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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-24
(45)【発行日】2024-07-02
(54)【発明の名称】気分障害の齧歯類モデル
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0278 20240101AFI20240625BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240625BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240625BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240625BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0278 ZNA
C12N5/10
C12N15/85 Z
C12Q1/02
【請求項の数】
42
(21)【出願番号】P 2021540415
(86)(22)【出願日】2020-01-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-04
(86)【国際出願番号】 US2020013801
(87)【国際公開番号】W WO2020150426
(87)【国際公開日】2020-07-23
【審査請求日】2022-12-21
(31)【優先権主張番号】62/793,523
(32)【優先日】2019-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/899,849
(32)【優先日】2019-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ドラモンド サミュエルソン、メーガン
(72)【発明者】
【氏名】ザンブロヴィッチ、ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ライ、カ－マン ヴィーナス
(72)【発明者】
【氏名】ハント、チャーリーン
(72)【発明者】
【氏名】ブリッジス、スザンナ
(72)【発明者】
【氏名】マーフィー、アンドリュー ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザガ－ハウレギ、クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】ロハス、ホセ
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドリ－ハーバー、ニコル
(72)【発明者】
【氏名】ブリース、ロバート
(72)【発明者】
【氏名】クロール、スーザン ディ．
【審査官】福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０２２９６７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００８／０６１２０９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００９－５１３１２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－３２１１８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】SCHEER N. et al.，Generation and utility of genetically humanized mouse models，Drug Discovery Today，2013年，vol. 18，p. 1200-1211
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇタンパク質共役受容体１５６（ＧＰＲ１５６）遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類であって、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含み、
前記齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分が、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列および／または３’非コードエクソン配列を含み、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質における５３３位に対応するアミノ酸位置でＡｓｐを含む（Ｅ５３３Ｄバリエーション）変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、かつ
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある、遺伝子改変された齧歯類。
【請求項2】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項3】
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分での置換から形成される、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項4】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンまでを含むヒトゲノム断片を含む、請求項３に記載の齧歯類。
【請求項5】
置換されている前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記齧歯類ゲノム断片が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから前記停止コドンまでを含む、請求項３に記載の齧歯類。
【請求項6】
Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む前記変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項7】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項8】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項9】
前記齧歯類が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない、請求項１～８のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項10】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項１～９のいずれか一項に記載の齧歯類。
【請求項11】
ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、単離された齧歯類細胞または組織であって、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含み、
前記齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分が、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列および／または３’非コードエクソン配列を含み、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、かつ、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で前記齧歯類Ｇｐｒ１５６のプロモーターの制御下にある、単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項12】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含む、請求項１１に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項13】
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分での置換から形成される、請求項１１に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項14】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンまでを含むヒトゲノム断片を含む、請求項１３に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項15】
置換されている前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記齧歯類ゲノム断片が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから前記停止コドンまでを含む、請求項１３に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項16】
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、前記変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項17】
前記単離された齧歯類細胞または組織が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項18】
前記単離された齧歯類細胞または組織が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項19】
前記齧歯類細胞または組織が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項20】
前記齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項21】
前記齧歯類細胞または組織が、マウス細胞もしくは組織、またはラット細胞もしくは組織である、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の単離された齧歯類細胞または組織。
【請求項22】
遺伝子改変された齧歯類を作製する方法であって、改変されたゲノムは、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含むように、齧歯類ゲノムを改変することであって、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含み、
前記齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分が、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列および／または３’非コードエクソン配列を含み、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、かつ
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で前記齧歯類Ｇｐｒ１５６のプロモーターの制御下にある、改変すること、および
前記改変されたゲノムを含む遺伝子改変された齧歯類を得ることを含む、方法。
【請求項23】
前記齧歯類ゲノムが、（ａ）標的化ベクターを齧歯類ＥＳ細胞に導入することであって、前記標的化ベクターが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位に統合されるべき前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、これにより、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を形成する、導入すること；
（ｂ）ゲノムが、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類ＥＳ細胞を得ること；および
（ｃ）（ｂ）の遺伝子改変された齧歯類ＥＳ細胞を使用し、齧歯類を作製すること、を含む工程により改変される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分での置換から形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸部分が、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから前記停止コドンまでを含むヒトゲノム断片を含み、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子が、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質における５３３位に対応するアミノ酸位置でＧｌｕまたはＡｓｐをコードするヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ヒトゲノム断片が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンまでを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
置換されている前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記齧歯類ゲノム断片が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから前記停止コドンまでを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記齧歯類が、前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記齧歯類が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
標的化ベクターであって、齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヌクレオチド配列に相同である５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列が隣接する、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子に統合されるべきヒトＧＰＲ１５６核酸を含み、
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸の前記齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子への統合が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、前記ヒトＧＰＲ１５６核酸での置換をもたらして、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を形成し、
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸が、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含み、
前記ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で前記齧歯類Ｇｐｒ１５６のプロモーターの制御下にある、標的化ベクター。
【請求項34】
前記ヒトＧＰＲ１５６核酸が、前記ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンまでを含む、請求項３３に記載の標的化ベクター。
【請求項35】
置換されている前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記齧歯類ゲノム断片が、前記内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の前記ＡＴＧ開始コドンから前記停止コドンまでを含む、請求項３４に記載の標的化ベクター。
【請求項36】
前記齧歯類が、マウスまたはラットである、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
【請求項37】
単極性うつ病または不安障害を治療するための剤の効果を試験する方法であって、前記剤を請求項１～１０のいずれか一項に記載の齧歯類に投与すること；
前記齧歯類を、単極性うつ病または前記不安障害を示す前記齧歯類における挙動を評価するための試験に供すること、および
前記剤が、前記齧歯類における前記挙動に対する効果を有するかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項38】
前記試験が、強制水泳試験である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記試験が、ガラス玉覆い隠し試験である、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された齧歯類を含む、気分障害の齧歯類モデル。
【請求項41】
請求項２０に記載の齧歯類胚性幹細胞を含む、齧歯類胚。
【請求項42】
前記齧歯類はマウスまたはラットである、請求項４１に記載の齧歯類胚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒト疾患の動物モデルに関する。より具体的には、本開示は、単極性うつ病および不安障害などの気分障害の齧歯類モデルに関する。全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質における５３３位に対応するアミノ酸位置でＡｓｐを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒト化Ｇタンパク質共役受容体１５６（ＧＲＰ１５６）遺伝子を有する遺伝子改変された齧歯類動物が、本明細書において開示される。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１７日に出願された米国仮出願第６２／７９３，５２３号および２０１９年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／８９９，８４９号の優先権を主張し、その両方の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１月１７日に出願された米国仮出願第６２／７９３，５２３号および２０１９年９月１３日に出願された米国仮出願第６２／８９９，８４９号の優先権を主張し、その両方の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
参照による配列表の援用
２０２０年１月８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６５０６ＰＣＴ＿１０２６９ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の１２９９ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
２０２０年１月８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６５０６ＰＣＴ＿１０２６９ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の１２９９ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
特許、特許出願、受託番号、技術論文および学術論文を含む様々な参考文献が、本明細書に引用される。各参考文献は、参照によりその全体が、全ての目的について本明細書に組み込まれる。
【0005】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、７つのらせん膜貫通ドメインと、Ｎ末端細胞外ドメインおよびＣ末端細胞内ドメインによって特徴付けられる細胞表面受容体の大きなスーパーファミリーである（非特許文献１）。ＧＰＣＲは、様々な細胞型で発現され、細胞膜を超えて、細胞内部に細胞外シグナルを導入するのに関与する（非特許文献２）。２０１２年、ＧＰＣＲがどのように機能するかを同定した２人の科学者に、ノーベル化学賞が授与された（非特許文献３）。
【0006】
ＧＰＲ１５６（Ｇタンパク質共役受容体１５６）は、代謝型グルタミン酸受容体サブファミリーに属するＧＰＣＲをコードするヒト遺伝子である（非特許文献４）。文献においてＧＰＲ１５６を参照するために使用されてきたその他の名称は、ＧＡＢＡＢＬ（ＧＡＢＡＢ様またはＧＡＢＡＢＬ）およびＰＧＲ２８である（非特許文献５）。マウスでは、ＧＰＲ１５６は、Ｇｐｒ１５６またはＧａｂａｂｌとして言及される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｃｈｅｒｅｚｏｖ Ｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１２５８～１２６５（２００７）
【文献】Ｋｏｂｉｌｋａ Ｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７６８：７９４～８０７（２００７）
【文献】Ｃｌａｒｋ Ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：５２７４～５２７５（２０１３）
【文献】Ｃａｌｖｅｒ Ａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１０：３０５～３０７（２００３）
【文献】Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓ Ｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：４９０３～４９０８（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
単極性うつ病および不安障害などの気分障害の動物モデルとしての使用に適した遺伝子改変された齧歯類が、本明細書において開示される。より具体的には、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にてヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を有する遺伝子改変された齧歯類動物（例えば、マウスまたはラット）が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質または全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（「Ｅ５３３Ｄバリエーション」としても本明細書において言及される）における５３３位に対応するアミノ酸位置でＡｓｐを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。遺伝子改変された齧歯類を作製する方法およびそのための標的化ベクター、交配方法、ならびに治療剤をスクリーニングし、試験するための気分障害の動物モデルとしての遺伝子改変された齧歯類の使用もまた、本明細書において開示される。
【0009】
一態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む遺伝子改変された齧歯類が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分各々は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0010】
一部の実施形態では、齧歯類におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最初のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最後のコードエクソンにおける停止コドンを含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列は、例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの任意の５’非コードエクソン、および／または５’非コーディング部分を含み得る。ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列は、例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲを含み得る。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最初のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最初のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最後のコードエクソンにおける停止コドンを含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列は、例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの任意の５’非コードエクソン、および／または５’非コーディング部分を含み得る。ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列は、例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲを含み得る。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最初のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
【0011】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせを含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、マウスＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、５’非コードエクソン配列は、例えば、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２（第一のコードエクソン）の５’非コード部分、またはその組み合わせを含み得、３’非コードエクソン配列は、例えば、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１０（第９および最後のコードエクソン）の３’ＵＴＲを含み得る。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、ラットＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、５’非コードエクソン配列は、例えば、ラットＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１（第一のコードエクソンでもある）の５’非コード部分を含み得、３’非コードエクソン配列は、例えば、ラットＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン９（最後のコードエクソンでもある）の３’ＵＴＲを含み得る。
【0012】
特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列、およびヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンを、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含み、ある特定の実施形態では、かかるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終エクソンの下流に位置する、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列をさらに含む。
【0013】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分をもたらす齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子である。
一部の実施形態では、齧歯類におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
一部の実施形態では、齧歯類におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0014】
一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲ）を、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
【0015】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドン（第一のコードエクソンにおける）から停止コドン（最終のコードエクソンにおける）を含む。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。
【0016】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、変異体タンパク質は、８１４アミノ酸の全長ＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５または配列番号６に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0017】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォームＧＰＲ１５６タンパク質であり、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７または配列番号８に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0018】
さらなる実施形態では、齧歯類におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲ）を含む。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせをさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲ）を含む。
【0019】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせを含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、マウスＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0020】
特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列、およびヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンを含み、ある特定の実施形態では、かかるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終のエクソンの下流に位置する、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、マウスＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよく、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１０の３’ＵＴＲは、存在するとき、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終のエクソンの下流に位置する。
【0021】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分をもたらす齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子である。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0022】
一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおける５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲ）を含む。
【0023】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類がマウスである実施形態では、置換されているマウスゲノム断片は、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0024】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、野生型タンパク質は、８１４アミノ酸の全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に実質的に同一であり、５３３位でＧｌｕを含むアミノ酸配列を含む。
【0025】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３または配列番号４に実質的に同一であり、５２９位でＧｌｕを含む、８１０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【0026】
一部の実施形態では、本明細書において開示される齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書において開示される齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0027】
一部の実施形態では、本明細書において開示される齧歯類は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、マウスまたはラットである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類は、マウスまたはラットである。
【0028】
別の態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、単離された齧歯類細胞または組織が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分各々は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0029】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
【0030】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチド（最終のコードエクソンにおける）を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲ）を、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
【0031】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはその組み合わせを含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、マウスＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0032】
特定の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列、およびヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンを、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含み、ある特定の実施形態では、かかるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終のエクソンの下流に位置する、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列をさらに含む。
【0033】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分をもたらす齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子である。
【0034】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0035】
一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード部分もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
【0036】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類細胞または組織が、マウス細胞または組織である実施形態では、置換されているマウスゲノム断片は、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0037】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、変異体タンパク質は、８１４アミノ酸の全長ＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５または配列番号６に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0038】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォームＧＰＲ１５６タンパク質であり、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７または配列番号８に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0039】
さらなる実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード部分もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を含む。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、コード配列は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード部分もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子におけるヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を含む。
【0040】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、５’非コードエクソン配列および／または３’非コードエクソン配列を含む。齧歯類細胞または組織が、マウス細胞または組織である実施形態では、単離されたマウス細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0041】
特定の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列、およびヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンを含み、ある特定の実施形態では、かかるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終のエクソンの下流に位置する、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列をさらに含む。
【0042】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子における齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分をもたらす齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子である。
【0043】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0044】
一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード部分もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を含む。
【0045】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。
【0046】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、野生型タンパク質は、８１４アミノ酸の全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に実質的に同一であり、５３３位でＧｌｕを含むアミノ酸配列を含む。
【0047】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織におけるヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３または配列番号４に実質的に同一であり、５２９位でＧｌｕを含む、８１０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【0048】
一部の実施形態では、本明細書において開示される単離された齧歯類細胞または組織は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書において開示される単離された齧歯類細胞または組織は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0049】
一部の実施形態では、本明細書において開示される単離された齧歯類細胞または組織は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である。
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【0050】
一部の実施形態では、単離された齧歯類細胞または組織は、マウス細胞もしくは組織、またはラット細胞もしくは組織である。
さらなる態様では、遺伝子改変された齧歯類を作製する方法が、本明細書において開示され、方法は、改変されたゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含むように、齧歯類ゲノムを改変することであって、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある、改変すること、および改変されたゲノムを含む齧歯類を得ることを含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分各々は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
さらなる態様では、遺伝子改変された齧歯類を作製する方法が、本明細書において開示され、方法は、改変されたゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含むように、齧歯類ゲノムを改変することであって、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある、改変すること、および改変されたゲノムを含む齧歯類を得ることを含む。齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分およびヒトＧＰＲ１５６核酸部分各々は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0051】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
【0052】
一部の実施形態では、齧歯類ゲノムは、（ａ）標的化ベクターを齧歯類ＥＳ細胞に導入して、ゲノムがヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、改変された齧歯類ＥＳ細胞を得ること；および（ｂ）（ａ）の改変された齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を作製することにより、改変される。
【0053】
一部の実施形態では、標的化ベクターは、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位に統合されるヒトＧＰＲ１５６核酸を含み、これにより、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を形成する。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0054】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｇｌｕ（野生型）またはＥ５３３Ｄバリエーション（変異体）のいずれかをコードするヌクレオチド（最終のコードエクソンにおける）を含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンの５’非コード配列もしくは３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を、Ｇｌｕ（野生型）またはＥ５３３Ｄバリエーション（変異体）のいずれかをコードするヌクレオチドを含むヒトＧＰＲ１５６遺伝子と共に含む。
【0055】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類がマウスである実施形態では、置換されているマウスゲノム断片は、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含んでもよい。
【0056】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、変異体タンパク質は、８１４アミノ酸の全長ＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５または配列番号６に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0057】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォームＧＰＲ１５６タンパク質であり、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７または配列番号８に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0058】
さらなる実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、野生型タンパク質は、８１４アミノ酸の全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に実質的に同一であり、５３３位でＧｌｕを含むアミノ酸配列を含む。
【0059】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０アミノ酸の短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３または配列番号４に実質的に同一であり、５２９位でＧｌｕを含む、８１０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【0060】
一部の実施形態では、本方法に従い作製された齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本方法に従い作製された齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0061】
一部の実施形態では、本方法に従い作製された齧歯類は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない。
一部の実施形態では、本方法に従い作製された齧歯類は、マウスまたはラットである。
一部の実施形態では、本方法に従い作製された齧歯類は、マウスまたはラットである。
【0062】
さらなる態様では、齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でのヌクレオチド配列に相同である５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列が隣接し、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子に統合されるべきヒトＧＰＲ１５６核酸を含む標的化核酸ベクターが、本明細書において開示され、ヒトＧＰＲ１５６核酸の齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子への統合が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位での内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、ヒトＧＰＲ１５６核酸での置換が、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の形成をもたらし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。ヒトＧＰＲ１５６核酸（およびヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子）は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質またはＥ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質のいずれかをコードする。
【0063】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むコード配列（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列）を含む標的化ベクターであり、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または２）における５３３位に対応するアミノ酸位置でＧｌｕ（野生型）またはＡｓｐ（変異体）のいずれかをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターにおけるヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のエクソンを含む。
【0064】
一部の実施形態では、標的化ベクターは、置換されている内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含むように、設計される。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類がマウスである実施形態では、標的化ベクターは、置換されているマウスゲノム断片が、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２における５’非コード配列、もしくはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはその組み合わせを含み得るように、設計される。
【0065】
一部の実施形態では、標的化ベクターは、齧歯類のゲノムにヒトＧＰＲ１５６核酸が統合されるように設計され、齧歯類は、マウスまたはラットである。
別の態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させ、ゲノムが、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む子孫齧歯類をもたらすことを含む方法が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
別の態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む第一の齧歯類を、第二の齧歯類と交配させ、ゲノムが、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む子孫齧歯類をもたらすことを含む方法が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
【0066】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
【0067】
一部の実施形態では、第一の齧歯類および第二の齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、第一の齧歯類および第二の齧歯類は、ラットである。
さらなる態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、子孫齧歯類が開示され、子孫齧歯類は、ゲノムが、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む第一の齧歯類を第二の齧歯類と交配することを含む方法により生成され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
さらなる態様では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、子孫齧歯類が開示され、子孫齧歯類は、ゲノムが、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む第一の齧歯類を第二の齧歯類と交配することを含む方法により生成され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
【0068】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
【0069】
一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0070】
一部の実施形態では、子孫齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ラットである。
一態様では、ゲノムが遺伝子改変されたＧｐｒ１５６座位を含む齧歯類が、本明細書において開示され、遺伝子改変は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損を含み、任意選択で、レポーター遺伝子の挿入も含み、レポーター遺伝子は、座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される。
一態様では、ゲノムが遺伝子改変されたＧｐｒ１５６座位を含む齧歯類が、本明細書において開示され、遺伝子改変は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損を含み、任意選択で、レポーター遺伝子の挿入も含み、レポーター遺伝子は、座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される。
【0071】
一部の実施形態では、第一のコードエクソンにおける開始コドン後のヌクレオチドから始まり、続くコードエクソン（例えば、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、または第九のコードエクソン）までのゲノム断片は、欠損され、一部のかかる実施形態では、レポーター遺伝子は、挿入され、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおける開始コドンに作動可能に結合される。これらの実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、改変されていない内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現パターンに似ている。
【0072】
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ＬａｃＺであるか、またはルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【0073】
一部の実施形態では、齧歯類は、遺伝子改変についてホモ接合性である。一部の実施形態では、齧歯類は、遺伝子改変についてヘテロ接合性である。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、ラットである。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、ラットである。
【0074】
別の態様では、単極性うつ病または不安障害などの気分障害の齧歯類モデルが、開示される。
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合であり得る。
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合であり得る。
【0075】
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類をさらに含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合であり得る。
【0076】
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、遺伝子改変されたＧｐｒ１５６座位を含む、遺伝子改変された齧歯類をさらに含み、遺伝子修飾は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損および任意選択で、レポーター遺伝子の挿入を含み、レポーター遺伝子は、座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される。齧歯類は、遺伝子改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。
【0077】
本開示に従い、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性であるか、または内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損についてホモ接合性である齧歯類は、強制水泳試験を完了することができず、一方、対照齧歯類（野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である齧歯類、または遺伝子改変またはヒト化を有さない齧歯類）は、強制水泳試験を行うことができる。強制水泳試験を終える能力は、抗うつ病／抗不安薬での処置後に、Ｅ５３３Ｄ変異体齧歯類またはＧｐｒ１５６欠損齧歯類において改善される。したがって、Ｅ５３３Ｄバリアントをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性であるか、または内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損についてホモ接合性である齧歯類における強制水泳試験を完了することができないことは、気分障害の特性または指標として働くことができ、齧歯類を使用して、単極性うつ病および不安障害などの気分障害の治療のための治療剤をスクリーニングするか、試験することができる。
【0078】
さらなる態様では、単極性うつ病または不安障害の治療のための治療剤をスクリーニングするか、または試験する方法が、本明細書において開示され、方法は、剤を本明細書において開示される齧歯類に投与すること、一つまたは複数のアッセイ（例えば、強制水泳試験またはガラス玉覆い隠し試験）を行い、剤が、一つまたは複数のアッセイにおいて齧歯類の能力に対して効果を有するかどかを決定することを含む。剤が、例えば、強制水泳試験における機能障害を低減すること、排除すること、もしくは予防すること、または強制水泳試験を行い、完了する能力を改善することにより、あるいは覆い隠したガラス玉の数における増加を低減すること、排除することもしくは防ぐことにより評価される齧歯類に対する治療効果を有するとき、剤は、治療候補として同定され得る。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1】上、内在性マウスＧｐｒ１５６座位（斜線で描いたコード領域で）；中、マウスＧｐｒ１５６エクソン２（一部、ＡＴＧ後のコドンから）およびエクソン３～５の欠損、ならびにＬａｃＺコード配列の挿入を有する遺伝子改変されたマウスＧｐｒ１５６座位；および下、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン２におけるＡＴＧ開始コドンからエクソン１０における停止コドンまでのマウスゲノム断片の、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子（野生型ヒトＧＰＲ１５６遺伝子またはＥ５３３Ｄバリアントをコードする変異体ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のいずれか）の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソン（最終のエクソンでもある）における停止コドンまでのヒトゲノム断片での置換を有する遺伝子改変されたマウスＧｐｒ１５６座位。この図において示されるマウスＧｐｒ１５６座位でのヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてのエクソン（「Ｅｘ」）ナンバリングは、マウスエクソンナンバリングに従った。
【図2】水泳試験の合計時間（秒）。マウスは、６分間の強制水泳試験について試験した；全てのマウスが、課題を行うことができたわけではない。グラフは、左から右に、オスＧｐｒ１５６＋／＋、オスＧｐｒ１５６－／－、オスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ（野生型ヒトＧＰＲ１５６についてホモ接合性）、オスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄ、メスＧｐｒ１５６＋／＋、メスＧｐｒ１５６－／－、メスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ、およびメスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄの、試験される異なるＧｐｒ１５６遺伝子タイプについての水泳試験の持続時間を示す。データを、各動物群について平均±ＳＥＭとして表した。
【図3A】左パネル：９週間のフルオキセチン１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射（１週間毎に６日間の日常的な注射）での日常的な処置の前および後の水泳試験の総時間（秒）。マウスは、３週間毎に、６分間の強制水泳について試験した。グラフは、試験された異なるＧｐｒ１５６遺伝子タイプ：処置ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウス、処置オスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ、処置メスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄ、処置メスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ、および未処置メスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄについての水泳試験の平均±ＳＥＭ持続時間を示す。フルオキセチンでの処置は、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスにおける損傷された水泳表現型を改善する。右パネル：フルオキセチンの腹腔内注射の３週間、６週間および９週間後に試験した異なるＧＰＲ１５６遺伝子タイプについて水泳試験を達成するマウスの割合。ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスのいずれ（０／１３）も、フルオキセチンでの９週間処置後、水泳試験１回目を行うことができなかった一方、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスの５３％（７／１３）は、試験を達成した（８番目のマウスが、３５０秒で試験を失敗した）。
【図3B】水泳試験における挙動を、９週間に渡り、図３Ａにおける実験において研究された個々のＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスからプロットし、これは、フルオキセチンでの処置が、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスにおける損傷された水泳表現型を改善することを示している。フルオキセチンでの９週間の処置後、マウスの５３％が、試験をやり遂げた。一方で、未処置群では、いく匹かのマウスが、それらの能力を改善し、１／１１匹のマウスが、９週間で水泳試験をやり遂げた。
【図3C】イミプラミンでの処置は、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスにおける損傷された水泳表現型を改善する。図３Ｃ：オスとメスのマウスを別々にプロットされた、イミプラミンでの処置前、およびイミプラミン１５ｍｇ／ｋｇを６日／週（月曜日から土曜日）腹腔内注射した９週間後に試験された異なるＧｐｒ１５６遺伝子型についての水泳試験の総時間（秒）。図３Ｄ：各遺伝子型についてオスとメスのマウスを組み合わせた、イミプラミンを用いた９週間の処置の前後で試験された、異なるＧＰＲ１５６遺伝子型についての水泳試験の総時間（秒）。
【図3D】イミプラミンでの処置は、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスにおける損傷された水泳表現型を改善する。図３Ｃ：オスとメスのマウスを別々にプロットされた、イミプラミンでの処置前、およびイミプラミン１５ｍｇ／ｋｇを６日／週（月曜日から土曜日）腹腔内注射した９週間後に試験された異なるＧｐｒ１５６遺伝子型についての水泳試験の総時間（秒）。図３Ｄ：各遺伝子型についてオスとメスのマウスを組み合わせた、イミプラミンを用いた９週間の処置の前後で試験された、異なるＧＰＲ１５６遺伝子型についての水泳試験の総時間（秒）。
【図4】左から右に、異なる遺伝子タイプ：オスＧｐｒ１５６＋／＋、オスＧｐｒ１５６－／－、オスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ、オスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄ、メスＧｐｒ１５６＋／＋、メスＧｐｒ１５６－／－、メスＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍ、およびメスＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄのマウスによる、１０分間での覆い隠したガラス玉の数。遺伝子改変され、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化ＧＰＲ１５６遺伝子についてホモ接合性のオスマウス、または遺伝子改変され、マウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性のオスマウスは、１０分間での覆い隠したガラス玉の数の増大を示した。データを、各動物群について平均±ＳＥＭとして表した。
【発明を実施するための形態】
【0080】
単極性うつ病および不安障害などの気分障害の動物モデルとしての使用に適した遺伝子改変された齧歯類が、本明細書において開示される。特に、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を有する遺伝子改変された齧歯類動物（例えば、マウスまたはｒａｔ）が、本明細書において開示され、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質または全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質における５３３位に対応するアミノ酸位置でＡｓｐを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（「Ｅ５３３Ｄバリエーション」としても本明細書において言及される）をコードする。遺伝子改変された齧歯類を作製する方法およびそのための標的化ベクター、交配方法、ならびに治療剤をスクリーニングし、試験するための気分障害の動物モデルとしての遺伝子改変された齧歯類の使用もまた、本明細書において開示される。
【0081】
本開示の様々な態様が、以下のセクションで詳細に記載される。
ＧＰＲ１５６
ＧＰＲ１５６（Ｇタンパク質共役受容体１５６）は、グループＣのＧタンパク質共役受容体ファミリーに属し、ＧＡＢＡＢ受容体サブファミリーに最も密接に関連する、タンパク質をコードする（Ｃａｌｖｅｒ Ａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１０：３０５～３０７（２００３））。ＧＰＲ１５６タンパク質は、シグナルペプチドを含まず、７つの膜貫通型ドメイン、Ｎ末端の細胞外ドメイン、およびＣ末端の細胞内ドメインを含有すると推定される（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。ＧＰＲ１５６のＣ末端配列は、推定上の多重コイルドメイン、ジロイシン、およびいくつかのＲＸＲ（Ｒ）ＥＲ保持モチーフを含有し、それらの全てが、ＧＡＢＡＢ受容体サブユニット機能において重要であることが示されている（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。さらに、中枢神経系におけるＧＰＲ１５６の分布は、他の既知のＧＡＢＡＢサブユニットの分布を連想させる（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。
ＧＰＲ１５６
ＧＰＲ１５６（Ｇタンパク質共役受容体１５６）は、グループＣのＧタンパク質共役受容体ファミリーに属し、ＧＡＢＡＢ受容体サブファミリーに最も密接に関連する、タンパク質をコードする（Ｃａｌｖｅｒ Ａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１０：３０５～３０７（２００３））。ＧＰＲ１５６タンパク質は、シグナルペプチドを含まず、７つの膜貫通型ドメイン、Ｎ末端の細胞外ドメイン、およびＣ末端の細胞内ドメインを含有すると推定される（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。ＧＰＲ１５６のＣ末端配列は、推定上の多重コイルドメイン、ジロイシン、およびいくつかのＲＸＲ（Ｒ）ＥＲ保持モチーフを含有し、それらの全てが、ＧＡＢＡＢ受容体サブユニット機能において重要であることが示されている（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。さらに、中枢神経系におけるＧＰＲ１５６の分布は、他の既知のＧＡＢＡＢサブユニットの分布を連想させる（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。
【0082】
ヒトＧＰＲ１５６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００３．１２において入手可能）は、染色体３の３ｑ１３と３ｑ２２の間に位置し、約１２０ｋｂの長さである。ヒト遺伝子は、第一のコードエクソンであるエクソン２を含む、１０個のエクソンを有すると推定されるが、基準の転写物は、推定される転写物に存在する５’非コードエクソンを含まないと思われ、第一のコードエクソンでもある第一のエクソンも含む、９個のエクソンを有する。相同マウス遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００８２．６において入手可能）は、染色体１６に位置し、第一のコードエクソンであるエクソン２を含む、１０個のエクソンを有すると文書化されている。相同ラット遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００５１１０．４で入手可能）は、染色体１１に位置し、第一のコードエクソンであるエクソン１を含む、９個のエクソンを有すると文書化されている。全長または短いアイソフォーム、野生型またはＥ５３３Ｄバリアント、ヒトＧＰＲ１５６タンパク質のいずれかをコードする例としてのヒトゲノムＤＮＡ配列が、配列番号９～１６に記載される。例としてのラットおよびマウス転写物ｃＤＮＡならびにタンパク質配列は、配列番号２５（ＮＭ＿１５３２９５．１）、配列番号２６（ＮＭ＿１５３３９４．２）、配列番号２７（ＮＰ＿６９５２０７．１）、および配列番号２８（ＮＰ＿７００４４３．２）において記載される。
【0083】
ＧＰＲ１５６は、それぞれ、ヒトタンパク質と、８７．５％同一であるマウスおよびラットタンパク質、６９．３％同一であるマウスおよびラットタンパク質、ならびに６９．５％同一であるマウスおよびラットタンパク質で、種をまたぎ高度に保存されている（Ｃａｌｖｅｒら、上記）。
【0084】
ヒトＧＰＲ１５６タンパク質の二つの野生型アイソフォームが報告されている。より長いアイソフォームは、本明細書では全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質とも呼称され、８１４個のアミノ酸からなる。より短いアイソフォームは、１２個のヌクレオチドのインフレーム欠失の結果として、より長いアイソフォームの１９８位～２０１位に対応する位置に４個のアミノ酸の欠失を含有する。各アイソフォームについて、二つのバリアントが存在し、より長いアイソフォーム中の５１６位に対応するアミノ酸位置、またはより短いアイソフォーム中の５１２位に対応するアミノ酸位置にグルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれかを有する。
【0085】
一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列により表される。配列番号１および配列番号２の両方は、８１４個のアミノ酸からなり、５１６位のみで異なっており、配列番号１は、この位置にグルタミン酸を有し、配列番号２は、アスパラギン酸を有する。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列により表されてもよい。
【0086】
所与のアミノ酸配列を、参照配列と「実質的に同一である」と言及する場合、所与のアミノ酸配列が、参照配列に少なくとも９８％同一、少なくとも９８．５％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である実施形態を含み、例えば、所与のアミノ酸配列は、参照配列と１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸、または５個、４個、３個、２個、もしくは１個以下のアミノ酸（複数可）だけ異なる。
【0087】
一部の実施形態では、短い野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質アイソフォームは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、短い野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質アイソフォームは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列により表される。配列番号３および配列番号４の両方は、８１０個のアミノ酸からなり、５１２位のみで異なっており、配列番号３は、この位置にグルタミン酸を有し、配列番号４は、アスパラギン酸を有する。一部の実施形態では、短い野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質アイソフォームは、配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列により表されてもよい。
【0088】
本開示による全ての野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質、全長タンパク質と短いアイソフォームタンパク質の両方が、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号２）中の５３３位に対応する位置にＧｌｕ残基を有する。
【0089】
本明細書で使用される場合、所与のポリペプチドまたは核酸分子内の位置のナンバリングの文脈で使用される場合の、語句「対応する」またはその文法的変形は、所与のアミノ酸または核酸分子が参照分子（例えば、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６のポリペプチドまたは核酸分子である本明細書の参照分子）と比較された場合に、指定された参照ポリペプチドまたは核酸分子のナンバリングを指す。言い換えれば、所与のポリマー中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの位置は、所与のポリマー内のアミノ酸残基またはヌクレオチドの実際の数値の位置によってではなく、参照分子に対して指定される。例えば、所与のアミノ酸配列は、二つの配列間の残基一致を最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に整列され得る。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列または核酸配列中の残基のナンバリングは、それが整列された参照配列に対して行われる。
【0090】
例えば、タンパク質が、配列番号１の５３３位に対応する位置にグルタミン酸を含む、「ＧＰＲ１５６タンパク質」という語句は、ＧＰＲ１５６タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１の配列に対して整列されている場合、ＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１の５３３位に対応する位置にグルタミン酸を有することを意味する。一例として、配列番号１の５３３位に対応する配列番号３の野生型ＧＰＲ１５６タンパク質の短いアイソフォームの位置は、５２９位である。
【0091】
上述のように、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質の５３３位に対応するＧＰＲ１５６タンパク質内の位置は、所与のＧＰＲ１５６タンパク質と全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号２）のアミノ酸配列との間の配列アラインメントを行うことによって容易に特定することができる。配列番号１または２の５３３位に対応するアミノ酸位置を特定するために配列アライメントを行うために使用できる様々な計算アルゴリズムが存在する。例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２）またはＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（ＳｉｅｖｅｒｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、２０１４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７９：１０５～１１６）を使用することにより、配列アライメントが行われてもよい。しかしながら、配列は、手動で整列することもできる。
【0092】
単極性うつ病および不安障害と関連するヒトＧＰＲ１５６における変更／変異
罹患した家族メンバーにおける単極性うつ病の表現型と分けるヒトＧＰＲ１５６遺伝子の希少バリアントが、米国出願公開第２０１８／００３０１１４Ａ１において報告されている。より具体的には、全長ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または２）における５３３位に対応する位置のアミノ酸を、ＧｌｕからＡｓｐへと変化させるヒトＧＰＲ１５６遺伝子の遺伝子改変は、罹患したファミリーメンバーにおける単極性うつ病の表現型と分けるものとして、米国公開第２０１８／００３０１１４Ａ１号で特定されている。かかるタンパク質は、本明細書では、「Ｅ５３３Ｄ変異」または「Ｅ５３３Ｄバリエーション」を有する変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質とも呼ばれる。Ｅ５３３Ｄバリエーションを有するさらなる家族は、不安障害の確定した診断を有していた。したがって、ヒトＧＰＲ１５６におけるＥ５３３Ｄバリエーションは、単極性うつ病および不安障害などの発症している気分障害に増加した感受性を示すことが、提案されている。
罹患した家族メンバーにおける単極性うつ病の表現型と分けるヒトＧＰＲ１５６遺伝子の希少バリアントが、米国出願公開第２０１８／００３０１１４Ａ１において報告されている。より具体的には、全長ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または２）における５３３位に対応する位置のアミノ酸を、ＧｌｕからＡｓｐへと変化させるヒトＧＰＲ１５６遺伝子の遺伝子改変は、罹患したファミリーメンバーにおける単極性うつ病の表現型と分けるものとして、米国公開第２０１８／００３０１１４Ａ１号で特定されている。かかるタンパク質は、本明細書では、「Ｅ５３３Ｄ変異」または「Ｅ５３３Ｄバリエーション」を有する変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質とも呼ばれる。Ｅ５３３Ｄバリエーションを有するさらなる家族は、不安障害の確定した診断を有していた。したがって、ヒトＧＰＲ１５６におけるＥ５３３Ｄバリエーションは、単極性うつ病および不安障害などの発症している気分障害に増加した感受性を示すことが、提案されている。
【0093】
本開示によれば、齧歯類中の内在性Ｇｐｒ１５６座位は、Ｅ５３３Ｄ変動を含む、すなわち、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質中の５３３位に対応する位置にＡｓｐを含む、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、発現する核酸を有するように改変（またはヒト化）されている。本明細書で示されるように、かかる遺伝子改変された齧歯類は、単極性うつ病および不安障害などの気分障害を反映し、それゆえ、気分障害の齧歯類モデルとしての役目を果たすことができる。
【0094】
ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類
本開示は、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類を提供し、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
本開示は、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類を提供し、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
【0095】
本明細書で使用される場合、「ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子」は、ヒトＧＰＲ１５６核酸部分と齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分の両方を含む、Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む。例えば、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子を改変して、ヒトＧＰＲ１５６核酸（例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の一部）で置換された齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の一部を有することができる。一部の実施形態では、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の一部が、ヒトＧＰＲ１５６核酸（例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の一部）によって置換されるように改変されている。
【0096】
遺伝子の「一部」は、本明細書において、遺伝子の「断片」と互換的に使用され、それは、例えば、５’調節領域（例えば、プロモーター）、５’非コードエクソン配列、３’非コードエクソン配列、５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、完全もしくは部分的なエクソン、完全もしくは部分的なイントロン、最終のエクソンの下流の３’領域、またはその組み合わせを含む、遺伝子の連続ヌクレオチド配列の一部への言及を含む。一部の実施形態では、遺伝子の一部は、遺伝子のコード領域、例えば、遺伝子のＡＴＧ開始コドンから停止コドンまでを含む核酸（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を指す。
【0097】
「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含有することができ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）を含んでもよく、一本鎖、二本鎖、または複数の鎖状であり得る。したがって、「ヒトＧＰＲ１５６核酸」への言及は、例えば、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のゲノム形態とｃＤＮＡ形態の両方を、全部または一部で含むことができる。
【0098】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質であるＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって表されてもよい。
一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって表されてもよい。
【0099】
一部の実施形態では、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、短いアイソフォーム野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列により表されてもよい。
【0100】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１４個のアミノ酸の全長ＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ＧＰＲ１５６タンパク質は、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号２）中の５３３位に相当する位置にＧｌｕ残基を含み、ＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む。
【0101】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０個のアミノ酸の短いアイソフォームＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ＧＰＲ１５６タンパク質は、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号２）中の５３３位に対応する位置にＧｌｕを含み、ＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号３にまたは配列番号４に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む。
【0102】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質、すなわち、全長野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（例えば、配列番号１または２）中の５３３位に対応するアミノ酸位置にＡｓｐを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、Ｅ５３３Ｄバリエーションは、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質と比較して、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質における唯一の変動であり、この場合、変異体ＧＰＲ１５６タンパク質は、Ｅ５３３Ｄバリアントとも呼ばれる。
【0103】
一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、全長ヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、全長変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、全長変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列により表されてもよい。
【0104】
一部の実施形態では、変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、短いアイソフォームヒトＧＰＲ１５６タンパク質である。一部の実施形態では、短いアイソフォーム変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、短いアイソフォーム変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列により表される。一部の実施形態では、短いアイソフォーム変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列により表されてもよい。
【0105】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１４個のアミノ酸の全長変異体ＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、全長変異体ＧＰＲ１５６タンパク質は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含み、配列番号５または配列番号６に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0106】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、８１０個のアミノ酸の短いアイソフォーム変異体ＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ＧＰＲ１５６タンパク質は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含み、変異体ＧＰＲ１５６タンパク質は、配列番号７または配列番号８に記載されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【0107】
上述のように、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６核酸部分および齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分を含み得る。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子中のヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、本明細書において上で記載されたＧＰＲ１５６タンパク質、例えば、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）、または変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）のコード配列を含む。
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子中のヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、本明細書において上で記載されたＧＰＲ１５６タンパク質、例えば、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）、または変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）のコード配列を含む。
【0108】
一部の実施形態では、コード配列は、ゲノムＤＮＡの形態である。一部の実施形態では、コード配列は、ｃＤＮＡの形態である（すなわち、イントロン配列を含まない）。コード配列の提供における使用に適した核酸配列の例は、配列番号９～２４に記載され、タンパク質配列に対するそれらの該当は、以下に要約されている。
【0109】
【表1-1】
【0110】
【表1-2】
【0111】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子中のヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソン中のＡＴＧ開始コドンから最後のコードエクソン（また最終のエクソン）中の停止コドンを含むコード配列を含む。ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、全長野生型ＧＰＲ１５６タンパク質の５３３位に対応するアミノ酸位置にＧｌｕをコードする最後のコードエクソンを有する野生型遺伝子、または全長野生型ＧＰＲ１５６タンパク質の５３３位に対応するアミノ酸位置にＡｓｐをコードする最後のコードエクソンを有する変異体遺伝子であり得る。
【0112】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子中のヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ＧＰＲ１５６タンパク質のコード配列に加えて、５’非コードエクソン配列（例えば、ＡＴＧ開始の上流にある第一のコードエクソンの５’部分）、３’非コードエクソン配列（例えば、停止コドンの下流の最終のエクソンの３’部分、すなわち、３’ＵＴＲ）、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の最終のエクソンの下流のヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含む。
【0113】
本開示のヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子において、ヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分に作動可能に結合されている。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子中の齧歯類Ｇｐｒ１５６核酸部分は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列もしくは３’非コードエクソン配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、マウスＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、５’非コードエクソン配列は、例えば、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２（第一のコードエクソン）の５’非コード部分、またはその組み合わせを含み得、３’非コードエクソン配列は、例えば、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１０（第９および最後のコードエクソン）の３’ＵＴＲを含み得る。齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子がラットＧｐｒ１５６遺伝子である実施形態では、５’非コードエクソン配列は、例えば、ラットＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１の５’非コード部分（また第一のコードエクソンである）を含むことができ、３’非コードエクソン配列は、例えば、ラットＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン９の３’ＵＴＲ（また、最後のコードエクソンおよび最終のエクソンである）を含むことができる。
【0114】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列（例えば、３’ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲと齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’ＵＴＲの両方を、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の３’ＵＴＲの下流に位置する齧歯類３’ＵＴＲと共に含む。
【0115】
一部の特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソン中のＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（３’ＵＴＲを含む）、続いて齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の３’非コードエクソン配列を含むヒトＧＰＲ１５６核酸に作動可能に結合された、齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列を含む。特定の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子のＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（３’ＵＴＲを含む）、続いてマウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１０の３’ＵＴＲを含むヒトＧＰＲ１５６核酸に作動可能に結合された、マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン２（第一のコードエクソン）のエクソン１および５’非コード部分を含む。
【0116】
一部の実施形態では、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子座の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の齧歯類ゲノム断片の、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質またはＥ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質のいずれかをコードするヒトＧＰＲ１５６核酸での置換から形成される。ヒトＧＰＲ１５６核酸部分は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【0117】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソン中のＡＴＧ開始コドンから最後のコードエクソン中の停止コドンを含むヒトゲノム断片を含み、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子は、Ｇｌｕ残基（野生型）またはＥ５３３Ｄバリエーションのいずれかをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の５’非コードエクソン配列（例えば、第一のコードエクソン中の５’非コード配列）、もしくは３’非コードエクソン配列（例えば、３’ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせをさらに含む。特定の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ヒトＧＰＲ１５６遺伝子の第一のコードエクソンのＡＴＧ開始コドンから最終のエクソン（すなわち、３’ＵＴＲを含む）を含む。
【0118】
一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の第一のコードエクソンにおけるＡＴＧ開始コドンから最終のコードエクソンにおける停止コドンを含む。一部の実施形態では、置換されている齧歯類ゲノム断片は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の５’および／または３’非コードエクソン配列をさらに含む。齧歯類がマウスである実施形態では、置換されているマウスゲノム断片はまた、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子のエクソン１、エクソン２の５’非コード配列、またはエクソン１０の３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【0119】
一部の実施形態では、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位中にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、本明細書に開示される齧歯類動物は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。
【0120】
一部の実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない。例えば、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子が、破壊されるか、または欠失されるか、または改変されるか、またはヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子で置換されている齧歯類が提供される。一部の実施形態では、二つの内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６対立遺伝子の各々におけるゲノム断片は、ヒトＧＰＲ１５６核酸で置換され、結果として、二つのヒト化Ｇｐｒ１５６対立遺伝子および内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない齧歯類動物がもたらされる。一部の実施形態では、一方の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６対立遺伝子のゲノム断片は、ヒトＧＰＲ１５６核酸で置換され、他の内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６対立遺伝子は、破壊または欠失を含有するよう改変され、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６タンパク質を発現することができない齧歯類動物をもたらす。
【0121】
ゲノムが、遺伝子改変されたＧｐｒ１５６座位を含む齧歯類も本明細書において提供され、遺伝子改変は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の欠失を含み、任意選択的にレポーター遺伝子の挿入も含み、レポーター遺伝子は、座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される。齧歯類は、遺伝子改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。
【0122】
一部の実施形態では、第一のコードエクソンの開始コドンの直後のヌクレオチドから始まり、続くコードエクソン（例えば、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、または第九のコードエクソン）までのゲノム断片が、欠失され、レポーター遺伝子は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の開始コドンのすぐ下流に挿入される。かかる結合において、レポーター遺伝子の発現は、改変されていない内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現パターンに似ていると予想される。
【0123】
複数のレポーター遺伝子が、当該技術分野で公知であり、本明細書での使用に適している。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子である。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【0124】
本明細書に記載される実施形態のいずれについても、齧歯類は、例えば、マウス、ラット、およびハムスターを含み得る。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。別の実施形態では、齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４～１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、または前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統の混合である。特定の実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合である。
一部の実施形態では、齧歯類は、マウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。別の実施形態では、齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４～１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、または前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統の混合である。特定の実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合である。
【0125】
一部の実施形態では、齧歯類は、ラットである。特定の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二つ以上の系統の混合である。
【0126】
標的化ベクター、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類を作製する方法、および交配方法
ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類は、様々な方法を使用して作製することができる。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸を担持する標的化核酸構築物（すなわち、標的化ベクター）が構築される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、本明細書において上で記載されたＧＰＲ１５６タンパク質、例えば、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）、または変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）のコード配列を含み得る。サイズに応じ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのどちらが使用されるかどうか）、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ｃＤＮＡ源から直接クローニングするか、または合成的に作製することができる。或いは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは、ヒトＧＰＲ１５６核酸配列を提供し得る。
ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類は、様々な方法を使用して作製することができる。一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸を担持する標的化核酸構築物（すなわち、標的化ベクター）が構築される。ヒトＧＰＲ１５６核酸は、本明細書において上で記載されたＧＰＲ１５６タンパク質、例えば、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）、または変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質（全長もしくは短いアイソフォームのいずれか）のコード配列を含み得る。サイズに応じ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのどちらが使用されるかどうか）、ヒトＧＰＲ１５６核酸は、ｃＤＮＡ源から直接クローニングするか、または合成的に作製することができる。或いは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは、ヒトＧＰＲ１５６核酸配列を提供し得る。
【0127】
標的化ベクターは、相同な組み換えおよび内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子にヒトＧＰＲ１５６核酸への挿入を仲介し、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を形成するように、ヒトＧＰＲ１５６核酸に加えて、適当な長さであり、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子配列に対して相同である隣接核酸配列を含むことができる。
【0128】
一部の実施形態では、標的化ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、および同第８，３５４，３８９号（これらはすべてが、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の選択可能なマーカー遺伝子を含有する自己欠失型カセット）も含み、これらは、部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接するか、またはこれらを含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子をヒトＧＰＲ１５６核酸に隣接する標的化ベクター上に置いて、トランスフェクタントの容易な選択を可能にすることができる。
【0129】
一部の実施形態では、ヒトＧＰＲ１５６核酸を担持する標的化ベクター（例えば、ＢＡＣベクター）は、例えば、電気穿孔により、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。マウスＥＳ細胞とラットＥＳ細胞の両方が、共に当技術分野で説明されている。例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、および米国公開第２００８－００７８０００Ａ１号（これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞および遺伝子改変されたマウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を記載し、米国公開第２０１４／０２３５９３３Ａ１号および米国公開第２０１４／０３１０８２８Ａ１（これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞および遺伝子改変されたラットを作製する方法を記載する。
【0130】
齧歯類ゲノム内に統合されたヒトＧＰＲ１５６核酸を有するＥＳ細胞を選択することができる。選択後、陽性のＥＳクローンは、例えば、必要に応じて、自己欠失型カセットを除去するように改変することができる。次に、ゲノムに統合されたヒトＧＰＲ１５６核酸配列を有するＥＳ細胞を、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、米国特許第７，６５９，４４２号、米国特許第７，２９４，７５４号、および米国公開第２００８－００７８０００Ａ１号を参照）、または米国公開第２０１４／０２３５９３３Ａ１号および米国公開第２０１４／０３１０８２８Ａ１号に記載される方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入のためのドナーＥＳ細胞として使用される。ドナーＥＳ細胞を含む胚は、胚盤胞期まで培養され、次に、代理母に移植して、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０齧歯類を生成する。突然変異対立遺伝子を有する齧歯類の仔は、ヒトＧＰＲ１５６核酸配列または選択可能なマーカー遺伝子の存在を検出する対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の変法を使用して、尾切片から単離されたＤＮＡの遺伝子型解析により同定することができる。
【0131】
本明細書に記載される遺伝子改変された齧歯類を、別の齧歯類と交配する方法、ならびにかかる交配から得られる子孫がさらに本明細書において提供される。
一部の実施形態では、本明細書において上で記載された第一の遺伝子改変された齧歯類（例えば、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類であって、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある）を、第二の齧歯類と交配させ、ゲノムがヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む子孫齧歯類を生成することを含む方法が提供される。上記のように、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質、またはＥ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードしてもよい。子孫は、交配で使用される第二の齧歯類から遺伝する他の望ましい表現型または遺伝子改変を有してもよい。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
一部の実施形態では、本明細書において上で記載された第一の遺伝子改変された齧歯類（例えば、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類であって、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある）を、第二の齧歯類と交配させ、ゲノムがヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む子孫齧歯類を生成することを含む方法が提供される。上記のように、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質、またはＥ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードしてもよい。子孫は、交配で使用される第二の齧歯類から遺伝する他の望ましい表現型または遺伝子改変を有してもよい。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0132】
一部の実施形態では、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む子孫齧歯類が提供され、子孫齧歯類は、本明細書に上で記載された第一の遺伝子改変された齧歯類（例えば、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位にヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む齧歯類であって、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現が、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある）と第二の齧歯類を交配させることを含む方法により生成される。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてヘテロ接合性である。一部の実施形態では、子孫齧歯類は、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である。
【0133】
気分障害の齧歯類モデル
単極性うつ病および不安障害などの気分障害の齧歯類モデルが、本明細書において開示される。
単極性うつ病および不安障害などの気分障害の齧歯類モデルが、本明細書において開示される。
【0134】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０１３年により公開された精神障害の診断および統計マニュアルによると、単極性うつ病は、大うつ病性障害、気分変調性障害、混合性うつ病性障害、抑うつ気分による調整障害、およびそうでない場合、特定されていないうつ病（ＮＯＳ）からなる。うつ病のＤＳＭＩＶ基準は、２週間以上の、次の：ｉ）ほぼ毎日、１日の大半、気分が落ち込むこと、ｉｉ）すべてまたはほぼすべての活動に対する関心または快楽が著しく低下、ｉｉｉ）著しい体重減少または食欲低下、ｉｖ）不眠または過眠、ｖ）精神運動性興奮または運動遅延、ｖｉ）疲労またはエネルギーの喪失、ｖｉｉ）無価値または過度な罪悪感、ｖｉｉｉ）思考力もしくは集中力の低下、または決断力の欠如、およびｉｘ）反復的な死の思考から５つ以上の症状である。気分変調性障害のＤＳＭＩＶ基準は、少なくとも２年間、ほぼ毎日、数日以上の抑うつ気分を呈する、圧倒的でありながら慢性的な抑うつ状態を特徴とする。この障害に罹患している人は、次の症状：ｉ）食欲不足または過食、ｉｉ）不眠または過眠、ｉｉｉ）低エネルギーまたは疲労、ｉｖ）低自尊心、ｖ）集中力の低下または意思決定の困難、およびｖｉ）絶望感の二つ以上と共に、２か月より長く経過してはいけない。
【0135】
不安障害の生理学的症状には、筋肉の緊張、心動揺、発汗、めまい、および息切れが含まれるが、これらに限定されない。情動症状には、情動不安、差し迫った運命の感覚、死の恐怖、恥ずかしさまたは屈服の恐怖、および恐ろしい出来事の恐怖が含まれるが、これらに限定されない。
【0136】
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類を含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、Ｅ５３３Ｄバリエーションを含む変異体ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。
【0137】
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位でヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を含む、遺伝子改変された齧歯類をさらに含み、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子は、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードし、ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子の発現は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６座位で齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターの制御下にある。かかる齧歯類は、野生型齧歯類（ヒト化を有さない）と同様に、強制水泳試験を完了できることが本明細書に示されており、したがって、比較されるべき追加の対照齧歯類として有用である。
【0138】
一部の実施形態では、気分障害の齧歯類モデルは、ゲノムが、遺伝子改変されたＧｐｒ１５６座位を含む、遺伝子改変された齧歯類をさらに含み、遺伝子修飾は、内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子における欠損および任意選択で、レポーター遺伝子の挿入を含み、レポーター遺伝子は、座位で内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される。齧歯類は、遺伝子改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子内の欠失についてホモ接合性の齧歯類は、強制水泳試験を完了できず、指定された時間内に覆い隠されたガラス玉の数が増加することが本明細書において示されており、したがって、比較されるべき追加の対照齧歯類として有用である。
【0139】
一部の実施形態では、遺伝子改変された齧歯類は、強制水泳試験において評価される。強制水泳試験の例示的な実施形態では、齧歯類を、水で満たされた容器またはビーカー内に配置して、齧歯類が尾部でさえ、容器の底部に触れないことを確実にすることができる。水は、室温または３０℃で維持され得る。試験は、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０分間継続することができる。一部の実施形態では、試験は、約６分続く。齧歯類が試験を行うことができない（例えば、試験期間が終了する前に浮上し続けることができない）なら、それが苦痛の兆候を示すとすぐに、それは水から引き上げられる。本明細書で確立されるように、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性または内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の齧歯類が、強制水泳試験を行うことができないことは、うつ病または不安などの気分障害の特徴的な反映である。野生型齧歯類（内在性齧歯類Ｇｐｒ１５６を発現する）およびヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子（Ｅ５３３Ｄ変異なし）についてホモ接合性である遺伝子改変された齧歯類は、水泳試験の完了に困難はなく、対照として使用することができる。一部の実施形態では、水泳試験を行う能力の改善は、例えば、異なる時間ポイントで、または処置の前および後に、個々の齧歯類の評価に基づいて決定することができる。一部の実施形態では、水泳試験を行う能力の改善は、例えば、異なる時間ポイントで、または処置の前および後に、同じ遺伝子改変を有する齧歯類の群の評価に基づいて決定され、試験を首尾よく行うことができる群における齧歯類の割合の増加は、改善された能力を示す。水泳試験を行う能力の変化（例えば、増加または改善）は、同じ遺伝子型を有する齧歯類の別個の未処置の群に対する齧歯類の処置された群の比較に基づいて、または処置後の齧歯類の同じ群に対する処置前の齧歯類の群の比較に基づいて決定することができる。
【0140】
強制水泳試験（またはＰｏｒｓｏｌｔ試験、Ｐｏｒｓｏｌｔら、Ａｒｃｈ Ｉｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ Ｔｈｅｒ．２２９（２）：３２７～３３６（１９７７））は、齧歯類が不快な環境にどのように反応するかに基づいて無力性を評価するために、当該技術分野で使用される。無力感は、うつ病の特徴である。水中に置かれる齧歯類（例えば、マウス）は、典型的には脱出を試みる。しかし、齧歯類が抑制行動を呈する場合、齧歯類は、救助されるまで脱出しようと試みることなく単に浮遊する。学習性無力感は、１９７０年代にＳｅｌｉｇｍａｎとその同僚によって最初に発見され、探索された現象である（Ｓｅｌｉｇｍａｎ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ．２３（１）：４０７～４１２（１９７２））。このモデルの大きな魅力の一つは、事象がネガティブに見られ、制御不可能であると解釈され、それに対処する際に不安感や無力感につながる、うつ病の認知的視野に由来することである。動物とヒトのうつ状態において学習性無力感には多くの類似点がある。例えば、齧歯類で観察されるうつ病様の挙動を促進する、制御不能なストレスの多い事象は、同様に、ヒトにおけるいくつかの臨床的うつ病の発症に先行する（Ｇｏｌｄら、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ．３１９（６）：３４８～３５３（１９８８）；Ｌｌｏｙｄ、Ａｒｃｈ Ｇｅｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３７（５）：５４１～５４８（１９８０））。さらに、類似だが、制御可能な事象への動物の曝露は、関連する挙動変化をもたらさない（ＣｏｒｕｍおよびＴｈｕｒｍｏｎｄ、Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍ Ｍｅｄ．３９（６）：４３６～４３（１９７７）、Ｗｅｉｓｓら、Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｉｎ Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｌｅｖｙ Ｅｄｓ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８２、１９５～２２３頁）。当技術分野で記載されるように、Ｐｏｒｓｏｌｔ強制水泳試験は、訓練日である１日目および試験日である２日目を含み、２日間にわたる。訓練挑戦中、動物は、タンクからの脱出は不可能であることを学習する。試験日（２日目）に、動物を５分間、水の容器に入れる。２日目の間、動物が動かない時間の長さは、依存変数として測定される。
【0141】
Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスおよびマウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスは、訓練セッションに対応する６分間の強制水泳試験を行うことができなかったことが本明細書に示された。マウスは、当初は泳ぐことができたが、脱出口を見つけようとした２～３分後には、マウスが水中で「パニックである」かのように見えた。次に、これらのマウスは、熱水泳、反復ダイビング、および水中でのスピニングを特徴とする異常な挙動を示し始め、浮上したままでいられなくなった。すぐに水から回収されない場合、これらのマウスはおぼれた。対照的に、野生型マウス（内在性マウスＧｐｒ１５６を発現する）およびヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウス（突然変異なし）は、６分間の水泳試験を完了するのに困難はなかった。
【0142】
Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスまたはマウスＧＰＲ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスによって示される特有の挙動は、文献において他者によって説明されていない。これらのマウスが試験を完了できないという事実から、発明者らは、学習性無力性を測定することができなかった。しかしながら、発明者らは、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性であるメスの９０％およびオスの６０％の遺伝子改変されたマウスが、訓練水性セッションに失敗し、一方で、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である遺伝子改変されたマウスが、試験を容易に完了したことを観察した。同様に、マウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性のメスの９０％およびオスの５３％の遺伝子改変されたマウスは、訓練水泳セッションに失敗し、一方、その野生型同腹仔は、試験を完了した。室温（約２３℃）の代わりに３０℃で加熱された水で、またはより大きく、プラットフォーム（脱出オプション）と共に呈する水迷路装置を使用したとき、同様の結果が得られた。
【0143】
また、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の齧歯類が、フルオキセチン（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）またはイミプラミン（ノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミンおよびセロトニンの再取り込み阻害剤）を用いた処置後に、水泳試験を行うそれらの能力を改善することも示されている。フルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日１回）またはイミプラミン（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日１回、６日／週）で９週間処置した後、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスについて、６分間の水泳試験行う能力の改善が観察された。
【0144】
一部の実施形態では、遺伝子改変された齧歯類は、ガラス玉覆い隠し試験において評価される。ガラス玉覆い隠し作業は、強迫的な行動および／または不安のような行動の指標として使用される。ＯＣＤ様症状を有する齧歯類は、高度な反復行動（掘り込みを含む）に関与する傾向があり、高度な不安を有する齧歯類は、新規の状況において高度な掘り込みを行う傾向がある。
【0145】
一部の実施形態では、ガラス玉覆い隠し試験は、以下のように行うことができる。齧歯類のケージは、トウモロコシの穂軸の寝藁で均等に充填することができ、ガラス玉は、寝藁の上部に均等に間隔をあけられる。各齧歯類をケージの中心に配置し、約１０分間試験を実行する。１０分後、動物をケージから取り出し、少なくとも３分の２が隠されたガラス玉をカウントする。
【0146】
例として、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたオスのマウスまたはマウスＧＰＲ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の遺伝子改変されたオスのマウスは、１０分間で覆い隠したガラス玉の数が増加する傾向を示したことが、本明細書において示されている（例えば、図４を参照）。
【0147】
本明細書に開示される齧歯類およびモデルにより、ＧＰＲ１５６タンパク質の機能および気分障害の発生についてよりよく理解することが可能となる。さらに、このような齧歯類は、単極性うつ病または不安障害などの気分障害の治療のための治療薬のスクリーニング、試験および開発に使用されてもよい。
【0148】
一部の実施形態では、単極性うつ病または不安障害を治療するための治療剤の効果は、本明細書に開示される齧歯類、例えば、Ｅ５３３Ｄバリアントをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子を担持する齧歯類に剤を投与すること、および齧歯類を一つまたは複数の試験（例えば、強制水泳試験またはガラス玉覆い隠し試験）に供すること、候補治療剤が、試験における齧歯類の性能に何らかの効果、例えば、水泳試験を完了する能力のいずれかの改善、またはガラス玉覆い隠し試験において覆い隠されたガラス玉の数のいずれかの減少を有するかを決定することにより、本明細書において決定される。
【0149】
本明細書に開示される齧歯類で試験され得る治療剤は、市販の抗うつ薬と抗不安薬の両方、ならびに単極性うつ病および不安障害を治療するための開発中の候補化合物を含む。小分子化学化合物および核酸（例えば、遺伝子治療薬）の両方が含まれる。
【0150】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）である。ＳＳＲＩの適当な例には、シタロプラム（Ｃｅｌｅｘａ（登録商標））、Ｅｓシタロプラム（Ｌｅｘａｐｒｏ（登録商標）、Ｃｉｐｒａｌｅｘ（登録商標））、パロキセチン（Ｐａｘｉｌ（登録商標）、Ｓｅｒｏｘａｔ（登録商標））、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））、フルボキサミン（Ｌｕｖｏｘ（登録商標））、およびセルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標）、Ｌｕｓｔｒａｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0151】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）である。ＳＮＲＩの適切な例には、デスベンラファキシン（Ｐｒｉｓｔｉｑ（登録商標））、デュロキセチン（Ｃｙｍｂａｌｔａ（登録商標））、レボミルナシプラン（Ｆｅｔｚｉｍａ（登録商標））、ミルナシプラン（Ｉｘｅｌ（登録商標）、Ｓａｖｅｌｌａ（登録商標））、トフェナセン（Ｅｌａｍｏｌ（登録商標）、トファシン（登録商標））、およびベンラファキシン（Ｅｆｆｅｘｏｒ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0152】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＮＲＩ）である。ＮＲＩの適切な例には、レボキセチン（Ｅｄｒｏｎａｘ（登録商標））、ビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ（登録商標））、およびアトモキセチン（Ｓｔｒａｔｔｅｒａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0153】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、リチウムである。
一部の実施形態では、抗うつ薬は、セロトニン調節剤および刺激剤（ＳＭＳ）である。ＳＭＳの適切な例には、ビラゾドン（Ｖｉｉｂｒｙｄ（登録商標））およびボルチオキセチン（Ｔｒｉｎｔｅｌｌｉｘ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、抗うつ薬は、セロトニン調節剤および刺激剤（ＳＭＳ）である。ＳＭＳの適切な例には、ビラゾドン（Ｖｉｉｂｒｙｄ（登録商標））およびボルチオキセチン（Ｔｒｉｎｔｅｌｌｉｘ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0154】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、セロトニン拮抗薬および再取り込み阻害剤（ＳＡＲＩ）である。ＳＡＲＩの適切な例には、エトペリドン（Ａｘｉｏｍｉｎ（登録商標）、Ｅｔｏｎｉｎ（登録商標））、ネファゾドン（Ｎｅｆａｄａｒ（登録商標）、Ｓｅｒｚｏｎｅ（登録商標））、およびトラゾドン（Ｄｅｓｙｒｅｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0155】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、三環式抗うつ薬（ＴＣＡ）である。ＴＣＡの適切な例には、アミトリプチリン（Ｅｌａｖｉｌ（登録商標）、Ｅｎｄｅｐ（登録商標））、アミトリプチリンオキシド（Ａｍｉｏｘｉｄ（登録商標）、Ａｍｂｉｖａｌｏｎ（登録商標）、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｎ（登録商標）、クロミプラミン（Ａｎａｆｒａｎｉｌ（登録商標））、デシプラミン（Ｎｏｒｐｒａｍｉｎ（登録商標）、Ｐｅｒｔｏｆｒａｎｅ（登録商標））、ジベンゼピン（Ｎｏｖｅｒｉｌ（登録商標）、Ｖｉｃｔｏｒｉｌ（登録商標））、ジメタクリン（Ｉｓｔｏｎｉｌ（登録商標））、ドスルピン（Ｐｒｏｔｈｉａｄｅｎ（登録商標））、ドキセピン（Ａｄａｐｉｎ（登録商標））、Ｓｉｎｅｑｕａｎ（登録商標））、イミプラミン（Ｔｏｆｒａｎｉｌ（登録商標））、ロフェプラミン（Ｌｏｍｏｎｔ（登録商標）、Ｇａｍａｎｉｌ（登録商標））、メリトラセン（Ｄｉｘｅｒａｎ（登録商標）、Ｍｅｌｉｘｅｒａｎ（登録商標）、Ｔｒａｕｓａｂｕｎ（登録商標））、ニトロキサゼピン（Ｓｉｎｔａｍｉｌ（登録商標））、ノルトリプチリン（Ｐａｍｅｌｏｒ（登録商標）、Ａｖｅｎｔｙｌ（登録商標））、ノキシプチリン（Ａｇｅｄａｌ（登録商標）、Ｅｌｒｏｎｏｎ（登録商標）、Ｎｏｇｅｄａｌ（登録商標））、ピポフェジン（Ａｚａｆｅｎ（登録商標）／Ａｚａｐｈｅｎ（登録商標））、プロトリプチリン（Ｖｉｖａｃｔｉｌ（登録商標））、およびトリミプラミン（Ｓｕｒｍｏｎｔｉｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。また、ブトリプチリン（Ｅｖａｄｙｎｅ（登録商標））、デメキシプチリン（Ｄｅｐａｒｏｎ（登録商標）、Ｔｉｎｏｒａｎ（登録商標））、イミプラミノキシド（Ｉｍｉｐｒｅｘ（登録商標）、Ｅｌｅｐｓｉｎ（登録商標））、イプリンドール（Ｐｒｏｎｄｏｌ（登録商標）、Ｇａｌａｔｕｒ（登録商標）、Ｔｅｔｒａｎ（登録商標））、メタプラミン（Ｔｉｍａｘｅｌ（登録商標））、プロピゼピン（Ｄｅｐｒｅｓｓｉｎ（登録商標）、Ｖａｇｒａｎ（登録商標））、およびキヌプラミン（Ｋｉｎｕｐｒｉｌ（登録商標）、Ｋｅｖｏｐｒｉｌ（登録商標））も含まれる。また、オピプラモル（Ｉｎｓｉｄｏｎ（登録商標））およびチアネプチン（Ｓｔａｂｌｏｎ（登録商標））も含まれる。
【0156】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、四環式抗うつ薬（ＴｅＣＡ）である。ＴｅＣＡの適切な例には、アモキサピン（Ａｓｅｎｄｉｎ（登録商標））、マプロチリン（Ｌｕｄｉｏｍｉｌ（登録商標））、ミアンセリン（Ｂｏｌｖｉｄｏｎ（登録商標）、Ｎｏｒｖａｌ（登録商標）、Ｔｏｌｖｏｎ（登録商標））、ミルタザピン（Ｒｅｍｅｒｏｎ（登録商標））、およびＳｅｔｉｐｔｉｌｉｎｅ（Ｔｅｃｉｐｕｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0157】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、モノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）である。ＭＡＯＩの適切な例には、イプロニアジド（Ｍａｒｓｉｌｉｄ（登録商標））、イソカルボキサジド（Ｍａｒｐｌａｎ（登録商標））、フェネルジン（Ｎａｒｄｉｌ（登録商標））、セレギリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ（登録商標）、Ｚｅｌａｐａｒ（登録商標）、Ｅｍｓａｍ（登録商標））、トラニルシプロミン（Ｐａｒｎａｔｅ（登録商標））、メトラリンドール（Ｉｎｋａｚａｎ（登録商標））、モクロベミド（Ａｕｒｏｒｉｘ（登録商標）、Ｍａｎｅｒｉｘ（登録商標））、ピルリンドール（Ｐｉｒａｚｉｄｏｌ（登録商標））、およびトロキサトン（Ｈｕｍｏｒｙｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。その他には、例えば、ベンモキシン（Ｎｅｕｒａｌｅｘ（登録商標））、カルオキサゾン（Ｓｕｒｏｄｉｌ（登録商標）、Ｔｉｍｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））、イプロクロジド（Ｓｕｒｓｕｍ（登録商標）、メバナジン（Ａｃｔｏｍｏｌ（登録商標））、ニアルアミド（Ｎｉａｍｉｄ（登録商標））、オクタモキシン（Ｘｉｍａｏｌ（登録商標））、フェニプラジン（Ｃａｔｒｏｎ（登録商標））、フェノキシプロパジン（Ｄｒａｚｉｎｅ（登録商標））、ピブヒドラジン（Ｔｅｒｓａｖｉｄ（登録商標））、サフラジン（Ｓａｆｒａ（登録商標））、エプロベミジン（Ｂｅｆｏｌ（登録商標））、およびミナプリン（Ｂｒａｎｔｕｒ（登録商標）、Ｃａｎｔｏｒ（登録商標））が含まれる。
【0158】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、非定型抗精神病薬である。非定型抗精神病薬の適切な例には、アミスルプリド（Ｓｏｌｉａｎ（登録商標））、ルラシドン（Ｌａｔｕｄａ（登録商標））、およびクエチアピン（Ｓｅｒｏｑｕｅｌ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
【0159】
一部の実施形態では、抗うつ薬は、アゴメラチン（Ｖａｌｄｏｘａｎ（登録商標））、ビフェメラン（Ａｌｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｅｌｅｐｏｒｔ（登録商標））、ブプロピオン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（登録商標））、ケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標））、タンドスピロン（Ｓｅｄｉｅｌ（登録商標））、またはテニロキサジン（Ｌｕｃｅｌａｎ（登録商標）、Ｍｅｔａｔｏｎｅ（登録商標））である。
【0160】
一部の実施形態では、抗不安剤は、アルプラゾラム（Ｘａｎａｘ（登録商標））、ブロマゼパム（Ｌｅｃｔｏｐａｍ（登録商標）、Ｌｅｘｏｔａｎ（登録商標）、クロルジアゼポキシド（Ｌｉｂｒｉｕｍ（登録商標））、クロナゼパム（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ（登録商標）、Ｒｉｖｏｔｒｉｌ（登録商標））、クロラゼパム（Ｔｒａｎｘｅｎｅ（登録商標））、ジアゼピン（Ｖａｌｉｕｍ（登録商標））、フルラゼパム（Ｄａｌｍａｎｅ（登録商標））、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標））、オキサゼパム（Ｓｅｒａｘ（登録商標）、セラパックス（登録商標））、テマゼパム（Ｒｅｓｔｏｒｉｌ（登録商標））、トリアゾラム（Ｈａｌｃｉｏｎ（登録商標））、およびトフィソパム（Ｅｍａｎｄａｘｉｎ（登録商標）、Ｇｒａｎｄａｘｉｎ（登録商標））を含むが、これらに限定されない、ベンゾジアゼピンである。
【0161】
一部の実施形態では、抗不安剤は、メプロバマート（Ｍｉｌｔｏｗｎ（登録商標）、Ｅｑｕａｎｉｌ（登録商標））を含むが、これらに限定されない、カルバメートである。
一部の実施形態では、抗不安薬は、ヒドロキシジン（Ａｔａｒａｘ（登録商標））、クロルフェニラミン（Ｃｈｌｏｒ－Ｔｒｉｍｅｔｏｎ（登録商標））、およびジフェンヒドラミン（ベナドリル（登録商標））を含むが、これに限定されない、抗ヒスタミン剤である。
一部の実施形態では、抗不安薬は、ヒドロキシジン（Ａｔａｒａｘ（登録商標））、クロルフェニラミン（Ｃｈｌｏｒ－Ｔｒｉｍｅｔｏｎ（登録商標））、およびジフェンヒドラミン（ベナドリル（登録商標））を含むが、これに限定されない、抗ヒスタミン剤である。
【0162】
一部の実施形態では、抗不安薬は、ブスピロネ（Ｂｕｓｐａｒ（登録商標））およびタンドスピロネ（Ｓｅｄｉｅｌ（登録商標））を含むが、これらに限定されない、アザピロンである。
【0163】
一部の実施形態では、抗不安剤は、本明細書に記載される、ＳＳＲＩ、ＳＮＲＩ、ＴＣＡ、ＴｅＣＡ、またはＭＡＯＩである。
一部の実施形態では、抗不安薬は、メビカル（Ｍｅｂｉｃａｒｕｍ（登録商標））、ファボモチゾール（Ａｆｏｂａｚｏｌｅ（登録商標））、セランク、ブロマンタン、エモキシピン、プレガバリン、イソ吉草酸メンチル、またはイソ吉草酸メンチル（Ｖａｌｉｄｏｌ（登録商標））である。
一部の実施形態では、抗不安薬は、メビカル（Ｍｅｂｉｃａｒｕｍ（登録商標））、ファボモチゾール（Ａｆｏｂａｚｏｌｅ（登録商標））、セランク、ブロマンタン、エモキシピン、プレガバリン、イソ吉草酸メンチル、またはイソ吉草酸メンチル（Ｖａｌｉｄｏｌ（登録商標））である。
【0164】
齧歯類への抗うつ薬または抗不安剤の投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所的、鼻腔内、または筋肉内を含むが、これらに限定されない、任意の適切な経路によるものであり得る。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。
【0165】
薬剤は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０週間、または必要に応じてより長い期間、適切な期間、齧歯類に与えることができる。
本記述は、以下の実施例により、さらに例示されるが、決して限定するものとして解釈されるべきではない。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本記述は、以下の実施例により、さらに例示されるが、決して限定するものとして解釈されるべきではない。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【0166】
実施例１．遺伝子改変したマウスの生成。
Ｇｐｒ１５６標的化構築物を以下のように設計した。マウスＧｐｒ１５６のノックアウトのため、マウスＧｐｒ１５６ゲノム配列を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を、ヒトＵＢＣ（ユビキチン）プロモーターの制御下にネオマイシン耐性遺伝子を含有するｌｏｘＰを導入したｌａｃＺレポーターカセットが、開始ＡＴＧコドンの直後のＧｐｒ１５６エクソン２（またはコードエクソン１、すなわち、第一のコードエクソン）をエクソン５の末端（またはコードエクソン４）に置換した。ＬａｃＺコード配列が、開始ＡＴＧコドンとインフレームであるように、カセットをクローニングした。この構築物を、１００％Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした。Ｇｐｒ１５６座位をヒト化するために、ゲノム配列を停止するマウスＡＴＧを、３’非翻訳領域の末端を超えてヒトＧＰＲ１５６ ＡＴＧから１００ｂｐまで置換した。このヒトＧＰＲ１５６ ＤＮＡは、５１６位でＧｌｕ（Ｅ）を有する長いアイソフォーム（８１４個のアミノ酸）をコードする。自己欠失ネオマイシン耐性カセットを、ヒト化の直後に、Ｇｐｒ１５６座位の３’末端に配置した。次いで、この標的化構築物を、ヒトＧＰＲ１５６コードエクソン９に単一のＡからＴ塩基対への置換を加することによってさらに改変して、Ｅ５３３Ｄヒト変異を生成し、ピューロマイシン耐性カセットを、ネオマイシンバージョンに置換した。これらの構築物を、５０％Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ／５０％１２９ＳｖＥｖＴａｃマウス胚性幹細胞株にエレクトロポレーションした。全てのエレクトロポレーションからの首尾よく標的化されたクローンを、ＴＡＱＭＡＮ解析によって同定した。Ｇｐｒ１５６－／＋、Ｇｐｒ１５６ｈｕｍＩｎ／＋、およびＧｐｒ１５６ｈｕｍＩｎ Ｇ５３３Ｄ／＋マウスを、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ２００３ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＰＭＩＤ：１２７３０６６７； Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ２００７ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＰＭＩＤ：１７１８７０５９）を使用して生成し、必要に応じて Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃに戻し交配した。
Ｇｐｒ１５６標的化構築物を以下のように設計した。マウスＧｐｒ１５６のノックアウトのため、マウスＧｐｒ１５６ゲノム配列を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）を、ヒトＵＢＣ（ユビキチン）プロモーターの制御下にネオマイシン耐性遺伝子を含有するｌｏｘＰを導入したｌａｃＺレポーターカセットが、開始ＡＴＧコドンの直後のＧｐｒ１５６エクソン２（またはコードエクソン１、すなわち、第一のコードエクソン）をエクソン５の末端（またはコードエクソン４）に置換した。ＬａｃＺコード配列が、開始ＡＴＧコドンとインフレームであるように、カセットをクローニングした。この構築物を、１００％Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした。Ｇｐｒ１５６座位をヒト化するために、ゲノム配列を停止するマウスＡＴＧを、３’非翻訳領域の末端を超えてヒトＧＰＲ１５６ ＡＴＧから１００ｂｐまで置換した。このヒトＧＰＲ１５６ ＤＮＡは、５１６位でＧｌｕ（Ｅ）を有する長いアイソフォーム（８１４個のアミノ酸）をコードする。自己欠失ネオマイシン耐性カセットを、ヒト化の直後に、Ｇｐｒ１５６座位の３’末端に配置した。次いで、この標的化構築物を、ヒトＧＰＲ１５６コードエクソン９に単一のＡからＴ塩基対への置換を加することによってさらに改変して、Ｅ５３３Ｄヒト変異を生成し、ピューロマイシン耐性カセットを、ネオマイシンバージョンに置換した。これらの構築物を、５０％Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ／５０％１２９ＳｖＥｖＴａｃマウス胚性幹細胞株にエレクトロポレーションした。全てのエレクトロポレーションからの首尾よく標的化されたクローンを、ＴＡＱＭＡＮ解析によって同定した。Ｇｐｒ１５６－／＋、Ｇｐｒ１５６ｈｕｍＩｎ／＋、およびＧｐｒ１５６ｈｕｍＩｎ Ｇ５３３Ｄ／＋マウスを、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ２００３ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＰＭＩＤ：１２７３０６６７； Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ２００７ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＰＭＩＤ：１７１８７０５９）を使用して生成し、必要に応じて Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃに戻し交配した。
【0167】
実施例２．レポーターを介したＧｐｒ１５６の発現の評価
レポーター遺伝子は、内在性マウスＧｐｒ１５６座位で内在性マウスＧｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子に欠失およびレポーター遺伝子の挿入を含む遺伝子改変したマウスを使用して、本発明者らは、成体マウスの脳においてＧｐｒ１５６の発現を確認することができ、眼角球、海馬、手綱、反屈束、および丘において有意な発現を有する。脳のこれらの領域は、うつ病のヒトおよび動物モデルにおけるうつ病および不安と関連している。最強の発現を、手綱で検出し、内側および外側の手綱は、うつ病性障害を有する患者において減少した体積を示す。ヒトにおける機能的画像研究は、負の結果が選択的に活性化する、外側の手綱を強調した（Ｓｈｅｐａｒｄら、Ｓｃｈｉｚ Ｂｕｌｌ．３２：４１７～４２１（２００６）、Ｕｌｌｓｐｅｒｇｅｒおよびｖｏｎ Ｃｒａｍｏｎ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４３０８～４３１４（２００３））。さらに、齧歯類およびヒトにおいて蓄積した証拠は、外側の手綱が、様々な種類のストレス因子への曝露に関連する活性の増加を伴う、大うつ病のいくつかのモデルにおいて超活性であることを実証している（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４７０：５３５～５３９（２０１１）、Ｍｉｒｒｉｏｎｅら、Ｆｒｏｎｔ．Ｈｕｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２９（２０１４）、Ｍｏｒｒｉｓら、ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ １０：１６３～１７２（１９９９）、Ｓｈｕｍａｋｅら、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｓ．９６３：２７４～２８１（２００３）、Ｗｉｒｔｓｈａｆｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｓ．６３３：２１～２６（１９９４））。手綱はまた、うつ病の処置における深部脳刺激の新規標的として十分に試験されている（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：ｅ９～ｅ１１（２０１０））。
レポーター遺伝子は、内在性マウスＧｐｒ１５６座位で内在性マウスＧｐｒ１５６プロモーターに作動可能に結合される、内在性マウスＧｐｒ１５６遺伝子に欠失およびレポーター遺伝子の挿入を含む遺伝子改変したマウスを使用して、本発明者らは、成体マウスの脳においてＧｐｒ１５６の発現を確認することができ、眼角球、海馬、手綱、反屈束、および丘において有意な発現を有する。脳のこれらの領域は、うつ病のヒトおよび動物モデルにおけるうつ病および不安と関連している。最強の発現を、手綱で検出し、内側および外側の手綱は、うつ病性障害を有する患者において減少した体積を示す。ヒトにおける機能的画像研究は、負の結果が選択的に活性化する、外側の手綱を強調した（Ｓｈｅｐａｒｄら、Ｓｃｈｉｚ Ｂｕｌｌ．３２：４１７～４２１（２００６）、Ｕｌｌｓｐｅｒｇｅｒおよびｖｏｎ Ｃｒａｍｏｎ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４３０８～４３１４（２００３））。さらに、齧歯類およびヒトにおいて蓄積した証拠は、外側の手綱が、様々な種類のストレス因子への曝露に関連する活性の増加を伴う、大うつ病のいくつかのモデルにおいて超活性であることを実証している（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ ４７０：５３５～５３９（２０１１）、Ｍｉｒｒｉｏｎｅら、Ｆｒｏｎｔ．Ｈｕｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：２９（２０１４）、Ｍｏｒｒｉｓら、ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ １０：１６３～１７２（１９９９）、Ｓｈｕｍａｋｅら、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｓ．９６３：２７４～２８１（２００３）、Ｗｉｒｔｓｈａｆｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｓ．６３３：２１～２６（１９９４））。手綱はまた、うつ病の処置における深部脳刺激の新規標的として十分に試験されている（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ６７：ｅ９～ｅ１１（２０１０））。
【0168】
実施例３．遺伝子改変された齧歯類の評価に使用する方法
動物
全ての手法は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認を受けたプロトコールに準拠して行われた。全てのマウスを、１２時間の明暗サイクル（午前７時から午後７時）で収容し、水および食餌に自由にアクセスできた。
動物
全ての手法は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認を受けたプロトコールに準拠して行われた。全てのマウスを、１２時間の明暗サイクル（午前７時から午後７時）で収容し、水および食餌に自由にアクセスできた。
【0169】
ガラス玉覆い隠し作業
ガラス玉覆い隠し作業は、強迫的な行動および／または不安のような行動の指標として使用される。マウスを新規のケージ内に置くとき、一般的な応答は、穴掘り行動の増加である。この試験を使用して、抗強迫特性を有する薬物によって低減される、ガラス玉を覆い隠すというマウスの自然かつ反復的挙動に対する薬物の効果を評価する（Ｎｊｕｎｇ’ｅおよびＨａｎｄｌｅｙ、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０４：１０５～１１２（１９９１ｂ）、Ｔｈｏｍａｓら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０４：３６１～３７３（２００９））。
ガラス玉覆い隠し作業は、強迫的な行動および／または不安のような行動の指標として使用される。マウスを新規のケージ内に置くとき、一般的な応答は、穴掘り行動の増加である。この試験を使用して、抗強迫特性を有する薬物によって低減される、ガラス玉を覆い隠すというマウスの自然かつ反復的挙動に対する薬物の効果を評価する（Ｎｊｕｎｇ’ｅおよびＨａｎｄｌｅｙ、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０４：１０５～１１２（１９９１ｂ）、Ｔｈｏｍａｓら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０４：３６１～３７３（２００９））。
【0170】
テクニプラストマウスケージ（３９×１９×１６ｃｍ）を、５ｃｍのトウモロコシの穂軸寝床で均等に充たした。２４個の透明なガラスビー玉（直径１５ｃｍ）を、４×６グリッドパターンで、寝床の上に均等に間隔を置いた。各マウスをケージの中心に配置し、試験を１０分間行った。１０分後、動物をケージから取り出し、少なくとも３分の２隠されたガラス玉の数をカウントした。
【0171】
強制水泳試験
マウスを、４リットルの２３～２５℃の水道水を充填した５リットルの透明なプラスチックビーカー（２５×直径１８ｃｍ）に入れ、マウスが尾部でさえフラスコの底部に触れないようにした。ＡＮＹ－ｍａｚｅ（商標）ビデオトラッキングシステム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）を使用して、４匹の動物を同時に記録した。データを６分間記録した。フラスコを、３つの側面のある白色のプラスチックパーティション（高さ４０ｃｍ×幅２５ｃｍ）で分けた。水泳試験を６分間記録した。記録した時間が、各マウスについて特定できるように、フラスコ内に動きがあった場合、記録が自動的に開始されるように設定した。マウスが試験を行うことができない場合、それが苦痛の兆候を示すとすぐに水から引き上げた。
マウスを、４リットルの２３～２５℃の水道水を充填した５リットルの透明なプラスチックビーカー（２５×直径１８ｃｍ）に入れ、マウスが尾部でさえフラスコの底部に触れないようにした。ＡＮＹ－ｍａｚｅ（商標）ビデオトラッキングシステム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）を使用して、４匹の動物を同時に記録した。データを６分間記録した。フラスコを、３つの側面のある白色のプラスチックパーティション（高さ４０ｃｍ×幅２５ｃｍ）で分けた。水泳試験を６分間記録した。記録した時間が、各マウスについて特定できるように、フラスコ内に動きがあった場合、記録が自動的に開始されるように設定した。マウスが試験を行うことができない場合、それが苦痛の兆候を示すとすぐに水から引き上げた。
【0172】
６分間の記録を、三つの時間セグメント（０～１００秒、１０１～２００秒、および残り１５８秒）に分割し、経時的な挙動のより良いサンプリングを得た。
ＦＳＴについて分析した主なデータ点は、泳ぐ時間、移動時間、移動時間、速度、移動距離、泳ぐゾーンでの飼育、移動エピソード、および移動不能エピソードであった。不動性を、２秒間不動である総体重の６０％として定義する。このパラメータにより、後脚と足の小さな動きが、バランスを保ち、活動的な水泳とはみなされない、水を踏むことが可能になる。
ＦＳＴについて分析した主なデータ点は、泳ぐ時間、移動時間、移動時間、速度、移動距離、泳ぐゾーンでの飼育、移動エピソード、および移動不能エピソードであった。不動性を、２秒間不動である総体重の６０％として定義する。このパラメータにより、後脚と足の小さな動きが、バランスを保ち、活動的な水泳とはみなされない、水を踏むことが可能になる。
【0173】
平均台
平均台（Ｍａｚｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ社）を使用して、協調および感音バランスを評価した。マウスを、一端にオープンプラットフォーム、および終了ポイントとしてオープンサイドの黒色のボックスを備えた、１メートルの長さ、６ｍｍ幅の台を歩くように訓練した。台を布のハンモックの上に持ち上げて、台を滑り落ちるマウスを捕獲した。訓練セッション中、マウスをまず、端のボックスのすぐ隣に配し、その後、マウスが台を歩くことができるまで、そこからさらに漸進的に配置した。その後、３回の連続する１分間の試験を、実行の間に３０秒の休憩と共に実行した。マウスを、オープンプラットフォームの強制終了ポイントの前に配置し、滑った回数および終了ポイントに到達するのにかかった時間についてスコア付けした。
平均台（Ｍａｚｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ社）を使用して、協調および感音バランスを評価した。マウスを、一端にオープンプラットフォーム、および終了ポイントとしてオープンサイドの黒色のボックスを備えた、１メートルの長さ、６ｍｍ幅の台を歩くように訓練した。台を布のハンモックの上に持ち上げて、台を滑り落ちるマウスを捕獲した。訓練セッション中、マウスをまず、端のボックスのすぐ隣に配し、その後、マウスが台を歩くことができるまで、そこからさらに漸進的に配置した。その後、３回の連続する１分間の試験を、実行の間に３０秒の休憩と共に実行した。マウスを、オープンプラットフォームの強制終了ポイントの前に配置し、滑った回数および終了ポイントに到達するのにかかった時間についてスコア付けした。
【0174】
ロータロッド試験
運動協調性と平衡を、ＩＩＴＣライフサイエンスシリーズ８の加速ロータロッドによって評価した。マウスを、ケージ床の上につるした、水平に配向した回転シリンダ上に３分間置いた。シリンダの回転は、動物を損傷させないほど十分に遅く、落下の回避を誘導するほど十分に速かった。所与の動物がこの回転するロッド上に滞在する時間の長さは、それらのバランス、協調性、身体状態、および運動計画の測定値である。動物をまず、漸進的に速い速度で回転する（最大速度１５ｒｐｍ、３回の試行）、ロータロッド（直径３．５ｃｍ、幅９ｃｍ）上に留まるように訓練した。翌日、各マウスを、１回の試験当たり１８０秒間、３回の連続試験（試験間隔３０分間）の間、最大１５ｒｐｍのロータロッド上に置いた。脱落までの潜伏を記録するか、または動物が脱落しなかった場合、最大１８０のスコアを割り当てた。各マウスについて３つの試験の中央値スコアを、解析に使用した。
運動協調性と平衡を、ＩＩＴＣライフサイエンスシリーズ８の加速ロータロッドによって評価した。マウスを、ケージ床の上につるした、水平に配向した回転シリンダ上に３分間置いた。シリンダの回転は、動物を損傷させないほど十分に遅く、落下の回避を誘導するほど十分に速かった。所与の動物がこの回転するロッド上に滞在する時間の長さは、それらのバランス、協調性、身体状態、および運動計画の測定値である。動物をまず、漸進的に速い速度で回転する（最大速度１５ｒｐｍ、３回の試行）、ロータロッド（直径３．５ｃｍ、幅９ｃｍ）上に留まるように訓練した。翌日、各マウスを、１回の試験当たり１８０秒間、３回の連続試験（試験間隔３０分間）の間、最大１５ｒｐｍのロータロッド上に置いた。脱落までの潜伏を記録するか、または動物が脱落しなかった場合、最大１８０のスコアを割り当てた。各マウスについて３つの試験の中央値スコアを、解析に使用した。
【0175】
キャットウォーク
足取りと歩行の変化を評価するために、最大３５の歩行パラメータ（フットプリントサイズから運動動態まで）の定量的評価を可能にする、ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ）ビデオベースの自動自由歩き歩行解析システムを使用して、マウスを評価した。このシステムにより、動物は、ヒトにおける臨床歩行試験と同様の様式で、好ましい速度で自発的に移動することが可能となる。ランウェイの開始地点に動物を置き、それらの正面に開口端を置いた。マウスはランウェイの端まで自発的に走り、逃げようとする。３回キャットウォーク走行を成功するまで、各マウスを評価し、マウスは、カウントするべき走行のため、５秒以内に通路の記録領域を移動しなければならない。装置は、直線への移動を制限する調整可能な路地のある１３０ｃｍ長の硬化ガラスプラットフォーム、赤い頭上光、ガラスプラットフォームに取り付けた緑色のＬＥＤ光、およびプラットフォームの下に取り付けられた高速カラーカメラからなっていた。装置に取り付けた緑色のＬＥＤ光は、ガラス板に光を放射し、この光は、齧歯類の肢がガラスに接触する場所でのみ屈折し、これにより、高速デジタルカメラが、リアルタイムで正確な齧歯類の肢の配置を捕捉することが可能になった。頭上の赤色の光は、体の輪郭を記録するためにコントラストを生み出していた。画像データをデジタル化し、備え付けのコンピュータに転送し、ここで、ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴソフトウェアを、足跡間の距離、時間、および強度の差異による静的および動的歩行運動の半自動標識および解析に使用することができた。その後、足取りデータを、データ記録およびその後の解析のために転送した。
足取りと歩行の変化を評価するために、最大３５の歩行パラメータ（フットプリントサイズから運動動態まで）の定量的評価を可能にする、ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ）ビデオベースの自動自由歩き歩行解析システムを使用して、マウスを評価した。このシステムにより、動物は、ヒトにおける臨床歩行試験と同様の様式で、好ましい速度で自発的に移動することが可能となる。ランウェイの開始地点に動物を置き、それらの正面に開口端を置いた。マウスはランウェイの端まで自発的に走り、逃げようとする。３回キャットウォーク走行を成功するまで、各マウスを評価し、マウスは、カウントするべき走行のため、５秒以内に通路の記録領域を移動しなければならない。装置は、直線への移動を制限する調整可能な路地のある１３０ｃｍ長の硬化ガラスプラットフォーム、赤い頭上光、ガラスプラットフォームに取り付けた緑色のＬＥＤ光、およびプラットフォームの下に取り付けられた高速カラーカメラからなっていた。装置に取り付けた緑色のＬＥＤ光は、ガラス板に光を放射し、この光は、齧歯類の肢がガラスに接触する場所でのみ屈折し、これにより、高速デジタルカメラが、リアルタイムで正確な齧歯類の肢の配置を捕捉することが可能になった。頭上の赤色の光は、体の輪郭を記録するためにコントラストを生み出していた。画像データをデジタル化し、備え付けのコンピュータに転送し、ここで、ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴソフトウェアを、足跡間の距離、時間、および強度の差異による静的および動的歩行運動の半自動標識および解析に使用することができた。その後、足取りデータを、データ記録およびその後の解析のために転送した。
【0176】
カメラが記録し、システムのソフトウェアが足取りを測定した。足取りを、肢の配置の異常について解析した。
開放フィールド
開放フィールドは、動物の活性を測定する、空の比較的大きく、明るく照らされた長方形の道場である。評価は、新規の環境探検、一般的な運動活動を反映しており、齧歯類における不安に関連する挙動についての初期スクリーニングを提供することができる。マウスを、開放フィールド装置（Ｋｉｎｄｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６”Ｗ×１６”Ｌ×１５”Ｈのチャンバー）に入れ、６０分間スコア付けした。チャンバーを、二つのゾーンとして設定し、中心ゾーングリッド（６”×６”）および外側のゾーングリッド（１６”×１６”）、ならびに動物の移動を、３２個の赤外線光ビームによって収集する。中心ゾーンへの探索行動の減少は、不安表現型と関連していた。マウスがグリッド線を横断する（すなわち、一方のグリッドから別のグリッドに移動する）回数、ならびに飼育回数、不動に費やされた時間、およびグルーミング現象の回数をカウントした。Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ装置において、これらの事象は、コンピュータソフトウェアおよび開放フィールド周辺の赤外線ビームを介して自動的にカウントした。
開放フィールド
開放フィールドは、動物の活性を測定する、空の比較的大きく、明るく照らされた長方形の道場である。評価は、新規の環境探検、一般的な運動活動を反映しており、齧歯類における不安に関連する挙動についての初期スクリーニングを提供することができる。マウスを、開放フィールド装置（Ｋｉｎｄｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６”Ｗ×１６”Ｌ×１５”Ｈのチャンバー）に入れ、６０分間スコア付けした。チャンバーを、二つのゾーンとして設定し、中心ゾーングリッド（６”×６”）および外側のゾーングリッド（１６”×１６”）、ならびに動物の移動を、３２個の赤外線光ビームによって収集する。中心ゾーンへの探索行動の減少は、不安表現型と関連していた。マウスがグリッド線を横断する（すなわち、一方のグリッドから別のグリッドに移動する）回数、ならびに飼育回数、不動に費やされた時間、およびグルーミング現象の回数をカウントした。Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ装置において、これらの事象は、コンピュータソフトウェアおよび開放フィールド周辺の赤外線ビームを介して自動的にカウントした。
【0177】
尾の巻き付け
尾の巻き付けは、可能性のある前庭機能障害をスクリーニングするために使用できる単純な方法である。マウスを平らな表面に置き、マウスが、その背に向くように、マウスの尾の中ほどを掴むことで、尾を巻き付けた。動物が、自身で足に戻るのが困難であった場合、これは、前庭欠損を示し得る。
尾の巻き付けは、可能性のある前庭機能障害をスクリーニングするために使用できる単純な方法である。マウスを平らな表面に置き、マウスが、その背に向くように、マウスの尾の中ほどを掴むことで、尾を巻き付けた。動物が、自身で足に戻るのが困難であった場合、これは、前庭欠損を示し得る。
【0178】
正向反射
正向反射は、運動協調および前庭機能障害を評価するための単純なアッセイである。マウスを、平らな表面上に背中を下にして置いた。それ自体を正すのにかかった時間（最大３０秒まで）を測定した。
正向反射は、運動協調および前庭機能障害を評価するための単純なアッセイである。マウスを、平らな表面上に背中を下にして置いた。それ自体を正すのにかかった時間（最大３０秒まで）を測定した。
【0179】
ワイヤぶら下がり試験
ワイヤぶら下がりは、後肢または前肢のいずれかの握力を測定するための代替的な試験である。足を滑らせたり、またはぶら下がることができないことは、不足を示し得る。青色のパッドと共に、テーブルトップから少なくとも１２インチ離して吊り下げられたワイヤケージトップを使用した。マウスは、その後肢または前肢のいずれかでワイヤケージトップを掴み、マウスが棒を握った総時間を、６０秒の間隔で測定した。マウス１匹当たり３回、６０秒の間隔を測定した。転倒までの潜伏を、記録した。
ワイヤぶら下がりは、後肢または前肢のいずれかの握力を測定するための代替的な試験である。足を滑らせたり、またはぶら下がることができないことは、不足を示し得る。青色のパッドと共に、テーブルトップから少なくとも１２インチ離して吊り下げられたワイヤケージトップを使用した。マウスは、その後肢または前肢のいずれかでワイヤケージトップを掴み、マウスが棒を握った総時間を、６０秒の間隔で測定した。マウス１匹当たり３回、６０秒の間隔を測定した。転倒までの潜伏を、記録した。
【0180】
実施例３．様々な行動アッセイにおけるマウスの評価
強制水泳試験
マウスを、６分間の強制水泳試験で評価したが、全てのマウスが、作業を行うことができたわけではなかった。図２は、試験した異なるＧＰＲ１５６／Ｇｐｒ１５６遺伝子型についての水泳試験の持続時間を示す。データを、各動物群について平均±ＳＥＭとして表した。
強制水泳試験
マウスを、６分間の強制水泳試験で評価したが、全てのマウスが、作業を行うことができたわけではなかった。図２は、試験した異なるＧＰＲ１５６／Ｇｐｒ１５６遺伝子型についての水泳試験の持続時間を示す。データを、各動物群について平均±ＳＥＭとして表した。
【0181】
データは、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスおよびマウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性である遺伝子改変されたマウスは、強制水泳試験を行うことができないことを示した。マウスは、当初は泳ぐことができたが、脱出口を見つけようとした２～３分後には、マウスが水中で「パニックである」かのように見えた。次に、これらのマウスは、熱水泳、反復ダイビング、および水中でのスピニングを特徴とする異常な挙動を示し始め、浮上したままでいられなくなった。すぐに水から回収されない場合、これらのマウスはおぼれた。対照的に、野生型マウス（内在性マウスＧｐｒ１５６を発現する）およびヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウス（突然変異なし）は、６分間の水泳試験を完了するのに困難はなかった。
【0182】
Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスまたはマウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の遺伝子改変されたマウスによって示される特有の挙動は、文献において他者によって説明されていない。これらのマウスが試験を完了できないという事実から、発明者らは、学習性無力性を測定することができなかった。しかしながら、本発明者らは、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性であるメスの８５％およびオスの９０％の遺伝子改変したマウスが、水泳セッションの訓練に失敗し、一方、野生型ヒトＧＰＲ１５６タンパク質をコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性である遺伝子改変された齧歯類は、試験を容易に完了したことを観察した。同様に、マウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性のメスの９０％およびオスの５３％の遺伝子改変されたマウスは、訓練水泳セッションに失敗し、一方、その野生型同腹仔は、試験を完了した。室温（約２３℃）の代わりに３０℃で加熱した水で、またはより大きく、プラットフォーム（脱出オプション）と共に呈する水迷路装置を使用したとき、同様の結果を得た。強制水泳試験の知見は、Ｅ５３３Ｄ点変異が、ＧＰＲ１５６タンパク質の機能における不足または喪失を導くことを示唆する。
【0183】
マウスをまた、それらの協調、平衡および運動機能、それらの一般的な運動活性、ならびにロータロッド、キャットウォーク、平均台、開放フィールド、正向反射、尾ぶら下がり運動およびワイヤぶら下がり試験について評価した。Ｅ５３３Ｄバリエーションまたは野生型ヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子をコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変したマウスは、以下の表２に要約するように、平衡、および協調もしくは運動障害、および／または前庭機能障害においていかなる肉眼的欠損も呈さなかった。
【0184】
水泳試験を行うことができないことが、不安の特徴であり得るかどうかを調べるために、マウスを、４週間毎日、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ、１０ｍｇ／ｋｇ）であるフルオキセチンの腹腔内注射で処置した。マウスを、フルオキセチン１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で４週間、毎日処置する前および後に、毎週６分間の強制水泳試験について試験した。フルオキセチンでの毎日の処置の前および後の水泳試験の総時間（秒）を記録した。図３Ａにおいて示す通り、最初の強制水泳試験（ベースライン、処置前）において、試験したＥ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性のマウスのいずれも、６分間の水泳試験を行うことができなかった。フルオキセチンでの４週間の処置後、６２．５％のオス（マウス８匹中５匹）および５０％のメス（１０匹中５匹）が、６分間の水泳試験を首尾よく行うことができた。未処置のメスのＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄの群も、対照として並行して実行し、４週間後に、メスの２０％（５匹中１匹）のみが、水泳試験を達成した。データを、各動物群についての平均±ＳＥＭとして表した。
【0185】
フルオキセチンが、障害された水泳試験表現型を逆転させることができるかどうかを試験するために、ＧＰＲ１５６ｈｕｍ／ｈｕｍおよびＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスを、フルオキセチン１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）で毎日、６日間／週、９週間処置した。ＧＰＲ１５６－／－マウスと同様に、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスは、水泳試験において障害を示し、約８５％のメスおよび９０％のオスが、６分間の水泳試験を完了できなかった。したがって、マウスを、水泳試験（ベースライン）に供し、６分間の水泳試験を行うことができる動物を、研究から除外した。次いで、残りのマウスを２群、フルオキセチンで処置および未処理に分けた。図３Ｂにおいて示す通り、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄマウスのいずれも（０／１３）、１回目に水泳試験を行うことができず、９週間のフルオキセチンでの処置後、マウスの６１％（８／１３）が、試験を達成した。対照的に、未処置の群において、一部のマウスはそれらの能力を改善する一方、１／１１マウスのみが、９週目に水泳試験を達成した（図３Ｃを参照、図３Ｂも参照）。
【0186】
別の抗うつ薬であるイミプラミン（トフラニル）での処置は、ＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄにおける損なわれた水泳表現型も改善する。イミプラミンは、ノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミンおよびセロトニンの再取り込みを阻害する三環系抗うつ薬である。この研究のため、マウスを、水泳試験（ベースライン）に供し、６分間の水泳試験を行うことができる動物を研究から除外した。マウスを、イミプラミン１５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ）で毎日、６日／週、９週間処置した。図３Ｄにおいて示す通り、イミプラミンを用いた処置はまた、水泳試験を完了するＧＰＲ１５６Ｅ５３３Ｄ／Ｅ５３３Ｄマウスの能力の改善を誘導した。
【0187】
マウスを、ガラス玉覆い隠し試験でさらに評価した。図４において示す通り、Ｅ５３３Ｄバリエーションをコードするヒト化Ｇｐｒ１５６遺伝子についてホモ接合性の遺伝子改変したオスのマウス、またはマウスＧｐｒ１５６遺伝子の欠失についてホモ接合性の遺伝子改変したオスのマウスは、１０分間で覆い隠したガラス玉の数の増加傾向を示した。データを、各動物群について平均±ＳＥＭとして表した。
【0188】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【配列表】