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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-20
(45)【発行日】2024-06-28
(54)【発明の名称】生産効率を向上させる線毛無し大腸菌の構築及び使用
(51)【国際特許分類】
C12P 1/04 20060101AFI20240621BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240621BHJP
C12P 7/62 20220101ALI20240621BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
C12P1/04 Z
C12N1/21
C12P7/62
C12P13/08 C
C12N1/20 A
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022575251
(86)(22)【出願日】2021-07-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-22
(86)【国際出願番号】 CN2021108590
(87)【国際公開番号】W WO2022151700
(87)【国際公開日】2022-07-21
【審査請求日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】202110053059.7
(32)【優先日】2021-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】514262886
【氏名又は名称】江南大学
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】王小元
(72)【発明者】
【氏名】喬君
(72)【発明者】
【氏名】檀▲しん▼
(72)【発明者】
【氏名】任鴻宇
(72)【発明者】
【氏名】呉錚
(72)【発明者】
【氏名】胡暁清
(72)【発明者】
【氏名】李▲いぇ▼
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１０６６９７０９（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９５７６１９８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１００５５２０５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９８５２５７２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１３９２２３１（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２２１２５０１（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０４８６２３２９（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／０４
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｐ ７／６２
Ｃ１２Ｐ １３／０８
Ｃ１２Ｎ １／２０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群をノックアウトすることを含む、大腸菌の増殖を促進し且つその発酵生成物の収量を増加する方法であって、前記線毛遺伝子群は、ｙａｇＶ－Ｚ、ｇｌｔＦ－ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ－Ｈ、ｓｆｍＡ－Ｆ、ｙｃｂＱ－Ｆ、ｙｄｅＱ－Ｔ、ｙｒａＨ－Ｋ、ｙａｄＣ－Ｎ、ｙｅｈＡ－Ｄ、ｙｂｇＯ－Ｄ、ｙｆｃＯ－Ｖ及びｙｇｉＬ－Ｉであるか、又は
ｙａｇＶ－Ｚ、ｇｌｔＦ－ｙｈｃＦ、ｓｆｍＡ－Ｆ、ｙｃｂＱ－Ｆ、ｙｄｅＱ－Ｔ、ｙｒａＨ－Ｋ、ｙａｄＣ－Ｎ、ｙｅｈＡ－Ｄ、ｙｂｇＯ－Ｄ、ｙｆｃＯ－Ｖ若しくはｙｇｉＬ－Ｉのいずれか１組の線毛遺伝子群であり、
前記線毛遺伝子群をノックアウトされていない大腸菌と比べ、前記線毛遺伝子群をノックアウトされた大腸菌は、アミノ酸欠乏の環境下での増殖が促進され、発酵生成物の収量が増加する、ことを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記線毛遺伝子群は、６４個の遺伝子を含み、前記６４個の遺伝子は、順に、ｙａｇＶ、ｙａｇＷ、ｙａｇＸ、ｙａｇＹ、ｙａｇＺ、ｇｌｔＦ、ｙｈｃＡ、ｙｈｃＤ、ｙｈｃＥ、ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ、ｆｉｍＩ、ｆｉｍＣ、ｆｉｍＤ、ｆｉｍＦ、ｆｉｍＧ、ｆｉｍＨ、ｓｆｍＡ、ｓｆｍＣ、ｓｆｍＤ、ｓｆｍＨ、ｓｆｍＦ、ｙｃｂＱ、ｙｃｂＲ、ｙｃｂＳ、ｙｃｂＴ、ｙｃｂＵ、ｙｃｂＶ、ｙｃｂＦ、ｙｄｅＱ、ｙｄｅＲ、ｙｄｅＳ、ｙｄｅＴ、ｙｒａＨ、ｙｒａＩ、ｙｒａＪ、ｙｒａＫ、ｙａｄＣ、ｙａｄＫ、ｙａｄＬ、ｙａｄＭ、ｈｔｒＥ、ｙａｄＶ、ｙａｄＮ、ｙｅｈＡ、ｙｅｈＢ、ｙｅｈＣ、ｙｅｈＤ、ｙｂｇＯ、ｙｂｇＰ、ｙｂｇＱ、ｙｂｇＤ、ｙｆｃＯ、ｙｆｃＰ、ｙｆｃＱ、ｙｆｃＲ、ｙｆｃＳ、ｙｆｃＴ、ｙｆｃＵ、ｙｆｃＶ、ｙｇｉＬ、ｙｑｉＧ、ｙｑｉＨ、ｙｑｉＩであり、それらの配列に対するＮＣＢＩアクセッション番号は、順に９４６６３１、９４７３４９、９４７６０６、９４８８０６、９４８７５９、９４７７４６、９４７７４１、９４７７３８、４０５６０３２、９４７７３５、９４８８３８、９４８８４１、９４８８４３、９４８８４４、９４８８４５、９４８８４６、９４８８４７、９４５５２２、９４５３６７、９４５１６０、９４５４０７、９４４９７７、９４８３０６、９４６７７３、９４６９３４、９４７１８５、９４５５６１、９４５５６２、９４５５５９、９４６０５０、９４６０４９、９４６０４７、９４６０４２、９４７６５８、９４７６５７、９４７６５６、９４７６５４、９４４８３７、９４４８３５、９４４８２９、９４４８２８、９４４８１９、９４４８５９、９４４８４１、９４６６４２、９４６６１７、９４６６２１、９４６６１９、９４７５５０、９４５１１０、９４６５３７、９４５３２５、９４６６２０、９４６７８８、９４６７７９、９４６８１８、９４６４１８、１４５０２６８、１４５０２６８、９４９１０９、９４７５２２、９４７５２９、９４７５３１、９４７５３５であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記大腸菌は、大腸菌ＭＧ１６５５であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法により構築される、組み換え大腸菌。
【請求項5】
プラスミドｐＢＨＲ６８又はプラスミドｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣをさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の組み換え大腸菌。
【請求項6】
請求項４又は５に記載の組み換え大腸菌の、アミノ酸欠乏の環境下での代謝物合成における使用。
【請求項7】
請求項５に記載の組み換え大腸菌を用いてアミノ酸欠乏の環境下で発酵させることを特徴とする、ＰＨＢの発酵生産方法。
【請求項8】
前記アミノ酸欠乏の環境は、菌株によりＰＨＢを生産するための発酵培地であり、前記発酵培地の組成は、グルコース １５～２０ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １５－２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １－８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ １－８ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２－０．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．１－０．５ｇ／Ｌ及びＣａＣｌ２ ０．０１－０．０５ｇ／Ｌを含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
請求項５に記載の組み換え大腸菌を用いてアミノ酸欠乏の環境下で発酵させることを特徴とする、Ｌ－トレオニンを発酵生産する方法。
【請求項10】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法又は請求項４若しくは５に記載の組み換え大腸菌の、発酵における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生産効率を向上させる線毛無し大腸菌の構築及び使用に関し、遺伝子工学及び発酵工学の分野に属する。
【背景技術】
【0002】
細菌の線毛は、細胞上に現れる大きくて長く、薄い超分子タンパク質の付属物であり、バイオフィルムの形成、走化性、接着、膜を介したＤＮＡ移動を担っている。また、線毛も、細菌バイオフィルムの重要な構成要素であり、産業活動に対するさまざまな悪影響がある。例えば、製品の腐敗や汚染のリスクを増加させること、酷い感染を引き起こすこと、休眠細胞を形成して抗生物質の薬剤耐性を増加させること、細菌のエネルギーや基質を消費させること、栄養物質の拡散を阻害すること、バイオファウリングの形成、熱伝達の低減、腐食の増加、発酵装置の使用寿命の短縮などが挙げられる。
【0003】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）は、様々なヒドロキシアシル補酵素aを基質として合成され、不溶性の球状封入体又はＰＨＡ粒子として細胞内に保持される。一般的に、ＰＨＡｓは、炭素当量を減らして余分な炭素を蓄える上で重要な役割を担っており、それにより、飢餓時のストレスに対する細胞の抵抗力を向上させることができると考えらえる。ＰＨＡｓは、生分解性、生体適合性、ガスバリア性、圧電性、非線形光学活性など、官能基に起因する特殊な特性を有しており、このＰＨＡｓの特性により、生分解性プラスチック、組織工学用足場、及びその他多くの潜在的な用途に使用される。ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、ＰＨＡの一種であり、大腸菌はＰＨＢの工業生産によく用いられる。Ｌ－スレオニンは、人体に必須な栄養アミノ酸で、タンパク質合成の重要な構成要素である。人間の食品、化粧品、医薬品、動物飼料及び健康食品に広く用いられている。
【0004】
大腸菌によるＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成においては、生成物と細胞の増殖とのバランスを取ることがポイントになる。詳しくは、細胞を良好に増殖させると同時に、その合成経路の代謝の流れを強化し、さらに生成物の合成経路の発現量を制御して収量を上げる。既存の報告では、主に、発酵条件の最適化、代謝経路の最適化、細胞内の補酵素濃度の増加、及び発現プラスミドの最適化などによりＰＨＢ合成を向上させており、Ｌ－スレオニンの効率的合成は、脂肪酸遮断、リン酸転移酵素系、基質再分配などの代謝経路の修飾に焦点を当てている。ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成基質であるアセチルコエンザイムＡ及びオキサロ酢酸は、それぞれ解糖系及びクエン酸回路から得られるため、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンを大量に生産すると、大量の炭素源を消費して菌の増殖に重大な影響を与える。このため、ＰＨＢの生収量の増加は、工業上の生産需要を満足することができず、Ｌ－スレオニンの発酵成長が遅くなる。したがって、菌株の増殖を促進させ、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成を向上させる新たな方法を提供することは、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成をさらに向上させるために非常に重要である。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、上記の技術的課題を解決するために、大腸菌から大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群の６４個の遺伝子をノックアウトして突然変異菌ＷＱＭ０２６を得ることを提供する。ＷＱＭ０２６菌株は、栄養不足（Ｍ９）培地での増殖が速くなり、菌体の総量が増加した。続いて、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成に関連する遺伝子をそれぞれコンパクト化した後の菌株ＷＱＭ０２６に形質転換して得られた組み換え菌ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８及びＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣは、ＰＨＢ及びスレオニンを効率的に合成できる。
【0006】
本発明の第１の目的は、大腸菌の増殖を促進し且つその発酵生成物の収量を増加する方法を提供することであって、当該方法は、大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群をノックアウトすることを含み、前記線毛遺伝子群は、ｙａｇＶ－Ｚ、ｇｌｔＦ－ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ－Ｈ、ｓｆｍＡ－Ｆ、ｙｃｂＱ－Ｆ、ｙｄｅＱ－Ｔ、ｙｒａＨ－Ｋ、ｙａｄＣ－Ｎ、ｙｅｈＡ－Ｄ、ｙｂｇＯ－Ｄ、ｙｆｃＯ－Ｖ及び／又はｙｇｉＬ－Ｉであることを特徴とする。
【0007】
本発明の一実施形態において、前記線毛遺伝子群は、６４個の遺伝子を含み、前記６４個の遺伝子は、順に、ｙａｇＶ、ｙａｇＷ、ｙａｇＸ、ｙａｇＹ、ｙａｇＺ、ｇｌｔＦ、ｙｈｃＡ、ｙｈｃＤ、ｙｈｃＥ、ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ、ｆｉｍＩ、ｆｉｍＣ、ｆｉｍＤ、ｆｉｍＦ、ｆｉｍＧ、ｆｉｍＨ、ｓｆｍＡ、ｓｆｍＣ、ｓｆｍＤ、ｓｆｍＨ、ｓｆｍＦ、ｙｃｂＱ、ｙｃｂＲ、ｙｃｂＳ、ｙｃｂＴ、ｙｃｂＵ、ｙｃｂＶ、ｙｃｂＦ、ｙｄｅＱ、ｙｄｅＲ、ｙｄｅＳ、ｙｄｅＴ、ｙｒａＨ、ｙｒａＩ、ｙｒａＪ、ｙｒａＫ、ｙａｄＣ、ｙａｄＫ、ｙａｄＬ、ｙａｄＭ、ｈｔｒＥ、ｙａｄＶ、ｙａｄＮ、ｙｅｈＡ、ｙｅｈＢ、ｙｅｈＣ、ｙｅｈＤ、ｙｂｇＯ、ｙｂｇＰ、ｙｂｇＱ、ｙｂｇＤ、ｙｆｃＯ、ｙｆｃＰ、ｙｆｃＱ、ｙｆｃＲ、ｙｆｃＳ、ｙｆｃＴ、ｙｆｃＵ、ｙｆｃＶ、ｙｇｉＬ、ｙｑｉＧ、ｙｑｉＨ、ｙｑｉＩであり、それらの配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、順に９４６６３１、９４７３４９、９４７６０６、９４８８０６、９４８７５９、９４７７４６、９４７７４１、９４７７３８、４０５６０３２、９４７７３５、９４８８３８、９４８８４１、９４８８４３、９４８８４４、９４８８４５、９４８８４６、９４８８４７、９４５５２２、９４５３６７、９４５１６０、９４５４０７、９４４９７７、９４８３０６、９４６７７３、９４６９３４、９４７１８５、９４５５６１、９４５５６２、９４５５５９、９４６０５０、９４６０４９、９４６０４７、９４６０４２、９４７６５８、９４７６５７、９４７６５６、９４７６５４、９４４８３７、９４４８３５、９４４８２９、９４４８２８、９４４８１９、９４４８５９、９４４８４１、９４６６４２、９４６６１７、９４６６２１、９４６６１９、９４７５５０、９４５１１０、９４６５３７、９４５３２５、９４６６２０、９４６７８８、９４６７７９、９４６８１８、９４６４１８、１４５０２６８、１４５０２６８、９４９１０９、９４７５２２、９４７５２９、９４７５３１、９４７５３５である。
【0008】
本発明の一実施形態において、前記大腸菌は、大腸菌ＭＧ１６５５である。
【0009】
本発明の第２の目的は、前記のいずれか一つの方法により構築して得られる組み換え大腸菌を提供することである。
【0010】
本発明の一実施形態において、前記組み換え大腸菌は、プラスミドｐＢＨＲ６８又はプラスミドｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣをさらに含む。
【0011】
本発明の第３の目的は、前記組み換え大腸菌の、不利な環境における使用を提供することである。
【0012】
本発明の一実施形態において、前記不利な環境は、アミノ酸欠乏のＭ９培地であり、前記培地の組成は、グルコース ４ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．２４ｇ／Ｌ及びＣａＣｌ２ ０．０１１ｇ／Ｌを含む。
【0013】
本発明の第４の目的は、前記組み換え大腸菌の、アミノ酸欠乏の環境下での代謝物合成における使用を提供することである。
【0014】
本発明の一実施形態において、前記のプラスミドｐＢＨＲ６８を含む組み換え大腸菌は、アミノ酸欠乏の環境下でＰＨＢを生産する。
【0015】
本発明の一実施形態において、前記組み換え大腸菌がＰＨＢを生産する方法は以下の通りである。詳しくは、菌株をＬＢプレート上で１０－１５時間活性化培養し、培地に接種して、３５－３８℃、１５０－２５０ｒｐｍという条件で置いて５－１０時間培養し、種菌液を得、発酵培地に５％（ｖ／ｖ）との接種量で接種して、３５－３８℃、１５０－２５０ｒｐｍという条件で置いて４０－５０時間培養した。
【0016】
本発明の一実施形態において、前記のＰＨＢを生産する発酵培地の組成は、グルコース １５～２０ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １５－２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １－８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ １－８ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．２－０．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．１－０．５ｇ／Ｌ及びＣａＣｌ２ ０．０１－０．０５ｇ／Ｌを含む。
【0017】
本発明の一実施形態において、前記のプラスミドｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣを含む組み換え大腸菌は、アミノ酸欠乏の環境下でＬ－スレオニンを生産する。
【0018】
本発明の一実施形態において、前記組み換え大腸菌がＬ－スレオニンを生産する方法は、以下の通りである。詳しくは、菌株をＬＢプレート上で１０－１５時間活性化培養し、培地に接種し、３５－３８℃、１５０－２５０ｒｐｍという条件に置いて５－１０時間培養し、種菌液を得、発酵培地に１０％（ｖ／ｖ）との接種量で接種し、３５－３８℃、１５０－２５０ｒｐｍという条件で置いて３０－４０時間培養した。
【0019】
本発明の一実施形態において、前記のＬ－スレオニンを生産する発酵培地の組成は、酵母粉末末 １－５ｇ／Ｌ、クエン酸 １－５ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０－３０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ５－１０ｇ／Ｌ、グルコース ２５－３５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １－５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２－８ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ２－８ｍｇ／Ｌ及びＣａＣＯ３ １５－２５ｇ／Ｌを含む。
【0020】
本発明はさらに、前記大腸菌の増殖を促進し且つその発酵生成物の収量を有効的に増加する方法、又は、前記組み換え大腸菌の発酵、薬剤調製、材料若しくは環境保護の分野における使用を提供する。
【0021】
［有利な効果］
本発明は、大腸菌から大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群の６４個の遺伝子をノックアウトして突然変異菌ＷＱＭ０２６を得る。ＷＱＭ０２６菌株は、栄養不足（Ｍ９）培地での増殖が速くなり、菌体の総量が増加した。続いて、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成に関連する遺伝子をそれぞれコンパクト化菌株ＷＱＭ０２６に形質転換し、得られた組み換え菌ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８及びＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣは、それぞれ、ＰＨＢ及びスレオニンを効率的に合成できる。合成されたＰＨＢは、細胞の乾燥重量の８７．８７％を占め、野生型の対照菌ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８の３．４４倍である。Ｌ－スレオニンの収量は、２．４９ｇ／Ｌであり、ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣの３．６６倍である。
本発明は、大腸菌から大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群の６４個の遺伝子をノックアウトして突然変異菌ＷＱＭ０２６を得る。ＷＱＭ０２６菌株は、栄養不足（Ｍ９）培地での増殖が速くなり、菌体の総量が増加した。続いて、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの合成に関連する遺伝子をそれぞれコンパクト化菌株ＷＱＭ０２６に形質転換し、得られた組み換え菌ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８及びＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣは、それぞれ、ＰＨＢ及びスレオニンを効率的に合成できる。合成されたＰＨＢは、細胞の乾燥重量の８７．８７％を占め、野生型の対照菌ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８の３．４４倍である。Ｌ－スレオニンの収量は、２．４９ｇ／Ｌであり、ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣの３．６６倍である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】細菌線毛の合成及び組み立てに関わる遺伝子群である。
【図2】各細菌線毛の遺伝子群をノックアウトしてＬＢ及びＭ９培地での増殖を促進する増殖曲線である。
【図3】線毛の遺伝子群を単独でノックアウトしたＰＨＢ合成菌株がＭ９Ｇ培地中でＰＨＢを合成する様子の顕微鏡検査である。
【図4】線毛の遺伝子群を単独でノックアウトしたＰＨＢ合成菌株がＬＢＧ培地中でＰＨＢを合成する様子の顕微鏡検査である。
【図5】線毛欠失の大腸菌の突然変異株ＷＱＭ０２６に対する特性分析である。
【図6】ＷＱＭ０２６の、ＰＨＢ及びＬ－スレオニンの生産における使用である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
（１）遺伝子のノックアウト方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトシステムを用いて大腸菌の遺伝子を跡形もなくノックアウトする。まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＧ１６５５）においてｐＣａｓを電気的に形質転換し、Ｌ－アラビノースで誘導して組換え酵素Ｇａｍ、Ｂｅｔ、Ｅｘｏを発現させた。その後、ホモロジーアームフラグメント、及び、特定のＮ２０配列含有ｐＴａｒｇｅｔＦプラスミドをＭＧ１６５５／Ｃａｓ９コンピテント細胞において同時に電気的に形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシンに対する二重耐性のプレートに塗布し、３０℃で１８時間培養した後、コロニーＰＣＲにより突然変異した菌株をスクリーニングした。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトシステムを用いて大腸菌の遺伝子を跡形もなくノックアウトする。まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＧ１６５５）においてｐＣａｓを電気的に形質転換し、Ｌ－アラビノースで誘導して組換え酵素Ｇａｍ、Ｂｅｔ、Ｅｘｏを発現させた。その後、ホモロジーアームフラグメント、及び、特定のＮ２０配列含有ｐＴａｒｇｅｔＦプラスミドをＭＧ１６５５／Ｃａｓ９コンピテント細胞において同時に電気的に形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシンに対する二重耐性のプレートに塗布し、３０℃で１８時間培養した後、コロニーＰＣＲにより突然変異した菌株をスクリーニングした。
【0024】
突然変異した菌株が得られた後、培地において、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加してｐＣａｓの転写を誘導してｓｇＲＮＡ－ｐＭＢ１を形成し、Ｃａｓ９と組み合わせてｐＴａｒｇｅｔＦのｐＭＢ１レプリコンを切断して破壊し、ｐＴａｒｇｅｔＦを除去した。ｐＣａｓを含む菌株は、そのまま次のノックダウンに用いられ、ｐＣａｓを含む菌株を４２℃で一晩インキュベートし、温度感受性プラスミドｐＣａｓを除去した。
【0025】
（２）ＰＨＢ収量の測定方法
発酵液を４℃、４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２０分間遠心分離し、上清を捨てた後、菌体を凍結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた菌体を一定量で秤量し、従来から報告された通常のメチルエステル化方法でメチルエステル化を行い、最終的に、通常のガスクロマトグラフィーによる定量を行った。
発酵液を４℃、４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２０分間遠心分離し、上清を捨てた後、菌体を凍結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた菌体を一定量で秤量し、従来から報告された通常のメチルエステル化方法でメチルエステル化を行い、最終的に、通常のガスクロマトグラフィーによる定量を行った。
【0026】
（３）細胞の顕微鏡観察
細胞の形態を観察するために、大腸菌の細胞を固形のＬＢプレート上で１２時間成長させ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で画像化した。細胞内のＰＨＡ粒子を観察するために、ＰＨＡを２４時間発酵生産した後に、１％クリスタルバイオレットで菌体懸濁液を調製し、油浸レンズ（倍率＝１００×）を用いて明視野顕微鏡で観察した。同時に、大腸菌の細胞を４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳバッファ）で２回洗浄した後、２．５％グルタルアルデヒド溶液で少なくとも７２時間固定した。Ｇ２ ｓｐｉｒｉｔ透過電子顕微鏡により、電圧１００ｋＶでＧａｔａｎ ＵＳ４０００ ４ｋｘ４ｋ ＣＣＤを用いて画像を取得した。
細胞の形態を観察するために、大腸菌の細胞を固形のＬＢプレート上で１２時間成長させ、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で画像化した。細胞内のＰＨＡ粒子を観察するために、ＰＨＡを２４時間発酵生産した後に、１％クリスタルバイオレットで菌体懸濁液を調製し、油浸レンズ（倍率＝１００×）を用いて明視野顕微鏡で観察した。同時に、大腸菌の細胞を４０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳバッファ）で２回洗浄した後、２．５％グルタルアルデヒド溶液で少なくとも７２時間固定した。Ｇ２ ｓｐｉｒｉｔ透過電子顕微鏡により、電圧１００ｋＶでＧａｔａｎ ＵＳ４０００ ４ｋｘ４ｋ ＣＣＤを用いて画像を取得した。
【0027】
（４）ＰＨＡの抽出、定性及び定量分析
ｐＢＨＲ６８を持っている大腸菌細胞を５ｍＬ遠心分離して集め、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。遠心分離して集めた後に、あらかじめ正確に秤量した遠心チューブに細胞を移し、水分を蒸発させるとともに菌体を噴出させないように、この遠心チューブをクリングフィルムで包み、クリングフィルムに複数の小さな穴を開けた。完全に乾燥するまで真空凍結乾燥機で４８時間、凍結乾燥させた。チューブの底を触って常温であれば、完全乾燥したことが示され、又は、チューブの底を指でそっと弾いた際に菌体が分離し且つチューブの壁から容易に脱離できれば、完全乾燥と判断した。重量を測定し、乾燥重量を計算する。
ｐＢＨＲ６８を持っている大腸菌細胞を５ｍＬ遠心分離して集め、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。遠心分離して集めた後に、あらかじめ正確に秤量した遠心チューブに細胞を移し、水分を蒸発させるとともに菌体を噴出させないように、この遠心チューブをクリングフィルムで包み、クリングフィルムに複数の小さな穴を開けた。完全に乾燥するまで真空凍結乾燥機で４８時間、凍結乾燥させた。チューブの底を触って常温であれば、完全乾燥したことが示され、又は、チューブの底を指でそっと弾いた際に菌体が分離し且つチューブの壁から容易に脱離できれば、完全乾燥と判断した。重量を測定し、乾燥重量を計算する。
【0028】
秤量した試料の重量を正確に計算するために、完全に乾燥させたドライ菌体１～１０ｍｇと、ＰＨＢ標準試料約１０ｍｇとを秤取し、それらをあらかじめ正確に秤量したエステル化チューブに転移する。その後、メタノール（硫酸を３％含有）２ｍＬ及びクロロホルム２ｍＬを加え、エステル化チューブをキャップで密栓し、その間に超音波で試料を分散させてエステル化をより完全にし、沸騰水浴中で６時間以上エステル化を行う。約０．５時間後、一般的に粉末状であるＰＨＢ試料が速く溶解することが観察される。０．５時間経過しても標準品の形態変化や溶解が見られない場合は、全部の試薬を交換すべきである。メタノール及びクロロホルムが劣化すると、エステル化がうまく進まないことがある一方、開封したばかりの試薬に交換することで、一般的に上記問題を解決できる。６時間の沸騰水浴後、ヒュームフード内で十分に冷却させた後、エステル化チューブを注意深く開け、脱イオン水１ｍＬを加え、この時、キャップを別々に密栓し、系が完全に混合されるまで激しく振盪し、この時、エステル化チューブをヒュームフード内放置して３時間以上静置して相を分離させた。その後、上層を水相、下層を有機相とした。適量の有機相を気相試料瓶に加え、密栓して－８０℃で密封保存した。
【0029】
ガスクロマトグラフィーは、ＰＨＢ含有量を正確かつ高感度に定量する手段である。ＤＢ－５ＭＳ 溶融石英キャピラリーカラム（３０ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２５μｍ）を備えたＳｃｉｏｎ－ＳＱ－４５６－ＧＣモジュールを用いて抽出物を分析することで、そのＰＨＡの組成及び正確な含有量を測定した。ガスクロマトグラフィーとしては、イオン化エネルギー７０ｅｖで陽電子イオン化（ＥＩ）が得られ、スキャン間隔が０．５秒間であるｍ／ｚ５０からｍ／ｚ６５０までのイオンにより、マススペクトルがプログラムされた。ＰＨＡ生成量（ｗｔ％）は、幹細胞の重量パーセント（ＤＣＷ）で表された。気相定量は、島津製作所ＧＣ２０１０ガスクロマトグラフィーを用いた。Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＢ ＷＡＸ ３０ｍ－０．３２ｍｍ ＧＣカラム及び炎イオン化検出器を用い、試料の注入温度は２５０℃である。各標準試料について、市販のＰＨＢを標準試料として異なる量を用いて標準曲線をプロットした。
【0030】
（５）ＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡの抽出及び測定
大腸菌細胞を、Ｍ９培地の中で、対数関数的成長の早期又は対数関数的成長の中期（ＯＤ６００＝０．８－１．０）まで培養し、ＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡのアッセイキットを用いて細胞内のＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡの量を収集した。ＡＴＰアッセイキットの説明書に従って、細胞内のＡＴＰを抽出・定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズＨＰＬＣシステムで、ＡＴＰ分析を行い、分析カラムは、２５０ｍｍｘ４．０ｍｍ ＯＤＳ－２ＨＹＰＥＲＳＩＬ Ｃ１８カラムである。
大腸菌細胞を、Ｍ９培地の中で、対数関数的成長の早期又は対数関数的成長の中期（ＯＤ６００＝０．８－１．０）まで培養し、ＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡのアッセイキットを用いて細胞内のＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡの量を収集した。ＡＴＰアッセイキットの説明書に従って、細胞内のＡＴＰを抽出・定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズＨＰＬＣシステムで、ＡＴＰ分析を行い、分析カラムは、２５０ｍｍｘ４．０ｍｍ ＯＤＳ－２ＨＹＰＥＲＳＩＬ Ｃ１８カラムである。
【0031】
（６）ＭＧ１６５５及びＷＱＭ０２６のトランスクリプトーム解析
大腸菌ＭＧ１６５５及びＷＱＭ０２６をＭ９培地の中で指数関数的成長の中期まで培養し、１２０００ｒｐｍで３分間採取し、ＰＢＳバッファで２回洗浄した後、液体窒素で急速冷凍させた。ＲＮＡライブラリの抽出、構築及び配列決定は、ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社により行った。ＭＧ１６５５ゲノムを参照配列として、配列の読み取り、比較及び解析を行った。遺伝子発現の差異は、ＦＩＥＳＴＡ Ｖｉｅｗｅｒ ｖ．１．０ ソフトウェアにより、それらの発現量及びＰ値≦０．０５に基づいて算出した。
大腸菌ＭＧ１６５５及びＷＱＭ０２６をＭ９培地の中で指数関数的成長の中期まで培養し、１２０００ｒｐｍで３分間採取し、ＰＢＳバッファで２回洗浄した後、液体窒素で急速冷凍させた。ＲＮＡライブラリの抽出、構築及び配列決定は、ＧＥＮＥＷＩＺ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社により行った。ＭＧ１６５５ゲノムを参照配列として、配列の読み取り、比較及び解析を行った。遺伝子発現の差異は、ＦＩＥＳＴＡ Ｖｉｅｗｅｒ ｖ．１．０ ソフトウェアにより、それらの発現量及びＰ値≦０．０５に基づいて算出した。
【0032】
（７）Ｌ－スレオニンの濃度解析
Ｔｈｅｒｍｏ ２５０ｍｍ×４．０ｍｍ ＯＤＳ－２ＨＹＰＥＲＳＩＬ Ｃ１８ カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ又は１２６０シリーズ ＨＰＬＣ システムを用いて、Ｌ－スレオニンの濃度を測定した。Ｌ－スレオニンの濃度は、ｏ－フタルアルデヒドによるプレカラム誘導体化法（Ｋｏｒｏｓ、 Ａ．、 Ｖａｒｇａ、 Ｚ．、 Ｍｏｌｎａｒ－Ｐｅｒｌ、 Ｉ． ２００８． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｉｎｅｓ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ－ｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ－９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｃｈｅｅｓｅ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、 １２０３（２）、 １４６－５２．）で測定された。
Ｔｈｅｒｍｏ ２５０ｍｍ×４．０ｍｍ ＯＤＳ－２ＨＹＰＥＲＳＩＬ Ｃ１８ カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ又は１２６０シリーズ ＨＰＬＣ システムを用いて、Ｌ－スレオニンの濃度を測定した。Ｌ－スレオニンの濃度は、ｏ－フタルアルデヒドによるプレカラム誘導体化法（Ｋｏｒｏｓ、 Ａ．、 Ｖａｒｇａ、 Ｚ．、 Ｍｏｌｎａｒ－Ｐｅｒｌ、 Ｉ． ２００８． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｉｎｅｓ ａｓ ｔｈｅｉｒ ｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ－ｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ－９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｃｈｅｅｓｅ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ、 １２０３（２）、 １４６－５２．）で測定された。
【0033】
（８）培地
ＬＢ培地（ｇ／Ｌ）：酵母粉末 ５、ペプトン １０及びＮａＣｌ １０。
Ｍ９培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
ＬＢＧ培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０ 、酵母粉末５、ペプトン １０及びＮａＣｌ １０。
Ｍ９Ｇ培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
ＰＨＢ発酵培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
Ｌ－スレオニン発酵培地（ｇ／Ｌ）：酵母粉末 ２、クエン酸 ２、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５、ＫＨ２ＰＯ４ ７．４６、グルコース ３０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００５、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００５及びＣａＣＯ３ ２０。
ＬＢ培地（ｇ／Ｌ）：酵母粉末 ５、ペプトン １０及びＮａＣｌ １０。
Ｍ９培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
ＬＢＧ培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０ 、酵母粉末５、ペプトン １０及びＮａＣｌ １０。
Ｍ９Ｇ培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
ＰＨＢ発酵培地（ｇ／Ｌ）：グルコース ２０、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １７．１、ＫＨ２ＰＯ４ ４、ＮＨ４Ｃｌ ３、ＮａＣｌ ０．５、ＭｇＳＯ４ ０．２４及びＣａＣｌ２ ０．０１１。
Ｌ－スレオニン発酵培地（ｇ／Ｌ）：酵母粉末 ２、クエン酸 ２、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５、ＫＨ２ＰＯ４ ７．４６、グルコース ３０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００５、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００５及びＣａＣＯ３ ２０。
【0034】
実施例１ 線毛欠乏エンジニアリング菌の構築
線毛欠乏エンジニアリング菌の具体的な構築過程は、以下の通りである。
（１）ＭＧ１６５５／ｐＣａｓ コンピテント細胞の細胞調製
Ｒｅｄ組換えヘルパープラスミドｐＣａｓ９（Ｊｉａｎｇ、 Ｙ．、 Ｃｈｅｎ、 Ｂ．、 Ｄｕａｎ、 Ｃ．、 Ｓｕｎ、 Ｂ．、 Ｙａｎｇ、 Ｊ．、 Ｙａｎｇ、 Ｓ． ２０１５． Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ８１（７）、 ２５０６－１４．）を持っている大腸菌ＭＧ１６５５を接種し、１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地の中で、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。この培養液を２％接種量でＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、３０℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００＝０．２まで培養した時に、Ｌ－アラビノース（最終濃度３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えてリコンビナーゼの発現を誘導した。続いて、Ｄ６００＝０．５まで培養し、培養液を氷浴で30分間放置下後、予め冷やしておいた５０ｍＬ遠心管に入れ、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を収集した。沈殿を予め冷やしておいた１０％グリセロールで３回洗浄し、最後に１０％グリセロール１ｍＬに懸濁させた。各チューブ８０μＬを予め冷やしておいた無菌ＥＰチューブに分注し、保存しておく。
線毛欠乏エンジニアリング菌の具体的な構築過程は、以下の通りである。
（１）ＭＧ１６５５／ｐＣａｓ コンピテント細胞の細胞調製
Ｒｅｄ組換えヘルパープラスミドｐＣａｓ９（Ｊｉａｎｇ、 Ｙ．、 Ｃｈｅｎ、 Ｂ．、 Ｄｕａｎ、 Ｃ．、 Ｓｕｎ、 Ｂ．、 Ｙａｎｇ、 Ｊ．、 Ｙａｎｇ、 Ｓ． ２０１５． Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ８１（７）、 ２５０６－１４．）を持っている大腸菌ＭＧ１６５５を接種し、１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地の中で、３０℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。この培養液を２％接種量でＬＢ液体培地１００ｍＬに接種し、３０℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００＝０．２まで培養した時に、Ｌ－アラビノース（最終濃度３０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えてリコンビナーゼの発現を誘導した。続いて、Ｄ６００＝０．５まで培養し、培養液を氷浴で30分間放置下後、予め冷やしておいた５０ｍＬ遠心管に入れ、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を収集した。沈殿を予め冷やしておいた１０％グリセロールで３回洗浄し、最後に１０％グリセロール１ｍＬに懸濁させた。各チューブ８０μＬを予め冷やしておいた無菌ＥＰチューブに分注し、保存しておく。
【0035】
（２）ｐＴａｒｇｅｔＦプラスミドの構築
ｐＴａｒｇｅｔＦシリーズのプラスミドの構築用プライマーを表２に示す。プラスミドｐＴａｒｇｅｔＦ０１は、ｐＴａｒｇｅｔＦをテンプレートとし、プライマーＦ－ｓｇＲＮＡ－ｙａｇＶ－ＺとＲ－ｓｇＲＮＡを用い、シーケンシングプライマーＴ－ｙａｇＶ－Ｚ－ＦとＴ－ｓｇＲＮＡ－Ｒを用いてプラスミドの正しさを確認した。他のプラスミドｐＴａｒｇｅｔＦ０２、ｐＴａｒｇｅｔＦ０３、ｐＴａｒｇｅｔＦ０４、ｐＴａｒｇｅｔＦ０５、ｐＴａｒｇｅｔＦ０６、ｐＴａｒｇｅｔＦ０７、ｐＴａｒｇｅｔＦ０８、ｐＴａｒｇｅｔＦ０９、ｐＴａｒｇｅｔＦ１０、ｐＴａｒｇｅｔＦ１１、ｐＴａｒｇｅｔＦ１２、ｐＴａｒｇｅｔＦ２７、ｐＴａｒｇｅｔＦ２８、ｐＴａｒｇｅｔＦ２９及びｐＴａｒｇｅｔＦ３０は、同じ方法（Ｊｉａｎｇ、 Ｙ．、 Ｃｈｅｎ、 Ｂ．、 Ｄｕａｎ、 Ｃ．、 Ｓｕｎ、 Ｂ．、 Ｙａｎｇ、 Ｊ．、 Ｙａｎｇ、 Ｓ． ２０１５． Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ８１（７）、 ２５０６－１４．）で構築され、対応するプライマーを使用した。
ｐＴａｒｇｅｔＦシリーズのプラスミドの構築用プライマーを表２に示す。プラスミドｐＴａｒｇｅｔＦ０１は、ｐＴａｒｇｅｔＦをテンプレートとし、プライマーＦ－ｓｇＲＮＡ－ｙａｇＶ－ＺとＲ－ｓｇＲＮＡを用い、シーケンシングプライマーＴ－ｙａｇＶ－Ｚ－ＦとＴ－ｓｇＲＮＡ－Ｒを用いてプラスミドの正しさを確認した。他のプラスミドｐＴａｒｇｅｔＦ０２、ｐＴａｒｇｅｔＦ０３、ｐＴａｒｇｅｔＦ０４、ｐＴａｒｇｅｔＦ０５、ｐＴａｒｇｅｔＦ０６、ｐＴａｒｇｅｔＦ０７、ｐＴａｒｇｅｔＦ０８、ｐＴａｒｇｅｔＦ０９、ｐＴａｒｇｅｔＦ１０、ｐＴａｒｇｅｔＦ１１、ｐＴａｒｇｅｔＦ１２、ｐＴａｒｇｅｔＦ２７、ｐＴａｒｇｅｔＦ２８、ｐＴａｒｇｅｔＦ２９及びｐＴａｒｇｅｔＦ３０は、同じ方法（Ｊｉａｎｇ、 Ｙ．、 Ｃｈｅｎ、 Ｂ．、 Ｄｕａｎ、 Ｃ．、 Ｓｕｎ、 Ｂ．、 Ｙａｎｇ、 Ｊ．、 Ｙａｎｇ、 Ｓ． ２０１５． Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ８１（７）、 ２５０６－１４．）で構築され、対応するプライマーを使用した。
【0036】
（３）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構築突然変異株
大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムには、ともに１２個の線毛合成・組立遺伝子群ｙａｇＶＷＸＹＺ、ｇｌｔＦｙｈｃＡＤＥＦ、ｆｉｍＡＩＣＤＦＧＨ、ｓｆｍＡＣＤＨＦ、ｙｃｂＱＲＳＴＵＶＦ、ｙｄｅＱＲＳＴ、ｙｒａＨＩＪＫ、ｙａｄＣＫＬＭｈｔｒＥｅｃｐＤｙａｄＮ、ｙｅｈＡＢＣＤ、ｙｂｇＯＰＱＤ及びｙｆｃＯＰＱＲＳＴＵＶが存在している。この１２個の線毛合成・組立遺伝子群は、６４個の遺伝子に細分化され、それぞれ、ｙａｇＶ、ｙａｇＷ、ｙａｇＸ、ｙａｇＹ、ｙａｇＺ、ｇｌｔＦ、ｙｈｃＡ、ｙｈｃＤ、ｙｈｃＥ、ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ、ｆｉｍＩ、ｆｉｍＣ、ｆｉｍＤ、ｆｉｍＦ、ｆｉｍＧ、ｆｉｍＨ、ｓｆｍＡ、ｓｆｍＣ、ｓｆｍＤ、ｓｆｍＨ、ｓｆｍＦ、ｙｃｂＱ、ｙｃｂＲ、ｙｃｂＳ、ｙｃｂＴ、ｙｃｂＵ、ｙｃｂＶ、ｙｃｂＦ、ｙｄｅＱ、ｙｄｅＲ、ｙｄｅＳ、ｙｄｅＴ、ｙｒａＨ、ｙｒａＩ、ｙｒａＪ、ｙｒａＫ、ｙａｄＣ、ｙａｄＫ、ｙａｄＬ、ｙａｄＭ、ｈｔｒＥ、ｙａｄＶ、ｙａｄＮ、ｙｅｈＡ、ｙｅｈＢ、ｙｅｈＣ、ｙｅｈＤ、ｙｂｇＯ、ｙｂｇＰ、ｙｂｇＱ、ｙｂｇＤ、ｙｆｃＯ、ｙｆｃＰ、ｙｆｃＱ、ｙｆｃＲ、ｙｆｃＳ、ｙｆｃＴ、ｙｆｃＵ、ｙｆｃＶ、ｙｇｉＬ、ｙｑｉＧ、ｙｑｉＨ、ｙｑｉＩであり、それらの配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、順に９４６６３１、９４７３４９、９４７６０６、９４８８０６、９４８７５９、９４７７４６、９４７７４１、９４７７３８、４０５６０３２、９４７７３５、９４８８３８、９４８８４１、９４８８４３、９４８８４４、９４８８４５、９４８８４６、９４８８４７、９４５５２２、９４５３６７、９４５１６０、９４５４０７、９４４９７７、９４８３０６、９４６７７３、９４６９３４、９４７１８５、９４５５６１、９４５５６２、９４５５５９、９４６０５０、９４６０４９、９４６０４７、９４６０４２、９４７６５８、９４７６５７、９４７６５６、９４７６５４、９４４８３７、９４４８３５、９４４８２９、９４４８２８、９４４８１９、９４４８５９、９４４８４１、９４６６４２、９４６６１７、９４６６２１、９４６６１９、９４７５５０、９４５１１０、９４６５３７、９４５３２５、９４６６２０、９４６７８８、９４６７７９、９４６８１８、９４６４１８、１４５０２６８、１４５０２６８、９４９１０９、９４７５２２、９４７５２９、９４７５３１、９４７５３５である。
大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムには、ともに１２個の線毛合成・組立遺伝子群ｙａｇＶＷＸＹＺ、ｇｌｔＦｙｈｃＡＤＥＦ、ｆｉｍＡＩＣＤＦＧＨ、ｓｆｍＡＣＤＨＦ、ｙｃｂＱＲＳＴＵＶＦ、ｙｄｅＱＲＳＴ、ｙｒａＨＩＪＫ、ｙａｄＣＫＬＭｈｔｒＥｅｃｐＤｙａｄＮ、ｙｅｈＡＢＣＤ、ｙｂｇＯＰＱＤ及びｙｆｃＯＰＱＲＳＴＵＶが存在している。この１２個の線毛合成・組立遺伝子群は、６４個の遺伝子に細分化され、それぞれ、ｙａｇＶ、ｙａｇＷ、ｙａｇＸ、ｙａｇＹ、ｙａｇＺ、ｇｌｔＦ、ｙｈｃＡ、ｙｈｃＤ、ｙｈｃＥ、ｙｈｃＦ、ｆｉｍＡ、ｆｉｍＩ、ｆｉｍＣ、ｆｉｍＤ、ｆｉｍＦ、ｆｉｍＧ、ｆｉｍＨ、ｓｆｍＡ、ｓｆｍＣ、ｓｆｍＤ、ｓｆｍＨ、ｓｆｍＦ、ｙｃｂＱ、ｙｃｂＲ、ｙｃｂＳ、ｙｃｂＴ、ｙｃｂＵ、ｙｃｂＶ、ｙｃｂＦ、ｙｄｅＱ、ｙｄｅＲ、ｙｄｅＳ、ｙｄｅＴ、ｙｒａＨ、ｙｒａＩ、ｙｒａＪ、ｙｒａＫ、ｙａｄＣ、ｙａｄＫ、ｙａｄＬ、ｙａｄＭ、ｈｔｒＥ、ｙａｄＶ、ｙａｄＮ、ｙｅｈＡ、ｙｅｈＢ、ｙｅｈＣ、ｙｅｈＤ、ｙｂｇＯ、ｙｂｇＰ、ｙｂｇＱ、ｙｂｇＤ、ｙｆｃＯ、ｙｆｃＰ、ｙｆｃＱ、ｙｆｃＲ、ｙｆｃＳ、ｙｆｃＴ、ｙｆｃＵ、ｙｆｃＶ、ｙｇｉＬ、ｙｑｉＧ、ｙｑｉＨ、ｙｑｉＩであり、それらの配列のＮＣＢＩアクセッション番号は、順に９４６６３１、９４７３４９、９４７６０６、９４８８０６、９４８７５９、９４７７４６、９４７７４１、９４７７３８、４０５６０３２、９４７７３５、９４８８３８、９４８８４１、９４８８４３、９４８８４４、９４８８４５、９４８８４６、９４８８４７、９４５５２２、９４５３６７、９４５１６０、９４５４０７、９４４９７７、９４８３０６、９４６７７３、９４６９３４、９４７１８５、９４５５６１、９４５５６２、９４５５５９、９４６０５０、９４６０４９、９４６０４７、９４６０４２、９４７６５８、９４７６５７、９４７６５６、９４７６５４、９４４８３７、９４４８３５、９４４８２９、９４４８２８、９４４８１９、９４４８５９、９４４８４１、９４６６４２、９４６６１７、９４６６２１、９４６６１９、９４７５５０、９４５１１０、９４６５３７、９４５３２５、９４６６２０、９４６７８８、９４６７７９、９４６８１８、９４６４１８、１４５０２６８、１４５０２６８、９４９１０９、９４７５２２、９４７５２９、９４７５３１、９４７５３５である。
【0037】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９方法で、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムから、１２個の線毛合成・組立遺伝子群ｙａｇＶＷＸＹＺ、ｇｌｔＦｙｈｃＡＤＥＦ、ｆｉｍＡＩＣＤＦＧＨ、ｓｆｍＡＣＤＨＦ、ｙｃｂＱＲＳＴＵＶＦ、ｙｄｅＱＲＳＴ、ｙｒａＨＩＪＫ、ｙａｄＣＫＬＭｈｔｒＥｅｃｐＤｙａｄＮ、ｙｅｈＡＢＣＤ、ｙｂｇＯＰＱＤ及びｙｆｃＯＰＱＲＳＴＵＶをそれぞれノックアウトし、対応する突然変異株ＷＱＭ００１、ＷＱＭ００２、ＷＱＭ００３、ＷＱＭ００４、ＷＱＭ００５、ＷＱＭ００６、ＷＱＭ００７、ＷＱＭ００８、ＷＱＭ００９、ＷＱＭ０１０、ＷＱＭ０１１及びＷＱＭ０１２を構築した。例えば、ＷＱＭ００１は、ゲノムからｙａｇＶＷＸＹＺ遺伝子群をノックアウトした。上流ホモロジーアーム用プライマーと下流ホモロジーアーム用プライマーによりＦ１－ｙａｇＶ－Ｚ／Ｒ１－ｙａｇＶ－Ｚ及びＦ２－ｙａｇＶ－Ｚ／Ｒ２－ｙａｇＶ－Ｚを増幅して得られた２つのＰＣＲ産物を、ゲル回収キットで回収し、Ｆ１－ｙａｇＶ－Ｚ／Ｒ２－ｙａｇＶ－Ｚに対して、プライマーによりオーバーラップＰＣＲを行い、オーバーラップホモロジーアームを得た。精製した後のオーバーラップホモロジーアーム（４００ｎｇ）及びｐＴａｒｇｅｔＦ０１（１００ｎｇ）を混合した後、８０μＬのＭＧ１６５５／ｐＣａｓコンピテント細胞において電気的に形質転換させた。電気的に形質転換させた後、細胞を３０℃で４５分間蘇生させた後、続いて、スペクチノマイシン及びカナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む二重耐性のプレートに塗布した。３０℃で３６時間培養した後、プライマーＦ１－ｙａｇＶ－Ｚ ／Ｒ２－ｙａｇＶ－Ｚにより、コロニーＰＣＲを行い、目的の菌株を選別した。その後、突然変異株を、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含むＬＢ培地に接種して一晩インキュベートし、ｐＴａｒｇｅｔＦ０１プラスミドを除去した。ｐＣａｓプラスミドは、温度感受性レプリコンを含んでおり、４２℃で２４時間インキュベートしてｐＣａｓプラスミドを除去した。ｐＴａｒｇｅｔＦ０１プラスミド及びｐＣａｓプラスミドを含んでない菌株は、後続の研究に用いられる。他の１１個の突然変異株ＷＱＭ００２、ＷＱＭ００３、ＷＱＭ００４、ＷＱＭ００５、ＷＱＭ００６、ＷＱＭ００７、ＷＱＭ００８、ＷＱＭ００９、ＷＱＭ０１０、ＷＱＭ０１１、ＷＱＭ０１２は、同じ方法により構築された。ＷＱＭ０２６は、この方法を用いて１２個の線毛オペロンを1つずつすべてノックアウトして構築された。本部分に係る菌株、プラスミド及びプライマーを表１及び表２に示す。
【0038】
【0039】
【0040】
実施例２ １組の線毛遺伝子群をノックアウトすることにより増殖及びＰＨＢ合成を促進すること
大腸菌には、線毛を合成し、組み立てるための１２個の遺伝子群を含む（図１）。線毛は、細菌の病原性を高めるだけでなく、その合成や組み立ての際に大量のエネルギーと炭素源を消費する。したがって、理論的には、これらの線毛を除去することで、大腸菌のバイオセーフティと生産性を向上させることができると考えられる。
大腸菌には、線毛を合成し、組み立てるための１２個の遺伝子群を含む（図１）。線毛は、細菌の病原性を高めるだけでなく、その合成や組み立ての際に大量のエネルギーと炭素源を消費する。したがって、理論的には、これらの線毛を除去することで、大腸菌のバイオセーフティと生産性を向上させることができると考えられる。
【0041】
大腸菌ＭＧ１６５５の染色体から、１２個の線毛合成・組立遺伝子群をそれぞれ除去したことにより、菌株ＷＱＭ００１、ＷＱＭ００２、ＷＱＭ００３、ＷＱＭ００４、ＷＱＭ００５、ＷＱＭ００６、ＷＱＭ００７、ＷＱＭ００８、ＷＱＭ００９、ＷＱＭ０１０、ＷＱＭ０１１及びＷＱＭ０１２が得られた。これらの菌株は、それぞれ、ＬＢ培地及びＭ９培地の中で培養された。図２に示すように、２時間ごとに菌液のＯＤ値を測定し、菌株の増殖曲線をプロットした。ＬＢ培地の中で、すべての１２株の突然変異株の増殖曲線は、対照株ＭＧ１６５５とほぼ同じであるため、大腸菌における１２個の線毛合成・組立遺伝子群の中でのいずれか一つを除去しても、細胞増殖に影響を与えないか、または細胞増殖をわずかに向上させることが示された。Ｍ９培地の中で、１２種の変異株の増殖状況はすべて対照株ＭＧ１６５５より良好であった。線毛の生合成及び組み立てには、大量のアミノ酸消費が必要となるが、Ｍ９培地にはいかなるアミノ酸も含まれていないので、Ｍ９培地の中で培養されて増殖した大腸菌は、タンパク質を合成するために、２０種類のアミノ酸をすべて自分で合成する必要があった。このため、線毛の合成・組立を減少させることで、突然変異体において保存されているアミノ酸を、細胞の増殖を促進するために利用できるようになった。このことから、大腸菌の線毛を特に栄養不足の場合には除去することは、細胞増殖に有利であることが判明した。
【0042】
線毛の突然変異体の生産性を検査するため、空ベクターｐＢＳＫ、及びＰＨＡの合成遺伝子を含むベクターｐＢＨＲ６８をＭＧ１６５５及び１２個の突然変異株において電気的に形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００１／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００２／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００３／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００４／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００５／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００６／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００７／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００８／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ００９／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ０１０／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ０１１／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ０１０／ｐＢＳＫ、ＷＱＭ０１１／ｐＢＳＫ及びＷＱＭ０１２／ｐＢＳＫ；ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００１／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００２／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００３／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００４／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００５／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００６／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００７／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００８／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ００９／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ０１０／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ０１１／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ０１０／ｐＢＨＲ６８、ＷＱＭ０１１／ｐＢＨＲ６８及びＷＱＭ０１２／ｐＢＨＲ６８が得られた。これらの組換え菌株をＭ９Ｇ及びＬＢＧ培地で増殖し、細胞及びそのベクター対照を顕微鏡で観察した（図３、４）。
【0043】
Ｍ９Ｇ培地の中で増殖した場合（図３）、１３個の空ベクターである菌株は、すべて類似した大きさを示し、ＰＨＡを生産しなかった。このうち、ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８は、細胞体積がわずかに大きくなり、少数の細胞だけがＰＨＡを生産した。しかしながら、ＰＨＡ合成遺伝子を含むｐＢＨＲ６８の１２個の突然変異株は、それらの細胞サイズが著しく大きくなり、ほぼすべての細胞がＰＨＡ（細胞内の白い顆粒）を産生した。
【0044】
ＬＢＧ培地の中で増殖した場合（図４）、１３個の空ベクターである菌株は、すべて類似した大きさであり、いずれもＰＨＡを生産しなかった。ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８のサイズは、その対照と類似し、ＰＨＡを産生しなかった。ｐＢＨＲ６８を含む１２個の突然変異体細胞は、そのサイズが大きくなり、ＰＨＡを生産する程度は、Ｍ９Ｇ培地の中での相応的な菌株より小さくなった。このことから、線毛の除去は、大腸菌がＰＨＡを生産するために有利であることが示唆された。
【0045】
実施例３ ＷＱＭ０２６の形態及び代謝物分析
実施例２の結果から、１組の線毛合成・組立遺伝子群の除去によって、いずれも大腸菌の細胞の増殖及びＰＨＡの生合成が促進されたので、大腸菌のＭＧ１６５５染色体における１２個の線毛合成・組立遺伝子群をすべて除去して、線毛欠失菌株ＷＱＭ０２６を構築した（構築方法については実施例１を参照）。菌液ＯＤ値を２時間ごとに測定し、図５Ａに示すように、菌株の増殖曲線をプロットした。ＷＱＭ０２６は、ＬＢ培地の中での増殖がＭＧ１６５５よりわずかに良くなり、Ｍ９の培地の中での増殖がＭＧ１６５５よりはるかによくなり、１８時間まで培養すると、ＷＱＭ０２６のＯＤ値が約ＭＧ１６５５の３倍であった。このことから、大腸菌における１２個の線毛遺伝子群のすべてを除去することは、特に栄養の乏しい環境下で、細胞増殖に有利であることが判明した。ＭＧ１６５５細胞とＷＱＭ０２６細胞を電子顕微鏡で観察したところ、ＭＧ１６５５の細胞表面において線毛が大量で覆われていたが（図５Ｂ）、ＷＱＭ０２６の表面は滑らかであり、線毛の痕跡が見られなかった（図５Ｃ）。
実施例２の結果から、１組の線毛合成・組立遺伝子群の除去によって、いずれも大腸菌の細胞の増殖及びＰＨＡの生合成が促進されたので、大腸菌のＭＧ１６５５染色体における１２個の線毛合成・組立遺伝子群をすべて除去して、線毛欠失菌株ＷＱＭ０２６を構築した（構築方法については実施例１を参照）。菌液ＯＤ値を２時間ごとに測定し、図５Ａに示すように、菌株の増殖曲線をプロットした。ＷＱＭ０２６は、ＬＢ培地の中での増殖がＭＧ１６５５よりわずかに良くなり、Ｍ９の培地の中での増殖がＭＧ１６５５よりはるかによくなり、１８時間まで培養すると、ＷＱＭ０２６のＯＤ値が約ＭＧ１６５５の３倍であった。このことから、大腸菌における１２個の線毛遺伝子群のすべてを除去することは、特に栄養の乏しい環境下で、細胞増殖に有利であることが判明した。ＭＧ１６５５細胞とＷＱＭ０２６細胞を電子顕微鏡で観察したところ、ＭＧ１６５５の細胞表面において線毛が大量で覆われていたが（図５Ｂ）、ＷＱＭ０２６の表面は滑らかであり、線毛の痕跡が見られなかった（図５Ｃ）。
【0046】
線毛の欠失により、大腸菌がより多くのＰＨＡを生産する理由を調べるために、ＷＱＭ０２６における酢酸及びアセチルコエンザイムＡの濃度を測定した。アセチルコエンザイムＡは、ＰＨＡ合成の直接前駆体であり、酢酸は、アセチルコエンザイムＡから生成される。ＷＱＭ０２６における酢酸及びアセチルコエンザイムＡの量は、ＭＧ１６５５よりも著しく高く、それぞれ２３．５７％増及び７９．１８％増であった（図５Ｄ）。線毛の欠失により、大腸菌ＷＱＭ０２６の体内での酢酸及びアセチルコエンザイムＡのレベルが上昇し、大腸菌がＰＨＡを生産するために有利となる。また、ＷＱＭ０２６におけるクエン酸塩の濃度は、ＭＧ１６５５よりも２８．７８％減であった（図５Ｄ）。クエン酸塩は、ＴＣＡサイクルの重要な代謝物であり、ＷＱＭ０２６の中ではその濃度が低いことから、節約した炭素がＴＣＡサイクルに流れていないことが示されており、さらに、線毛の欠失によりエネルギー消費量の減少が示された。様々な線毛の生合成及び組み立てにはエネルギーが必要であるため、ＭＧ１６５５を含むＷＱＭ０２６の細胞の中でのＡＴＰ濃度も測定した（図５Ｄ）。ＷＱＭ０２６及びＭＧ１６５５の中でのＡＴＰ濃度は、それぞれ０．７４１及び０．４０２μｍｏｌ／ｇであり、ＷＱＭ０２６のＡＴＰ濃度は、ＭＧ１６５５の中でのＡＴＰ濃度よりも１．８倍増加した。このことから、線毛の除去によりエネルギーを節約できることが示された。
【0047】
実施例４ ＷＱＭ０２６のＰＨＢ合成における使用
ＷＱＭ０２６は、対照ＭＧ１６５５と比べて、増殖が良く、ＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡの蓄積量が高いという利点がある。したがって、発酵産業への使用は、検討する価値がある。
ＷＱＭ０２６は、対照ＭＧ１６５５と比べて、増殖が良く、ＡＴＰ及びアセチルコエンザイムＡの蓄積量が高いという利点がある。したがって、発酵産業への使用は、検討する価値がある。
【0048】
ＰＨＡ合成経路を含むプラスミドｐＢＨＲ６８をＷＱＭ０２６において電気的に形質転換し、ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８を得た。超薄切片の電子顕微鏡分析により、ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８細胞には巨大なＰＨＡ粒子が充填されていたこと（図６Ｂ）が示されたが、ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ６８細胞には、ごく微量のＰＨＡが観察された（図６Ａ）。このことから、ＷＱＭ０２６はＰＨＡを効率的に合成できることが示唆された。
【0049】
ＰＨＡは、様々な基質から合成され、細胞内に不溶性の球状封入体又はＰＨＡ粒子を形成することができる。ＰＨＡモノマーは９０種類以上存在している。大腸菌にｐＢＨＲ６８を導入すると、通常はポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）が生産されるが、ｐＢＨＲ６８を導入すると、他の種類のＰＨＡも生産される。そこで、ＧＣ／ＭＳ法によりＰＨＡの種類及び収量を測定した。
【0050】
菌株をＬＢプレート上で１２時間活性化培養した後、菌が苔状に大きなリングになった部分を１つ選んで摘み取り、５０ｍＬのＬＢを含む２５０ｍＬコニカルフラスコに接種し、３７℃、２００ｒｐｍとの条件で６時間培養して種菌液を得た。５％（ｖ／ｖ）の接種量で５０ｍＬの発酵培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で４８時間培養した。
【0051】
上記菌株ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８の発酵液に対して、ＰＨＡ抽出、メチルエステル化、及びＧＣ／ＭＳ分析を行ったところ、ＧＣスペクトルには、保持時間が５．５０８分間であり、標準ＰＨＢの保持時間と完全に同じである一つのピークのみが観察された（図６Ｃ）。ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８により生産されたＰＨＡのマススペクトルには、標準ＰＨＢと同じパターン（図６Ｄ）を示した。このことから、ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８により産生されたＰＨＡはＰＨＢであることが証明された。図６Ｅに示すように、ＷＱＭ０２６／ｐＢＨＲ６８のＰＨＢ及び幹細胞の重量パーセント（ＤＣＷ）による収量は、対照ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ０２６に比べて、いずれも著しく増加し、それぞれ３．３１ｇ／Ｌ及び８７．８７％に達しており、対照ＭＧ１６５５／ｐＢＨＲ０２６よりそれぞれ２倍及び３．４４倍に向上した。
【0052】
実施例５ ＷＱＭ０２６のＬ－スレオニン合成における使用
大腸菌はＬ－スレオニン生産のために開発されたものであるため、ＷＱＭ０２６でＬ－スレオニンを効率的に生産する可能性がさらに検討された。Ｌ－スレオニン生合成及び輸送に関するキー遺伝子を含むプラスミドｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣをそれぞれＭＧ１６５５及びＷＱＭ０２６において形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣ及びＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣを得た。
大腸菌はＬ－スレオニン生産のために開発されたものであるため、ＷＱＭ０２６でＬ－スレオニンを効率的に生産する可能性がさらに検討された。Ｌ－スレオニン生合成及び輸送に関するキー遺伝子を含むプラスミドｐＦＷ０１－ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣをそれぞれＭＧ１６５５及びＷＱＭ０２６において形質転換し、ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣ及びＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ－ｒｈｔＣを得た。
【0053】
菌株をＬＢプレート上で１２時間活性化培養した後、菌が苔状に大きなリングになった部分を１つ選んで摘み取り、５０ｍＬのＬＢを含む２５０ｍＬコニカルフラスコに接種し、３７℃、２００ｒｐｍとの条件で４時間培養して種菌液を得た。１０％（ｖ／ｖ）の接種量で８０ｍＬの発酵培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍとの条件で３６時間培養した。発酵液の中でのＬ－トレオニン含有量を測定したところ、対照菌株ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｒｈｔＣと比べて、ＷＱＭ０２６／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｒｈｔＣによるＬ－スレオニンの合成収量は２．４９ｇ／Ｌに達しており、対照菌株ＭＧ１６５５／ｐＦＷ０１ ｔｈｒＡ＊ＢＣ ｒｈｔＣと比べて、２６６．１８％（３．６６倍）に向上した（図６Ｆ）。
【0054】
本発明は、好ましい実施形態によって上記のように開示されているが、本発明を限定するためのものではない。当業者であれば、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、いかなる変更及び修正を行うことができる。本発明の権利範囲は、特許請求の範囲により限定される範囲を基準とする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】