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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-21
(45)【発行日】2024-07-01
(54)【発明の名称】ユビキチン化欠損キメラ抗原受容体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240624BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240624BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240624BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240624BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240624BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240624BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240624BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240624BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240624BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240624BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240624BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240624BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240624BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C07K19/00
C12N15/867 Z
C07K16/28
C07K16/46
C12N5/10
C12N7/01
C12N15/13
A61K35/17
A61K38/17
A61P35/02
A61P37/04
C12P21/08
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021561800
(86)(22)【出願日】2019-10-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-04
(86)【国際出願番号】 CN2019114655
(87)【国際公開番号】W WO2020211330
(87)【国際公開日】2020-10-22
【審査請求日】2021-12-15
(31)【優先権主張番号】201910302508.X
(32)【優先日】2019-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518222745
【氏名又は名称】上海科技大学
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＴＥＣＨ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９３ Ｍｉｄｄｌｅ Ｈｕａｘｉａ Ｒｏａｄ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】王▲ハオ▼鵬
(72)【発明者】
【氏名】李文濤
(72)【発明者】
【氏名】邱士真
(72)【発明者】
【氏名】魏平
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／００７８６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／１２９４１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０８３５００６２（ＣＮ，Ａ）
【文献】Nature biotechnology，2018年，Vol.36，p.346-350
【文献】cancer cell，2015年，Vol.28，p.417-420
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １５／８６７
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ０７Ｋ １６／４６
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ７／０１
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含み、前記細胞外ドメインは抗原認識領域を含み、
前記細胞内ドメインは、順に連結される共刺激シグナル伝達領域とＣＤ３ζ細胞内領域を含み、共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域を形成しており、前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８細胞内領域又は４１ＢＢ細胞内領域から選択され、
前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域は、野生型の共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域内のリシンがアルギニンに突然変異して形成されたポリペプチドであり、前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域における全てのリシン部位がアルギニンに突然変異している、キメラ抗原受容体。
【請求項2】
（１）前記４１ＢＢ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され、（２）前記ＣＤ２８細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、
（３）前記ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、
（４）前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又は５に示される、
との特徴のうちの１又は複数を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
ａ．前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択され、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２及びＧＤ２のうちの１又は複数から選択され、ｂ．前記細胞外ドメインは、シグナルペプチド及び／又はヒンジ領域を更に含み、順に連結されるシグナルペプチド－抗原認識領域ヒンジ領域を形成しており、
ｃ．前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂの膜貫通領域から選択され、
ｄ．前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される、
との特徴のうちの１又は複数を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のキメラ抗原受
容体。
【請求項4】
特徴ａにおいて、前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３又は１４ｇ２ａから選択されることを特徴とする請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
特徴ｂにおいて、前記シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチドから選択され、及び／又は、前記ヒンジ領域はＣＤ８αのヒンジ領域から選択されることを特徴とする請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
（１）請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、（２）（１）の前記ポリヌクレオチドの配列の相補的ポリヌクレオチド、から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されることを特徴とする請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【請求項9】
ベクターであることを特徴とする請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項10】
レンチウイルスベクターであり、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、及び請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項11】
請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むレンチウイルス。
【請求項12】
請求項１１に記載のレンチウイルスを用いてＴ細胞を感染させるステップを含むＴ細胞の体外活性化方法。
【請求項13】
遺伝子組み換えＴ細胞を含む薬物組成物であって、前記Ｔ細胞は、請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含むか、或いは請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸構築物を含むか、或いは請求項１１に記載のレンチウイルスに感染されているか、或いは請求項１２に記載の方法で作製された体外にて活性化されたＴ細胞である、ことを特徴とする薬物組成物。
【請求項14】
請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６又は７に記載のポリヌクレオチド、請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸構築物又は請求項１１に記載のレンチウイルス、又は請求項１３に記載の薬物組成物を、腫瘍治療薬の製造に適用する方法。
【請求項15】
前記腫瘍は、白血病及びリンパ腫のうちの１又は複数から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラ抗原受容体の分野に関し、具体的には、ユビキチン化欠損キメラ抗原受容体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体は、ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と略称され、特定の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲが搭載されたＴ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞と称する。ＣＡＲ－Ｔ療法は、養子免疫細胞療法に続く優れた治療法であり、すでに様々な腫瘍（特に、血液系腫瘍）の治療において明らかな効果を得ている。２０１７年、米国ＦＤＡは、ＣＤ１９抗原を標的とする商業化された２種類のＣＡＲ－Ｔ製品について、悪性白血病及びリンパ腫治療への適用を承認しており、治療効果が目覚ましい。しかし、固形腫瘍の治療において、ＣＡＲ－Ｔ療法には依然として多くの制限が存在する。これについては、様々な要因に起因してＣＡＲ－Ｔ細胞が患者の体内で有効に増殖し続けられないことが、ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍活性を制限する主な原因の１つであると考えられている。研究の結果、血液腫瘍の治療か固形腫瘍の治療かに関わらず、体内におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能力を強化させれば、ＣＡＲ－Ｔ治療の効果を著しく改善可能なことが証明されている。これは、ＣＡＲ－Ｔ設計の最適化に対し１つの方向性を示すものである。既存の最適化設計ストラテジーでは、主に、ＣＡＲ－Ｔ細胞内にＴ細胞の肝細胞性及び増殖能力を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８等（１３－１５））を共発現させている。しかし、こうした設計は、往々にして作製の難易度が高く、形質転換効率が低い等の要因から、一定規模以上の工業生産や臨床実践が制限されている。
【0003】
よって、ＣＡＲ構造そのものを対象とした改変設計がより好ましい方案と考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、ユビキチン化欠損キメラ抗原受容体及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の局面において、キメラ抗原受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む。
【0006】
前記細胞外ドメインは抗原認識領域を含む。
【0007】
前記細胞内ドメインは、順に連結される共刺激シグナル伝達領域とＣＤ３ζ細胞内領域を含み、共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域を形成している。
【0008】
前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域は、野生型の共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域内のリシンがアルギニンに突然変異して形成されたポリペプチドである。
【0009】
本発明は、第２の局面において、ポリヌクレオチド配列を提供する。当該ポリヌクレオチド配列は、（１）請求項で記載するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で記載したポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
【0010】
本発明は、第３の局面において、核酸構築物を提供する。前記核酸構築物は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【0011】
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
【0012】
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであり、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【0013】
本発明は、第４の局面において、レンチウイルスを提供する。前記レンチウイルスは前記核酸構築物を含む。
【0014】
本発明は、第５の局面において、Ｔ細胞の体外活性化方法を提供する。前記方法は、前記レンチウイルスを前記Ｔ細胞に感染させるステップを含む。
【0015】
本発明は、第６の局面において、遺伝子組み換えＴ細胞、又は当該遺伝子組み換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。特徴として、前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、或いは前記核酸構築物を含むか、或いは前記レンチウイルスに感染されているか、或いは前記方法で作製される。
【0016】
本発明は、第７の局面において、前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物又は前記レンチウイルスの、活性化Ｔ細胞の作製及び／又はＴ細胞の分解抑制における使用を提供する。
【0017】
本発明は、第８の局面において、前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルス又は前記遺伝子組み換えＴ細胞を、（１）腫瘍治療薬の製造、（２）腫瘍殺傷効率の向上、（３）Ｔ細胞の増殖能力の維持、（４）腫瘍成長の抑制、のうちの１又は複数の用途に適用する方法を提供する。
【0018】
好ましくは、前記腫瘍は、白血病又はリンパ腫のうちの１又は複数から選択される。
【0019】
より好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択される。
【0020】
本発明は、第９の局面において、細胞療法を提供する。当該細胞療法において、Ｔ細胞は前記ＣＡＲを発現するよう遺伝子組み換えがなされ、ＣＡＲ－Ｔ細胞はこれを必要とする適用者に注入される。
【発明の効果】
【0021】
上述したように、本発明におけるユビキチン化欠損キメラ抗原受容体及びその使用は、以下の有益な効果を有する。
【0022】
本発明では、ＣＡＲの細胞内セグメントにおける全てのリシン部位をアルギニンに突然変異させることで、抗原刺激後にＣＡＲに発生するユビキチン修飾を阻害した。当該ストラテジーは、異なるＣＡＲや、変換の異なる細胞内共刺激領域のいずれにも適用可能である。
【0023】
また、このような改変方法を細胞内共刺激領域が４１ＢＢであるＣＡＲ－Ｔに適用したところ、従来の４１ＢＢ ＣＡＲ－Ｔと比較して、ＫＲを突然変異させたこの種のＣＡＲ－Ｔは、体外培養時に標的細胞刺激にいっそう良好に反応して増殖し、セントラルメモリーＴ細胞への分化に傾いた表現型を有した。且つ、長期間にわたる体外腫瘍殺傷試験におい
て、この種のＣＡＲ－Ｔはより強い殺傷活性を示した。強化されたこのような表現型は、４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが代謝においていっそう酸化的リン酸化依存となるのに有利であり、より強いミトコンドリア生成能力及び機能を有した。且つ、改変した４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔは、従来の４１ＢＢ ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの抗酸化タンパク質産物を産生可能であり、細胞の生存及び増殖能力が強化された。
て、この種のＣＡＲ－Ｔはより強い殺傷活性を示した。強化されたこのような表現型は、４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが代謝においていっそう酸化的リン酸化依存となるのに有利であり、より強いミトコンドリア生成能力及び機能を有した。且つ、改変した４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔは、従来の４１ＢＢ ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの抗酸化タンパク質産物を産生可能であり、細胞の生存及び増殖能力が強化された。
【0024】
更に、本発明は、腫瘍マウスモデルにおいて、４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔと４１ＢＢ ＷＴ ＣＡＲ－Ｔの体内抗腫瘍効果を比較した。増殖レベルにおいて、４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ－Ｔは、より強い増殖反応を有しており、且つ増殖能力が一段と持続的であった。また、細胞分化表現型においては、脾臓、血液或いは腫瘍のいずれにおいても、改変されたＣＡＲ－Ｔはより多くのセントラルメモリーＴ細胞を蓄積し、ターミナルエフェクターＴ細胞への分化は減少した。よって、改変したＣＡＲ－Ｔは、より有効に腫瘍組織を浸潤して殺傷することが可能であり、Ｔ細胞注射投与量が同一の場合には、改変したＣＡＲ－Ｔの方が腫瘍の成長を効果的に制御可能であった。
【0025】
本発明は、ＣＡＲ－Ｔの最適化及び改変のための方法を提供するものであって、特に、ＣＡＲ－Ｔが固形腫瘍内での増殖能力に劣るとの課題について解決策を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図2】図２は、ＫＲを突然変異させたＣＡＲのダウンモジュレーション及び分解抑制の結果を示す図である（図２のＡは、ヒト初代Ｔ細胞にＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ ＣＡＲ又はＫＲ ＣＡＲを発現させた後のユビキチン修飾の状況を比較したものである。図２のＢは、ヒト初代Ｔ細胞にＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ ＣＡＲ又はＫＲ ＣＡＲを発現させた後の標的細胞刺激に対する反応を比較したものである。図２のＣ及びＤは、ヒト初代Ｔ細胞上で、ＫＲの突然変異がＣＤ１９－ＣＤ２８ζ及びＧＤ２－ＣＤ２８ζＣＡＲのダウンモジュレーションに及ぼす影響を比較したものである。図２のＥは、ヒト初代Ｔ細胞上で、ＣＤ１９－４１ＢＢζＣＡＲの分解に対するＫＲの突然変異の影響をテストしたものである。図２のＦは、図２のＥの定量化結果であって、ＫＲの突然変異が当該反応におけるＣＡＲの分解を効果的に抑制したことを示している。図２のＧは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で、ＫＲの突然変異がＧＤ２－４１ＢＢζ、ＧＤ２－ＣＤ２８ζＣＡＲの分解に及ぼす影響をテストしたものである。図２のＨは、図２のＧの定量化結果であって、ＫＲの突然変異が抗原刺激誘導型のＣＡＲの分解を効果的に抑制したことを示している）。
【図3】図３は、ＫＲの突然変異がＣＡＲ－Ｔの体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）機能に及ぼす影響を示す図である（体外機能実験はいずれもヒト初代Ｔ細胞で実施した。図３のＡは、標的細胞刺激に反応した後のＣＡＲ－Ｔの増殖に対するＫＲの突然変異の影響を示している。図３のＢは、体外培養条件におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの分化状況を示しており、ＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＡを分化指標としてＦＡＣＳ分析を行ったものである。図３のＣは、図３のＢについての統計分析であって、ＫＲの突然変異によって、ＣＡＲ－Ｔがより多量にセントラルメモリーＴ細胞に分化した一方、ターミナルエフェクターＴ細胞への分化は減少したことを示している。図３のＤは、４日間標的細胞刺激した後のＣＡＲ－Ｔの分化表現型を示しており、ＣＡＲ－Ｔと放射線照射後の標的細胞を２：１の比率で共培養し、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＯを分化指標としてＦＡＣＳ分析を行ったものである。図３のＥは、図３のＤについての統計分析であって、ＫＲの突然変異によって、ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激への反応後により多くのセントラルメモリーＴ細胞を形成したことを示している。図３のＦは、ＣＡＲ－Ｔの体外殺傷活性テストを示している）。
【図4】図４は、ＣＤ１９－４１ＢＢζＫＲ ＣＡＲがより多くのセントラルメモリーＴ細胞を蓄積可能であること、及び強化された増殖表現型の分子基盤を有することを示す図である（この部分の実験は、いずれもヒト初代Ｔ細胞で実施及び検証した。図４のＡは、酸化代謝におけるＷＴ ＣＡＲ－ＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの差をシーホース社（Ｓｅａｈｏｒｓｅ）の計器で検出したものであり、検出細胞にはいずれも予め２週間の標的細胞刺激を施した。図４のＢは、図４のＡの主要パラメータについての統計分析を示す図である。図４のＣ及びＤは、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒを検出マーカーとして、ＦＡＣＳ検出方法及び共焦点蛍光検出方法のそれぞれによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強いミトコンドリア生成能力を有することを検証したものである。図４のＥは、放射線照射後の標的細胞による刺激前後のＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔについて、ミトコンドリアの生成及び機能に関連する４つの重要遺伝子の変化を蛍光定量ＰＣＲで検出したものである。図４のＦ及びＧは、ウエスタンブロット検出方法及びＦＡＣＳ検出方法のそれぞれによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後により多くの抗アポトーシス因子Ｂｃｌ－ｘＬを産生可能なことを検証したものである。図４のＨは、蛍光定量ＰＣＲを検出手段として、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後に、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの４１ＢＢ下流抗アポトーシス産物Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｆｌ１のｍＲＮＡを生成することを検証したものである）。
【図5】図５は、腫瘍マウスモデル体内におけるＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの機能を比較した図である（図５のＡは、体内におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲのダウンモジュレーション現象を比較したものである。図５のＢは、ＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの腫瘍浸潤効果を示している。図５のＣは、腫瘍マウス体内にＣＡＲ－Ｔ細胞を注射してから１０日後、２０日後、４０日後のマウス脾臓内におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの数量の変化を示している。図５のＤは、腫瘍マウスの脾臓内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したものである。図５のＥは、図５のＤについての統計分析図である。図５のＦは、腫瘍マウスの末梢血内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したものである。図５のＧは、図５のＦについての統計分析図である。図５のＨは、腫瘍組織内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したものである。図５のＩは、図５のＨについての統計分析図である）。
【図6】図６は、ＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍効果を比較した図である（図６のＡは、異なるＴ細胞を注射したＮＳＧマウス体内におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現した標的細胞の成長状況を示している。図６のＢは、図６のＡの定量化結果を示す図である）。
【図7】図７は、ＣＤ１９－４１ＢＢζ及びＣＤ１９－ＣＤ２８ζＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型に対するＫＲの突然変異の影響を比較した図である（図７のＡ及びＢは、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ細胞上にＣＤ１９－４１ＢＢζ又はＣＤ１９－ＣＤ２８ζ及び対応する突然変異型ＣＡＲを発現させた後のＣＤ６９及びＩＣＯＳの発現レベルを比較したものである。図７のＣは、ＣＤ１９－４１ＢＢζ又はＣＤ１９－ＣＤ２８ζ及び対応する突然変異型ＣＡＲを発現させたヒト初代Ｔ細胞のＰＤ－１発現レベルを示している。図中のＰＤ－１の相対的な発現レベルは、ＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現レベルを基準としている。図７のＤ～Ｇは、ＣＡＲを発現した後の初代Ｔ細胞の分化表現型の結果を示している。図７のＤ及びＥは、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現したＴ細胞を示しており、図７のＤはＣＤ４Ｔ細胞、図７のＥはＣＤ８Ｔ細胞を示している。図７のＦ及びＧは、ＧＤ２ ＣＡＲを発現したＴ細胞を示しており、図７のＦはＣＤ４Ｔ細胞、図７のＧはＣＤ８Ｔ細胞を示している）。
【図8】図８は、腫瘍細胞再刺激モデルに対するＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反応効果を比較した図である（図８のＡでは、マウスに２×１０６個の腫瘍細胞を皮下移植してから４日後に１．５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を注射して治療し、マウスの体全体から腫瘍信号が検出されなくなってから腫瘍細胞を再び移植した（尾静脈に１×１０６個の腫瘍細胞を注入）。矢印は、再刺激のタイミングを示しており、各線はマウス１匹を示している。図８のＢは、標的細胞で１０日間体外刺激した後の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞について、体内での抗腫瘍効果を比較したものである。皮下移植した腫瘍細胞は１×１０６個であり、４日後に尾静脈にＴ細胞を２×１０６個注射した。なお、マウスは各群６匹とした。図８のＣは、標的細胞で２１日間体外刺激した後の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞について、体内での抗腫瘍効果を比較したものである。皮下移植した腫瘍細胞は３×１０６個であり、４日後に尾静脈にＴ細胞を１×１０７個注射した。なお、マウスは各群４～６匹とした。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明で記載するキメラ抗原受容体は、順に連結される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを含む。
【0028】
前記細胞外ドメインは抗原認識領域を含む。
【0029】
前記細胞内ドメインは、順に連結される共刺激シグナル伝達領域とＣＤ３ζ細胞内領域を含み、共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域を形成している。
【0030】
前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域は、野生型の共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域内のリシンがアルギニンに突然変異して形成されたポリペプチドである。
【0031】
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４１ＢＢ又はＩＣＯＳの細胞内領域から選択される。
【0032】
好ましくは、前記共刺激シグナル伝達領域は、４１ＢＢ細胞内領域又はＣＤ２８細胞内領域から選択される。
【0033】
一実施形態において、前記４１ＢＢ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される（４１ＢＢ ＫＲ）。具体的には、以下である。
【0034】
ＲＲＧＲＲＲＬＬＹＩＦＲＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ。
【0035】
一実施形態において、前記ＣＤ２８細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される（ＣＤ２８ＫＲ）。具体的には、以下である。
【0036】
ＲＳＲＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＲＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ。
【0037】
一実施形態において、前記ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される（ＣＤ３ＫＲ）。具体的には、以下である。
【0038】
ＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。
【0039】
一実施形態において、前記共刺激シグナル伝達領域－ＣＤ３ζ細胞内領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（４１ＢＢ－ＣＤ３ＫＲ）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＣＤ２８－ＣＤ３ＫＲ）に示される。具体的には、以下である。
【0040】
ＲＲＧＲＲＲＬＬＹＩＦＲＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）
【0041】
ＲＳＲＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＲＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
【0042】
一実施形態において、前記抗原認識領域は、腫瘍表面抗原を標的とする一本鎖抗体から選択される。また、前記腫瘍表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、Ｈｅｒ２、ＩＬ１３Ｒα２及びＧＤ２のうちの１又は複数から選択される。
【0043】
好ましくは、ＣＤ１９又はＧＤ２から選択される。
【0044】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。
【0045】
一実施形態において、前記軽鎖可変領域と前記重鎖可変領域はリンカー配列で連結されている。
【0046】
一実施形態において、前記一本鎖抗体はＦＭＣ６３又は１４ｇ２ａから選択される。
【0047】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体ＦＭＣ６３の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
【0048】
一実施形態において、前記一本鎖抗体は、モノクローナル抗体１４ｇ２ａの軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域が選択的にリンカー配列で連結されている。
【0049】
更に、前記細胞外ドメインは、シグナルペプチド及び／又はヒンジ領域を含み、順に連結されるシグナルペプチド－抗原認識領域ヒンジ領域を形成している。
【0050】
好ましくは、前記シグナルペプチドはＣＤ８αシグナルペプチドから選択され、及び／又は、前記ヒンジ領域はＣＤ８αのヒンジ領域から選択される。
【0051】
一実施形態において、前記抗原認識領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。具体的には、以下である。
【0052】
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、抗ＣＤ１９（ＦＭＣ６３））。
【0053】
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、抗ＧＤ２（１４ｇ２ａ））
【0054】
一実施形態において、ＣＤ８αシグナルペプチドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される。具体的には、以下である。
【0055】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ。
【0056】
一実施形態において、前記ＣＤ８αのヒンジ領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。具体的には、以下である。
【0057】
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ。
【0058】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＯＸ４０又はＨ２－Ｋｂの膜貫通領域から選択される。好ましくは、ＣＤ８αの膜貫通領域から選択される。
【0059】
一実施形態において、前記ＣＤ８αの膜貫通領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される。具体的には、以下である。
【0060】
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ。
【0061】
一実施形態において、前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１４に示される。具体的には、以下である。
【0062】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＲＧＲＲＲＬＬＹＩＦＲＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＣＤ１９ ４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ）
【0063】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷ
ＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＳＲＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＲＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＣＤ１９ ＣＤ２８ ＫＲ ＣＡＲ）
ＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＳＲＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＲＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＣＤ１９ ＣＤ２８ ＫＲ ＣＡＲ）
【0064】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＲＧＲＲＲＬＬＹＩＦＲＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＧＤ２ ４１ＢＢ ＫＲ
ＣＡＲ）
ＣＡＲ）
【0065】
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＲＳＲＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＲＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＲＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＲＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＲＰＱＲＲＲＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＲＤＲＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＲＧＥＲＲＲＧＲＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＲＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＧＤ２ ＣＤ２８ ＫＲ ＣＡＲ）
【0066】
本発明のキメラ抗原受容体における上記各部分を形成する際には、互いを直接連結してもよいし、リンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列は、当該分野において周知の抗体に適用されるリンカー配列とすればよく、例えば、Ｇ及びＳを含むリンカー配列とする。通常、リンカーは、前後が繰り返される１又は複数のモチーフを含む。例えば、当該モチーフは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＳＳＧ、ＧＳＧＳＡ及びＧＧＳＧＧとすることができる。好ましくは、当該モチーフは、リンカー配列において隣接しており、繰り返し間にアミノ酸残基は挿入されない。リンカー配列は、１個、２個、３個、４個又は５個の繰り返しモチーフを含んで構成可能である。リンカーの長さは３～２５個のアミノ酸残基とすることができ、例えば、３～１５個、５～１５個、１０～２０個のアミノ酸残基とする。いくつかの実施方案において、リンカー配列はポリグリシンリンカー配列である。
リンカー配列中のグリシンの数に特に制限はなく、通常は２～２０個とし、例えば、２～１５個、２～１０個、２～８個とする。グリシン及びセリン以外にも、リンカーは、その他の既知のアミノ酸残基（例えばアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等）を含み得る。
リンカー配列中のグリシンの数に特に制限はなく、通常は２～２０個とし、例えば、２～１５個、２～１０個、２～８個とする。グリシン及びセリン以外にも、リンカーは、その他の既知のアミノ酸残基（例えばアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等）を含み得る。
【0067】
理解すべき点として、遺伝子クローン操作では、適切な酵素切断部位の設計を要することが多い。その場合、発現するアミノ酸配列の末端に必然的に１又は複数の無関係な残基が導入されるが、これが標的配列の活性に影響することはない。また、融合タンパク質の作製、組換えタンパク質の発現促進、宿主細胞外に自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、或いは組換えタンパク質の有利な精製のためには、組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は当該タンパク質内のその他の適切な領域内（例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長等を含むが、これらに限らない）に何らかのアミノ酸を添加せねばならないことが多い。そのため、本発明の融合タンパク質（即ち、上記のＣＡＲ）のＮ末端又はＣ末端は、タンパク質タグとして、１又は複数のポリペプチドフラグメントを更に含んでもよい。本文では、任意の適切なタグを適用可能である。例えば、前記タグは、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ、Ｐｏｌｙ－Ａｒｇ、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇＩＩ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ及びＴｙ１とすることができる。これらのタグは、タンパク質の精製に適用可能である。
【0068】
本発明で提供するポリヌクレオチド配列は、（１）請求項で記載するキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列と、（２）（１）で記載したポリヌクレオチド配列の相補的配列、から選択される。
【0069】
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８で示される。具体的には、以下である。
【0070】
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣｔＡＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＡ
ＧＴＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧｃａｇＡＧＡＡＧＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＴＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＣＤ１９ ４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ）
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【0071】
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【0072】
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＡＴＡＴＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＧＧＡＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＴＡＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＴＣＴＣＧＧＧＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＧＡＡＧＴＡＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧＧＴＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＡＣＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＴＣＴＣＴＣｇａａＴＧＧＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＣＧＡＣＡＣＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡＴＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣｔＡＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＣＧＣＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧｃａｇＡＧＡＡＧＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＡＴＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＧＣ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＧＤ２ ４１ＢＢ ＫＲ ＣＡＲ）
【0073】
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴ
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【0074】
本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ形式であってもよいし、ＲＮＡ形式であってもよい。ＤＮＡ形式は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは、１本鎖であってもよいし、２本鎖であってもよい。また、ＤＮＡは、コード鎖であってもよいし、非コード鎖であってもよい。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の縮重バリアントも含む。即ち、同一のアミノ酸配列をコードするがヌクレオチド配列の一部が異なるヌクレオチド配列も含む。
【0075】
通常、本文中で記載するポリヌクレオチド配列はＰＣＲ増幅法で取得可能である。具体的には、本文中で開示するヌクレオチド配列（特に、オープンリーディングフレーム配列）に基づいてプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリか、当業者にとって既知の一般的な方法で作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として用い、増幅することで関連の配列を取得する。配列が長い場合には、２回又は複数回のＰＣＲ増幅を行った後、各回で増幅した断片を正しい順序で連結せねばならないことが多い。
【0076】
本発明で提供する核酸構築物は、上記のポリヌクレオチド配列を含む。
【0077】
前記核酸構築物は、更に、上記のポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１又は複数の調節配列を含む。本発明で記載するＣＡＲのコード配列は、前記タンパク質の発現を保証するために、様々な方式で操作可能である。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの違いや要求に応じて、核酸構築物を操作してもよい。組換えＤＮＡ手法を利用してポリヌクレオチド配列を変更する技術は、当該分野において既知である。
【0078】
調節配列は、適切なプロモーター配列とすることができる。通常、プロモーター配列は、発現されるタンパク質のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。
【0079】
調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列とすることができる。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作的に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。
【0080】
調節配列は、宿主細胞の翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列としてもよい。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である。
【0081】
好ましくは、前記核酸構築物はベクターである。
【0082】
通常は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を操作可能にプロモーターに連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことで、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列の発現を実現する。当該ベクターは、真核細胞の複製及び統合にとって適切となり得る。代表的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節可能な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
【0083】
本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、数多くのタイプのベクターにクローニング可能である。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドにクローニング可能である。更に、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクター形式で細胞に提供可能である。ウイルスベクター技術は当該分野において公知である。ベクターとして用い得るウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれる（但し、これらに限らない）。通常、適切なベクターには、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製起点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、及び１又は複数の選択可能なマーカーが含まれる。
【0084】
より好ましくは、前記核酸構築物はレンチウイルスベクターであり、複製起点、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ及び前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【0085】
適切なプロモーターの一例としては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列が挙げられる。当該プロモーター配列は、自身に操作可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列を高水準で発現可能とする強い構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例としては、伸長因子－１α（ＥＦ－１α）が挙げられる。ただし、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕ
ＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルスの最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーター。但し、これらに限らない）を含む（但し、上記に限らない）その他の構成型プロモーター配列を使用してもよい。更に、誘導型プロモーターの使用を検討してもよい。誘導型プロモーターを使用することで分子スイッチが提供される。分子スイッチは、一過性発現時において、誘導型プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンとすることができ、発現を期待しない場合には発現をオフとする。誘導型プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる（但し、これらに限らない）。
ＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルスの最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びヒト遺伝子プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーター。但し、これらに限らない）を含む（但し、上記に限らない）その他の構成型プロモーター配列を使用してもよい。更に、誘導型プロモーターの使用を検討してもよい。誘導型プロモーターを使用することで分子スイッチが提供される。分子スイッチは、一過性発現時において、誘導型プロモーターに操作可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンとすることができ、発現を期待しない場合には発現をオフとする。誘導型プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる（但し、これらに限らない）。
【0086】
ＣＡＲのポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子うちのいずれか一方又は双方を含んでもよい。このことは、ウイルスベクターによってトランスフェクション又は感染を試みた細胞群から発現細胞を鑑定及び選択するのに都合がよい。他方で、選択可能なマーカーは、単独のＤＮＡ断片に保持されてコトランスフェクション手順に使用することが可能である。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の双方のフランキングには、宿主細胞内で発現可能となるよう、いずれも適切な調節配列が備わっている。有効な選択可能なマーカーには、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【0087】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞の鑑定に用いられると共に、調節配列の機能性評価にも用いられる。ＤＮＡが受容細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現が適切なタイミングで測定される。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る。また、適切な発現システムは、公知且つ既知の技術で作製可能であるか、商業的に取得される。
【0088】
遺伝子を細胞に導入する方法及び遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該分野において既知である。ベクターは、当該分野における任意の方法で容易に宿主細胞（例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞）に導入可能である。例えば、発現ベクターは、物理、化学又は生物学的手段で宿主細胞に導入可能である。
【0089】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。また、興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターを使用する方法が含まれる。また、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズといったコロイド分散系や、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。
【0090】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法には、ウイルスベクター（特に、レンチウイルスベクター）を使用する方法が含まれる。これは、遺伝子を哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に導入するための最も汎用的な方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス等から入手可能である。遺伝子を哺乳動物の細胞に導入するための数多くのウイルスベースのシステムがすでに開発されており、例えば、レンチウイルスによって、遺伝子導入システムに用いられる便利なプラットフォームが提供されている。当該分野において既知の技術を用いれば、選択した遺伝子をベクターに導入し、レンチ
ウイルス粒子にパッケージングすることが可能である。当該組換えウイルスは、その後分離して体内又は体外の対象細胞に導入可能となる。当該分野では、数多くのレトロウイルスシステムが知られている。また、いくつかの実施方案では、アデノウイルスベクターを使用する。当該分野では、数多くのアデノウイルスベクターが知られている。また、一実施方案では、レンチウイルスベクターを使用する。
ウイルス粒子にパッケージングすることが可能である。当該組換えウイルスは、その後分離して体内又は体外の対象細胞に導入可能となる。当該分野では、数多くのレトロウイルスシステムが知られている。また、いくつかの実施方案では、アデノウイルスベクターを使用する。当該分野では、数多くのアデノウイルスベクターが知られている。また、一実施方案では、レンチウイルスベクターを使用する。
【0091】
本発明は、レンチウイルスを提供する。前記レンチウイルスは上記の核酸構築物を含む。また、好ましくは前記ベクターを含み、より好ましくは、前記レンチウイルスベクターを含む。
【0092】
本発明は、Ｔ細胞の体外活性化方法を提供する。前記方法は、前記レンチウイルスを前記Ｔ細胞に感染させるステップを含む。
【0093】
本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、体内でＴ細胞の安定的な増殖と、血液及び骨髄における高水準での持続的延長時間を経て、特異的メモリーＴ細胞を形成可能である。いかなる具体的理論にも拘束されることなく、代替抗原を発現する標的細胞に遭遇し、その後これが除去された場合、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、体内でセントラルメモリー様状態に分化可能である。
【0094】
本発明は、更に、細胞療法を含む。当該細胞療法において、Ｔ細胞は本文中で記載するＣＡＲを発現するよう遺伝子組み換えがなされる。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、これを必要とする適用者に注入される。注入された細胞は、適用者の腫瘍細胞を殺傷可能である。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で複製可能であって、持続的に腫瘍を制御可能な長期持続性を発揮する。
【0095】
ＣＡＲ－Ｔ細胞が発揮する抗腫瘍免疫反応は、能動的又は受動的な免疫反応である。このほか、ＣＡＲにより誘導される免疫反応は、養子免疫細胞療法のステップの一部分となり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲの抗原結合部分に対して特異的な免疫反応を誘導する。
【0096】
治療可能な癌は、血液腫瘍（例えば、白血病やリンパ腫）のような非固形腫瘍とすることができる。特に、本発明のＣＡＲ、そのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス及びＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて治療可能な疾病は、好ましくはＣＤ１９誘導性の疾病であり、特にＣＤ１９誘導性の血液腫瘍である。
【0097】
具体的に、本文中の「ＣＤ１９誘導性の疾病」には、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病といった白血病及びリンパ腫が含まれる（但し、これらに限らない）。
【0098】
本発明は、遺伝子組み換えＴ細胞、又は当該遺伝子組み換えＴ細胞を含む薬物組成物を提供する。前記細胞は、前記ポリヌクレオチド配列を含むか、或いは前記核酸構築物を含むか、或いは前記レンチウイルスに感染されているか、或いは前記方法で作製される。
【0099】
本発明のＣＡＲ－修飾Ｔ細胞は、単独で投与してもよいし、薬物組成物として、希釈剤及び／又はその他の成分（例えば、関連のサイトカイン又は細胞群）と組み合わせて投与してもよい。簡単に言うと、本発明の薬物組成物には、本文中で記載したＣＡＲ－Ｔ細胞と、１又は複数種類の薬学的又は生理学的に許容可能なベクター、希釈剤又は賦形剤の組み合わせが含まれ得る。このような組成物には、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水、硫酸塩緩衝生理食塩水等）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖又はデキストラン、マンニトール）、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば
、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤が含まれ得る。
、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤が含まれ得る。
【0100】
本発明の薬物組成物は、治療（又は予防）対象の疾病に適した方式で投与される。投与の数量及び頻度は、例えば、患者の病症、患者の疾病タイプ及び深刻度といった要素から決定する。
【0101】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍－抑制有効量」又は「治療量」を示す場合、投与対象の本発明の組成物の正確な量は医師により決定される。その際には、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び病症の個体差が考慮される。通常、本文中で記載するＴ細胞を含む薬物組成物の投与量は、１０４～１０９細胞／ｋｇ（体重）、好ましくは、１０５～１０６細胞／ｋｇ（体重）とすることができる。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法において公知の注入技術で投与可能である。具体的な患者に対する最適な投与量及び治療プランについては、医療分野の技術者であれば、患者の疾病の兆候を観察し、それにより治療を調節することで容易に決定可能である。
【0102】
対象組成物の投与は、噴霧法、注射、内服、点滴、埋め込み又は移植を含む任意の容易な方式で実施可能である。本文中で記載する組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射又は腹膜内注射によって患者に投与可能である。一実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与する。他の実施方案において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈注射によって投与する。また、Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注入可能である。
【0103】
本発明のいくつかの実施方案において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はその組成物は、当該分野において既知のその他の治療法と組み合わせ可能である。前記治療法には、化学療法、放射線治療及び免疫抑制剤が含まれる（但し、これらに限らない）。例えば、各種の放射線治療製剤を組み合わせて治療することが可能である。これらの放射線治療製剤には、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ＦＫ５０６、フルダラビン、ラパマイシン及びミコフェノール酸等が含まれる。更なる実施方案において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植や、化学療法薬（例えば、フルダラビン）、放射線外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド又は抗体（例えば、ＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ）を利用したＴ細胞アブレーション療法と組み合わせて（例えば、事前、同時又は事後）患者に投与する。
【0104】
本文中の「抗腫瘍効果」とは生物学的な効果を意味し、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、推定寿命の延長又は癌関連の各種生理的症状の改善によって示すことができる。
【0105】
「患者」、「対象」「個体」等は、本文中で互換的に使用可能であり、免疫反応を発揮し得る生体有機体（例えば、哺乳動物）を意味する。これには、例えば、ヒト、犬、猫、マウス、ラット及びその遺伝子組換え種が含まれる（但し、これらに限らない）。
【0106】
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物又は前記レンチウイルスは、活性化Ｔ細胞の作製及び／又はＴ細胞の分解抑制に適用される。
【0107】
前記キメラ抗原受容体、前記ポリヌクレオチド配列、前記核酸構築物、前記レンチウイルス又は前記遺伝子組み換えＴ細胞は、（１）腫瘍治療薬の製造、（２）腫瘍殺傷効率の向上、（３）Ｔ細胞の増殖能力の維持、（４）腫瘍成長の抑制、のうちの１又は複数の用途に適用される。
【0108】
好ましくは、前記腫瘍は、白血病又はリンパ腫のうちの１又は複数から選択される。
【0109】
より好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病及び急性骨髄性白血病から選択される。
【0110】
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は適用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び適用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
【0111】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、理解すべき点として、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らない。更に、理解すべき点として、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではない。また、本発明の明細書及び特許請求の範囲では、別途明示しない限り、「１つ」、「一の」及び「この」といった単数形には複数形が含まれる。
【0112】
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と同義である。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【0113】
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。
【実施例】
【0114】
実施例１：ＣＡＲのベクター作製
本発明で使用するＣＤ１９及びＧＤ２ ＣＡＲの抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）配列は、それぞれ臨床で使用するＦＭＣ６３及び１４ｇ２ａ配列から取得した。ＣＡＲの細胞外セグメント構造は、ＣＤ８αシグナルペプチド配列、ｍｙｃタグ配列、ｓｃＦｖ配列、ＣＤ８αのヒンジ配列を直列に連結して構成した。また、膜貫通領域配列はＣＤ８αの膜貫通領域配列とした。細胞内セグメント構造は、ヒトの４１ＢＢ細胞内セグメント配列又はＣＤ２８細胞内セグメント配列にヒトのＣＤ３ζ細胞内セグメント配列を直列に連結して構成した。以上のアミノ酸配列及び細胞内セグメントのリシンをアルギニンに突然変異させたアミノ酸配列は、いずれもコドンを最適化した後に塩基配列に変換し、企業（Ｑｉｎｇｌａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて合成した。本発明における全てのＣＡＲの塩基配列は、共焦点蛍光顕微鏡撮影実験で使用する一部のＣＡＲをｐＨＲ－ｈＥＦ１α－ＥＧＦＰベクターにクローニングした以外は、最終的にギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）連結方式（ＮＥＢ＃Ｅ２６１１Ｌ）でｐＨＲ－ｈＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰベクターにクローニングした。
本発明で使用するＣＤ１９及びＧＤ２ ＣＡＲの抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）配列は、それぞれ臨床で使用するＦＭＣ６３及び１４ｇ２ａ配列から取得した。ＣＡＲの細胞外セグメント構造は、ＣＤ８αシグナルペプチド配列、ｍｙｃタグ配列、ｓｃＦｖ配列、ＣＤ８αのヒンジ配列を直列に連結して構成した。また、膜貫通領域配列はＣＤ８αの膜貫通領域配列とした。細胞内セグメント構造は、ヒトの４１ＢＢ細胞内セグメント配列又はＣＤ２８細胞内セグメント配列にヒトのＣＤ３ζ細胞内セグメント配列を直列に連結して構成した。以上のアミノ酸配列及び細胞内セグメントのリシンをアルギニンに突然変異させたアミノ酸配列は、いずれもコドンを最適化した後に塩基配列に変換し、企業（Ｑｉｎｇｌａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて合成した。本発明における全てのＣＡＲの塩基配列は、共焦点蛍光顕微鏡撮影実験で使用する一部のＣＡＲをｐＨＲ－ｈＥＦ１α－ＥＧＦＰベクターにクローニングした以外は、最終的にギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）連結方式（ＮＥＢ＃Ｅ２６１１Ｌ）でｐＨＲ－ｈＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰベクターにクローニングした。
【0115】
実施例２：ヒト初代Ｔ細胞の培養及びレンチウイルス感染
ヒト初代Ｔ細胞は、いずれも事情を理解している健康な志願者から採取した。初代Ｔ細胞は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した（以上の試薬はいずれもＧ
ｉｂｃｏ社から購入した）。Ｔ細胞の増殖を維持するために、培地には１００Ｕ／ｍｌのｈＩＬ－２（シグマアルドリッチ社）を添加した。
ヒト初代Ｔ細胞は、いずれも事情を理解している健康な志願者から採取した。初代Ｔ細胞は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した（以上の試薬はいずれもＧ
ｉｂｃｏ社から購入した）。Ｔ細胞の増殖を維持するために、培地には１００Ｕ／ｍｌのｈＩＬ－２（シグマアルドリッチ社）を添加した。
【0116】
レンチウイルスの作製：２．２×１０５個のＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（タカラ社＃６３２１８０）を１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社＃１１９９５－０６５）に再懸濁し、６ウェル細胞培養プレート（コーニング社＃ＣＬＳ３５１６）内で２４時間培養した。リポソームトランスフェクションシステム（Ｍｉｒｕｓ社＃２３００）を利用して、５００ｎｇのレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＣＭＶｄＲ８．９２（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８４５５）及びｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）と５００ｎｇのパッケージング対象のレンチウイルスプラスミドをリポソームトランスフェクションの説明書の操作手順に基づいてＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞培地に加えた。そして、４８時間後に細胞上清を収集し、－８０℃の冷蔵庫内に凍結保存して備えた。
【0117】
初代Ｔ細胞のレンチウイルス感染：抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズ（ライフテクノロジーズ社＃１１１３２Ｄ）を使用してＴ細胞を活性化させた。Ｔ細胞と磁気ビーズを１：３の比率で２４時間共培養した後、作製済みのレンチウイルスを加えて感染させた。そして、１８時間後に細胞上清を取り除き、新鮮なＴ細胞完全培地に交換した。Ｔ細胞を磁気ビーズで５日間刺激した後に磁気ビーズを取り除き、２～３日置きに新鮮なＴ細胞完全培地を補充した。
【0118】
実施例３：フローサイトメトリー分析
細胞表面マーカーの染色：抗体をＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝液ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清）に希釈した後、４℃の暗環境下で細胞と２５分間共培養した。
細胞表面マーカーの染色：抗体をＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝液ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清）に希釈した後、４℃の暗環境下で細胞と２５分間共培養した。
【0119】
細胞内マーカーの染色：まず、４％のポリアセタール（Ｍｅｉｌｕｎｂｉｏ社＃ＭＡ０１９２）を用い、細胞を室温で１５分間固定した後、予め冷却しておいたメタノールを用いて氷上で５０分間膜破壊した。その後、室温の暗環境下で抗体希釈液（及び表面染色）と６０分間共培養して染色した。また、Ｚｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社＃４２３１１４）を使用して細胞の生死状態を区別した。
【0120】
フローサイトメトリーのデータは、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ バイオサイエンス社）によって取得し、ＦｌｏｗＪｏ ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を使用してデータ分析を行った。フローサイトメトリーに使用した抗体情報のリストを以下に示す。
【0121】
【表1】
【0122】
実施例４：共焦点蛍光イメージング
細胞のリソソーム及びミトコンドリアのイメージングを生細胞状態で行った。リソソームとミトコンドリアは、それぞれＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（インビトロジェン社＃Ｌ７５２８）及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社＃Ｍ７５１０）でマーカー染色した。染色の方式としては、染料を１：１０００の希釈比で培地に加え、３７℃のインキュベーター内で細胞と３０分間共培養した。細胞画像は、Ａ１Ｒ－ｓｉ顕微鏡（ニコン）又はＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ顕微鏡（ライカ）で取得した。
細胞のリソソーム及びミトコンドリアのイメージングを生細胞状態で行った。リソソームとミトコンドリアは、それぞれＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（インビトロジェン社＃Ｌ７５２８）及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社＃Ｍ７５１０）でマーカー染色した。染色の方式としては、染料を１：１０００の希釈比で培地に加え、３７℃のインキュベーター内で細胞と３０分間共培養した。細胞画像は、Ａ１Ｒ－ｓｉ顕微鏡（ニコン）又はＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ顕微鏡（ライカ）で取得した。
【0123】
腫瘍組織切片の染色：まず、切り取った腫瘍組織を４％のポリアセタール内に浸漬して、４℃で一晩固定した。次に、固定した腫瘍組織を３０％のショ糖溶液に投入し、組織片が底に沈むまで脱水した後、ＯＣＴコンパウンド（サクラ社＃４５８３）を使用して組織を固定及び包埋した。続いて、クリオスタット（ライカ）を使用して包埋組織を８μｍの組織切片に切断してから染色した。細胞核は、ヘキスト染色（インビトロジェン社＃Ｈ１３９９）によって識別した。染色方式としては、染料を１：１０００の希釈比でＰＢＳ緩衝液中に加え、切片に滴下してから室温で遮光しつつ１０分間培養した。余分な染料はＰＢ
Ｓ緩衝液で洗い落とした。ＣＡＲ－Ｔ細胞はＥＧＦＰ蛍光を有し、標的細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を有していたため、顕微鏡によって２種類の細胞を直接識別可能であった。７０％のグリセリンを切片に滴下し、カバーガラスで覆った後、マニキュアでスライドガラスの縁をシールすることでプレパラート作製を完了した。組織切片画像は、ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ顕微鏡で取得した。
Ｓ緩衝液で洗い落とした。ＣＡＲ－Ｔ細胞はＥＧＦＰ蛍光を有し、標的細胞はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を有していたため、顕微鏡によって２種類の細胞を直接識別可能であった。７０％のグリセリンを切片に滴下し、カバーガラスで覆った後、マニキュアでスライドガラスの縁をシールすることでプレパラート作製を完了した。組織切片画像は、ＴＣＳ ＳＰ８ ＳＴＥＤ顕微鏡で取得した。
【0124】
実施例５：細胞の代謝分析
ＸＦ２４シーホース細胞外フラックスアナライザー（シーホースバイオサイエンス社）を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア機能をテストした。まず、ポリ－Ｌ－リシン（シグマアルドリッチ社＃Ｐ４８３２）でＸＦ２４細胞培養プレートをコーティングした後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１ウェルあたり１．５×１０５個の数量で、２ｍＭのＬ－グルタミン、５．５ｍＭのグルコース及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁して３０分間培養した。次に、ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザーをキャリブレーションした。キャリブレーション手順は計器の使用説明書を参照した。また、キャリブレーションと同時に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＯ２が存在しないインキュベーター内に載置して培養した。そして、１μＭのオリゴマイシン、２μＭの２，４－ジニトロフェノール、及び４０ｎＭのロテノン、及び１μＭのアンチマイシンＡ（以上の阻害剤はいずれもシーホースバイオサイエンス社から入手した）を使用して細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。
ＸＦ２４シーホース細胞外フラックスアナライザー（シーホースバイオサイエンス社）を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞のミトコンドリア機能をテストした。まず、ポリ－Ｌ－リシン（シグマアルドリッチ社＃Ｐ４８３２）でＸＦ２４細胞培養プレートをコーティングした後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を１ウェルあたり１．５×１０５個の数量で、２ｍＭのＬ－グルタミン、５．５ｍＭのグルコース及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁して３０分間培養した。次に、ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザーをキャリブレーションした。キャリブレーション手順は計器の使用説明書を参照した。また、キャリブレーションと同時に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＯ２が存在しないインキュベーター内に載置して培養した。そして、１μＭのオリゴマイシン、２μＭの２，４－ジニトロフェノール、及び４０ｎＭのロテノン、及び１μＭのアンチマイシンＡ（以上の阻害剤はいずれもシーホースバイオサイエンス社から入手した）を使用して細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。
【0125】
実施例６：ＣＡＲのダウンモジュレーション及び分解の測定
ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞又は非標的細胞を１：３の細胞比率として２４ウェル細胞培養プレート内で共培養した。培養時間は具体的な実験に応じて決定した。細胞表面のＣＡＲのダウンモジュレーションは、フローサイトメトリーによって細胞表面のＣＡＲの発現量を分析することで測定した。また、ＣＡＲの分解については、更に固定して膜破壊操作した後、フローサイトメトリーによって細胞内外のＣＡＲの発現量の変化を分析した。ＣＡＲの分解経路の検出は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を１：３の細胞比率とし、９６ウェル細胞培養Ｕ底プレート内で８時間共培養した後に実行した。その際、ＭＧ１３２（セレック社＃Ｓ２６１９）及びＮＨ４Ｃｌ（シグマ社＃２５４１３４）をそれぞれプロテアソームとリソソームの機能抑制に使用した。また、ウエスタンブロット方式でＣＡＲの分解を検出する場合には、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を１：１の細胞比率とし、４８ウェル細胞培養プレート内で共培養した。また、新たに生成されたＣＡＲによる測定結果への干渉を減少させるために、一部の実験では、更に２５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＳＴ社＃２１１２）を加えることでタンパク質の合成を抑制した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞又は非標的細胞を１：３の細胞比率として２４ウェル細胞培養プレート内で共培養した。培養時間は具体的な実験に応じて決定した。細胞表面のＣＡＲのダウンモジュレーションは、フローサイトメトリーによって細胞表面のＣＡＲの発現量を分析することで測定した。また、ＣＡＲの分解については、更に固定して膜破壊操作した後、フローサイトメトリーによって細胞内外のＣＡＲの発現量の変化を分析した。ＣＡＲの分解経路の検出は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を１：３の細胞比率とし、９６ウェル細胞培養Ｕ底プレート内で８時間共培養した後に実行した。その際、ＭＧ１３２（セレック社＃Ｓ２６１９）及びＮＨ４Ｃｌ（シグマ社＃２５４１３４）をそれぞれプロテアソームとリソソームの機能抑制に使用した。また、ウエスタンブロット方式でＣＡＲの分解を検出する場合には、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞を１：１の細胞比率とし、４８ウェル細胞培養プレート内で共培養した。また、新たに生成されたＣＡＲによる測定結果への干渉を減少させるために、一部の実験では、更に２５μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ＣＳＴ社＃２１１２）を加えることでタンパク質の合成を抑制した。
【0126】
実施例７：フローサイトメトリーに基づくＣＡＲ－Ｔの体外殺傷機能測定
ＣＤ１９及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現する二重陽性のＫ５６２標的細胞と、ＣＤ１９及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現しないＫ５６２非標的細胞を１：１の細胞比率で混合した後、具体的な実験計画の細胞比率でＣＡＲ－Ｔ細胞と３日間共培養した。細胞は２４ウェル細胞培養プレート内で培養し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を加えた。
ＣＤ１９及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現する二重陽性のＫ５６２標的細胞と、ＣＤ１９及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発現しないＫ５６２非標的細胞を１：１の細胞比率で混合した後、具体的な実験計画の細胞比率でＣＡＲ－Ｔ細胞と３日間共培養した。細胞は２４ウェル細胞培養プレート内で培養し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を加えた。
【0127】
フローサイトメトリー分析：Ｔ細胞を含まないＫ５６２混合細胞群を対照群として、Ｋ５６２標的細胞が占める細胞の割合（ＣＫ％）を分析した。Ｔ細胞を含む実験群では、ＣＤ３ε染色によってＴ細胞をＫ５６２細胞群から区別した後、Ｋ５６２標的細胞がＫ５６２細胞群に占める割合（ＥＸ％）を分析した。そして、Ｔ細胞の殺傷効率＝（１－ＥＸ％／ＣＫ％）×１００％とした。
【0128】
実施例８：マウス腫瘍モデル及びＣＡＲ－Ｔの体内機能測定
体内実験の対象は、５～８週齢の免疫不全（ＮＳＧ）マウスとした。体内におけるＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍効果を比較するために、まずは、ＮＳＧマウスの大腿外側の皮下に、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子を発現しているＫ５６２－ＣＤ１９標的細胞を具体的実験の指定数だけ移植した。そして、標的細胞を体内で４日間安定させた後、ＮＳＧマウスの尾静脈にＣＡＲ－Ｔ細胞を具体的実験の指定数だけ注射して治療した。続いて、毎週、動物・生体イメージング技術によって体内における腫瘍の成長状況をモニタリングした。
体内実験の対象は、５～８週齢の免疫不全（ＮＳＧ）マウスとした。体内におけるＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍効果を比較するために、まずは、ＮＳＧマウスの大腿外側の皮下に、ホタル
ルシフェラーゼ遺伝子を発現しているＫ５６２－ＣＤ１９標的細胞を具体的実験の指定数だけ移植した。そして、標的細胞を体内で４日間安定させた後、ＮＳＧマウスの尾静脈にＣＡＲ－Ｔ細胞を具体的実験の指定数だけ注射して治療した。続いて、毎週、動物・生体イメージング技術によって体内における腫瘍の成長状況をモニタリングした。
【0129】
具体的に実施した操作：担癌マウスの腹腔にホタルルシフェリン基質を注射した。基質の使用量は、１．５ｍｇ／ｇ（マウスの体重）に基づき投与した。１０分後に、基質がマウスの全身に十分に循環するまで待機してから、２．５～３．５％のイソフルランガスでマウスを麻酔してイメージングを行った。生物発光イメージングは、ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（パーキンエルマー社）で実行し、蛍光定量データは生体イメージングソフトウェア（パーキンエルマー社）で取得した。
【0130】
実施例９：結果分析
ＣＡＲ－Ｔの抗原刺激下におけるＣＡＲのダウンモジュレーション及び分解の結果は図１に示す通りとなった。具体的には、図１Ａに示すように、Ｔ細胞とＫ５６２細胞の作用比率を１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、ＦＡＣＳにより細胞表面のＣＡＲの発現量を分析した。ＣＡＲ－Ｔと標的細胞Ｋ５６２－ＣＤ１９を作用させた後、ＣＡＲは急速に反応してダウンモジュレーションしたが、非標的細胞Ｋ５６２－Ｍｅｓｏと作用させた場合にはダウンモジュレーションは発生しなかった。また、図１Ｂに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、細胞内染色法により、ＦＡＣＳを用いて細胞全体のＣＡＲの発現量の変化を分析した。すると、標的細胞刺激から６０分以内に、ＣＡＲに分解が発生した。また、含まれる細胞内セグメント構造の違いによってＣＡＲの分解速度は異なっていた。
ＣＡＲ－Ｔの抗原刺激下におけるＣＡＲのダウンモジュレーション及び分解の結果は図１に示す通りとなった。具体的には、図１Ａに示すように、Ｔ細胞とＫ５６２細胞の作用比率を１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、ＦＡＣＳにより細胞表面のＣＡＲの発現量を分析した。ＣＡＲ－Ｔと標的細胞Ｋ５６２－ＣＤ１９を作用させた後、ＣＡＲは急速に反応してダウンモジュレーションしたが、非標的細胞Ｋ５６２－Ｍｅｓｏと作用させた場合にはダウンモジュレーションは発生しなかった。また、図１Ｂに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、細胞内染色法により、ＦＡＣＳを用いて細胞全体のＣＡＲの発現量の変化を分析した。すると、標的細胞刺激から６０分以内に、ＣＡＲに分解が発生した。また、含まれる細胞内セグメント構造の違いによってＣＡＲの分解速度は異なっていた。
【0131】
ＫＲを突然変異させたＣＡＲのダウンモジュレーション及び分解抑制の結果は、図２に示す通りとなった。具体的には、図２のＡに示すように、共免疫沈降法によってＣＡＲタンパク質をプルダウンさせて、ウエスタンブロットにより測定した。すると、標的細胞と５分間作用させた後に、ＷＴ ＣＡＲには明らかなユビキチン修飾バンドが形成されたが、ＫＲ ＣＡＲには刺激前後のいずれにおいてもユビキチン修飾は形成されなかった。このことから、ＣＡＲの細胞内セグメントのリシン部位を突然変異させれば、ＣＡＲのユビキチン修飾を効果的にブロック可能なことが証明された。また、図２のＢに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、ＦＡＣＳにより細胞表面のＣＡＲの発現量を分析した。すると、標的細胞と作用させた後、ＷＴ ＣＡＲ－ＴにはＣＡＲの明らかなダウンモジュレーション反応が発生したが、ＫＲを突然変異させたＣＡＲはダウンモジュレーションに対する感受性が低かった。また、蛍光定量ＰＣＲでＷＴ ＣＡＲとＫＲ ＣＡＲのｍＲＮＡの変化を測定したところ、新たに生成されたＣＡＲの量に違いは認められなかった。即ち、ＫＲ ＣＡＲにダウンモジュレーションが見られなかったのは、より多くのＣＡＲが生成されたからではなく、ＣＡＲのダウンモジュレーションが抑制されたためであった。また、図２のＣ及びＤに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率をいずれも１：３とし、反応時間を図中の横座標に示す通りとして、ＦＡＣＳにより細胞表面のＣＡＲの発現量の変化を分析した。２種類のＣＡＲはダウンモジュレーションのキネティクスが異なっていたが、ＫＲの突然変異によってＣＡＲのダウンモジュレーションレベルを抑制することができた。本発明では、図２のＢ～Ｄの実験を通じて、ＣＡＲの細胞内セグメントのリシン部位をアルギニンに突然変異させることで、抗原刺激誘導型のＣＡＲのダウンモジュレーションを効果的に抑制可能であり、且つ異なる構造のＣＡＲに適用可能なことが証明された。また、図２のＥに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：１とし、反応時間を３～９時間とした。且つ、新たに生成されたＣＡＲによる測定結果への影響を回避するために、反応系に２５μＭのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を加えてタンパク質の合成を抑制し、ウエスタンブロットでＣＡＲタンパク質の発現量の変化を測定した。図２のＥの定量化結果は図２のＦに示す通りとな
り、ＫＲの突然変異が当該反応におけるＣＡＲの分解を効果的に抑制したことが示された。また、図２のＧに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：１とし、反応時間を４～１２時間として、ウエスタンブロットによりＣＡＲタンパク質の発現量の変化を測定した。図２のＧの定量化結果は図２のＨに示す通りとなり、ＫＲの突然変異が抗原刺激誘導型のＣＡＲの分解を効果的に抑制したことが示された。本発明では、図２のＥ～Ｈの実験を通じて、ＣＡＲの細胞内セグメントのリシン部位をアルギニンに突然変異させることで、抗原刺激誘導型のＣＡＲの分解を効果的に抑制可能であり、且つ各種構造のＣＡＲに適用可能なことが証明された。
り、ＫＲの突然変異が当該反応におけるＣＡＲの分解を効果的に抑制したことが示された。また、図２のＧに示すように、Ｔ細胞と標的細胞の作用比率を１：１とし、反応時間を４～１２時間として、ウエスタンブロットによりＣＡＲタンパク質の発現量の変化を測定した。図２のＧの定量化結果は図２のＨに示す通りとなり、ＫＲの突然変異が抗原刺激誘導型のＣＡＲの分解を効果的に抑制したことが示された。本発明では、図２のＥ～Ｈの実験を通じて、ＣＡＲの細胞内セグメントのリシン部位をアルギニンに突然変異させることで、抗原刺激誘導型のＣＡＲの分解を効果的に抑制可能であり、且つ各種構造のＣＡＲに適用可能なことが証明された。
【0132】
ＫＲの突然変異がＣＡＲ－Ｔの体外機能に及ぼす影響は図３に示す通りとなった。具体的に、体外機能実験はいずれもヒト初代Ｔ細胞で実施した。図３のＡでは、ＣＡＲ－Ｔと放射線照射後の標的細胞を２：１の比率で共培養した。そして、２日ごとにＴ細胞を１回カウントし、新たな培地を補充して細胞密度を１．５ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍｌに制御した。また、８～１０日置きに２：１の細胞比率で標的細胞を補充した。ＣＤ１９－４１ＢＢζＣＡＲの場合を例示すると、ＫＲを突然変異させたＣＡＲ－Ｔは、より効果的に標的細胞刺激誘導型の増殖に反応可能であった。体外培養条件におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの分化状況については、図３のＢに示すように、ＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＡを分化指標としてＦＡＣＳ分析を行った。図３のＣは、図３のＢについての統計分析である。ＫＲの突然変異によって、ＣＡＲ－Ｔはより多量にセントラルメモリーＴ細胞に分化した一方、ターミナルエフェクターＴ細胞への分化は減少した。また、４日間標的細胞刺激した後のＣＡＲ－Ｔの分化表現型の結果は図３のＤに示す通りとなった。ＣＡＲ－Ｔと放射線照射後の標的細胞を２：１の比率で共培養し、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＯを分化指標としてＦＡＣＳ分析を行った。図３のＤについての統計分析の結果は図３のＥに示す通りとなった。ＫＲの突然変異によって、ＣＡＲ－Ｔは標的細胞刺激への反応後により多くのセントラルメモリーＴ細胞を形成した。また、図３のＦに示すように、Ｔ細胞と標的細胞を図中の横座標に示す細胞比率で共培養した。培養時間は３日間とし、ＦＡＣＳで標的細胞の残存比率を分析してＣＡＲ－Ｔの殺傷効率を推計した。Ｔ細胞と標的細胞の細胞比率が１：１よりも小さい場合に、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔはより高い殺傷効率を有した。
【0133】
ＣＤ１９－４１ＢＢζＫＲ ＣＡＲがより多くのセントラルメモリーＴ細胞を蓄積可能であること、及び強化された増殖表現型の分子基盤を有することが図４に示されている。この部分の実験は、いずれもヒト初代Ｔ細胞で実施及び検証した。図４のＡに示すように、本発明では、酸化代謝におけるＷＴ ＣＡＲ－ＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの差をシーホース社の計器で検出した。なお、検出細胞にはいずれも予め２週間の標的細胞刺激を施した。図４のＡの主要パラメータについての統計分析は図４のＢに示す通りとなった。ＫＲ ＣＡＲ－Ｔは、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも高い基礎酸素消費速度（ＯＣＲ）を有していた。ＫＲ ＣＡＲ－Ｔの最大呼吸能力はＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも明らかに高く、最終的なＫＲ ＣＡＲ－Ｔの残存呼吸能力もＷＴ ＣＡＲ－Ｔより明らかに高かった。これは、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強い酸化呼吸代謝を有しており、低酸素条件であったとしても、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより効果的に酸化的リン酸化を実行可能なことを反映している。また、図４のＣ及びＤに示すように、本発明では、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒを検出マーカーとして、ＦＡＣＳ検出方法及び共焦点蛍光検出方法のそれぞれによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強いミトコンドリア生成能力を有することを検証した。図４のＥに示すように、本発明では、放射線照射後の標的細胞による刺激前後のＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔについて、ミトコンドリアの生成及び機能に関連する４つの重要遺伝子の変化を蛍光定量ＰＣＲで検出した。未刺激のＷＴ ＣＡＲ－Ｔの遺伝子発現量を対照としたところ、標的細胞刺激を受けたＫＲ ＣＡＲ－Ｔは、４つの遺伝子の発現においていずれもＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも高い発現レベルを示した。これにより、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強いミトコンドリア生成能力を有する原因を解釈した。また、本発明では、図４のＣ～Ｅの実験を通じて、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強い酸化呼吸能力を有する原因を解釈した。また、ウエスタンブロット検出方法及びＦ
ＡＣＳ検出方法のそれぞれによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後により多くの抗アポトーシス因子Ｂｃｌ－ｘＬを産生可能なことを検証したところ、結果は図４のＦ及びＧに示す通りとなった。図４のＦに示すように、本発明では、ウエスタンブロットによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより多くの抗アポトーシス因子Ｂｃｌ－２及び細胞の肝細胞性マーカーβ－カテニンを産生可能であることが更に示された。また、図４のＨに示すように、本発明では、蛍光定量ＰＣＲを検出手段として、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後に、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの４１ＢＢ下流抗アポトーシス産物Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｆｌ１のｍＲＮＡを生成可能なことを検証した。これにより、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強い増殖能力を有する原因についても部分的に解釈した。
ＡＣＳ検出方法のそれぞれによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後により多くの抗アポトーシス因子Ｂｃｌ－ｘＬを産生可能なことを検証したところ、結果は図４のＦ及びＧに示す通りとなった。図４のＦに示すように、本発明では、ウエスタンブロットによって、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより多くの抗アポトーシス因子Ｂｃｌ－２及び細胞の肝細胞性マーカーβ－カテニンを産生可能であることが更に示された。また、図４のＨに示すように、本発明では、蛍光定量ＰＣＲを検出手段として、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが標的細胞刺激後に、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの４１ＢＢ下流抗アポトーシス産物Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｆｌ１のｍＲＮＡを生成可能なことを検証した。これにより、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔがより強い増殖能力を有する原因についても部分的に解釈した。
【0134】
腫瘍マウスモデル体内におけるＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの機能を比較したところ、図５に示す通りとなった。具体的に、図５のＡに示すように、本発明では、体内におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲのダウンモジュレーション現象を比較した。各ラットの末梢血及び脾臓内のＣＡＲの発現量を対照として、腫瘍内のＣＡＲの発現レベルの変化を比較したところ、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔでは表面のＣＡＲがほぼ完全にダウンモジュレーションしたのに対し、ＫＲを突然変異させた場合には、腫瘍内のＣＡＲのダウンモジュレーションが抑制されて、ＣＡＲ－Ｔ表面に２５％を超えるＣＡＲが残留した。また、図５のＢに示すように、Ｔ細胞を注射してから１４日後に、腫瘍組織をマウスから剥離して凍結切片を作製し、免疫蛍光共焦点分析を行ったところ、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔを接種したマウスの腫瘍にはより多くのＣＡＲ－Ｔ細胞とより少ない腫瘍細胞が見られた。また、図５のＣは、本発明において、腫瘍マウス体内にＣＡＲ－Ｔ細胞を注射してから１０日後、２０日後、４０日後のマウス脾臓内におけるＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの数量の変化を示している。ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが各検出タイミングのいずれにおいてもＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くの細胞量を示し、１０～４０日間の細胞数に明らかな減少が見られなかったのに対し、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔの細胞数は４０日目に明らかに減少した。また、腫瘍マウスの脾臓内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したところ、図５のＤに示す通りとなった。ここでは、ＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＡを分化指標としてＦＡＣＳ分析を行った。図５のＤについて統計分析したところ、図５のＥに示すように、ＷＴ ＣＡＲと比較して、ＫＲ ＣＡＲはＴ細胞をより多量に記憶細胞（特に、セントラルメモリーＴ細胞）に分化させた一方、ターミナルエフェクターＴ細胞への分化は減少した。同様に、腫瘍マウスの末梢血内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したところ、図５のＦに示す通りとなった。図５のＦについて統計分析したところ、図５のＧに示すように、やはりＫＲ ＣＡＲはＴ細胞をより多量にメモリーＴ細胞に分化させた。また、腫瘍組織内におけるＣＡＲ－Ｔの分化表現型を比較したところ、図５のＨに示す通りとなった。ＣＤ２７とＣＤ４５ＲＯを分化の指標としてＦＡＣＳ分析を行い、図５のＨについて統計分析したところ、図５のＩに示すように、ＫＲ ＣＡＲ－ＴはＷＴ ＣＡＲ－Ｔよりも多くのセントラルメモリーＴ細胞を蓄積可能であった。本発明における図５のＤ～Ｉより、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔが腫瘍マウス体内で増殖能力を維持可能であり、且つより効果的に腫瘍組織を浸潤可能な原因の大部分を解釈した。
【0135】
ＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴとＫＲ ＣＡＲ－Ｔの抗腫瘍効果を比較したところ、図６に示す通りとなった。具体的に、異なるＴ細胞を注射したＮＳＧマウス体内におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現した標的細胞の成長状況は、図６に示す通りとなった。１００万個の標的細胞を皮下移植してから４日後に、尾静脈から５０万個のＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－Ｔに感染していないＴ細胞を注射して治療した。そして、１週間置きにフルオレセイン基質を腹腔注射し、蛍光イメージングシステムを利用して腫瘍の成長をモニタリングした。図６のＡの定量化結果は、図６のＢに示すように、通常Ｔ細胞が腫瘍の成長を制御不可能であったのに対し、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔは腫瘍の成長を遅延させるとともに、部分的な治愈を実現可能であった。一方、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔは腫瘍の発展を完全に抑制可能であった。
【0136】
ＣＤ１９－４１ＢＢζ及びＣＤ１９－ＣＤ２８ζＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型に対するＫＲの突然変異の影響を比較したところ、図７に示す通りとなった。具体的には、図７のＡ及びＢに示すように、４１ＢＢ、ＣＤ２８及びこれらのＫＲ突然変異型共刺激領域を含むＣＤ１９ ＣＡＲをレンチウイルス感染方式でＪｕｒｋａｔ細胞上に発現させて、１週間後にＦＡＣＳ方式で細胞表面の活性化マーカーＣＤ６９及びＩＣＯＳの発現レベルを検出した。図面から明らかなように、４１ＢＢは、突然変異後に自己活性化レベルが大きくは向上せず、正常ＣＤ２８の自己活性化レベルよりも低かったのに対し、ＣＤ２８は突然変異後に非常に強い自己活性化シグナルを発生させた。このことは、強い刺激シグナル誘導型の細胞死（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ，ＡＩＣＤ）を引き起こし、細胞の分化及び疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）を加速するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍機能の発揮にとっては不利となる。また、Ｔ細胞の疲弊マーカーの分析結果は図７のＣに示す通りとなった。４１ＢＢ、ＣＤ２８及びこれらのＫＲ突然変異型共刺激領域を含むＣＤ１９ ＣＡＲをレンチウイルス感染方式でヒト初代Ｔ細胞上に発現させて、１週間後にＦＡＣＳ方式で細胞表面のＰＤ－１マーカーの発現レベルを検出した。図中の相対的な発現量は、ＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現量を基準としている。図面から明らかなように、４１ＢＢは、突然変異後にＰＤ－１の発現に顕著な変化が見られなかったのに対し、ＣＤ２８は、突然変異後にＰＤ－１が著しく上昇しており、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を発揮するには不利となった。Ｔ細胞の分化表現型の分析結果は、図７のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇに示す通りとなった。分化マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡを用いた。ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋はnaiveＴ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ－はセントラルメモリーＴ細胞（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＡ－はエフェクターメモリーＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＡ＋はエフェクターメモリーＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）であり、分化度は順に増加した。ＣＤ２８及びこれらのＫＲ突然変異型共刺激領域を含むＣＤ１９又はＧＤ２ ＣＡＲをレンチウイルス感染方式でヒト初代Ｔ細胞上に発現させて、１０～１４日後に、ＦＡＣＳ方式で細胞表面のＣＤ６２Ｌ／ＣＤ４５ＲＡの発現レベルを検出した。図７のＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇから明らかなように、ＣＤ１９かＧＤ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞かに関わらず、ＣＤ２８のＫＲの突然変異によっていずれも分化が強化され、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖に不利となった。
【0137】
腫瘍細胞再刺激（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）モデルにおけるＣＤ１９－４１ＢＢζＷＴ及びＫＲ ＣＡＲ－Ｔの効果を比較したところ、図８に示す通りとなった。具体的には、図８のＡに示すように、ＮＳＧマウスに２×１０６個の腫瘍細胞を皮下移植してから４日後に、１．５×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈注射によって腫瘍マウスの体内に注入し、介入治療を行った。その後、毎週、生体イメージングシステムによってマウス体内の腫瘍の成長をモニタリングした。すると、４週間後に、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射したマウスについては、２匹のみが体内の腫瘍細胞が完全に消滅した（全５匹）のに対し、ＫＲ
ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射したマウスは、４匹について腫瘍の兆候が検出されなくなった（全５匹）。その後、回復したマウスの体内に再び１×１０６個の腫瘍細胞を注射した（黒色の矢印は再移植のタイミングを示している）。なお、元の位置の腫瘍再生による干渉を回避するために、尾静脈注射によって全身性の移植を行った。すると、その後の検出において、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した４匹の回復マウスについては、１匹のみが再移植した腫瘍細胞を防御不可能であったのに対し、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した２匹の生存マウスは、いずれも腫瘍細胞の再刺激によって死亡した。また、２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞を同じ初期レベルの腫瘍負荷モデルに確実に作用させるために、本発明では、別途、体外で標的細胞刺激を受けたＣＡＲ－Ｔについて、腫瘍細胞再刺激に対する反応状況を比較した。具体的には、図８のＢに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を体外で１０日間標的細胞刺激した後に腫瘍マウスに注射した。このときには、１×１０６個の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植してから４日後に、２×１０６個の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注入した。マ
ウスは各群６匹とした。また、各線がマウス１匹を示している。この場合には、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療したマウスは１匹のみが腫瘍の成長を抑制したが、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、比較的短時間のうちにマウス体内の腫瘍細胞が完全に消滅した。更に、図８のＣに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を体外で２１日間標的細胞刺激した後に腫瘍マウスに注射した。このときには、３×１０６個の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植してから４日後に、１×１０７個の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注入した。マウスは各群４～６匹とした。このように、更に長期間にわたって標的細胞刺激を繰り返し、腫瘍負荷を増加させたストレスモデルにおいて、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗腫瘍能力を完全に喪失した。一方、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、時間は要したものの、最終的には腫瘍の成長を抑制した。以上の体内実験の結果は、ＫＲの突然変異によって４１ＢＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が延長されたことを意味している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射したマウスは、４匹について腫瘍の兆候が検出されなくなった（全５匹）。その後、回復したマウスの体内に再び１×１０６個の腫瘍細胞を注射した（黒色の矢印は再移植のタイミングを示している）。なお、元の位置の腫瘍再生による干渉を回避するために、尾静脈注射によって全身性の移植を行った。すると、その後の検出において、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した４匹の回復マウスについては、１匹のみが再移植した腫瘍細胞を防御不可能であったのに対し、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した２匹の生存マウスは、いずれも腫瘍細胞の再刺激によって死亡した。また、２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞を同じ初期レベルの腫瘍負荷モデルに確実に作用させるために、本発明では、別途、体外で標的細胞刺激を受けたＣＡＲ－Ｔについて、腫瘍細胞再刺激に対する反応状況を比較した。具体的には、図８のＢに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を体外で１０日間標的細胞刺激した後に腫瘍マウスに注射した。このときには、１×１０６個の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植してから４日後に、２×１０６個の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注入した。マ
ウスは各群６匹とした。また、各線がマウス１匹を示している。この場合には、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療したマウスは１匹のみが腫瘍の成長を抑制したが、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、比較的短時間のうちにマウス体内の腫瘍細胞が完全に消滅した。更に、図８のＣに示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞を体外で２１日間標的細胞刺激した後に腫瘍マウスに注射した。このときには、３×１０６個の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植してから４日後に、１×１０７個の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞を尾静脈に注入した。マウスは各群４～６匹とした。このように、更に長期間にわたって標的細胞刺激を繰り返し、腫瘍負荷を増加させたストレスモデルにおいて、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗腫瘍能力を完全に喪失した。一方、ＫＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、時間は要したものの、最終的には腫瘍の成長を抑制した。以上の体内実験の結果は、ＫＲの突然変異によって４１ＢＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が延長されたことを意味している。
【0138】
臨床実践では、一般的に、患者の限られた自家Ｔ細胞を使用して大量のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、再注入療法に用いる必要がある。この場合には、長期間の体外増幅とＴ細胞機能の低下という矛盾した局面に対峙せねばならない。これに対し、我々の実験において、ＫＲを突然変異させた４１ＢＢζＣＡＲ－Ｔ細胞は、長期的な体外増幅と抗原刺激の後でも、腫瘍モデル内で有効性に優れた抗腫瘍効果を発揮可能であった。このことは、ＫＲを突然変異させた設計を利用すれば、臨床生産において長い時間をかけて体外培養したＣＡＲ－Ｔ細胞であっても、有効性に優れた抗腫瘍効果の維持が期待できることを示している。
【0139】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的及び実質的になんら制限するものではない。指摘すべき点として、当業者であれば、本発明の方法を逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であって、これらの改良及び補足もまた本発明の保護の範囲内とみなすべきである。本専門分野に精通した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、追加及び変形の等価の変更は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記の実施例に対し実施される任意の等価の変更の修正、追加及び変形も、本発明の技術方案の範囲に属する。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】