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特許7507774骨障害治療のためのＧＩＰ及びＧＬＰ－２受容体を標的とするペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-20
(45)【発行日】2024-06-28
(54)【発明の名称】骨障害治療のためのＧＩＰ及びＧＬＰ－２受容体を標的とするペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240621BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240621BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20240621BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20240621BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240621BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240621BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240621BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240621BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240621BHJP
A61P 5/18 20060101ALI20240621BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240621BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
A61K38/16
A61P19/00
A61P19/10
A61P19/08
A61P35/00
A61P1/02
A61P21/00
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P5/18
A61P3/00
A61L27/54
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021549182
(86)(22)【出願日】2020-02-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-14
(86)【国際出願番号】 EP2020054604
(87)【国際公開番号】W WO2020169792
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2023-01-20
(31)【優先権主張番号】19305210.7
(32)【優先日】2019-02-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】512259891
【氏名又は名称】ユニベルシテ アンジェ
(73)【特許権者】
【識別番号】521367363
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ユニベルシテール ダンジェ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】ギヨーム マビロー
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドラ ミエチコウスカ
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－１６９１７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５０８４１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５２６５５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０６９４４２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／００
Ａ６１Ｋ ３８／１６
Ａ６１Ｌ ２７／５４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号４）のＧＬ－０００７；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤＧＡＡＤＤＤＤＤＤ（配列番号５）のＧＬ－０００１－タグ；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号６）のＧＬ－０００２；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＥＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号７）のＧＬ－０００３；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号８）のＧＬ－０００４；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＬＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号９）のＧＬ－０００５；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号１０）のＧＬ－０００６；
－配列ＨＧＥＧＳＦＴＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号１１）のＧＬ－０００８；及び
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ ２ （配列番号１２）のＧＬ－０００９
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド。
【請求項2】
Ｃ末端リシンがアミド化される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
Ｃ末端にペプチドタグをさらに含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項4】
ペプチドが、ペプチド：－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号４）のＧＬ－０００７；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤＧＡＡＤＤＤＤＤＤ（配列番号５）のＧＬ－０００１－タグ；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号６）のＧＬ－０００２；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＥＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号７）のＧＬ－０００３；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号８）のＧＬ－０００４；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＬＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号９）のＧＬ－０００５；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１０）のＧＬ－０００６；
－配列ＨＧＥＧＳＦＴＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１１）のＧＬ－０００８；及び
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１２）のＧＬ－０００９
からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド
【請求項5】
配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のペプチドＧＬ－０００１である、請求項４記載のペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に定義されるペプチドを含む医薬組成物。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか一項に定義されるペプチドを含む移植可能な医療機器。
【請求項8】
対象の骨障害を治療及び／又は予防するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項9】
骨障害が、原発性又は二次性の骨粗鬆症（閉経後、グルココルチコイド誘発性、固定化誘発性及び老人性骨粗鬆症を含む）、骨減少症、糖尿病性骨疾患、骨軟化症及びくる病、骨の骨ジストロフィー、骨のパジェット病、悪性腫瘍の高カルシウム血症、骨転移による骨減少症、骨肉腫、ユーイング腫瘍、骨軟骨腫、癌治療によって引き起こされる骨異常、骨形成不全症、骨髄炎、軟骨無形成症、無血管性骨壊死、骨大理石症、骨化性筋炎、歯周病、副甲状腺機能亢進症、関節リウマチにおける関節周囲びらん、強直性脊椎炎における骨びらん、及び神経性無食欲症における骨減少症から選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項10】
骨障害が骨形成不全症である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項11】
骨障害が、代謝障害又はホルモン障害の骨における発現である、請求項８に記載のペプチド。
【請求項12】
対象の骨障害を治療及び／又は予防するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項13】
骨障害が、原発性又は二次性の骨粗鬆症（閉経後、グルココルチコイド誘発性、固定化誘発性及び老人性骨粗鬆症を含む）、骨減少症、糖尿病性骨疾患、骨軟化症及びくる病、骨の骨ジストロフィー、骨のパジェット病、悪性腫瘍の高カルシウム血症、骨転移による骨減少症、骨肉腫、ユーイング腫瘍、骨軟骨腫、癌治療によって引き起こされる骨異常、骨形成不全症、骨髄炎、軟骨無形成症、無血管性骨壊死、骨大理石症、骨化性筋炎、歯周病、副甲状腺機能亢進症、関節リウマチにおける関節周囲びらん、強直性脊椎炎における骨びらん、及び神経性無食欲症における骨減少症から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
骨障害が骨形成不全症である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
骨障害が、代謝障害又はホルモン障害の骨における発現である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項16】
請求項１～５のいずれか一項に定義されるペプチドを含む骨充填生体材料。
【請求項17】
骨再生に使用する、請求項１６に記載の骨充填材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨障害の治療に関する。
【背景技術】
【0002】
今日、骨脆弱性は重要な公衆衛生問題である。実際、人口の高齢化に伴い、骨折数は絶えず増加しており（２０１３年にフランスで３７万７０００件の骨折）、社会経済的に影響がある。
【0003】
骨組織は、機械的ストレス（重力、運動など）に適応するだけでなく、代謝ストレス（カルシウム、リン酸、タンパク質などの放出又は貯蔵）にも適応するために永久的にリモデリングされる組織であり、骨形成と骨吸収の間のバランスのとれたシステムを表す。骨のリモデリングは、リン酸カルシウム代謝ホルモン、機械的負荷、又は局所因子などのいくつかの因子に依存する。
【0004】
骨脆弱性は、骨形成及び骨吸収活性の不均衡、骨リモデリング中、又は骨細胞活性の害時に起こる。これにより、骨組織の量が減少したり、骨基質の質が変化したり、骨基質の質が変化したりし、骨の脆弱性が増加し、骨折のリスクが高くなる。
【0005】
骨脆弱性を治療するためのいくつかの治療溶液が存在するか（ビタミンＤ、ビスフォスフォネート、抗ＲＡＮＫＬ、組換えカルシトニン、組換えパラソルモンの間欠注射、エストロゲン受容体のモジュレーター）、又は市販されようとしている（抗カテプシンＫ、抗スクレロスチン、ＰＴＨｒＰ類似体）。しかしながら、これらの分子は使用制限を示し、骨脆弱性に苦しむ全ての患者に投与することはできない。さらに、これらの分子のいくつかは副作用（下顎骨壊死、大腿骨の非定型骨折、癌のリスク）を有し、患者の厳格なモニタリングと定期的なフォローアップを必要とする。さらに、これらの分子の効率は依然として中等度であり、それらの使用にもかかわらず、骨脆弱性骨折のわずか５０％が進行中の治療の場合に予防されると推定され、新しい治療経路を見出す必要性が確認された。
【0006】
本発明は、この必要性を満たす。
【0007】
最近、腸内の食器の侵入後に放出される腸内ホルモンが骨リモデリングに作用することが示された。
【0008】
消化管から分泌される多量の生理活性ペプチドの中で、インクレチンと呼ばれる一群のペプチドがエネルギー代謝の重要な調節因子として浮上してきた。インクレチンは、グルコースに応答して腸から分泌され、グルコース依存的にインスリン放出を刺激するホルモンである。インスリン親和性作用を有するいくつかのホルモンは腸から分泌されるが、グルコース依存性インスリン親和性ポリペプチド（ＧＩＰ）及びグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、これまでに同定された唯一の２つの生理学的インクレチンである。最近、ノックアウト前臨床動物モデルに基づいて、ＧＩＰとＧＬＰ－１の両方が糖尿病誘発骨脆弱性に有益である可能性が強調されている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、特別に設計されたコンセンサス配列を有するペプチドが、それぞれのＧＩＰ及びＧＬＰ－２天然ペプチドと同様にグルコース依存性インスリン刺激性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体及びグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）受容体の両方に結合し、活性化し、それによって骨リモデリングを制御することができるという、本発明者らによる予想外の発見から生じる。特に、本発明者らは、この二重標的ペプチドが、各天然ペプチドよりも高いレベルで骨芽細胞によって産生されるコラーゲンマトリックスの酵素的架橋を増加させ、生成された破骨細胞の数を、各天然ペプチドよりも重要な方法で減少させることを示す。
【0010】
したがって、本発明は、配列番号１：
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ（配列番号１）
のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離されたペプチドに関し、ここで、Ｘ７は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１０は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１２は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１３は任意のアミノ酸残基である。
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ（配列番号１）
のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離されたペプチドに関し、ここで、Ｘ７は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１０は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１２は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１３は任意のアミノ酸残基である。
【0011】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む医薬組成物に関する。
【0012】
本発明は、さらに、特に本発明のペプチドでコーティングされた、移植可能な医療装置に関する。
【0013】
本発明の別の目的は、移植可能な医療機器をコーティングするための本発明のペプチドのインビトロでの使用である。
【0014】
本発明のさらなる目的は、対象における骨障害を治療及び／又は予防する方法で使用するための本発明のペプチド又は本発明の医薬組成物に関する。
【0015】
特定の実施態様において、前記骨障害は、骨における代謝性又はホルモン性障害の発現である。
【0016】
本発明はまた、本発明のペプチドを含む骨充填生体材料に関する。
【0017】
本発明は、骨再生のための使用のために本発明のペプチドを含む骨充填生体材料に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１：二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の設計のためのインシリコ戦略。最終目標は、配列とヒトＧＩＰ１－３０ｏｒヒトＧＬＰ－２との間に少なくとも５０％の相同性を有するコンセンサス配列を得ることであった。ステップ３における小文字は、ｎ：負に荷電したアミノ酸、ｐ：極性アミノ酸及びａ：脂肪族アミノ酸を表す。
【図2】図２～３：ＧＩＰ及びＧＬＰ－２の関節投与がコラーゲン成熟度及び破骨細胞数に及ぼす影響。図２：溶媒（ＣＴＲＬ）、又は２００ｎＭ［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２（ＧＩＰ）、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２（ＧＬＰ－２）、又は両方の分子（ＧＩＰ＋ＧＬＰ－２）の存在下で、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１培養物中のコラーゲン成熟度を評価した。＊：ｐ＜０．０５、及び＊＊＊：ｐ＜０．００１対溶媒処理培養物；＄＄：ｐ＜０．０１対［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２－処理培養物；及び＃：ｐ＜０．０５対［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２処理培養物。
【図3】図３：ウェルあたりの新たに生成された破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ／ウェル）が、健常人から分離され、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト可溶性ＲＡＮＫＬ（ＭＲ）の存在下で培養されたヒト末梢血単核細胞において評価した。このパラメータはまた、１ｎＭ［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２（ＧＩＰ）、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２（ＧＬＰ－２）又は両方の分子（ＧＩＰ＋ＧＬＰ－２）を補充したＭＲ処理培養で評価した。＊＊＊：ｐ＜０．００１対ＭＲ；＄：ｐ＜０．０５、及び＄＄＄：ｐ＜０．００１対［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２－処理培養物、並びに＃＃＃：ｐ＜０．００１対［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２処理培養物。
【図4】図４：骨芽細胞死に対するＧＬ－０００１の作用。マウスＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、生理食塩水、種々の濃度のＧＬ－０００１又は１０－６Ｍロシグリタゾンの存在下で２４時間培養した。＊ｐ＜０．０５対生理食塩水処理培養。
【図8】図８：ＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７が体重に及ぼす影響。卵巣摘出動物の体重を、賦形剤（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日ＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇ／日ゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）のいずれかで処置した場合、８週間の治療終了時に提示する。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図9】図９：皮質骨強度に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の影響。卵巣摘出動物において、ビヒクル（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）又は１００μｇ／ｋｇゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）のいずれかで処置した動物において、３点屈曲試験により皮質骨強度を評価した。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図10】図１０：皮質骨微細構造に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の効果。皮質骨マイクロアーキテクチャを、遠位大腿骨成長プレート（３Ｄモデル上の白色長方形）の４ｍｍ上のマイクロコンピュータＸ線断層撮影により評価した。動物を溶媒（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）で処理した。研究した特徴は、Ｔｔ．Ａｒ：全断面積、Ｃｔ．Ｔｈ：皮質厚さ、Ｍａ．Ａｒ：髄質面積、Ｊ：慣性極性モーメント、Ｃｔ．Ａｒ：皮質骨面積、Ｃｔ．Ａｒ／Ｔｔ．Ａｔ：皮質面積分率、Ｉａｐ：前後軸に関する慣性断面モーメント、Ｉｍｌ：中外側軸に関する慣性断面モーメントであった。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図11】図１１：皮質骨微細構造に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の効果。皮質骨マイクロアーキテクチャを、遠位大腿骨成長プレート（３Ｄモデル上の白色長方形）の４ｍｍ上のマイクロコンピュータＸ線断層撮影により評価した。動物を溶媒（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）で処理した。研究した特徴は、Ｔｔ．Ａｒ：全断面積、Ｃｔ．Ｔｈ：皮質厚さ、Ｍａ．Ａｒ：髄質面積、Ｊ：慣性極性モーメント、Ｃｔ．Ａｒ：皮質骨面積、Ｃｔ．Ａｒ／Ｔｔ．Ａｔ：皮質面積分率、Ｉａｐ：前後軸に関する慣性断面モーメント、Ｉｍｌ：中外側軸に関する慣性断面モーメントであった。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図13】第５腰椎の椎体における骨梁微細構造を評価した。動物を溶媒（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）で処理した。検討した特徴は、ＢＶ／ＴＶ：骨体積分率、Ｔｂ．Ｎ：骨梁数、Ｔｂ．Ｔｈ：骨梁厚、Ｔｂ．Ｓｐ：骨梁分離であった。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図14】図１４：骨マトリックス組成に及ぼすＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の影響。組織材料特性を、大腿骨中央軸の後方四分円におけるフーリエ変換赤外イメージング（ＦＴＩＲＩ）により評価した。動物を溶媒（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）で処理した。ＣＣＬ：コラーゲン成熟度、ＸＳＴ：鉱物結晶度、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｉｚｅ：結晶サイズ指数、Ｐ／Ａ：リン酸塩／アミド比、Ｃ／Ｐ：炭酸塩／リン酸塩比及びＡｃＰ：リン酸塩含量。各パラメータの平均値と不均一性（幅）を表す。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図15】図１５：骨マトリックス組成に及ぼすＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の影響。組織材料特性を、大腿骨中央軸の後方四分円におけるフーリエ変換赤外イメージング（ＦＴＩＲＩ）により評価した。動物を溶媒（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１）、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５）、１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００）、又は１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）で処理した。ＣＣＬ：コラーゲン成熟度、ＸＳＴ：鉱物結晶度、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｉｚｅ：結晶サイズ指数、Ｐ／Ａ：リン酸塩／アミド比、Ｃ／Ｐ：炭酸塩／リン酸塩比及びＡｃＰ：リン酸塩含量。各パラメータの平均値と不均一性（幅）を表す。＊：ｐ＜０．０５及び＊＊：ｐ＜０．０１対ＯＶＸ＋Ｖｅｈ。
【図16】図１６～１８：ＧＩＰｒとＧＬＰ－２ｒの活性化。図１６：ＨＥＫ－２９３細胞を、ヒトＧＩＰｒをコードするプラスミドでトランスフェクトした。サイクリックＡＭＰの産生をＨ７４プローブを用いてＦＲＥＴにより記録した。ＦＲＥＴ比４７０／５３０ｎｍの増加は、より高いｃＡＭＰを示す。［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２、ＧＬ－０００１又はビヒクルを培養物に添加し、ｃＡＭＰのレベルを３０分後に記録した。＊＊＊：ｐ＜０．００１対溶媒；＃＃＃：ｐ＜０．００１対［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２。
【図17】図１７：ＨＥＫ－２９３細胞を、ヒトＧＬＰ－２ｒをコードするプラスミドでトランスフェクトした。サイクリックＡＭＰの産生をＨ７４プローブを用いてＦＲＥＴにより記録した。ＦＲＥＴ比４７０／５３０ｎｍの増加は、より高いｃＡＭＰを示す。［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２、ＧＬ－０００１又はビヒクルを培養物に添加し、ｃＡＭＰのレベルを３０分後に記録した。＊＊：ｐ＜０．０１及び＊＊＊：ｐ＜０．００１対溶媒；＄：ｐ＜０．０５及び＄：ｐ＜０．０１対［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２。
【発明を実施するための形態】
【0019】
定義
本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、天然ペプチド（タンパク質分解産物又は合成ペプチドのいずれか）を指し、さらに、ペプチド擬態物、例えばペプチドアナログであり、例えば、体内での間にペプチドをより安定にする改変、又はより免疫原性を有することができるペプチド及びセミペプトイドを指す。そのような修飾は、限定されるものではないが、環化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、アシル化、ペグ化、ペプチド結合修飾を含み、限定されるものではないが、ＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨ、主鎖修飾及び残基修飾を含む。ペプチド模倣化合物を調製する方法は、当該分野で周知であり、定量的薬物設計（CA. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)）に明記されている。
本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、天然ペプチド（タンパク質分解産物又は合成ペプチドのいずれか）を指し、さらに、ペプチド擬態物、例えばペプチドアナログであり、例えば、体内での間にペプチドをより安定にする改変、又はより免疫原性を有することができるペプチド及びセミペプトイドを指す。そのような修飾は、限定されるものではないが、環化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、アシル化、ペグ化、ペプチド結合修飾を含み、限定されるものではないが、ＣＨ２－ＮＨ、ＣＨ２－Ｓ、ＣＨ２－Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ２－Ｏ、ＣＨ２－ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ－ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＦ＝ＣＨ、主鎖修飾及び残基修飾を含む。ペプチド模倣化合物を調製する方法は、当該分野で周知であり、定量的薬物設計（CA. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)）に明記されている。
【0020】
本発明のペプチドは、好ましくは、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３１個のアミノ酸、少なくとも３２個のアミノ酸又は少なくとも３３個のアミノ酸、好ましくは５０個未満のアミノ酸からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、さらに、少なくとも３０、３１、３２又は３３アミノ酸に加えて、以下に定義されるペプチドタグを含む。
【0021】
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、２０の天然アミノ酸、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、及びバリン；ヒドロキシプロリン、ホスホセリン及びホスホスレオニンのような生体内で見出され得る翻訳後修飾を有するアミノ酸；ならびに２－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、又はバリン、又はロイシン及びオルニチンを含むがこれらに限定されない他の異常なアミノ酸を含むと理解される。さらに、用語「アミノ酸」は、両方のＤ－及びＬ－アミノ酸を含む。
【0022】
「非極性アミノ酸」とは、本明細書において、可変Ｒ－基が主として炭化水素からなるアミノ酸のクラスを意味する。非極性アミノ酸には、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びフェニルアラニンが含まれる。
【0023】
本明細書中で使用される場合、用語「単離されたペプチド」は、その合成方法にかかわらず、天然に存在するタンパク質配列から局所的に異なる任意のペプチドを指す。
【0024】
ペプチド
上述し、下記の実施例に示されるように、本発明者らは、この配列を有するペプチドが、それぞれのＧＩＰ及びＧＬＰ－２天然ペプチドと同様に、グルコース依存性インスリン親和性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体及びグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）受容体の両方に結合し、活性化することができるように、特にコンセンサスアミノ酸配列を設計した。
上述し、下記の実施例に示されるように、本発明者らは、この配列を有するペプチドが、それぞれのＧＩＰ及びＧＬＰ－２天然ペプチドと同様に、グルコース依存性インスリン親和性ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体及びグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ－２）受容体の両方に結合し、活性化することができるように、特にコンセンサスアミノ酸配列を設計した。
【0025】
従って、本発明は、配列番号１：
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ（配列番号１）
のコンセンサスアミノ酸配列を含むか又はそれからなる単離されたペプチドに関し、ここで、Ｘ７は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１０は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１２は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１３は任意のアミノ酸残基である。
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ（配列番号１）
のコンセンサスアミノ酸配列を含むか又はそれからなる単離されたペプチドに関し、ここで、Ｘ７は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１０は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１２は任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１３は任意のアミノ酸残基である。
【0026】
特定の実施形態では、Ｘ７は、グリシン、バリン、スレオニン及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくはグリシン、バリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0027】
別の特定の実施形態では、Ｘ１０は、メチオニン、ロイシン及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0028】
別の特定の実施形態では、Ｘ１２は、イソロイシン、バリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくはイソロイシン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0029】
別の特定の実施形態では、Ｘ１３は非極性アミノ酸、好ましくはアラニン、バリン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸であり、特にアラニン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0030】
特定の実施形態では、Ｘ７はグリシン、バリン、スレオニン及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０はメチオニン、ロイシン及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２はイソロイシン、バリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３は非極性アミノ酸である。
【0031】
別の特定の実施形態では、Ｘ７はグリシン、バリン、スレオニン及びセリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０はメチオニン、ロイシン及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２はイソロイシン、バリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３はアラニン、バリン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0032】
別の特定の実施形態では、Ｘ７はグリシン、バリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１０はメチオニン、ロイシン及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１２はイソロイシン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ１３はアラニン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0033】
好ましい態様において、本発明のペプチドのＣ末端リシンはアミド化される。
【0034】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、配列番号２：
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号２）
のコンセンサスアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ここで、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１２及びＸ１３は、上述の通りである。
ＨＧＥＧＳＦＸ７ＳＤＸ１０ＳＸ１２Ｘ１３ＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号２）
のコンセンサスアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、ここで、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１２及びＸ１３は、上述の通りである。
【0035】
特定の実施形態では、本発明のペプチドにおいて、Ｋ１６及び／又はＫ３０は、さらに修飾、典型的には翻訳後修飾を有する。より具体的な実施形態では、本発明のペプチドにおいて、Ｋ１６及び／又はＫ３０は、アシル化又はペグ化される。
【0036】
本発明によるペプチドは、さらに、そのＮ末端又はＣ末端、特にそのＣ末端にペプチドタグを含んでもよい。
【0037】
本発明では、種々の技術分野で認識されたペプチドタグのいずれかを使用することができる。例えば、適当なペプチドタグは、ＦＬＡＧペプチド、短いＦＬＡＧペプチド、ヒスチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ブドウ球菌タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールセチルトランスフェラーゼＳ－ペプチド（リボヌクレアーゼＡ、残基１～２０）、ミオシン重鎖、ＤｓｂＡ、ビオチンサブユニット、アビジン、ストレプトアビジン、Ｓｆｒｐ－タグ、ｃ－Ｍｙｃ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＣＫＳ、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ｌａｃリプレッサー、成長ホルモンのＮ－末端、マルトース結合タンパク質、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、カルロース結合ドメイン、ヘモリシンＡ、ＴφＬＥを含む。プロテインキナーゼ部位、ＢＡＩエピトープ、Ｂｔａｇ、ブルータングウイルスのＶＰ７領域、緑色蛍光タンパク質、又は任意の蛍光色素。
【0038】
ペプチドタグは、１つ以上の特異的プロテアーゼ切断部位を含むことができる。
【0039】
好ましい態様において、ペプチドタグは、配列ＧＡＤＤＤＤＤ（配列番号１３）からなるペプチドである。
【0040】
特定の実施形態において、本発明のペプチドは、下記のペプチドからなる群から選択される：
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号４）のＧＬ－０００７；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤＧＡＡＤＤＤＤＤＤ（配列番号５）のＧＬ－０００１－タグ；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号６）のＧＬ－０００２；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＥＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号７）のＧＬ－０００３；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号８）のＧＬ－０００４：
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＬＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号９のＧＬ－０００５；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１０）のＧＬ－０００６；
－配列ＨＧＥＧＳＦＴＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１１）のＧＬ－０００８；及び
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１２）のＧＬ－０００９。
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号４）のＧＬ－０００７；
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤＧＡＡＤＤＤＤＤＤ（配列番号５）のＧＬ－０００１－タグ；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号６）のＧＬ－０００２；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＥＭＳＩＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号７）のＧＬ－０００３；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＭＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号８）のＧＬ－０００４：
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＬＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号９のＧＬ－０００５；
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＶＶＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１０）のＧＬ－０００６；
－配列ＨＧＥＧＳＦＴＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１１）のＧＬ－０００８；及び
－配列ＨＧＥＧＳＦＶＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号１２）のＧＬ－０００９。
【0041】
好ましい態様において、本発明のペプチドは、以下のペプチド中からなる群から選択される：
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１及び
－ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号４）のＧＬ－０００７。
－配列ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のＧＬ－０００１及び
－ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＦＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫ－ＮＨ２（配列番号４）のＧＬ－０００７。
【0042】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＧＥＧＳＦＧＳＤＭＳＩＡＬＤＫＬＡＡＲＤＦＶＮＷＬＬＱＴＫＩＴＤ（配列番号３）のペプチドＧＬ－０００１である。
【0043】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、非修飾ペプチドと比較して、その安定性、特にインビボ、及び／又はその循環時間が増加するように修飾される。実施可能な修飾としては、上述の「ペプチド」の項で定義されたもの、例えば、ＰＥＧ化、アシル化、ビオチン化、アセチル化、ホルミル化、ユビキチン化、アミド化、酵素標識、又は放射標識が挙げられる。例えば、種々の程度のＰＥＧ化を用いてペプチドの半減期を変化させることができ、増加したＰＥＧ化は増加した半減期に対応する。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含むペプチド上の任意の位置で起こり得る。
【0044】
一実施形態では、本発明のペプチドは、ペプチドの送達に一般的に使用され、かつ短いペプチドのインビボ投与を容易にすることが知られている周知のペプチドであるＴＡＴ（トランス活性化転写活性化アクチベーター）ペプチドの添加によって修飾することができる。
【0045】
別の態様において、本発明のペプチドは、抗体のＦｃドメインの添加によって修飾され得る。抗体のＦｃドメインは、抗原結合よりもむしろ生物学的活性に関与する比較的定常な領域である。ポリペプチドの半減期を増加させるため、又は特定の受容体に結合する能力などの特定の生物学的機能を組み込むために、Ｆｃドメインを用いて種々の治療用ポリペプチドが作製されている。本発明のペプチドへのＦｃドメインの結合は、ペプチドの半減期を増加させる可能性が高い。Ｆｃドメインは、消化された、天然に存在する抗体の部分を含むことができ、又はそれは組換え抗体又はヒト化抗体に由来することができる。
【0046】
本発明のペプチドは、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２受容体の両方を活性化することができる。
【0047】
「ＧＩＰ」又は「グルコース依存性インスリン親和性ポリペプチド」とは、インクレチンのクラスに属し、インスリン分泌を刺激するホルモンのセクレチンファミリーの阻害ホルモンを意味する。これは、ヒトにおいてＧＩＰ遺伝子によりコードされ、生物学的に活性な４２－アミノ酸ペプチドとして循環する１５３－アミノ酸プロタンパク質に由来する。Ｋ細胞は、十二指腸の粘膜や消化管の空腸に存在する。
【0048】
「ＧＩＰ受容体」又は「ＧＩＰ－Ｒ」とは、本明細書において、ヒトにおいて、膵臓のβ細胞上に見出されるＧタンパク質共役受容体のクラスである７膜貫通タンパク質ファミリーのメンバーであるＧＩＰＲ遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。
【0049】
「ＧＩＰ受容体の活性化」とは、本明細書において、ＧＩＰ－Ｒへのペプチドの結合は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の増加などの細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらすが、これに限定されないことを意味する。
【0050】
ＧＩＰ受容体の活性化は、当業者から周知の任意の技術によって検出することができる。特に、ＧＩＰ受容体の活性化は、酵素結合免疫吸着アッセイ又はフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの生化学的及び／又はイメージングアッセイによってｃＡＭＰを評価することによって検出することができるが、これらに限定されるものではない。
【0051】
「ＧＬＰ－２」又は「グルカゴン様ペプチド２」とは、本明細書において、関連するグルカゴン様ペプチド－１を放出するプロセスにおいてプログルカゴンの特異的翻訳後タンパク質分解切断によって作製される３３アミノ酸ペプチドを意味する。ＧＬＰ－２は、腸内分泌Ｌ細胞及び中枢神経系の種々のニューロンによって産生される。
【0052】
「ＧＬＰ－２受容体」又は「ＧＬＰ－２Ｒ」とは、ヒトにおいて、ＧＬＰ１受容体に密接に関連するＧタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーであるＧＬＰ２Ｒ遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。
【0053】
「ＧＬＰ－２受容体の活性化」とは、本明細書において、ペプチドのＧＬＰ２－Ｒへの結合が、ｃＡＭＰの増加などの細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらすが、これに限定されないことを意味する。
【0054】
ＧＬＰ－２受容体の活性化は、当業者から周知の任意の技術によって検出することができる。特に、ＧＬＰ－２受容体の活性化は、酵素結合免疫吸着アッセイ又はフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などの生化学的及び／又はイメージングアッセイによってｃＡＭＰを評価することによって検出することができるが、これらに限定されるものではない。
【0055】
医薬成物及び医療機器
本発明はまた、上記のセクション「ペプチド」として定義されるペプチド、及び場合により薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、上記のセクション「ペプチド」として定義されるペプチド、及び場合により薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0056】
用語「薬学的に許容される」とは、薬理学的又は毒性学的観点から対象に投与することが許容される特性及び／又は物質を指す。さらなる「薬学的に許容される」とは、製剤化、安定性、患者の受容性及びバイオアベイラビリティのような因子を指し、これらは物理的／化学的観点から製造薬学者に知られるであろう。
【0057】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」とは、活性成分とは異なる医薬組成物中の任意の物質を指す。前記賦形剤は、液体、例えば、ガソリン、動物、植物又は合成に由来するものを含む水及び油のように、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、及び類似のように、崩壊剤、湿潤剤、可溶化剤、酸化防止剤、抗菌剤、等張剤、安定化剤又は希釈剤であり得る。適切なアジュバント及び／又は薬学的担体は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【0058】
本発明の医薬組成物は、非経口的、例えば、静脈内、皮内、脳室内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口（例えば、頬、吸入、鼻及び肺スプレー）、皮内、経皮（局所）、経粘膜又は眼内投与のために製剤化することができる。
【0059】
本発明のペプチドは、とりわけ、骨内でのそれらの統合を増加及び改善することを可能にするので、移植可能な医療装置と共に使用される場合に特に有用である。
【0060】
従って、本発明はまた、本発明のペプチドを特にコーティングした移植可能な医療装置に関する。
【0061】
本明細書中で使用される「移植可能な医療機器」とは、外科的又は医学的に、対象の身体内に、又は自然開口部内への医学的介入によって、全部又は一部導入され、処置後もそこにとどまることを意図される、任意のタイプの機器を指す。埋植期間は、本質的に永続的であってもよく、すなわち、対象の残存寿命の間、デバイスが生分解するまで、又はデバイスが物理的に除去されるまで、所定の位置に維持されることを意図していてもよい。移植可能な医療機器の例としては、整形外科用プロテーゼ及び歯科用インプラントが挙げられる。
【0062】
本発明は、さらに、上述のように、移植可能な医療装置をコーティングするための本発明のペプチドのインビトロでの使用に関する。
【0063】
医学的適応
本発明者らは、本発明のペプチドが、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２よりも高いレベルで骨芽細胞により産生されるコラーゲンマトリックスの酵素的架橋を増加させ、生成された破骨細胞の数をＧＩＰ及びＧＬＰ－２よりも重要な方法で減少させることを実証した。従って、本発明のペプチドは、骨障害を治療するために特に興味深い。
本発明者らは、本発明のペプチドが、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２よりも高いレベルで骨芽細胞により産生されるコラーゲンマトリックスの酵素的架橋を増加させ、生成された破骨細胞の数をＧＩＰ及びＧＬＰ－２よりも重要な方法で減少させることを実証した。従って、本発明のペプチドは、骨障害を治療するために特に興味深い。
【0064】
従って、本発明は、上記の「ペプチド」の項に定義されるペプチド、又は被験者の骨障害を治療及び／又は予防する方法で使用するための上記の「医薬組成物」の項に定義される医薬組成物にも関する。
【0065】
また、本発明は、骨障害を治療及び／又は予防することを意図した医薬の製造のために、上記の「ペプチド」の項で定義されるペプチドの使用、又は上記の「医薬組成物」の項で定義される医薬組成物の使用に関する。
【0066】
また、本発明は、対象における骨障害を治療及び／又は予防するための方法に関し、それを必要とする対象に、上記の「ペプチド」の項に定義される治療有効量のペプチド、又は上記の「医薬組成物」の項に定義される医薬組成物を投与することを含む。
【0067】
「骨障害」とは、本明細書において、骨形成、沈着、又は吸収が異常である障害を意味する。骨障害には、あらゆる種類の原発性又は続発性骨粗鬆症（閉経後、グルココルチコイド誘発性、固定化誘発性、老人性）、骨減少症、糖尿病性骨疾患、骨軟化症及びくる病、骨の骨ジストロフィー、骨のパジェット病、悪性腫瘍の高カルシウム血症、骨転移による骨減少症、骨肉腫、ユーイング腫瘍、骨軟骨腫、癌治療によって引き起こされる骨異常、骨形成不全症、骨髄炎、軟骨無形成症、無血管性骨壊死、骨大理石症、骨化性筋炎、歯周病、副甲状腺機能亢進症、関節リウマチにおける関節周囲びらん、強直性脊椎炎における骨びらん、及び神経性無食欲症における骨減少が含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
したがって、特定の実施形態では、前記骨障害は、原発性又は続発性の骨粗鬆症（閉経後、グルココルチコイド誘発性、固定化誘発性及び老人性骨粗鬆症を含む）、骨減少症、糖尿病性骨疾患、骨軟化症及びくる病、骨の骨ジストロフィー、骨のパジェット病などの骨ジストロフィー、悪性腫瘍、骨肉腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、骨軟骨腫、癌治療によって引き起こされる骨異常、骨形成不全症、骨髄炎、軟骨形成不全症、軟骨無形成症、無血管性骨壊死、骨大理石症、骨化性筋炎、歯周病、副甲状腺機能亢進症、関節リウマチにおける関節周囲びらん、強直性脊椎炎における骨びらん、及び神経性無食欲症における骨減少から選択される。
【0069】
より特定の実施態様において、前記骨障害は、骨形成不全症である。
【0070】
特定の実施態様において、前記骨障害は、骨における代謝性又はホルモン性障害の発現である。
【0071】
「代謝障害」又は「代謝性疾患」とは、本明細書において、正常な代謝過程を変化させる体内の異常な化学反応によって誘発される障害又は疾患を意味する。代謝異常には、酸塩基平衡異常、代謝性脳疾患、カルシウム代謝異常、ＤＮＡ修復欠損症、糖代謝異常、糖代謝異常、乳酸高値症、鉄代謝異常、脂質代謝異常、吸収不良症候群、メタボリックシンドロームＸ、先天性代謝異常、ミトコンドリア疾患、リン代謝異常、ポルフィリン症、プロテオスタシス欠損症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質平衡異常などがある。
【0072】
好ましくは、代謝障害は、カルシウム代謝障害、グルコース代謝障害、及びリン代謝障害からなる群から選択される。
【0073】
「ホルモン障害」又は「ホルモン性疾患」とは、本明細書では、血流中を循環することによってその産生部位から離れたところで作用し、かつ若年の健康な無病哺乳動物のそれより下又は上であるインスリン、グルカゴン、エストロゲン、テストステロン、及び／又は性ホルモン結合グロブリン、甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、線維芽細胞成長因子２３、カルシトリオールの血清濃度と関連する、又は関連する、任意の可溶性分子の過剰産生及び／又は過少産生に起因して哺乳動物に生じる状態、障害又は疾患を意味する。ホルモン障害には、糖尿病、低血糖症及びグルカゴノーマなどのグルコース恒常性障害；甲状腺腫、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺炎及び甲状腺ホルモン抵抗性などの甲状腺障害；カルシウム恒常性障害及び副甲状腺疾患、骨粗鬆症、変形性骨炎、くる病及び骨軟化症などの代謝性骨疾患；尿崩症及び下垂体機能低下症などの下垂体障害がある。
【0074】
好ましくは、ホルモン障害は、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺炎、甲状腺ホルモン抵抗性、カルシウムホメオスタシス障害、副甲状腺障害、骨粗鬆症、変形性骨炎、くる病及び骨軟化症からなる群から選択される。
【0075】
本発明のペプチドは、骨充填生体材料と共に使用される場合に特に有用である。なぜなら、それは、とりわけ、骨におけるその統合を増加させ、改善することを可能にするからである。
【0076】
従って、本発明はまた、本発明のペプチドを含む骨充填生体材料に関する。
【0077】
「骨充填生体材料」とは、本明細書では、初期段階（例えば、液体又はペースト）で骨欠損を充填することができ、時間の経過とともに硬化（例えば、凝固又は半凝固）される生体材料を意味する。そして、「骨充填材」とは、溶融、吸収、置換、組織化等により、材料が置かれた骨に、骨欠陥の充填（骨接合促進、骨増強等の骨改善も含む）を行うことができる材料である。
【0078】
本発明は、骨再生のための使用のために本発明のペプチドを含む骨充填生体材料に関する。
【0079】
特定の実施態様において、前記骨充填生体材料は、神経外科手術、整形外科手術又はソケット／骨欠損充填に使用されるが、これらに限定されない。
【0080】
特定の実施態様において、本発明の前記ペプチドは、骨再生のために使用される場合、前記骨充填材料の骨統合を改善する。
【0081】
「対象」とは、本明細書において、げっ歯類、ネコ、イヌ、又は霊長類のような哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による対象はヒトである。
【0082】
特定の実施形態では、対象は、人工器官などの移植可能な医療機器を有する。
【0083】
本発明の文脈において、用語「治療」又は「治療」は、そのような用語が適用される障害又は状態、又はそのような障害又は状態の１つ以上の症状を逆転、軽減、抑制することを意味する。
【0084】
本発明の文脈において、用語「予防」又は「予防」は、対象が状態を発現する確率の低下又は状態の発現の遅延をもたらす状態を発現するリスクがある対象の予防的治療を指す。
【0085】
本発明のペプチド又は医薬組成物の「治療有効量」とは、特定の疾患を治療又は予防するのに十分な量のペプチド又は組成物を意味し、いずれかの医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比である。しかしながら、本発明のペプチド又は組成物の一日当たりの総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の対象のための特定の治療有効用量レベルは、治療される疾患及び疾患の重症度、使用される特定のペプチド又は組成物の活性、使用される特定の組み合わせ、年齢、体重、一般健康、性別及び食事、投与時間、使用される特定のペプチドの投与経路及び排泄速度、治療の期間、使用される特定のペプチドと組み合わせて使用されるか又は同時に使用される薬物、及び医学分野で周知の類似の因子を含む種々の因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルでペプチドの用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当業者の範囲内である。
【0086】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、治療又は予防される状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに自然に依存する。
【0087】
本発明のペプチド及び医薬組成物は、任意の適切な経路、特に、静脈内、皮内、脳室内、皮下、筋肉内、腹腔内、口腔内（例えば、頬、吸入、鼻及び肺スプレー）、皮内、経皮（局所）、経粘膜又は眼内経路によって投与することができる。
【0088】
本出願を通して、用語「含む」は、特に言及された全ての特徴、並びに任意の、追加の、特定されていない特徴を包含するものとして解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む」の使用は、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在しない（すなわち、「からなる」）実施形態も開示する。
【0089】
本発明は、以下の図及び実施例によってさらに説明される。
【0090】
【表1】
【実施例】
【0091】
実施例１：本発明のペプチドの設計
材料及び方法
すべてのステップの詳細を図１に示す。ヒトＧＩＰ（受託番号：Ｐ０９６８１）及びヒトＧＬＰ－２（受託番号：Ｐ０１２７５．３）のアミノ酸配列を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）から収集した。既知のＧＬＰ－２類似体、すなわち、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：１６１３９６０５）、Ｅｌｓｉｇｌｕｔｉｄｅ、ＺＰ１８４８及びＦＥ２０３７９９のアミノ酸配列も収集した（Wisniewski et al. (2016) J. Med. Chem. 59:3129-3139）。Ｗｏｒｄ ２０１３ソフトウェアを用いて、タンパク質配列を手動で整列させた。相同性パーセンテージの分析は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてＭａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂで行った。バリデーションのための配列相同性の閾値は、ＧＩＰ１－３０又はＧＬＰ－２のいずれかとの＞５０％の相同性に設定した。
材料及び方法
すべてのステップの詳細を図１に示す。ヒトＧＩＰ（受託番号：Ｐ０９６８１）及びヒトＧＬＰ－２（受託番号：Ｐ０１２７５．３）のアミノ酸配列を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）から収集した。既知のＧＬＰ－２類似体、すなわち、Ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ（ＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤ：１６１３９６０５）、Ｅｌｓｉｇｌｕｔｉｄｅ、ＺＰ１８４８及びＦＥ２０３７９９のアミノ酸配列も収集した（Wisniewski et al. (2016) J. Med. Chem. 59:3129-3139）。Ｗｏｒｄ ２０１３ソフトウェアを用いて、タンパク質配列を手動で整列させた。相同性パーセンテージの分析は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてＭａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂで行った。バリデーションのための配列相同性の閾値は、ＧＩＰ１－３０又はＧＬＰ－２のいずれかとの＞５０％の相同性に設定した。
【0092】
結果
図１は、二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体を設計するために使用されるインシリコ戦略を示す。
図１は、二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体を設計するために使用されるインシリコ戦略を示す。
【0093】
ステップ１では、ヒトＧＩＰ１－３０とヒトＧＬＰ－２との間の配列アラインメントをＷｏｒｄ ２０１３で手動で行い、同じ配列位置の同じアミノ酸に対応するコンセンサス配列１（ＣＳ１）の生成に導いた。ＣＳ１は、それぞれ、Ａｌａ２、Ｇｌｙ４、Ｐｈｅ６、Ａｓｐ１５、Ａｓｐ２１、Ｐｈｅ２２、Ａｓｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、及びＬｙｓ３０で構成される。
【0094】
ステップ２において、コンセンサス配列２（ＣＳ２）を確立するために、４つの既知のＧＬＰ－２類似体、すなわちテデュグルチド、エルシグルチド、ＺＰ１８４８及びＦＥ２０３７９９も手動で配列整列させた。ＣＳ２は、Ｈｉｓ１、Ｇｌｙ２、Ｇｌｙ４、Ｐｈｅ６、Ｓｅｒ７、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１２、Ｉｌｅ１３、Ｌｅｕ１４、Ａｓｐ１５、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１８、Ａｌａ１９、Ａｒｇ２０、Ａｓｐ２１、Ｐｈｅ２２、Ｉｌｅ２３、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｉｌｅ２７、Ｔｈｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｉｌｅ３１、Ｔｈｒ３２及びＡｓｐ３３で構成される。
【0095】
ステップ３において、ヒトＧＩＰ１－３０及びヒトＧＬＰ－２を手動で配列整列させて、ＣＳ１の欠損位置におけるアミノ酸のクラスを決定した。同じクラスのアミノ酸が同じ位置の両方の配列に出会った場合、そのクラスは配列コンセンサス３（ＣＳ３）に示された。３、５、９、１１、１３、１４、１７、２３、２７及び２９位の両方のペプチド配列において、それぞれ、負に荷電した、極性の、負に荷電した、極性の、脂肪族の、脂肪族の、脂肪族の、脂肪族の、脂肪族の、脂肪族の、及び極性のアミノ酸が見出された。
【0096】
ステップ４では、ＧＬＰ－２類似体に導く配列を確立するために、進歩者らはＣＳ１とＣＳ２を比較した。この比較からＨｉｓ１、Ｇｌｙ４、Ｐｈｅ６、Ｓｅｒ７、Ｇｌｕ９、Ｔｈｒ１２、Ｉｌｅ１３、Ｌｅｕ１４、Ａｓｐ１５、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１８、Ａｌａ１９、Ａｒｇ２０、Ａｓｐ２１、Ｐｈｅ２２、Ｉｌｅ２３、Ａｓｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｉｌｅ２７、Ｔｈｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｉｌｅ３１、Ｔｈｒ３２、Ａｓｐ３３を含む配列コンセンサス４（ＣＳ４）を構築した。
【0097】
ステップ５において、発明者らは、３、５、９、１１、１３、１４、１７、２３、２７及び２９位のアミノ酸が正しいクラスのものであるか否かを検証するために、ＣＳ４をＣＳ３と整列させた。その後、ＣＳ４の妥当性が確認された。
【0098】
次に、ヒトＧＩＰ１－３０とＣＳ４との間の一方からの配列相同性、及びヒトＧＬＰ－２とＣＳ４との間の他方からの配列相同性の分析を、ステップ６において実施した。本発明者らは、ＣＳ４がヒトＧＬＰ－２（７６％）と大きな配列相同性を有するが、ヒトＧＩＰ１－３０（２７％）との相同性が低いことを証明した。
【0099】
次に、ＣＳ４を２、３、５、８、１０、１１、１６、２８位で調整し、コンセンサス配列７（ＣＳ７）、Ｈｉｓ１、Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｇｌｙ４、Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ８、Ｇｌｕ９、Ｓｅｒ１１、Ｔｈｒ１２、Ｉｌｅ１３、Ｌｅｕ１４、Ａｓｐ１５、Ｌｙｓ１６、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１８、Ａｌａ１９、Ａｒｇ２０、Ａｓｐ２１、Ｐｈｅ２２、Ｉｌｅ２３、Ａｓｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｉｌｅ２７、Ａｌａ２８、Ｔｈｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｉｌｅ３１、Ｔｈｒ３２及びＡｓｐ３３をもたらした。Ｇｌｙ２がジペプチジルペプチダーゼ－４耐性を付与するために選択されたことは注目に値する。
【0100】
ここでも、発明者らはヒトＧＩＰ１－３０ａｎｄヒトＧＬＰ－２との配列相同性をチェックし、それぞれ４５％及び７６％を見出した。しかし、彼らの目標は両ヒト分子と少なくとも５０％の相同性を得ることであったため、ヒトＧＩＰ１－３０との相同性を高めるためにＣＳ７を改良した。修正は、５、７、９、１２、１３、２３、２７、２８及び３１～３３位で行った。この結果、末端アミド化を伴うＨｉｓ１、Ｇｌｙ２、Ｇｌｕ３、Ｇｌｙ４、Ｓｅｒ５、Ｐｈｅ６、Ｓｅｒ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１１、Ｌｅｕ１４、Ａｓｐ１５、Ｌｙｓ１６、Ｌｅｕ１７、Ａｌａ１８、Ａｌａ１９、Ａｒｇ２０、Ａｓｐ２１、Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ａｓｎ２４、Ｔｒｐ２５、Ｌｅｕ２６、Ｌｅｕ２７、Ａｓｎ２８、Ｔｈｒ２９及びＬｙｓ３０である共通配列９（ＣＳ９）が得られた。文献から、Ｌｙｓ３０をアミド化すると、Ｉｌｅ３１、Ｔｈｒ３２及びＡｓｐ３３は不要と思われた（Wisniewski et al. (2016) J. Med. Chem. 59:3129-3139）。また、７位、１０位、１２位、１３位では、受容体結合能及び生物学的活性に作用するために、任意のアミノ酸である可能性があることも判明した。
【0101】
次に、ＣＳ９をヒトＧＩＰ１－３０ａｎｄヒトＧＬＰ－２と比較し、両分子について５０％以上の相同性を認め、ＣＳ９の妥当性が確認された。
【0102】
実施例２：本発明のペプチドが骨リモデリングに及ぼす影響
材料及び方法
１．試薬
すべての類似体は純度＞９５％（Ｄｕｄｅｌａｎｇｅ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）のＧｅｎｅＣｕｓｔ Ｅｕｒｏｐｅから購入した。純度は、質量分析により検証された高速液体クロマトグラフィー及びペプチド組成により検証された。マウスＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４、マウス未変化体２６４．７及びヒトＨＥＫ－２９３細胞を、米国型培養コレクション（ＡＴＣＣ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）から購入した。健常者からバフィーコートをエタブリセメント・フランサイス・ドゥ・サン（フランス、アンガース）から入手した。核因子ｋＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）及びヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）のヒト及びマウス受容体アクチベーターをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）から購入した。ヒトＧＩＰ受容体及びヒトＧＬＰ－２受容体ｃＤＮＡは、それぞれＡｄｄｇｅｎｅ（プラスミド１４９４２、Ｂ．Ｔｈｏｒｅｎｓが親切に提供）及びＰｌａｓｍｉｄ ＩＤリポジトリ（プラスミドＨｓＣＤ００３４６２４４）から購入した。他のすべての化学物質は、特に断らない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（フランス、リヨン）から入手した。
材料及び方法
１．試薬
すべての類似体は純度＞９５％（Ｄｕｄｅｌａｎｇｅ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）のＧｅｎｅＣｕｓｔ Ｅｕｒｏｐｅから購入した。純度は、質量分析により検証された高速液体クロマトグラフィー及びペプチド組成により検証された。マウスＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４、マウス未変化体２６４．７及びヒトＨＥＫ－２９３細胞を、米国型培養コレクション（ＡＴＣＣ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）から購入した。健常者からバフィーコートをエタブリセメント・フランサイス・ドゥ・サン（フランス、アンガース）から入手した。核因子ｋＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）及びヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）のヒト及びマウス受容体アクチベーターをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）から購入した。ヒトＧＩＰ受容体及びヒトＧＬＰ－２受容体ｃＤＮＡは、それぞれＡｄｄｇｅｎｅ（プラスミド１４９４２、Ｂ．Ｔｈｏｒｅｎｓが親切に提供）及びＰｌａｓｍｉｄ ＩＤリポジトリ（プラスミドＨｓＣＤ００３４６２４４）から購入した。他のすべての化学物質は、特に断らない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（フランス、リヨン）から入手した。
【0103】
２．細胞培養
マウスＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したα最小必須培地（αＭＥＭ）を含む増殖培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で富化した加湿雰囲気中で増殖及び増殖させた。
マウスＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したα最小必須培地（αＭＥＭ）を含む増殖培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で富化した加湿雰囲気中で増殖及び増殖させた。
【0104】
マウス未処理２６４．７及びヒトＨＥＫ－２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む増殖培地中で、３７℃で５％ＣＯ２を濃縮した加湿雰囲気中で増殖及び拡大した。
【0105】
３．細胞死試験
細胞死中に起こる細胞膜透過性の増加は、生きている細胞から除外され、死を迎えている細胞に取り込まれる色素トリパンブルーを用いて可視化することができる（Bellido and Plotkin (2008) Methods Mol. Biol. 455:51-75）。
細胞死中に起こる細胞膜透過性の増加は、生きている細胞から除外され、死を迎えている細胞に取り込まれる色素トリパンブルーを用いて可視化することができる（Bellido and Plotkin (2008) Methods Mol. Biol. 455:51-75）。
【0106】
簡単に説明すると、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を２４ウェルプレートに平板培養し、生理食塩水、種々の濃度のＧＬ－０００１又は骨細胞死を増大させることが知られている１０－６Ｍロシグリタゾンの存在下で培養した（Mieczkowska et al. (2012) J. Biol. Chem 287:23517-23526）。２４時間後、浮遊細胞を含む細胞培養上清を回収し、以前に標識したエッペンドルフチューブに入れた。各ウェルをＰＢＳ中で洗浄した後、トリプシンを添加して接着細胞を分離した。分離した接着細胞を含有する混合物を収集し、細胞培養上清を含有するエッペンドルフ中にプールした。細胞を１，５００回転／分（ｒｐｍ）で１０分間遠心し、上清を注意深く除去し、細胞をトリパンブルー０．０４％でインキュベートし、血液サイトメーターに移した。生きている（透明）細胞及び死んだ（青色）細胞を光学顕微鏡検査下で計数し、以下のように各条件について死滅細胞のパーセンテージを測定した。
死細胞率＝１００×（死細胞数）／（死細胞数＋生細胞数）
死細胞率＝１００×（死細胞数）／（死細胞数＋生細胞数）
【0107】
４．破骨細胞試験
Mabilleau and Sabokbar (2009) PLoS One 4:e4173に記載されるEtablissement Francais du Sang (Angers, France)で得られた３つの軟膜からヒト末梢血単核細胞を単離した。
Mabilleau and Sabokbar (2009) PLoS One 4:e4173に記載されるEtablissement Francais du Sang (Angers, France)で得られた３つの軟膜からヒト末梢血単核細胞を単離した。
【0108】
血液をα－最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ上に層状にして、２０分間遠心分離した（７００×ｇ）。界面層をＭＥＭに再懸濁し（６００×ｇ）、さらに１０分間遠心分離し、その後、得られた細胞を、１０％加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）を添加した培地に再懸濁し、５％（ｖ／ｖ）酢酸溶液を用いて赤血球を溶解した後、血球計数器で計数した。
【0109】
破骨細胞形成の程度を評価するために、分離されたヒトＰＢＭＣを、１００ＵＩ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ＦＣＳ（破骨細胞培地）を含有するＭＥＭ中の２４ウェルプレート中で培養した（Mabilleau et al. (2011) J Biol Chem 286:3242-3249）。２時間のインキュベーション後、培養物を培地中で激しくすすぎ、非接着性細胞を除去し、次いで、２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＭ－ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｓＲＡＮＫＬ（７日目に添加）及び種々の濃度の消化管ホルモン類似体（７日目に添加）を含む１ｍｌのＭＥＭ／ＦＣＳ中に維持した。１４日後に培養を終了し、破骨細胞形成の程度を評価した（後述のＴＲＡｃＰ染色）。全ての因子は２～３日ごとに補充された。
【0110】
マウス原料２６４．７細胞をプラスチック皿から取り出し、１．２５×１０４細胞／ｃｍ３の密度でプレートし、１０ｎｇ／ｍｌ可溶性マウスＲＡＮＫＬで富化した増殖培地中で増殖させた。１１０時間後、細胞をホルマリン（ＰＢＳ緩衝液中１０％）で１０分間固定し、ＴＲＡｃＰ染色前に蒸留水中で洗浄した。
【0111】
５．ＴＲＡｃＰ染色
酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡｃＰ）は、基質としてナフトールＡＳ－ＢＩ－リン酸と、暗所で３７℃で９０分間ジアゾニウム塩としてファストバイオレットＢを用いた同時カップリング反応により組織化学的に明らかにした。培養物を蒸留水中で３回すすぎ、残留活性を４％ＮａＦで３０分間阻害した。次いで、細胞を蒸留水中でリンスし、ＤＡＰＩで２０分間対比染色し、そして水性媒体を用いてマウントする前に乾燥させた。３個以上の核を有するＴＲＡｃＰ陽性細胞を破骨細胞として同定した。新たに発生した数は光学顕微鏡検査を用いて評価した。
酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡｃＰ）は、基質としてナフトールＡＳ－ＢＩ－リン酸と、暗所で３７℃で９０分間ジアゾニウム塩としてファストバイオレットＢを用いた同時カップリング反応により組織化学的に明らかにした。培養物を蒸留水中で３回すすぎ、残留活性を４％ＮａＦで３０分間阻害した。次いで、細胞を蒸留水中でリンスし、ＤＡＰＩで２０分間対比染色し、そして水性媒体を用いてマウントする前に乾燥させた。３個以上の核を有するＴＲＡｃＰ陽性細胞を破骨細胞として同定した。新たに発生した数は光学顕微鏡検査を用いて評価した。
【0112】
６．コラーゲン成熟度試験
コラーゲン成熟度アッセイのために、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで分離し、１．５×１０４細胞／ｃｍ３の密度で平板培養し、増殖培地中でコンフルエンスになるまで増殖させた。コンフルエンス時に、増殖培地を、５％ＦＢＳ、５％ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、及び種々の濃度の類似体を添加したαＭＥＭを含む分化培地に置き換えた。この日を１日目とみなした。分化培地は２日ごとに補充した。
コラーゲン成熟度アッセイのために、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで分離し、１．５×１０４細胞／ｃｍ３の密度で平板培養し、増殖培地中でコンフルエンスになるまで増殖させた。コンフルエンス時に、増殖培地を、５％ＦＢＳ、５％ウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、及び種々の濃度の類似体を添加したαＭＥＭを含む分化培地に置き換えた。この日を１日目とみなした。分化培地は２日ごとに補充した。
【0113】
１４日目に、骨芽細胞培養物を、０．１％トリトンＸ１００を含有する０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で４時間、軌道振盪器上でインキュベーションすることにより脱細胞化した。培養物をミリＱ水で少なくとも６回すすぎ、無水エタノール中で固定し、培養皿から取り出し、ＢａＦ２ウィンドウに移し、そこで風乾した。
【0114】
得られたフーリエ変換赤外スペクトルと市販のコラーゲンのスペクトルを比較することにより、コラーゲン細胞外マトリックスの完全性を検証した。
【0115】
Ｂｒｕｋｅｒ Ｖｅｒｔｅｘ ７０分光計（Ｂｒｕｋｅｒ ｏｐｔｉｃｓ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスペクトル分析を行い、標準的な単一元素のＭｅｒｃｕｒｙ Ｃａｄｍｉｕｍ Ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ（ＭＣＴ）検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ３０００赤外顕微鏡とインターフェースした。赤外スペクトルは４ｃｍ－１の分解能で記録され、伝送モードでは平均３２スキャンであった。背景スペクトル画像を、各実験の開始時と終了時に同じＢａＦ２ウィンドウから同一条件下で収集し、装置の安定性を確保した。各条件について少なくとも２０のスペクトルを取得し、Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）の実験室製ルーチンスクリプトを用いて分析した。コラーゲン成熟度指数は、アミドＩピークの１６６０ｃｍ－１及び１６９０ｃｍ－１に位置するそれぞれのサブバンドを用いて、成熟ピリジニウムの未成熟デヒドロキシリシノノロロイシンコラーゲン架橋に対する比として決定した。
【0116】
７．結合アッセイ
ヒトＨＥＫ－２９３細胞を、１０ｃｍペトリ皿中で２×１０５細胞／ｃｍ３の濃度で平板培養した。２４時間後、ヒトＧＩＰ受容体又はヒトＧＬＰ－２受容体のいずれかをコードする１５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、最適化リン酸カルシウム法で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、トランスフェクションを受けた細胞を分離し、透明底を有する黒色９６ウェルプレート（Ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ， Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の６×１０４細胞／ｃｍ３の密度で平板培養した。２４時間後、種々の濃度の類似体を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したαＭＥＭ中の１０－７Ｍ Ｆａｍ－［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０又は１０－６Ｍ Ｆａｍ－［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２のいずれかの存在下、各ウェルに添加した。平衡結合を３７℃で一晩達成し、次いで、細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄し、０．１Ｍ ＮａＯＨに可溶化した。
ヒトＨＥＫ－２９３細胞を、１０ｃｍペトリ皿中で２×１０５細胞／ｃｍ３の濃度で平板培養した。２４時間後、ヒトＧＩＰ受容体又はヒトＧＬＰ－２受容体のいずれかをコードする１５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、最適化リン酸カルシウム法で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、トランスフェクションを受けた細胞を分離し、透明底を有する黒色９６ウェルプレート（Ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ， Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の６×１０４細胞／ｃｍ３の密度で平板培養した。２４時間後、種々の濃度の類似体を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したαＭＥＭ中の１０－７Ｍ Ｆａｍ－［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０又は１０－６Ｍ Ｆａｍ－［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２のいずれかの存在下、各ウェルに添加した。平衡結合を３７℃で一晩達成し、次いで、細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄し、０．１Ｍ ＮａＯＨに可溶化した。
【0117】
蛍光をＭ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で読み、励起波長を４９０ｎｍに設定し、発光波長を５２５ｎｍに設定した。
【0118】
ヒトＧＩＰ受容体又はヒトＧＬＰ－２受容体への結合は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０における非線形回帰分析によって達成された。
【0119】
８．サイクリックＡＭＰアッセイ
ヒトＨＥＫ－２９３細胞を、４ウェルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）中で２×１０５細胞／ｃｍ３の密度で平板培養した。２４時間後、細胞を、ヒトＧＩＰ受容体又はヒトＧＬＰ－２受容体のいずれかをコードする１０μｇのプラスミドＤＮＡ、及びｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＥＰＡＣ－ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ－Ｖｅｎｕｓ Ｈ７４プローブをコードする５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて最適化リン酸カルシウム法でトランスフェクトした。同時トランスフェクション実験において、細胞を、ヒトＧＩＰ受容体をコードする５μｇのプラスミドＤＮＡ、ヒトＧＬＰ－２受容体をコードする５μｇのプラスミドＤＮＡ、及びＨ７４プローブをコードする５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、トランスフェクションした細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、Ｌｅｉｃａ撮像システム（ＳＰ８共焦点ヘッドを装着したＤＭＩ６０００逆顕微鏡）及び制御された雰囲気（３７℃、５％ＣＯ２）を含むチャンバー中で、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）中でインキュベートした。画像取得は、６３×、１．４Ｎ．Ａ．油浸対物レンズ及びＨｙｂｒｉｄ（登録商標）検出器（Ｌｅｉｃａ）を用いて行い、３０分後に画像を収集した。４５８ｎｍのＡｒレーザーを用いてドナー励起を行い、それに応じてＳＰ８分光計を設定することにより、ドナー発光を４６０～５０５ｎｍの間に集め、アクセプタ発光を５２０～６００ｎｍの間に集めた。ＦＲＥＴは、ドナーシグナルとアクセプターシグナルとの比として表した。実験開始時にＦＲＥＴ値を１に設定した。溶媒、１０－９Ｍ［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０、１０－９Ｍ［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は１０－９Ｍ ＧＬ－０００１をアッセイ培地に添加し、ＦＲＥＴシグナルを上記のように測定した。
ヒトＨＥＫ－２９３細胞を、４ウェルマイクロスライド（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）中で２×１０５細胞／ｃｍ３の密度で平板培養した。２４時間後、細胞を、ヒトＧＩＰ受容体又はヒトＧＬＰ－２受容体のいずれかをコードする１０μｇのプラスミドＤＮＡ、及びｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ－ＥＰＡＣ－ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ－Ｖｅｎｕｓ Ｈ７４プローブをコードする５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて最適化リン酸カルシウム法でトランスフェクトした。同時トランスフェクション実験において、細胞を、ヒトＧＩＰ受容体をコードする５μｇのプラスミドＤＮＡ、ヒトＧＬＰ－２受容体をコードする５μｇのプラスミドＤＮＡ、及びＨ７４プローブをコードする５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、トランスフェクションした細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、Ｌｅｉｃａ撮像システム（ＳＰ８共焦点ヘッドを装着したＤＭＩ６０００逆顕微鏡）及び制御された雰囲気（３７℃、５％ＣＯ２）を含むチャンバー中で、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む）中でインキュベートした。画像取得は、６３×、１．４Ｎ．Ａ．油浸対物レンズ及びＨｙｂｒｉｄ（登録商標）検出器（Ｌｅｉｃａ）を用いて行い、３０分後に画像を収集した。４５８ｎｍのＡｒレーザーを用いてドナー励起を行い、それに応じてＳＰ８分光計を設定することにより、ドナー発光を４６０～５０５ｎｍの間に集め、アクセプタ発光を５２０～６００ｎｍの間に集めた。ＦＲＥＴは、ドナーシグナルとアクセプターシグナルとの比として表した。実験開始時にＦＲＥＴ値を１に設定した。溶媒、１０－９Ｍ［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０、１０－９Ｍ［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は１０－９Ｍ ＧＬ－０００１をアッセイ培地に添加し、ＦＲＥＴシグナルを上記のように測定した。
【0120】
９．動物
ＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊ）マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス、Ｓａｉｎｔ－Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ）から入手した。すべての動物実験は、フランス高等教育研究イノベーション省により、ライセンス６１５４－２０１６０７２１１１３０４１５ｖ１の下で承認された。
ＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＪＲｊ）マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（フランス、Ｓａｉｎｔ－Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ）から入手した。すべての動物実験は、フランス高等教育研究イノベーション省により、ライセンス６１５４－２０１６０７２１１１３０４１５ｖ１の下で承認された。
【0121】
マウスは、施設内の動物実験室（Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｅ４９００７００２）でケージ当たり４匹の動物を２４℃±２℃で１２時間の明暗サイクルで飼育し、頸部脱臼により屠殺するまで、水道水と通常の食餌（Ｄｉｅｔ Ａ０４、Ｓａｆｅ、Ａｕｇｙ、Ｆｒａｎｃｅ）を自由に与えた。全ての手順は、Ｆｒｅｎｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ ２０１３－１１８に従って実施した。
【0122】
両側卵巣摘出術（ＯＶＸ）を、β２アドレナリン受容体作動薬を補充した全身麻酔下１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス４０匹で行った。１６週齢で、下の生理食塩水又はペプチドを充填したＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプ（モデル番号２００６、Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）を、３２匹のマウスにおいて全身麻酔下で２つの肩甲骨の間に皮下移植した。ポンプの充填が成功したことを、充填前後にポンプを重み付けすることにより確認した。２０週齢時に、ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプを同様のポンプに置き換え、４週間の供給を確実にした。マウスを４群に無作為に割り付けた。
（ｉ）ビヒクル、毎日（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ、ｎ＝８）、
（ｉｉ）２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１、ｎ＝８）、
（ｉｉｉ）２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５、ｎ＝８）、
（ｉｖ）１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００、ｎ＝８）。
（ｉ）ビヒクル、毎日（ＯＶＸ＋Ｖｅｈ、ｎ＝８）、
（ｉｉ）２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１、ｎ＝８）、
（ｉｉｉ）２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５、ｎ＝８）、
（ｉｖ）１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７（ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００、ｎ＝８）。
【0123】
これらの用量の類似体は、消化管ホルモン類似体に関する本発明者の広範な知識に基づいていた（Mabilleau et al. (2014) Bone 63:61-68; Mansur et al. (2015) J Cell Physiol 230:3009-3018; Mieczkowska et al. (2015) Bone 74:29-36; Mabilleau et al. (2016) Bone 91:102-112; Mansur et al. (2016) Bone 87:102-113; Pereira et al. (2017) Front Endocrinol (Lausanne) 8:327; Mabilleau et al. (2018) J Endocrinol.）。残念ながら、２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日のマウスは浸透圧ポンプ置換中に死亡した。
【0124】
さらに８匹のＯＶＸマウスを陽性対照（ＯＶＸ＋Ｚｏｌ）として用い、１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸（参照番号６１１１、バッチ番号１Ａ／２０３５２３、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国ブリストル）を尾静脈に単回静脈内注射した。このゾレドロン酸の用量及びレジメンは、ヒトの閉経後骨粗鬆症の治療に承認された５ｍｇの注入と同等であった。
【0125】
体重は、精密スケール（Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｒ（商標）Ｐｒｏ，Ｏｈａｕｓ，Ｎａｎｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で週１回モニターした。すべてのマウスにカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉｐ）を１２及び２日間投与し、２４週齢で殺処分した。剖検後、大腿骨、第２及び第５腰椎、肝臓及び膵臓を採取し、以下に詳述するように処理した。
【0126】
１０．生体力学的試験
剖検では、大腿骨及び第２腰椎（Ｌ２）を軟組織で洗浄し、直ちに－２０℃で生理食塩水に浸したガーゼで凍結させ、骨を４℃で一晩解凍した後、大腿骨で３点屈曲実験を行った。
剖検では、大腿骨及び第２腰椎（Ｌ２）を軟組織で洗浄し、直ちに－２０℃で生理食塩水に浸したガーゼで凍結させ、骨を４℃で一晩解凍した後、大腿骨で３点屈曲実験を行った。
【0127】
大腿骨長さは、デジタルキャリパ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ，Ｒｏｉｓｓｙ ｅｎ Ｆｒａｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で測定した。大腿骨長の有意差は群間で観察されなかった。
【0128】
サーボ油圧材料試験システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ ５９４２，Ｉｎｓｔｒｏｎ，Ｅｌａｎｃｏｕｒｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、大腿骨を２ｍｍ／分で３点曲げで破損するまで装填した。下部スパン長は１０ｍｍであった。大腿骨は、前方四分円が下向きになり、引張荷重を受けるように配向した。上部クロスヘッドの荷重及び変位は、１００Ｈｚのサンプリング速度でデジタル的に記録され、５００Ｎロードセル（Ｉｎｓｔｒｏｎ）を用いて測定された。剛性、終局荷重、降伏荷重、降伏後変位（ＰＹＤ）、及び仕事対破壊を荷重－変位曲線から計算した。ＰＹＤは、破壊時の変位から降伏時の変位を引いたものと定義した。降伏は、剛性の０．２％低下を表す回帰が荷重－変位曲線と交差する点と定義した。
【0129】
圧縮実験をＬ２で行った。簡単に説明すると、椎体を注意深く切開し、プレキシグラスプレート上にシアノアクリレート接着剤で接着し、次いで翌日まで生理食塩水中で４℃でインキュベートした。Ｌ２椎体は、Ｉｎｓｔｒｏｎ ５９４２デバイスを用いて１ｍｍ／分の変位速度で破壊まで圧縮した。上部プラトーの荷重と変位を１００Ｈｚのサンプリング速度で記録した。荷重－変位曲線から最大荷重と剛性を計算した。
【0130】
１１．マイクロコンピュータＸ線断層撮影
Ｓｋｙｓｃａｎ １０７６マイクロトモグラフィー（Ｂｒｕｋｅｒ ＭｉｃｒｏＣＴ，Ｋｏｎｔｉｃｈ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を５０ｋＶ、２００μＡ、２０００ｍｓ積分時間で操作し、大腿骨中央部のマイクロＣＴ分析を行った。等方性画素サイズを９μｍに固定し、０．５°で回転ステップを行い、０．５ｍｍアルミニウムフィルタで露光した。各３Ｄ再構成画像データセットは、大域的閾値化を用いて２値化した。関心のある皮質体積（ＶＯＩ）は、遠位成長プレートの４ｍｍ上に位置し、さらに１ｍｍ上方に延長した。
Ｓｋｙｓｃａｎ １０７６マイクロトモグラフィー（Ｂｒｕｋｅｒ ＭｉｃｒｏＣＴ，Ｋｏｎｔｉｃｈ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を５０ｋＶ、２００μＡ、２０００ｍｓ積分時間で操作し、大腿骨中央部のマイクロＣＴ分析を行った。等方性画素サイズを９μｍに固定し、０．５°で回転ステップを行い、０．５ｍｍアルミニウムフィルタで露光した。各３Ｄ再構成画像データセットは、大域的閾値化を用いて２値化した。関心のある皮質体積（ＶＯＩ）は、遠位成長プレートの４ｍｍ上に位置し、さらに１ｍｍ上方に延長した。
【0131】
第５腰椎（Ｌ５）の椎体の分析を、８５ｋＶ、２２０μＡ、１０００ｍｓ積分時間で手術したＮａｎｏｔｏｍナノトモグラフィー（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＧＥ、米国）を用いて行った。等方性画素サイズを４μｍに固定し、回転ステップを０．２５°にし、露光を０．１ｍｍ銅フィルターで行った。各３Ｄ再構成画像データセットは、大域的閾値化を用いて２値化した。関心のある小柱体積を、Ｌ５椎体の冠状断面上でコンピュータ化した。骨梁ＶＯＩは、前皮質壁及び後皮質壁からの最初と最後の８０μｍを除いて、椎体全体に広がった。すべてのｍｉｃｒｏＣＴ／ＮａｎｏＣＴパラメータは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈによって提案されたガイドライン及び命名法に従って決定した(Bouxsein et al., 2010）。
【0132】
１２．骨組成評価
３点曲げ実験の後、大腿骨を４℃でｐＭＭＡ中に脱灰せずに埋め込み、大腿骨中央部の１マイクロメートル断面をＢａＦ２光学窓の間にサンドイッチし、後方象限でフーリエ変換赤外イメージング（ＦＴＩＲＩ）評価を行った。ＦＴＩＲＩは、Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ３０００顕微鏡とインターフェースした頂点７０分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、１８０×１８０μｍの視野をカバーする焦点面アレイ検出器（６４×６４画素）を用いて実施した。十分な骨を分析できるように、９つの視野を一緒に縫い合わせた。８ｃｍ－１のスペクトル分解能（スペクトル領域９００～２０００ｃｍ－１）で切片を走査した。各スペクトルは、ｐＭＭＡ減算に供する前に、ＲＭｉｅＳ－ＥＭＳＣ ｖ５アルゴリズム（英国マンチェスター大学Ｐｅｔｅｒ Ｇａｒｄｎｅｒ教授の種類贈与）を用いてＭｉｅ散乱に対して補正した。
３点曲げ実験の後、大腿骨を４℃でｐＭＭＡ中に脱灰せずに埋め込み、大腿骨中央部の１マイクロメートル断面をＢａＦ２光学窓の間にサンドイッチし、後方象限でフーリエ変換赤外イメージング（ＦＴＩＲＩ）評価を行った。ＦＴＩＲＩは、Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ３０００顕微鏡とインターフェースした頂点７０分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と、１８０×１８０μｍの視野をカバーする焦点面アレイ検出器（６４×６４画素）を用いて実施した。十分な骨を分析できるように、９つの視野を一緒に縫い合わせた。８ｃｍ－１のスペクトル分解能（スペクトル領域９００～２０００ｃｍ－１）で切片を走査した。各スペクトルは、ｐＭＭＡ減算に供する前に、ＲＭｉｅＳ－ＥＭＳＣ ｖ５アルゴリズム（英国マンチェスター大学Ｐｅｔｅｒ Ｇａｒｄｎｅｒ教授の種類贈与）を用いてＭｉｅ散乱に対して補正した。
【0133】
スペクトル画像の評価は、Aguado et al. (2017) Calcif Tissue Int 100:332-340に記載されているように、Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）の実験室製ルーチンスクリプトを用いて行った。
【0134】
ＦＴＩＲ骨パラメータ（Paschalis (2012) Methods Mol Biol 816:517-525）を計算した：（１）リン酸塩／アミド比（ｖ１，ｖ３リン酸塩／面積アミド１）；（２）酸性リン酸塩含有量（強度比１１２７ｃｍ－１／１０９６ｃｍ－１）（Spevak et al. (2013) Calcif Tissue Int 92:418-428）；（３）結晶サイズと完全性を反映する無機結晶度（強度比１０３０ｃｍ－１／１０２０ｃｍ－１）；（４）結晶サイズ指数（強度比１０７５ｃｍ－１／１０５５ｃｍ－１）であり、結晶サイズを００２、２１１、２００、及び２０２方向に表す（Gadaleta et al. (1996) Calcif Tissue Int 58:9-16）；及び（５）コラーゲン成熟度（強度比１６６０ｃｍ－１／１６９０ｃｍ－１）。
【0135】
炭酸塩／リン酸塩比（約１４１５ｃｍ－１／１０３０ｃｍ－１に位置する強度ｖ３炭酸塩）は、有機マトリックススペクトルを差し引いた後に計算した（Ou-Yang et al. (2001) J Bone Miner Res 16:893-900）。各組成パラメータについて、画素分布の半値最大における平均及び全幅（ゼロバックグラウンド値を除く）を計算し、平均及び不均一性として表した。
【0136】
１３．組織学
剖検時に肝臓及び膵臓を採取し、直ちにホルマリンで固定した。パラフィン包埋後、厚さ４μｍの切片を切断し、ヘマトキシリン／フロキシン染色で染色した。組織異常の有無を評価するために、訓練を受けた組織学者によって組織学的観察が行われている。
剖検時に肝臓及び膵臓を採取し、直ちにホルマリンで固定した。パラフィン包埋後、厚さ４μｍの切片を切断し、ヘマトキシリン／フロキシン染色で染色した。組織異常の有無を評価するために、訓練を受けた組織学者によって組織学的観察が行われている。
【0137】
１４．統計解析
図２－３のコラーゲン成熟度及び破骨細胞数の差、ならびに図１６～１８のｃＡＭＰレベルを比較するために、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定と単一の統合分散を用いた一元配置分散分析を用いた。
図２－３のコラーゲン成熟度及び破骨細胞数の差、ならびに図１６～１８のｃＡＭＰレベルを比較するために、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較検定と単一の統合分散を用いた一元配置分散分析を用いた。
【0138】
ＯＶＸ＋Ｖｅｈ群、ＯＶＸ＋ＧＬ－０００１群、ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ ２５群、ＯＶＸ＋ＧＬ－０００７ １００群の有意性を検定するため、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を用いた一元配置分散分析を行った。
【0139】
ｐが０．０５以下の場合は有意差とみなした。
【0140】
結果
実施例１に開示されているように得られたコンセンサス配列に基づいて、以下のペプチドを本発明者らが試験した。
実施例１に開示されているように得られたコンセンサス配列に基づいて、以下のペプチドを本発明者らが試験した。
【0141】
【表2】
【0142】
１．ＧＩＰとＧＬＰ－２の併用がコラーゲン成熟度と破骨細胞数に及ぼす影響
図２は、ビヒクル（ＣＴＲＬ）、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２及び［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２の併用投与がコラーゲン成熟度に及ぼす影響を示す。
図２は、ビヒクル（ＣＴＲＬ）、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２及び［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２の併用投与がコラーゲン成熟度に及ぼす影響を示す。
【0143】
［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２又は［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２は、それぞれ約８２％（ｐ＝０．０７４）又は１１１％（ｐ＝０．０２４６）までコラーゲン成熟度を増加させることができた。［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２と［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２の同時投与は、このパラメータにおいて有意な増加（２５５％，ｐ＜０．００１）をもたらした。この増加は、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２又は［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２単独で観察されたものよりも有意に大きかった。
【0144】
図３は、インビトロでのヒト破骨細胞形成に対するビヒクル（ＣＴＲＬ）、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２と［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２の併用投与の影響を示す。ここでも、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２及び［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２は、それぞれ１６％（ｐ＜０．００１）及び３４％（ｐ＜０．００１）の破骨細胞形成を有意に低下させた。これらの分子の同時投与は破骨細胞形成の有意な６６％減少をもたらした（ｐ＜０．００１）。
【0145】
２．骨芽細胞死に対するＧＬ－０００１の作用
図４は、ビヒクル、ＧＬ－０００１又はロシグリタゾンの存在下でのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞死に関する結果を示す。本発明者らは以前に、ロシグリタゾン投与が細胞死を増加させることを示し、それ自体がこのアッセイにおいて細胞死の正のインダクターとして使用されることを示した。
図４は、ビヒクル、ＧＬ－０００１又はロシグリタゾンの存在下でのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞死に関する結果を示す。本発明者らは以前に、ロシグリタゾン投与が細胞死を増加させることを示し、それ自体がこのアッセイにおいて細胞死の正のインダクターとして使用されることを示した。
【0146】
この図から、ＧＬ－０００１は１０－６Ｍの高濃度では、ロシグリタゾンとは反対に細胞死を誘発しないことがわかる。
【0147】
３．ヒトＧＩＰ受容体とそれらのＩＣ５０における二重類似体の結合親和性。
本発明者らは、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２又は上記表１に開示された二重類似体ペプチドのヒトＧＩＰ受容体における結合親和性を決定した。各化合物について決定された対応するＩＣ５０は、以下の通りであった。
本発明者らは、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２又は上記表１に開示された二重類似体ペプチドのヒトＧＩＰ受容体における結合親和性を決定した。各化合物について決定された対応するＩＣ５０は、以下の通りであった。
【0148】
【表3】
【0149】
ＩＣ５０値から、試験された異なる類似体の効力は、ＧＬ－０００５＞ＧＬ－０００３＞ＧＬ－０００８＞［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２＞ＧＬ－０００７＞ＧＬ－０００１＞ＧＬ－０００２＞ＧＬ－０００６＞ＧＬ－０００９＞ＧＬ－０００４と見られた。
【0150】
４．ヒトＧＬＰ－２受容体とそれらのそれぞれのＩＣ５０における二重類似体の結合親和性。
本発明者らは、ヒトＧＬＰ－２受容体における［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２又は上記表１に開示された二重類似体ペプチドの結合親和性を測定した。各化合物について決定された対応するＩＣ５０は、以下の通りであった。
本発明者らは、ヒトＧＬＰ－２受容体における［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２又は上記表１に開示された二重類似体ペプチドの結合親和性を測定した。各化合物について決定された対応するＩＣ５０は、以下の通りであった。
【0151】
【表4】
【0152】
ＩＣ５０値から、試験された異なる類似体の効力は、ＧＬ－０００４＞［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２＞ＧＬ－０００１＞ＧＬ－０００７＞ＧＬ－０００６＞ＧＬ－０００８＞ＧＬ－０００５＞ＧＬ－０００２＞ＧＬ－０００３＞ＧＬ－０００９と見られた。
【0153】
５．インビトロでの破骨細胞形成に及ぼす二重類似体の影響とそれぞれのＩＣ５０。
本発明者らは、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は表１に開示される二重類似体ペプチドが、インビトロでのＲａｗ２６４．７細胞媒介性破骨細胞形成に及ぼす影響を決定した。
本発明者らは、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は表１に開示される二重類似体ペプチドが、インビトロでのＲａｗ２６４．７細胞媒介性破骨細胞形成に及ぼす影響を決定した。
【0154】
各化合物について決定された対応するＩＣ５０は、以下の通りであった。
【0155】
【表5】
【0156】
ＩＣ５０値から、試験された異なる類似体の効力は、ＧＬ－０００６＞ＧＬ－０００５＞ＧＬ－０００４＞ＧＬ－０００８＞ＧＬ－０００１＞［ＧＬ－０００１］＞［ＧＬＰ－２＞ＧＬ－０００７＞［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２＞ＧＬ－０００９＞ＧＬ－０００２＞ＧＬ－０００１－Ｔａｇ＞ＧＬ－０００３と見られた。
【0157】
６．インビトロでのコラーゲン成熟に及ぼす二重類似体の影響
図５～７は、表１に開示された［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は二重類似体ペプチドが、インビトロでのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１培養物中のコラーゲン成熟度に及ぼす影響を示す。点線は基礎コラーゲン成熟度に相当する。
図５～７は、表１に開示された［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２又は二重類似体ペプチドが、インビトロでのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１培養物中のコラーゲン成熟度に及ぼす影響を示す。点線は基礎コラーゲン成熟度に相当する。
【0158】
類似体のいくつかは二相性プロファイル、すなわちＧＬ－０００１－Ｔａｇ、ＧＬ－０００２、ＧＬ－０００４を示した。
【0159】
本発明者らは以前に、コラーゲンの最大成熟度が１００～２００ｐＭ［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－４２の濃度で得られることを示した（Mieczkowska et al. (2015) Bone 74:29-36このように、１００～２００ｐＭの濃度間の平均コラーゲン成熟度を各類似体について決定し、これらの分子の効力は、ＧＬ－０００７＞ＧＬ－０００１＞［ＧＬ－０００１］＞［ＧＬ－２＞ＧＬ－０００８＞ＧＬ－０００６及びＧＬ－０００９＞［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２＞ＧＬ－０００１－Ｔａｇ＞ＧＬ－０００２＞ＧＬ－０００４及びＧＬ－０００５＞ＧＬ－０００３であった。
【0160】
試験した各ペプチドで陽性の効果が観察されたが、本発明者らは、ペプチドＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７を特に興味深いペプチドとして同定した。インビトロでの破骨細胞形成とインビトロでのコラーゲン成熟に基づいて、ＧＬ－０００１とＧＬ－０００７は、各天然ペプチドより優れた効力を有する唯一の２つのペプチドであり、従って、以下の実験のために選択された。
【0161】
７．ＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７が体重に及ぼす影響
図８は、８週間の投与期間終了時の動物の体重を示したものである。ゾレドロン酸を注射した動物は、約１．３～１．５ｇの重量のＡＬＺＥＴポンプ移植を受けなかったことに注目するに値する。溶媒と比較して、いずれの投与も体重の有意な変化をもたらさなかった。
図８は、８週間の投与期間終了時の動物の体重を示したものである。ゾレドロン酸を注射した動物は、約１．３～１．５ｇの重量のＡＬＺＥＴポンプ移植を受けなかったことに注目するに値する。溶媒と比較して、いずれの投与も体重の有意な変化をもたらさなかった。
【0162】
８．皮質骨強度に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の影響
図９は、閉経後骨粗鬆症のモデルとしてのマウスにおける卵巣摘出誘発性骨喪失における虫垂骨格の皮質骨強度に関するデータを示す。卵巣摘出動物を、賦形剤、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７で処理した。閉経後骨粗鬆症の治療に最も使用される分子の１つであるゾレドロン酸を、単回静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後の陽性対照として使用した。
図９は、閉経後骨粗鬆症のモデルとしてのマウスにおける卵巣摘出誘発性骨喪失における虫垂骨格の皮質骨強度に関するデータを示す。卵巣摘出動物を、賦形剤、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００１、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日のＧＬ－０００７で処理した。閉経後骨粗鬆症の治療に最も使用される分子の１つであるゾレドロン酸を、単回静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後の陽性対照として使用した。
【0163】
二重類似体又はゾレドロン酸はいずれも最終荷重、降伏荷重又は剛性の修飾に強力ではなかったが、ＧＬ－０００１は最終変位（３４％，ｐ＝０．０４７），降伏後変位（７０％，ｐ＝０．０３８）及び仕事対骨折（３７％，ｐ＝０．０２２）を有意に増加させることができ、後者は骨折に必要なエネルギーを表す。ワーク・トゥ・フラクチャーが高いほど、より抵抗性の高い骨を意味する。１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日でのＧＬ－０００７は最終変位（３３％，ｐ＝０．０５４）と収量後変位（６２％，ｐ＝０．０７４）を増加させ，最終的に仕事－骨折における有意な増加をもたらした（３３％，ｐ＝０．０４９）。
【0164】
９．皮質骨微細構造に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の作用。
図１０－１１は、卵巣摘出マウスにおける虫垂骨格の皮質骨微細構造に関するデータを示している。動物を溶媒、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日 ＧＬ－０００１、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日 ＧＬ－０００７、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７又はゾレドロン酸（１００μｇ／ｋｇ ｉｖ）で処理した。遠位成長板の４ｍｍ上の大腿骨で皮質骨微細構造を調べた。ビヒクル、ダブルアナログ、ゾレドロン酸はいずれも皮質骨微細構造に影響を及ぼさなかった。
図１０－１１は、卵巣摘出マウスにおける虫垂骨格の皮質骨微細構造に関するデータを示している。動物を溶媒、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日 ＧＬ－０００１、２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日 ＧＬ－０００７、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００７又はゾレドロン酸（１００μｇ／ｋｇ ｉｖ）で処理した。遠位成長板の４ｍｍ上の大腿骨で皮質骨微細構造を調べた。ビヒクル、ダブルアナログ、ゾレドロン酸はいずれも皮質骨微細構造に影響を及ぼさなかった。
【0165】
１０．骨梁強度及び微細構造に対するＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の効果
図１２－１３は、体軸骨格、より正確には腰椎における骨梁の特徴に関するデータを報告している。第２腰椎の骨梁強度を圧迫試験により評価した（図１２）。賦形剤投与動物と比較して、ＧＬ－０００１、ＧＬ－０００７は、両方の濃度及びゾレドロン酸で骨剛性を有意に低下させた。圧迫試験は破壊的であるため、第５腰椎で小柱の微細構造が研究された（図１３）。予想通り、ゾレドロン酸は骨梁骨量（ＢＶ／ＴＶ）を１５％増加させ（ｐ＝０．０１３）、骨梁数を１２％増加させた（ｐ＝０．０３６）。２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の濃度のＧＬ－０００７は、小柱間隔を１７％減少させたが、わずかではあるが有意な減少（ｐ＝０．００９）をもたらした。
図１２－１３は、体軸骨格、より正確には腰椎における骨梁の特徴に関するデータを報告している。第２腰椎の骨梁強度を圧迫試験により評価した（図１２）。賦形剤投与動物と比較して、ＧＬ－０００１、ＧＬ－０００７は、両方の濃度及びゾレドロン酸で骨剛性を有意に低下させた。圧迫試験は破壊的であるため、第５腰椎で小柱の微細構造が研究された（図１３）。予想通り、ゾレドロン酸は骨梁骨量（ＢＶ／ＴＶ）を１５％増加させ（ｐ＝０．０１３）、骨梁数を１２％増加させた（ｐ＝０．０３６）。２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の濃度のＧＬ－０００７は、小柱間隔を１７％減少させたが、わずかではあるが有意な減少（ｐ＝０．００９）をもたらした。
【0166】
１１．骨基質組成に及ぼすＧＬ－０００１又はＧＬ－０００７の影響
図１４－１５は、二重アナログ投与が虫垂骨の皮質骨の組織材料特性に及ぼす影響を調べたものである。溶媒と比較して、ＧＬ－０００１は平均コラーゲン成熟度（１０％，ｐ＝０．０１７）、コラーゲン成熟度不均一性（２８％，ｐ＝０．００８）、酸性リン酸含量不均一性（２１％、ｐ＝０．０１６）を有意に増加させ、平均リン酸／アミド比を減少させた（６％，ｐ＝０．０１６）。１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日でのＧＬ－０００７は平均リン酸／アミド比を有意に低下させ（５％、ｐ＝０．０３１）、酸性リン酸含量不均一性を増加させた（１８％、ｐ＝０．０４４）。ゾレドロン酸は、ミネラル結晶度の不均一性のみが有意に増大したので（２１％、ｐ＝０．００２）、わずかな効果を示した。
図１４－１５は、二重アナログ投与が虫垂骨の皮質骨の組織材料特性に及ぼす影響を調べたものである。溶媒と比較して、ＧＬ－０００１は平均コラーゲン成熟度（１０％，ｐ＝０．０１７）、コラーゲン成熟度不均一性（２８％，ｐ＝０．００８）、酸性リン酸含量不均一性（２１％、ｐ＝０．０１６）を有意に増加させ、平均リン酸／アミド比を減少させた（６％，ｐ＝０．０１６）。１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日でのＧＬ－０００７は平均リン酸／アミド比を有意に低下させ（５％、ｐ＝０．０３１）、酸性リン酸含量不均一性を増加させた（１８％、ｐ＝０．０４４）。ゾレドロン酸は、ミネラル結晶度の不均一性のみが有意に増大したので（２１％、ｐ＝０．００２）、わずかな効果を示した。
【0167】
１２．肝臓と膵臓の構造の組織学的調査
本発明者らは、肝臓及び膵臓において組織学的分析を行った。肝臓及び膵臓を処理、包埋、切片化、染色し、賦形剤２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００１又は２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ ＧＬ－０００７の存在下で浮腫、炎症又は壊死のあらゆる徴候について検査した。形態学的変化又は壊死の徴候は３群間で観察されなかった。
本発明者らは、肝臓及び膵臓において組織学的分析を行った。肝臓及び膵臓を処理、包埋、切片化、染色し、賦形剤２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日ＧＬ－０００１又は２５ｎｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ ＧＬ－０００７の存在下で浮腫、炎症又は壊死のあらゆる徴候について検査した。形態学的変化又は壊死の徴候は３群間で観察されなかった。
【0168】
１３．ＧＩＰｒ及びＧＬＰ－２ｒの活性化
本発明者らは、ビヒクル、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２又はＧＬ－０００１に応答するｃＡＭＰレベルの上昇を研究した。ヒトＧＩＰｒのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２及びＧＬ－０００１は、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させたが、ビヒクル又は［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２は増加させなかった（図１６）。ヒトＧＬＰ－２ｒのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２及びＧＬ－０００１は、ビヒクル又は［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２ではなく、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させた（図１７）。ヒトＧＩＰｒ及びヒトＧＬＰ－２ｒと同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２及びＧＬ－０００１は、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させたが、ビヒクルでは増加させなかった（図１８）。同時トランスフェクションされた細胞におけるｃＡＭＰ上昇の大きさは、各天然ペプチドよりもＧＬ－０００１で大きかったことに注目すべきである。
本発明者らは、ビヒクル、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２又はＧＬ－０００１に応答するｃＡＭＰレベルの上昇を研究した。ヒトＧＩＰｒのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２及びＧＬ－０００１は、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させたが、ビヒクル又は［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２は増加させなかった（図１６）。ヒトＧＬＰ－２ｒのみをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２及びＧＬ－０００１は、ビヒクル又は［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２ではなく、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させた（図１７）。ヒトＧＩＰｒ及びヒトＧＬＰ－２ｒと同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、［Ｄ－Ａｌａ２］ＧＩＰ１－３０ＮＨ２、［Ｇｌｙ２］ＧＬＰ－２及びＧＬ－０００１は、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させたが、ビヒクルでは増加させなかった（図１８）。同時トランスフェクションされた細胞におけるｃＡＭＰ上昇の大きさは、各天然ペプチドよりもＧＬ－０００１で大きかったことに注目すべきである。
【0169】
結論
これらすべてのデータは、本発明のペプチドが、骨芽細胞により産生されるコラーゲンマトリックスの酵素的架橋を、インビトロ及びインビボにおいて、各天然ペプチドよりも高いレベルで増加させ、生成された破骨細胞の数を、各天然ペプチドよりも重要な方法で減少させ、骨折に対する骨抵抗性を、ゴールドスタンダードのゾレドロン酸よりも良好に増加させ、従って、骨障害を治療するための強力な薬剤であることを確認する。
これらすべてのデータは、本発明のペプチドが、骨芽細胞により産生されるコラーゲンマトリックスの酵素的架橋を、インビトロ及びインビボにおいて、各天然ペプチドよりも高いレベルで増加させ、生成された破骨細胞の数を、各天然ペプチドよりも重要な方法で減少させ、骨折に対する骨抵抗性を、ゴールドスタンダードのゾレドロン酸よりも良好に増加させ、従って、骨障害を治療するための強力な薬剤であることを確認する。
【0170】
実施例３：本発明のペプチドと先行技術のペプチドとの比較
本研究の目的は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体、特にＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７、ならびに特許出願ＷＯ２０１８／０６９４４２からの３つのペプチド、すなわち、配列ＨＡＤＧＴＦＩＳＤＹＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１４）のペプチドＣｏ－３、配列ＨＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１５）のペプチドＣｏ－７、及び配列ＨＡＤＧＴＦＩＳＤＹＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＧＫＫ（配列番号１６）のペプチドＣｏ－１９の可能性を比較することであった。
本研究の目的は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体、特にＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７、ならびに特許出願ＷＯ２０１８／０６９４４２からの３つのペプチド、すなわち、配列ＨＡＤＧＴＦＩＳＤＹＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１４）のペプチドＣｏ－３、配列ＨＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＩＴＤ（配列番号１５）のペプチドＣｏ－７、及び配列ＨＡＤＧＴＦＩＳＤＹＳＴＩＬＤＮＬＡＡＲＤＦＩＮＷＬＩＱＴＫＧＫＫ（配列番号１６）のペプチドＣｏ－１９の可能性を比較することであった。
【0171】
ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９は、ＷＯ２０１８／０６９４４２において二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体として引用された。しかしながら、骨芽細胞による骨マトリックスの沈着及び成熟（すなわち、コラーゲン成熟）に関するデータは提供されなかった。このプロトコールにより、本発明は、相乗的、相加的又は拮抗的なＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の作用を評価することが可能となった。
【0172】
材料及び方法
１．ペプチド配列
すべてのペプチドは、フランス、ボインズのＧｅｎｅＣｕｓｔによるＦｍｏｃ合成によって作製された。高速液体クロマトグラフィーと質量分析により、純度とペプチド組成を検証した。ペプチド配列、ロット番号及び純度を下の表５に示す。
１．ペプチド配列
すべてのペプチドは、フランス、ボインズのＧｅｎｅＣｕｓｔによるＦｍｏｃ合成によって作製された。高速液体クロマトグラフィーと質量分析により、純度とペプチド組成を検証した。ペプチド配列、ロット番号及び純度を下の表５に示す。
【0173】
【表6】
【0174】
２．配列相同性
本発明のペプチドとＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されたペプチドとの間の相同性のパーセンテージを決定するために、ペプチド配列をＭａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂ（ｎｗａｌｉｇｎ機能）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムと整列させた。
本発明のペプチドとＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されたペプチドとの間の相同性のパーセンテージを決定するために、ペプチド配列をＭａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂ（ｎｗａｌｉｇｎ機能）におけるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムと整列させた。
【0175】
３．データ
簡単に説明すると、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウシ血清（ＢＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したα－ＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で富化した加湿雰囲気中で増殖させ、増殖させた。
簡単に説明すると、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１サブクローン４細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％ウシ血清（ＢＣＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したα－ＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で富化した加湿雰囲気中で増殖させ、増殖させた。
【0176】
コラーゲン成熟度アッセイのために、細胞を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで分離し、１．５×１０４細胞／ｃｍ３の密度で平板培養し、５％ＦＢＳ、５％ＢＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したα－ＭＥＭ中でコンフルエンスまで増殖させた。コンフルエンス時に、培養培地を、５％ＦＢＳ、５％ＢＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸及び種々の濃度のＧＩＰ、ＧＬＰ－２又は二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体を添加したα－ＭＥＭを含む分化培地に置き換えた。この日を１日目とみなした。分化培地は２日ごとに補充した。１４日目に、骨芽細胞培養物を、０．１％トリトンＸ１００を含有する０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で４時間、軌道振盪器上でインキュベーションすることにより脱細胞化した。培養物をミリＱ水で少なくとも６回すすぎ、無水エタノール中で固定し、培養皿から取り出し、ＢａＦ２ウィンドウに移し、そこで風乾した。得られたフーリエ変換赤外スペクトルと市販のコラーゲンのスペクトルを比較することにより、コラーゲン細胞外マトリックスの完全性を検証した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｖｅｒｔｅｘ ７０分光計（Ｂｒｕｋｅｒ ｏｐｔｉｃｓ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスペクトル分析を行い、標準的な単一元素のＭｅｒｃｕｒｙ Ｃａｄｍｉｕｍ Ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ（ＭＣＴ）検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ３０００赤外顕微鏡とインターフェースした。赤外分光光度計の校正は、ポリスチレンフィルム標準（Ｂｒｕｋｅｒ光学系）を用いて週１回行う。赤外スペクトルは４ｃｍ－１の分解能で記録され、伝送モードでは平均３２スキャンであった。背景スペクトル画像を、各実験の開始時と終了時に同じＢａＦ２ウィンドウから同一条件下で収集し、装置の安定性を確保した。各条件について少なくとも５つのスペクトルを収集し、Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１６ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）の実験室製ルーチンスクリプト（バージョン２．０）を用いて分析した。コラーゲン成熟度指数は、アミドＩピークの１６６０ｃｍ－１及び１６９０ｃｍ－１に位置するそれぞれのサブバンドを用いて、成熟３価及び未成熟２価コラーゲン架橋の相対比として決定した。
【0177】
ＧＩＰ及びＧＬＰ－２データセットについては、本発明者らは、以前に収集及び分析されたコラーゲン成熟度データを使用した。
【0178】
４．相乗作用の評価
まず、対照培養物、すなわち二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体非存在下で得られたコラーゲン成熟度を平均し、全データセットに差し引いた。二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の投与の効果を決定するために、変換されたデータセットを未処理培養物の平均値で割った。ペプチドの各濃度について、平均、ＳＤ及び事象数を計算した。その後、これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０）にエクスポートし、さらなる分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ解析は、（１）薬物濃度の対数（濃度）での変換、（２）ガウス分布、刺激された用量反応（４つのパラメータ）、２つのガウス関数又は６次多項式関数の和、（３）薬物ごとのＥＣ５０及びＥｍａｘの推定から構成された。
まず、対照培養物、すなわち二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体非存在下で得られたコラーゲン成熟度を平均し、全データセットに差し引いた。二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の投与の効果を決定するために、変換されたデータセットを未処理培養物の平均値で割った。ペプチドの各濃度について、平均、ＳＤ及び事象数を計算した。その後、これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０）にエクスポートし、さらなる分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ解析は、（１）薬物濃度の対数（濃度）での変換、（２）ガウス分布、刺激された用量反応（４つのパラメータ）、２つのガウス関数又は６次多項式関数の和、（３）薬物ごとのＥＣ５０及びＥｍａｘの推定から構成された。
【0179】
さらに、相乗効果を検討するために、本発明者らは、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２に遭遇するＥＣ５０の固定用量、ならびにＥＣ５０ ＧＩＰ／ＧＬＰ－２の０．２、０．４、０．８、０．９、１．０、１．２及び１．５倍のＧＩＰ／ＧＬＰ－２の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の効果を推定した。各濃度で、Ｃｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙモデル（Chou & Talalay (1983) Trends Pharmacol Sci 4: 450-454）を用いて、以下のように組み合わせ指数を計算した。
ＣＩ＝（ＥＧＩＰ＋ＥＧＬＰ２－（ＥＧＩＰ×ＥＧＬＰ２））／ＥＤＡ
ここで、ＥＧＩＰ、ＥＧＬＰ２及びＥＤＡは、それぞれＧＩＰ単独、ＧＬＰ－２単独又は二重アゴニストで観察された効果を表す。本発明者らは以前に、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２はコラーゲン成熟度に対して異なる最大効果を示したが、それぞれのＥＣ５０はほぼ同じであることを観察した。
ＣＩ＝（ＥＧＩＰ＋ＥＧＬＰ２－（ＥＧＩＰ×ＥＧＬＰ２））／ＥＤＡ
ここで、ＥＧＩＰ、ＥＧＬＰ２及びＥＤＡは、それぞれＧＩＰ単独、ＧＬＰ－２単独又は二重アゴニストで観察された効果を表す。本発明者らは以前に、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２はコラーゲン成熟度に対して異なる最大効果を示したが、それぞれのＥＣ５０はほぼ同じであることを観察した。
【0180】
５．統計解析
ＥＣ５０と１．５ｘＥＣ５０の組み合わせ指数の差を、両側ｔ検定を用いて１．０±０．１５の値として定義した加算性と比較した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。データは平均値±標準偏差で表す。
ＥＣ５０と１．５ｘＥＣ５０の組み合わせ指数の差を、両側ｔ検定を用いて１．０±０．１５の値として定義した加算性と比較した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。データは平均値±標準偏差で表す。
【0181】
結果
１．本発明のペプチドとペプチドとの間の配列相同性は、ＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されている。
配列相同性のパーセンテージはコンピュータ化され、下記の表６に示されている。ＧＬ－０００１とＧＬ－０００７との間の配列アラインメント、及びＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されているペプチドも下記の表６に示されている。
１．本発明のペプチドとペプチドとの間の配列相同性は、ＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されている。
配列相同性のパーセンテージはコンピュータ化され、下記の表６に示されている。ＧＬ－０００１とＧＬ－０００７との間の配列アラインメント、及びＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されているペプチドも下記の表６に示されている。
【0182】
ＷＯ２０１８／０６９４４２由来のペプチドＣｏ－７は、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７の両方との最大配列相同性を示す。データは、アルカリホスファターゼ上のペプチドＣｏ－３及びＣｏ－１９を有するＷＯ２０１８／０６９４４２に提供されたので、本発明者らは、さらなる比較のためにこれら２つのペプチドも選択した。
【0183】
【表7】
【0184】
本発明のペプチドとＷＯ２０１８／０６９４４２ペプチドのペプチドとの間の同一位置におけるアミノ酸組成（同一又は同一クラス）の相違を図１９に要約した。
【0185】
ＧＬ－０００１では、ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９との主な相違点は、７、１２、１３、３１、３２及び３３位である。ＧＬ－０００７では、ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９との主な相違点は、７、１２、１３、３１、３２及び３３位である。
【0186】
２．ペプチド濃度の関数としてのコラーゲン成熟度
３価成熟／２価成熟コラーゲン架橋の比として得られたコラーゲン成熟指数を細胞外マトリックス中で測定した。図２０は、本発明のペプチド及びＷＯ２０１８／０６９４４２のペプチドがこのパラメーターに及ぼす影響を表す。
３価成熟／２価成熟コラーゲン架橋の比として得られたコラーゲン成熟指数を細胞外マトリックス中で測定した。図２０は、本発明のペプチド及びＷＯ２０１８／０６９４４２のペプチドがこのパラメーターに及ぼす影響を表す。
【0187】
予想されたように、かつ以前のデータを確認すると、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７は、ペプチドの非存在下で観察された指標（点線）を上回るコラーゲン成熟度を増加させた。興味深いことに、ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９の効果は、コラーゲン成熟指数を上昇させるのに非常に適度であった。
【0188】
３．コラーゲン成熟度に対するＧＩＰ／ＧＬＰ－２二重類似体の用量－効果曲線
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２アナログについて用量－効果曲線をプロットした。各ダブルＧＩＰ／ＧＬＰ－２アナログの最適モデルを表７に示す。
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２アナログについて用量－効果曲線をプロットした。各ダブルＧＩＰ／ＧＬＰ－２アナログの最適モデルを表７に示す。
【0189】
【表8】
【0190】
４．コラーゲン成熟度に対するＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体倍加ＥＣ５０
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体のＥＣ５０を用量－効果曲線から同定した。相互ＥＣ５０を表８に示す。
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体のＥＣ５０を用量－効果曲線から同定した。相互ＥＣ５０を表８に示す。
【0191】
【表9】
【0192】
すでに述べたように、［Ｄ－Ａｌａ２］－ＧＩＰ１－３０及び［Ｇｌｙ２］－ＧＬＰ－２は同様のＥＣ５０を示し、したがって結合指数の決定には平均ＥＣ５０が６９ｐＭであった。興味深いことに、すべての二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体は同じ範囲でＥＣ５０を示し、同じ濃度で最大効果の半分を達成することができることを示唆している。しかし、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７はＷＯ２０１８／０６９４４２ペプチドで観察された最大効果のほぼ２倍であることから、最大効果（Ｅｍａｘ）の項において明確な差異が観察された。
【0193】
５．コラーゲン成熟度に対するＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の２種類の組み合わせ指数
Ｃｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙモデルに基づいて、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２の平均ＥＣ５０の０．２倍、０．４倍、０．８倍、０．９倍、１．０倍、１．２倍、及び１．５倍、すなわち１４、２７、５４、６１、６９、８２倍、及び１００ｐＭで組み合わせ指数を算出した。図２１は、用量に対するＣＩの進展を示すために、濃度に対する組み合わせインデックスをプロットしたものである。
Ｃｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙモデルに基づいて、ＧＩＰ及びＧＬＰ－２の平均ＥＣ５０の０．２倍、０．４倍、０．８倍、０．９倍、１．０倍、１．２倍、及び１．５倍、すなわち１４、２７、５４、６１、６９、８２倍、及び１００ｐＭで組み合わせ指数を算出した。図２１は、用量に対するＣＩの進展を示すために、濃度に対する組み合わせインデックスをプロットしたものである。
【0194】
表９及び表１０は、ＥＣ５０及び１．５×ＥＣ５０における各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体のそれぞれの組み合わせ指数を示す。
【0195】
【表10】
【0196】
【表11】
【0197】
ＣＩ＞１０：非常に強い拮抗作用；ＣＩ３．３－１０：強い拮抗作用；ＣＩ１．４５－３．３：拮抗作用；ＣＩ１．１５－１．４５：中等度の拮抗作用；ＣＩ０．８５－１．１５：相加作用；ＣＩ０．８５－０．６５：中等度の相乗作用；ＣＩ０．３－０．６５：相乗作用；ＣＩ０．１－０．３：強い相乗作用；ＣＩ＜０．１：非常に強い相乗作用。
【0198】
データは、５～１３回の実験の平均±ＳＤとして提示されている。両側ｔ検定を用いて、ＣＩが加法性（１．０±０．１５）と比較して有意差があるかどうかを評価した。
【0199】
Ｌ－０００１及びＧＬ－０００７は、６９ｐＭ及び１００ｐＭで、強い相乗作用を示唆する組み合わせ指数を示した。以前に、本発明者らは、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７の相乗作用を支持する結合指数と同様の挙動を既に示した。本研究は、以前に得られたデータと一致している。
【0200】
興味深いことに、Ｃｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９ペプチドのいずれも相乗特性を示さなかったが、濃度に依存して相加的又は拮抗性を示した。
【0201】
ＥＣ５０と１．５×ＥＣ５０の組み合わせ指数に基づくと、ＧＬ－０００１とＧＬ－０００７のみが相乗作用の良好な候補であると思われる。
【0202】
結論
本研究は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体及びＷＯ２０１８／０６９４４２特許出願に開示されたペプチドの効果を比較した。
本研究は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体及びＷＯ２０１８／０６９４４２特許出願に開示されたペプチドの効果を比較した。
【0203】
本発明のペプチドであるＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７は、コラーゲン成熟及び破骨細胞形成に対する作用の観点から、それらが最良の妥協点を表すものとして選択された。ＷＯ２０１８／０６９４４２ペプチドとの配列アラインメントは、ペプチドＣｏ－７がＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７に最も近いペプチドであることを示した。アルカリホスファターゼに関するデータは、ペプチドＣｏ－３及びペプチドＣｏ－１９を用いてＷＯ２０１８／０６９４４２に提供されたので、本発明者らは、一方でＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７の作用を、他方でＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９のペプチドと頭部対頭部で比較することを決定した。すべてのペプチドは同様のＥＣ５０を示したが、最大効果の大きさに明らかな差があった。これは、同じ用量のペプチドについて、コラーゲン成熟度に対する効果は、本発明のペプチドにより大きくなるであろうことを意味する。さらに、二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の背後にある薬理学的メカニズムを解明し、本発明のペプチドは強い相乗作用を示したが、ＷＯ２０１８／０６９４４２ペプチドは相加作用又は拮抗作用様式を示した。
【0204】
実施例４：本発明のペプチドと先行技術のペプチドとの比較
本研究の目的は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体、すなわちＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７、ならびに特許出願ＷＯ２０１８／０６９４４２からの３つのペプチド、すなわち、インビトロでの破骨細胞形成に関するペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９の可能性を比較することであった。
本研究の目的は、本発明の二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体、すなわちＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７、ならびに特許出願ＷＯ２０１８／０６９４４２からの３つのペプチド、すなわち、インビトロでの破骨細胞形成に関するペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９の可能性を比較することであった。
【0205】
材料及び方法
１．ペプチド配列
ペプチドは実施例３に開示されたとおりであった。
１．ペプチド配列
ペプチドは実施例３に開示されたとおりであった。
【0206】
２．細胞及び増殖方法
マウス２６４．７細胞を、３７℃で５％ＣＯ２を濃縮した加湿雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ－Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ－Ｇｉｂｃｏ）を含む増殖培地中で増殖・拡大し、生２６４．７細胞を解凍後の第１継代を継代１とみなした。細胞を継代８まで使用した。
マウス２６４．７細胞を、３７℃で５％ＣＯ２を濃縮した加湿雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ－Ｌｏｎｚａ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ－Ｇｉｂｃｏ）を含む増殖培地中で増殖・拡大し、生２６４．７細胞を解凍後の第１継代を継代１とみなした。細胞を継代８まで使用した。
【0207】
３．破骨細胞形成試験
マウス原料２６４．７細胞をプラスチック皿から取り出し、１．２５×１０４細胞／ｃｍ３の密度でプレートし、１０ｎｇ／ｍｌ可溶性マウスＲＡＮＫＬ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ、参考文献４６２－ＴＥＣ－０１０）で富化した増殖培地中で増殖させた。１１０時間後、細胞をホルマリン（ＰＢＳ緩衝液中１０％）で１０分間固定し、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡｃＰ）染色前に蒸留水中で洗浄した。
マウス原料２６４．７細胞をプラスチック皿から取り出し、１．２５×１０４細胞／ｃｍ３の密度でプレートし、１０ｎｇ／ｍｌ可溶性マウスＲＡＮＫＬ（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ、参考文献４６２－ＴＥＣ－０１０）で富化した増殖培地中で増殖させた。１１０時間後、細胞をホルマリン（ＰＢＳ緩衝液中１０％）で１０分間固定し、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡｃＰ）染色前に蒸留水中で洗浄した。
【0208】
ＴＲＡｃＰは、基質としてナフトールＡＳ－ＢＩ－リン酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び暗所で３７℃で９０分間ジアゾニウム塩としてファストバイオレットＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた同時カップリング反応により組織化学的に明らかにした。培養物を蒸留水中で３回すすぎ、残留活性を４％ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間阻害した。次いで、細胞を蒸留水中でリンスし、乾燥させた。３個以上の核を有するＴＲＡｃＰ陽性細胞を破骨細胞として同定した。新たに発生した破骨細胞の数は、治療介入について盲検化された組織学者による光学顕微鏡検査を用いて評価した。本例では、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０及び（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２で以前に取得したデータセットを、比較及び組み合わせインデックス計算のために使用した。
【0209】
４．データの評価
２倍のＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体で得られた破骨細胞数は、ペプチド非存在下（ＲＡＮＫＬ単独）で観察された破骨細胞数のパーセンテージとして最初に報告された。ペプチドの各濃度について、平均、ＳＤ及び事象数を計算した。その後、これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０）にエクスポートし、さらなる分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ解析は、（１）ｌｏｇ（濃度）における薬物濃度の変換、（２）３パラメータＬｏｇ（阻害剤）対応答モデル（トップ制約１００）との曲線適合、（３）各薬物のＩＣ５０の推定で構成された。
２倍のＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体で得られた破骨細胞数は、ペプチド非存在下（ＲＡＮＫＬ単独）で観察された破骨細胞数のパーセンテージとして最初に報告された。ペプチドの各濃度について、平均、ＳＤ及び事象数を計算した。その後、これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０）にエクスポートし、さらなる分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ解析は、（１）ｌｏｇ（濃度）における薬物濃度の変換、（２）３パラメータＬｏｇ（阻害剤）対応答モデル（トップ制約１００）との曲線適合、（３）各薬物のＩＣ５０の推定で構成された。
【0210】
さらに、相乗効果を検討するために、本発明者らは、破骨細胞形成のパーセンテージを１００に減じることにより、破骨細胞形成データを抑制効果に変換した。次いで、これらのデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにエクスポートし、（１）ｌｏｇ（濃度）における薬物濃度の変化、（２）３パラメータＬｏｇ（アゴニスト）対応答モデル（下限０）による曲線フィッティング、（３）各薬物のＥＣ５０とＥｍａｘの推定からなる解析を行った。ＧＩＰ及びＧＬＰ－２（３６．８ｐＭ）に遭遇したＥＣ５０での二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の効果は、以前に実施された実験から使用され、組み合わせ指数は、以下のようにＣｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙ（Chou & Talalay (1983) Trends Pharmacol Sci 4: 450-454）に従って計算された。：
ＣＩ＝（ＥＧＩＰ＋ＥＧＬＰ２－（ＥＧＩＰ×ＥＧＬＰ２））／ＥＤＡ
ここで、ＥＧＩＰ、ＥＧＬＰ２及びＥＤＡは、それぞれＧＩＰ単独、ＧＬＰ－２単独又は二重アゴニストで観察された効果を表す。
ＣＩ＝（ＥＧＩＰ＋ＥＧＬＰ２－（ＥＧＩＰ×ＥＧＬＰ２））／ＥＤＡ
ここで、ＥＧＩＰ、ＥＧＬＰ２及びＥＤＡは、それぞれＧＩＰ単独、ＧＬＰ－２単独又は二重アゴニストで観察された効果を表す。
【0211】
結果
１．破骨細胞形成
すべてのペプチドは、最高濃度で新たに生成された破骨細胞の量を減少させた。破骨細胞応答の曲線フィッティングをすべてのペプチドについて図２２に示す。ＩＣ５０は曲線フィッティングから推定し、表１１に示した。
１．破骨細胞形成
すべてのペプチドは、最高濃度で新たに生成された破骨細胞の量を減少させた。破骨細胞応答の曲線フィッティングをすべてのペプチドについて図２２に示す。ＩＣ５０は曲線フィッティングから推定し、表１１に示した。
【0212】
【表12】
【0213】
ＮＤ：最大効果が５０％阻害に達しなかったため、測定しなかった。＊：これまでの実験から決定された。
【0214】
興味深いことに、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０と（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２は同様のＩＣ５０を示した。両側ｔ検定によりこの所見が確認された。このように、３６．８ｐＭの中間ＩＣ５０を用いて、二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の「相乗」特性を調べた。
【0215】
２．ＧＩＰ／ＧＬＰ－２二重類似体の破骨細胞形成及び薬理学的機序に対する用量反応阻害作用
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の応答を評価するために、本発明者らは破骨細胞形成阻害のパーセンテージとしてデータを変換した。次いで、データを曲線フィットさせ、各曲線フィッティングのＲ２値を表１２に示す。
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体の応答を評価するために、本発明者らは破骨細胞形成阻害のパーセンテージとしてデータを変換した。次いで、データを曲線フィットさせ、各曲線フィッティングのＲ２値を表１２に示す。
【0216】
【表13】
【0217】
各二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２アナログについて用量－効果曲線をプロットし、図２３に示す。ＥＣ５０及び最大阻害作用（Ｅｍａｘ）は、それぞれの二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体について計算され、表１３に示されている。
【0218】
【表14】
【0219】
データは、５つの個々の実験の平均±ＳＤを表す。＊以前の実験で得られたデータ。
【0220】
二重ＧＩＰ／ＧＬＰ－２類似体で観察された破骨細胞応答が、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０と（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２の両方の関節投与と同等か、より高いか、より低いかを決定することは興味深いと思われた。この疑問に答えるために、Ｃｈｏｕ ＆ Ｔａｌａｌａｙによる結合指数が計算され、表１４に報告されている。さらに、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０及び（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２のＥＣ５０における結合指数を図２４にプロットした。
【0221】
【表15】
【0222】
ＣＩ＞１０：非常に強い拮抗作用；ＣＩ３．３－１０：強い拮抗作用；ＣＩ１．４５－３．３：拮抗作用；ＣＩ１．１５－１．４５中等度の拮抗作用；ＣＩ０．８５－１．１５：相加作用；ＣＩ０．８５－０．６５：中等度の相乗作用；ＣＩ０．３－０．６５：相乗作用；ＣＩ０．１－０．３：強い相乗作用；ＣＩ＜０．１：非常に強い相乗作用。
【0223】
両側ｔ検定を用いて、ＣＩが加法性（１．０±０．１５）と比較して有意差があるかどうかを評価した。
【0224】
結論
本研究は、本発明のペプチド、特にＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７が、従来技術のペプチドよりも低いＥＣ５０を示したことを示す。このことは、低用量のＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７を用いて、破骨細胞形成を５０％阻害することができることを示唆している。さらに、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７のＥｍａｘ値は、両ペプチドが（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２単独よりも高い破骨細胞生成の８５％以上の抑制を達成することを示した。ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７の作用の背後にある薬理学的機序は、中等度の相乗作用から相加作用までの範囲である。興味深いことに、ＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されたペプチド、すなわち、ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９は、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０又は（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２単独と比較して、等しいか又はより高いＥＣ５０を示し、これは、同じ用量又はより高い用量が、破骨細胞形成の５０％を阻害するために必要であることを示唆する。さらに、これら３つのペプチドで遭遇する最大の阻害効果はせいぜい約６２．４％であり、（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２又は（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０単独で観察された効果よりも低かった。さらに、これら３つのペプチドの薬理学的作用様式は、拮抗作用から非常に強い拮抗作用までの範囲に及んだ。
本研究は、本発明のペプチド、特にＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７が、従来技術のペプチドよりも低いＥＣ５０を示したことを示す。このことは、低用量のＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７を用いて、破骨細胞形成を５０％阻害することができることを示唆している。さらに、ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７のＥｍａｘ値は、両ペプチドが（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２単独よりも高い破骨細胞生成の８５％以上の抑制を達成することを示した。ＧＬ－０００１及びＧＬ－０００７の作用の背後にある薬理学的機序は、中等度の相乗作用から相加作用までの範囲である。興味深いことに、ＷＯ２０１８／０６９４４２に開示されたペプチド、すなわち、ペプチドＣｏ－３、Ｃｏ－７及びＣｏ－１９は、（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０又は（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２単独と比較して、等しいか又はより高いＥＣ５０を示し、これは、同じ用量又はより高い用量が、破骨細胞形成の５０％を阻害するために必要であることを示唆する。さらに、これら３つのペプチドで遭遇する最大の阻害効果はせいぜい約６２．４％であり、（Ｇｌｙ２）ＧＬＰ－２又は（Ｄ－Ａｌａ２）ＧＩＰ１－３０単独で観察された効果よりも低かった。さらに、これら３つのペプチドの薬理学的作用様式は、拮抗作用から非常に強い拮抗作用までの範囲に及んだ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】