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特許7507751結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞及び結腸直腸腺癌腹水初代腫瘍細胞の培養方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-20
(45)【発行日】2024-06-28
(54)【発明の名称】結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞及び結腸直腸腺癌腹水初代腫瘍細胞の培養方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/02 20060101AFI20240621BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/02
C12N5/09
【請求項の数】
27
(21)【出願番号】P 2021518844
(86)(22)【出願日】2019-08-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(86)【国際出願番号】 CN2019099245
(87)【国際公開番号】W WO2019238143
(87)【国際公開日】2019-12-19
【審査請求日】2022-05-06
(73)【特許権者】
【識別番号】520492695
【氏名又は名称】北京基石生命科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸ ＨＥＡＬＴＨ ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】２０１－Ｃ１１ Ｗｅｓｔ， Ｅ－Ｐａｒｋ， Ｎｏ．６５ Ｘｉｎｇｓｈｉｋｏｕ Ｒｄ．， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】張函▲すうえ▼
(72)【発明者】
【氏名】▲いん▼申意
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１１５１０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０２７４０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／２１６２７８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００９－５２３００９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０６－０７８７５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１６５６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５１６２５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６４７９８９１（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０９０２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】PNAS，1980年06月01日，Vol. 77, No. 6，pp. 3464-3468
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ２０２１９０、Ａ８３－０１、ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ニコチンアミド、Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、コルチゾール、Ｂ－２７ＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ、インスリン、トランスフェリン、セレン、エタノールアミン溶液（ＩＴＳ－Ｘ）、Ｙ－２７６３２、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地からなる結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地であって、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のアンホテリシンＢの最終濃度は１００～２５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭであり、前記Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの最終濃度が０．８～１．２％（体積％）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０～１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０～５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００～３００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００～２００ｎｇ／ｍＬであり、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度が５～１０μＭであり、前記Ａ８３－０１の最終濃度が０．２５～１．２５μＭであり、前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭの最終濃度が１％（体積％）であり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が０．５～２ｍＭであり、前記ニコチンアミドの最終濃度が５～１０ｍＭであり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１％（体積％）であり、前記コルチゾールの最終濃度が２０～５０ｎｇ／ｍＬであり、前記Ｂ－２７ＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ），ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａの最終濃度が１．５～２．５％（体積％）であり、前記インスリン、トランスフェリン、セレン、エタノールアミン溶液（ＩＴＳ－Ｘ）の最終濃度が０．８～１．２％（体積％）であり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が５～２０μＭであり、残りがＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地である、培地。
【請求項2】
結腸直腸癌初代細胞を培養するためのキットであって、請求項１に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、サンプル洗浄液、細胞分離緩衝液、細胞消化液、消化終止液、および細胞凍結保存液の全部または一部とからなり、前記サンプル解離液は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、およびＰＢＳからなり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩの最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬであり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬであり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度は５０～１５０Ｕ／ｍＬであり、残りはＰＢＳであり、
前記サンプル保存液は、ウシ胎児血清、ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ、ＨＥＰＥＳ、およびＨＢＳＳからなり、前記サンプル保存液中の前記ウシ胎児血清の最終濃度は１～５％（体積％）であり、前記サンプル保存液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記サンプル保存液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記サンプル保存液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬであり、前記サンプル保存液中の前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭであり、残りはＨＢＳＳであり、
前記サンプル洗浄液は、ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢとＰＢＳからなり、サンプル洗浄液中のペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、サンプル洗浄液中のペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、サンプル洗浄液中のペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳであり、
前記細胞分離緩衝液は、ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ、ヘパリンナトリウム、およびＰＢＳからなり、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度は１０１Ｕ／ｍＬであり、残りはＰＢＳであり、
前記細胞消化液の組成は、前記細胞消化液の１０ｍＬごとに４～６ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏＴＭ ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ、１．５～２．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ （ｌＸ）， ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄが含まれ、残りはＰＢＳであり、
前記消化終止液は、ウシ胎児血清、ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ、およびＤＭＥＭ培地からなり、前記消化終止液中の前記ウシ胎児血清の最終濃度は８～１２％（体積％）であり、前記消化終止液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬであり、前記消化終止液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬであり、前記消化終止液中の前記ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬであり、残りはＤＭＥＭ培地であり、
前記細胞凍結保存液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地、ＤＭＳＯ、及び１％メチルセルロース溶液からなり、前記Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地、前記ＤＭＳＯ、及び前記１％メチルセルロース溶液の体積比は２０：２：（０．８～１．２）であり、前記１％メチルセルロース溶液は、１ｇ／１００ｍｌの濃度のメチルセルロース水溶液である、キット。
【請求項3】
（Ｂ１）結腸直腸癌初代細胞の培養における請求項１に記載の培地の使用；（Ｂ２）結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養における請求項２に記載のキットの使用；
（Ｂ３）結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養における請求項２に記載のキットの使用
の中から選ばれるいずれか一つの使用。
【請求項4】
結腸直腸癌初代細胞を培養する方法であって、当該結腸直腸癌初代細胞の種類が、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞であり、以下のステップ：（ａ１）請求項２に記載のサンプル解離液を使用して、対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離し、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を得るステップ；
（ａ２）請求項１に記載の培地を使用して、ステップ（ａ１）で解離された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップ
を含む、方法。
【請求項5】
ステップ（ａ１）において、組織１ｍｇあたり０．１～０．３ｍＬの前記サンプル解離液の用量で、細かく切られた前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を、予め３７℃に予熱した前記サンプル解離液で処理し、３７℃条件下で１５分間から３時間でサンプルを解離するステップを含む方法に従って、前記サンプル解離液を使用して前記対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ａ２）において、細胞培養容器Ｍを使用して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を前記培地に懸濁培養し、２～４日ごとに培地を交換するステップを含む方法に従って、前記培地を使用して前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、前記細胞培養容器Ｍは、（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器または低吸着表面を有する細胞培養容器；（ＩＩ）（Ｉ）の細胞培養容器をペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾した細胞培養容器のいずれか一つである、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
結腸直腸癌初代細胞を培養する方法であって、当該結腸直腸癌初代細胞の種類が、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞であり、以下のステップ：（ｂ１）対象から採取された結腸直腸癌腹水から結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を分離して獲得するステップ；
（ｂ２）請求項１に記載の培地を使用して、ステップ（ｂ１）で分離された結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップ
を含む、方法。
【請求項8】
ステップ（ｂ１）において、結腸直腸癌腹水中の細胞を請求項２に記載の細胞分離緩衝液で懸濁し、次いで、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を密度勾配遠心分離によって得るステップを含む方法に従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を前記対象から採取された結腸直腸癌腹水から分離して獲得する、ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ステップ（ｂ２）において、細胞培養容器Ｍを使用して、３７℃、５％ＣＯ
２
の条件下で、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を前記培地に懸濁培養し、２～４日ごとに培地を交換するステップを含む方法に従って、前記培地を使用して前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を懸濁培養し、前記細胞培養容器Ｍは、（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器または低吸着表面を有する細胞培養容器；（ＩＩ）（Ｉ）の細胞培養容器をペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾した細胞培養容器のいずれか一つである、
ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記（ＩＩ）において、パワー２０Ｗ、エッチング時間が３分間であるエッチング条件で前記（Ｉ）における細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行い、そして、細胞培養容器の表面を１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液で覆い、１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液を乾かしてペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾を完成するステップを含む方法に従って前記（Ｉ）中の細胞培養容器をペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾し、前記１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液の組成として、前記１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液１００ｍＬごとに１ｍＬのペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマーが含まれ、残りはフッ素油である、
ことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルの表面を７０～７５％体積容量のエタノールで洗浄し、前記対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルを、請求項２に記載のサンプル洗浄液及び滅菌ＰＢＳ溶液でこの順に洗浄するという、前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離前処理するステップをステップ（ａ１）の前にさらに含む、ことを特徴とする、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記解離前処理を受けた前記対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルが単離された時間は２時間以内であり、前記解離前処理が行われるまで、請求項２に記載のサンプル保存液に保存されている、ことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ステップ（ａ１）において、前記サンプル解離液を使用して前記対象から採取された結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離処理した後に、請求項２に記載の消化終止液を用いて解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、細胞懸濁液をろ過して組織断片及び付着細胞を除去し、遠心分離後に滅菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、再度遠心分離してから、請求項１に記載の培地を使用して細胞ペレットを再懸濁するステップをさらに含む、ことを特徴とする、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ステップ（ａ２）において、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞が５０～８０μｍの直径を有する塊を形成する場合には、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を継代させるステップをさらに含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｂ２）において、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞が５０～８０μｍの直径を有する塊を形成する場合には、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を継代させるステップをさらに含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記継代で使用される細胞消化液は、請求項２に記載の細胞消化液である、ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記継代で使用される消化終止液は、請求項２に記載の消化終止液である、ことを特徴とする、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
２～３回の継代増殖後の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞または結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を凍結保存及び／または蘇生させるステップをさらに含み、前記凍結保存を行う際に使用される細胞凍結保存液は、請求項２に記載の細胞凍結保存液であり、
前記蘇生させるステップが、以下のステップ：
蘇生する対象細胞が入った凍結保存管を液体窒素から取り出し、３７－３９℃の無菌水で細胞を迅速に融解する；８００－１０００ｇを室温で５－１０分間、遠心した後、請求項１に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁し、続いて細胞培養容器Ｍを用いて懸濁した細胞を培養し（初期播種密度は１０５個／ｃｍ２容器底面積）、各管の細胞（１０６個）を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させるステップ、培養条件は３７℃、５％のＣＯ２であり、前記細胞培養容器Ｍは、（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器または低吸着表面を有する細胞培養容器；（ＩＩ）（Ｉ）の細胞培養容器をペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾した細胞培養容器のいずれか一つである、
を含む、ことを特徴とする、請求項４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
請求項２に記載のサンプル保存液である結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル保存液。
【請求項20】
請求項２に記載の細胞分離緩衝液である結腸直腸癌腹水細胞分離緩衝液。
【請求項21】
結腸直腸癌固形腫瘍組織の保存における、請求項１９に記載のサンプル保存液の使用。
【請求項22】
対象から採取された結腸直腸癌腹水からの結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の分離における、請求項２０に記載の細胞分離緩衝液の使用。
【請求項23】
単離された直後の結腸直腸癌固形腫瘍組織を請求項２に記載のサンプル保存液に入れて２時間以内に保存するステップを含む、結腸直腸癌固形腫瘍組織を保存する方法。
【請求項24】
前記結腸直腸癌が原発性結腸直腸癌である、ことを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項25】
前記結腸直腸癌が結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣である、ことを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項26】
前記結腸直腸癌初代細胞が結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞または結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞である、ことを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項27】
前記結腸直腸癌初代細胞は、結腸直腸癌患者の手術サンプル、結腸鏡検査穿刺サンプル、または腹水サンプルから分離される、ことを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的には、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞及び結腸直腸腺癌腹水初代腫瘍細胞の培養方法およびキットに関する。
【背景技術】
【0002】
結腸直腸癌は、人間の健康を深刻に脅かす最もよく見られる悪性腫瘍の一つである。中国における結腸直腸癌の発生率は９．２４％であり、すべての悪性腫瘍の中で第４位である。結腸直腸癌の死亡率は１１．７７％であり、すべての悪性腫瘍の中で第５位である。経済の発展、生活水準の向上、およびライフスタイルの変化に伴い、結腸直腸癌の発生率は増加し続けるであろう。また、結腸直腸癌の再発と転移のリスクが高く、結腸直腸癌患者の５０％以上が、根治的治療後の数ヶ月から数年以内に異なる程度の再発と転移を経験する。
【0003】
世界各国の化学研究及び医療機構は結腸直腸癌の原因と発生発達に関する研究に多大な投資を行っているが、人類はまだこの病気についてほとんど知らない。結腸直腸癌は複雑な疾患であり、その発生と発達は動的な過程であり、多くのシグナル分子の相互作用に関わり、複雑な分子調節ネットワークが形成され、外部環境要因の影響をも受ける。結腸直腸癌の病因と発生発達には強い個体差があり、一般化することはできない。そのため、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培養物をモデルとして個別化した正確な研究を行うことは、結腸直腸癌の研究分野、さらには結腸直腸癌の診断と治療の分野でのトレンドである。
【0004】
手術の機会を逃した進行性結腸直腸癌の患者にとって、化学療法と標的療法は最も重要な治療方法であり、初めて治療を受けた患者のための最初の化学療法レジメンの選択は、患者の病状管理にとって特に重要である。第二世代シーケンシングテクノロジーの広範な使用に伴い、個別化遺伝子シーケンシングとデータマイニングにより、結腸直腸癌患者の３０％～５０％はシーケンシング結果を通して有効である可能性のある薬剤を見つけることを予測できるが、これらの薬剤レジメンが実際の化学療法で癌細胞を殺すのに効果的であるという保証はない。
【0005】
従来の方法では、結腸直腸癌細胞株は結腸直腸癌の研究モデルとして使用され、何千万の異なる結腸直腸癌患者の体内の癌細胞の真の状態を代表し難く、大きな制限がある。精密医療の概念を代表するＰＤＸモデルは、モデリングサイクルが長すぎて臨床治療を導くことができないという弱点を克服することは困難である。進行性結腸直腸癌の患者は、腹水をよく併発し、即時に体外に排出する必要があるので、腹水は非常に入手しやすい臨床サンプルであり、脱落した結腸直腸癌細胞は腹水からよく見つかる。結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培養物と結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培養物をモデルとして個別化した正確な研究を行うことは、結腸直腸癌の研究分野、さらには結腸直腸癌の診断と治療の分野でのトレンドである。
【0006】
既存の初代腫瘍細胞培養技術には、主に２Ｄ培養、３Ｄ培養、リプログラミング培養などがあり、これらの方法はすべて程度が異なるものの、培養サイクルが非常に長く、培養成功率が低く、雑細胞の除去が難しいという問題に直面している。
【発明の開示】
【0007】
上記の技術課題を効果的に解決するために、本発明は、新規の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞及び結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養技術およびキットを提供し、その技術の核心は、（１）結腸直腸癌固形腫瘍組織を温和な細胞解離試薬で処理し、組織中の癌細胞の生存率を最大限に確保する；（２）特別な無血清培地を調製し、懸濁培養システムを使用して結腸直腸癌固形腫瘍に由来する腫瘍細胞と結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞をインビトロで培養し、癌細胞の正常な増殖を確保しながら正常細胞からの干渉を最大限に排除することである。
【0008】
第一態様において、本発明は、結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地について保護を求める。
【0009】
本発明が保護を求めている結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地は、抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド）、ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ニコチン（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）、Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、コルチゾール、Ｂ２７、ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｙ－２７６３２、およびＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地からなる。その中で、前記抗菌抗真菌剤三次抗体中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体中のアンホテリシンＢの最終濃度は１００～２５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、前記Ｇｌｕｔａ Ｍａｘの最終濃度が０．８～１．２％（例えば、１％、％は体積％を表す）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０～１００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍＬまたは４０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０～５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５～２５ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００～３００ｎｇ／ｍＬ（例えば、３００ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００～２００ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度が５～１０μＭ（例えば、１０μＭ）であり、前記Ａ８３－０１の最終濃度が０．２５～１．２５μＭ（例えば、０．５μＭまたは１μＭ）であり、前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭの最終濃度が１％（体積％）であり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度が０．５～２ｍＭ（例えば、１ｍＭ）であり、前記ニコチン（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度が５～１０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１％（体積％）であり、前記コルチゾールの最終濃度が２０～５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記Ｂ２７の最終濃度が１．５～２．５％（例えば、２％、％は体積％を表す）であり、前記ＩＴＳ－Ｘの最終濃度が０．８～１．２％（例えば、１％、％は体積％を表す）であり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度が５～２０μＭ（例えば、５μＭまたは１０μＭ）であり、残りがＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。
【0010】
さらに、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）の組成として、１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含む。前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」の１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含み、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(R)抗真菌剤として、０．８５％食塩水の形のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢを使用する。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは「ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃３５０５００６１、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」の成分は、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅの代替品であるＬ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅであり、濃度は２００ｎＭであり、溶媒は０．８５％ＮａＣｌ溶液である。前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭは、初代細胞用の抗菌剤（例えば、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ＃ａｎｔ－ｐｍ－１、またはそれと同じ組成を有する他の製品）であり、微生物汚染から初代細胞を保護するために使用される抗生物質であり、グラム陽性菌、グラム陰性菌、マイコプラズマ、及び真菌を殺す効果がある。前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは「Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２００１、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）」には、最終濃度１ｍＭのヒトトランスフェリン（ホロ）（Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｈｏｌｏ））、５００ｍｇ／Ｌのインスリン組換えフルチェーン（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆｕｌｌ Ｃｈａｉｎ）、０．６３ｍｇ／Ｌのプロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、１０ｍＭのプトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、０．５２ｍｇ／Ｌのセレナイト（Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）が含まれている。前記Ｂ２７は「Ｂ－２７ＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１２５８７０１０、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ｂ－２７ＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ」には、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ＤＬ Ａｌｐｈａ Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ Ａｃｅｔａｔｅ）、ＤＬ－α－トコフェロール（ＤＬ Ａｌｐｈａ Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、ＢＳＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ヒト組換えインスリン（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒトトランスフェリン（Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、コルチコステロン（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、エタノールアミン塩酸塩（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ＨＣｌ）、還元グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ （ｒｅｄｕｃｅｄ））、Ｌ－カルニチン塩酸塩（Ｌ－Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ＨＣｌ）、リノール酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、リノレン酸（Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ Ａｃｉｄ）、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ２ＨＣｌ）、セレナイトナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、トリヨードサイロニン（Ｔ３－（ｔｒｉｏｄｏ－Ｉ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ））が含まれている。前記ＩＴＳ－Ｘの溶媒はＥＢＳＳ溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡塩溶液）であり、溶質および濃度は、インスリン１ｇ／Ｌ、トランスフェリン０．５５ｇ／Ｌ、セレナイトナトリウム０．０００６７ｇ／Ｌ、エタノールアミン０．２ｇ／Ｌである。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは、細胞培地中のＬ－グルタミンを直接に置き換えることができる高度な細胞培養添加剤である。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは「ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃３５０５００６１、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記Ｙ－２７６３２は「Ｙ－２７６３２ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＴＰ競合性ＲＯＣＫ－ＩおよびＲＯＣＫ－ＩＩ阻害剤、Ｋｉはそれぞれ２２０ｎＭおよび３００ｎＭである）」（例えば、ＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。
【0011】
本発明の具体的な実施形態において、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＨＥＰＥＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５６３００８０であり、前記ＧｌｕｔａＭＡＸのロット番号はＧｉｂｃｏ＃３５０５００６１であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦのロット番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－１５－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦのロット番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－１８Ｂ－５０であり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦのロット番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ ＡＦ－１００－３９－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａのロット番号はＲ＆Ｄ ５０３６－ＷＮ－５００であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎのロット番号は上海近岸＃Ｃ０１８であり、前記ＳＢ２０２１９０のロット番号はＳｉｇｍａ＃Ｓ７０６７であり、前記Ａ８３－０１のロット番号はＴｏｃｒｉｓ＃２９３９であり、前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭのロット番号はＩｎｖｉｖｏｇｅｎｅ＃ａｎｔ－ｐｍ－１であり、前記Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅのロット番号はＳｉｇｍａ＃Ａ９１６５であり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅのロット番号はＳｉｇｍａ＃Ｎ０６３６であり、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１７５０２００１であり、前記コルチゾールのロット番号はＳｉｇｍａ＃Ｈ０８８８であり、前記Ｂ２７のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１２５８７０１０であり、前記ＩＴＳ－Ｘのロット番号はＧｉｂｃｏ＃５１５０００５６であり、前記Ｙ－２７６３２のロット番号はＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２であり、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１２６３４０１０である。
【0012】
さらに、前記結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地が存在する形として、次の二種類がある：
その一、前記結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地は、前記抗菌抗真菌剤三次抗体、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、前記ＳＢ２０２１９０、前記Ａ８３－０１、前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記ニコチン、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記コルチゾール、前記Ｂ２７、前記ＩＴＳ－Ｘ、前記Ｙ－２７６３２、および前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を混合してなる溶液である。
前記培地は調製後、０．２２μＭシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）でろ過して滅菌する必要があり、４℃で２週間保存できる。
その二、結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地中の各成分は別々に存在し、使用時に処方に従って調製される。
その一、前記結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地は、前記抗菌抗真菌剤三次抗体、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、前記ＳＢ２０２１９０、前記Ａ８３－０１、前記ＰｒｉｍｏｃｉｎＴＭ、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記ニコチン、前記Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、前記コルチゾール、前記Ｂ２７、前記ＩＴＳ－Ｘ、前記Ｙ－２７６３２、および前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を混合してなる溶液である。
前記培地は調製後、０．２２μＭシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）でろ過して滅菌する必要があり、４℃で２週間保存できる。
その二、結腸直腸癌初代細胞を培養するための培地中の各成分は別々に存在し、使用時に処方に従って調製される。
【0013】
さらに、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎは、ストック溶液（母液）の形で存在することができ（－８０℃で長期間保存可能）、具体的には１０００倍のストック溶液（母液）の形で存在することができる。ＳＢ２０２１９０、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、コルチゾール、およびＹ－２７６３２は、ストック溶液（母液）の形で存在することができ（－２０℃で長期間保存）、具体的には１０００００倍のストック溶液（母液）の形で存在することができる。
【0014】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦストック溶液は、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ＢＳＡ、およびＰＢＳからなり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0015】
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦストック溶液は、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ＢＳＡ、およびＰＢＳからなり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0016】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦストック溶液は、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ＢＳＡ、およびＰＢＳからなり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0017】
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａストック溶液は、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ＢＳＡ、およびＰＢＳからなり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0018】
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎストック溶液は、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＳＡ、およびＰＢＳからなり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0019】
上記の５つの１０００倍ストック溶液の中で、前記ＢＳＡは１００倍のストック溶液（母液）の形で存在することができ（使用する直前に調製する）、具体的にはＢＳＡとＰＢＳからなり、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ１９３３）の最終濃度は０．１ｇ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0020】
また、１０００×ＳＢ２０２１９０ストック溶液は、ＳＢ２０２１９０とＤＭＳＯからなり、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０ｍＭであり、残りはＤＭＳＯである。
【0021】
１０００００×Ａ８３－０１ストック溶液は、Ａ８３－０１とＤＭＳＯからなり、前記Ａ８３－０１の濃度は２５ｍＭであり、残りはＤＭＳＯである。
【0022】
１０００×Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅストック溶液は、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅと超純水からなり、前記Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅの濃度は０．５Ｍであり、残りは超純水である。
【0023】
１０００×Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅストック溶液は、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅと超純水からなり、前記Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの濃度は５Ｍであり、残りは超純水である。
【0024】
１０００×コルチゾールストック溶液は、コルチゾール、無水エタノール、および超純水からなり、前記コルチゾールの最終濃度は２５μｇ／ｍＬであり、前記無水エタノールの最終濃度は５％（体積％）であり、残りは超純水である。
【0025】
１０００×Ｙ－２７６３２は、Ｙ－２７６３２と超純水からなり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０ｍＭであり、残りは超純水である。
【0026】
第二態様において、本発明は、結腸直腸癌初代細胞を培養するためのキットについて保護を求めている。
【0027】
本発明が保護を求めているキットは、下記のいずれか一つであってもよい：
（Ａ１）上記第一態様に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、およびサンプル洗浄液の全部または一部とからなる；
（Ａ２）上記第一態様に記載の培地と細胞分離緩衝液からなる；
（Ａ３）（Ａ１）と、細胞消化液、消化終止液、および細胞凍結保存液の全部または一部とからなる：；
（Ａ４）（Ａ２）と、細胞消化液、消化終止液、および細胞凍結保存液の全部または一部とからなる：。
（Ａ１）上記第一態様に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、およびサンプル洗浄液の全部または一部とからなる；
（Ａ２）上記第一態様に記載の培地と細胞分離緩衝液からなる；
（Ａ３）（Ａ１）と、細胞消化液、消化終止液、および細胞凍結保存液の全部または一部とからなる：；
（Ａ４）（Ａ２）と、細胞消化液、消化終止液、および細胞凍結保存液の全部または一部とからなる：。
【0028】
前記サンプル解離液は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、およびＰＢＳからなり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩの最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度は１５０～２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、前記サンプル解離液中の前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度は５０～１５０Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、残りはＰＢＳである。
【0029】
プロテアーゼの酵素活性を使用してコラゲナーゼ（コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕを定義する：３７℃、ｐＨ７．５の条件下で、１Ｕのプロテアーゼを使用してコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩ、または前記コラゲナーゼＩＶ）を５時間処理すると、１μｍоｌのＬ－ロイシンを放出することができる。
【0030】
本発明の具体的な実施形態では、前記コラゲナーゼＩのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１７１００－０１７であり、前記コラゲナーゼＩＩのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１７１０１－０１５であり、前記コラゲナーゼＩＶのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１７１０４－０１９であり、前記ＰＢＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0031】
前記サンプル保存液は、ウシ胎児血清、抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、およびＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液）からなり、前記サンプル保存液中の前記ウシ胎児血清の最終濃度は１～５％（例えば、２％、％は体積％を表す）であり、前記サンプル保存液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記サンプル保存液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記サンプル保存液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記サンプル保存液中の前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８～１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、残りはＨＢＳＳである。
【0032】
さらに、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）の組成として、１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含む。前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」の１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含み、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(R)抗真菌剤として、０．８５％食塩水の形のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢを使用する。
【0033】
本発明の具体的な実施形態において、前記ウシ胎児血清のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１６０００－０４４であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＨＥＰＥＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５６３００８０であり、前記ＨＢＳＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１４１７０１６１である。
【0034】
前記サンプル洗浄液は、抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）とＰＢＳからなり、前記サンプル洗浄液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記サンプル洗浄液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記サンプル洗浄液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、残りはＰＢＳである。
【0035】
さらに、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）の組成として、１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含む。前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」の１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含み、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(R)抗真菌剤として、０．８５％食塩水の形のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢを使用する。
【0036】
本発明の具体的な実施形態において、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＰＢＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0037】
前記細胞分離緩衝液は、抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）、ヘパリンナトリウム、およびＰＢＳからなり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、ヘパリンナトリウムの最終濃度は１０１Ｕ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。
【0038】
さらに、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）の組成として、１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含む。前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」の１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含み、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(R)抗真菌剤として、０．８５％食塩水の形のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢを使用する。
【0039】
本発明の具体的な実施形態において、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ヘパリンナトリウムのロット番号はＳｏｌａｒｂｉｏ＃Ｈ８２７０であり、前記ＰＢＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0040】
前記細胞消化液の組成は次のとおりである：前記細胞消化液の１０ｍＬあたり４～６ｍＬ（例えば、５ｍＬ）のＡｃｃｕｔａｓｅ、最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ（すなわち、１０ｕＬ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ）、１．５～２．５ｍＬ（例えば、２ｍＬ）のＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓが含まれ、残りはＰＢＳである。
【0041】
さらに、前記Ａｃｃｕｔａｓｅは「ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ ＡｃｃｕｔａｓｅＴＭ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記Ａｃｃｕｔａｓｅは、Ｄ－ＰＢＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解する単一成分の酵素である。前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは、「ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ （１Ｘ）、ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１２６０４０１３、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ （１Ｘ）、ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ」には、２００ｍｇ／ＬのＫＣｌ、２００ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８０００ｍｇ／ＬのＮａＣｌ、２１６０ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４５７．６ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ、および組換えプロテアーゼが含まれている。
【0042】
本発明の具体的な実施形態において、前記Ａｃｃｕｔａｓｅのロット番号はＧｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１であり、前記０．５Ｍ ＥＤＴＡのロット番号はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＡＭ９２６１であり、前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓのロット番号はＧｉｂｃｏ＃１２６０４０１３であり、前記ＰＢＳのロット番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0043】
前記消化終止液は、ウシ胎児血清、抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）、およびＤＭＥＭ培地からなり、前記消化終止液中の前記ウシ胎児血清の最終濃度は８～１２％（例えば、１０％、％は体積％を表す）であり、前記消化終止液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のペニシリンの最終濃度は１００～２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記消化終止液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のストレプトマイシンの最終濃度は１００～２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記消化終止液中の前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）中のアンホテリシンＢの最終濃度は２５０～５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、残りはＤＭＥＭ培地である。
【0044】
さらに、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）の組成として、１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含む。前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）は、「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、またはそれと同じ組成を有する他の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」の１ｍＬあたり１００００単位のペニシリン（塩基）、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）、及び２５μｇのアンホテリシンＢを含み、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ(R)抗真菌剤として、０．８５％食塩水の形のペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢを使用する。
【0045】
本発明の具体的な実施形態において、前記ウシ胎児血清のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１６０００－０４４であり、前記抗菌抗真菌剤三次抗体（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ）のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＤＭＥＭ培地のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１１９６５－０９２である。
【0046】
前記細胞凍結保存液は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＳＯ、及び１％メチルセルロース溶液からなり、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＳＯ、及び１％メチルセルロース溶液の体積比は２０：２：（０．８～１．２）、例えば、２０：２：１であり、前記１％メチルセルロース溶液は、１ｇ／１００ｍｌの濃度のメチルセルロースの水溶液である。
【0047】
本発明の具体的な実施形態において、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地のロット番号はＧｉｂｃｏ＃１２６３４０１０であり、前記ＤＭＳＯのロット番号はＳｉｇｍａ＃Ｄ２４３８であり、前記メチルセルロースのロット番号はＳｉｇｍａ＃Ｍ７０２７である。
【0048】
前記サンプル保存液は、サンプルの単離後の一時保存に使用でき、サンプルの単離後の短時間内でサンプル中の細胞の活性を維持することができる。前記サンプル保存液は、調製後４℃で１ヶ月間保存できる。
【0049】
前記サンプル洗浄液は、サンプルの洗浄と消毒に使用できる。前記サンプル洗浄液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0050】
前記サンプル解離液は、サンプルの解離に使用でき、サンプル中の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を組織から解離することができる。前記サンプル解離液は、使用する直前に調製する必要があり、その中のコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、およびコラゲナーゼＩＶは、ストック溶液（母液）の形で－２０℃で長期間保存することができ、具体的には１０または２０倍のストック溶液（母液）の形で存在することができる。１０×コラゲナーゼＩストック溶液は、前記コラゲナーゼＩとＰＢＳからなり、前記コラゲナーゼＩの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬである。１０×コラゲナーゼＩＩストック溶液は、前記コラゲナーゼＩＩとＰＢＳからなり、前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。２０×コラゲナーゼＩＶストック溶液は、前記コラゲナーゼＩＶとＰＢＳからなり、前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬであり、残りはＰＢＳである。前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩ、および前記コラゲナーゼＩＶの酵素活性の定義について、上記を参照できる。
【0051】
前記細胞分離緩衝液は、腹水中の細胞の懸濁に使用され、細胞の密度勾配分離の準備をするためのものである。前記細胞分離緩衝液は調製後、４℃で１ヶ月間保存できる。
【0052】
前記細胞消化液は、細胞塊の消化と継代に使用でき、結腸直腸癌腫瘍塊を単一の細胞に消化することができる。前記細胞消化液は、使用する直前に調製する必要がある。
【0053】
前記消化終止液は、サンプルの解離または細胞の消化過程を終止するために使用できる。前記消化終止液は調製後、４℃で１ヶ月間保存できる。
【0054】
前記細胞凍結保存液は、使用する直前に調製する必要がある。前記１％メチルセルロース溶液は、４℃で長期間保存することができる。
【0055】
第三態様において、本発明は、
（Ｂ１）結腸直腸癌初代細胞の培養における上記第一態様に記載の培地の使用；
（Ｂ２）結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養における上記第二態様の（Ａ１）または（Ａ３）に記載のキットの使用；
（Ｂ３）結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養における上記第二態様の（Ａ２）または（Ａ４）に記載のキットの使用
の中から選ばれるいずれか一つの使用について保護を求めている。
（Ｂ１）結腸直腸癌初代細胞の培養における上記第一態様に記載の培地の使用；
（Ｂ２）結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養における上記第二態様の（Ａ１）または（Ａ３）に記載のキットの使用；
（Ｂ３）結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養における上記第二態様の（Ａ２）または（Ａ４）に記載のキットの使用
の中から選ばれるいずれか一つの使用について保護を求めている。
【0056】
第四態様において、本発明は、結腸直腸癌初代細胞を培養する方法について保護を求めている。
【0057】
本発明が保護を求めている結腸直腸癌初代細胞を培養する方法は、方法Ａまたは方法Ｂである：
方法Ａ：
（ａ１）上記第二態様に記載のサンプル解離液を使用して結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離し、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を得るステップ；
（ａ２）上記第一態様に記載の培地を使用して、ステップ（ａ１）で解離された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップ
を含んでもよい、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を培養する方法；
方法Ｂ：
（ｂ１）結腸直腸癌腹水から結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を分離して獲得するステップ；
（ｂ２）上記第一態様に記載の培地を使用して、ステップ（ｂ１）で分離された結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップ
を含んでもよい、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を培養する方法。
方法Ａ：
（ａ１）上記第二態様に記載のサンプル解離液を使用して結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離し、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を得るステップ；
（ａ２）上記第一態様に記載の培地を使用して、ステップ（ａ１）で解離された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップ
を含んでもよい、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を培養する方法；
方法Ｂ：
（ｂ１）結腸直腸癌腹水から結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を分離して獲得するステップ；
（ｂ２）上記第一態様に記載の培地を使用して、ステップ（ｂ１）で分離された結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップ
を含んでもよい、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を培養する方法。
【0058】
さらに、ステップ（ａ１）において、組織１ｍｇあたり０．１～０．３ｍＬ（例えば、０．１ｍＬ）の前記サンプル解離液の用量で、細かく切られた前記結腸直腸癌固形腫瘍組織（例えば、０．８～１．２ｍｍ３の細かい塊に切られた）を、予め３７℃に予熱した前記サンプル解離液で処理し、３７℃条件下で１５分間から３時間でサンプルを解離するステップを含む方法に従って、前記サンプル解離液を使用して前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離することができる。
【0059】
さらに、ステップ（ｂ１）において、結腸直腸癌腹水中の細胞を上記第二態様に記載の細胞分離緩衝液で懸濁し、次いで、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌリンパ球分離液を利用すること）によって得るステップを含む方法に従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を結腸直腸癌腹水から分離して獲得することができる。
【0060】
さらに、ステップ（ａ２）において、細胞培養容器Ｍを使用して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を前記培地に懸濁培養し、２～４日（例えば、３日）ごとに培地を交換し、細胞が直径５０～８０μｍ（例えば、８０μｍ）の塊を形成するまでに培養するステップを含む方法に従って、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地を使用して前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を懸濁培養することができる。
【0061】
さらに、ステップ（ｂ２）において、細胞培養容器Ｍを使用して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を前記培地に懸濁培養し、２～４日（例えば、３日）ごとに培地を交換し、細胞が直径５０～８０μｍ（例えば、８０μｍ）の塊を形成するまでに培養するステップを含む方法に従って、前記培地を使用して前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を懸濁培養することができる。
【0062】
ここで、最初の播種密度は、容器の底部面積の１ｃｍ２当たりに１０５セルにすることができ、６ウェルプレートを例にすると、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングする。
【0063】
ここで、前記細胞培養容器Ｍは、（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器または低吸着表面を有する細胞培養容器；（ＩＩ）（Ｉ）の細胞培養容器をＣＹＴＯＰ修飾した細胞培養容器のいずれか一つであってもよい。
【0064】
さらに、前記細胞培養容器は、細胞培養皿、細胞培養ウェルプレート、または細胞培養用のマイクロウェルプレートチップである。
【0065】
前記（ＩＩ）において、パワー２０Ｗ、エッチング時間が３分間であるエッチング条件で前記（Ｉ）における細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行い、そして、前記細胞培養容器の表面を１％ＣＹＴＯＰ溶液でコーティングし、前記１％ＣＹＴＯＰ溶液を乾かしてＣＹＴＯＰ修飾を完成するステップを含む方法に従って前記（Ｉ）中の細胞培養容器をＣＹＴＯＰ修飾することができる。
【0066】
ここで、前記１％ＣＹＴＯＰ溶液の組成として、前記１％ＣＹＴＯＰ溶液１００ｍＬごとに１ｍＬのＣＹＴＯＰが含まれ、残りはフッ素油である。
【0067】
さらに、結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルの表面を７０～７５％（例えば、７５％）体積容量のエタノールで１０～３０秒洗浄し、前記結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルをサンプル洗浄液で１０～２０回（例えば、１０回）洗浄し、前記結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルを滅菌ＰＢＳ溶液で５～１０回（例えば、５回）洗浄し、そして、前記結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル中の不純物、結合組織、脂肪組織、壊死組織など、初代細胞培養に影響を与える成分を除去するという、前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離前処理するステップをステップ（ａ１）の前にさらに含んでもよい。
【0068】
前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離前処理するステップは、氷上で操作する必要があり、操作ステップ全体は１０分間以内に完了する必要がある。
【0069】
さらに、前記解離前処理を受けた前記結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルが単離された時間は２時間以内であり、前記解離前処理が行われるまでにずっとサンプル保存液に保存されている。
【0070】
さらに、ステップ（ａ１）において、前記サンプル解離液を使用して前記結腸直腸癌固形腫瘍組織を解離処理した後に、８～１５倍（例えば、１０倍）の容量の前記消化終止液を用いて解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、前記細胞懸濁液を１００μｍまたは４０μｍ滅菌セルストレーナーでろ過して組織断片及び付着細胞を除去し、８００～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）室温で１０～１５分間（例えば、１０分間）遠心分離した後に上澄みを捨て、そして、３～５ｍＬ（例えば、５ｍＬ）滅菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、再度８００～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）、室温で１０～１５分間（例えば、１０分間）遠心分離して上澄みを捨ててから、上記第一態様に記載の培地を使用して細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞をカウントするステップをさらに含んでもよい。
【0071】
さらに、ステップ（ｂ１）の前に、結腸直腸癌腹水サンプル中の不純物や凝血塊など、細胞密度勾配分離に影響を与える成分を除去するという、結腸直腸癌腹水サンプルを分離前処理するステップを含む。
【0072】
さらに、ステップ（ａ２）において、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞が５０～８０μｍ（例えば、８０μｍ）の直径を有する塊を形成する場合には、前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を継代させるステップをさらに含んでもよい。
【0073】
さらに、ステップ（ｂ２）において、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞が５０～８０μｍ（例えば、８０μｍ）の直径を有する塊を形成する場合には、前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を継代させるステップをさらに含んでもよい。
【0074】
前記継代で使用される細胞消化液は、上記第二態様に記載の細胞消化液である。
【0075】
前記継代で使用される消化終止液は、上記第二態様に記載の消化終止液である。
【0076】
さらに、前記継代時の消化温度は３７℃である。
【0077】
より具体的には、前記継代のステップは次の通りである。継代される細胞塊を収集し、遠心分離後に滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄して遠心分離してから、細胞塊を前記細胞消化液で再懸濁し、３７℃で消化し、細胞塊が単一の細胞に消化された後、消化終止液（その用量は５～１０倍、例えば、１０倍の容量にすることができる）を使用して消化反応を終止させ、細胞懸濁液を収集する。遠心分離後に、上記第一態様に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁してカウントし、上記に記載の細胞培養容器Ｍを使用して培養細胞を懸濁し（最初の播種密度は、容器の底部面積の１ｃｍ２当たりに１０５セルにすることができ、６ウェルプレートを例にすると、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングする）、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２である。上記の継代ステップにおけるすべての遠心分離は、具体的には８００～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）室温で１０～２０分間（例えば、１０分間）の遠心分離であってもよい。
【0078】
さらに、前記方法は、２～３回の継代増殖後の前記結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞または前記結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を凍結保存及び／または蘇生（回復）させるステップをさらに含んでもよい。前記凍結保存を行う際に使用される細胞凍結保存液は、上記第二態様に記載の細胞凍結保存液である。
【0079】
さらに、前記凍結保存のステップは次の通りである。凍結保存される細胞塊を収集し、遠心分離後に滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄して遠心分離してから、細胞塊を前記細胞消化液で再懸濁し、３７℃で消化し、細胞塊が単一の細胞に消化された後、前記消化終止液（その用量は５～１０倍、例えば、１０倍の容量にすることができる）を使用して消化反応を終止させ、細胞懸濁液を収集する。遠心分離後に、前記細胞凍結保存液を使用し、０．５～２×１０６／ｍＬ（例えば、１０６／ｍＬ）の密度で細胞ペレットを再懸濁し、勾配冷却ボックス（細胞凍結コンテナー）で一晩凍結保存した後に、長期保存のために液体窒素に移す。上記の凍結保存ステップにおけるすべての遠心分離は、具体的には８００～１０００ｇ（例えば、８００ｇ）室温で１０～２０分間（例えば、１０分間）の遠心分離であってもよい。
【0080】
さらに、前記蘇生の具体的なステップは次の通りである。蘇生される細胞が入った凍結保存チューブを液体窒素から取りだし、３７～３９℃（例えば、３７℃）の滅菌水で細胞をすばやく解凍する。遠心分離（例えば、８００～１０００ｇ、例えば８００ｇ、室温で５～１０分間、例えば、１０分間）後に、上記第一態様に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁してから、上記に記載の細胞培養容器Ｍを使用して培養細胞を懸濁し（最初の播種密度は、容器の底部面積の１ｃｍ２当たりに１０５セルにすることができる）、各チューブの細胞（１０６）を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させ、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２である。
【0081】
第五態様において、本発明は、
（Ｃ１）上記第二態様に記載のサンプル解離液である結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル解離液；
（Ｃ２）上記第二態様に記載のサンプル保存液である結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル保存液；
（Ｃ３）上記第二態様に記載の細胞分離緩衝液である結腸直腸癌腹水細胞分離緩衝液
の中から選ばれるいずれか一つの試薬について保護を求めている。
（Ｃ１）上記第二態様に記載のサンプル解離液である結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル解離液；
（Ｃ２）上記第二態様に記載のサンプル保存液である結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプル保存液；
（Ｃ３）上記第二態様に記載の細胞分離緩衝液である結腸直腸癌腹水細胞分離緩衝液
の中から選ばれるいずれか一つの試薬について保護を求めている。
【0082】
第六態様において、本発明は、
（Ｄ１）結腸直腸癌固形腫瘍組織からの結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の解離における、上記第五態様の（Ｃ１）に記載のサンプル解離液の使用；
（Ｄ２）結腸直腸癌固形腫瘍組織の保存における、上記第五態様の（Ｃ２）に記載のサンプル保存液の使用；
（Ｄ３）結腸直腸癌腹水からの結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の分離における、上記第五態様の（Ｃ３）に記載の細胞分離緩衝液の使用
の中から選ばれるいずれか一つの使用について保護を求めている。
（Ｄ１）結腸直腸癌固形腫瘍組織からの結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の解離における、上記第五態様の（Ｃ１）に記載のサンプル解離液の使用；
（Ｄ２）結腸直腸癌固形腫瘍組織の保存における、上記第五態様の（Ｃ２）に記載のサンプル保存液の使用；
（Ｄ３）結腸直腸癌腹水からの結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の分離における、上記第五態様の（Ｃ３）に記載の細胞分離緩衝液の使用
の中から選ばれるいずれか一つの使用について保護を求めている。
【0083】
第七態様において、本発明は、
（Ｅ１）上記第四態様に記載の方法のステップ（ａ１）を含む、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を結腸直腸癌固形腫瘍組織から解離する方法；
（Ｅ２）単離された直後の結腸直腸癌固形腫瘍組織を上記第二態様に記載のサンプル保存液に入れて２時間以内に保存するステップを含む、結腸直腸癌固形腫瘍組織を保存する方法；
（Ｅ３）上記第四態様に記載のステップ（ｂ１）を含む、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を結腸直腸癌腹水から分離する方法
の中から選ばれるいずれか一つの方法について保護を求めている。
（Ｅ１）上記第四態様に記載の方法のステップ（ａ１）を含む、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を結腸直腸癌固形腫瘍組織から解離する方法；
（Ｅ２）単離された直後の結腸直腸癌固形腫瘍組織を上記第二態様に記載のサンプル保存液に入れて２時間以内に保存するステップを含む、結腸直腸癌固形腫瘍組織を保存する方法；
（Ｅ３）上記第四態様に記載のステップ（ｂ１）を含む、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を結腸直腸癌腹水から分離する方法
の中から選ばれるいずれか一つの方法について保護を求めている。
【0084】
上記各態様において、前記結腸直腸癌は、原発性結腸直腸癌であってもよい。病理学的分類は、結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣である。病期はステージＩＩまたはステージＩＩＩまたはステージＩＶである。
【0085】
さらに、結腸直腸癌固形腫瘍組織から結腸直腸癌初代細胞を分離する際に使用されるサンプルは、結腸直腸癌ステージＩＩまたはステージＩＩＩまたはステージＩＶのサンプルであってもよい。結腸直腸癌腹水から結腸直腸癌初代細胞を分離する際に使用されるサンプルは、結腸直腸癌ステージＩＶのサンプルである。
【0086】
上記各態様において、前記結腸直腸癌初代細胞が結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞または結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞であってもよい。
【0087】
上記各態様において、前記結腸直腸癌初代細胞は、結腸直腸癌患者の手術サンプル（固形腫瘍サンプル）、結腸鏡検査穿刺サンプル、または腹水サンプルから分離されるものであってもよい。ここで、手術サンプルから得られた結腸直腸癌固形腫瘍組織標本は好ましくは２０ｍｇを超える重量を有する。腹水サンプルは好ましくは５０ｍＬ以上である。結腸鏡検査穿刺サンプル（固形腫瘍サンプル）は２つ以上である。
【0088】
本発明において、上記のすべてのＰＢＳは、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３～７．５であってもよい。その具体的な組成として、溶媒は水であり、溶質および濃度は、ＫＨ２ＰＯ４ １４４ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ９０００ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ７Ｈ２Ｏ ７９５ｍｇ／Ｌである。
【図面の簡単な説明】
【0089】
【図1】結腸直腸癌組織を処理して得られた単一細胞を示す図である。スケールは１００μｍであり、１００倍拡大されている。
【図2】結腸直腸癌組織の初代培養後に得られた細胞塊を示す図である。スケールは１００μｍであり、１００倍拡大されている。
【図3】結腸直腸癌組織の初代培養後に得られた結腸直腸癌細胞塊の切片のＨＥ染色図である。スケールは１００μｍであり、２００倍拡大されている。
【図4】結腸直腸癌組織の初代培養後に得られた癌細胞塊の免疫蛍光染色図である。スケールは５０μｍであり、２００倍拡大されている。
【図5】シーケンシング結果に基づいたコピー数変動分析（ＣＮＶ）を示す図である。図５は、各代の結腸直腸癌初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）と原発性結腸直腸癌腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変動状況が非常に一致していることを示している。
【図6】結腸直腸癌腹水サンプルから分離された単一細胞を示す図である。スケールは１００μｍである。
【図7】結腸直腸癌腹水サンプルで初代腫瘍細胞を培養して得られた細胞塊を示す図である。スケールは２００μｍである。
【図8】結腸直腸癌腹水サンプルの初代培養後に得られた結腸直腸癌細胞のＨＥ染色図である。
【図9】結腸直腸癌腹水サンプルの初代培養後に得られた癌細胞塊の免疫蛍光染色図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0090】
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するためのものであるが、本発明を限定するものではない。以下の実施例の実験方法は、特に明記しない限り、通常の方法である。以下の実施例で使用される試験材料は、特に明記しない限り、いずれも通常の生化学試薬店から購入可能なものである。
【0091】
実施例１：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を培養するための試薬の調製
１、サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表１に示す。
サンプル保存液を調製した後、１５ｍＬの遠心分離チューブに分割装入し、チューブあたり５ｍＬにした。分割装入後、４℃で１ヶ月間保存できる。
１、サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表１に示す。
【0092】
２、サンプル洗浄液（１００ｍＬ）
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表２に示す。
サンプル洗浄液は、使用する直前に調製する必要がある。
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表２に示す。
【0093】
３、サンプル解離液（１０ｍＬ）
サンプル解離液（１０ｍＬ）の具体的な処方を表３に示す。
注：サンプル解離液は、使用する直前に調製した。
表３中のコラゲナーゼストック溶液の調製を表４～６に示す。
１０×コラゲナーゼＩストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入し、チューブあたり１ｍＬにした。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０×コラゲナーゼＩＩストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入し、チューブあたり１ｍＬにした。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
２０×コラゲナーゼＩＶストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入し、チューブあたり１ｍＬにした。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
表４、表５、及び表６では、プロテアーゼの酵素活性を使用してコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩまたは前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕを定義する：３７℃、ｐＨ７．５の条件下で、１Ｕのプロテアーゼを使用してコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩまたは前記コラゲナーゼＩＶ）を５時間処理すると、１μｍоｌのＬ－ロイシンを放出することができる。
サンプル解離液（１０ｍＬ）の具体的な処方を表３に示す。
表３中のコラゲナーゼストック溶液の調製を表４～６に示す。
表４、表５、及び表６では、プロテアーゼの酵素活性を使用してコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩまたは前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕを定義する：３７℃、ｐＨ７．５の条件下で、１Ｕのプロテアーゼを使用してコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩまたは前記コラゲナーゼＩＶ）を５時間処理すると、１μｍоｌのＬ－ロイシンを放出することができる。
【0094】
４、細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な処方を表７に示す。
細胞消化液は、使用する直前に調製した。
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な処方を表７に示す。
【0095】
５、消化終止液（１００ｍＬ）
消化終止液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表８に示す。
消化終止液を調製した後、４℃で１ヶ月間保存できる。
消化終止液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表８に示す。
【0096】
６、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）
結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の具体的な処方を表９に示す。
結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地を調製した後、０．２２μＭシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）でろ過して滅菌し、４℃で２週間保存できる。
表９中のヒト組換えタンパク質ストック溶液の調製を表１１～表１５に示し、ＳＢ２０２１９０ストック溶液の調製を表１６に示し、Ａ８３－０１ストック溶液の調製を表１７に示し、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎストック溶液の調製を表１８に示し、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅストック溶液の調製を表１９に示し、コルチゾールストック溶液の調製を表２０に示し、Ｙ－２７６３２ストック溶液の調製を表２１に示す。これらのストック溶液を調製する際に必要な１００×ＢＳＡ溶液の調製を表１０に示す。
１００×ＢＳＡ溶液は、使用する直前に調製した。
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－８０℃で長期間保存できる。
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－８０℃で長期間保存できる。
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－８０℃で長期間保存できる。
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－８０℃で長期間保存できる。
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－８０℃で長期間保存できる。
１０００×ＳＢ２０２１９０ストック溶液を調製した後、０．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０００００×Ａ８３－０１ストック溶液を調製した後、０．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０００×Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉストック溶液を調製した後、０．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０００×Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅストック溶液を調製した後、０．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０００×コルチゾールストック溶液を調製した後、１．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
１０００×Ｙ－２７６３２ストック溶液を調製した後、０．５ｍＬの滅菌遠心分離チューブに分割装入した。このストック溶液は、－２０℃で長期間保存できる。
結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の具体的な処方を表９に示す。
表９中のヒト組換えタンパク質ストック溶液の調製を表１１～表１５に示し、ＳＢ２０２１９０ストック溶液の調製を表１６に示し、Ａ８３－０１ストック溶液の調製を表１７に示し、Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎストック溶液の調製を表１８に示し、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅストック溶液の調製を表１９に示し、コルチゾールストック溶液の調製を表２０に示し、Ｙ－２７６３２ストック溶液の調製を表２１に示す。これらのストック溶液を調製する際に必要な１００×ＢＳＡ溶液の調製を表１０に示す。
【0097】
７、細胞凍結保存液
細胞凍結保存液の具体的な処方を表２２に示す。
細胞凍結保存液は、使用する直前に調製した。
表２２中の１％メチルセルロース溶液の調製を表２３に示す。
１％メチルセルロース溶液を調製した後、４℃で長期間保存できる。
細胞凍結保存液の具体的な処方を表２２に示す。
表２２中の１％メチルセルロース溶液の調製を表２３に示す。
【0098】
実施例２：結腸直腸癌固形腫瘍の術後標本の獲得
１、三級甲等病院と協力し、この協力は、正式な医療倫理審査により承認された。
２、主治医は、医療ガイドラインで指定された臨床的適応に従ってグループされる患者を選択し、術中の臨床的適応に従って適切なサンプルを選択してインビトロ培養にした。サンプルの選択基準は、原発性結腸直腸癌、病理学的病期分類がステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶに分けられ、各病理学的分類が結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣であり、結腸直腸癌手術標本の重量が２０ｍｇを超えたサンプルである。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の名前、ＩＤ番号などの患者のプライバシーに関連する情報は隠され、統一された実験番号に置き換えられた。実験番号の命名原則は、サンプル収集の８桁の日付＋患者の入院番号の最後の４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルは、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５である場合、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５となる。
４、手術中、外科医は手術室の無菌環境で新鮮な標本を収集し、予め準備されたサンプル保存液（表１）に入れた。サンプルは体から採取（単離）後に一時的に氷上に保管され、次の操作のために２時間以内に実験室に輸送された。
１、三級甲等病院と協力し、この協力は、正式な医療倫理審査により承認された。
２、主治医は、医療ガイドラインで指定された臨床的適応に従ってグループされる患者を選択し、術中の臨床的適応に従って適切なサンプルを選択してインビトロ培養にした。サンプルの選択基準は、原発性結腸直腸癌、病理学的病期分類がステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶに分けられ、各病理学的分類が結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣であり、結腸直腸癌手術標本の重量が２０ｍｇを超えたサンプルである。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の名前、ＩＤ番号などの患者のプライバシーに関連する情報は隠され、統一された実験番号に置き換えられた。実験番号の命名原則は、サンプル収集の８桁の日付＋患者の入院番号の最後の４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルは、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５である場合、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５となる。
４、手術中、外科医は手術室の無菌環境で新鮮な標本を収集し、予め準備されたサンプル保存液（表１）に入れた。サンプルは体から採取（単離）後に一時的に氷上に保管され、次の操作のために２時間以内に実験室に輸送された。
【0099】
実施例３：結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルの解離前処理
以下の操作は氷上で行う必要があり、すべての操作ステップは１０分以内に完了しなければならない。
以下の操作に使用する手術器具は、予め高温高圧で滅菌する必要があり、乾燥しないと使用できない。
１、サンプルの重量を量った。
２、サンプル表面を７５％（体積％）エタノールで１０～３０秒間洗浄した。
３、サンプルをサンプル洗浄液（表２）で１０回洗浄し、滅菌ＰＢＳ溶液で５回洗浄した。
４、眼科用はさみ、眼科用鑷子、外科用メスなどの器具を使用して、サンプル中の脂肪組織、結合組織、壊死組織を注意深く剥離させた。
以下の操作は氷上で行う必要があり、すべての操作ステップは１０分以内に完了しなければならない。
以下の操作に使用する手術器具は、予め高温高圧で滅菌する必要があり、乾燥しないと使用できない。
１、サンプルの重量を量った。
２、サンプル表面を７５％（体積％）エタノールで１０～３０秒間洗浄した。
３、サンプルをサンプル洗浄液（表２）で１０回洗浄し、滅菌ＰＢＳ溶液で５回洗浄した。
４、眼科用はさみ、眼科用鑷子、外科用メスなどの器具を使用して、サンプル中の脂肪組織、結合組織、壊死組織を注意深く剥離させた。
【0100】
実施例４：結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルの解離
次の実施例で使用された手術器具は、予め高温高圧で滅菌する必要があり、乾燥しないと使用できない。
１、眼科用はさみで組織を１ｍｍ３くらいの小片に切った。
２、組織１ｍｇあたり０．１ｍＬのサンプル解離液（表３）の用量で、細かく切られた組織サンプルを、予め３７℃に予熱したサンプル解離液で処理し、３７℃条件下で１５分間から３時間でサンプルを解離した。大量の単一細胞が観察されるまで、１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察した。
３、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
４、細胞懸濁液を４０μｍの滅菌セルストレーナーでろ過して組織断片及び付着細胞を除去した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離した後に上澄みを捨てた。
６、５ｍＬ滅菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離して上澄みを捨てた。
７、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）を使用して細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞をカウントした。
図１に示すように、解離して得られた単一細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、赤血球、リンパ球、線維細胞など、さまざまな種類の細胞が大量に存在する。本方法の利点の１つは、後続の培養過程では、癌細胞のみを大量に増殖させることができ、他の細胞の割合は徐々に減少するまたは無くなるので、最終的に高純度の結腸直腸癌初代腫瘍細胞が得られる。
次の実施例で使用された手術器具は、予め高温高圧で滅菌する必要があり、乾燥しないと使用できない。
１、眼科用はさみで組織を１ｍｍ３くらいの小片に切った。
２、組織１ｍｇあたり０．１ｍＬのサンプル解離液（表３）の用量で、細かく切られた組織サンプルを、予め３７℃に予熱したサンプル解離液で処理し、３７℃条件下で１５分間から３時間でサンプルを解離した。大量の単一細胞が観察されるまで、１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察した。
３、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
４、細胞懸濁液を４０μｍの滅菌セルストレーナーでろ過して組織断片及び付着細胞を除去した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離した後に上澄みを捨てた。
６、５ｍＬ滅菌ＰＢＳで細胞を再懸濁し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離して上澄みを捨てた。
７、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）を使用して細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞をカウントした。
図１に示すように、解離して得られた単一細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、赤血球、リンパ球、線維細胞など、さまざまな種類の細胞が大量に存在する。本方法の利点の１つは、後続の培養過程では、癌細胞のみを大量に増殖させることができ、他の細胞の割合は徐々に減少するまたは無くなるので、最終的に高純度の結腸直腸癌初代腫瘍細胞が得られる。
【0101】
実施例５：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養
１、低付着表面（Ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を使用して結腸直腸癌初代細胞の懸濁培養をした。使用した培地はすなわち、実施例１の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）であった。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
２、毎日細胞の状態を観察し、細胞が約８０μｍの直径を有する塊を形成するまで、３日ごとに培地を交換した。
図２に示すように、３～１０日間の培養を経て、癌細胞は大量に増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成した。腫瘍細胞の総数は１０７を超え得、他の種類の細胞の数は明らかに減少するまたは無くなる。本方法は大量のサンプルでテストされており、結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞のインビトロ培養の成功率は８０％に達することができる。
１、低付着表面（Ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を使用して結腸直腸癌初代細胞の懸濁培養をした。使用した培地はすなわち、実施例１の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）であった。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
２、毎日細胞の状態を観察し、細胞が約８０μｍの直径を有する塊を形成するまで、３日ごとに培地を交換した。
図２に示すように、３～１０日間の培養を経て、癌細胞は大量に増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成した。腫瘍細胞の総数は１０７を超え得、他の種類の細胞の数は明らかに減少するまたは無くなる。本方法は大量のサンプルでテストされており、結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞のインビトロ培養の成功率は８０％に達することができる。
【0102】
実施例６：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の継代
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントした。
７、低付着表面（Ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を使用して結腸直腸癌初代細胞の培養をした。使用した培地はすなわち、実施例１の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）であった。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントした。
７、低付着表面（Ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を使用して結腸直腸癌初代細胞の培養をした。使用した培地はすなわち、実施例１の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）であった。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
【0103】
実施例７：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の凍結保存
懸濁培養した結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞は、２～３回の継代増殖後に凍結保存することができる。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントした。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、細胞凍結保存液（表２２）を使用し、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁し、２ｍＬ凍結保存チューブにチューブあたり１ｍＬの細胞懸濁液を入れて、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後に、長期保存のために液体窒素に移した。
懸濁培養した結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞は、２～３回の継代増殖後に凍結保存することができる。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントした。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、細胞凍結保存液（表２２）を使用し、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁し、２ｍＬ凍結保存チューブにチューブあたり１ｍＬの細胞懸濁液を入れて、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後に、長期保存のために液体窒素に移した。
【0104】
実施例８：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の蘇生
液体窒素に保存された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を蘇生させることができる。
１、３７℃の滅菌水を５分前に準備した。
２、凍結保存チューブを液体窒素から取りだし、３７℃の滅菌水で細胞をすばやく解凍した。
３、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、低付着表面を使用して結腸直腸癌初代細胞を培養し、各チューブの細胞を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
液体窒素に保存された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞を蘇生させることができる。
１、３７℃の滅菌水を５分前に準備した。
２、凍結保存チューブを液体窒素から取りだし、３７℃の滅菌水で細胞をすばやく解凍した。
３、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、低付着表面を使用して結腸直腸癌初代細胞を培養し、各チューブの細胞を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
【0105】
実施例９：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞のＨＥ染色同定
下記実施例で使用された試薬消耗品についての説明：
ＨＥ染色キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｇ１１２０）；
カチオン脱落防止ガラススライド（北京中杉金橋生物科技有限公司）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試剤公司、分析グレード）；
ニュートラルバルサム（Neutral balsam，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
１、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた懸濁結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の塊を８００ｇでの遠心分離によって収集し、４％パラホルムアルデヒドで固定させた。細胞塊ペレットをパラフィンに包埋して切片化し、切片の厚さは５μｍであった。
２、パラフィン切片をキシレン溶液に浸し、室温で５分間インキュベーションして脱パラフィンし、３回繰り返した後、脱イオン水で２回濯いだ。
３、切片を無水エタノールに浸し、室温で１０分間インキュベーションし、２回繰り返した。
４、切片を９５％エタノールに浸し、室温で１０分間インキュベーションし、２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回濯いだ。
５、ガラススライド上の水分が少し乾いたら、ヘマトキシリン染色液１００μＬを加えて１分間染色した。
６、ヘマトキシリン染色液を吸い取って、ガラススライドを水道水で３回洗浄した。
７、分化液１００μＬを滴下して１分間分化した。
８、分化液を吸い取って、ガラススライドを水道水で２回洗浄してから、蒸留水で１回洗浄した。
９、ガラススライドの表面の水分を吸い取って、エオシン染色液２００μＬを加えて４０秒間染色した。
１０、エオシン染色液を吸い取って、順に７５％、８０％、９０％、１００％エタノールで２０秒、２０秒、４０秒、４０秒すすいで脱水した。
１１、エタノールが乾いた後、キシレン５０μＬを滴下して細胞に透過化処理をした。
１２、キシレンが完全に乾いた後、ニュートラルバルサムを一滴加え、切片をカバーガラスで封入し、顕微鏡で観察して写真を撮った。
図３は、インビトロ培養で得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞のＨＥ染色効果を示す図である。この図から見えるように、これらの細胞は一般に、核細胞質比が高く、核が深く染色され、核内にクロマチンが凝集し、多核で、細胞サイズが不均一であるなど、癌細胞の特徴を持っており、数十から数百の腫瘍細胞が凝集して、特定の三次元構造を有する腫瘍細胞塊を形成している。
下記実施例で使用された試薬消耗品についての説明：
ＨＥ染色キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｇ１１２０）；
カチオン脱落防止ガラススライド（北京中杉金橋生物科技有限公司）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試剤公司、分析グレード）；
ニュートラルバルサム（Neutral balsam，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
１、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた懸濁結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の塊を８００ｇでの遠心分離によって収集し、４％パラホルムアルデヒドで固定させた。細胞塊ペレットをパラフィンに包埋して切片化し、切片の厚さは５μｍであった。
２、パラフィン切片をキシレン溶液に浸し、室温で５分間インキュベーションして脱パラフィンし、３回繰り返した後、脱イオン水で２回濯いだ。
３、切片を無水エタノールに浸し、室温で１０分間インキュベーションし、２回繰り返した。
４、切片を９５％エタノールに浸し、室温で１０分間インキュベーションし、２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回濯いだ。
５、ガラススライド上の水分が少し乾いたら、ヘマトキシリン染色液１００μＬを加えて１分間染色した。
６、ヘマトキシリン染色液を吸い取って、ガラススライドを水道水で３回洗浄した。
７、分化液１００μＬを滴下して１分間分化した。
８、分化液を吸い取って、ガラススライドを水道水で２回洗浄してから、蒸留水で１回洗浄した。
９、ガラススライドの表面の水分を吸い取って、エオシン染色液２００μＬを加えて４０秒間染色した。
１０、エオシン染色液を吸い取って、順に７５％、８０％、９０％、１００％エタノールで２０秒、２０秒、４０秒、４０秒すすいで脱水した。
１１、エタノールが乾いた後、キシレン５０μＬを滴下して細胞に透過化処理をした。
１２、キシレンが完全に乾いた後、ニュートラルバルサムを一滴加え、切片をカバーガラスで封入し、顕微鏡で観察して写真を撮った。
図３は、インビトロ培養で得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞のＨＥ染色効果を示す図である。この図から見えるように、これらの細胞は一般に、核細胞質比が高く、核が深く染色され、核内にクロマチンが凝集し、多核で、細胞サイズが不均一であるなど、癌細胞の特徴を持っており、数十から数百の腫瘍細胞が凝集して、特定の三次元構造を有する腫瘍細胞塊を形成している。
【0106】
実施例１０：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の免疫蛍光染色同定
次の実施例で使用された試薬についての説明：
パラホルムアルデヒド（北京化学試剤公司、分析グレード）、パラホルムアルデヒド粉末を超純水に溶解して４％（４ｇ／１００ｍＬ）のパラホルムアルデヒド溶液を調製した；
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試剤公司、分析グレード）；
過酸化水素（北京化学試剤公司、３５％）；
メタノール、ジメチルスルホキシド、および３５％過酸化水素を４：４：１（体積比）の比率で混合して丹氏すすぎ液を調製した；
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ１９３３）、ウシ血清アルブミンをＰＢＳ溶液に溶解して３％（３ｇ／１００ｍＬ）のＢＳＡ溶液を調製した；
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１７１３９）；
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ、＃４４０８）；
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｃ００２１）；
次のステップに従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞の塊を免疫蛍光染色し、一次抗体はＣＫ８＋ＣＫ１８であり、上皮由来の細胞をキャラクタライゼーションした。
１、培養皿の中の細胞塊を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで再懸濁し、４℃で一晩して固定させた。
２、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを予冷したメタノール溶液で再懸濁し、氷上に１時間置いた。
３、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを丹氏すすぎ液で再懸濁し、室温で２時間置いた。
４、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、ＰＢＳで希釈した７５％、５０％、２５％（体積％）のメタノール溶液で順に細胞を洗浄し、毎回１０分間洗浄した。
５、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを３％ＢＳＡ溶液で懸濁し、室温で２時間ブロックした。
６、一次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：５００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で再懸濁し、一次抗体を４℃で一晩保持した。
７、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
８、二次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：２０００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で再懸濁し、二次抗体を室温で２時間保持した。
９、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
１０、１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を１／１００の体積比で加え、室温で２０分間染色した。
１１、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で２回、毎回１０分間洗浄した。共焦点レーザー顕微鏡を使用して細胞塊の染色状況を観察した。
図４は、インビトロで培養された結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞の塊の免疫蛍光染色効果を示す図である。この図から見えるように、細胞塊を構成する細胞はすべてＣＫ８／ＣＫ１８陽性であり、上皮由来である。これは、本方法で培養した腫瘍細胞が純度の高いものであることを実証した。２０の結腸直腸癌サンプルの初代培養物について免疫蛍光染色によって同定して統計した結果、本方法によって得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞における腫瘍細胞の割合が７２％～９５％に達したことは示されている（表２４）。
次の実施例で使用された試薬についての説明：
パラホルムアルデヒド（北京化学試剤公司、分析グレード）、パラホルムアルデヒド粉末を超純水に溶解して４％（４ｇ／１００ｍＬ）のパラホルムアルデヒド溶液を調製した；
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試剤公司、分析グレード）；
過酸化水素（北京化学試剤公司、３５％）；
メタノール、ジメチルスルホキシド、および３５％過酸化水素を４：４：１（体積比）の比率で混合して丹氏すすぎ液を調製した；
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ１９３３）、ウシ血清アルブミンをＰＢＳ溶液に溶解して３％（３ｇ／１００ｍＬ）のＢＳＡ溶液を調製した；
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１７１３９）；
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ、＃４４０８）；
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｃ００２１）；
次のステップに従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞の塊を免疫蛍光染色し、一次抗体はＣＫ８＋ＣＫ１８であり、上皮由来の細胞をキャラクタライゼーションした。
１、培養皿の中の細胞塊を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで再懸濁し、４℃で一晩して固定させた。
２、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを予冷したメタノール溶液で再懸濁し、氷上に１時間置いた。
３、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを丹氏すすぎ液で再懸濁し、室温で２時間置いた。
４、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、ＰＢＳで希釈した７５％、５０％、２５％（体積％）のメタノール溶液で順に細胞を洗浄し、毎回１０分間洗浄した。
５、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを３％ＢＳＡ溶液で懸濁し、室温で２時間ブロックした。
６、一次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：５００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で再懸濁し、一次抗体を４℃で一晩保持した。
７、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
８、二次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：２０００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で再懸濁し、二次抗体を室温で２時間保持した。
９、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
１０、１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を１／１００の体積比で加え、室温で２０分間染色した。
１１、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で２回、毎回１０分間洗浄した。共焦点レーザー顕微鏡を使用して細胞塊の染色状況を観察した。
図４は、インビトロで培養された結腸直腸癌固形腫瘍初代腫瘍細胞の塊の免疫蛍光染色効果を示す図である。この図から見えるように、細胞塊を構成する細胞はすべてＣＫ８／ＣＫ１８陽性であり、上皮由来である。これは、本方法で培養した腫瘍細胞が純度の高いものであることを実証した。２０の結腸直腸癌サンプルの初代培養物について免疫蛍光染色によって同定して統計した結果、本方法によって得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞における腫瘍細胞の割合が７２％～９５％に達したことは示されている（表２４）。
【0107】
実施例１１：結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培養物及び原発腫瘍組織
下記実施例で言及されたＤＮＡ抽出フローは、天根（TIANGEN）血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたライブラリー構築フローは、ＮＥＢ ＤＮＡシーケンシングライブラリー構築キット（Ｅ７６４５）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたハイスループットシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンシングプラットフォームを指す。
１、結腸直腸癌固形腫瘍サンプルを取得し、インビトロ培養操作を行う前に、まず、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）のために結腸直腸癌固形腫瘍サンプル１０ｍｇを取り、シーケンシング深度は３０Ｘであり、残りの固形腫瘍サンプルを結腸直腸癌初代細胞のインビトロ培養に使用した。
２、結腸直腸癌組織の処理後、一定期間の培養を経て、直径８０μｍ以上の細胞塊を形成したものをＰ０代細胞として記録し、その後は継代の回数に応じて順にＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとして記録した。結腸直腸癌初代腫瘍細胞培養物のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４代からそれぞれ１０６の細胞を取りだし、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）に使用し、シーケンシング深度は３０Ｘであった。
３、各グループのシーケンシング結果をコピー数変動分析（ＣＮＶ）して、原発性結腸直腸癌腫瘍組織と各代の結腸直腸癌初代細胞培養物との間のコピー数変動を比較した。図５に示すように、各代の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）と原発性結腸直腸癌腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変動状況が非常に一致している。よって、本方法で得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞は、患者の原発性腫瘍の真の状況を表すことができる。
下記実施例で言及されたＤＮＡ抽出フローは、天根（TIANGEN）血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたライブラリー構築フローは、ＮＥＢ ＤＮＡシーケンシングライブラリー構築キット（Ｅ７６４５）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたハイスループットシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンシングプラットフォームを指す。
１、結腸直腸癌固形腫瘍サンプルを取得し、インビトロ培養操作を行う前に、まず、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）のために結腸直腸癌固形腫瘍サンプル１０ｍｇを取り、シーケンシング深度は３０Ｘであり、残りの固形腫瘍サンプルを結腸直腸癌初代細胞のインビトロ培養に使用した。
２、結腸直腸癌組織の処理後、一定期間の培養を経て、直径８０μｍ以上の細胞塊を形成したものをＰ０代細胞として記録し、その後は継代の回数に応じて順にＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとして記録した。結腸直腸癌初代腫瘍細胞培養物のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４代からそれぞれ１０６の細胞を取りだし、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）に使用し、シーケンシング深度は３０Ｘであった。
３、各グループのシーケンシング結果をコピー数変動分析（ＣＮＶ）して、原発性結腸直腸癌腫瘍組織と各代の結腸直腸癌初代細胞培養物との間のコピー数変動を比較した。図５に示すように、各代の結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）と原発性結腸直腸癌腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変動状況が非常に一致している。よって、本方法で得られた結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞は、患者の原発性腫瘍の真の状況を表すことができる。
【0108】
実施例１２：異なる初代細胞培地での結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率の比較
本実施例では、培地の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の初代細胞培地について表２５を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表９を参照できる。
初代細胞培地を調製した後、０．２２μＭシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）でろ過して滅菌し、４℃で２週間保存できる。
４つの初代細胞培地スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルを処理し、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表２６に示す：
以上から分かるように、初代細胞培地は、結腸直腸癌初代細胞の培養成功率に大きな影響を与え、本発明で使用した結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞培地（表９）は、結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルにおける癌細胞の増殖を最大限に刺激することができ、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を高めることができる。
本実施例では、培地の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の初代細胞培地について表２５を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表９を参照できる。
４つの初代細胞培地スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルを処理し、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表２６に示す：
【0109】
実施例１３：異なるサンプル保存液での結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率の比較
本実施例では、サンプル保存液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種のサンプル保存液について表２７を参照できる。スキームＥは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表１を参照できる。
上記の表の各種のサンプル保存液を調製した後、１５ｍＬの遠心分離チューブに分割装入し、チューブあたり５ｍＬにした。分割装入後、４℃で１ヶ月間保存できる。
５つのサンプル保存液スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌固形腫瘍サンプルを処理し、サンプルを体から採取した後、４℃でサンプル保存液に一時的に保存した。体から採取して２時間後、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表２８に示す：
以上から分かるように、サンプル保存液の処方は、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率に大きな影響を与え、本発明で使用したサンプル保存液（表１）は、結腸直腸癌固形腫瘍組織サンプルにおける癌細胞の活性を最大限に保護することができ、培養成功率を高めることができる。
本実施例では、サンプル保存液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種のサンプル保存液について表２７を参照できる。スキームＥは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表１を参照できる。
５つのサンプル保存液スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌固形腫瘍サンプルを処理し、サンプルを体から採取した後、４℃でサンプル保存液に一時的に保存した。体から採取して２時間後、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表２８に示す：
【0110】
実施例１４：異なるサンプル解離液での結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率の比較
本実施例では、サンプル解離液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種のサンプル解離液について表２９を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表３を参照できる。
サンプル解離液は、使用する直前に調製した。
重量が１００ｍｇを超えた結腸直腸癌固形腫瘍組織塊を２０個選択し、４部分に均等に分け、上記の４つのサンプル解離液を使用して、それぞれ実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表３０に示す：
以上から分かるように、サンプル解離液の処方は、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率に大きな影響を与え、本発明で使用したサンプル解離液（表３）は、結腸直腸癌固形腫瘍組織における癌細胞を最大限に分離することができ、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を高めることができる。
本実施例では、サンプル解離液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種のサンプル解離液について表２９を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表３を参照できる。
重量が１００ｍｇを超えた結腸直腸癌固形腫瘍組織塊を２０個選択し、４部分に均等に分け、上記の４つのサンプル解離液を使用して、それぞれ実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養成功率を統計した結果を表３０に示す：
【0111】
実施例１５：異なる細胞消化液での結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の継代成功率の比較
本実施例では、細胞消化液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代細胞継代の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の細胞消化液について表３１を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表７を参照できる。
細胞消化液は、使用する直前に調製した。
培養に成功した結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞のサンプルを２０個選択し、それぞれ上記の４つの細胞消化液を使用して、培養された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞について実施例６に記載の方法に従って連続継代操作を行った。癌細胞が増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成すると継代し（１０回以下）、最大継代回数を記録した。統計した結果を表３２に示す：
以上から分かるように、細胞消化液の処方は、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の継代成功率に大きな影響を与え、本発明で使用した細胞消化液（表７）は、細胞塊中の癌細胞を温和に解離し、サンプルを連続的に継代して結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の活性を維持することができる。
本実施例では、細胞消化液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代細胞継代の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の細胞消化液について表３１を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表７を参照できる。
培養に成功した結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞のサンプルを２０個選択し、それぞれ上記の４つの細胞消化液を使用して、培養された結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞について実施例６に記載の方法に従って連続継代操作を行った。癌細胞が増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成すると継代し（１０回以下）、最大継代回数を記録した。統計した結果を表３２に示す：
【0112】
実施例１６：結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養に使用される試薬の調製
１、細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）
細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表３３に示す：
細胞分離緩衝液を調製した後、４℃で１ヶ月間保存できる。
表３３中のヘパリンナトリウム溶液の調製について、表３４を参照できる。
１０００×ヘパリンナトリウム溶液は、使用する直前に調製した。
２、細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な処方は、表７に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される細胞消化液の処方と同じである）。
３、消化終止液（１００ｍＬ）
消化終止液（１００ｍＬ）の具体的な処方は、表８に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される消化終止液の処方と同じである）。
４、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培地（１００ｍＬ）
結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培地（１００ｍＬ）の具体的な処方は、表９に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培地の処方と同じである）。
５、細胞凍結保存液
細胞凍結保存液の具体的な処方は、表２２に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される細胞凍結保存液の処方と同じである）。
１、細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）
細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）の具体的な処方を表３３に示す：
表３３中のヘパリンナトリウム溶液の調製について、表３４を参照できる。
２、細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の具体的な処方は、表７に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される細胞消化液の処方と同じである）。
３、消化終止液（１００ｍＬ）
消化終止液（１００ｍＬ）の具体的な処方は、表８に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される消化終止液の処方と同じである）。
４、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培地（１００ｍＬ）
結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培地（１００ｍＬ）の具体的な処方は、表９に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培地の処方と同じである）。
５、細胞凍結保存液
細胞凍結保存液の具体的な処方は、表２２に示す通りである（結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養に使用される細胞凍結保存液の処方と同じである）。
【0113】
実施例１７：結腸直腸癌腹水サンプルの獲得
１、三級甲等病院と協力し、この協力は、正式な医療倫理審査により承認された。
２、主治医は、医療ガイドラインで指定された臨床的適応に従ってグループされる患者を選択し、術中の臨床的適応に従って適切なサンプルを選択してインビトロ培養にした。サンプルの選択基準は、原発性結腸直腸癌、病理学的病期分類がステージＩＶであり、病理学的分類が結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣であり、患者は、排出する必要のある悪性腹水があり、排出量は５０ｍＬ以上である。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の名前、ＩＤ番号などの患者のプライバシーに関連する情報は隠され、統一された実験番号に置き換えられた。実験番号の命名原則は、サンプル収集の８桁の日付＋患者の入院番号の最後の４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルは、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５である場合、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５となる。
４、主治医は滅菌器具および容器を使用して腹水サンプルを収集した。サンプルは体から採取後に一時的に氷上に保管され、次の操作のために７２時間以内に実験室に輸送された。
１、三級甲等病院と協力し、この協力は、正式な医療倫理審査により承認された。
２、主治医は、医療ガイドラインで指定された臨床的適応に従ってグループされる患者を選択し、術中の臨床的適応に従って適切なサンプルを選択してインビトロ培養にした。サンプルの選択基準は、原発性結腸直腸癌、病理学的病期分類がステージＩＶであり、病理学的分類が結腸直腸癌または結腸直腸癌転移病巣であり、患者は、排出する必要のある悪性腹水があり、排出量は５０ｍＬ以上である。
３、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の名前、ＩＤ番号などの患者のプライバシーに関連する情報は隠され、統一された実験番号に置き換えられた。実験番号の命名原則は、サンプル収集の８桁の日付＋患者の入院番号の最後の４桁である。例えば、２０１８年１月１日に提供されたサンプルは、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５である場合、サンプルの実験番号は２０１８０１０１２７６５となる。
４、主治医は滅菌器具および容器を使用して腹水サンプルを収集した。サンプルは体から採取後に一時的に氷上に保管され、次の操作のために７２時間以内に実験室に輸送された。
【0114】
実施例１８：結腸直腸癌腹水サンプルの前処理
下記実施例は氷上で操作する必要がある：
１、結腸直腸癌腹水サンプルを氷上に約３０分間静置し、サンプル中の凝血塊と大きい不溶性固形物をサンプルチューブの底に沈降させた。
２、上澄みを５０ｍＬの滅菌遠心分離チューブに注意深く移した。
３、２０００ｇで５分間、室温で遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、細胞ペレットを細胞分離緩衝液（表３３）で再懸濁し、２０００ｇで室温で５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
５、細胞ペレットを細胞分離緩衝液（表３３）で再懸濁し、細胞濃度を１０７～１０８セル／ｍＬに調整した。
下記実施例は氷上で操作する必要がある：
１、結腸直腸癌腹水サンプルを氷上に約３０分間静置し、サンプル中の凝血塊と大きい不溶性固形物をサンプルチューブの底に沈降させた。
２、上澄みを５０ｍＬの滅菌遠心分離チューブに注意深く移した。
３、２０００ｇで５分間、室温で遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、細胞ペレットを細胞分離緩衝液（表３３）で再懸濁し、２０００ｇで室温で５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
５、細胞ペレットを細胞分離緩衝液（表３３）で再懸濁し、細胞濃度を１０７～１０８セル／ｍＬに調整した。
【0115】
実施例１９：結腸直腸癌腹水サンプルの密度勾配遠心分離
１、５０ｍＬの滅菌遠心分離チューブを使用して、細胞懸濁液と同じ容量のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を取った。
２、細胞懸濁液を細胞分離液の上層に注意深く加え、細胞懸濁液と細胞分離液との間に明確な界面を形成させた。
３、２０００ｇで横型遠心分離機で室温で２０分間遠心分離した。
４、中間層白膜を吸い取って新しいチューブに入れた。
５、細胞ペレットを２０ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁し、１５００ｇで１０分間、室温で遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）を使用して細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞をカウントした。
図６に示すように、結腸直腸癌腹水サンプルから解離して得られた単一細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、赤血球、リンパ球、線維細胞など、さまざまな種類の細胞が大量に存在する。本方法の利点の１つは、後続の培養過程では、癌細胞のみを大量に増殖させることができ、他の細胞の割合は徐々に減少するまたは無くなるので、最終的に高純度の結腸直腸癌初代腫瘍細胞が得られる。
１、５０ｍＬの滅菌遠心分離チューブを使用して、細胞懸濁液と同じ容量のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を取った。
２、細胞懸濁液を細胞分離液の上層に注意深く加え、細胞懸濁液と細胞分離液との間に明確な界面を形成させた。
３、２０００ｇで横型遠心分離機で室温で２０分間遠心分離した。
４、中間層白膜を吸い取って新しいチューブに入れた。
５、細胞ペレットを２０ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁し、１５００ｇで１０分間、室温で遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）を使用して細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞をカウントした。
図６に示すように、結腸直腸癌腹水サンプルから解離して得られた単一細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、赤血球、リンパ球、線維細胞など、さまざまな種類の細胞が大量に存在する。本方法の利点の１つは、後続の培養過程では、癌細胞のみを大量に増殖させることができ、他の細胞の割合は徐々に減少するまたは無くなるので、最終的に高純度の結腸直腸癌初代腫瘍細胞が得られる。
【0116】
実施例２０：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の培養
１、低付着表面を使用して結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の懸濁培養をした。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
２、毎日細胞の状態を観察し、細胞が約８０μｍの直径を有する塊を形成するまで、３日ごとに培地を交換した。
図７に示すように、３～１０日間の培養を経て、癌細胞は大量に増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成した。腫瘍細胞の総数は１０７を超え得、他の種類の細胞の数は明らかに減少するまたは無くなる。本方法は大量のサンプルでテストされており、結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞のインビトロ培養の成功率は８０％に達することができる。
１、低付着表面を使用して結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の懸濁培養をした。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
２、毎日細胞の状態を観察し、細胞が約８０μｍの直径を有する塊を形成するまで、３日ごとに培地を交換した。
図７に示すように、３～１０日間の培養を経て、癌細胞は大量に増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成した。腫瘍細胞の総数は１０７を超え得、他の種類の細胞の数は明らかに減少するまたは無くなる。本方法は大量のサンプルでテストされており、結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞のインビトロ培養の成功率は８０％に達することができる。
【0117】
実施例２１：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の継代
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントした。
７、低付着表面を使用して結腸直腸癌初代細胞の培養をした。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して解離反応を終止させ、細胞懸濁液を収集した。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントした。
７、低付着表面を使用して結腸直腸癌初代細胞の培養をした。６ウェルプレートを例にして、ウェルあたり１０６セルの密度でプレートにコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
【0118】
実施例２２：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の凍結保存
懸濁培養した結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞は、２～３回の継代増殖後に凍結保存することができる。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントした。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、細胞凍結保存液（表２２）を使用し、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁し、２ｍＬ凍結保存チューブにチューブあたり１ｍＬの細胞懸濁液を入れて、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後に、長期保存のために液体窒素に移した。
懸濁培養した結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞は、２～３回の継代増殖後に凍結保存することができる。
１、培養皿中の細胞塊を収集し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
２、滅菌ＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
３、細胞塊を細胞消化液（表７）で再懸濁し、３７℃で消化した。細胞塊が単一の細胞に消化されるまで、５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化状態を観察した。
４、１０倍容量の消化終止液（表８）を使用して反応を終止させ、細胞懸濁液を収集し、細胞をカウントした。
５、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
６、細胞凍結保存液（表２２）を使用し、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁し、２ｍＬ凍結保存チューブにチューブあたり１ｍＬの細胞懸濁液を入れて、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後に、長期保存のために液体窒素に移した。
【0119】
実施例２３：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の蘇生
液体窒素に保存された結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞を蘇生させることができる。
１、３７℃の滅菌水を５分前に準備した。
２、凍結保存チューブを液体窒素から取りだし、３７℃の滅菌水で細胞をすばやく解凍した。
３、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、低付着表面を使用して結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞を培養し、各チューブの細胞を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
液体窒素に保存された結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞を蘇生させることができる。
１、３７℃の滅菌水を５分前に準備した。
２、凍結保存チューブを液体窒素から取りだし、３７℃の滅菌水で細胞をすばやく解凍した。
３、８００ｇで室温で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
４、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）で細胞ペレットを再懸濁し、低付着表面を使用して結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞を培養し、各チューブの細胞を３．５ｃｍ培養皿に蘇生させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で細胞インキュベーターで培養した。
【0120】
実施例２４：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞のＨＥ染色同定
下記実施例で使用された試薬消耗品についての説明：
ＨＥ染色キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｇ１１２０）；
カチオン脱落防止ガラススライド（北京中杉金橋生物科技有限公司）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試剤公司、分析グレード）；
ニュートラルバルサム（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
１、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた懸濁結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞を１０４／ｍＬの濃度の細胞懸濁液に調製し、カチオン脱落防止ガラススライドに１０μＬを滴下し、自然に乾燥させた。
２、風乾した細胞に、４℃で予冷した５０μＬのメタノール／アセトン混合物（体積比１：１）を注意深く滴下してから、ガラススライドを４℃の冷蔵庫に入れて１０分間固定させた。
３、細胞が固定されたガラススライドを取りだして、室温で自然に乾燥させた。
４、ガラススライドを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
５、ガラススライド上の水分が少し乾いたら、ヘマトキシリン染色液１００μＬを加えて１分間染色した。
６、ヘマトキシリン染色液を吸い取って、ガラススライドを２００μＬの水道水で３回洗浄した。
７、分化液１００μＬを滴下して１分間分化した。
８、分化液を吸い取って、ガラススライドを水道水で２回洗浄してから、蒸留水で１回洗浄した。
９、ガラススライドの表面の水分を吸い取って、エオシン染色液２００μＬを滴下して４０秒間染色した。
１０、エオシン染色液を吸い取って、順に７５％、８０％、９０％、１００％エタノールで２０秒、２０秒、４０秒、４０秒すすいで脱水した。
１１、エタノールが乾いた後、キシレン５０μＬを滴下して細胞に透過化処理をした。
１２、キシレンが完全に乾いた後、ニュートラルバルサムを一滴加え、切片をカバーガラスで封入し、顕微鏡で観察して写真を撮った。
図８は、インビトロ培養で得られた結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞のＨＥ染色効果を示す図である。この図から見えるように、これらの細胞は一般に、核細胞質比が高く、核が深く染色され、核内にクロマチンが凝集し、多核で、細胞サイズが不均一であるなど、癌細胞の特徴を持っている。
下記実施例で使用された試薬消耗品についての説明：
ＨＥ染色キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｇ１１２０）；
カチオン脱落防止ガラススライド（北京中杉金橋生物科技有限公司）；
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試剤公司、分析グレード）；
ニュートラルバルサム（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｌｉ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
１、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた懸濁結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞を１０４／ｍＬの濃度の細胞懸濁液に調製し、カチオン脱落防止ガラススライドに１０μＬを滴下し、自然に乾燥させた。
２、風乾した細胞に、４℃で予冷した５０μＬのメタノール／アセトン混合物（体積比１：１）を注意深く滴下してから、ガラススライドを４℃の冷蔵庫に入れて１０分間固定させた。
３、細胞が固定されたガラススライドを取りだして、室温で自然に乾燥させた。
４、ガラススライドを２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。
５、ガラススライド上の水分が少し乾いたら、ヘマトキシリン染色液１００μＬを加えて１分間染色した。
６、ヘマトキシリン染色液を吸い取って、ガラススライドを２００μＬの水道水で３回洗浄した。
７、分化液１００μＬを滴下して１分間分化した。
８、分化液を吸い取って、ガラススライドを水道水で２回洗浄してから、蒸留水で１回洗浄した。
９、ガラススライドの表面の水分を吸い取って、エオシン染色液２００μＬを滴下して４０秒間染色した。
１０、エオシン染色液を吸い取って、順に７５％、８０％、９０％、１００％エタノールで２０秒、２０秒、４０秒、４０秒すすいで脱水した。
１１、エタノールが乾いた後、キシレン５０μＬを滴下して細胞に透過化処理をした。
１２、キシレンが完全に乾いた後、ニュートラルバルサムを一滴加え、切片をカバーガラスで封入し、顕微鏡で観察して写真を撮った。
図８は、インビトロ培養で得られた結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞のＨＥ染色効果を示す図である。この図から見えるように、これらの細胞は一般に、核細胞質比が高く、核が深く染色され、核内にクロマチンが凝集し、多核で、細胞サイズが不均一であるなど、癌細胞の特徴を持っている。
【0121】
実施例２５：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の免疫蛍光染色同定
下記実施例で使用された試薬についての説明：
パラホルムアルデヒド（北京化学試剤公司、分析グレード）、パラホルムアルデヒド粉末を超純水に溶解して４％のパラホルムアルデヒド溶液を調製した；
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試剤公司、分析グレード）；
過酸化水素（北京化学試剤公司、３５％）；
メタノール、ジメチルスルホキシド、および３５％過酸化水素を４：４：１の比率で混合して丹氏すすぎ液を調製した；
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ１９３３）、ウシ血清アルブミンをＰＢＳ溶液に溶解して３％のＢＳＡ溶液を調製した；
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１７１３９）；
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ、＃４４０８）；
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｃ００２１）；
次のステップに従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞の塊を免疫蛍光染色し、一次抗体はＣＫ８＋ＣＫ１８であり、上皮由来の細胞をキャラクタライゼーションした。
１、培養皿の中の腹水由来の初代腫瘍細胞塊を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで再懸濁し、４℃で一晩して固定させた。
２、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを予冷したメタノール溶液で再懸濁し、氷上に１時間置いた。
３、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを丹氏すすぎ液で再懸濁し、室温で２時間置いた。
４、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、ＰＢＳで希釈した７５％、５０％、２５％のメタノール溶液で順に細胞を洗浄し、毎回１０分間洗浄した。
５、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを３％ＢＳＡ溶液で懸濁し、室温で２時間ブロックした。
６、一次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：５００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液で再懸濁し、一次抗体を４℃で一晩保持した。
７、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
８、二次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：２０００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液で再懸濁し、二次抗体を室温で２時間保持した。
９、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
１０、１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を１／１００の体積比で加え、室温で２０分間染色した。
１１、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で２回、毎回１０分間洗浄した。レーザー共焦点顕微鏡を使用して細胞塊の染色状況を観察した。
図９は、インビトロで培養された結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞の塊の免疫蛍光染色効果を示す図である。この図から見えるように、細胞塊を構成する細胞はすべてＣＫ８／ＣＫ１８陽性であり、上皮由来である。これは、本方法で培養した腫瘍細胞が純度の高いものであることを実証した。２０の結腸直腸癌腹水初代培養物について免疫蛍光染色によって同定して統計した結果、本方法によって得られた結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞における腫瘍細胞の割合が７２％～９１％に達したことは示されている（表３５）。
下記実施例で使用された試薬についての説明：
パラホルムアルデヒド（北京化学試剤公司、分析グレード）、パラホルムアルデヒド粉末を超純水に溶解して４％のパラホルムアルデヒド溶液を調製した；
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試剤公司、分析グレード）；
過酸化水素（北京化学試剤公司、３５％）；
メタノール、ジメチルスルホキシド、および３５％過酸化水素を４：４：１の比率で混合して丹氏すすぎ液を調製した；
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ１９３３）、ウシ血清アルブミンをＰＢＳ溶液に溶解して３％のＢＳＡ溶液を調製した；
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１７１３９）；
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ、＃４４０８）；
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、＃Ｃ００２１）；
次のステップに従って、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）で培養して得られた結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞の塊を免疫蛍光染色し、一次抗体はＣＫ８＋ＣＫ１８であり、上皮由来の細胞をキャラクタライゼーションした。
１、培養皿の中の腹水由来の初代腫瘍細胞塊を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞ペレットを４％パラホルムアルデヒドで再懸濁し、４℃で一晩して固定させた。
２、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを予冷したメタノール溶液で再懸濁し、氷上に１時間置いた。
３、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを丹氏すすぎ液で再懸濁し、室温で２時間置いた。
４、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、ＰＢＳで希釈した７５％、５０％、２５％のメタノール溶液で順に細胞を洗浄し、毎回１０分間洗浄した。
５、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットを３％ＢＳＡ溶液で懸濁し、室温で２時間ブロックした。
６、一次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：５００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液で再懸濁し、一次抗体を４℃で一晩保持した。
７、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
８、二次抗体を３％ＢＳＡ溶液で１：２０００の比率で希釈し、細胞ペレットを抗体希釈液で再懸濁し、二次抗体を室温で２時間保持した。
９、８００ｇで遠心分離して上澄みを捨て、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で５回、毎回２０分間洗浄した。
１０、１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を１／１００の体積比で加え、室温で２０分間染色した。
１１、細胞ペレットをＰＢＳ溶液で２回、毎回１０分間洗浄した。レーザー共焦点顕微鏡を使用して細胞塊の染色状況を観察した。
図９は、インビトロで培養された結腸直腸癌腹水由来初代腫瘍細胞の塊の免疫蛍光染色効果を示す図である。この図から見えるように、細胞塊を構成する細胞はすべてＣＫ８／ＣＫ１８陽性であり、上皮由来である。これは、本方法で培養した腫瘍細胞が純度の高いものであることを実証した。２０の結腸直腸癌腹水初代培養物について免疫蛍光染色によって同定して統計した結果、本方法によって得られた結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞における腫瘍細胞の割合が７２％～９１％に達したことは示されている（表３５）。
【0122】
実施例２６：結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞培養物及び原発腫瘍組織
下記実施例で言及されたＤＮＡ抽出フローは、天根血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたライブラリー構築フローは、ＮＥＢ ＤＮＡシーケンシングライブラリー構築キット（Ｅ７６４５）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたハイスループットシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンシングプラットフォームを指す。
１、結腸直腸癌腹水サンプルを取得し、インビトロ培養操作を行う前に、まず、結腸直腸癌腹水サンプル２０ｍＬを取って遠心分離し、腹水細胞ペレットを得て、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）を行い、シーケンシング深度は３０Ｘであり、残りの結腸直腸癌腹水サンプルを結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞のインビトロ培養に使用した（具体的な方法について、前述の実施例を参照）。
２、結腸直腸癌腹水サンプルの処理後、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）を使用して一定期間培養した後、直径８０μｍ以上の細胞塊を形成したものをＰ０代細胞として記録し、その後は継代の回数に応じて順にＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとして記録した。結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞培養物のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５代からそれぞれ１０６の細胞を取りだし、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）に使用し、シーケンシング深度は３０Ｘであった。
３、各グループのシーケンシング結果をコピー数変動分析（ＣＮＶ）して、結腸直腸癌腹水中の癌細胞と各代の結腸直腸癌腹水初代細胞培養物との間のコピー数変動を比較した。図１０に示すように、各代の結腸直腸癌腹水初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）と結腸直腸癌腹水中の癌細胞のコピー数変動状況が非常に一致している。よって、本方法で得られた結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞は、患者の腹水に存在する癌細胞の真の状況を表すことができる。
下記実施例で言及されたＤＮＡ抽出フローは、天根血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたライブラリー構築フローは、ＮＥＢ ＤＮＡシーケンシングライブラリー構築キット（Ｅ７６４５）を使用して行われた。
下記実施例で言及されたハイスループットシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンシングプラットフォームを指す。
１、結腸直腸癌腹水サンプルを取得し、インビトロ培養操作を行う前に、まず、結腸直腸癌腹水サンプル２０ｍＬを取って遠心分離し、腹水細胞ペレットを得て、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）を行い、シーケンシング深度は３０Ｘであり、残りの結腸直腸癌腹水サンプルを結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞のインビトロ培養に使用した（具体的な方法について、前述の実施例を参照）。
２、結腸直腸癌腹水サンプルの処理後、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９、その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が１μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が１０μＭである）を使用して一定期間培養した後、直径８０μｍ以上の細胞塊を形成したものをＰ０代細胞として記録し、その後は継代の回数に応じて順にＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとして記録した。結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞培養物のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５代からそれぞれ１０６の細胞を取りだし、ＤＮＡ抽出、ライブラリー構築、および全ゲノムハイスループットシーケンシング（ＷＧＳ）に使用し、シーケンシング深度は３０Ｘであった。
３、各グループのシーケンシング結果をコピー数変動分析（ＣＮＶ）して、結腸直腸癌腹水中の癌細胞と各代の結腸直腸癌腹水初代細胞培養物との間のコピー数変動を比較した。図１０に示すように、各代の結腸直腸癌腹水初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）と結腸直腸癌腹水中の癌細胞のコピー数変動状況が非常に一致している。よって、本方法で得られた結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞は、患者の腹水に存在する癌細胞の真の状況を表すことができる。
【0123】
実施例２７：異なる初代細胞培地での結腸直腸癌腹水由来の初代腫瘍細胞の培養成功率の比較
本実施例では、培地の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の初代細胞培地について表３６を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表９を参照できる（その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が４０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が３００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１５０ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が０．５μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が５μＭである）。
初代細胞培地を調製した後、０．２２μＭシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）でろ過して滅菌し、４℃で２週間保存できる。
４つの初代細胞培地スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌腹水サンプルを処理し、実施例１８、１９、２０に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養成功率を統計した結果を表３７に示す：
以上から分かるように、初代細胞培地は、結腸直腸癌腹水初代細胞の培養成功率に大きな影響を与え、本発明で使用した結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞培地（表９）は、結腸直腸癌腹水サンプルにおける癌細胞の増殖を最大限に刺激することができ、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養成功率を高めることができる。
本実施例では、培地の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の初代細胞培地について表３６を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表９を参照できる（その中で、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が４０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が３００ｎｇ／ｍＬであり、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１５０ｎｇ／ｍＬであり、ＳＢ２０２１９０の最終濃度が１０μＭであり、Ａ８３－０１の最終濃度が０．５μＭであり、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が１ｍＭであり、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅの最終濃度が１０ｍＭであり、コルチゾールの最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであり、Ｙ－２７６３２の最終濃度が５μＭである）。
４つの初代細胞培地スキームを使用して、それぞれ２０の結腸直腸癌腹水サンプルを処理し、実施例１８、１９、２０に記載の方法に従ってサンプル処理および培養操作を行った。１０日間培養した後、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養成功率を統計した結果を表３７に示す：
【0124】
実施例２８：異なる細胞消化液での結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の継代成功率の比較
本実施例では、細胞消化液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代細胞継代の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の細胞消化液について表３８を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表７を参照できる。
細胞消化液は、使用する直前に調製した。
培養に成功した結腸直腸癌腹水サンプルを２０例選択し、それぞれ上記の４つの細胞消化液を使用して、培養された結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞について実施例２１に記載の方法に従って連続継代操作を行った。癌細胞が増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成すると継代し（１０回以下）、最大継代回数を記録した。統計した結果を表３９に示す：
以上から分かるように、細胞消化液の処方は、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の継代成功率に大きな影響を与え、本発明で使用した細胞消化液（表７）は、細胞塊中の癌細胞を温和に解離し、サンプルを連続的に継代して結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の活性を維持することができる。
本実施例では、細胞消化液の処方のみが異なる以外、すべてのサンプルの初代細胞継代の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。テストされた各種の細胞消化液について表３８を参照できる。スキームＤは、本発明で使用される処方であり、詳細について、表７を参照できる。
培養に成功した結腸直腸癌腹水サンプルを２０例選択し、それぞれ上記の４つの細胞消化液を使用して、培養された結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞について実施例２１に記載の方法に従って連続継代操作を行った。癌細胞が増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成すると継代し（１０回以下）、最大継代回数を記録した。統計した結果を表３９に示す：
【0125】
実施例２９：異なる材料の細胞培養消耗品を用いた結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養
本実施例では、細胞培養消耗品の材料（未修飾）のみが異なる（表４０）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。
注：ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ、ＰＳと省略）、ポリカーボネート（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＰＣと省略）、ポリメチルメタクリレート（Ｐｏｌｙ－ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＭＭＡと省略）、ＣＯＣ樹脂、シクロオレフィンポリマー（Ｃｙｃｌｏ Ｏｌｅｆｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ、ＣＯＰと省略）、低付着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ、ＬＡＳと省略）。
表４０から分かるように、異なる材料の培養消耗品は、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養成功率に一定の影響を与え、低付着表面（ＬＡＳ）の培養成功率が最も高い。
本実施例では、細胞培養消耗品の材料（未修飾）のみが異なる（表４０）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じである（上記記載を参照）。
表４０から分かるように、異なる材料の培養消耗品は、結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養成功率に一定の影響を与え、低付着表面（ＬＡＳ）の培養成功率が最も高い。
【0126】
実施例３０：ＣＹＴＯＰ修飾した細胞培養消耗品を使用した結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞の培養
本実施例では、細胞培養消耗品の材料のみが異なる（表４１）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じであり（上記記載を参照）、ＣＹＴＯＰの修飾方法も完全に同じである。
ＣＹＴＯＰ修飾方法は次の通りである。まず、パワー２０Ｗ、エッチング時間が３分間であるエッチング条件で、細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行う。そして、培養皿または培養プレートの表面を適切な量（９６ウェルプレートを例にすると、各ウェルで２０μＬ、適切な量とは、培養皿の底部を完全に覆うことを意味する）の１％ＣＹＴＯＰ溶液（処方について表４２を参照）で覆い、ＣＹＴＯＰ溶液が完全に乾燥してから使用することができる。
表４１から見えるように、ＣＹＴＯＰ修飾は、様々な材料の培養成功率を効果的に高めることができる。
１％ＣＹＴＯＰ溶液を調製した後、室温で長期間保存できる。
本実施例では、細胞培養消耗品の材料のみが異なる（表４１）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは完全に同じであり（上記記載を参照）、ＣＹＴＯＰの修飾方法も完全に同じである。
ＣＹＴＯＰ修飾方法は次の通りである。まず、パワー２０Ｗ、エッチング時間が３分間であるエッチング条件で、細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行う。そして、培養皿または培養プレートの表面を適切な量（９６ウェルプレートを例にすると、各ウェルで２０μＬ、適切な量とは、培養皿の底部を完全に覆うことを意味する）の１％ＣＹＴＯＰ溶液（処方について表４２を参照）で覆い、ＣＹＴＯＰ溶液が完全に乾燥してから使用することができる。
【0127】
実施例３１：結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞を用いた薬剤感受性試験
本実施例で使用された化学療法薬剤の５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、およびイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）はいずれもＳｅｌｌｅｃｋ製品である。
本実施例で言及されたＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ製品である。
本発明で培養して得られた結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞をインビトロ薬剤感受性試験に使用した：標準サイズの９６ウェル低吸着細胞培養プレートを使用し、１０５／ウェルの密度で初代細胞を播種し、各薬剤に５つの薬剤濃度勾配を設置し、ｎ＝３である。薬剤を添加した後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間インキュベーションした。薬剤作用が終わった後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率検出キットを使用して、各ウェルの細胞生存率を検出した。実験の結果を図１１に示す。この結果は、本方法によって得られた結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞が、インビトロの薬剤感受性検出に使用できることを示している。
本実施例で使用された化学療法薬剤の５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、およびイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）はいずれもＳｅｌｌｅｃｋ製品である。
本実施例で言及されたＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ製品である。
本発明で培養して得られた結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞をインビトロ薬剤感受性試験に使用した：標準サイズの９６ウェル低吸着細胞培養プレートを使用し、１０５／ウェルの密度で初代細胞を播種し、各薬剤に５つの薬剤濃度勾配を設置し、ｎ＝３である。薬剤を添加した後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間インキュベーションした。薬剤作用が終わった後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率検出キットを使用して、各ウェルの細胞生存率を検出した。実験の結果を図１１に示す。この結果は、本方法によって得られた結腸直腸癌腹水初代腫瘍細胞が、インビトロの薬剤感受性検出に使用できることを示している。
【0128】
実施例３２：マイクロウェルプレートチップの加工
本実施例では、注入成形の加工方法が使用され、ＰＭＭＡ材料（または、ＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの材料）を加工して、本発明の結腸直腸癌初代細胞を培養するためのマイクロウェルプレートチップを得た。このチップは、結腸直腸癌初代細胞の培養およびインビトロの薬剤感受性検出実験に使用できる。マイクロウェルプレートチップの設計図を図１２に示す。
実際の使用過程では、具体的には、ＰＭＭＡ材料（または、ＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの材料）を使用して、図１２の設計図に示されるマイクロウェルプレートチップの構造を作製し、上記のＣＹＴＯＰ修飾方法（実施例３０を参照）によってその表面をＣＹＴＯＰ修飾すると、ここに記載されている結腸直腸癌初代細胞の培養に使用可能なマイクロウェルプレートチップが得られる。
本実施例では、注入成形の加工方法が使用され、ＰＭＭＡ材料（または、ＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの材料）を加工して、本発明の結腸直腸癌初代細胞を培養するためのマイクロウェルプレートチップを得た。このチップは、結腸直腸癌初代細胞の培養およびインビトロの薬剤感受性検出実験に使用できる。マイクロウェルプレートチップの設計図を図１２に示す。
実際の使用過程では、具体的には、ＰＭＭＡ材料（または、ＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの材料）を使用して、図１２の設計図に示されるマイクロウェルプレートチップの構造を作製し、上記のＣＹＴＯＰ修飾方法（実施例３０を参照）によってその表面をＣＹＴＯＰ修飾すると、ここに記載されている結腸直腸癌初代細胞の培養に使用可能なマイクロウェルプレートチップが得られる。
【0129】
実施例３３：結腸鏡検査穿刺微量サンプルを使用した結腸直腸癌初代腫瘍細胞の培養
本実施例では、サンプルの由来のみが異なる（表４１）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養方法と完全に同じであり（上記記載を参照）、２つの結腸鏡検査サンプルに統一された（表４３）。
表４３から分かるように、結腸鏡検査から得られた微量のサンプルでも、依然として高い成功率で結腸直腸癌初代細胞の培養に使用することができる。
本実施例では、サンプルの由来のみが異なる（表４１）以外、すべてのサンプルの初代培養の操作方法およびフローは、結腸直腸癌固形腫瘍初代細胞の培養方法と完全に同じであり（上記記載を参照）、２つの結腸鏡検査サンプルに統一された（表４３）。
【産業上の利用可能性】
【0130】
本発明は、新鮮な結腸直腸癌固形腫瘍組織または結腸直腸癌腹水から結腸直腸癌初代腫瘍細胞を抽出および培養する方法、並びにキットを提供する。この方法は、以下の利点を有する：結腸直腸癌固形腫瘍組織の場合、組織サンプルの用量が少なく、約２０ｍｇの結腸直腸癌手術サンプルのみが必要である。結腸直腸癌腹水の場合、サンプルが容易に入手でき、結腸直腸癌患者の通常の治療中に排出される腹水を最大限に利用でき、患者には追加の外傷や痛みを与えることはない。サンプルの用量が少なく、約５０ｍＬの結腸直腸癌腹水サンプルのみが必要である。サンプルを収集した後、すぐに処理する必要はなく、サンプルを体から採取してから最大７２時間以内に本方法に従って処理すれば、９０％以上の細胞生存率が保証できる。培養サイクルが短く、１０７レベルの結腸直腸癌初代腫瘍細胞を得るには３～１０日間しか掛からない。培養安定性が高く、本方法を用いて適格な結腸直腸癌固形腫瘍および腹水標本に対してインビトロ培養をした成功率は７０％～８０％と高い。細胞純度が高く、本方法によって得られた結腸直腸癌初代細胞培養物における癌細胞の割合は７０％～９５％にも達することができ、雑細胞の干渉は少ない。本発明の方法で得られた結腸直腸癌初代細胞培養物は、様々な細胞レベルのインビトロ実験、次世代シーケンシング、動物モデルの構築、細胞株の構築などに使用することができる。この培養方法は、結腸直腸癌の研究および臨床診断と治療の分野で幅広い応用の見通しがある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】