＮＳＣＬＣを有する２８名ならびに年齢および性別をマッチさせた対照２８名）からの血清試料とを使用して群間の差を観察して、プラットフォームの能力を評価した。選択した対象試料は、群間に差がある可能性のあるＭＳ特徴を同定するためのかなりバランスのよい研究を意味した。対象の年齢および性別特徴を表６に要約し、疾患状態および併存疾患を含む対象アノテーションに関する全データを表９にまとめる。

【表9】

【0211】

ＭＳ１特徴の収集およびフィルター処理、続いてそれらの強度のｌｏｇ２変換の後、データセットは、クラスを考慮せずにスケーリングした中央値であった。

【0212】

図２９は、５６の対象データセット全てについての正規化強度分布を示す。このＮＳＣＬＣ対対照研究からの５６の試料ＭＳ生データファイル全てをＯｐｅｎＭＳパイプラインスクリプトにより処理して、ＭＳ１特徴およびそれらの強度を抽出し、ｍｚと指定許容範囲内のＲＴ値の重複に基づいてそれらを特徴群にクラスター化した。１）比較のアームの少なくとも１つからの群における特徴の少なくとも５０％存在を有し、かつ２）第１四分位数より上の特徴群クラスター品質を有した特徴群のみを、保持した。保持した特徴は、クラスを考慮せずに正規化した中央値であり、これらの特徴をその後の単変量分析比較に使用した。分布の検査により外れ値はなく、全てのデータセットを単変量解析のために保持した。

【0213】

検査により外れ値データセットに見えるものは一切なかった。クラス間の特徴群強度の単変量比較を、ノンパラメトリックウィルコクソン検定（両側）で行った。比較について得られたｐ値を、ベンジャミニ・ホッホベルクの方法を使用して多重検定用に補正した。図２７に要約されているように、０．０５の調整ｐ値カットオフを使用して、合計７つの特徴群が統計的有意性を実証した。

【0214】

ＮＳＣＬＣ罹患群と対照群の間で存在度が異なると同定されたタンパク質の５つ全てが、実際にＮＳＣＬＣ自体でないにしても、がんに以前に関係付けられていた。ＰＯＮ１、すなわちパラオキソナーゼ（paraoxanase）－１は、肺がんの際に、リスク因子としての
比較的よく見られる小さい対立遺伝子バリアント（Ｑ１９２Ｒ）の関与を含む複雑なパターンを有する。タンパク質レベルでは、ＰＯＮ１は、肺腺癌の際にやや減少される。ＳＡＡ１は、ＭＳ関連研究においてＮＳＣＬＣの際に過剰発現されることが示されている急性期タンパク質であり、同定されたペプチドは、罹患対象では５．４倍増加されることが判明した。マトリソーム因子テネイシンＣ（ＴＥＮＡ）は、原発性肺腫瘍および関連リンパ節転移の際に正常組織と比較して増加されることが示されており、関連ＭＳ特徴は、２倍増加されることがこの研究で判明した。神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ１）は、肺神経内分泌腫瘍を診断するためのマーカーとして役立つ。ＦＩＢＡペプチドは、ＭＳによる解析によって肺がんの悪化の進行と相関するレベル増加で同定された。特に注目すべきは、対照対象と罹患対象間で差を示す２つの未知の特徴、群２および群７である。群２は、対照５６名のうちの５４名に認められ、罹患対象では小規模な３３％減少を有した。対照的に、群７は、罹患対象（このクラスのメンバー２８名のうちの１４名）にのみ認められた。これらの結果は、異なる病状のための既知および未知のマーカーを同定するのに役立つ粒子コロナの潜在的有用性を実証した。
（実施例９）
試料中のタンパク質をアッセイするための粒子パネル

【0215】

この実施例は、試料中のタンパク質をアッセイするための１０粒子型粒子パネルを例証する。表１０に示すこの粒子パネルは、サイズ、電荷およびポリマーコーティングが異なる１０の別個の粒子型を含む。この粒子パネルの全ての粒子型は、超常磁性である。下記に示すパネルを使用して試料中のタンパク質をアッセイした。

【表10】

【0216】

Ｖ１パネルのタンパク質カバレッジ。臨床試料セットにおける複数の試料にわたって見られる全タンパク質群カバレッジを評価するために、個体１６名からの血漿試料を、１０の別個の粒子型のパネルであって、表１０に示あれており、Ｖ１パネルと呼ばれるパネルについて、本明細書に記載する試料調製、ＭＳデータ収集およびＭＳデータ解析法を使用して評価した。小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者と健常個体（各々についてｎ＝８）の組合せを使用して、本明細書に記載の方法を使用する解析および同定のための、健常細胞とがん細胞の両方に存在するタンパク質およびタンパク質群の多様なセットを得た。１％ＦＤＲ（タンパク質およびペプチド）率で、合計２，００９のタンパク質群を効率的に同定した。比較のために、前に言及した公開研究では、７０を超えるステップおよび１試料当たり３０を超えるＭＳ画分を含み、完了するまで数週間かかる可能性が高い複雑なワークフローで、１６の個々の血漿試料にわたって４，５００のタンパク質群が検出された。
（実施例１０）
タンパク質アッセイのための１０粒子型粒子パネル

【0217】

この実施例は、本明細書に記載の、生体分子コロナ解析を使用してタンパク質をアッセイする方法のための１０粒子型粒子パネルの開発を例証する。

【0218】

粒子スクリーン。ガイド粒子を加えることによりコロナ解析プラットフォームがそのカバレッジを拡大することができることを実証するための、別個の物理化学的性質を有する４３の粒子型であって、本明細書で開示する３粒子型粒子パネルと同様の方法でスクリーニングした４３の粒子型からの生体分子コロナ。

【表11-1】

【表11-2】

【0219】

４３の粒子型を、方法セクションで説明した通りの６つの条件を使用して評価し、最適な条件を二次解析で使用して、同定されたタンパク質の総数に基づいて最高の組合せを選択した。生体試料にわたってのプラットフォーム検証を実証するために、３粒子型粒子パネルに使用したＣＲＣプールとは異なる、健常および肺がん患者の血漿プールを使用して、４３粒子型スクリーニングを行った。プール試料を使用してタンパク質の多様性を増大させた。厳しい条件を使用して、パネル選択および最適化のための可能性のあるタンパク質を同定した。最大可能性評価のために、タンパク質は、３回の完全アッセイ反復の各々において少なくとも１つのペプチド－スペクトルマッチ（ＰＳＭ；１％偽陽性率（ＦＤＲ））により、「同定されたもの」として計数されることを示されなければならなかった。個々の一意のＵｎｉｐｒｏｔ識別子の最大数を有するパネルを１０粒子型粒子パネルに選択した。

【0220】

１０粒子型粒子パネルのタンパク質カバレッジ。本明細書で開示するデータは、提供する粒子パネルを使用して、多くの生体試料にわたってプロテオーム含有率の変化を判定することができることを確証する。本明細書で開示される粒子パネルは、高い精度および正確度を有し、既知タンパク質に対する特異的配位子を必要としない偏りのない手法をとる方法を提供する。したがって、これらのパネルは、バイオマーカー発見に特によく適している。１０粒子型パネルを使用する血漿タンパク質カバレッジの幅および深度を調査した。ＭＳ導出血漿タンパク質強度（濃度と密接な相関関係があるものの１つ）のデータベース（ｎ＝５，３０４）を使用して、１０粒子型パネルのカバレッジをデータベースの全範囲と比較し、単純血漿のＭＳ評価（粒子に基づく試料抽出を伴わない同じ血漿のＭＳによる直接解析）により得られたカバレッジとも比較した。図３６は、ＭＳ強度の５，３０４血漿タンパク質データベースに対する１０の別個の粒子型の粒子パネルのマッチングおよびカバレッジを示す。データベースタンパク質についてのランク付けされた強度が一番上のパネル（「データベース」）に示されており、単純血漿ＭＳ評価からのタンパク質の強度が、２番目のパネル（「血漿」）に示されており、最適な１０粒子パネルの強度が残りのパネルに示されている。血漿タンパク質強度データベースは、Keshishian et al. (2015). Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury. Molecular & Cellular Proteomics, 14(9), 2375-2393からのものである。図３６に示されている結果は、図２６に示されている精度実験で使用した上記の３つの別個の粒子型の粒子パネルについて示した結果を確証し、拡大した。１０の別個の粒子型の粒子パネルは、単純血漿についての２６８のタンパク質に対して、１，５９８のタンパク質を同定した。さらに、個々の粒子型各々は、単純血漿のＭＳによる直接解析より実質的に多くのタンパク質を検出した。単純血漿に関するＭＳによる解析とは異なり、１０の別個の粒子型の粒子パネルは、血漿タンパク質の濃度の全ての範囲を照合した。別の言い方をすれば、単純血漿試料から同定されたタンパク質は、より強度の大きいタンパク質（すなわち、より存在量の多いタンパク質）に偏っていたが、１０の別個の粒子型の粒子パネルから同定されたタンパク質は、データベースにおける濃度のダイナミックレンジが８桁を超えて拡大した。データベース内の２１のタンパク質しか、１０の別個の粒子型の粒子パネルからのマッチした最低タンパク質より低い強度を有さなかった。図３６で実証されるように、１０の別個の粒子型の粒子パネルは、高い精度、正確度、および血漿中の広範なタンパク質濃度にわたる広いカバレッジを実証しており、多数の生体分子にわたっての並行した大規模な、偏りのないプロテオーム解析を可能にし、ゲノムデータ収集で現在可能であることのコストおよび速度とマッチし得る。

【0221】

１０の別個の粒子型を含む粒子パネルの精度。この実施例は、１０の別個のナノ粒子型を含む粒子パネルについての粒子コロナの再現性を説明する。粒子を解析して、１０の別個のナノ粒子型を含む粒子パネルの各粒子型についての反復実行間の各特徴群の変動係数（ＣＶ）を決定した。低いＣＶは、反復実行間の高い精度および再現性を示した。データは、ソフトウェアプログラムＯｐｅｎＭＳを使用して処理したものであり、３回の反復の各々からの実測前駆体特徴を有する特徴群を保持した。クラスタリングアルゴリズムの品質スコアに基づいてデータの下位５％を除去して統計的外れ値を消去した。群特徴強度を中央値正規化し、各粒子型のコロナの全体精度を推定した。各注入の全体的な中央値強度が同じままであるように正規化を行い、比較する分布の各々について強度シフト、例えば、機械応答の全体的な差に起因する強度シフトを構成するように、強度を調整した。Ｘ線光電子分光分析、高分解能透過型電子顕微鏡法および他の分析法を含む、様々な分析法において、機械応答に差が生じ得る。次いで、各特徴の変動係数（ＣＶ）の正規化値を、１０の別個のナノ粒子型を含む粒子パネルの各粒子型について評価した。表１２は、１０の別個の粒子型の最適化パネルを示す。

【表12】

【0222】

表１３は、血漿、および１０の別個の粒子型を含む粒子パネルの、特徴、ペプチドおよびタンパク質についての、タンパク質コロナベースのプロテオグラフワークフローの精度評価の分位正規化ＣＶのパーセント（ＱＮＣＶ％）中央値を示す。１％ペプチドおよび１％タンパク質偽陽性率（ＦＤＲ）を適用した。ＭａｘＬＦＱ解析ソフトウェアを使用し、各タンパク質群が少なくとも１のペプチド比の計数値および全ての反復における検出を有するという、精度解析に使用した群の数を低減させる条件を適用して、データを処理した。１０の別個のナノ粒子型を含む粒子パネルの各粒子型についての、分位正規化ＣＶのパーセントすなわちＱＮＣＶ％を含む、ＣＶ中央値を表１３に示す。ＭａｘＱｕａｎｔを使用してペプチドおよびタンパク質レベルで同様の解析を行って、識別可能な特徴群と特徴、ペプチドおよびタンパク質のアライメントを行った（表１３）。ペプチドは、複数の特徴を含むことができ、タンパク質は、複数のペプチドを含むことができるので、識別可能な特徴群の数は、特徴からペプチドへ、そしてタンパク質へと減少する。このナノ粒子パネルは、１％偽陽性率（ＦＤＲ）で１，１８４のタンパク質群を検出した。

【表13】

【0223】

変動係数（ＣＶ）を特徴、ペプチドおよびタンパク質のレベルで独立して調査した。特徴、ペプチドおよびタンパク質ＣＶの解析は、アッセイ精度の包括的な見解をもたらす。ＯｐｅｎＭＳおよびＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアエンジンを特徴、ペプチドおよびタンパク質マッチングに使用した。ＭａｘＱｕａｎｔは、ＦＤＲでのタンパク質群化に使用した。ＯｐｅｎＭＳは、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍマッチングツールを使用してペプチド－スペクトルマッチング（ＰＳＭ）を行うために使用した。Ａｎｄｒｏｍｅｄａアルゴリズムを使用するためにＭａｘＱｕａｎｔを構成した。ペプチドＣＶおよびタンパク質ＣＶを使用して、生物学的変数とともに使用するためのプラットフォームの精度を評定した。平均ＣＶはペプチドサイズの増加とともに減少し、したがって、平均ＣＶは、タンパク質についてよりペプチドについてのほうが低かった。ペプチドは、血漿と同様のＣＶを維持するが、粒子は、血漿よりも高い特徴、ペプチドおよびタンパク質の出現率を有した。詳細には、いずれの所与の粒子型の粒子上のタンパク質の数も血漿より多い（平均：２１８％多い、範囲：１３３％～２９６％多い）が、同等のＣＶ（粒子および血漿についてそれぞれ２１．１％対１７．１％）を維持する。さらに、粒子型のパネルは、１，１８４のタンパク質を同定したが、単独での血漿の場合は１６２のタンパク質しか同定しなかった。

【0224】

１０の別個の粒子型を含む粒子パネルの正確度。１０の別個の粒子型を含む粒子パネルがバイオマーカー発見および検証研究における試料の現実の群間差を検出する正確度を評定した。正確度は、ナノ粒子型ＳＰ－００７およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の存在下でスパイク回収率を測定することにより判定した。スパイク回収率データを、３つの粒子型（ＳＰ－００６、ＳＰ－３３９、ＳＰ－３７４）の各々と組み合わせて、ｏｎｅ ｔｈｒｅｅの追加のポリペプチド（Ｓ１００Ａ８／９、およびアンジオゲニン）の存在下でさらに測定した。既知量の各ポリペプチドを、１０の倍数（例えば、１倍、２倍、５倍、１０倍および１００倍）ずつ増加する異なる濃度でスパイクインした。各ポリペプチドのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。導出ペプチドおよびタンパク質強度をＥＬＩＳＡタンパク質濃度に対してプロットした。ペプチド強度をＯｐｅｎＭＳ ＭＳ１／ＭＳ２パイプラインを使用して導出して、クラスター内の少なくとも１つの特徴に指定される標的タンパク質ＭＳ２ ＩＤを有するクラスター化特徴群を見出した。少なくとも１回の反復で上位スパイクレベルについての表示があったクラスターのみを解析に使用した。ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアを使用してタンパク質強度を導出した。各タンパク質についての強度値を要約し、最大濃度が２になるようにデータをスケーリングした。ＭＳデータセットをスパイク濃度（例えば、１倍、２倍、５倍、１０倍および１００倍）ごとに３回ずつ実行して、１５の個々のタンパク質またはペプチド測定値を得た。全てのペプチドが全ての粒子型または粒子型反復において検出されるとは限らなかった。ＭＳデータセットの結果を図３１～３４に示す。図３１は、スパイク回収率実験におけるアンジオゲニンのペプチド特徴測定の正確度を示す。図３２は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ８のペプチド特徴測定の正確度を示す。図３３は、スパイク回収率実験におけるＳ１０Ａ９のペプチド特徴測定の正確度を示す。図３４は、スパイク回収率実験におけるＣＲＰのペプチド特徴測定の正確度を示す。フィットした線は、各特徴のスパイク強度への線形フィットである。

【0225】

図３１～３４は、アンジオゲニン、Ｓ１０Ａ８、Ｓ１０Ａ９およびＣＲＰペプチド特徴測定の正確度をそれぞれ判定するための３回のスパイク回収率実験の結果を示す。データは、ペプチド（平均ｒ^２が０．８１である）およびタンパク質（平均ｒ^２が０．９７である）についての個々の測定間の高い相関度を実証した。全てのタンパク質にわたっての傾きの平均値は１．０６である。表１４は、比較ごとのｒ^２相関を示し、タンパク質ごとの平均ｒ^２相関も示す。２０のペプチドのうち２つだけは、２つの異なる粒子型に関するＥＬＩＳＡアッセイ間で相関を示さず、この場合、１つのペプチドが２つの電荷状態で存在した。これらの異常は、ペプチドサイズの増加とともに減少し、したがって、異常の頻度は、タンパク質についてよりペプチドについてのほうが低かった。ここで２つの異なる粒子に関してＥＬＩＳＡで相関を示した２つのペプチドは、他の粒子型でのＥＬＩＳＡと高い相関度を示した。問題を起こすペプチドは、そのシグナルを、例えば電荷を奪うことによって、隠蔽する別のペプチドと、共溶出されることがある。

【0226】

表１４は、コロナ解析またはＥＬＩＳＡにより測定したときのタンパク質強度に対する回帰フィットの要約を提供する。個々の粒子型についての、粒子型ごとに４回の反復間で平均した値を示す。タンパク質濃度は、コロナ解析で測定すると、様々な条件および様々な粒子型にわたって一致した。表１４に示されているように、タンパク質測定値は、高いｒ^２値（平均値０．９７、個々の粒子間の範囲０．９２～１．０；粒子間で平均した範囲０．９４～０．９９）により示されるように、よく相関した。ＥＬＩＳＡにより測定したときの４タンパク質間のこの一貫した挙動は、コロナ解析アッセイの正確度を例証する。

【表14】

【0227】

他のプラットフォームとの比較。パネル内の各タンパク質型に対応する別個のコロナにおけるタンパク質を濃縮するために多粒子型パネルを使用する本明細書で開示する方法（例えば、プロテオグラフワークフローを使用するコロナ解析）は、プロテオームにおけるタンパク質同定の広い、偏りのないカバレッジを提供する。プロテオームの広いカバレッジを達成しようとする他の方法は、複数の分画ステップ、複雑なワークフローを必要とし、本明細書で提示する方法と比較して遅い。他の方法は、本明細書で開示する方法の幅および不偏性を欠いており、他の方法を、タンパク質をアッセイする本明細書で開示する方法とここで比較する。

【0228】

Ｇｅｙｅｒら（Cell Systems 2016）は、高速ショットガンプロテオーム手法を利用
し、１アッセイ当たり平均２８４のタンパク質群、および全ての反復にわたって３２１のタンパク質群を得た。評定は、おおよそ１，０００のタンパク質群を生じさせる分画を伴う、より緩徐な複数日プロトコールを利用した。反復実験は、恐らく法外なコストおよび時間要件のため行われず、そのため分散が判定され得なかった。

【0229】

Ｇｅｙｅｒは、短時間の実行を使用して３２１のタンパク質群を生成し、各タンパク質のＣＶを決定した。Ｇｅｙｅｒらにより評定された３２１の群、および１０粒子型パネルにより同定した１，１８４のタンパク質群は、これら２つのモデル間に共通する８８のタンパク質群を含んだ。タンパク質群は、検出されたペプチドに基づいて別様に組み合わせることができる複数の関連タンパク質を含み得るので、８８の共通タンパク質群の同定は、予想外に高度である。

【0230】

８８の共通タンパク質群について、Ｇｅｙｅｒらからのデータを解析し、１２．１％のＣＶ中央値を決定した。対照的に、同じ８８の共通タンパク質群は、プロテオグラフにより解析した場合、わずか７．２％というより低いＣＶを有した。したがって、多粒子型パネルおよびプロテオグラフワークフローを使用するコロナ解析の本方法は、Ｇｅｙｅｒらの方法よりも向上した精度を提供する。加えて、Ｇｅｙｅｒらの評定は、４つのタンパク質について０．９９の、アッセイ正確度を示す、ｒ^２を示した。同様に、プロテオグラフアッセイは、０．９７のｒ^２を示した。

【0231】

Ｇｅｙｅｒらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断アッセイに一般に使用されるカットオフであるＣＶ＜２０％を有するタンパク質群の数をさらに評定した。本粒子パネル法は、ＣＶ＜２０％を有する７６１のタンパク質群を検出し、これは、Ｇｅｙｅｒらにより同定された数より３．７倍多かった。Ｄｒ．Ｍａｎｎ（Niu et al, 2019）によるさらなる評定は、ＣＶ＜２０％を有する２７２のタンパク質群を同定し、この数は、本明細書で開示される多粒子型パネルおよびそれらの使用方法により同定された数の２．８分の１であった。

【0232】

Ｂｒｕｄｅｒｅｒらは、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓプラットフォームにより生成されたデータを使用してタンパク質群ＣＶを評定した（Bruderer et al, 2019）。この評定は、４
６５のタンパク質を同定し、これらの４６５のタンパク質は、５．２％のＣＶ中央値を有し、これらのタンパク質のうちの４０４は、ＣＶ＜２０％を有した。対照的に、本明細書で開示する方法を使用して同定した１，１８４のタンパク質からの最良の４６５のタンパク質は、４．７％のＣＶ中央値を有し、プロテオグラフにより同定した１，１８４のタンパク質のうちの７６１は、ＣＶ＜２０％を有した。

【0233】

Ｇｅｙｅｒら、Ｎｉｕら、およびＢｒｕｄｅｒｅｒらの評定と比較すると、本粒子パネルは、他の同定方法と比較して、ＣＶ閾値を満たすタンパク質の数ばかりでなくタンパク質の同等の数についてのＣＶの改善をもたらした。本明細書で開示される方法は、他の方法、例えば、標的質量分析および他の分析物特異的試薬（例えば、Ｏｌｉｎｋ）と比べて、偏りの低減をさらに有する。そのような手法は、小数のあらかじめ選択されたタンパク質を測定することによって、タンパク質パネル選択プロセス中に偏りを導入する。結果として、これらの手法は、プロテオグラフにより同定されたタンパク質と比較して彼らのパネルでのタンパク質について低いＣＶおよび高いｒ^２を有し、パネルでのタンパク質の検出に限定される。
（実施例１１）
粒子合成のための材料および方法

【0234】

この実施例は、粒子合成のための材料および方法を説明する。

【0235】

材料。塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物ＡＣＳ、酢酸ナトリウム（無水ＡＣＳ）、エチレングリコール、水酸化アンモニウム２８～３０％、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（≧９８％、Ｐｒｏ－Ｐｕｒｅ、プロテオームグレード）、エタノール（試薬アルコールＡＣＳ）およびメタノール（≧９９．８％ＡＣＳ）は、ＶＷＲから購入した。Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（９９％）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。クエン酸三ナトリウム二水和物（ＡＣＳ試薬、≧９９．０％）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）（試薬グレード、９８％）、３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（ＭＰＳ）（９８％）およびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ、平均Ｍｎ５００、阻害剤として１００ｐｐｍのＭＥＨＱ、阻害剤として２００ｐｐｍのＢＨＴを含有する）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ、９８％、約１８％水含有）およびジビニルベンゼン（ＤＶＢ、８０％、異性体の混合物）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入し、短いシリカカラムに通すことにより精製して阻害剤を除去した。Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）は、ＴＣＩから購入し、短いシリカカラムに通すことにより精製して阻害剤を除去した。ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を測定するためのＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ヒト血清から精製されたヒトＣＲＰタンパク質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。

【0236】

超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）に基づくＳＰ－００３、ＳＰ－００７およびＳＰ－０１１の合成。酸化鉄コアをソルボサーマル反応により合成した（図２８Ａ～Ｅ、最上部（図２８Ａ））（Liu, J., et al. Highly water-dispersible biocompatible
magnetite particles with low cytotoxicity stabilized by citrate groups. Angew Chem Int Ed Engl 48, 5875-5879 (2009)；Xu, S., et al. Toward
designer magnetite/polystyrene colloidal composite microspheres with controllable nanostructures and desirable surface functionalities. Langmuir
28, 3271-3278 (2012)）。典型的には、約２６．４ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物を約２２０ｍＬのエチレングリコールに約１６０℃で約１０分間、攪拌しながら溶解した。次いで、約８．５ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物および約２９．６ｇの無水酢酸ナトリウムを添加し、さらに約１５分間１６０℃で混合することにより完全に溶解した。次いで、その溶液をテフロン（登録商標）裏打ちステンレス鋼オートクレーブ（容量３００ｍＬ）内に密封し、約１２時間、約２００℃に加熱した。室温に冷却した後、黒色常磁性生成物を磁石により単離し、ＤＩ水で３～５回洗浄した。最終生成物をさらなる使用のために凍結乾燥させて黒色粉末にした。

【0237】

シリカコーティングが施されている酸化鉄ナノ粒子（ＳＰ－００３）は、以前に報告された改良型ストーバー法によって調製した（図２８Ｂ）（Deng, Y., Qi, D., Deng,
C., Zhang, X. & Zhao, D. Superparamagnetic high-magnetization microspheres with an Fe3O4@SiO2 core and perpendicularly aligned mesoporous SiO2 shell for removal of microcystins. J Am Chem Soc 130, 28-29 (2008)；Teng, Z.G., et al. Superparamagnetic high-magnetization composite spheres with highly aminated ordered mesoporous silica shell for biomedical
applications. J Mater Chem B 1, 4684-4691 (2013)）。典型的には、約１ｇ
のＳＰＩＯＮをエタノール（約４００ｍＬ）とＤＩ水（約１０ｍＬ）と濃厚アンモニア水溶液（約１０ｍＬ、２８～３０重量％）との混合物に均一に分散させ、その後、ＴＥＯＳ（約２ｍＬ）を添加した。約７０℃で約６時間攪拌した後、非晶質のシリカコーティングが施されているＳＰＩＯＮ（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＳｉＯ_２と表示する）を得、メタノールで３回、水でさらに３回洗浄し、最終生成物を凍結乾燥させて粉末にした。

【0238】

ＳＰ－００７（ＰＤＭＡＰＭＡ修飾ＳＰＩＯＮ）およびＳＰ－０１１（ＰＥＧ修飾ＳＰＩＯＮ）を調製するために、ビニル基官能化ＳＰＩＯＮ（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳと表示する）を、以前に報告された改良型ストーバー法によって、先ず調製した（図２８Ｃ）（Crutchfield, C.A., Thomas, S.N., Sokoll, L.J. & Chan, D.W. Advances in mass spectrometry-based clinical biomarker discovery. Clin Proteomics 13, 1 (2016)）。手短に述べると、ボルテックス処理（または超音波処理）の助けをかりつ
つ、約１ｇのＳＰＩＯＮをエタノール（約４００ｍＬ）とＤＩ水（約１０ｍＬ）と濃厚アンモニア水溶液（約１０ｍＬ、２８～３０重量％）との混合物に均一に分散させ、その後、ＴＥＯＳ（約２ｍＬ）を添加した。７０℃で約６時間攪拌した後、約２ｍＬの３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを反応混合物に添加し、約７０℃で一晩攪拌した。ビニル官能化ＳＰＩＯＮを得、メタノールで３回、水でさらに３回洗浄し、最終生成物を凍結乾燥させて粉末にした。次に、ポリ（ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＰＤＭＡＰＭＡと表示する；図２８ＤのＳＰ－００７）の合成のために、約１００ｍｇのＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳを約１２５ｍＬのＤＩ水に均一に分散させた。約３０分間、Ｎ_２でバブリングした後、約２ｇのＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）および約０．２ｇのジビニルベンゼン（ＤＶＢ）をＮ_２保護下でＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳ懸濁液に添加した。得られた混合物を約７５℃に加熱した後、約５ｍＬのＤＩ水中の約４０ｍｇの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を添加し、約７５℃で一晩攪拌した。冷却した後、Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＰＤＭＡＰＭＡを磁石で単離し、水で３～５回洗浄した。最終生成物を凍結乾燥させて暗褐色粉末にした。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コーティングが施されているＳＰＩＯＮ（Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＰＥＧＯＭＡと表示する；図２８ＥのＳＰ－０１１）の合成のために、約１００ｍｇのＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳを約１２５ｍＬのＤＩ水に均一に分散させた。約３０分間、Ｎ_２でバブリングした後、約２ｇのポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ、平均Ｍｎ ５００）および約５０ｍｇのＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）をＮ_２保護下でＦｅ_３Ｏ_４＠ＭＰＳ懸濁液に添加した。得られた混合物を約７５℃に加熱した後、約５ｍＬのエタノール中の約５０ｍｇの４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）を添加し、約７５℃で一晩攪拌した。冷却した後、Ｆｅ_３Ｏ_４＠ＰＯＥＧＭＡを磁石で単離し、水で３～５回洗浄した。最終生成物を凍結乾燥させて暗褐色粉末にした。
（実施例１２）
患者試料

【0239】

この実施例は、本開示で使用した患者試料を説明する。８つ大腸がん（ＣＲＣ）血漿試料と８つの年齢および性別をマッチさせた対照のセットをＢｉｏＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から購入した。２８の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）血清試料と年齢および性別をマッチさせた２８の対照のセットも、ＢｉｏＩＶＴから購入した。ＣＲＣ／ＮＳＣＬＣ患者試料および対照に関する詳細な情報を表１５および表１６に示す。

【表15-1】

【表15-2】

【表15-3】

【表15-4】

【表15-5】

【表15-6】

【表16】

（実施例１３）
粒子型の物理化学的特性の特徴付け。

【0240】

この実施例は、様々な技法による粒子物理化学的特性の特徴付けを説明する。動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）で行った。試験前に約１０分の浴超音波処理を用いて粒子を水に１０ｍｇ／ｍＬで懸濁させた。次いで、試料を、ＤＬＳ測定とゼータ電位測定の両方のために、それぞれの緩衝剤中おおよそ０．０２重量％に希釈した。ＤＬＳは、約１分の温度平衡時間で使い捨てポリスチレンセミマイクロキュベット（ＶＷＲ、Ｒａｎｄｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）において水中、約２５℃で行い、１７３°後方散乱モードで６３３ｎｍのレーザーを用いる、約１分の３回の実行からの平均からなった。キュムラント法を使用して、ＤＬＳ結果を解析した。ゼータ電位は、約１分の平衡時間で、使い捨て折りたたみキャピラリーセル（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＰＮ ＤＴＳ１０７０）において約２５℃で、５％ ｐＨ７．４ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＰＮ １００１０－０２３、ＵＳＡ）中で測定した。最低１０回実行および最大１００回実行し、測定と測定の間に１分保持して、自動測定時間で３回の測定を行った。Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデルを使用して、電気泳動移動度からゼータ電位を決定した。

【0241】

走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）は、ＦＥＩ Ｈｅｌｉｏｓ ６００ Ｄｕａｌ－Ｂｅａｍ ＦＩＢ－ＳＥＭを使用することにより行った。粒子の水性分散液を、計量済み粒子粉末から約１０分の超音波処理によりＤＩ水に再分散させて約１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。次いで、試料をメタノール（Ｆｉｓｈｅｒからのもの）によって４倍希釈して水／メタノール中の分散液にし、これを電子顕微鏡法に直接使用した。Ｔｅｄ ＰｅｌｌａからのＳｉウェーハ上に約６μＬの粒子試料をドロップキャストすることによりＳＥＭ基板を調製し、次いで、液滴を測定前に約２４時間、真空デシケーターの中で完全に乾燥させた。

【0242】

３００ｋＶの加速電圧でＴｉｔａｎ ８０－３００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を低分解能ＴＥＭ測定と高分解能ＴＥＭ測定の両方に使用した。水－エタノール混合物（２５－７５ｖ／ｖ％）中の粒子分散液約２μＬを約０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度でドロップキャストすることによりＴＥＭグリッドを調製し、ＴＥＭ分析前に約２４時間、真空デシケーターの中で乾燥させた。全ての測定は、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａからのレース状穴あきＴＥＭグリッドで行った。

【0243】

Ｘ線光電子分光分析（ＸＰＳ）は、ＰＨＩ ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅおよびＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＳＣＡＬＡＢ ２５０ｅ ＩＩＩを使用することにより行った。ＸＰＳによる分析は、粒子微粉末を用いて行い、これらの粉末は、測定前には乾燥下で密封および保管状態に保った。材料を分析のために均一な表面にするようにカーボンテープに載置した。淡色Ａｌ Ｋ－アルファＸ線源（５０Ｗおよび１５ｋＶ）は、２００μｍ^２走査領域に対して１４０ｅＶの通過エネルギーで使用し、全ての結合エネルギーは、２８４．８ｅＶのＣ－Ｃピークを基準にした。サーベイスキャンと高分解能スキャンの両方を行って、目的の元素を詳細に評定した。各元素の原子濃度は、試料の２カ所の異なる位置からの結果を平均することによって相対原子感度係数により補正した、元素の光電子放出特徴の積分強度から決定した。一部の場合には、４カ所またはそれより多くの位置を平均して均一性を評定した。
（実施例１４）
タンパク質コロナ調製およびプロテオーム解析

【0244】

この実施例は、タンパク質コロナ調製およびプロテオーム解析を説明する。血漿および血清試料を、０．０５％ＣＨＡＰＳを含有するＴＥ緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ二ナトリウム、１５０ｍＭ ＫＣｌ）で構成されている希釈用緩衝剤で１：５希釈した。粒子粉末を、ＤＩ水中での約１０分間の超音波処理、続いての約２～３秒のボルテックス処理により、再構成した。タンパク質コロナを作製するために、マイクロタイタープレートにおいて約１００μＬの粒子懸濁液（ＳＰ－００３、５ｍｇ／ｍｌ；ＳＰ－００７、２．５ｍｇ／ｍｌ；ＳＰ－０１１、１０ｍｇ／ｍｌ）を約１００μＬの希釈された生体試料と混合した。プレートを密封し、３７℃で約１時間、３００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、プレートを約５分間、磁石の集合体の上に置いて、ナノ粒子をペレット化して沈降させた。上清中の未結合タンパク質をピペットで除去した。タンパク質コロナを磁気分離しながら約２００μＬの希釈用緩衝剤で３回、さらに洗浄した。１０粒子型粒子パネルスクリーンのために評価した５つの追加のアッセイ条件は、以下のうちの１つを例外として、上記説明と同一であった。第１に、元の粒子濃度の５０％の濃度（予想ペプチド収量に依存して、各粒子について２．５～１５ｍｇ／ｍｌ）であった低濃度の粒子を評価した。第２および第３のアッセイ変形形態については、低い粒子濃度と高い粒子濃度の両方を、緩衝剤で粒子を希釈するのではなく未希釈の生血漿を使用して実行した。第４および第５のアッセイ変形形態については、低い粒子濃度と高い粒子濃度の両方を、ｐＨ５クエン酸緩衝剤を希釈とすすぎの両方に使用して実行した。

【0245】

ナノ粒子上に結合したタンパク質を消化するために、トリプシン消化キット（ｉＳＴ ９６Ｘ、ＰｒｅＯｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、提供されたプロトコールに従って使用した。手短に述べると、約５０μＬの溶解用緩衝剤を各ウェルに添加し、約９５℃で約１０分間、攪拌しながら加熱した。プレートを室温に冷却した後、トリプシン消化用緩衝剤を添加し、プレートを約３７℃で約３時間、振盪しながらインキュベートした。消化プロセスを停止用緩衝剤で停止させた。上清をナノ粒子からマグネティックコレクターにより分離し、キットに含まれていたペプチドクリーンアップカートリッジによりさらに清浄化した。ペプチドを約７５μＬの溶出用緩衝剤で２回溶出し、併せた。ペプチド濃度をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からの定量的比色分析ペプチドアッセイキットにより測定した。

【0246】

次に、ペプチド溶出物を凍結乾燥させ、０．１％ＴＦＡで再構成した。各試料からの２μｇの分割量を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにインターフェースで接続したＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いてｎａｎｏ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ペプチドを捕捉カラムに負荷し、７５μｍ分析用カラムを用いて３５０ｎＬ／分で溶出させた。両方のカラムにＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）からのＬｕｎａ Ｃ１８樹脂が充填されていた。質量分析計をデータ依存モードで操作し、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳをＯｒｂｉｔｒａｐにおいて６０，０００のＦＷＨＭ分解能および１５，０００のＦＷＨＭ分解能でそれぞれ行った。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳのために計器を３秒サイクルで実行した。
（実施例１５）
質量分析データ解析

【0247】

この実施例は、質量分析データ解析法を説明する。取得したＭＳデータファイルを、ＯｐｅｎＭＳの一連のツールを使用して処理した。これらのツールは、ベンダー提供の計器付属生ファイルのｍｚＭＬファイルへの変換のための、ＭＳ１特徴同定および強度抽出のための、ＭＳデータセット実行時間アライメントおよび特徴群クラスタリングのための、およびＸ！Ｔａｎｄｅｍ検索エンジンでのＭＳ２スペクトルデータベースマッチングのための、モジュールおよびパイプラインスクリプトを含む。スペクトル－データベース検索中の前駆体イオンおよび断片イオンマッチングの許容範囲をそれぞれ１０および３０ｐｐｍに設定した。固定されたカルバミドメチル（Ｃ）修飾ならびに可変的アセチル（Ｎ末端）および酸化（Ｍ）修飾のためのデフォルト設定を可能にした。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔタンパク質配列データベース（受諾日２０１９年１月２７日）を検索に使用し、ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を、１％ＦＤＲでの標準的な逆配列デコイデータベース戦略を使用してスコア化した。ＰＳＭを使用して、各粒子型反復についてのタンパク質リストを、所与の粒子型反復の列挙されたタンパク質リストにタンパク質を加えるために十分な証拠として単一のＰＳＭを使用して、コンパイルした。加えて、１つより多くのタンパク質にマッチしたＰＳＭは、可能性のあるタンパク質の全てを、所与の粒子型反復の列挙されたタンパク質リストに加える。タンパク質列挙のこの閾値は、寛容であり、偽陽性（より高い感度、より低い特異度）を含む可能性があるが、２つまたはそれより多くのペプチド（少なくとも１つのユニークペプチドを含む）を必要とする、よりストリンジェントな試験は、偽陰性（より低い感度、より高い特異度）を有する逆の問題に悩まされる。既知ペプチドの定量分析のために、カスタムＲスクリプトを使用して、ｍｚおよび滞留時間についてそれぞれ１ｄａおよび３０秒の許容範囲で位置的重複に基づいてＭＳ２ ＰＳＭをＭＳ１特徴群に指定した。万が一、１つより多くのＰＳＭが、事前に指定した許容範囲内のＭＳ１特徴に最初に位置した場合には、ＭＳ１特徴の最も近く（ＭＳデータセット内）にあるＰＳＭ、またはＭＳ１特徴クラスターの中心の最も近く（ＭＳデータセット間）にあるＰＳＭを使用した。全てのＭＳ２が、ＭＳ１特徴群に指定されているとは限らないこと、および全てのＭＳ１特徴群クラスターが、指定されたＭＳ２を有するとは限らないことに留意すべきであり、マッピングおよびその後のペプチド特徴同定を向上させるためにこの分野での研究は継続する。
（実施例１６）
タンパク質群の同定

【0248】

この実施例は、質量分析によるタンパク質群の同定のための方法を説明する。タンパク質群レベル解析のために、タンパク質群レベルでのＭＳデータを次のようにした。ＭＳ生ファイルをＭａｘＱｕａｎｔ（ｖ．１．６．７（４９）およびＡｎｄｒｏｍｅｄａ（５０））で処理し、標準設定を利用してＭＳ／ＭＳスペクトルをＵｎｉＰｒｏｔＫＢヒトＦＡＳＴＡデータベース（ＵＰ０００００５６４０、７４，３４９フォワードエントリー；２０１９年８月からのバージョン）に対して検索した。酵素消化特異度をトリプシンに設定し、プロリンのＮ末端側での切断および最大２つの誤切断を許容した。最小ペプチド長を７アミノ酸に設定し、最大ペプチド質量を４，６００Ｄａに設定した。メチオニン酸化およびタンパク質Ｎ末端アセチル化を可変修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。ＭａｘＱｕａｎｔは、時間依存性再較正アルゴリズムにより前駆体イオン質量正確度を向上させ、各ペプチドに対する個々の質量の許容範囲を定義する。許される初期最大前駆体質量許容範囲は、最初の検索中は２０ｐｐｍであり、主検索では４．５ｐｐｍであった。ＭＳ／ＭＳ質量許容範囲を２０ｐｐｍに設定した。解析のために、１％の偽陽性率（ＦＤＲ）カットオフをペプチドおよびタンパク質レベルで適用した（ｐｒｏｔｅｉｎＧｒｏｕｐｓ．ｔｘｔ表で、全てのタンパク質群がそれらの対応するｑ値で報告される）。「実行間のマッチ」を無効にした。同定の数は、少なくとも１つのｒａｚｏｒペプチドを必要とするタンパク質強度（１％より低いｑ値を有するタンパク質のみを計数する）に基づいて計数した。ＭａｘＬＦＱ正規化タンパク質強度（少なくとも１のペプチド比計数値を必要とする）が生出力で報告され、これらの強度をＣＶ精度解析にのみ使用した。区別することができたペプチドをそれらの独自のタンパク質群に選別し、ユニークペプチドに基づいて判別することができなかったタンパク質をタンパク質群に集めた。さらに、ＭａｘＱｕａｎｔに含まれている共通夾雑物のリストについてのフィルター処理をタンパク質に対して行った。部位修飾によってのみ同定されたタンパク質を解析から厳格に除外した。
（実施例１７）
スパイク回収率

【0249】

この実施例は、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のスパイク回収率実験のための方法を説明する。プール健常血漿試料中のＣＲＰのベースライン濃度を、上記（「材料」）で説明した通りのＥＬＩＳＡキットを製造業者提案プロトコールに従って用いて測定した。ＣＲＰの原液および適切な希釈物を調製し、同一のプール血漿試料にスパイクして、ＣＲＰのベースライン内在性濃度の２倍、５倍、１０倍および１００倍である最終濃度にした。プール血漿への添加の体積は、総試料体積の１０％であった。スパイク対照は、同体積の緩衝剤をプール血漿試料に添加することにより作製した。スパイクされた試料の濃度をＥＬＩＳＡにより再度測定して各スパイクレベル中のＣＲＰレベルを確認した。これらの試料を使用して、上記「結果」で説明した通りの粒子コロナ測定正確度を評価した。
（実施例１８）
ＮＳＣＬＣ試料および健常対照のプロテオーム解析

【0250】

この実施例は、ＮＳＣＬＣ試料および健康対照のプロテオーム解析を説明する。ステージＩＶ ＮＳＣＬＣを有する２８名ならびに年齢および性別をマッチさせた対照２８名である、対象５６名からの血清試料を商業的に購入し、ＳＰ－００７ナノ粒子形成に関して評価した（試料収集ならびにコロナ形成および処理については上記を参照されたい）。各コロナのＭＳスペクトルデータを記載の通り収集し、生データを上記（ＭＳデータ解析）で説明した通り処理した。１９，２１４の特徴群を同定し、１（１つだけの試料におけるシングルトン特徴、ｎ＝６，２４９、すなわちデータの０．２９％）～５６（全試料に存在する特徴、ｎ＝４５０、すなわちデータの１２％）の範囲の群サイズで５６の対象試料にわたって抽出した。クラスタリングアルゴリズムは、データセット間の群に伴う特徴の群化の空間的均一性に関する「群＿品質」メトリックを計算する。次いで、群サイズにより分割して群の下位４分の１を、低品質スコアの分布の傾斜特性のため考慮から外し、その結果、１５，９６７群が残った。解析の前の追加のフィルターとして、クラス、罹患または対照、の少なくとも一方の少なくとも５０％に存在する特徴を有する群のみを前に進め、その結果、解析のために２，５０７特徴群のセットが残った。

【0251】

ペプチドおよびタンパク質同一性を以下のように特徴群に指定した。ＭＳ２ ＰＳＭおよびＭＳ１特徴群を一緒に上記（ＭＳデータ解析）で説明した通り指定した。この手法を使用して、１９，２４９の元の特徴群の２５％をペプチド配列と関連付けた。指定されたペプチド配列を有するまたは有さない全ての特徴群に対して群間の単変量統計比較を遂行した。
（実施例１９）
統計解析

【0252】

この実施例は、本明細書で開示するデータの統計解析を説明する。統計解析および視覚化は、適切なパッケージを用いてＲ（ｖ３．５．２）を使用して行った（Ｒ：統計的計算のための言語および環境。Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．ＵＲＬ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。

【0253】

本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態を単なる例として提供することは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形、変更および置換が今や当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の代替形態を、本発明を実施する際に使用することができることは、理解されるはずである。下記の請求項が本発明の範囲を定義すること、およびこれらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、これらの請求項に包含されることを意図している。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料中のタンパク質を同定する方法であって、
粒子パネルを、前記粒子パネルの別個の粒子型に対応する複数の別個の生体分子コロナを形成するために、前記試料とともにインキュベートするステップ；
前記複数の別個の生体分子コロナにおけるタンパク質を濃縮するために、前記粒子パネルを前記試料中の未結合タンパク質から磁気的に単離するステップ；および
濃縮されたタンパク質を同定するために前記複数の別個の生体分子コロナをアッセイするステップ
を含む方法。
（項目２）
前記アッセイするステップが、１～２０，０００のタンパク質群を同定できる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記アッセイするステップが、１０００～１０，０００のタンパク質群を同定できる、項目１～２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記アッセイするステップが、１，０００～５，０００のタンパク質群を同定できる、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記アッセイするステップが、１，２００～２，２００のタンパク質群を同定できる、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記タンパク質群が、７アミノ酸残基の最小長を有するペプチド配列を含む、項目２～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記アッセイするステップが、１，０００～１０，０００のタンパク質を同定できる、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記アッセイするステップが、１，８００～５，０００のタンパク質を同定できる、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記試料が、複数の試料を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記複数の試料が、少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記インキュベートするステップが、前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料を前記粒子パネルと同時に接触させることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記磁気的に単離するステップが、前記複数の試料の前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中の未結合タンパク質から前記粒子パネルを同時に磁気的に単離することを含む、項目１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記アッセイするステップが、前記少なくとも２つまたはそれより多くの空間的に隔離されている試料中のタンパク質を同時に同定するために前記複数の別個の生体分子コロナをアッセイすることを含む、項目１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
項目１～７のいずれか一項に記載の方法を繰り返すステップをさらに含み、繰り返された場合、前記インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップが、前記粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、２０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
繰り返された場合、前記インキュベートするステップ、単離するステップおよびアッセイするステップが、前記粒子パネル内の各粒子型について少なくとも３回の完全アッセイ反復からのペプチド質量分析特徴を比較することにより判定して、１０％またはそれ未満の分位正規化変動係数（ＱＮＣＶ）パーセントを生じさせる、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記アッセイするステップが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のダイナミックレンジにわたってタンパク質を同定できる、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記粒子パネルを前記未結合タンパク質から磁気的に単離するステップの後、前記粒子パネルを少なくとも１回または少なくとも２回洗浄するステップをさらに含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記アッセイするステップの後に、前記複数の別個の生体分子コロナ中の前記タンパク質を溶解するステップをさらに含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記複数の別個の生体分子コロナ中の前記タンパク質を消化して、消化されたペプチドを生成するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記消化されたペプチドを精製するステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記アッセイするステップが、質量分析を使用して前記試料中のタンパク質を同定することを含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記アッセイするステップが、約２～約４時間以内に行われる、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
約１～約２０時間以内に行われる、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
約２～約１０時間以内に行われる、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
約４～約６時間以内に行われる、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
単離するステップは、約３０分以下、約１５分以下、約１０分以下、約５分以下、または約２分以下かかる、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記複数の試料が、少なくとも１０の空間的に隔離されている試料、少なくとも５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも１００の空間的に隔離されている試料、少なくとも１５０の空間的に隔離されている試料、少なくとも２００の空間的に隔離されている試料、少なくとも２５０の空間的に隔離されている試料、または少なくとも３００の空間的に隔離されている試料を含む、項目３～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記複数の試料が、少なくとも９６の試料を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記粒子パネルが、少なくとも２つの別個の粒子型、少なくとも３つの別個の粒子型、少なくとも４つの別個の粒子型、少なくとも５つの別個の粒子型、少なくとも６つの別個の粒子型、少なくとも７つの別個の粒子型、少なくとも８つの別個の粒子型、少なくとも９つの別個の粒子型、少なくとも１０の別個の粒子型、少なくとも１１の別個の粒子型、少なくとも１２の別個の粒子型、少なくとも１３の別個の粒子型、少なくとも１４の別個の粒子型、少なくとも１５の別個の粒子型、少なくとも２０の別個の粒子型、少なくとも２５の粒子型、または少なくとも３０の別個の粒子型を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記粒子パネルが、少なくとも１０の別個の粒子型を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも２つの空間的に隔離されている試料が、少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なる、項目１０～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも１つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目１～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目１～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記物理化学的特性が、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を含む、項目３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記サイズが、動的光散乱、ＳＥＭ、ＴＥＭまたはこれらの任意の組合せによって測定される直径または半径である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、カルボキシレート材料を含み、前記第１の別個の粒子がマイクロ粒子であり、前記第２の別個の粒子型がナノ粒子である、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、０ｍＶおよび－５０ｍＶの表面電荷を有し、前記第１の別個の粒子型が、２００ｎｍ未満の直径を有し、前記第２の別個の粒子型が、２００ｎｍより大きい直径を有する、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、１００～４００ｎｍの直径を有し、前記第１の別個の粒子型が、正の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、中性表面電荷を有する、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、ナノ粒子であり、前記第１の別個の粒子型が、－２０ｍＶ未満の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、－２０ｍＶより大きい表面電荷を有する、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、マイクロ粒子であり、前記第１の別個の粒子型が、負の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、正の表面電荷を有する、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記粒子パネルが、負に荷電されているナノ粒子のサブセットを含み、前記サブセットの各粒子が、少なくとも１つの表面化学基の点で異なる、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型、第２の粒子および第３の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型、第２の別個の粒子型および前記第３の別個の粒子型が、酸化鉄コア、ポリマーシェルを含み、直径約５００ｎｍ未満であり、前記第１の別個の粒子型が負電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が正電荷を有し、前記第３の別個の粒子型が中性電荷を有し、前記直径が、動的光散乱によって測定された平均直径である、項目１～３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記第１の別個の粒子型が、シリカコーティングを含み、前記第２の別個の粒子型が、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）を含み、前記第３の別個の粒子型が、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、ナノ粒子である、項目１～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、マイクロ粒子である、項目１～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、超常磁性酸化鉄粒子である、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記粒子パネルの各粒子が、酸化鉄材料を含む、項目１～４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、酸化鉄コアを有する、項目１～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、項目１～４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記粒子パネルの別個の粒子型各々が、超常磁性酸化鉄粒子である、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記粒子パネルの別個の粒子型各々が、酸化鉄コアを含む、項目１～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記粒子パネルの各１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、項目１～５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、カルボキシル化ポリマー、アミノ化ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含む、項目１～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記粒子パネルの少なくとも１つの粒子型が、シリカシェルコーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記粒子パネルの少なくとも１つの粒子型が、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記粒子パネルの少なくとも１つの粒子型が、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、負の表面電荷を有する、項目１～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、正の表面電荷を有する、項目１～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記粒子パネルの少なくとも１つの別個の粒子型が、中性表面電荷を有する、項目１～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記粒子パネルが、表１０から選択される１つまたは複数の別個の粒子型を含む、項目１～６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記粒子パネルが、表１０から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む、項目１～６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記粒子パネルが、表１２から選択される１つまたは複数の別個の粒子型を含む、項目１～６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記粒子パネルが、表１２から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む、項目１～６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
２つまたはそれより多くの物理化学的特性の点で異なる３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型を含む組成物であって、前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のサブセットが、前記２つまたはそれより多くの物理化学的特性のうちの物理化学的特性を共有し、前記サブセットのそのような粒子型が、異なるタンパク質に結合する、組成物。
（項目６７）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のダイナミックレンジにわたって試料からのタンパク質を吸着する、項目６６に記載の組成物。
（項目６８）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１～２０，０００のタンパク質の群を吸着できる、項目６６～６７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６９）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１，０００～１０，０００のタンパク質群を吸着できる、項目６６～６８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１，０００～５，０００のタンパク質群を吸着できる、項目６６～６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１，２００～２，２００のタンパク質群を吸着できる、項目６６～７０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７２）
前記タンパク質群が、７アミノ酸残基の最小長を有するペプチド配列を含む、項目６９～７１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７３）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１～２０，０００のタンパク質を吸着できる、項目６６～７２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７４）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１，０００～１０，０００のタンパク質を吸着できる、項目６６～７３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７５）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、試料からの１，８００～５，０００のタンパク質を吸着できる、項目６６～７４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７６）
少なくとも４つの別個の磁性粒子型、少なくとも５つの別個の磁性粒子型、少なくとも６つの別個の磁性粒子型、少なくとも７つの別個の磁性粒子型、少なくとも８つの別個の磁性粒子型、少なくとも９つの別個の磁性粒子型、少なくとも１０の別個の磁性粒子型、少なくとも１１の別個の磁性粒子型、少なくとも１２の別個の磁性粒子型、少なくとも１３の別個の磁性粒子型、少なくとも１４の別個の磁性粒子型、少なくとも１５の別個の磁性粒子型、少なくとも２０の別個の磁性粒子型、または少なくとも３０の別個の磁性粒子型を含む、項目６６～７５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７７）
少なくとも１０の別個の磁性粒子型を含む、項目７６に記載の組成物。
（項目７８）
第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも２つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目６６～７７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７９）
第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、少なくとも２つの物理化学的特性を共有するが少なくとも１つの物理化学的特性の点で異なり、したがって、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が異なる、項目６６～７８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８０）
前記物理化学的特性が、サイズ、電荷、コア材料、シェル材料、多孔度、または表面疎水性を含む、項目６６～７９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８１）
前記サイズが、動的光散乱、ＳＥＭ、ＴＥＭまたはこれらの任意の組合せによって測定される直径または半径である、項目８０に記載の組成物。
（項目８２）
第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、カルボキシレート材料を含み、前記第１の別個の粒子がマイクロ粒子であり、前記第２の別個の粒子型がナノ粒子である、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８３）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、０ｍＶおよび－５０ｍＶの表面電荷を有し、前記第１の別個の粒子型が、２００ｎｍ未満の直径を有し、前記第２の別個の粒子型が、２００ｎｍより大きい直径を有する、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８４）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、１００～４００ｎｍの直径を有し、前記第１の別個の粒子型が、正の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、中性表面電荷を有する、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８５）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、ナノ粒子であり、前記第１の別個の粒子型が、－２０ｍＶ未満の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、－２０ｍＶより大きい表面電荷を有する、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８６）
前記粒子パネルが、第１の別個の粒子型および第２の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型および前記第２の別個の粒子型が、マイクロ粒子であり、前記第１の別個の粒子型が、負の表面電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が、正の表面電荷を有する、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８７）
負に荷電されているナノ粒子のサブセットを含み、前記サブセットの各粒子型が、少なくとも１つの表面化学基の点で異なる、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８８）
第１の別個の粒子型、第２の別個の粒子型および第３の別個の粒子型を含み、前記第１の別個の粒子型、前記第２の別個の粒子型および前記第３の別個の粒子型が、酸化鉄コア、ポリマーシェルを含み、直径約５００ｎｍ未満であり、前記第１の別個の粒子型が負電荷を有し、前記第２の別個の粒子型が正電荷を有し、前記第３の別個の粒子型が中性電荷を有し、前記直径が、動的光散乱によって測定された平均直径である、項目６６～８１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８９）
前記第１の別個の粒子型が、シリカコーティングを含み、前記第２の別個の粒子型が、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）を含み、前記第３の別個の粒子型が、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを含む、項目８８に記載の組成物。
（項目９０）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、ナノ粒子を含む、項目６６～８９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９１）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、マイクロ粒子を含む、項目６６～９０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９２）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型が、超常磁性酸化鉄粒子である、項目６６～９１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９３）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型が、酸化鉄材料を含む、項目６６～９２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９４）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型が、酸化鉄コアを有する、項目６６～９３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９５）
前記３つまたはそれより多くの別個磁性粒子型のうちの少なくとも１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、項目６６～９４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９６）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型の別個の粒子型各々が、超常磁性酸化鉄粒子である、項目６６～９５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９７）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型の別個の粒子型各々が、酸化鉄コアを含む、項目６６～９６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９８）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型の各１つの別個の粒子型が、ポリスチレンコアに埋め込まれた酸化鉄結晶を有する、項目６６～９７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９９）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、ポリマーコーティングを含む、項目６６～９８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１００）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、カルボキシル化ポリマー、アミノ化ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはこれらの任意の組合せを含む、項目６６～９９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０１）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、シリカシェルコーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目６６～１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０２）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、ポリ（Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）メタクリルアミド）（ＰＤＭＡＰＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目６６～１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０３）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）コーティングを有する酸化鉄コアを含む、項目６６～１００のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０４）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、負の表面電荷を有する、項目６６～１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０５）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、正の表面電荷を有する、項目６６～１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０６）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型のうちの少なくとも１つの粒子型が、中性表面電荷を有する、項目６６～１０３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０７）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、表１０の１つまたは複数の粒子型を含む、項目６６～１０６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０８）
前記粒子パネルが、表１０から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む、項目６６～１０７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０９）
前記３つまたはそれより多くの別個の磁性粒子型が、表１２の１つまたは複数の粒子型を含む、項目６６～１０８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１０）
前記粒子パネルが、表１２から選択される２つもしくはそれより多くの別個の粒子型、３つもしくはそれより多くの別個の粒子型、４つもしくはそれより多くの別個の粒子型、５つもしくはそれより多くの別個の粒子型、６つもしくはそれより多くの別個の粒子型、７つもしくはそれより多くの別個の粒子型、８つもしくはそれより多くの別個の粒子型、９つもしくはそれより多くの別個の粒子型、または１０全ての別個の粒子型を含む、項目６６～１０９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１１）
前記試料が生体試料である、項目１～６４のいずれか一項に記載の方法または項目６７～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１２）
前記生体試料が、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、涙、細胞溶解物、組織溶解物、細胞ホモジネート、組織ホモジネート、乳頭吸引液、糞便試料、滑液および全血、または唾液である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記試料が、非生体試料である、項目１～６４のいずれか一項に記載の方法または項目６７～１１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１４）
前記非生体試料が、水、乳、溶媒またはホモジネート試料である、項目１１３に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32-1】

【図32-2】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図33-4】

【図33-5】

【図33-6】

【図33-7】

【図33-8】

【図34】

【図35-1】

【図35-2】

【図36】

【図37】

【図38】