特許 7509800 被検体とリガンドとの間の反応の速度論的パラメータを決定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-24

(45)【発行日】2024-07-02

(54)【発明の名称】被検体とリガンドとの間の反応の速度論的パラメータを決定するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/557 20060101AFI20240625BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20240625BHJP

【ＦＩ】

G01N33/557

G01N21/41 101

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021560907

(86)(22)【出願日】2020-05-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-15

(86)【国際出願番号】 IB2020054472

(87)【国際公開番号】W WO2020234691

(87)【国際公開日】2020-11-26

【審査請求日】2022-09-12

(31)【優先権主張番号】00648/19

(32)【優先日】2019-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CH

(73)【特許権者】

【識別番号】514323235

【氏名又は名称】クレオプティクス・アーゲー

【氏名又は名称原語表記】ＣＲＥＯＰＴＩＸ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(72)【発明者】

【氏名】コティエ・カスパー

【審査官】倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５０４８０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１８７３２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０－５３７１９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５２７３６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２８４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２２１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】James INGLESE et al.，Quantitative high-throughput screening: A titration-based approach that efficiently identifies biological activities in large chemical libraries，PNAS，2006年08月01日，Vol.103, No.31，pp.11473-11478

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／００－３３／９８，

Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／０１，２１／１７－２１／６１，

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検体とリガンドとの間の反応の速度論的パラメータを決定するための方法であって、 （ａ）被検体の濃度（ｃ_ｏ）を有するサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）の間、前記のサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）中の被検体が試験表面（３）上の第１のリガンド（４）に結合できるように、流すステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の間に試験表面上の第１のリガンド（４）に結合した、サンプル流体の第１の体積（Ｖ１）からの被検体が、それらのリガンド（４）から解離するように、バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、第１のバッファーの持続時間（ｔ_１ｂ）の間、流すステップと、
（ｃ）少なくともサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）を、前記のサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）中の被検体が、試験表面（３）上の第１のリガンド（４）に結合できるように、前記試験表面上に、第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）の間、流すステップであって、第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）は第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）よりも長く、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）は、サンプル流体の第１の体積（Ｖ１）中の被検体の濃度（ｃ_ｏ）と同じ被検体の濃度（ｃ_ｏ）を有するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の間に試験表面上の第１のリガンド（４）に結合した、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）からの被検体が、それらの第１のリガンド（４）から解離するように、バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）の間、流すステップと、
（ｅ）センサーを使用してステップ（ａ）～（ｄ）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一測定結合曲線を得るステップと、
（ｆ）被検体の濃度（ｃ_ｏ）を有するサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）の間、流すステップと、
（ｇ）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第１のバッファーの持続時間（ｔ_１ｂ）の間、流すステップと、
（ｈ）少なくともサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）の間、流すステップであって、第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）は第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）よりも長く、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）は、サンプル流体の第１の体積（Ｖ１）中の被検体の濃度（ｃ_ｏ）と同じ被検体の濃度（ｃ_ｏ）を有するステップと、
（ｉ）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）の間、流すステップと、
（ｊ）センサーを使用してステップ（ｆ）～（ｉ）の間の第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上での結合を測定して、単一参照結合曲線を得るステップと、
（ｋ）前記単一測定結合曲線と前記単一参照結合曲線を使用して速度論的パラメータを決定するステップと、
を含む方法。

【請求項2】

前記方法が、第１のリガンド（４）が付着している第１の試験表面（３）を含む第１のフローセル（２）、および第１のリガンドを有さない第２の試験表面（３’）を含む第２のフローセル（２’）を使用して実行され、ならびに
ステップ（ａ）と（ｆ）が同時に実行され、ステップ（ｂ）と（ｇ）が同時に実行され、ステップ（ｃ）と（ｈ）が同時に実行され、ステップ（ｄ）と（ｉ）が同時に実行され、およびステップ（ｅ）と（ｊ）が同時に実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法が、試験表面を含む単一のフローセルを使用して実行され、単一のフローセルの前記試験表面は、最初は第１のリガンドを有さない状態にあり、および前記試験表面が第１のリガンドを有さない状態にある間に、前記ステップ（ｆ）～（ｊ）が、前記単一のフローセルを使用して実行され、
前記方法がさらに、ステップ（ｆ）～（ｊ）を実行した後、次いで、前記の単一のフローセルの試験表面上に第１のリガンド（４）を提供するステップと、
第１のリガンドが前記の単一のフローセルの試験表面上に提供された後、次いで、前記単一のフローセルを使用してステップ（ａ）～（ｅ）を実行するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

さらに以下のステップ：
（ａ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ_１Ｂ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）と等しい期間（ｔ_１Ｂ）の間、流すステップと、
（ｂ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ_１ｂ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｃ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ_２Ｂ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｃ）の第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）に等しい第２の期間（ｔ_２Ｂ）の間、流すステップと、
（ｄ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｅ’）センサーを使用してステップ（ａ’）～（ｄ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク測定結合曲線を得るステップと、
（ｆ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ_１Ｂ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）と等しい期間（ｔ_１Ｂ）の間、流すステップと、
（ｇ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｇ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ_１ｂ ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｈ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ_２Ｂ）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）と等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ）の間、流すステップと、
（ｉ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｊ’）センサーを使用してステップ（ｆ’）～（ｉ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク参照結合曲線を得るステップと、
を含む、請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。

【請求項5】

（ａ’’）屈折率標準流体の第１の体積（Ｖ_１ｓ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）と等しい期間（ｔ_１ｓ）の間、流すステップと、
（ｂ’’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ_１ｂ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｃ’’）少なくとも屈折率標準流体の第２の体積（Ｖ_２ｓ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｃ）における第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）に等しい第２の期間（ｔ_２ｓ）の間、流すステップと、
（ｄ’’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｅ’’）センサーを使用してステップ（ａ’’）～（ｄ’’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一溶媒測定結合曲線を得るステップと、
（ｆ’’）屈折率標準流体の第１の体積（Ｖ_１ｓ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）と等しい期間（ｔ_１ｓ）の間、流すステップと、
（ｇ’’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の被検体の持続時間（ｔ_１ａ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｈ’’）少なくとも屈折率標準流体の第２の体積（Ｖ_２ｓ）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の被検体の持続時間（ｔ_２ａ）と等しい第２の期間（ｔ_１ｓ）の間、流すステップと、
（ｉ’’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ_２ｂ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｊ’’）センサーを使用してステップ（ｆ’’）～（ｉ’’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一溶媒参照結合曲線を得るステップと、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

さらに以下のステップ：
（ａ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の被検体の持続時間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｂ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ _１ｂ ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｃ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ _２Ｂ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｃ）の第２の被検体の持続時間（ｔ _２ａ ）に等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｄ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ _２ｂ ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｅ’）センサーを使用してステップ（ａ’）～（ｄ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク測定結合曲線を得るステップと、
（ｆ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の被検体の持続時間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｇ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｇ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ _１ｂ ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｈ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ _２Ｂ ）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の被検体の持続時間（ｔ _２ａ ）と等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｉ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ _２ｂ ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｊ’）センサーを使用してステップ（ｆ’）～（ｉ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク参照結合曲線を得るステップと、
を含み、
前記方法が、第１のリガンド（４）が付着している第１の試験表面（３）を含む第１のフローセル（２）、および第１のリガンドを有さない第２の試験表面（３’）を含む第２のフローセル（２’）を使用して実行され、ならびに
ステップ（ａ’）と（ｆ’）が同時に実行され、ステップ（ｂ’）と（ｇ’）が同時に実行され、ステップ（ｃ’）と（ｈ’）が同時に実行され、ステップ（ｄ’）と（ｉ’）が同時に実行され、およびステップ（ｅ’）と（ｊ’）が同時に実行される、
請求項１に記載の方法。

【請求項7】

さらに以下のステップ：
（ａ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の被検体の持続時間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｂ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ _１ｂ ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｃ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ _２Ｂ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｃ）の第２の被検体の持続時間（ｔ _２ａ ）に等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｄ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ _２ｂ ）に等しい期間の間、流すステップと、
（ｅ’）センサーを使用してステップ（ａ’）～（ｄ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク測定結合曲線を得るステップと、
（ｆ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の被検体の持続時間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｇ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｇ）の第１のバッファーの持続時間（ｔ _１ｂ ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｈ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ _２Ｂ ）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の被検体の持続時間（ｔ _２ａ ）と等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ ）の間、流すステップと、
（ｉ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２のバッファーの持続時間（ｔ _２ｂ ）と等しい期間の間、流すステップと、
（ｊ’）センサーを使用してステップ（ｆ’）～（ｉ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク参照結合曲線を得るステップと、
を含み、
前記方法が、試験表面を含む単一のフローセルを使用して実行され、単一のフローセルの前記試験表面は、最初は第１のリガンドを有さない状態にあり、および試験表面が第１のリガンドを有さない状態にある間に、前記ステップ（ｆ’）～（ｊ’）が、前記単一のフローセルを使用して実行され、
前記方法がさらに、ステップ（ｆ’）～（ｊ’）を実行した後、次いで、単一のフローセルの試験表面上に第１のリガンド（４）を提供するステップと、
第１のリガンドが単一のフローセルの試験表面上に提供された後、次いで、前記単一のフローセルを使用してステップ（ａ’）～（ｅ’）を実行するステップとを含む、
請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、事前定義された分子（つまり被検体）と標的（つまりリガンド）との間の反応の速度論的パラメータを決定するための方法、特に、前記リガンドが付着しているフローセルの試験表面に、それぞれが被検体の同じ濃度を含む複数のサンプル流体体積を順次接触させること、および前記試験表面上の結合を測定するセンサーの出力を評価して前記速度論的パラメータを決定することを含む方法に関する。

【背景技術】

【0002】

薬の探索および開発、環境試験、ならびに診断などの多くの用途において、多数の液体サンプルを短時間で分析することへのニーズがある。そのような分析は、光学的または音響的なラベルフリーセンサーまたはバイオセンサー、質量分析計、クロマトグラフィーシステム、および分光光度検出器を含むがこれらに限定されないシステムを使用して実行される。

【0003】

ラベルフリーの捕捉方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または導波路に基づく光学的方法、または表面弾性波（ＳＡＷ）に基づく方法、熱的方法、または電気化学的方法を含むが、これらに限定はされない。光学的方法は、生化学的分子（つまり被検体）が水溶液とは異なる屈折率を示すという原理に基づく。センサー表面近くの屈折率の変化は、分子（つまり被検体）とセンサー表面自体または表面に付着している別の分子との相互作用による、表面への分子（つまり被検体）の付加または除去に起因する。次いで、共鳴要素（ＳＰＲの場合は表面プラズモンをサポートする金属層、または導波路センサーの場合は光導波路モードをサポートする光導波路）を使用して、局所的な屈折率の変化を適切な照明および検出スキームを使用して調べることができ、分子反応イベントを測定するために変化がリアルタイムで記録される。この文脈では、これらの変化がシグナルに対応する。表面弾性波と電気化学的方法は、屈折率の違いが物理的に測定されるのではなく、質量または誘電率の違いが測定されることを除いて、同様の方法で動作する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

この文脈において、多くのラベルフリー測定またはラベルフリー感知技術またはラベルフリーアッセイは、１つまたは複数の「リガンド」（抗体または薬物標的などの反応物）のセンシング表面（つまり、記録されるシグナルを構成する経時的な測定値を出力する、検出スキームによって読み取られるように適合されたセンサーチップ上の増感表面）上の固体支持体への付着（固定化）を伴う。センシング表面を含む流体管は、一般にフローセルまたは流体チャンバーと呼ばれ、調べられる他の反応物（複数可）（「被検体」）を含む流体がリガンドと接触するようにされることを可能にする。それにより、被検体は、センシング表面上の固体支持体で固定化されたリガンドと反応する機会を持ち、最終的な生成物濃度が測定され、特徴付けられる。典型的な分子相互作用測定手順は、最初に表面結合リガンドを中性バッファー溶液（「バッファー」）と最初に接触させて、反応なしのベースシグナル（「ベースライン」）を確立し、続いて、表面に結合したリガンドを実際の被検体またはサンプル（抗原または薬物候補など）を含む流体と接触させて、表面に結合したリガンドが被検体またはサンプルと反応し、反応が起こる会合相を監視することができるようにし、任意選択的に、表面に結合したリガンドを中性バッファー溶液と再度接触させて、フローセルから被検体を除去することにより、被検体またはサンプルの解離相を監視することから成る。言い換えれば、被検体の濃度は、会合相を特徴付けるために段階的に増やされ、解離相を特徴付けるために段階的に再び減らされる。会合および解離相中に記録されるセンサーシグナルは典型的には、結合曲線と呼ばれる。典型的には、前述のステップは、相互作用モデルにフィッティング可能な一連の結合曲線を生成するために、いくつかの濃度の被検体に対して繰り返される。典型的には、実験の全期間中、測定値が記録されて、反応ネットワークシグナルが得られ、これを本発明によりさらに分析して、速度論的パラメータが取得され得る。

【課題を解決するための手段】

【0005】

サンプルリザーバからフローセルに被検体を送達するための流体アセンブリは、当技術分野で周知であり、典型的には、ポンプ、バルブおよび導管を含むサンプル送達ユニットに流体的に接続されたサンプル貯蔵およびハンドリングユニット（「オートサンプラー」）を含む。さらにそれは、それらが所望の測定方法を実行するために適切なタイミングで操作されるように、前記オートサンプラーを制御するシーケンスコントローラーユニットと、サンプル送達ユニットのポンプおよびバルブを含む。サンプルリザーバは、バイアル、または複数のリザーバ用の業界標準容器（「マイクロタイタープレート」）内のいわゆる「ウェル」の形をとることができ、これは典型的には９６、３８４、または１５３６個のウェルを含む。測定の前に、マイクロタイタープレートは、ユーザーまたは流体ハンドリングロボットによって適切に被検体で満たされ、次いでオートサンプラーに配置される。測定中、１つまたは複数の被検体がオートサンプラーによってマイクロタイタープレートから吸引され、次いで（１つまたは複数の）フローセル内の対応する（１つまたは複数の）センシング表面が（１つまたは複数の）被検体と接触するように、サンプル送達ユニットによって適切な１つまたは複数のフローセルに送達または注入される。サンプル送達ユニットはまた、（１つまたは複数の）フローセル内の対応する（１つまたは複数の）センシング表面がバッファーと接触して、被検体がリガンドから解離することを可能にするように、バッファーを注入することによって適切な１つまたは複数のフローセルをリンスするようにも適合される。本発明の方法実施形態による例示的な方法を実行するように適合された流体アセンブリの例示的な型は、ＷＯ２０１７１８７３２５に記載されている。

【0006】

物質の存在による屈折率の変化に依存するラベルフリーの捕捉方法は、バッファーとサンプルを含む流体との間の屈折率のわずかな違いなど、バルク屈折率の不一致に対してしばしば感受性である。そのような不一致は、シグナルにオフセットを引き起こし得る。そのようなシグナルから速度論的パラメータを正確に計算するためには、シグナルオフセットを速度論的パラメータと一緒に計算する必要がある。

【0007】

光導波路ベースのバイオセンサーの例示的なタイプは、Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＡＧ（ヴェーデンスヴィル、スイス）によって、商品名ＷＡＶＥ（登録商標）（以下、「ＷＡＶＥ機器」と呼ぶ）の下で販売されている。これらのバイオセンサーは、導波管干渉法ベースの質量検出技術を利用して、表面に結合したリガンドと関心のある被検体との間の「リアルタイム」センサーシグナルを提供する。ＷＡＶＥ機器は、密度測定値（ｐｇ／ｍｍ２）の時間的なシーケンスを出力シグナルとして生成し、密度測定値はセンサー表面の生成物の濃度に比例する。

【0008】

最近、特に創薬において薬物と薬物標的との間の相互作用を研究している製薬会社において、分子相互作用のハイスループットスクリーニングが、ますます関心を集めている。（ハイスループット）スクリーニング中に、典型的には、多数の被検体（この場合は薬物候補）が、個々のウェル内で１００マイクロモルまたは１００ナノモルなどの単一濃度で調製され、リガンド（この場合は薬物標的）を含むフローセルに連続的に注入される。典型的には、このようなスクリーニング環境では、注入中の所与の時間におけるセンサーシグナル値に対応する結合レベルのみが、単一の注入から評価される。未知のパラメータ間の強い相関関係のために、信頼できる速度論的パラメータを単一注入の測定から抽出することはできず、したがって、その単一注入のセンサーシグナルを相互作用モデルにフィッティングしようとする試みは、あいまいな問題をもたらす。言い換えれば、速度論的パラメータが異なる２つの被検体の単回注入の測定は、同様な結合曲線を生成し得る。対応する結合レベルが最小値と最大値の間などの特定の範囲内にあり、結合の形状が標的または表面との非特異的相互作用の兆候を示さない場合、候補被検体はヒット（ｈｉｔ）としてマークされる。この方法の主な欠点は、リガンドに結合する被検体が、バルク屈折率の不一致などのアーティファクトから十分に区別できないこと、また、速度論的パラメータに関する定量的情報を決定できないことである。次いで、典型的には、複数のウェルから複数の濃度を注入する方法を使用して、ヒットを連続的な測定における速度論的パラメータについて特徴付ける必要がある。複数のウェルから複数の濃度を注入する方法を使用することは、被検体のスクリーニングおよび調製の時間が増加し、オートサンプラーの貯蔵スペースが十分に利用されないため、一次スクリーニングには適合しないことが理解される。

【0009】

単一のウェルからの注入を使用して分子相互作用の速度論的および親和性パラメータを決定するための方法は、ＷＯ２００９０２５６８０に記載されており、現在、モレキュラーデバイス（ダナハー）によるＯｎｅＳｔｅｐ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎとして販売されている。その応用については、Ａ． Ｍ． Ｇｉａｎｎｅｔｔｉら、Ｆｒａｇｍｅｎｔ－Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｓ． Ｈｏｗａｒｄ、Ｃ． Ａｂｅｌｌ編（Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２０１５年）の第２章に詳しく説明されている。この方法は、サンプルあたりの分析時間が少なくとも３０秒であるという制限を受ける。さらに、親和性の指標はしばしば決定することができるが、速度論的パラメータは確実に決定することができない。さらに、勾配プロファイルは、流路の形状と流速のみによって決定されるため、勾配プロファイルを特定の関心のある速度論的範囲に適応させることは困難である。

【0010】

被検体の連続注入を使用して分子相互作用の速度論的および親和性パラメータを決定するための方法は、ＷＯ２００４１０９２８４に記載されている。この方法は、異なる濃度の被検体を提供することに依存しており、そのことが当該方法をスクリーニング用途には適さなくしている。

【0011】

分子相互作用の最も単純なモデルは、可逆反応を伴うラングミュアまたは１：１モデルである

【0012】

【数1】

【0013】

ここで、被検体Ａおよび固定化されたリガンドＢは生成物ＡＢと平衡に達する。反応物ＡおよびＢは会合して生成物ＡＢを形成し、同時に、反応物ＡＢは解離して生成物ＡおよびＢを形成する。したがって、Ａ、ＢおよびＡＢは同時に反応物であり、生成物である。

【0014】

数学的には、反応ネットワークは微分方程式によって記述される

【0015】

【数2】

【0016】

ここで、［Ａ］、［Ｂ］および［ＡＢ］は、Ａ、ＢおよびＡＢの濃度である。［Ａ］と［Ｂ］が会合して生成物［ＡＢ］を形成する速度は、速度論的パラメータｋ_ａによって決定され、［ＡＢ］が解離して生成物［Ａ］と［Ｂ］を形成する速度は、速度論的パラメータｋ_ｄによって決定される。［ＡＢ］に比例する観測可能なセンサーシグナルＲ、および濃度［Ｂ］＋［ＡＢ］の合計に比例する最大センサーシグナルＲｍａｘ、および濃度ｃ＝［Ａ］で反応を表す場合、反応は以下の微分方程式で表され得る。

【0017】

【数3】

【0018】

よって、単純な分子相互作用モデルにおける関心のある速度論的パラメータは、いわゆるオンレート（ｏｎ－ｒａｔｅ）または会合速度定数ｋ_ａと、いわゆるオフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）または解離速度定数ｋ_ｄである。スクリーニング用途では、速度論的空間内の関心領域は典型的には、研究者によって選択される。早期の創薬の例では、研究者は、有効な薬物候補は１０^５Ｍ^－１ｓ^－１～１０^９Ｍ^－１ｓ^－１のｋ_ａと、０．１ｓ^－１～１０００ｓ^－１のｋ_ｄを示すべきであると選択し得る。対照的に、抗体スクリーニングの例では、研究者は、有効な候補が１０^４Ｍ^－１ｓ^－１～１０^７Ｍ^－１ｓ^－１のｋ_ａと、１０^－２ｓ^－１～１０^－６ｓ^－１のｋ_ｄを示し得ると選択し得る。典型的には、測定可能な速度論的空間は、測定可能な範囲などの機器パラメータだけでなく、接触時間や濃度などの選択された測定パラメータにも依存する。したがって、研究者は、流速や被検体の接触および解離時間などの測定パラメータを選択することによって、または選択した用途で機能することがわかっている適切な測定プロトコルを受動的に選択することによって、この関心領域を能動的に選択し得る。

【0019】

スクリーニング用途のための、よりハイスループットなシステムの例は、その操作方法がＷＯ２０１７０５０９４０に記載されているＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）８ｋ機器、またはそのフローセル構成がＵＳ７８５８３７２Ｂ２に記載されているＳｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ ＭＡＳＳ－２機器を含む。言及されたいずれの機器も、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の効果に基づいている。しかしながら、これらの機器は、サンプルやバッファーの使用量が多いなど、いくつかの制限を受ける。

【0020】

本発明の目的は、上記の短所の少なくともいくつかを軽減することである。本発明のいくつかの実施形態の方法は、フローセルを通して被検体の複数の異なる濃度を流す必要性を排除し、これは測定時間の短縮を有利に導くことができる。

【0021】

本発明によれば、これらの目的は、独立請求項に記載された特徴を有するアセンブリおよび／または方法によって達成される；ここで、従属請求項は、好ましい実施形態の任意の特徴を記載している。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、本発明による方法を実行するのに適したマイクロ流体アセンブリの概略図を提供している。

【図2】図２は、本発明による方法を実行する際に、図１のアセンブリのセンサーによって出力される単一測定結合曲線と単一参照結合曲線の例を示している。

【図3】図３は、本発明による方法を使用して得られた調整された結合曲線（実線）に最もよく近似する、速度論的パラメータＲｍａｘ、ｋａ、ｋｄについてシミュレートされた結合曲線（破線）を示している。

【図4】図４は、本発明による方法を使用して得られた調整された結合曲線（実線）および対応する最もよく近似するシミュレートされた結合曲線（破線）の例を示している。

【発明を実施するための形態】

【0023】

例の目的でのみ与えられ、図によって示される以下の実施形態の説明の助けを借りて、本発明はよりよく理解されるであろう。

【0024】

以下の詳細な説明および例において、本発明は導波路干渉法、より具体的にはＣｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥシステムの文脈で示されているが、本発明は、この検出方法に限定されるものではないことが理解されるべきである。むしろ、センシング表面上の固定化リガンドに被検体が結合することを定量的に示すセンシング表面での変化が測定できるという条件で、被検体がセンシング表面に固定化されたリガンドに結合する任意の親和性ベースの検出方法が使用され得る。

【0025】

好ましい実施形態では、リガンドは、フローセル内のセンサー表面に共有結合したデキストランまたはポリカルボキシレート層などの薄いヒドロゲル層内にアミンカップリングを使用して固定化され；別の好ましい実施形態では、リガンドは、固定化ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）に対するポリヒスチジンタグまたは固定化ストレプトアビジンに対するビオチンタグまたは固定化ストレプトアビジンに対するＡＶｉＴａｇ（商標）タグなどの、センサー表面に固定化された適切な捕捉結合パートナーへの適切なタグによって捕捉される。

【0026】

本発明で使用され得る典型的なリガンドは、タンパク質（例えば、抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、またはアプタマー）、酵素、受容体、抗原、ハプテン、ペプチド、または化学分子（例えば、薬物候補またはその断片）を含むが、これらに限定はされない。本発明で使用され得る典型的な被検体は、タンパク質および糖タンパク質（例えば、抗体またはその断片、アフィボディ、またはアプタマー）、脂質、炭水化物、酵素、受容体、抗原、ハプテン、ペプチド、または化学分子（例えば、薬物候補またはその断片、特異的または非特異的な結合剤、キレート剤または凝集化剤（ａｇｇｒｅｇａｔｏｒｓ））を含むが、これらに限定はされない。「抗体」という用語は、天然であるか、部分的または全体的に合成的に生成されるかを問わず、免疫グロブリンを説明する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができ、宿主の免疫化および血清（ポリクローナル）の回収などの当技術分野で周知の技術によって、または連続的なハイブリッド細胞株を調製して、分泌されたタンパク質（モノクローナル）を回収することによって、またはヌクレオチド配列または、少なくとも天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするその変異誘発バージョンをクローニングして発現させることによって、調製され得る。「抗体」という用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質もカバーする。抗体抗原結合部位を含む抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの分子；およびディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）を含むが、これらに限定はされない。

【0027】

図１は、本発明を実施するためのマイクロ流体アセンブリ１の概略図を提供している。マイクロ流体アセンブリ１は、第１のリガンド４を含む第１の試験表面３を含む第１のフローセル２と、第１のリガンドを含まない第２の試験表面３’を含む第２のフローセル２’とを含む。本発明において、第２の試験表面３’は、リガンドを含まなくてよく、あるいは第２の試験表面３’はリガンドを有していてよいがそれらのリガンドは第１の試験表面３上にある第１のリガンドと同じ型ではなく、いずれの場合も、第２の試験表面３’は前記の第１のリガンドを有さないことが理解されるべきである。第１のリガンド４は、好ましくは、第１の試験表面３に共有結合したデキストラン層などの薄いヒドロゲル層内にアミンカップリングを使用して固定化され；別の好ましい実施形態では、第１のリガンド４は、第１のフローセル体積内のアガロースなどのゲルマトリックス内でヘキサヒスチジンまたはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどの適切なタグによって捕捉される。好ましくは、第１の試験表面３は、所与の（事前定義された）リガンド表面密度に対するリガンドの全量を増加させるために（例えば、第１の試験表面３上のリガンドの密度は、事前定義された密度である；したがって、第１の試験表面３の面積を増加させ、事前定義された密度に等しい密度を維持することは、第１のフローセル内のリガンドの数を増加させる）、０．１平方ミリメートルより大きい、または０．５平方ミリメートルより大きい、または１平方ミリメートルより大きい面積を有するが、これは、一例として、ヒドロゲル層の厚さ、および／またはリガンドのサイズによって制限され得る。面積は、平坦な表面の面積であっても、または表面に存在するマイクロポアの内面を含んでいてもよい。最も好ましくは、第２の試験表面３’の面積は、好ましくは第１の試験表面３の面積に等しい。

【0028】

好ましい実施形態では、マイクロ流体アセンブリ１は、第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’における変化を測定するように構成されたセンサー４５（表面プラズモン共鳴センサー、または導波管干渉法センサー、または表面弾性センサーなど）をさらに含む。最も好ましくは、センサー４５は、第１および第２の試験表面３、３’のそれぞれで生じる結合を測定する（つまり、サンプル流体中の被検体の、第１および第２の試験表面３、３’上のリガンドへの結合を測定する）ように構成される。第２の試験表面３’はリガンドを有さないため、第２の試験表面３’については、センサー４５により、結合はほとんどまたは全く測定されないと予想することができる。センサー４５は、被検体が第１のフローセル２内の第１のリガンド４に結合したかどうかを測定し、好ましくは、第１のフローセル２内の第１のリガンド４に結合した被検体の量を測定するように構成される。前記センサー４５は、好ましくは、そのような測定を実行することができるように、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に作動可能に接続される。第１のリガンド４は、分子がリガンドの結合ポケットに適合する単純な鍵と鍵穴のメカニズムを介するか、またはコンフォメーション変化などの、より複雑な分子プロセスにより補助されて、リガンド４に対して高い親和性を有するなどの事前定義された特性を有する被検体に結合することができる。したがって、サンプル流体を第１のフローセル２の第１の試験表面３に通し、次いで、どの被検体が第１のリガンド４に結合したかを決定することにより、サンプル流体中のどの被検体が、リガンドに対して高い親和性を有するという前記事前定義された特性を有するかが決定され得る。

【0029】

マイクロ流体アセンブリ１は、第１の導管５をさらに含み、その一端は、第１のフローセル２の第１の流体ポート２ａおよび第２のフローセル２’の第１の流体ポート２ａ’に流体的に接続され、その他方の端は、第１の選択バルブ８に流体的に接続されている。第１の選択バルブ８は、第１の導管５を第１の廃棄物リザーバ７に選択的に流体的に接続することができる。第１の廃棄物リザーバ７は、洗浄廃液などの不要な流体を受け取り、貯蔵することができる。

【0030】

第１の選択バルブ８は、第１の位置と第２の位置との間で移動可能である；第１の選択バルブ８がその第１の位置にある場合、第１の選択バルブ８は、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７に通過することを可能し；第１の選択バルブ８がその第２の位置にある場合、第１の選択バルブ８は閉じられており、したがって、第１の選択バルブ８を介して第１の導管５から流体が流れるのを防ぐ。

【0031】

マイクロ流体アセンブリ１は、マイクロ流体アセンブリ１の部品を洗浄するために使用され得るバッファー流体を含む第１のバッファーリザーバ９をさらに含む。この例では、第１のバッファーリザーバ９は、第１のシリンジポンプ９を含み；第１のシリンジポンプ９は、バッファー流体を含むレセプタクル９ｂと、レセプタクル９ｂ中に選択的に押し込まれて第１のシリンジポンプ９からバッファー流体を放出することができるプランジャ９ａとを備える。さらに、プランジャをレセプタクル９ｂから出る方向に動かすと、バッファー流体を第１のシリンジポンプ９内に吸引するための負圧が生じる。好ましくは、バッファー流体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）などの生理学的バッファーと、少量の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）および／またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの添加剤を含む。

【0032】

第１のバッファーリザーバ９は、バッファー導管１０によって第１の導管５に流体的に接続されている。バッファー導管１０は、第１の接合部１１で第１の導管５と接続する。図１に示されるように、この例では、バッファー導管１０は、第１の接合部１１がＴ字形の接合部１１となるように、第１の導管５に対して垂直に配置される；しかしながら、第１の接合部１１は、任意の形状または構成をとり得ることが理解されよう。さらに、第１の接合部１１は、バルブレスの接合部である（つまり、第１の接合部１１にはバルブが存在しない）。この実施形態の変形例では、バルブが第１の接合部１１に提供される；バルブは、第１の開位置と第２の閉位置との間で移動可能である；第１の開位置では、バルブは開いて、バッファー導管１０と第１の導管５との間の流体の流れを可能にし、第２の閉位置では、バルブは閉じられており、バッファー導管１０と第１の導管５との間の流体の流れを遮断する。

【0033】

マイクロ流体アセンブリ１は、第２の導管１５をさらに含み、その一端は、第１のフローセル２の第２の流体ポート２ｂおよび第２のフローセル２’の第２の流体ポート２ｂ’に流体的に接続されており、他方の端部は、第２の選択バルブ２８に流体的に接続されている；第２の選択バルブ２８は、第２の導管５を第２の廃棄物リザーバ２７に選択的に流体的に接続することができる。第２の廃棄物リザーバ２７は、洗浄廃液などの不要な流体を受け取り、貯蔵することができる。

【0034】

図１に示される実施形態に関して続けると、第２の選択バルブ２８は、第１の位置と第２の位置との間で移動可能である；第２の選択バルブ２８がその第１の位置にある場合、第２の選択バルブ２８は、流体が第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に通過することを可能にする；第２の選択バルブ２８がその第２の位置にある場合、第２の選択バルブ２８は閉じられており、したがって、第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７への流体の流れを防ぐ。

【0035】

マイクロ流体アセンブリ１は、マイクロ流体アセンブリ１の部品を洗浄するために使用され得るバッファー流体を含む第２のバッファーリザーバ１９をさらに含む。この例では、第２のバッファーリザーバ１９は、第２のシリンジポンプ１９を含む；第２のシリンジポンプ１９は、バッファー流体を含むレセプタクル１９ｂと、レセプタクル１９ｂ中に選択的に押し込まれて第２のシリンジポンプ１９からバッファー流体を選択的に放出することができるプランジャ１９ａとを備える。さらに、プランジャ１９ａをレセプタクル１９ｂから出る方向に動かすと、バッファー流体を第２のシリンジポンプ１９内に吸引するための負圧が生じる。好ましくは、バッファー流体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理学的バッファーを含む。

【0036】

マイクロ流体アセンブリ１は、第１のリガンド４への結合について試験されるべき被検体を含むサンプル流体を含む、サンプルリザーバ２９をさらに含む。サンプルリザーバ２９は好ましくは、バイアルまたはマイクロタイタープレートのウェルである。この例示的な実施形態では、サンプルリザーバ２９は、ｘ－ｙテーブル５０上に配置されている。ｘ－ｙテーブルは、サンプルリザーバ２９のいずれかが選択的に中間導管５１と流体接続するように（両方向矢印によって示されるように、ｘ軸またはｙ軸に沿って）選択的に移動され得る。中間導管５１は、好ましくはステンレス鋼またはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製の、サンプルリザーバから液体を吸引するように一方の開放端が適合された中空導管である。サンプル貯蔵導管は、ＰＥＥＫまたはポリテトラフルオロエチレン（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）（ＰＴＦＥ）またはステンレス鋼製のマイクロ流体チューブ、またはポリイミド製の層状マニホールド内の導管であり得る。

【0037】

図１は、サンプルリザーバ２９が中間導管５１に流体的に接続される位置にあるｘ－ｙテーブルを示しており、これにより、サンプルリザーバ２９が中間導管５１の自由端の下に配置されるようにｘ－ｙテーブル５０が配置される。

【0038】

マイクロ流体アセンブリ１は、第３の選択バルブ１８をさらに含む。第３の選択バルブ１８は、中間導管５１に流体的に接続されており、したがって、サンプルリザーバ２９は、第３の選択バルブ１８に選択的に流体的に接続され得る。第３の選択バルブは、貯蔵導管３０を介して、第２のシリンジポンプ１９とさらに流体的に接続される。この例では、貯蔵導管３０は、貯蔵導管３０に貯蔵され得る流体の体積を増加させるようにコイル状の導管である。この例では、貯蔵導管３０は、１００マイクロリットルを超える内部容積を有する。貯蔵導管３０の一端は、第２のシリンジポンプ１９に流体的に接続され、貯蔵導管３０の反対側の端部は、第３の選択バルブ１８に流体的に接続される。

【0039】

貯蔵導管３０、ｘ－ｙテーブル５０、第３の選択バルブ１８、第２のバッファーリザーバ１９（例えば、第２のシリンジポンプ１９）、中間導管１、サンプルリザーバ２９は、集合的にサンプル送達ユニット７１を規定するとみなすことができる。

【0040】

実施形態の変形例では、サンプル送達ユニット７１の代わりに（つまり、貯蔵導管３０、ｘ－ｙテーブル５０、第２のバッファーリザーバ１９、第３の選択バルブ１８、中間導管１およびサンプルリザーバ２９を含む構成要素群の代わりに）、例えばオートサンプラーなど、サンプル流体を装填および貯蔵するための他の適切な手段が提供されてもよい；例えば、オランダのＳｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ製の「Ａｌｉａｓ」などのオートサンプラーモデルが、上記の構成要素群の代わりに、アセンブリ１に提供され得る。好ましくは、実施形態のこの変形例では、アセンブリは、オートサンプラーに作動可能に接続されたポンプをさらに含むであろう。

【0041】

図１に示されるアセンブリに関して続けると、第３の選択バルブ１８は、サンプル導管２０によって第２の導管１５に流体的に接続されている。サンプル導管２０は、第２の接合部２１で第２の導管１５と接続する。図１に示されるように、この例では、サンプル導管２０は、第２の接合部２１がＴ字形の接合部２１となるように、第２の導管１５に対して垂直に配置される；しかしながら、第２の接合部２１は、任意の形状または構成をとり得ることが理解されよう。この実施形態では、第２の接合部２１はバルブレスである（つまり、第２の接合部２１にはバルブが存在しない）。この実施形態の変形例では、バルブが第２の接合部２１に提供される；バルブは、第１の開位置と第２の閉位置との間で移動可能である；第１の開位置では、バルブは開いて、サンプル導管２０と第２の導管１５との間の流体の流れを可能にし、第２の閉位置では、バルブは閉じられており、サンプル導管２０と第２の導管１５との間の流体の流れを遮断する。

【0042】

第３の選択バルブ１８は、第１の位置と第２の位置との間で移動可能である。第３の選択バルブ１８がその第１の位置にある場合、第３の選択バルブ１８は、中間導管５１を貯蔵導管３０に流体的に接続する。したがって、第３の選択バルブ１８がその第１の位置にあり、ｘ－ｙテーブルが、中間導管５１がサンプルリザーバ２９に流体的に接続されるように配置されている場合、サンプルリザーバ内のサンプル流体は、導管５１を通過して、第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に入ることができる。

【0043】

第３の選択バルブ１８がその第２の位置にある場合、第３の選択バルブ１８は、貯蔵導管３０をサンプル導管２０と流体的に接続する；したがって、第３の選択バルブ１８がその第２の位置にある場合、流体は、貯蔵導管３０から第３の選択バルブ１８を介してサンプル導管２０中へ、またはサンプル導管２０から第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０中へと流れることができる。

【0044】

以下に詳細に説明されるように、マイクロ流体アセンブリ１を使用して、本発明の方法の実施形態による例示的な方法を実施することができる。

【0045】

ステップ（ａ）
試験すべきサンプル流体は、所定の濃度ｃ_０でサンプルリザーバ２９に提供される。好ましくは、サンプル流体は、バッファー中で所定の濃度ｃ_０に希釈された被検体を含む。好ましくは、所定の濃度ｃ_０は、被検体とリガンド４との間で測定可能であるべき最大の予想される平衡解離定数Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}以上である。例えば、一次薬物候補スクリーニングで結合する「ヒット」が検出されるべきであり、「ヒット」が１００μＭ未満の平衡解離定数Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}で第１のリガンド４への結合を示す被検体として定義される場合、所定の濃度ｃ_０は、好ましくは１００μＭ以上となるように選択される。異なる濃度の被検体の一連の注入を使用して被検体とリガンド４との間の相互作用の速度論的速度を決定するために、最高の被検体濃度は、最大の予想される平衡解離定数Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}よりも約一桁高くすべきであることが当業者に知られている。有利なことに、本発明の方法を使用して速度論的速度を測定するために、サンプル流体中の被検体の所定の濃度ｃ_０は、最大の予想される平衡解離定数Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}よりも一桁高い必要はない。好ましくは、本発明において、リザーバ２９内に提供される前記サンプル流体中の被検体の所定の濃度ｃ_０は、ｃ_０＝１×Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}、またはｃ_０＝２×Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}、またはｃ_０＝３×Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}であり、ここで、Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}は、最大の予想される平衡解離定数である。１×Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}などの低い濃度の利点は、乏しい被検体の溶解度や被検体の凝集などの悪影響を回避できることである。３×Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}などの若干高い濃度の利点は、Ｋ_{Ｄ，ｍａｘ}に近い平衡解離定数を有する相互作用について評価される速度論的速度における誤差がより小さいことである。

【0046】

最も好ましくは、マイクロ流体アセンブリ１の全ての導管、ポンプ、バルブ、ならびに第１のフローセル２および第２のフローセル２’は、残りの空気を排出し、汚染物質から流路を洗浄するためにリンスされる。これを行うために、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされ、第１の選択バルブ８が開くように第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が閉じるように第２の選択バルブ２８がその第２の位置に動かされる。次いで、プランジャ１９ａは、第２のシリンジポンプ１９からより多くのバッファー流体を押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ中に押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されたバッファー流体は、バッファー流体を貯蔵導管３０およびサンプル導管２０に押し込み、次いで、第２の導管１５に押し込み、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に押し込み、そして第１の導管５に沿っておよび第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと押し込む。サンプル流体が流れるにつれて、それはまた、貯蔵導管３０、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２、および第１の導管５中に存在する空気または汚染物質を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。次いで、第１の選択バルブ８が閉じるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が開くように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。次いで、バッファー流体が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、プランジャ９ａがレセプタクル９ａ内に押し込まれる。バッファー流体は、第１のシリンジポンプ９からバッファー導管１０を通って第１の導管５に流れ、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に流れ、第２の導管１５に流れ、そして第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0047】

この時点で、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２および第２のフローセル２’、ならびに第１の導管５、およびバッファー導管１０は、全てバッファー流体で満たされている。
次いで、ｘ－ｙテーブル５０は、サンプルリザーバ２９が中間導管５１と流体的に接続するように移動される。次いで、第３の選択バルブ１８は、中間導管５１が第３の選択バルブを介して貯蔵導管３０と流体的に接続するように、その第１の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がその第１の位置にある状態で、第２のシリンジポンプ１９のプランジャ１９ａは、貯蔵導管３０内に負圧を生成するように、レセプタクル１９ｂから出る方向に動かされる。結果として、サンプル流体の全ピックアップ体積Ｖｔが、サンプルリザーバ２９から、中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引される。全ピックアップ体積Ｖｔは、好ましくは１０μＬ～５００μＬの間である。

【0048】

次いで、第３の選択バルブ１８が貯蔵導管３０とサンプル導管２０とを流体的に接続するように、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされる。任意選択的に、次いで、バッファー流体を第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、プランジャ１９ａが第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、サンプル流体の一部を貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。第１の選択ポンプ８が閉じているため、第１のフローセル２に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、サンプル流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かって流れるのを防ぐ；さらに、第２の選択バルブ２８が開くように第２の選択バルブ２８がその第１の位置にあるため、サンプル流体は、サンプル導管２０から第２の導管１５に流れ、第２の選択バルブ２８を介して第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0049】

好ましくは、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、サンプル流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを防ぐ。一部の場合、無視できる量のサンプル流体が、第１および第２のフローセル２、２’の方向に第２の導管１５の一部に沿って拡散することによって移動し得る。第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かうサンプル流体の拡散を防止するか、または少なくとも最小化するために、好ましくは、サンプル流体が貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿って第２の廃棄物リザーバ２７に流れる際、第１のバッファーリザーバ９から第１および第２のフローセル２、２’を通した第２の廃棄物リザーバ２７へのバッファー流体の流れが維持される。

【0050】

好ましくは、貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿ってそして第２の廃棄物リザーバ２７に流れることができるサンプル流体の体積は、サンプル導管２０の体積の２倍を超えるが、全ピックアップ量Ｖｔ未満である（つまり、サンプルリザーバ２９から中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引されたサンプル流体の体積よりも少ない）。したがって、貯蔵導管３０には、いくらかのサンプル流体が残っている。

【0051】

したがって、この段階で、好ましくは、サンプル導管２０はサンプル流体でリンスされており；サンプル流体で満たされている。この段階で、好ましくは、バッファー導管１０、第１および第２のフローセル２、２’は全て、バッファー流体のみを含み；一方、好ましくは、サンプル導管２０は、サンプル流体のみを含む。

【0052】

以下のステップが実行される前に、また以下のステップの実行中にも、第１および第２のフローセル２、２’に取り付けられたセンサー４５は、第１および第２のフローセル２、２’のそれぞれについての結合曲線を出力するように構成される。このステップ（ａ）中に第１のフローセル２に対してセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一測定結合曲線と呼ばれ；単一測定結合曲線は、時間の経過とともに、第１のフローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４に結合した被検体の量を表すシグナルである。このステップ（ａ）の間に、第２のフローセル２’についてセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一参照結合曲線と呼ばれる。第２のフローセル２’の第２の試験表面３’にはリガンドがないため、単一参照結合曲線は、結合がないことを示す定数「ゼロ」であると予測できることに留意されたい；しかしながら、実際にはそのようにならない；実際には、屈折率の寄与により、単一参照結合曲線はゼロ以外になるであろう。

【0053】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１を第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれるが、ここで、第１の体積Ｖ_１は全ピックアップ体積Ｖｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、サンプル流体の対応する第１の体積Ｖ_１を貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。第１の選択バルブ８がその第２の位置にある（つまり、第１の選択バルブ８が開いている）ため、第１および第２のフローセル２、２’に存在するバッファー流体は、サンプル流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを妨げる圧力をもはや提供しない。したがって、現在サンプル導管２０を通過しているサンプル流体は、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_ｓ０に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、そして第１の導管５に沿って、第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。サンプル流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す（好ましくは、サンプル流体は、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管、および第２の接合部２１と第１のフローセル３との間の第２の導管１５の部分に存在する全てのバッファー流体を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す）。

【0054】

よって、この段階では、サンプル導管２０、第２の接合部２１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第２の導管１５の部分、ならびに第１の導管５は全て、サンプル流体のみを含む。有利には、第１の選択バルブ８をその第２の位置に動かす前に、サンプル流体がすでにサンプル導管２０中に存在するため、これは、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされた際に、第１および第２のフローセル２、２’内のサンプル流体の濃度を迅速に増加させることを可能とする。

【0055】

第１の被検体の持続時間ｔ_１ａは、サンプル流体の第１の体積Ｖ１が、第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間である。したがって、第１の被検体の持続時間ｔ_１は、（前の段落で概説したステップにおいて説明されているように）サンプル流体の第１の体積Ｖ１が第１および第２のフローセル２、２’に注入される時間の持続時間に等しく；より具体的には、一例では、これまでの段落で説明したステップを参照して、第１の被検体の持続時間ｔ_１は、前記のバッファー流体の第１の体積Ｖ１をシリンジポンプから排出するためにプランジャ１９ａを第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ中に押し込み始めてから、プランジャ１９ａを第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに押し込むのを停止するまでの間の時間として定義され得る。第１のサンプル流体体積が注入される平均流速ｆ_１ａは、Ｖ_１／ｔ_１ａに対応する。好ましくは、ｔ_１は１０ミリ秒～６０分の間であり、ｆ_１は１μＬ／分～１ｍＬ／分の間であり、Ｖ_１は０．１μＬ～２００μＬの間である。

【0056】

次に、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、（被検体を含まない）バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ中に押し込まれる。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体は、第１の導管５を通って、時間ｔ_ｂ０に第１および第２のフローセル２、２’に同時に流れ、そして第２の導管１５および第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセル２との間の第１の導管の部分に存在するサンプル流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する全てのサンプル流体を部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。バッファー流体が第１のフローセル２の第１の試験表面３を通過すると、サンプル流体の第１の体積Ｖ１に属していたかつ以前に第１のリガンド４と結合していたが第１のリガンド４から受動的に解離した被検体は、第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流される。さらに、好ましい実施形態では、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’は、第１のリガンド４に結合している（サンプル流体の第１の体積Ｖ１に属していた）被検体を、第１のリガンド４から解離させるように構成される（つまり、解離させる組成を有する）；バッファーによって第１のリガンド４から解離した被検体は、第１のフローセル２、第２の導管１５を通って第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流される。

【0057】

第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂは、上記のステップにおいて、どのくらい長く、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかであり、第１のシリンジポンプ９からバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’を排出するように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａをレセプタクル９ｂ中に押し込み始めてから、プランジャ９ａをレセプタクル９ｂ中に押し込めるのを停止するまでの間の時間の差として定義される。バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が注入される平均流速ｆ_１ｂ’は、Ｖ_１’／ｔ_１ｂに対応する。好ましくは、ｔ_１ｂは１０ミリ秒～６０分の間であり、ｆ_１’は０．１μＬ／分～１ｍＬ／分の間であり、Ｖ_１’は１μＬ～２００μＬの間である。

【0058】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、そして好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２を第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ中に押し込まれるが、ここで、第２の体積Ｖ_２は全ピックアップ体積Ｖｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体の第２の体積Ｖ_２は、貯蔵導管３０に残っている対応するサンプル流体の第２の体積Ｖ_２を貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。好ましい実施形態では、サンプル流体の第２の体積Ｖ_２は、サンプル流体の第１の体積Ｖ_１よりも大きい。第１の選択バルブ８がその第２の位置にある（つまり、第１の選択バルブ８が開いている）ため、第１フローセル２に存在するバッファー流体は、サンプル流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを妨げる圧力をもはや提供しない。したがって、現在サンプル導管２０へ通過しているサンプル流体は、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_ｓ１に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、そして第１の導管５に沿って、および第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。サンプル流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。サンプル流体が第１のフローセル２の第１の試験表面３上を通過すると、表面上の第１のリガンド４と結合することを可能にするために必要な事前定義された特性を有するサンプル流体に含まれる被検体が、第１のリガンド４と結合する。

【0059】

第２の被検体の持続時間ｔ_２ａは、サンプル流体の第２の体積Ｖ２が第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間である。したがって、第２の被検体の持続時間ｔ_２ａは、（これまでの段落で概説したステップにおいて説明されているように）サンプル流体の第２の体積Ｖ２が第１および第２のフローセル２、２’に注入される時間の持続時間に等しく；より具体的には、一例では、これまでの段落で説明したステップを参照して、第２の被検体の持続時間ｔ_２は、前記バッファーの第２の体積Ｖ_２をシリンジポンプから排出するためにプランジャ１９ａを第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ中に押し込み始めてから、プランジャ１９ａを第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに押し込むのを停止するまでの間の時間の差として定義され得る。（被検体を含む）サンプル流体の第２の体積Ｖ_２が注入される平均流速ｆ_２ａは、Ｖ_２／ｔ_２ａに対応する。好ましくは、ｔ_２は１０ミリ秒～６０分の間であり、ｆ_２ａは１μＬ／分～１ｍＬ／分の間であり、Ｖ_１は０．１μＬ～２００μＬの間である。

【0060】

重要なことに、本発明において、第１の被検体の持続時間ｔ_１ａは、第２の被検体の持続時間ｔ_２ａよりも短い。重要なことに、サンプル流体の第１の体積Ｖ１中の被検体の所定の濃度ｃ_０は、サンプル流体の第２の体積Ｖ２中の被検体の所定の濃度ｃ_０と同じである。

【0061】

サンプル流体の他の体積が、サンプル流体の第１の体積Ｖ１の前、および／またはサンプル流体の第１の体積Ｖ１とサンプル流体の第２の体積Ｖ２の注入の間にフローセルに注入され得ることが理解されるべきである；言い換えれば、上記のサンプル流体の第１の体積Ｖ１およびサンプル流体の第２の体積Ｖ２は、必ずしも互いに連続している必要はない；また、それらは一連のサンプル流体体積注入において注入される第１および第２の体積を構成する必要もなく、むしろそれらは一連の注入の任意の時点で生じることができ、任意の順序で発生し得る。

【0062】

有利には、本発明において、サンプル導管２０は、サンプル流体の第１の体積Ｖ１をサンプル導管２０を通しておよび第１の試験表面３上に流してから、サンプル流体の第２の体積Ｖ２をサンプル導管２０を通しておよび第１の試験表面３上に流すまでの間に（例えばバッファーまたは任意の他の適切なリンス剤で）リンスされる必要がない。

【0063】

次に、好ましくは、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から排出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ内に押し込まれる。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’は、第１の導管５を通って流れ、同時に、ｔ_ｂ１において第１および第２のフローセル２、２’を通って、第２の導管１５に沿って第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセルとの間の第１の導管５の部分に存在するサンプル流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す。（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する全てのサンプル流体を第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のフローセル２の第１の試験表面３上を通過すると、サンプル流体の第２の体積Ｖ２に属していた、かつ以前に第１のリガンド４と結合していたが第１のリガンド４から受動的に解離した被検体は、第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流される。さらに、好ましい実施形態では、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’は、第１のリガンド４に結合している（サンプル流体の第２の体積Ｖ２に属していた）被検体を、それらを第１のリガンド４から解離させるように構成される（つまり、解離させるように適切な組成を有する）；バッファーによって第１のリガンド４から解離した被検体は、第１のフローセル２、第２の導管１５を通って第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流される。

【0064】

第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂは、上記のステップにおいて、どのくらい長く、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかであり、第１のシリンジポンプ９からバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’を排出するように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａをレセプタクル９ｂに押し込み始めてから、プランジャ９ａをレセプタクル９ｂに押し込めるのを停止するまでの間の時間の差として定義される。被検体を含まない第１の流体体積が注入される平均流速ｆ_２ｂ’は、Ｖ_２’／ｔ_２ｂ’に対応する。好ましくは、ｔ_２’は１０ミリ秒～６０分の間であり、ｆ_２ａ’は０．１μＬ／分～１ｍＬ／分の間であり、Ｖ_２’は１μＬ～２００μＬの間である。

【0065】

前述のように、センサーは、サンプル流体の第１および第２の体積（Ｖ１、Ｖ２）ならびにバッファー流体の第１および第２の体積（Ｖ１’、Ｖ２’）が、第１および第２のフローセル２、２’を通して流される際に、第１および第２のフローセル２、２’それぞれの第１および第２の試験表面３、３’上での結合を測定する；センサー４５は、単一測定結合曲線および単一参照結合曲線を出力する。

【0066】

サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１ Ｖ_２が第１のフローセル２の第１の試験表面３上を通過すると、第１の試験表面３上の第１のリガンド４と結合することを可能にするために必要な事前定義された特性を有するサンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１ Ｖ_２に含まれる被検体が、第１のリガンド４と結合する；この結合は、センサー４５によって出力される単一測定結合曲線において指し示される。センサーはまた、バッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’が、第１のフローセル２の第１の試験表面３上を通過するときに、第１のフローセル２の第１の試験表面３上での結合を測定する；好ましい実施形態では、バッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’は、第１の試験表面３上のリガンド４に結合している被検体をリガンド４から解離させるように構成される；この結合の減少は、センサー４５によって出力される単一測定結合曲線において指し示される。

【0067】

第２の試験表面３’にはリガンドがないため、単一参照結合曲線は結合を指し示さない；しかしながら、単一参照結合曲線はゼロではない；単一参照結合曲線に指し示される活性はいずれも、サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１、Ｖ_２とバッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’によって、それらが第２のフローセル２’を流れるときに引き起こされる屈折率効果によるものである。サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１ Ｖ_２が第２のフローセル２’の第２の試験表面３’上を通過すると、サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１ Ｖ_２によって引き起こされる屈折率が、非ゼロの単一参照結合曲線を生じさせる；サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ_１ Ｖ_２の屈折率への寄与は、センサー４５によって出力される単一参照結合曲線において指し示される。バッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’が第２のフローセル２’の第２の試験表面３’上を通過すると、バッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’によって引き起こされる屈折率が、非ゼロの単一参照結合曲線を生じさせる；バッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’、Ｖ_２’の屈折率への寄与は、センサー４５によって出力される単一参照結合曲線において指し示される。

【0068】

このステップ（ａ）においてセンサー４５によって出力される単一測定結合曲線および／または単一参照結合曲線は、処理のためにセグメントに分割され得ることが理解される。

【0069】

このステップ（ａ）に記載された上記のステップは、対応する複数のサンプル流体体積が、第１および第２のフローセル２、２’を通過するように、複数回繰り返されてもよい。好ましい実施形態では、次いで、複数のサンプル流体体積が第１および第２のフローセル２、２’を通過するように、（被検体を含む）サンプル流体体積を注入するステップおよび（被検体を含まない）バッファー流体体積を注入するステップが、複数回繰り返される；好ましくは、これらのステップは、３回または４回または５回または６回または７回または８回または９回または１０回繰り返される。（それぞれに被検体を含む）サンプル流体体積を注入するステップと、（被検体を含まない）バッファー流体体積を注入するステップを少ない回数（例えば３回繰り返す）繰り返すことの利点は、実験の合計時間が短縮されることである。これは、初期段階の薬物候補スクリーニングで遭遇される弱い結合物質（例えばｕＭまたはｍＭの範囲の親和性を有する）に特に適している。（被検体を含む）サンプル流体体積を注入するステップと（被検体を含まない）バッファー流体体積を注入するステップを多い回数（例えば５～１０回）繰り返すことの利点は、より広い範囲の速度論的パラメータを決定することができること、または速度論的パラメータをより正確に決定することができることである。これは、ｎＭまたはｐＭの範囲の親和性など、よりタイトな結合物質に特に適している。

【0070】

一例として、図２は、前述のステップ（つまり、（被検体を含む）サンプル流体体積の注入および（被検体を含まない）バッファー流体体積の注入が「５」回実行された（つまり、「５」サンプル流体体積と「５」バッファー流体体積が第１および第２のフローセル２、２’を通して流された）の例示的な実施形態について、センサー４５から出力された単一測定結合曲線（実線）および単一参照結合曲線（破線）の例を示している。グラフのｘ軸は秒単位の時間を示し、ｙ軸はｐｇ／ｍｍ２単位の表面質量を示している。

【0071】

示された例では、サンプル体積のそれぞれに含まれ、フローセル中のリガンド４に結合することができる被検体は、１００μＭの所定の濃度ｃ_ｏのフロセミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｆ４３８１）である。言い換えれば、サンプル流体体積のそれぞれは、１００μＭの所定の濃度ｃ_ｏのフロセミドを含み；バッファー流体体積は被検体を有さず、つまり、バッファー流体体積はフロセミドを含んでいなかった。サンプル流体の第１の体積Ｖ１は、ｘ＝７５ｓで注入され、第１の被検体の持続時間ｔ_１ａは３１２．５ｍｓであり、その後にバッファー流体の第１の体積Ｖ１’が４．６８７５ｓの第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂで続き、その後にサンプル流体の第２の体積Ｖ２が６２５ｍｓの第２の被検体の持続時間ｔ_２ａで続き、その後にバッファー流体の第２の体積Ｖ２’が４．３７５ｓの第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂで続き、その後にサンプル流体の第３の体積Ｖ３が１．２５ｓの第３の被検体の持続時間ｔ_３ａで続き、その後にバッファー流体の第３の体積Ｖ３’が３．７５ｓの第３のバッファーの持続時間ｔ_３ｂで続き、その後にサンプル流体の第４の体積Ｖ４が２．５ｓの第４の被検体の持続時間ｔ_４ａで続き、その後にバッファー流体の第４の体積Ｖ４’が２．５ｓの第４のバッファーの持続時間ｔ_４ｂで続き、その後にサンプル流体の第５の体積Ｖ５が５ｓの第５の被検体の持続時間ｔ_５ａで続き、その後にバッファー流体の第５の体積Ｖ５’が２００ｓの第５のバッファーの持続時間ｔ_５ｂで続いた（全てのデータが示されてはいない）。測定全体を通して、サンプル流体体積とバッファー流体体積の流速は８０ｕｌ／分であった。

【0072】

センサー４５は、任意の適切な形態をとり得ることに留意されたい。１０Ｈｚの捕捉周波数と２５℃のフローセル温度で動作させたＣｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥｄｅｌｔａシステムと、（その第１の試験表面３上にリガンド４を含む）第１のフローセル２を含むディスポーザブルセンサーチップ（例えば、Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＡＧの「ＷＡＶＥｃｈｉｐ ４ＰＣＨ」など）と、（その第２の試験表面３’にリガンドを有さない）第２のフローセル２’を使用して、図２に示される単一測定結合曲線と単一参照結合曲線が取得された。Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥｄｅｌｔａシステムは、単一のサンプルリザーバから複数回の注入ができるように、その測定プロセスが変更された。図２に示される測定値を取得する前に、ウシ赤血球由来の炭酸脱水酵素アイソザイムＩＩ（「ＣＡＩＩ」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｃ２５２２）が、第１のフローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４として、アミンカップリングを使用して、ＰＣＨ ＷＡＶＥｃｈｉｐ上に固定化された（約１０，４００ｐｇ／ｍｍ２の密度）。第２のフローセル２’の第２の試験表面３は、リガンドなしで空のままとされた。ＰＢＳバッファー ｐＨ７．４ ３％ＤＭＳＯをバッファーとして使用し、つまり、バッファー流体の体積Ｖ１’～Ｖ５’の各々は、ＰＢＳバッファー ｐＨ７．４ ３％ＤＭＳＯを含む。

【0073】

ステップ（ｂ）
上記のステップ（ａ）または以下のステップ（ｃ）が実行された後、またはその前に、サンプルバッファー流体の体積がそれぞれ第１および第２のフローセル２、２’を通され、これらのサンプルバッファー流体の体積がそれぞれ第１および第２のフローセル２、２’を通過するときの各フローセル２、２’それぞれについての結合曲線をセンサー４５が出力する。サンプルバッファー流体の体積は、ステップ（ａ）のサンプル流体（Ｖ１、Ｖ２）の体積と同じ速度、間隔、流速、および持続時間で第１および第２のフローセルを通される；例えば、この例では、サンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２が、第１および第２のフローセル２、２’を通されたため、このステップ（ｂ）においてサンプルバッファー流体の２つの体積がフローセルを通過し；サンプルバッファー流体の２つの体積を第１および第２のフローセル２、２’に注入する間隔は、サンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２を注入する間隔に等しくなり（つまり、ｔ_ｓ０とｔ_ｓ１の間の間隔に等しくなる）；また、サンプルバッファー流体の２つの体積を注入するための流速と期間は、ステップ（ａ）のサンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２と同じになる。これらのサンプルバッファー流体体積がそれぞれ第１のフローセル２を通されるときに、センサー４５が第１のフローセル２に関して出力する結合曲線は、単一ブランク測定結合曲線と呼ばれる；これらのサンプルバッファー流体体積がそれぞれ第２のフローセル２’を通されるときに、センサー４５が第２のフローセルに関して出力する結合曲線は、単一ブランク参照結合曲線と呼ばれる。このステップ（ｂ）について、次に詳しく説明する：

【0074】

サンプルバッファー流体は、サンプルリザーバ２９内に提供される。サンプルリザーバ２９に提供されるサンプルバッファー流体は、第１のシリンジポンプ９に提供されるバッファー流体と同じであっても、または異なっていてもよく、かつ／または、第２のシリンジポンプ１９に提供されるバッファー流体と同じであっても、または異なっていてもよいことが理解されるべきである。

【0075】

最も好ましくは、マイクロ流体アセンブリ１の全ての導管、ポンプ、バルブ、ならびに第１のフローセル２および第２のフローセル２’は、残りの空気を排出し、汚染物質から流路を洗浄するためにリンスされる。これを行うために、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされ、第１の選択バルブ８が開くように第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が閉じるように第２の選択バルブ２８がその第２の位置に動かされる。次いで、プランジャ１９ａは、第２のシリンジポンプ１９からより多くのバッファー流体を押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、バッファー流体を貯蔵導管３０およびサンプル導管２０に押し込み、次いで、第２の導管１５に押し込み、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に押し込み、第１の導管５に沿って第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと押し込む。バッファー流体が流れるにつれて、それはまた、貯蔵導管３０、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２、および第１の導管５中に存在する空気または汚染物質を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。次いで、第１の選択バルブ８が閉じるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が開くように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。次いで、バッファー流体が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、プランジャ９ａがレセプタクル９ａ内に押し込まれる。バッファー流体は、第１のシリンジポンプ９からバッファー導管１０を通って第１の導管５に流れ、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に流れ、第２の導管１５に流れ、第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0076】

この時点で、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２および第２のフローセル２’、ならびに第１の導管５、およびバッファー導管１０は、全てバッファー流体で満たされている。

【0077】

次いで、ｘ－ｙテーブル５０は、サンプルリザーバ２９が中間導管５１と流体的に接続されるように移動される。次いで、第３の選択バルブ１８は、中間導管５１が第３の選択バルブを介して貯蔵導管３０と流体的に接続されるように、その第１の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がその第１の位置にある状態で、第２のシリンジポンプ１９のプランジャ１９ａは、貯蔵導管３０内に負圧を生成するように、レセプタクル１９ｂから出る方向に動かされる。結果として、サンプルバッファー流体の全ピックアップ体積ＶＢｔは、サンプルリザーバ２９から、中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引される。

【0078】

次いで、第３の選択バルブ１８が貯蔵導管３０とサンプル導管２０とを流体的に接続するように、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされる。任意選択的に、次いで、バッファー流体を第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、プランジャ１９ａが第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、サンプルバッファー流体の一部を貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。第１の選択ポンプ８が閉じているため、第１のフローセル２に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、サンプルバッファー流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かって流れるのを防ぐ；さらに、第２の選択バルブ２８が開くように第２の選択バルブ２８がその第１の位置にあるため、サンプルバッファー流体は、サンプル導管２０から第２の導管１５に流れ、第２の選択バルブ２８を介して第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0079】

好ましくは、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、サンプルバッファー流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを防ぐ。一部の場合には、無視できる量のサンプルバッファー流体が、第１および第２のフローセル２、２’の方向に第２の導管１５の一部に沿って拡散することによって移動し得る。第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かうサンプルバッファー流体の拡散を防止するか、または少なくとも最小化するために、好ましくは、サンプルバッファー流体が貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿って第２の廃棄物リザーバ２７に流れる際、第１のバッファーリザーバ９から第１および第２のフローセル２、２’を通した第２の廃棄物リザーバ２７へのバッファー流体の流れが維持される。

【0080】

好ましくは、貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿って第２の廃棄物リザーバ２７に流れることができるサンプルバッファー流体の体積は、サンプル導管２０の体積の２倍を超えるが、全ピックアップ体積ＶＢｔ未満である（つまり、サンプルリザーバ２９から中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引されたサンプルバッファー流体の体積よりも少ない）。したがって、貯蔵導管３０には、いくらかのサンプルバッファー流体が残っている。

【0081】

したがって、この段階で、好ましくは、サンプル導管２０はサンプルバッファー流体でリンスされており；そしてサンプルバッファー流体で満たされている。この段階で、好ましくは、バッファー導管１０、第１および第２のフローセル２、２’は全て、バッファー流体のみを含み；一方、好ましくは、サンプル導管２０は、サンプルバッファー流体を含む。

【0082】

以下のステップが実行される前に、また以下のステップの実行中にも、第１および第２のフローセル２、２’に取り付けられたセンサー４５は、第１および第２のフローセル２、２’のそれぞれについての結合曲線を出力するように構成される。このステップ（ｂ）の間に、第１のフローセル２についてセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一ブランク測定結合曲線と呼ばれる。このステップ（ｂ）の間に、第２のフローセル２’についてセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一ブランク参照結合曲線と呼ばれる。サンプルリザーバ２９内に提供されたサンプルバッファー流体は、第１のフローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない；さらに、第２のフローセル２’の第２の試験表面３’は、リガンドを含まない。したがって、サンプルバッファー流体が第１および第２のフローセル２、２’それぞれの第１および第２の試験表面３、３’上を流れる際、第１および第２の試験表面３、３’で結合が発生しないため、単一ブランク測定結合曲線と単一ブランク参照結合曲線は、それぞれ一定の「ゼロ」になると予想されるだろう。しかしながら、実際には、単一ブランク測定結合曲線および／または単一ブランク参照結合曲線のうちの少なくとも１つは、ゼロ以外の値を含むであろう；また、単一ブランク測定結合曲線と単一ブランク参照結合曲線は、系統誤差のために互いに異なるであろう。

【0083】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、そして好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１Ｂを第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれるが、ここで、第１の体積Ｖ_１Ｂは全ピックアップ体積ＶＢｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、サンプルバッファー流体の対応する第１の体積Ｖ_１Ｂを貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。

【0084】

現在サンプル導管２０を通過しているサンプルバッファー流体は、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_Ｂ０に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、第１の導管５に沿って、第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。サンプルバッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す（好ましくは、サンプルバッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管、および第２の接合部２１と第１のフローセル３との間の第２の導管１５の部分に存在する全てのバッファー流体を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す）。

【0085】

よって、この段階では、サンプル導管２０、第２の接合部２１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第２の導管１５の部分、ならびに第１の導管５は全て、サンプルバッファー流体のみを含む。

【0086】

サンプルバッファー流体の第１の体積Ｖ_１Ｂは、ステップ（ａ）におけるサンプル流体の第１の体積Ｖ１に等しい。

【0087】

サンプルバッファー流体の第１の体積Ｖ_１Ｂが第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の継続時間（ｔ_１Ｂ）は、ステップ（ａ）における第１の被検体の持続時間ｔ_１ａに等しい。

【0088】

サンプルバッファー流体の第１の体積Ｖ_１Ｂが注入される平均流速（Ｖ_１Ｂ／ｔ_１ｂ）は、ステップ（ａ）における第１のサンプル体積の平均流速ｆ_１ａに等しい。

【0089】

次に、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ内に押し込まれる。バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’は、ステップ（ａ）におけるバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’に等しい。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体は、第１の導管５を通って、時間ｔ_Ｂｂ０に第１および第２のフローセル２、２’に同時に流れ、第２の導管１５および第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、（第１のシリンジポンプ９からの）それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセル２との間の第１の導管の部分に存在する（元々はサンプルリザーバ２９からの）バッファー流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する（元々はサンプルリザーバ２９からの）全てのバッファー流体を第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。

【0090】

第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂは、どのくらい長く、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかの尺度であり；このステップ（ｂ）の第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂは、ステップ（ａ）の第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂに等しい。

【0091】

このステップ（ｂ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が注入される平均流速（Ｖ_１’／ｔ_１ｂ）は、ステップ（ａ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が注入される平均流速ｆ_１ｂ’に等しい。

【0092】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、そして好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂを第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれるが、ここで、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂは全ピックアップ体積ＶＢｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂは、貯蔵導管３０に残っているサンプルバッファー流体の対応する第２の体積Ｖ_２Ｂを貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。

【0093】

第１の選択バルブ８がその第２の位置にある（つまり、第１の選択バルブ８が開いている）ため、第１フローセル２に存在するバッファー流体は、サンプルバッファー流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを妨げる圧力をもはや提供しない。したがって、現在サンプル導管２０を通過しているサンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂは、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_Ｂ１に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、第１の導管５に沿って、第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。サンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂが流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。

【0094】

このステップ（ｂ）においてｔ_Ｂ０（サンプルバッファー流体の第１の体積Ｖ_１Ｂが第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）とｔ_Ｂ１（サンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂが第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔の持続時間は、ステップ（ａ）におけるｔ_ｓ０（サンプル流体の第１の体積Ｖ１が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）とｔ_ｓ１（サンプル流体の第２の体積Ｖ２が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）と間の時間間隔に等しい。

【0095】

このステップ（ｂ）におけるサンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂは、ステップ（ａ）におけるサンプル流体の第２の体積Ｖ_２に等しい。

【0096】

サンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２Ｂが第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間（ｔ_２Ｂ）は、ステップ（ａ）における第２の被検体の持続時間ｔ_２ａに等しい。

【0097】

サンプルバッファー流体の第２の体積Ｖ_２ｓが注入される平均流速（Ｖ_２Ｂ／ｔ_２Ｂ）は、ステップ（ａ）における第２のサンプル体積の平均流速ｆ_２ａに等しい。

【0098】

次に、好ましくは、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から排出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ内に押し込まれる。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’は、第１の導管５を通って流れ、同時に、時間ｔ_Ｂｂ１において第１および第２のフローセル２、２’へと流れ、第２の導管１５に沿って第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセルとの間の第１の導管５の部分に存在するサンプルバッファー流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す。（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する全てのサンプルバッファー流体を第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。

【0099】

第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂは、どのくらい長く、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかの尺度であり；このステップ（ｂ）の第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂは、ステップ（ａ）の第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂに等しい。

【0100】

このステップ（ｂ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が注入される平均流速（Ｖ_２’／ｔ_２ｂ）は、ステップ（ａ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が注入される平均流速ｆ_２ｂ’に等しい。

【0101】

ｔ_Ｂｂ０（このステップ（ｃ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）およびｔ_Ｂｂ１（このステップ（ｃ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔の持続時間は、ｔ_ｂ０（ステップ（ａ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）およびｔ_ｂ１（ステップ（ａ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔に等しい。

【0102】

前述のように、センサー４５は、サンプルバッファー流体の第１および第２の体積（Ｖ_１Ｂ、Ｖ_２Ｂ）ならびにバッファー流体の第１および第２の体積（Ｖ１’、Ｖ２’）が、第１および第２のフローセル２、２’を通して流される際に、第１および第２のフローセル２、２’それぞれの第１および第２の試験表面３、３’上での結合を測定する。単一ブランク測定結合曲線は、このステップ（ｂ）の間に、第１のフローセル２についてセンサー４５によって出力される結合曲線であり；そして単一ブランク参照結合曲線は、このステップ（ｂ）の間に、第２のフローセル２’についてセンサー４５によって出力される結合曲線である。

【0103】

サンプルリザーバ２９内に提供される前記サンプルバッファー流体は、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない；したがって、サンプルバッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１Ｂ Ｖ_２Ｂは、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない。さらに、第１および／または第２のシリンジポンプ９、１９から来るバッファー流体は、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない。したがって、サンプルバッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１Ｂ Ｖ_２Ｂまたはバッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’ Ｖ_２’が第１および第２のフローセル２、２’を通って流れる際、第１または第２のフローセル２、２’のいずれにも結合は生じない。このような場合、単一ブランク測定結合曲線と単一ブランク参照結合曲線のどちらも、一定の「ゼロ」のままであると予想されるであろう。しかしながら、実際には、単一ブランク測定結合曲線および／または単一ブランク参照結合曲線のうちの少なくとも１つは、ゼロ以外の値を含むであろう；また、単一ブランク測定結合曲線と単一ブランク参照結合曲線は、系統誤差のために互いに異なるであろう。

【0104】

ステップ（ｂ）においてセンサー４５によって出力される単一ブランク測定結合曲線および単一ブランク参照結合曲線は、処理のためにセグメントに分割され得ることが理解される。

【0105】

ステップ（ｃ）
上記のステップ（ａ）および（ｂ）が実行された後、またはその前に、屈折率標準流体の体積がそれぞれ第１および第２のフローセル２、２’を通され、これらの屈折率標準流体体積（およびバッファー体積）がそれぞれ第１および第２のフローセル２、２’を通過するときの各フローセル２、２’それぞれについての結合曲線をセンサー４５が出力する。屈折率標準は、好ましくは、ＤＭＳＯまたはグルコースなどの低分子などの添加剤を含むバッファー流体を、好ましくは０．１％ｖ／ｖ、または０．５％ｖ／ｖ、または１％ｖ／ｖの濃度で含むため、屈折率標準流体の屈折率はバッファー流体とは異なる。好ましくは、屈折率標準流体における添加剤の拡散特性は、試験されるべき被検体の拡散特性に非常に類似している。好ましくは、添加剤の分子量は、測定されるべき被検体の分子量と類似している。例えば、添加剤の分子量は、試験されるべき被検体の平均分子量の範囲±２０％であり得る。屈折率標準流体の体積は、サンプル流体の体積（Ｖ１、Ｖ２）と同じ速度、間隔、流速、および持続時間で第１および第２のフローセルを通され；例えば、この例では、サンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２が第１および第２のフローセル２、２’を通されるため、このステップにおいて屈折率標準流体の２つの体積がフローセルを通過し；屈折率標準流体の２つの体積を第１および第２のフローセル２、２’に注入する間の間隔は、サンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２を注入する間の間隔に等しくなり（つまり、ｔｓ０とｔｓ１の間の間隔に等しくなる）；また、屈折率標準流体の２つの体積を注入するための流速と期間は、サンプル流体の２つの体積Ｖ１、Ｖ２と同じになる。これらの屈折率標準流体体積（およびバッファー体積）がそれぞれ第１のフローセル２を通されるときに、センサー４５が第１のフローセル２に関して出力する結合曲線は、単一溶媒測定結合曲線と呼ばれ；そしてこれらの屈折率標準流体体積（およびバッファー体積）がそれぞれ第２のフローセル２’を通されるときに、センサー４５が第２のフローセルに関して出力する結合曲線は、単一溶媒参照結合曲線と呼ばれる。このステップ（ｃ）について、次に詳しく説明する：

【0106】

屈折率標準流体は、サンプルリザーバ２９内に提供される。

【0107】

最も好ましくは、マイクロ流体アセンブリ１の全ての導管、ポンプ、バルブ、ならびに第１のフローセル２および第２のフローセル２’は、残りの空気を排出するため、および汚染物質から流路を洗浄するためにリンスされる。これを行うために、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされ、第１の選択バルブ８が開くように第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が閉じるように第２の選択バルブ２８がその第２の位置に動かされる。次いで、プランジャ１９ａは、第２のシリンジポンプ１９からより多くのバッファー流体を押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されたバッファー流体は、バッファー流体を貯蔵導管３０およびサンプル導管２０に押し込み、次いで、第２の導管１５に押し込み、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に押し込み、第１の導管５に沿って第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと押し込む。屈折率標準流体が流れるにつれて、それはまた、貯蔵導管３０、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２、および第１の導管５中に存在する空気または汚染物質を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。次いで、第１の選択バルブ８が閉じるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブ２８が開くように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。次いで、バッファー流体が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、プランジャ９ａがレセプタクル９ａ内に押し込まれる。バッファー流体は、第１のシリンジポンプ９からバッファー導管１０を通って第１の導管５に流れ、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に流れ、第２の導管１５に流れ、第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0108】

この時点で、サンプル導管２０、第２の導管１５、第１のフローセル２および第２のフローセル２’、ならびに第１の導管５、およびバッファー導管１０は、全てバッファー流体で満たされている。

【0109】

次いで、ｘ－ｙテーブル５０は、サンプルリザーバ２９が中間導管５１と流体的に接続されるように移動される。次いで、第３の選択バルブ１８は、中間導管５１が第３の選択バルブを介して貯蔵導管３０と流体的に接続されるように、その第１の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がその第１の位置にある状態で、第２のシリンジポンプ１９のプランジャ１９ａは、貯蔵導管３０内に負圧を生成するように、レセプタクル１９ｂから出る方向に動かされる。結果として、屈折率標準流体の全ピックアップ体積Ｖｓｔは、サンプルリザーバ２９から、中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引される。

【0110】

次いで、第３の選択バルブ１８が貯蔵導管３０とサンプル導管２０とを流体的に接続するように、第３の選択バルブ１８がその第２の位置に動かされる。任意選択的に、次いで、バッファー流体を第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、プランジャ１９ａが第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに押し込まれる。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、屈折率標準流体の一部を貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。第１の選択ポンプ８が閉じているため、第１のフローセル２に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、屈折率標準流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かって流れるのを防ぐ；さらに、第２の選択バルブ２８が開くように第２の選択バルブ２８がその第１の位置にあるため、屈折率標準流体は、サンプル導管２０から第２の導管１５に流れ、そして第２の選択バルブ２８を介して第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。

【0111】

好ましくは、第１のフローセル２および第２のフローセル２’に存在するバッファー流体によって提供される圧力は、屈折率標準流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを防ぐ。一部の場合、無視できる量の屈折率標準流体が、第１および第２のフローセル２、２’の方向に第２の導管１５の一部に沿って拡散することによって移動し得る。第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に向かう屈折率標準流体の拡散を防止するか、または少なくとも最小化するために、好ましくは、屈折率標準流体が貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿って第２の廃棄物リザーバ２７に流れる際、第１のバッファーリザーバ９から第１および第２のフローセル２、２’を通した第２の廃棄物リザーバ２７へのバッファー流体の流れが維持される。

【0112】

好ましくは、貯蔵導管３０からサンプル導管２０に沿って第２の廃棄物リザーバ２７に流れることができる屈折率標準流体の体積は、サンプル導管２０の体積の２倍を超えるが、全ピックアップ体積Ｖｓｔ未満である（つまり、サンプルリザーバ２９から中間導管５１に、そして第３の選択バルブ１８を介して貯蔵導管３０に吸引された屈折率標準流体の体積よりも少ない）。したがって、貯蔵導管３０には、いくらかの屈折率標準流体が残っている。

【0113】

したがって、この段階で、好ましくは、サンプル導管２０は、屈折率標準流体でリンスされており；そして屈折率標準流体で満たされている。この段階で、好ましくは、バッファー導管１０、第１および第２のフローセル２、２’は全て、バッファー流体のみを含み；一方、好ましくは、サンプル導管２０は、屈折率標準流体のみを含む。

【0114】

以下のステップが実行される前に、また以下のステップの実行中にも、第１および第２のフローセル２、２’に取り付けられたセンサー４５は、第１および第２のフローセル２、２’のそれぞれについての結合曲線を出力するように構成される。このステップ（ｃ）の間に、第１のフローセル２についてセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一溶媒測定結合曲線と呼ばれる。このステップ（ｃ）の間に、第２のフローセル２’についてセンサー４５によって出力される結合曲線は、以下、単一溶媒参照結合曲線と呼ばれる。第１のフローセル２’内の体積が第２のフローセル２’内の体積と異なるという事実のため（第１のフローセル内の体積の一部を占める第１のフローセル２に存在するリガンド４が存在するため）、単一溶媒測定結合曲線と単一溶媒参照結合曲線の間には違いが生じるであろう；一方、第２のフローセル２’にはリガンドが存在しない（または、第２のフローセル２’の第２の試験表面３’にリガンドがある場合、第１の試験表面３上のリガンドとは異なる型のものが存在し、また、第２の試験表面３’上に異なる量のリガンドが存在することもあり得る）；第１および第２のフローセル２、２’内の体積におけるこれらの違いにより、異なるセンサー結合曲線の出力が導かれる。

【0115】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、そして好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１ｓを第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれるが、ここで、第１の体積Ｖ_１ｓは全ピックアップ体積Ｖｓｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体は、対応する屈折率標準流体の第１の体積Ｖ_１ｓを貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。

【0116】

現在サンプル導管２０を通過している屈折率標準流体は、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_ｒ０に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、そして第１の導管５に沿って、第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。屈折率標準流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す（好ましくは、屈折率標準流体は、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管、および第２の接合部２１と第１のフローセル３との間の第２の導管１５の部分に存在する全てのバッファー流体を第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す）。

【0117】

よって、この段階では、サンプル導管２０、第２の接合部２１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第２の導管１５の部分、ならびに第１の導管５は全て、屈折率標準流体のみを含む。

【0118】

屈折率標準流体の第１の体積Ｖ_１ｓは、ステップ（ａ）におけるサンプル流体の第１の体積Ｖ１に等しい。

【0119】

屈折率標準流体の第１の体積Ｖ_１ｓが第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間（ｔ_１ｓ）は、ステップ（ａ）における第１の被検体の持続時間ｔ_１ａに等しい。

【0120】

屈折率標準流体の第１の体積Ｖ_１ｓが注入される平均流速（Ｖ_１ｓ／ｔ_１ａ）は、ステップ（ａ）における第１のサンプル体積の平均流速ｆ_１ａに等しい。

【0121】

次に、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、（被検体を含まない）バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から放出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ内に押し込まれる。バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’は、ステップ（ａ）におけるバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’に等しい。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体は、第１の導管５を通って、時間ｔ_ｒｂ０に第１および第２のフローセル２、２’に同時に流れ、そして第２の導管１５および第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセル２との間の第１の導管の部分に存在する屈折率標準流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する全ての屈折率標準流体を第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。

【0122】

第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂは、どのくらい長く、バッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかの尺度であり；上記のステップの第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂは、ステップ（ａ）の第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂに等しい。

【0123】

このステップにおいてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が注入される平均流速（Ｖ_１’／ｔ_１ｂ）は、ステップ（ａ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が注入される平均流速ｆ_１ｂ’に等しい。

【0124】

次に、流体が第１の導管５から第１の廃棄物リザーバ７へと通過できるように、第１の選択バルブ８がその第１の位置に動かされ（つまり、第１の選択バルブ８が開かれる）、そして好ましくは、第２の選択バルブ２８が、それが閉じられるようにその第２の位置に動かされる。第３の選択バルブ１８がまだその第２の位置にある状態において、プランジャ１９ａは、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２ｓを第２のシリンジポンプ１９から押し出すように、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂ内に押し込まれるが、ここで、第２の体積Ｖ_２ｓは全ピックアップ体積Ｖｓｔよりも小さい。第２のシリンジポンプ１９から放出されるバッファー流体の第２の体積Ｖ_２ｓは、貯蔵導管３０に残っている屈折率標準流体の対応する第２の体積Ｖ_２ｓを貯蔵導管３０からサンプル導管２０へと押し出す。

【0125】

第１の選択バルブ８がその第２の位置にある（つまり、第１の選択バルブ８が開いている）ため、第１フローセル２に存在するバッファー流体は、屈折率標準流体が第２の導管１５に沿って第１および第２のフローセル２、２’に流れるのを妨げる圧力をもはや提供しない。したがって、現在サンプル導管２０を通過している屈折率標準流体の第２の体積Ｖ_２ｓは、第２の導管１５に流れ込み、時間ｔ_ｒ１に第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、第１の導管５に沿って、第１の選択バルブ８を介して第１の廃棄物リザーバ７へと流れ込む。屈折率標準流体の第２の体積Ｖ_２ｓが流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、ならびに第１の導管５に存在するバッファー流体を少なくとも部分的に第１の廃棄物リザーバ７へと洗い流す。

【0126】

ｔ_ｒ０（屈折率標準流体の第１の体積Ｖ_１ｓが第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）とｔ_ｒ１（屈折率標準流体の第２の体積Ｖ_２ｓが第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔の持続時間は、ステップ（ａ）におけるｔ_ｓ０（サンプル流体の第１の体積Ｖ１が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）とｔ_ｓ１（サンプル流体の第２の体積Ｖ２が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）と間の時間間隔に等しい。

【0127】

屈折率標準流体の第２の体積Ｖ_２ｓは、ステップ（ａ）のサンプル流体の第２の体積Ｖ２に等しい。

【0128】

屈折率標準流体の第２の体積Ｖ_２ｓが第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間（ｔ_２ｓ）は、ステップ（ａ）における第２の被検体の持続時間ｔ_２ａに等しい。

【0129】

第１の屈折率標準流体体積の第２の体積Ｖ_２ｓが注入される平均流速（Ｖ_２ｓ／ｔ_２ａ）は、ステップ（ａ）における第１のサンプル体積の平均流速ｆ_２ａに等しい。

【0130】

次に、好ましくは、第１の選択バルブ８が閉じられるように、第１の選択バルブ８がその第２の位置に動かされ、第２の選択バルブが第２の導管１５から第２の廃棄物リザーバ２７に流体が流れることを可能とできるように、第２の選択バルブ２８がその第１の位置に動かされる。好ましくは、第３の選択バルブ１８は依然としてその第２の位置にあり、プランジャ１９ａの位置は、第２のシリンジポンプ１９のレセプタクル１９ｂに出入りする流体の流れを防ぐように固定されている。次いで、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から排出されるように、第１のシリンジポンプ９のプランジャ９ａがレセプタクル９ｂ内に押し込まれる。第１のシリンジポンプ９から放出されたバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’は、第１の導管５を通って流れ、時間ｔ_ｒｂ１において第１および第２のフローセル２、２’へと同時に流れ、第２の導管１５に沿って第２の廃棄物リザーバ２７へと流れる。バッファー流体が流れる際、それはまた、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１とフローセルとの間の第１の導管５の部分に存在する屈折率標準流体を少なくとも部分的に第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す（好ましくは、バッファー流体は、第１および第２のフローセル２、２’、および第２の導管１５、ならびに第１の接合部１１と第１および第２のフローセル２、２’との間の第１の導管の部分に存在する全ての屈折率標準流体を第２の廃棄物リザーバ２７へと洗い流す）。

【0131】

第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂは、どのくらい長く、バッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’に注入されるかの尺度であり；上記のステップの第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂは、ステップ（ａ）の第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂに等しい。

【0132】

このステップにおいてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が注入される平均流速（Ｖ_２’／ｔ_２ｂ）は、ステップ（ａ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が注入される平均流速ｆ_２ｂ’に等しい。

【0133】

ｔ_ｒｂ０（このステップ（ｃ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）およびｔ_ｒｂ１（このステップ（ｃ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔の持続時間は、ｔ_ｂ０（ステップ（ａ）においてバッファー流体の第１の体積Ｖ_１’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）およびｔ_ｂ１（ステップ（ａ）においてバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）との間の時間間隔に等しい。

【0134】

前述のように、センサーは、屈折率標準流体の第１および第２の体積（Ｖ_１ｓ、Ｖ_２ｓ）ならびにバッファー流体の第１および第２の体積（Ｖ１’、Ｖ２’）が、第１および第２のフローセル２、２’を通して流される際に、第１および第２のフローセル２、２’それぞれの第１および第２の試験表面３、３’上での結合を測定する。単一溶媒測定結合曲線は、このステップ（ｃ）の間に、第１のフローセル２についてセンサー４５によって出力される結合曲線であり；単一溶媒参照結合曲線は、このステップ（ｃ）の間に、第２のフローセル２’についてセンサー４５によって出力される結合曲線である。前記屈折率標準流体は、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まず；したがって、屈折率標準流体の第１および第２の体積Ｖ_１ｓ Ｖ_２ｓは、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない。さらに、バッファー流体は、第１のフローセル２の試験表面３上のリガンド４に結合し得る被検体を含まない。

【0135】

したがって、第１および第２の体積Ｖ_１ｓ Ｖ_２ｓまたはバッファー流体の第１および第２の体積Ｖ_１’ Ｖ_２’が第１および第２のフローセル２、２’を通って流れる際、第１または第２のフローセル２、２’のいずれにも結合は生じない。このような場合、単一溶媒測定結合曲線と溶媒参照結合曲線のどちらも、一定の「ゼロ」のままであると予想される；しかしながら、実際にはそうならない。センサー４５は屈折率の変化に敏感であり、屈折率標準流体はバッファー流体とは異なる屈折率を有するため、単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線はどちらも、ゼロ以外の値を含むであろう。重要なことに、単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線は、第１のフローセル２’内の自由体積が第２のフローセル２’内の自由体積とは異なるという事実のため（第１のフローセル内の体積の一部を占める第１のフローセル２に存在するリガンド４が存在するため）、互いに異なるものとなり；一方、第２のフローセル２’にはリガンドが存在しない（または、第２のフローセル２’の第２の試験表面３’にリガンドがある場合、第１の試験表面３のリガンドとは異なる型のものが存在し、また、第２の試験表面３’に異なる量のリガンドが存在することもあり得る）；したがって、屈折率標準流体とバッファー流体の間の屈折率の差は、単一溶媒参照結合曲線におけるものとは異なる影響を単一溶媒測定結合曲線に及ぼすであろう。

【0136】

ステップ（ｃ）においてセンサー４５によって出力される単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線は、処理のためにセグメントに分割され得ることが理解される。

【0137】

重要なことに、上記のステップ（ａ）～（ｃ）は、任意の順序で実行され得ることが理解されるべきである。本発明は、ステップ（ａ）～（ｃ）を上記の段落に記載されている順序で実行することに限定されない。例えば、別の実施形態では、最初にステップ（ｃ）が実行され、続いてステップ（ｂ）が実行され、続いてステップ（ａ）が実行され得；別の実施形態では、最初にステップ（ｂ）が実行され、続いてステップ（ｃ）が実行され、続いてステップ（ａ）が実行され得；別の実施形態では、最初にステップ（ａ）が実行され、続いてステップ（ｂ）が実行され、続いてステップ（ｃ）が実行され得る。

【0138】

ステップ（ｄ）
次いで、ステップ（ａ）から得られた単一参照結合曲線および単一測定結合曲線；およびステップ（ｂ）から得られた単一ブランク参照結合曲線および単一ブランク測定結合曲線；およびステップ（ｃ）から得られた単一溶媒参照結合曲線および単一溶媒測定結合曲線を処理して、調整された結合曲線を以下のようにして決定する：

【0139】

ステップ１：単一参照結合曲線を単一測定結合曲線から引いて、差分曲線を得る。

【0140】

ステップ２：単一ブランク参照結合曲線を単一ブランク測定結合曲線から引いて、ブランク差シグナルを得る。

【0141】

ステップ３：単一溶媒参照結合曲線を単一溶媒測定結合曲線から引いて、溶媒差シグナルを得る。

【0142】

ステップ４：差分曲線からゼロ化時間（ｚｅｒｏｉｎｇ ｔｉｍｅ）ｔｙでの差分曲線の平均ｙ値を引くことにより、差分曲線がｙ軸に関してゼロ化（ｚｅｒｏｅｄ）され、その結果、ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）が得られる。好ましくは、ゼロ化時間ｔｙは、サンプル流体Ｖ１の第１の体積を第１および第２のフローセル２、２’に通過させる前である。

【0143】

ステップ５：ブランク差シグナルからゼロ化時間ｔｙにおけるブランク差シグナルの平均ｙ値を引くことにより、ブランク差シグナルがｙ軸に関してゼロ化され、その結果、ゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）が得られる。

【0144】

ステップ６：ゼロ化時間ｔｙでの溶媒差シグナルの平均ｙ値を溶媒差シグナルから引くことにより、溶媒差シグナルがｙ軸に関してゼロ化され、その結果、ゼロ化された単一溶媒結合曲線（ｚｓｓｂｃ）が得られる。

【0145】

ステップ７（任意）：次に、任意選択的に、溶媒補正が実施されるが、これには以下が含まれる：

【0146】

（ｉ）平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）を決定する。

【0147】

一実施形態では、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）は、以下によって決定される：溶媒時間ｔｓでの溶媒差シグナルの平均値を決定し、ここで、溶媒時間ｔｓでの溶媒差シグナルの平均値が、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）である。最も好ましくは、時間ｔｓは、第２の被検体の持続時間ｔ２ａの中間（つまり、サンプル流体の第２の体積Ｖ２が第１および第２のフローセル２、２’を通って同時に流れている時間の中間）にある時刻である。さらに、溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線の平均値が決定される（溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線ｄの平均値は以下、「ｓｒｂｃ」と表示）。

【0148】

別の実施形態では、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）は、以下によって決定される：まず、溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒測定結合曲線の平均値を決定する（溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒測定結合曲線の平均値は以下、「ｓｍｂｃ」と表示）。次に、溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線の平均値を決定する（溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線ｄの平均値は以下、「ｓｒｂｃ」と表示）。次いで、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」と表示）は、以下のようにして決定される：
ｓｄｉｆｆ＝ｓｍｂｃ－ｓｒｂｃ

【0149】

（ｉｉ）上記のステップ（ｃ）を複数回繰り返して、複数の異なる単一溶媒参照結合曲線および単一溶媒測定結合曲線を得；複数の異なる単一溶媒参照結合曲線および単一溶媒測定結合曲線のそれぞれについて、上記のステップ（ｉ）を繰り返して、ｓｒｂｃ_ｉ、ｓｄｉｆｆ_ｉのセットを生成し、平均溶媒差ｓｄｉｆｆを、測定された全ての溶媒測定の単一溶媒参照結合曲線の平均値ｓｒｂｃに関連付ける。

【0150】

（ｉｉｉ）次いで、ｓｒｂｃ_ｉ、ｓｄｉｆｆ_ｉのセットを通して多項式関数をフィッティングすることにより、溶媒補正関数ｆｓを確立して、ｓｄｉｆｆ＝ｆｓ（ｓｒｂｃ）を近似する。例えば、ステップ（ｖ）が屈折率標準流体体積の３つの異なる体積に対して繰り返される場合、ｓｒｂｃ、ｓｄｉｆｆ値の３つの異なるセットが得られ；溶媒補正関数ｆｓは、ｓｒｂｃ、ｓｄｉｆｆ値のこれら３つの異なるセットにフィッティングされた近似値であり、記述される分析関係を確立する。

【0151】

（ｉｖ）溶媒補正単一結合曲線（「ｓｃｓｂｃ」と表示）は、溶媒補正関数（ｆｓ）を単一参照結合曲線（「ｓｒｂｃ」と表示）に適用し、以下のようにして、ゼロ化単一結合曲線（ｚｓｂｃ）からそれを引くことによって得られる：
ｓｃｓｂｃ＝ｚｓｂｃ－ｆｓ（ｓｒｂｃ）

【0152】

（ｖ）溶媒補正単一ブランク結合曲線（「ｓｃｓｂｂｃ」と表示）は、溶媒補正関数（ｆｓ）を単一ブランク参照結合曲線（「ｓｂｒｂｃ」と表示）に適用し、以下のようにして、その結果をゼロ化単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）から引くことによって得られる：
ｓｃｓｂｂｃ＝ｚｓｂｂｃ－ｆｓ（ｓｂｒｂｃ）

【0153】

上記の溶媒補正ステップ（ｉ）～（ｖｉ）は任意であることが理解されるべきである。

【0154】

ステップ８：最後に、曲線が好ましくはブランク参照されて、調整された結合曲線（「ａｂｃ」と表示）が得られる：

【0155】

一実施形態では、調整された結合曲線（「ａｂｃ」）は、以下のようにして、ゼロ化単一結合曲線（ｚｓｂｃ）からゼロ化単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）を引くことによって得られる：
ａｂｃ＝ｚｓｂｃ－ｚｓｂｂｃ

【0156】

上記の溶媒補正ステップ（ｉ）～（ｖｉ）が実施される別の実施形態においては、調整された結合曲線は、以下のようにして、溶媒補正単一結合曲線（「ｓｃｓｂｃ」と表示）から溶媒補正単一ブランク結合曲線（「ｓｃｓｂｂｃ」と表示）を引くことによって得られる：
ａｂｃ＝ｓｃｓｂｃ－ｓｃｓｂｂｃ

【0157】

図３は、上記のステップ（ａ）～（ｄ）が実行された（溶媒補正の実行を含む）後に得られた調整された結合曲線（実線）を示している。

【0158】

ステップ（ｅ）
次いで、調整された結合曲線を使用して、会合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄなどの速度論的パラメータを決定し、第１のフローセル２（および第２のフローセル２’）を通って流れたサンプル流体の体積中の被検体（具体的には、サンプル流体Ｖ１、Ｖ２の第１および第２の体積中に存在した）と、フローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４との相互作用を特徴付ける。

【0159】

一実施形態では、調整された結合曲線は、反応曲線を処理して速度論的パラメータを決定するための当技術分野における任意の適切な既知の手段を使用して処理され得る。

【0160】

好ましい実施形態では、速度論的パラメータｋａおよびｋｄを決定するために、結合を説明するモデルが、調整された結合曲線にフィッティングされる。

【0161】

一実施形態では、調整された結合曲線にモデルをフィッティングさせることは、好ましくは、以下のようにして、単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）から単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）を引くことによって、調整された溶媒曲線（「ａｓｃ」と表示）を決定するステップを含む：
ａｓｃ＝ｓｓｒｂｃ－ｓｂｒｂｃ

【0162】

次いで、調整された溶媒曲線は、調整された溶媒曲線からゼロ化時間ｔｙにおける調整された溶媒曲線の平均ｙ値を引くことにより、ｙ軸に関してゼロ化され、その結果、ゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）が得られる。好ましくは、ゼロ化時間ｔｙは、サンプル流体の第１の体積Ｖ１を第１および第２のフローセル２、２’に通過させる前である。

【0163】

好ましい実施形態では、次いで、ゼロ化された調整された溶媒曲線を調整された溶媒曲線の平均最大値で割って、正規化された溶媒曲線を取得し、次いで、正規化された溶媒曲線に、サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ１、Ｖ２に含まれた被検体の所定の濃度ｃ_０を掛けることによって、単一濃度曲線が確立される（サンプル流体の各体積は、被検体の同じ所定の濃度ｃ_０を有していることを想起されたい）。好ましくは、調整された溶媒曲線の平均最大値は、溶媒時間ｔｓにおける調整された溶媒曲線の平均値を決定することによって得られ、ここで、溶媒時間ｔｓにおける調整された溶媒曲線の平均値が、調整された溶媒曲線の平均最大値である。

【0164】

１：１の結合モデルを想定すると、ステップ（ａ）における第１および第２のフローセル２、２’を通って流れたサンプル流体の体積中にあった被検体（具体的には、この例では、サンプル流体の第１および第２の体積（Ｖ１、Ｖ２）における被検体）の第１のフローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４に対する結合は、以下の微分方程式で記述され得る：

【0165】

【数4】

【0166】

上記の微分方程式は、各時間ステップにおける単一濃度曲線の値を変数「ｃ」として使用し、変数Ｒｍａｘならびにパラメータｋａおよびｋｄの初期推定値を仮定して数値積分されて、シミュレートされた結合曲線を生成する（「ｓｂｃ」と表示）。

【0167】

次いで、シミュレートされた結合曲線（「ｓｂｃ」）のカイ二乗（χ^２）が、以下によって決定される：

【0168】

【数5】

【0169】

シミュレートされた結合曲線（「ｓｂｃ」）のカイ二乗（χ^２）は、シミュレートされた結合曲線（「ｓｂｃ」）が調整された結合曲線（ａｂｃ）にどれだけよく近似するかの尺度である。カイ二乗を最小化する、よく知られているＬｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムなどの推定量または最適化スキームを使用することにより、調整された結合曲線（ａｂｃ）を最もよく近似するパラメータＲｍａｘ、ｋａ、ｋｄが見つかる。調整された結合曲線（ａｂｃ）を最もよく近似する前記パラメータＲｍａｘ、ｋａ、ｋｄは、第１のフローセル２を通して流されたサンプル流体の体積中の被検体（具体的には、この例では、サンプル流体の第１および第２の体積Ｖ１、Ｖ２の被検体）と、フローセル２の第１の試験表面３上のリガンド４との間の相互作用を特徴付けるパラメータＲｍａｘ、ｋａ、ｋｄを定義する。

【0170】

図３は、調整された結合曲線（実線）を最もよく近似するパラメータＲｍａｘ、ｋａ、ｋｄ＝５．８９×１０^－２ｓ^－１のシミュレーション（破線）を示しており、この例では、調整された結合曲線（実線）を最もよく近似するパラメータは、Ｒｍａｘ＝６３．３ｐｇ／ｍｍ２、ｋａ＝２．６６×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１、ｋｄ＝５．８９×１０^－２ｓ^－１である。

【0171】

好ましくは、上記のステップ（ａ）～（ｅ）は、異なる型の被検体の結合を決定し、それらの動態を測定するために、複数の異なる型のサンプル流体に対して繰り返される。

【0172】

有利には、本発明の方法を用いる全測定時間は、従来技術と比較して短く；新しいサンプルは、前のサンプルの試験が開始された短時間後に試験を開始され得；言い換えれば、サンプル流体の第１の体積が第１の試験表面３を通過したすぐ後に、サンプル流体の第２の体積が第１のフローセル２の第１の試験表面３上に通され得る。さらに、異なる型の被検体を含む異なる型のサンプル流体が、前のサンプル流体を試験した後すぐに（約５秒）試験され得る。言い換えれば、被検体のうちの１つの型を含む１つの型のサンプル流体に関して、その型の被検体の結合を決定し、動態を測定するために、上記のステップ（ａ）～（ｅ）を実行したすぐ後（約５秒）に、被検体のうちの別の型を含む別の型のサンプル流体について、上記のステップ（ａ）～（ｅ）を行って、当該他の型の被検体の結合を決定し、動態を測定することができる。

【0173】

本発明の方法は、１つの単一のフローセルのみを含み得るアセンブリを使用して実行されてもよいことが理解されるべきであり；この場合、ステップ（ａ）～（ｃ）が、前記の１つの単一のフローセルの試験表面上にリガンドを提供する前に実行されて、ステップ（ａ）からの単一参照結合曲線、ステップ（ｂ）からの単一ブランク参照結合曲線、およびステップ（ｃ）からの単一溶媒参照結合曲線が得られる。その後、リガンドが前記の１つの単一のフローセルの試験表面上に提供され、ステップ（ａ）～（ｃ）が繰り返されて、ステップ（ａ）から単一測定結合曲線が得られ、ステップ（ｂ）から得られた単一ブランク測定結合曲線が得られ；ステップ（ｃ）から単一溶媒測定結合曲線が得られる。したがって、図１に示されるアセンブリ１の実施形態の変形例では、アセンブリは、第１および第２のフローセル２、２’を有する代わりに、代替的に単一のフローセルを含み得る。

【0174】

本発明の方法は、ＷＯ２０１７１８７３２５Ａ１に記載されているアセンブリのいずれかを使用して実施され得ることが理解されるべきである。

【0175】

本発明の方法は、問題のアセンブリが被検体を含むサンプル流体の体積と（被検体を含まない）バッファー流体の体積をフローセルに連続的に注入できることを条件として、例えば、ＷＯ２０１４００９２８６Ａ１またはＷＯ２０１３０５５２８１に記載されているアセンブリのいずれかなど、バイオセンシング分野で一般的に使用されるマイクロ流体アセンブリの様々な実施形態を使用して実施され得ることが理解されるべきである。

【0176】

好ましくは、本発明の方法では、第１および第２のフローセルを通されるサンプル流体体積のそれぞれは、同じ単一のサンプルリザーバ２９に由来する。単一のサンプルリザーバ２９は、マイクロタイタープレートのウェルであってもよい。最も好ましい実施形態では、フローセルの試験表面上を流れるサンプル流体の前記それぞれの体積の全てが、サンプル流体の任意の体積がフローセルの試験表面上を流れる前に、同じ単一のレセプタクルから吸引され；言い換えれば、サンプル流体の単一の体積が単一のレセプタクルから吸引される単一の吸引ステップがあり、これは、サンプル流体の任意の体積がフローセルの試験表面上を流される前に実行され、その後フローセルの試験表面上を流れるサンプル流体の全ては、吸引されたサンプル流体のその単一の体積に由来する。言い換えれば、フローセルの試験表面上を流れるサンプル流体の各体積は、単一のレセプタクルから吸引されたサンプル流体の単一の体積の一部である。

【0177】

本発明の方法の好ましい実施形態では、第１および第２のフローセル２、２’を通して流される（被検体を含む）サンプル流体の体積の合計ΣＶ_ｉは、全ピックアップ体積Ｖ_ｔよりも小さい。

【0178】

驚くべきことに、本発明では、（第１および第２のフローセル２、２’に流入するサンプル流体の体積の各々は全て被検体の同じ所定濃度ｃ_０を有するため）第１の試験表面２上のリガンド４は１つの共通の被検体濃度とのみ接触するにもかかわらず、会合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄなどの速度論的パラメータに関する情報を、本発明の方法による測定から得ることができる。

【0179】

好ましい実施形態では、第１の被検体の持続時間ｔ_１ａは、全ての被検体の持続時間ｔ_ｉａの中で最も短く、最後の被検体の持続時間ｔ_Ｎａは、全ての被検体の持続時間ｔ_ｉａの中で最も長く、最短の時間で可能な限り最も広い速度論的空間の測定を可能とする。さらなる好ましい実施形態では、被検体の持続時間は、最初の被検体の持続時間ｔ_１ａから最後の被検体の持続時間ｔ_Ｎａまで指数関数的に増加する。例えば、サンプル流体の５体積が第１および第２のフローセル２、２’に流される実施形態では、第２の被検体の持続時間ｔ_２ａは、第１の被検体の持続時間ｔ_１ａの３倍の長さであり、第３の被検体の持続時間ｔ_３ａは、第２の被検体の持続時間ｔ_２ａの３倍の長さであり、第４の被検体の持続時間ｔ_４ａは、第３の被検体の持続時間ｔ_３ａの３倍の長さであり、第５の被検体の持続時間ｔ_５ａは、第４の被検体の持続時間ｔ_４ａの３倍の長さである。上記のステップ（ａ）ですでに詳細に説明したように、被検体の持続時間は、サンプル流体の体積が、第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間であり；したがって、例えば、第３の被検体の持続時間ｔ_３ａは、サンプル流体の第３の体積が第１および第２のフローセル２、２’の第１および第２の試験表面３、３’上を流れる時間の持続時間である。

【0180】

さらなる好ましい実施形態では、次のサンプル流体の体積を注入する前に、第１のフローセル２のリガンド４からの被検体の解離を可能にするために、最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮは、全てのバッファーの持続時間ｔ_ｂｉの中で最長である。ステップ（ａ）ですでに詳細に説明したように、バッファーの持続時間は、どのくらい長く、バッファー流体が第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’へと注入されるかであり；したがって、最後のバッファーの持続時間は、どのくらい長く、第１および第２のフローセル２、２’を通して流されるバッファー流体の最後の体積が、第１のシリンジポンプ９から第１および第２のフローセル２、２’へと注入されるかである。

【0181】

好ましい実施形態では、最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮは、約１／ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}または２／ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}または３／ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}に対応し、ここで、ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}は、特定の測定について関心のある速度論的領域内の最小の解離速度定数である。一例として、１０ｎＭ～１０μＭの親和性範囲で結合物質を特性評価する場合、この親和性範囲の結合物質の関心領域内における最小解離定数はｋ_{ｄ，ｍｉｎ}＝１ｅ－２ｓ^－１となるように選択でき、また、最後のバッファーの持続時間は３／ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}＝３００ｓとなるように選択され得る。

【0182】

１ｐＭ～１ｎＭの親和性範囲などのタイトな結合物質（「ピコモル結合物質」）に特に適したさらなる好ましい実施形態では、フローセル３、３’の試験表面２，２’は、解離を促進する再生試薬を使用するか、リガンドを除去して再捕捉するかのいずれかにより再生され、最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮ’は約１／（１０ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}）または１／（２０ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}）または１／（５０ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}）に対応する。一例として、ピコモル結合物質の関心領域内の最小解離定数はｋ_{ｄ，ｍｉｎ}＝１ｅ－５ｓ^－１となるように選択でき、また、最後のバッファーの持続時間は１／（５０ｋ_{ｄ，ｍｉｎ}）＝２，０００ｓとなるように選択され得る。

【0183】

さらなる好ましい実施形態では、ステップ（ａ）、および／またはステップ（ｂ）、および／またはステップ（ｃ）においてセンサー４５から出力される結合曲線が、リアルタイムで系統誤差について評価および補正される。一実施形態では、単一測定結合曲線がまだ事前定義されたベースラインに戻っていない場合、ステップ（ａ）の最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮが増やされる。好ましくは、ステップ（ａ）における最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮは、単一測定結合曲線が事前定義されたベースラインに戻るまでである。

【0184】

さらなる好ましい実施形態では、最後のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮは、全てのバッファーの持続時間ｔ_ｂｉの中で最も長く、第１のバッファーの持続時間ｔ_ｂ１は、全てのバッファーの持続時間ｔ_ｂｉの中で２番目に長い。さらなる好ましい実施形態では、バッファーの持続時間は、最初のバッファーの持続時間ｔ_ｂ１から最後から２番目のバッファーの持続時間ｔ_ｂＮ－１まで指数関数的に減少する。例えば、バッファー流体の「６」体積が第１および第２のフローセル２、２’に流される実施形態では、第２のバッファーの持続時間ｔ_ｂ２は、第１のバッファーの持続時間ｔ_ｂ１の３分の１の長さであり、第３のバッファーの持続時間ｔ_ｂ３は、第２のバッファーの持続時間ｔ_ｂ２の３分の１の長さであり、第４のバッファーの持続時間ｔ_ｂ４は、第３のバッファーの持続時間ｔ_ｂ３の３分の１の長さであり、第５のバッファーの持続時間ｔ_ｂ５は、第４の被検体の持続時間ｔ_ｂ４の３分の１の長さである。

【0185】

さらなる好ましい実施形態では、最短のバッファーの持続時間ｔｂ_ｍｉｎは、約１／ｋ_{ｄ，ｍａｘ}または２／ｋ_{ｄ，ｍａｘ}または３／ｋ_{ｄ，ｍａｘ}に対応し、ここで、ｋ_{ｄ，ｍａｘ}は測定される最も速い解離に対応する最大の解離速度定数であり、例えば、結合曲線は、測定される最速のオフレートでベースラインにほぼ戻る。

【0186】

さらなる好ましい実施形態では、最短のバッファーの持続時間ｔ_ｍｉｎは、被検体τ_ａ’の立下がり時間にほぼ対応し、ここで、被検体τ_ａ’の立下がり時間は、バッファー流体の注入の開始から、第１のフローセル２の第１の試験表面３上の被検体の濃度が、所定の濃度ｃ_０の平均５％まで減少するまでの時間である。最も好ましい実施形態では、屈折率流体は、被検体と同様な拡散特性を有する添加剤を含み、屈折率流体の立下がり時間が被検体τ_ａ’の立下がり時間に少なくとも近いことから、これは、溶媒結合曲線を用いて被検体τ_ａ’の立下がり時間を測定することを可能とする。好ましくは、被検体τ_ａ’の立下がり時間は、時間ｔ_ｒｂＮ（バッファー流体の最後の体積Ｖ_２’が上記のステップ（ｃ）で第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）付近のゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）で測定される。最短のバッファーの持続時間ｔ_ｍｉｎの好ましい値は、例えば、ｔ_ｍｉｎ’＝１×τ_ａ’、またはｔ_ｍｉｎ’＝０．７５×τ_ａ’、またはｔ_ｍｉｎ’＝１．２５×τ_ａ’、またはｔ_ｍｉｎ’＜２×τ_ａ’、またはｔ_ｍｉｎ’＜３×τ_ａ’である。これにより、可能な限り最速のオフレートが決定され得る。

【0187】

さらなる好ましい実施形態では、第１の被検体の持続時間ｔ_ａ１は、被検体τ_ａの立上がり時間よりも短く、ここで、被検体τ_ａの立上がり時間は、サンプル流体の１つの体積の注入の開始から、第１のフローセルの第１の試験表面２における被検体の濃度が所定の濃度ｃ_０の平均９５％に達した時間までの時間である。最も好ましい実施形態では、屈折率流体は、被検体と同様な拡散特性を有する添加剤を含み、屈折率流体の立上がり時間が被検体τ_ａの立上がり時間に少なくとも近いことから、これは、溶媒結合曲線を用いて被検体τ_ａの立上がり時間を測定することを可能とする。好ましくは、被検体τ_ａの立上がり時間は、時間ｔ_ｒＮ（屈折率標準流体の最後の体積Ｖ_Ｎｓが第１および第２の試験表面３、３’上を流れ始める時間）付近のゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）で測定される。最短のバッファーの持続時間ｔ_ｍｉｎの好ましい値は、例えば、ｔ_ａ１＝τ_ａ／２、またはｔ_ａ１＝τ_ａ／５、またはｔ_ａ１＝τ_ａ／１０である。これにより、センサー表面における実効濃度が下げられ、より高速なオンレートの測定が可能となる。

【0188】

さらなる好ましい実施形態では、注入シーケンスのパラメータは、速度論的空間の関心領域内の相互作用について、結合曲線の形状の差を最大化するために、モンテカルロシミュレーションなどのコンピュータシミュレーションを使用して最適化される。

【0189】

図４は、本発明による例示的な測定の結果を提供しており、これは、典型的には１μＭ～１ｍＭの親和性範囲にある弱い結合物質のハイスループットスクリーニングに対する本発明の適合性を強調している。この例では、（被検体を含む）サンプル流体体積を注入し、（被検体を含まない）バッファー流体体積を注入する前述のステップが「５」回実行された（つまり、「５」サンプル流体体積と「５」バッファー流体体積が第１および第２のフローセル２、２’を通して流された）。グラフのｘ軸は秒単位の時間を示し、ｙ軸はｐｇ／ｍｍ２単位の表面質量を示している。

【0190】

図４は、６－ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（５’－ＣＡＧＴＧＣ－３’；１７９２Ｄａ）とビオチン化３４－ｍｅｒ（ｂｉｏ－３４；５’－［Ｂｔｎ］ＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣ－３’；１１ｋＤａ）との相互作用の３回の測定に対応する３つの調整された結合曲線（実線）、および調整された結合曲線に対して速度論的パラメータを最もよくフィットさせる、対応するシミュレートされた結合曲線（破線）を示している。測定値は、Ｃｒｅｏｐｔｉｘ ＷＡＶＥｄｅｌｔａシステムを使用して、４０Ｈｚの取得周波数と１５℃のフローセル温度で取得した。４つの並列フローセルで構成されるＰＣＰ－Ｓ ＷＡＶＥｃｈｉｐを使用した。機器は、単一のサンプルリザーバから複数回の注入ができるように、その測定プロセスが変更された。記述された測定に先立ち、ビオチン化３４－ｍｅｒ（ｂｉｏ－３４；５’－［Ｂｔｎ］ＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＴＡＧＡＣＴＣＣ－３’；１１ｋＤａ、「標的」）がフローセル２および３のセンサー表面上のリガンドとして、ＰＣＰ－ＳＷＡＶＥｃｈｉｐ上のストレプトアビジンに捕捉された（約３００ｐｇ／ｍｍ２の密度で）。フローセル１およびフローセル４は空のままにし、参照として使用した。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳバッファー ｐＨ７．４をバッファーとして使用した。サンプル流体の第１の体積Ｖ１が３１．２５ｍｓの第１の被検体の持続時間ｔ_１ａで注入され、その後にバッファー流体の第１の体積Ｖ１’が０．４６８７５ｓの第１のバッファーの持続時間ｔ_１ｂで続き、その後にサンプル流体の第２の体積Ｖ_２が０．６２５ｍｓの第２の被検体の持続時間ｔ_２ａで続き、その後にバッファー流体の第２の体積Ｖ_２’が０．４．３７５ｓの第２のバッファーの持続時間ｔ_２ｂで続き、その後にサンプル流体の第３の体積Ｖ３が０．１２５ｓの第３の被検体の持続時間ｔ_３ａで続き、その後にバッファー流体の第３の体積Ｖ３’が０．３７５ｓの第３のバッファーの持続時間ｔ_３ｂで続き、その後にサンプル流体の第４の体積Ｖ４が０．２５ｓの第４の被検体の持続時間ｔ_４ａで続き、その後にバッファー流体の第４の体積Ｖ４’が０．２５ｓの第４のバッファーの持続時間ｔ_４ｂで続き、その後にサンプル流体の第５の体積Ｖ５が０．５ｓの第５の被検体の持続時間ｔ_５ａで続き、その後にバッファー流体の第５の体積Ｖ５’が２．５ｓの第５のバッファーの持続時間ｔ_５ｂで続いた。

【0191】

この例では、３１．２５ｍｓの第１の被検体の持続時間ｔ_ａ１は、被検体τ_ａの立上がり時間（時間の前後で１２５ｍｓと測定）よりも短く、特にｔ_ａ１＝τ_ａ／４であり、第４のバッファーの持続時間ｔ_４ｂは、２５０ｍｓの最短のバッファーの持続時間ｔ_ｍｉｎであり、被検体τ_ａ’の立下がり時間（１５０ｍｓと測定）にほぼ対応する。

【0192】

最初に、参照の目的で、バッファーブランクを被検体として、単一のバイアルから４つ全てのフローセルに並行して、フローセルあたり１００μｌ／分の流速でバッファーと交互に注入し、対応する単一ブランク測定結合曲線および単一ブランク参照結合曲線をセンサーによって記録した（非表示）。次いで、６－ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（５’－ＣＡＧＴＧＣ－３’；１７９２Ｄａ）を、被検体として単一のバイアルから１００μＭの濃度で、４つのフローセル全てに、フローセルあたり１００μｌ／分の流速で並行してバッファー流体と交互に３回注入し（つまり、同じ測定を３回繰り返した）、対応する単一測定結合曲線および単一参照結合曲線をセンサーで記録した。次いで、バッファーで１％濃度に希釈したＤＭＳＯを、被検体として単一のバイアルから４つのフローセル全てに、フローセルあたり１００ｕｌ／分の流速で並行してバッファーと交互に注入し、対応する単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線をセンサーによって記録した（非表示）。次いで、調整された結合曲線（実線）が、単一測定結合曲線および単一参照結合曲線の各セットについて、上記のステップ（ｄ）ステップ１～８を使用して得られた。次いで、調整された結合曲線を使用し、上記のステップ（ｅ）を用いて、３つの調整された結合曲線のそれぞれについて、速度論的パラメータの会合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄを決定した。相互作用モデルに対する３つの結合曲線のフィッティングから決定された速度論的パラメータの平均および標準偏差は、ｋ_ａ＝５．９５±０．５３×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１、ｋ_ｄ＝２．３２±０．０９ｓ^－１、および２９．７±１．８ｐｇ／ｍｍ^２のＲ_ｍａｘであった。

【0193】

有利なことに、上記の例では、相互作用の速度論的パラメータは、わずか５秒の合計測定時間で決定されており、スクリーニングにおいて速度論的速度を決定する際のハイスループットを可能にした。

【0194】

さらなる好ましい実施形態では、系統誤差を補償するために、ニューラルネットワークが、所与の注入シーケンスパラメータのセットに対して所与の範囲の速度論的パラメータ、所与のタイミングパラメータのセットｔ_１、ｔ_２．．ｔ_Ｎおよびｔ_１’、ｔ_２’．．ｔ_Ｎ’および所与のストック濃度、ならびに誤差パラメータの偏差の範囲をカバーするシミュレーションデータを使用して訓練される。誤差パラメータには、有効流速、有効フローセル高さ、または有効拡散定数が含まれるが、これらに限定はされない。次いで、前記ニューラルネットワークを使用して、誤差パラメータ、ならびにオンレートおよびオフレートに関するスクリーニングからの結果が決定される。

【0195】

有利には、同じ注入シーケンス内で異なる流速で異なる注入パルスを操作することにより、物質移動効果を速度論的パラメータから区別することができる。

【0196】

有利には、本発明の方法の短い接触時間は、非特異的結合または凝集効果などによって、被検体がセンサー表面上のリガンドを損傷する可能性を低減する。
なお、本願は特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．被検体とリガンドとの間の反応の速度論的パラメータを決定するための方法であって、
（ａ）被検体の濃度（ｃ _ｏ ）を有するサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、第１の期間（ｔ _１ａ ）の間、前記のサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）中の被検体が試験表面（３）上の第１のリガンド（４）に結合できるように、流すステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の間に試験表面上の第１のリガンド（４）に結合した、サンプル流体の第１の体積（Ｖ１）からの被検体が、それらのリガンド（４）から解離するように、バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、第１の期間（ｔ _１ｂ ）の間、流すステップ；
（ｃ）少なくともサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）を、前記のサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）中の被検体が、試験表面（３）上の第１のリガンド（４）に結合できるように、前記試験表面上に、第２の期間（ｔ _２ａ ）の間、流すステップであって；第２の期間（ｔ _２ａ ）は第１の期間（ｔ _１ａ ）よりも長く、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）は、サンプル流体の第１の体積（Ｖ２）中の被検体の濃度（ｃ _ｏ ）と同じ被検体の濃度（ｃ _ｏ ）を有するステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）の間に試験表面上の第１のリガンド（４）に結合した、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）からの被検体が、それらの第１のリガンド（４）から解離するように、バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、第２の期間（ｔ _２ｂ ）の間、流すステップ；
（ｅ）センサーを使用してステップ（ａ）～（ｄ）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一測定結合曲線を得るステップ；
（ｆ）被検体の濃度（ｃ _ｏ ）を有するサンプル流体の第１の体積（Ｖ１）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、第１の期間（ｔ _１ａ ）の間、流すステップ；
（ｇ）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第１の期間（ｔ _１ｂ ）の間、流すステップ；
（ｈ）少なくともサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第２の期間（ｔ _２ａ ）の間、流すステップであって；第２の期間（ｔ _２ａ ）は第１の期間（ｔ _１ａ ）よりも長く、サンプル流体の第２の体積（Ｖ２）は、サンプル流体の第１の体積（Ｖ２）中の被検体の濃度（ｃ _ｏ ）と同じ被検体の濃度（ｃ _ｏ ）を有するステップ；
（ｉ）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、第２の期間（ｔ _２ｂ ）の間、流すステップ；
（ｊ）センサーを使用してステップ（ｆ）～（ｉ）の間の第１のリガンドを有さない試験表面（３）上での結合を測定して、単一参照結合曲線を得るステップ；
（ｋ）前記単一測定結合曲線と前記単一参照結合曲線を使用して速度論的パラメータを決定するステップ、
を含む方法。
２．前記方法が、第１のリガンド（４）が付着している第１の試験表面（３）を含む第１のフローセル（２）、および第１のリガンドを有さない第２の試験表面（３’）を含む第２のフローセル（２’）を使用して実行され；
ステップ（ａ）と（ｆ）が同時に実行され、ステップ（ｂ）と（ｇ）が同時に実行され、ステップ（ｃ）と（ｈ）が同時に実行され、ステップ（ｄ）と（ｉ）が同時に実行され、およびステップ（ｅ）と（ｊ）が同時に実行される、上記１に記載の方法。
３．前記方法が、試験表面を含む単一のフローセルを使用して実行され、単一のフローセルの前記試験表面は、最初は第１のリガンドを有さない状態にあり、および前記試験表面が第１のリガンドを有さない状態にある間に、前記ステップ（ｆ）～（ｊ）が、前記単一のフローセルを使用して実行され；
前記方法がさらに、ステップ（ｆ）～（ｊ）を実行した後、次いで、前記の単一のフローセルの試験表面上に第１のリガンド（４）を提供するステップ；
第１のリガンドが前記の単一のフローセルの試験表面上に提供された後、次いで、前記単一のフローセルを使用してステップ（ａ）～（ｅ）を実行するステップを含む、上記１に記載の方法。
４．さらに以下のステップ：
（ａ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップ；
（ｂ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１の期間（ｔ _１ｂ ）に等しい期間の間、流すステップ；
（ｃ’）少なくともサンプルバッファー流体の第２の体積（Ｖ _２Ｂ ）を、試験表面上に、ステップ（ｃ）の第２の期間（ｔ _２ａ ）に等しい第２の期間（ｔ _２Ｂ ）の間、流すステップ；
（ｄ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２の期間（ｔ _２ｂ ）に等しい第２の期間の間、流すステップ；
（ｅ’）センサーを使用してステップ（ａ’）～（ｄ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク測定結合曲線を得るステップ；
（ｆ’）サンプルバッファー流体の第１の体積（Ｖ _１Ｂ ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップ；
（ｇ’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３）上に、ステップ（ｆ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間の間、流すステップ；
（ｈ’）少なくともサンプル流体の第２の体積（Ｖ２）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の期間（ｔ _２ａ ）と等しい第２の期間（ｔ _１Ｂ ）の間、流すステップ；
（ｉ’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２の期間（ｔ _２ｂ ）と等しい第２の期間の間、流すステップ；
（ｊ’）センサーを使用してステップ（ｆ’）～（ｉ’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一ブランク参照結合曲線を得るステップ、
を含む、上記１～３のいずれか一つに記載の方法。
５．（ａ’’）屈折率標準流体の第１の体積（Ｖ _１ｓ ）を、第１のリガンド（４）が付着しているフローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ａ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１ｓ ）の間、流すステップ；
（ｂ’’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｂ）の第１の期間（ｔ _１ｂ ）に等しい期間の間、流すステップ；
（ｃ’’）少なくとも屈折率標準流体の第２の体積（Ｖ _２ｓ ）を、試験表面上に、ステップ（ｃ）における第２の期間（ｔ _２ａ ）に等しい第２の期間（ｔ _２ｓ ）の間、流すステップ；
（ｄ’’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、フローセル（２）の試験表面（３）上に、ステップ（ｄ）の第２の期間（ｔ _２ｂ ）に等しい第２の期間の間、流すステップ；
（ｅ’’）センサーを使用してステップ（ａ’’）～（ｄ’’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一溶媒測定結合曲線を得るステップ；
（ｆ’’）屈折率標準流体の第１の体積（Ｖ _１ｓ ）を、第１のリガンドを有さないフローセル（２’）の試験表面（３’）上に、ステップ（ｆ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間（ｔ _１ｓ ）の間、流すステップ；
（ｇ’’）バッファー溶液の第１の体積（Ｖ１’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３）上に、ステップ（ｆ）の第１の期間（ｔ _１ａ ）と等しい期間の間、流すステップ；
（ｈ’’）少なくとも屈折率標準流体の第２の体積（Ｖ _２ｓ ）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｈ）の第２の期間（ｔ _２ａ ）と等しい第２の期間（ｔ _１ｓ ）の間、流すステップ；
（ｉ’’）バッファー溶液の第２の体積（Ｖ２’）を、第１のリガンドを有さない試験表面（３’）上に、ステップ（ｉ）の第２の期間（ｔ _２ｂ ）と等しい第２の期間の間、流すステップ；
（ｊ’’）センサーを使用してステップ（ｆ’’）～（ｉ’’）の間の試験表面（３）上での結合を測定して、単一溶媒参照結合曲線を得るステップ、
をさらに含む、上記４に記載の方法。
６．ステップ（ｋ）が、
単一測定結合曲線（ｓｍｂｃ）から単一参照結合曲線（ｓｒｂｃ）を引いて、差分曲線を提供するステップ；
単一ブランク測定結合曲線（ｓｂｍｂｃ）から単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）を引いて、ブランク差シグナルを提供するステップ；
差分曲線からゼロ化時間ｔｙでの差分曲線の平均ｙ値を引くことにより、差分曲線をｙ軸に関してゼロ化して、ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）を提供するステップ；
ブランク差シグナルからゼロ化時間ｔｙでのブランク差シグナルの平均ｙ値を引くことにより、ブランク差シグナルをｙ軸に関してゼロ化して、ゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）を提供するステップ；
ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）からゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）を引いて、調整された結合曲線（ａｂｃ）を提供するステップ；
前記の調整された結合曲線を使用して前記速度論的パラメータを決定するステップ、
を含む、上記５に記載の方法。
７．ステップ（ｋ）が、
単一測定結合曲線（ｓｍｂｃ）から単一参照結合曲線（ｓｒｂｃ）を引いて、差分曲線を提供するステップ；
単一ブランク測定結合曲線（ｓｂｍｂｃ）から単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）を引いて、ブランク差シグナルを提供するステップ；
単一溶媒測定結合曲線（ｓｓｍｂｃ）から単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）を引いて、溶媒差シグナルを提供するステップ；
差分曲線からゼロ化時間ｔｙでの差分曲線の平均ｙ値を引くことにより、差分曲線をｙ軸に関してゼロ化して、ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）を提供するステップ；
ブランク差シグナルからゼロ化時間ｔｙでのブランク差シグナルの平均ｙ値を引くことにより、ブランク差シグナルをｙ軸に関してゼロ化して、ゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）を提供するステップ；
溶媒差シグナルからゼロ化時間ｔｙでの溶媒差シグナルの平均ｙ値を引くことにより、溶媒差シグナルをｙ軸に関してゼロ化し、ゼロ化された単一溶媒結合曲線（ｚｓｓｂｃ）を生成するステップ；
溶媒補正単一ブランク結合曲線（「ｓｃｓｂｂｃ」）および溶媒補正単一結合曲線（「ｓｃｓｂｃ」）を提供するように溶媒補正を実行するステップ；
溶媒補正単一結合曲線（「ｓｃｓｂｃ」）から溶媒補正単一ブランク結合曲線（「ｓｃｓｂｂｃ」）を引いて、調整された結合曲線（ａｂｃ）を提供するステップ；
前記の調整された結合曲線を使用して前記速度論的パラメータを決定するステップ、
を含む、上記５に記載の方法。
８．前記溶媒補正が、
（ｉ）最初に、単一溶媒測定結合曲線（ｓｓｍｂｃ）から単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）を引くことによって溶媒差分曲線（「ｓｄｃ」）を決定し；次いで、溶媒時間ｔｓにおける溶媒差分曲線の平均値を決定することによって、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）を決定するステップであって、溶媒時間ｔｓにおける溶媒差分曲線の平均値が平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）である、ステップ；
（ｉｉ）溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線（ｓｒｂｃ）の平均値を決定するステップ；
（ｉｉｉ）上記５のステップを繰り返して、複数の異なる単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線を提供し；前記複数の異なる単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線のそれぞれについて、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返して、単一溶媒参照結合曲線の平均値（ｓｒｂｃ _ｉ ）を含むセットおよび平均溶媒差（ｓｄｉｆｆ _ｉ ）のセットを生成する、ステップ；
（ｉｖ）前記セットを介してｓｄｉｆｆ＝ｆｓ（ｓｒｂｃ）を近似するように多項式関数をフィッティングすることにより、溶媒補正関数（ｆｓ）を決定するステップ；
（ｖ）溶媒補正関数（ｆｓ）を単一参照結合曲線（ｓｒｂｃ）に適用し、下式の通り、ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）からそれを引くことにより、溶媒補正単一結合曲線（ｓｃｓｂｃ）を得るステップ：
ｓｃｓｂｃ＝ｚｓｂｃ－ｆｓ（ｓｒｂｃ）；
（ｖｉ）溶媒補正関数（ｆｓ）を単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）に適用し、下式の通り、その結果をゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）から引くことにより、溶媒補正単一ブランク結合曲線（ｓｃｓｂｂｃ）を得るステップ：
ｓｃｓｂｂｃ＝ｚｓｂｂｃ－ｆｓ（ｓｂｒｂｃ）
を含む、上記７に記載の方法。
９．前記溶媒補正が、
（ｉ）溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒測定結合曲線（「ｓｍｂｃ」）の平均値を決定するステップ；
（ｉｉ）溶媒時間ｔｓにおける単一溶媒参照結合曲線（「ｓｒｂｃ」）の平均値を決定するステップ；
（ｉｉｉ）以下の式に従って、単一溶媒測定結合曲線（「ｓｍｂｃ」）の平均値から単一溶媒参照結合曲線（「ｓｒｂｃ」）の平均値を引くことにより、平均溶媒差（「ｓｄｉｆｆ」）を決定するステップ：
ｓｄｉｆｆ＝ｓｍｂｃ－ｓｒｂｃ
（ｉｖ）上記５のステップを繰り返して、複数の異なる単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線を提供し；前記複数の異なる単一溶媒測定結合曲線および単一溶媒参照結合曲線のそれぞれについて、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を繰り返して、単一溶媒参照結合曲線の平均値（ｓｒｂｃ _ｉ ）を含むセットおよび平均溶媒差（ｓｄｉｆｆ _ｉ ）のセットを生成する、ステップ；
（ｖ）前記セットを介してｓｄｉｆｆ＝ｆｓ（ｓｒｂｃ）を近似するように多項式関数をフィッティングすることにより、溶媒補正関数（ｆｓ）を決定するステップ；
（ｖｉ）溶媒補正関数（ｆｓ）を単一参照結合曲線（ｓｒｂｃ）に適用し、下式の通り、ゼロ化された単一結合曲線（ｚｓｂｃ）からそれを引くことにより、溶媒補正単一結合曲線（ｓｃｓｂｃ）を得るステップ：
ｓｃｓｂｃ＝ｚｓｂｃ－ｆｓ（ｓｒｂｃ）；
（ｖｉｉ）溶媒補正関数（ｆｓ）を単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）に適用し、下式の通り、その結果をゼロ化された単一ブランク結合曲線（ｚｓｂｂｃ）から引くことにより、溶媒補正単一ブランク結合曲線（ｓｃｓｂｂｃ）を得るステップ：
ｓｃｓｂｂｃ＝ｚｓｂｂｃ－ｆｓ（ｓｂｒｂｃ）
を含む、上記７に記載の方法。
１０．溶媒補正関数（ｆｓ）を単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）に適用し、下式の通り、その結果をゼロ化された単一溶媒結合曲線（ｚｓｓｂｃ）から引くことにより、溶媒補正単一溶媒結合曲線（ｓｃｓｓｂｃ）を得るステップ：
ｓｃｓｓｂｃ＝ｚｓｓｂｃ－ｆｓ（ｓｓｒｂｃ）
をさらに含む、上記８または９に記載の方法。
１１．調整された結合曲線を使用して前記速度論的パラメータを決定するステップが、調整結合曲線にモデルをフィッティングさせるステップであって、調整結合曲線に最もよくフィットするモデルの速度論的パラメータが、サンプル流体の第１および第２の体積（Ｖ１、Ｖ２）中の被検体と、第１のフローセルの第１の試験表面上の第１のリガンドとの間の反応の前記速度論的パラメータとして採用されるステップを含む、上記６～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．上記７～１０のいずれか一つに従属する場合、調整された結合曲線にモデルをフィッティングさせる前記ステップが、
単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）から単一ブランク参照結合曲線（ｓｂｒｂｃ）を引くことにより、調整された溶媒曲線（ａｓｃ）を決定し；ブランク差シグナルからゼロ化時間ｔｙでの調整された溶媒曲線（ａｓｃ）の平均ｙ値を引くことにより、調整された溶媒曲線（ａｓｃ）をｙ軸に関してゼロ化して、ゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）を提供するステップ；
ゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）をゼロ化された調整された溶媒曲線（ｚａｓｃ）の平均最大値で割って、正規化された溶媒曲線を得、正規化された溶媒曲線に、サンプル流体体積の第１および第２の体積（Ｖ１、Ｖ２）中に存在した被検体の濃度ｃ _０ を掛けることにより、単一濃度曲線を決定するステップ；
単一濃度曲線を変数「ｃ」として使用し、変数Ｒｍａｘならびにパラメータｋａおよびｋｄの初期推定値を仮定して、微分方程式を積分して、シミュレートされた結合曲線（ｓｂｃ）を生成するステップ：

【数6】

シミュレートされた結合曲線（ｓｂｃ）のカイ二乗（χ ^２ ）を決定するステップ；
カイ二乗（χ ^２ ）を最小化して、調整結合曲線に最もよくフィットするシミュレートされた結合曲線を見つけるステップであって；調整結合曲線に最もよくフィットするシミュレートされた結合曲線の速度論的パラメータが、被検体と第１のリガンドとの間の前記反応の前記速度論的パラメータとして採用されるステップ、
を含む、上記１１に記載の方法。
１３．上記６に従属する場合、調整結合曲線にモデルをフィッティングさせる前記ステップが、
単一溶媒参照結合曲線（ｓｓｒｂｃ）を変数「ｃ」として使用し、変数Ｒｍａｘならびにパラメータｋａおよびｋｄの初期推定値を仮定して、微分方程式を積分して、シミュレートされた結合曲線（ｓｂｃ）を生成するステップ：

【数7】

シミュレートされた結合曲線（ｓｂｃ）のカイ二乗（χ ^２ ）を決定するステップ；
カイ二乗（χ ^２ ）を最小化して、調整結合曲線に最もよくフィットするシミュレートされた結合曲線を見つけるステップであって；調整結合曲線に最もよくフィットするシミュレートされた結合曲線の速度論的パラメータが、サンプル流体の第１および第２の体積（Ｖ１、Ｖ２）中の被検体と、第１のフローセルの第１の試験表面上の第１のリガンドとの間の前記反応の前記速度論的パラメータとして採用されるステップ
を含む、上記１１に記載の方法。
１４．前記方法が、第１のリガンド（４）が付着している第１の試験表面（３）を含む第１のフローセル（２）、および第１のリガンドを有さない第２の試験表面（３’）を含む第２のフローセル（２’）を使用して実行され；
ステップ（ａ’）と（ｆ’）が同時に実行され、ステップ（ｂ’）と（ｇ’）が同時に実行され、ステップ（ｃ’）と（ｈ’）が同時に実行され、ステップ（ｄ’）と（ｉ’）が同時に実行され、およびステップ（ｅ’）と（ｊ’）が同時に実行される、
上記４に記載の方法。
１５．前記方法が、試験表面を含む単一のフローセルを使用して実行され、単一のフローセルの前記試験表面は、最初は第１のリガンドを有さない状態にあり、および試験表面が第１のリガンドを有さない状態にある間に、前記ステップ（ｆ’）～（ｊ’）が、前記単一のフローセルを使用して実行され；
前記方法がさらに、ステップ（ｆ’）～（ｊ’）を実行した後、次いで、単一のフローセルの試験表面上に第１のリガンド（４）を提供するステップ；
第１のリガンドが単一のフローセルの試験表面上に提供された後、次いで、前記単一のフローセルを使用してステップ（ａ’）～（ｅ’）を実行するステップを含む、
上記４に記載の方法。
１６．前記方法が、第１のリガンド（４）が付着している第１の試験表面（３）を含む第１のフローセル（２）、および第１のリガンドを有さない第２の試験表面（３’）を含む第２のフローセル（２’）を使用して実行され；
ステップ（ａ’’）と（ｆ’’）が同時に実行され、ステップ（ｂ’’）と（ｇ’’）が同時に実行され、ステップ（ｃ’’）と（ｈ’’）が同時に実行され、ステップ（ｄ’’）と（ｉ’’）が同時に実行され、およびステップ（ｅ’’）と（ｊ’’）が同時に実行される、
上記５に記載の方法。
１７．前記方法が、試験表面を含む単一のフローセルを使用して実行され、単一のフローセルの前記試験表面は、最初は第１のリガンドを有さない状態にあり、試験表面が第１のリガンドを有さない状態にある間に、前記ステップ（ｆ’’）～（ｊ’’）が、前記単一のフローセルを使用して実行され；
前記方法がさらに、ステップ（ｆ’’）～（ｊ’’）を実行した後、引き続き、単一のフローセルの試験表面上に第１のリガンド（４）を提供するステップ；
第１のリガンドが単一のフローセルの試験表面上に提供された後、引き続き、前記単一のフローセルを使用してステップ（ａ’’）～（ｅ’’）を実行するステップを含む、
上記５に記載の方法。
１８．フローセルの試験表面上を流されるサンプル流体の前記各体積のそれぞれが、同じ単一のレセプタクルから吸引される、上記１～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．ステップ（ａ）～（ｋ）が実行される前に、フローセルの試験表面上を流されるサンプル流体の前記各体積の全てが、同じ単一のレセプタクルから吸引される、上記１～１８のいずれか一つに記載の方法。
２０．フローセルの試験表面上に、全て被検体の同じ濃度（ｃ _ｏ ）を有する、サンプル流体の複数の体積を流すステップを含み；サンプル流体の各体積がフローセルの試験表面上を流れる持続時間が、サンプル流体の１つの体積から次の体積までに増加する、上記１～１９のいずれか一つに記載の方法。
２１．サンプル流体の複数の体積のうち最初のものがフローセルの試験表面上を流される時間の持続時間が最も短い持続時間となり、サンプル流体の複数の体積のうちの最後のものがフローセルの試験表面上を流される時間の持続時間が最も長い持続時間となるように、サンプル流体の各体積がフローセルの試験表面上を流れる持続時間が、サンプル流体の１つの体積から次の体積までに増加する、上記２０に記載の方法。
２２．サンプル流体の各体積がフローセルの試験表面上を流れる持続時間が、サンプル流体の１つの体積から次の体積までに指数関数的に増加する、上記２０または２１に記載の方法。
２３．サンプル流体のそれぞれの各体積がフローセルの試験表面上を流れた後、フローセルの試験表面上にバッファー溶液の１つの体積を流すことが、フローセルの試験表面上にサンプル流体の前記各体積が流される間に試験表面上の第１のリガンドに結合した被検体が、それら第１のリガンドから解離することを引き起こし、ただし、バッファー溶液の第１の体積がフローセルの試験表面上を流される持続時間が最も短い持続時間となり、バッファー溶液の最後の体積がフローセルの試験表面上を流される持続時間が最も長い持続時間となるように、バッファー溶液の各体積が試験表面上を流れる持続時間が、バッファー溶液の１つの体積から次の体積までに増加する、上記２０～２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．バッファー溶液の１つの体積が試験表面上を流れる最も短い持続時間が、被検体τ _ａ ’の立下がり時間の３倍よりも短く、被検体τ _ａ ’の立下がり時間は、バッファー溶液の前記体積の注入を開始してから、フローセルの試験表面における被検体の濃度が、サンプル流体の１つの体積中の被検体の濃度の５％以下である平均濃度に低下した時間までの時間である、上記２３に記載の方法。
２５．単一測定結合曲線が、第１のリガンドに結合した被検体の量が、事前定義された閾値を下回ることを指し示すかどうかを同定するステップ；ならびに、第１のリガンドに結合した被検体の量が、事前定義された閾値を下回らない場合、単一測定結合曲線が、第１のリガンドに結合した被検体の量が事前定義された閾値を下回ることを指し示すまで、バッファー溶液の最後の体積がフローセルの試験表面上を流される持続時間を増やすステップをさらに含む、上記１～２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．サンプル流体の第１の体積が試験表面上を流される前記第１の期間が被検体τ _ａ の立上がり時間よりも短く、被検体τ _ａ の立上がり時間は、被検体のフローセルへの注入の開始から、フローセルの試験表面における被検体の濃度が、サンプル流体の第１の体積中の被検体の濃度の９５％以上である平均濃度に達した時間までの時間である、上記１～２５のいずれか一つに記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】