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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-24
(45)【発行日】2024-07-02
(54)【発明の名称】アネキシンＡ５の用途
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240625BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240625BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240625BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240625BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240625BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61P9/10
A61P43/00 105
A61K45/00
A61P43/00 121
A61P37/06
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022513985
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-11
(86)【国際出願番号】 CN2020112217
(87)【国際公開番号】W WO2021037230
(87)【国際公開日】2021-03-04
【審査請求日】2022-02-28
(31)【優先権主張番号】201910815496.0
(32)【優先日】2019-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522078392
【氏名又は名称】蘇州亜宝薬物研発有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】楊磊
(72)【発明者】
【氏名】連国寧
(72)【発明者】
【氏名】高暁平
(72)【発明者】
【氏名】朱琳
(72)【発明者】
【氏名】王川
(72)【発明者】
【氏名】朱桃桃
(72)【発明者】
【氏名】王星星
(72)【発明者】
【氏名】ヂゥオ，ラン
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－２５４９９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２０５７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０２９１０８６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５００３６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５０６５９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１８５０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０２５８５８４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１５２５１３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１７９４３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Peptides, 2002, Vol.23, pp.1249-1263
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ４５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＦＡＳＴＡ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬物の調製におけるアネキシンＡ５の使用方法であって、前記薬物は血液脳関門の損傷の予防及び／又は治療に使用される、使用方法。
【請求項2】
前記血液脳関門の損傷は、血漿と脳細胞及び／又は脳脊髄液との間の関門の損傷、破裂又は障害から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項3】
前記血液脳関門の損傷は、毛細血管壁と神経膠細胞で形成される血漿と脳細胞との間の関門の損傷及び／又は脈絡叢で形成される血漿と脳脊髄液との間の関門の損傷から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項4】
前記血液脳関門の損傷は、脳卒中又は頭蓋骨損傷に起因する血液脳関門の損傷である、請求項１に記載の使用方法。
【請求項5】
前記血液脳関門の損傷は、外力に起因する頭蓋脳外傷から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項6】
前記薬物は、損傷した血液脳関門を修復するために用いられる、請求項１に記載の使用方法。
【請求項7】
前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するヒトアネキシンＡ５ポリペプチド又はその変異体から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項8】
前記アネキシンＡ５は、原核生物発現系により発現される組換えヒトアネキシンＡ５から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項9】
前記アネキシンＡ５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される、請求項７に記載の使用方法。
【請求項10】
前記薬物は、注射剤である、請求項１に記載の使用方法。
【請求項11】
単位剤形の前記薬物における前記アネキシンＡ５の含有量は、０．０２５ｍｇ～２５０ｍｇである、請求項１０に記載の使用方法。
【請求項12】
単位剤形の前記薬物における前記アネキシンＡ５の含有量は、１～１００ｍｇである、請求項１０に記載の使用方法。
【請求項13】
前記薬物が、
（ｉ）アネキシンＡ５と、
（ｉｉ）他の薬物と、の混合物を含む組合せであって、
前記他の薬物は、アネキシンＡ５以外の活性成分から選択され、前記活性成分は、脳卒中、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況から選択される疾患又は状況を予防及び／又は治療するために使用される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項14】
前記脳卒中を治療する他の薬物は、血栓溶解薬、抗血小板薬、抗凝血薬、抗線維薬、容量拡張薬、血管拡張薬又は他の脳血液循環の改善用薬物及び神経保護剤の少なくとも１つから選択される、請求項１３に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本願は、２０１９年８月３０日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号が２０１９１０８１５４９６．０で、名称が「脳卒中の治療におけるアネキシンＡ５の用途」の先行出願の優先権を主張し、上記先行出願の全文は援用により本願に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は生物医薬分野に関し、具体的にはアネキシンＡ５の用途に関する。
【背景技術】
【0003】
アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）は、カルシウムイオン依存性リン脂質結合タンパク質ファミリーであり、広く発現され、様々な重要な機能を有する。一部のアネキシン、例えばアネキシンＡ１は、腫瘍と密接に関連しており、膵臓がん、肝臓がん、頭頸部腫瘍において高度に発現される。一部のアネキシン、例えばアネキシンＡ５（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ５、又はＡ５）は、抗炎症及び抗凝血などの機能を有する。膜タンパク質Ａ５は、１９７０年にヒト胎盤に最初に見出され、その遺伝子が染色体４ｑ２６～ｑ２８に位置し、１３個のエキソン及び１２個のイントロンを有する。アネキシンＡ５は、カルシウムイオン依存性の、負に帯電したリン脂質表面に結合できるチャネルタンパク質として、分子量が約３４ ｋＤａ程度であり、主に細胞膜及び小胞体膜上に存在し、その大きな分子量により脳組織に一般的に入らないため、神経系関連の研究ではあまり注目されていない。
【0004】
「脳卒中」（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｔｒｏｋｅ）は、「卒中」、「脳血管障害」（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｃｃｉｄｅｎｔ，ＣＶＡ）とも呼ばれ、急性脳血管疾患である。当該疾患は、主に脳部血管の急な破裂、又は血管閉塞により血液が脳部及び一部の組織に流入できないことによる脳組織損傷に起因し、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中を含む。そのうち、虚血性脳卒中の発症率は、出血性脳卒中よりも高く、脳卒中の総数の６０％～７０％を占める。臨床研究から、様々な要因により脳卒中が誘発されることを示した。脳卒中は、発症率、後遺障害率、再発率、死亡率がいずれも高いという特性を有するため、その薬物治療に対して、更に新しい治療剤を開発し、治療効果を改善する必要がある。
【0005】
なお、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化などの疾患又は状況に対する治療方法にも更なる改善が求められており、新しい治療剤の開発が急務とされている。
【0006】
アネキシンＡ５の構造研究の結果が明らかになっているが、その機能及び応用への研究はまだ、研究者によって絶えず探求され、実験によって開発及び実証されることが期待されている。それと同時に、当該タンパク質を疾患の予防及び／又は治療に用いられる時の安全性を更に考慮する必要がある。
【発明の概要】
【0007】
上記技術問題を改善するために、本発明は、脳卒中、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況の予防及び／又は治療におけるアネキシンＡ５の用途を提供する。
【0008】
本発明の実施形態によれば、本発明は、上記疾患又は状況及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況を予防及び／又は治療するための薬物の調製におけるアネキシンＡ５の用途を提供する。
【0009】
本発明の実施形態によれば、前記神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化は、脳卒中又は他の原因に起因する前記疾患又は状況から選択されてもよい。
【0010】
本発明の実施形態によれば、前記脳卒中は、虚血性脳卒中又は出血性脳卒中から選択され、例えば、急性期及び／又は回復期の虚血性脳卒中、並びに急性期及び／又は回復期の出血性脳卒中、特に急性虚血性脳卒中又は急性期にある虚血性脳卒中から選択される。
【0011】
本発明の実施形態によれば、前記神経行動学的障害は、肢体麻痺及び／又は肢体無力を含むが、それらに限定されない。
【0012】
本発明の実施形態によれば、前記神経変性疾患は、急性神経変性疾患及び／又は慢性神経変性疾患を含み、例えば、脳虚血（ＣＩ）、脳損傷（ＢＩ）、癲癇といった急性神経変性疾患から選択され、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、異なる病型の脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、Ｐｉｃｋ病といった慢性神経変性疾患から選択される。
【0013】
本発明の実施形態によれば、前記神経損傷は、例えば脳外傷、脳血管硬化、脳炎、髄膜炎、脱髄疾患などの脳血管疾患に起因する脳神経損傷；例えば嗅覚神経損傷、視覚神経損傷、聴覚神経損傷、味覚神経損傷などの認知神経損傷；及び顔面神経損傷から選択される。
【0014】
本発明の実施形態によれば、前記神経損傷は、酸素グルコース欠乏又は興奮毒性に起因する脳神経損傷であってもよい。
【0015】
本発明の実施形態によれば、神経変性疾患、神経損傷又はそれに起因する疾患又は状況は、気分障害、うつ病、大うつ病性障害、産後うつ病、双極性障害に関するうつ病、アルツハイマー病、精神病、パーキンソン病、ハンチントン病、不安障害、全般性不安障害、社会不安障害、強迫性障害、パニック障害、パニック発作、恐怖症、社会恐怖症、広場恐怖症、尿失禁、嘔吐、部分応答、治療抵抗性うつ病、認知障害、記憶力の低下、ＡＤＨＤ（注意欠陥及び多動性障害）、気分変調症又はＰＴＳＤ（心的外傷後ストレス障害）から選択される。
【0016】
本発明の実施形態によれば、前記脳内免疫細胞の過剰な活性化における「脳内免疫細胞」という用語は、中枢神経系（ＣＮＳ）免疫反応性細胞、特に小膠細胞を含む。
【0017】
本発明の実施形態によれば、前記血液脳関門の損傷は、血漿と脳細胞及び／又は脳脊髄液との間の関門の損傷、破裂又は障害、例えば、毛細血管壁と神経膠細胞で形成される血漿と脳細胞との間の関門の損傷及び／又は脈絡叢で形成される血漿と脳脊髄液との間の関門の損傷から選択されるものを含む。前記血液脳関門の損傷は、上記疾患又は状況に起因してもよく、頭蓋骨損傷（例えば、頭蓋が外力によって打撃されることによる頭蓋脳外傷）による血液脳関門の損傷であってもよい。
【0018】
本発明の実施形態によれば、前記脳浮腫とは、脳内の水分が増加し、脳容積が増大する病理学的現象を意味し、頭蓋内高血圧を誘発し、脳組織を損傷することが可能である。脳浮腫は、頭蓋骨損傷、血液脳関門の損傷、微小循環障害、脳出血、脳虚血、脳低酸素又は他の原因に起因する脳浮腫から選択されてもよい。
【0019】
本発明の実施形態によれば、前記カルシウムイオン含有量の増加とは、脳組織中のカルシウムイオン濃度が上昇し、正常範囲を超えることを意味する。
【0020】
本発明の実施形態によれば、前記興奮毒性は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸により誘発される興奮毒性である。
【0021】
本発明の実施形態によれば、前記ＮＯＳの過剰な活性化とは、ＮＯＳの活性化によるＮＯの過剰合成を意味する。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化は、脳卒中により誘発されてもよい。従って、前記アネキシンＡ５又はそれにより調製される薬物の用途が脳卒中の予防又は治療に関わる場合、前記アネキシンＡ５の用途は、以下の技術的特徴を更に含むことができる。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態において、前記脳卒中は、虚血性脳卒中、特に急性虚血性脳卒中又は急性期にある虚血性脳卒中である。よって、アネキシンＡ５は、例えば、肢体麻痺及び無力などの、虚血性脳卒中による神経行動学的障害を改善し、脳梗塞面積を減少させ、虚血性脳卒中を治療する目的を達成することができる。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態において、前記脳卒中は、脳内免疫細胞の過剰な活性化を伴う。アネキシンＡ５によって脳内免疫細胞の過剰な活性化を抑制することができ、それにより、脳内免疫細胞の過剰な活性化による神経損傷を緩和し、脳卒中を治療することができる。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態において、前記脳卒中は、脳神経損傷を伴う。アネキシンＡ５は、脳部において神経保護剤の機能を発揮し、脳部の神経損傷を修復し、脳卒中を治療することができる。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態において、前記脳卒中は、損傷した血液脳関門を伴う。アネキシンＡ５は、損傷した血液脳関門を修復し、脳部に対する更なる損傷を回避し、脳卒中を治療することができる。
【0027】
本発明のいくつかの実施形態において、前記免疫細胞は小膠細胞である。小膠細胞の過剰な活性化により、大量の神経毒性因子を放出し、神経変性疾患の発生を引き起こすが、アネキシンＡ５は、小膠細胞の過剰な活性化を抑制することができる。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態において、前記神経損傷は、酸素グルコース欠乏による脳神経損傷である。アネキシンＡ５は、酸素グルコース欠乏による脳神経損傷を軽減することができる。脳内低酸素又はグルコース減少により、神経損傷を誘発するが、アネキシンＡ５は、酸素グルコース欠乏による神経損傷を軽減し、脳卒中を治療することができる。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態において、前記神経損傷は、興奮毒性により誘発される脳神経損傷である。興奮毒性により脳組織内のカルシウムイオン含有量を増加させることができ、ＮＯＳが大量に活性化され、大量のＮＯの合成などの一連の生理学的又は病理学的変化を引き起こし、脳神経損傷を誘発するが、アネキシンＡ５は、前記神経損傷を修復し、脳卒中を治療することができる。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態において、前記興奮毒性は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸により誘発される興奮毒性である。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、脳内免疫細胞の過剰な活性化を抑制することができる。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、脳神経損傷を修復することができる。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、損傷した血液脳関門を修復することができる。
【0034】
当業者であれば、前記神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化は、脳卒中以外の他の原因に起因してもよいことを理解すべきである。例えば、頭蓋骨外傷により誘発される血液脳関門の損傷である。
【0035】
本発明の実施形態によれば、前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するヒトアネキシンＡ５ポリペプチド又はその変異体であってもよいが、それらに限定されない。天然単離物又は組換え又は合成源又はこれらの適切な組み合わせなどの任意の供給源又は方法によってＡ５ポリペプチドを提供することができる。アネキシンＡ５のポリペプチド配列は、完全的に又は部分的に天然に存在するアミノ酸配列又はこれらの完全的に又は部分的に天然に存在するアミノ酸配列の変異体に基づいてもよい。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、ヒトの天然のアネキシンＡ５である。本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、原核生物発現系により発現される組換えヒトアネキシンＡ５である。よって、原核生物発現系により、所望の組換えヒトアネキシンＡ５を速やかで効率的に取得することができ、コストが高くない。また、それは、免疫毒性を持たず、非常に低い免疫原性を有し、且つラット及びカニクイザルの両方において、アネキシンＡ５の耐量が４５００ μｇ／ｋｇ以上に達し、ラットにおいて９０００ μｇ／ｋｇ以上にも達し、安全性が良好であり、高い用量で投与される場合でも、薬物使用のリスクをもたらさず、脳卒中のような急性の脳血管疾患に対し、重要な治療的意義を有することが検証される。本発明のいくつかの実施形態において、原核生物発現系により発現される前記アネキシンＡ５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列は、天然のヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列と一致し、前記配列のＮ末端アミノ酸がアラニン（Ａ）であるのに対し、天然のヒトアネキシンＡ５のＮ末端がアセチル化アラニンであるという点のみで異なり、効率的で速やかに取得することができ、また、安全性が非常に良好であり、高い用量で投与される場合でも、薬物使用のリスクをもたらさず、前記疾患又は状況の予防及び／又は治療に対して重要な価値を有することが証明される。
【0037】
研究により、アネキシンＡ５は、配列保存を有し、異なる種で相同性が高く、類似又は同一の機能を発揮し、相同性が高いか又は配列保存を有するこれらのアネキシンＡ５は、脳卒中の治療又は脳卒中を治療する薬物の調製に用いられることができることが見出された。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、天然のヒトアネキシンＡ５と比べ、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と比べ、相同性が９６％以上であり、例えば９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．３％以上、９８．５％以上、９８．８％以上、９９％以上、９９．３％以上、９９．５％以上である。本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と比べ、１つの保存的アミノ酸置換を生じさせ、２つの保存的アミノ酸置換を生じさせ、３つの保存的アミノ酸置換を生じさせ、４つの保存的アミノ酸置換を生じさせ、又は５つの保存的アミノ酸置換を生じさせる。高相同性又は保存的アミノ酸置換を示すこれらのアネキシンＡ５は、人工的に設計されることで合成されてもよく、自然界に天然に存在するアネキシンＡ５によって分離又は合成されてもよい。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態において、前記薬物は、注射剤などの製剤の形態である。単位剤形の前記薬物におけるアネキシンＡ５の含有量は０．０２５ ｍｇ～２５０ ｍｇである。アネキシンＡ５の日用量が約０．０５ ｍｇ～５００ ｍｇであることを考慮し、薬物の調製中に、単位剤形の薬物におけるアネキシンＡ５の含有量を０．０２５ ｍｇ～２５０ ｍｇの間に適応的に調整することができ、例えば、０．１～５０ ｍｇの間、０．１～１００ ｍｇの間、０．１～２００ ｍｇ、又は０．１～２５０ ｍｇの間、又は１～５０ ｍｇの間、１～１００ ｍｇ、１～２００ ｍｇ又は１～２５０ ｍｇの間であってもよく、好ましくは、１～１００ ｍｇの間、例えば１ ｍｇ、１０ ｍｇ、２０ ｍｇ、３０ ｍｇ、４０ ｍｇ、５０ ｍｇ、６０ ｍｇ、７０ ｍｇ、８０ ｍｇ、９０ ｍｇ又は１００ ｍｇであってもよい。アネキシンＡ５製剤を調製することにより、前記疾患又は状況の治療を実現することができ、且つ安全性が良好であり、毒性及び副作用がない。単位剤形（又は単位用量）の薬物とは、薬物が異なる剤形に調製される時に設計された１つの単位を指す。例えば、錠剤に設計され、錠剤の大きさが４００ ｍｇに設計されると、４００ ｍｇは、単位剤形の薬物である。更に例えば、薬物は、注射剤として設計され、各注射剤の個別包装は、単位剤形の薬物である。通常、単位剤形の薬物は、１日の日用量であるか、又は半日の日用量である。これらの単位剤形の薬物におけるアネキシンＡ５の含有量は、０．０２５～２５０ ｍｇの間で変動してもよく、他の薬学的に利用可能な担体と更に組み合わせ、単位剤形の薬物に調製される。
【0039】
これらの「薬学的に受容可能な担体」は、生理学的に適合する任意の又は全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含むことができる。具体的な実例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、グルコース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組成物の１つ又は複数であってもよい。多くの場合、例えば糖類、ポリオール（例えばマンニトール、ソルビトール）又は塩化ナトリウムなどの一部の等張化剤であってもよい。当然、薬学的に受容可能な担体は、抗体の保存期間又は効力を延長するために、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤などの微量の補助物質を更に含んでもよい。
【0040】
本発明は、脳卒中、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況から選択される疾患又は状況を予防及び／又は治療するために用いられる、アネキシンＡ５を含む薬物を更に提供する。
【0041】
本発明は、アネキシンＡ５と他の薬物とを含む医薬的連合体を更に提供する。
【0042】
本発明の実施形態によれば、前記他の薬物は、アネキシンＡ５以外の薬物、例えば、脳卒中、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況から選択される疾患又は状況を予防及び／又は治療するための活性成分から選択される。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態において、脳卒中を予防及び／又は治療するための他の薬物は、血栓溶解薬、抗血小板薬、抗凝血薬、抗線維薬、容量拡張薬、血管拡張薬又は他の脳血液循環の改善用薬物及び神経保護剤の少なくとも１つから選択されてもよい。これらの薬物と組み合わせて投与することにより、脳卒中の多角度及び多段階の治療を実現し、脳卒中を迅速に治療することができる。
【0044】
本発明は、患者に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含み、前記疾患又は状況が脳卒中、神経行動学的障害、神経変性疾患、神経損傷、脳内免疫細胞の過剰な活性化、血液脳関門の損傷、脳浮腫、カルシウムイオン含有量の増加、興奮毒性、ＮＯＳの過剰な活性化及び上記疾患又は状況の少なくとも１つに起因する疾患又は状況から選択される、疾患又は状況を予防及び／又は治療する方法を更に提供する。
【0045】
本文における「状況」とは、患者が示す異常な生理学的状態、例えば、患者が示す疾患の症状又は生理学的に異常な生理指標などを意味する。
【0046】
本文における「有効量の」又は「治療上有効量の」とは、前記疾患又は状況に対して緩和又は回復などの治療的機能を発揮できる薬物用量を意味する。
【0047】
「患者」という用語は、上記疾患を罹患したか又は前記障碍が存在するか、又は上記疾患を罹患したか又は前記障碍が存在するリスクがある個体又は集団、例えば被験者であってもよい。前記患者は、ヒト及び哺乳動物を含む。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態において、前記アネキシンＡ５の用量は、０．０５ ｍｇ～５００ ｍｇの日用量であり、好ましくは２～２００ ｍｇの日用量である。通常、１ ｍｇ～５００ ｍｇ／日であってもよく、１ ｍｇ～４５０ ｍｇ／日、例えば１ ｍｇ～４００ ｍｇ／日、１ ｍｇ～３５０ ｍｇ／日、１ ｍｇ～３００ ｍｇ／日、１ ｍｇ～２５０ ｍｇ／日、１ ｍｇ～２００ ｍｇ／日などであってもよい。当然、一部の軽度脳卒中の患者に投与される場合、アネキシンＡ５の用量は、より少なくてもよく、例えば１ ｍｇ～１００ ｍｇ／日、又は１ ｍｇ～８０ ｍｇ／日などであってもよい。
【0049】
前記アネキシンＡ５又はその薬物は、単回投与であってもよく、複数回の反復投与であってもよい。前記アネキシンＡ５又はその薬物は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、髄腔内注射、鼻腔用スプレー、口腔用スプレーなどの形態の投与を採用することができる。迅速な静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、髄腔内注射、鼻腔用スプレー、口腔用スプレーなどを含むが、これらに限定されない短時間迅速投与であってもよい。持続徐放する静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、髄腔内注射などを含むが、これらに限定されない持続的曝露投与であってもよい。アネキシンＡ５がタンパク質薬物に属することを考慮し、好ましくは、それを注射剤の形態に調製できることにより、例えばそれを凍結乾燥粉末又は特定の規格の他の注射薬物に調製できることにより、迅速な治療及び生体内での高生体利用性を実現することができる。
【0050】
治療時、アネキシンＡ５は、上記疾患又は状況（例えば、脳卒中）の急性期及び回復期の投与に使用されてもよく、卒中後の二次予防投与に使用されてもよく、画像の徴候があるが臨床症状がない潜在的な脳卒中の患者の予防的投与に更に使用されてもよい。
【0051】
なお、アネキシンＡ５は、脳卒中を治療する単独投与であってもよく、手術又は他の薬物との組み合わせ投与であってもよい。手術は、血管内インターベンション治療（例えば、機械的血栓摘出、血管形成術又はステント留置術など）を含むが、これらに限定されず、他の薬物は、血栓溶解薬（例えば、組換え組織型プラスミノーゲンアクチベータｒｔＰＡ及びウロキナーゼなど）、抗血小板薬（例えば、アスピリン、クロピドグレルなど）、抗凝血薬、抗線維薬（例えば、デフィブラーゼ及びバトロキソビンなど）、容量拡張薬、血管拡張薬、他の脳血液循環の改善用薬物及び神経保護剤（例えば、エダラボンなど）を含むが、これらに限定されない。組み合わせ投与により、脳卒中の多角度の治療を実現することができ、脳卒中を迅速に治療することができる。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態において、被験者に有効量のアネキシンＡ５を投与した後、脳内免疫細胞の過剰な活性化を抑制することができ、例えば、脳内小膠細胞の過剰な活性化を抑制し、免疫細胞の過剰な活性化による神経損傷を間接的に修復する。同時に、脳部の神経損傷を直接修復することができ、例えば、酸素グルコース欠乏による脳神経損傷を軽減し、興奮毒性、例えばＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸によるニューロン損傷を軽減することができる。脳卒中の治療中に、アネキシンは、損傷した血液脳関門を通して脳部に入り、治療的機能を発揮することができ、同時に損傷した血液脳関門を修復し、病態の更なる悪化を阻止し、更に治療目的を達成することができる。
【0053】
本発明のいくつかの実施形態において、使用されるアネキシンは、原核生物発現系によって発現され、例えば、大腸菌発現系によって発現され、アネキシンＡ５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。
【0054】
発明者が長時間にわたって研究した結果、アネキシンＡ５は、脳卒中を治療し、脳部の神経損傷を修復するために使用することができると見出した。ラット虚血再灌流モデルにより実証されるように、アネキシンＡ５は、ラットの脳梗塞面積を減少し、神経欠損症状を改善し、長時間の運動回復を促進することができることを見出した。例えば、光照射によってラット大脳皮質の局所的虚血モデルを取得し、その後、尾静脈からアネキシンＡ５を投与し、検出によりラットの神経欠損症状が改善され、脳梗塞面積が顕著に低下することを見出した。更に例えば、ラット自己由来の動脈血の脳内注射による損傷により、ラット出血性脳卒中モデルを取得し、その後、アネキシンＡ５を尾静脈注射投与し、検出によりラットの神経欠損症状が明確に改善され、脳梗塞面積も低下することを見出した。
【0055】
発明者は、アネキシンＡ５が脳卒中に関連する損傷に対して修復及び緩和作用を有し、脳卒中疾患を治療するために使用できることを更に見出した。
【0056】
発明者は、急性損傷の場合（脳卒中、外傷など）、血液脳関門が破壊され、脳部に入ることがあり、放射標識されたアネキシンＡ５が現像剤として脳中に分布することを更に見出した。アネキシンＡ５を投与した後、被験者の血液脳関門の損傷、及び脳神経損傷又は上記関連病変を顕著に修復することができる。なお、脳に入ったアネキシンＡ５は、脳部疾患を治療し、脳神経損傷を修復し、例えば、脳虚血又は再灌流損傷を修復でき、以上に記載の疾患又は状況を予防又は治療するために使用することができる。驚くべきことに、上記優れた治療効果を取得すると同時に、治療中に、被験者に出血のリスクが認められず、本発明の薬物は、優れる安全性を更に有することが分かった。
【0057】
本文における「修復」又は「緩和」とは、上記脳損傷を低減する任意の形態又は作用手段を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】神経欠損症状に対する、本発明の実施例により提供されるアネキシンＡ５溶液の影響結果を示す図である。
【図2】脳梗塞範囲に対する、本発明の実施例により提供されるアネキシンＡ５溶液の影響結果を示す図である。
【図3】初代皮質ニューロンＯＧＤ損傷に対する、本発明の実施例４により提供されるアネキシンＡ５の影響結果を示す図である。
【図4】ＮＭＤＡ誘発のラット初代皮質ニューロンの興奮性損傷に対する、本発明の実施例５により提供されるアネキシンＡ５の保護作用結果を示す図である。
【図5】脳組織のＥＢ含有量に対する、本発明の実施例６により提供されるアネキシンＡ５の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0059】
以下、図面を参照しながら説明される実施形態は、例示的なものであり、本発明を解釈するために用いられ、本発明を限定するものではないと理解すべきである。
【0060】
発明者は、修復又は損傷緩和を発揮できるか、又は本発明の予防及び／又は治療作用を発揮できるアネキシンＡ５が天然に存在するヒトアネキシンＡ５ポリペプチドの全長又はその一部のアミノ酸配列であってもよく、天然に存在するヒトアネキシンＡ５ポリペプチドの全長又は一部のアミノ酸配列に基づく変異体配列であってもよいことを見出した。当然、これらの天然に存在するアネキシン又は変異体を調製又は取得する場合、天然に存在する物質から直接分離されるか、又は直接、人工的に合成されるか、又は以上のこれらの方法の任意の組み合わせなどの任意の供給源又は方法に基づいてもよい。
【0061】
ヒトの天然の全長アネキシンＡ５を例にし、使用できるアネキシンＡ５は、ヒトの天然の全長アネキシンＡ５と比べ、相同性が少なくとも９７％以上であり、好ましくは９８％以上であり、例えば、少なくとも９８．５％以上であり、少なくとも９８．８％以上であり、より好ましくは９９％以上であり、例えば、少なくとも９９．３％以上であり、少なくとも９９．５％以上であり、更に例えば９９．６％以上である。ヒトの天然の全長アネキシンＡ５と比べて相同性を示すこれらのアミノ酸配列は、１つのアミノ酸の違い、２つのアミノ酸の違い、３つのアミノ酸の違い、４つのアミノ酸の違い、更には５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸の違いを示すことができる。これらのアミノ酸の違いは、ヒトの天然の全長アネキシンＡ５配列のアミノ酸で生じた保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸が別のアミノ酸の生物学的、化学的又は構造的に類似する残基で置換されることを意味してもよい。構造的に類似することは、アミノ酸がアラニン、グリシン又はセリンなどの類似した長さの側鎖を有するか、又は類似した大きさの側鎖を有することを意味する。化学的類似性とは、アミノ酸が同じ電荷を有するか、又はいずれも親水性又は疎水性であることを意味する。例えば、疎水性残基であるイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンは、互いに置換される。或いは、極性アミノ酸で、例えばアルギニンでリシンを置換し、グルタミン酸でアスパラギン酸を置換し、グルタミンでアスパラギンを置換し、セリンでスレオニンを置換する、等々。
【0062】
相同性を示す上記アミノ酸配列又は保存的アミノ酸置換を示す配列は、人工的に設計して合成することで取得されてもよく、自然界の他の種に直接存在してもよい。研究により、アネキシンＡ５が配列保存を有し、異なる種に高い相同性を示すことを見出した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列は、天然のヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列と一致し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列のＮ末端アミノ酸がアラニン（Ａ）であるのに対し、天然のヒトアネキシンＡ５のＮ末端がアセチル化アラニンであるという点のみ異なる。従って、以下の表１に示されるのは、異なる種に存在する変異部位及び変異アミノ酸がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列を例にして行われた比較であり、自然界の異なる種において、アネキシンＡ５の配列と天然のヒトアネキシンＡ５の差異も反映される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列と比べ、Ｇｏｒｉｌｌａゴリラにおいて変異し、第３位のアミノ酸は、バリンからイソロイシンに変異した。更に例えば、文献J. Mol. Biol. 223 (3), 683～704 (1992)及び文献J. Mol. Biol. 223 (3), 683～704 (1992)において、ヒトの天然ヒトアネキシンにも変異が存在し、即ち、天然のヒトアネキシンＡ５と比べて、第７６位のアミノ酸がグルタミン酸からグルタミンに変異したか又はグルタミン酸からグリシンに変異したことも報告されている。以下の表１には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列と比べ、一部の種に存在する変異部位及び対応する変異アミノ酸を列挙し、これらの配列は、全てＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓ Ｎｕｍｂｅｒに基づいてＮＣＢＩから取得されてもよく、対応する参照文献から直接取得されてもよい。
【0063】
【表1】
【0064】
【表2】
【0065】
以下、実施例を参照しながら本発明の実施形態を説明する。当業者であれば、以下の実施例は、本発明の実施形態を例示的に解釈して説明するためのものに過ぎず、本発明の請求範囲を制限するものではないと理解すべきである。実施例に具体的な技術又は条件が記載されていない場合、本分野の文献に記載された技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って行われる。製造者の記載がなく使用される試薬又は機器は、全て市場で入手できる通常の製品である。
【0066】
実施例１
本実施例及び以下の実施例で使用されるアネキシンＡ５（以下、Ａ５タンパク質と略称される）は、ヒト由来の全長アネキシンＡ５であり、組換えベクターを構築することで、原核生物である大腸菌生体内に大量に発現され、発現されたＡ５タンパク質が配列決定され、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
本実施例及び以下の実施例で使用されるアネキシンＡ５（以下、Ａ５タンパク質と略称される）は、ヒト由来の全長アネキシンＡ５であり、組換えベクターを構築することで、原核生物である大腸菌生体内に大量に発現され、発現されたＡ５タンパク質が配列決定され、そのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【0067】
AQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すように、大腸菌発現系により発現されるＡ５タンパク質は、３１９個のアミノ酸を含有し、その完成したｃＤＮＡ配列が３２０個のアミノ酸のコドンによってコードされ、Ｎ末端のメチオニンが発現中に切断される。当該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列は、天然のヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列と一致し、当該系により発現されるＡ５タンパク質のＮ末端アミノ酸がアラニン（Ａ）であるのに対し、天然のヒトアネキシンＡ５のＮ末端がアセチル化アラニンであるという点のみ異なる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すように、大腸菌発現系により発現されるＡ５タンパク質は、３１９個のアミノ酸を含有し、その完成したｃＤＮＡ配列が３２０個のアミノ酸のコドンによってコードされ、Ｎ末端のメチオニンが発現中に切断される。当該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列は、天然のヒトアネキシンＡ５のアミノ酸配列と一致し、当該系により発現されるＡ５タンパク質のＮ末端アミノ酸がアラニン（Ａ）であるのに対し、天然のヒトアネキシンＡ５のＮ末端がアセチル化アラニンであるという点のみ異なる。
【0068】
その後、実施例１で得られたＡ５タンパク質を利用して以下の実験を行う。
【0069】
実施例２
文献Behavioral deficits and recovery following transient focal cerebral ischemia in rats: glutamatergic and GABAergic receptor densities(Jolkkonen J, Gallagher NP, Zilles K, Sivenius J.Behav Brain Res 2003;138:187～200)及び文献Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. (Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R.Stroke 1989;20:84～91)に記載の内容を参照すると、内頚動脈縫合法によって大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ， ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを構築し、それぞれＡ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群を設置し、エダラボンの静脈内投与（６．０ ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照群とし、モデル群及び偽手術群を別途設置する。モデル群及び偽手術群に同体積の０．９％の塩化ナトリウム注射液を投与する。Ａ５タンパク質の各用量群に再灌流時に１回投与することができ、再灌流の１ｈ後に更に１回投与し、他の各群に再灌流した直後に１回投与する。脳虚血の２４時間後に神経行動学的障害の症状評価及び脳梗塞面積の測定を行う。
文献Behavioral deficits and recovery following transient focal cerebral ischemia in rats: glutamatergic and GABAergic receptor densities(Jolkkonen J, Gallagher NP, Zilles K, Sivenius J.Behav Brain Res 2003;138:187～200)及び文献Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. (Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R.Stroke 1989;20:84～91)に記載の内容を参照すると、内頚動脈縫合法によって大脳動脈閉塞（Ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ， ＭＣＡＯ）脳虚血再灌流モデルを構築し、それぞれＡ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群を設置し、エダラボンの静脈内投与（６．０ ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照群とし、モデル群及び偽手術群を別途設置する。モデル群及び偽手術群に同体積の０．９％の塩化ナトリウム注射液を投与する。Ａ５タンパク質の各用量群に再灌流時に１回投与することができ、再灌流の１ｈ後に更に１回投与し、他の各群に再灌流した直後に１回投与する。脳虚血の２４時間後に神経行動学的障害の症状評価及び脳梗塞面積の測定を行う。
【0070】
１． 試験材料
（１）実験動物
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、ＳＰＦ級、雄性、年齢が６～８週程度、体重２５０～２８０ ｇ。
（１）実験動物
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット、ＳＰＦ級、雄性、年齢が６～８週程度、体重２５０～２８０ ｇ。
【0071】
動物は、実験中に以下の場合で除外される。ａ）麻酔中に死亡し、ｂ）脳虚血中に死亡し、ｃ）再灌流後に指標を評価するまで死亡し、ｄ）脳を取り出した後に頭蓋底出血を発見し、ｅ）ＴＴＣ染色後に右脳に梗塞領域がない。
【0072】
（２）試薬
Ａ５タンパク質溶液は、即ち、実施例１で調製されたＡ５タンパク質を０．９％の塩化ナトリウム水溶液で希釈して調製してなる。
Ａ５タンパク質溶液は、即ち、実施例１で調製されたＡ５タンパク質を０．９％の塩化ナトリウム水溶液で希釈して調製してなる。
【0073】
対照品：エダラボン注射液（南京先声東元製薬有限公司から購入される）であり、１：１の割合でエダラボン注射液と０．９％の塩化ナトリウム注射液を混合して希釈し、陽性対照とする。
【0074】
２． 試験設計
（１）用量設計
（１）用量設計
【0075】
【表3】
【0076】
（２）投与
各群の動物に尾静脈から静脈内注射で投与し、静脈内注射による投与の速度は、約１．５～２．５ ｍＬ／分間である。
各群の動物に尾静脈から静脈内注射で投与し、静脈内注射による投与の速度は、約１．５～２．５ ｍＬ／分間である。
【0077】
各処置群に対して、脳虚血の２４時間後に神経行動学的障害の症状評価及び脳梗塞面積の測定を行う。
【0078】
３． 評価方法
（１）神経欠損症状のスコア
文献Rat middle cerebral artery occlusion, evaluation of the model and development of a neurologic examination(Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski H. 1986.Stroke 17: 472-476)に記載の方法を参照し、動物に対して２４ ｈ虚血した後に改良されたＢｅｄｅｒｓｏｎ ５点法によって神経欠損の症状評価を行う。
（１）神経欠損症状のスコア
文献Rat middle cerebral artery occlusion, evaluation of the model and development of a neurologic examination(Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski H. 1986.Stroke 17: 472-476)に記載の方法を参照し、動物に対して２４ ｈ虚血した後に改良されたＢｅｄｅｒｓｏｎ ５点法によって神経欠損の症状評価を行う。
【0079】
（２）脳梗塞程度の測定
文献Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats(Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Stroke 1986;17:1304-8)及び文献Quantification of infarct size on focal cerebral ischemia model of rats using a simple and economical method(Yang Y, Shuaib A, Li Q. J Neurosci Methods 1998;84:9～16)に記載の内容を参照し、ＴＴＣ染色法によって脳梗塞程度の測定を行う。
文献Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats(Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, Nishimura MC, Davis RL, Bartkowski HM. Stroke 1986;17:1304-8)及び文献Quantification of infarct size on focal cerebral ischemia model of rats using a simple and economical method(Yang Y, Shuaib A, Li Q. J Neurosci Methods 1998;84:9～16)に記載の内容を参照し、ＴＴＣ染色法によって脳梗塞程度の測定を行う。
【0080】
脳梗塞面積の計算：写真をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて処理し、公式で左脳の対応する面積及び右脳の非梗塞巣の面積を計算し、梗塞範囲の百分率を求める。
【0081】
梗塞体積計算法：
Ｖ＝ｔ（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋ ………＋Ａｎ）
ｔは、切片の厚さであり、Ａは梗塞面積である。
％Ｉ＝（ＶＣ－ＶＬ）／ＶＣ×１００％
％Ｉは、梗塞範囲の百分率であり、ＶＣは、対照側（左脳半球）の脳体積であり、ＶＬは、梗塞側（右脳半球）の非梗塞領域の体積である。
Ｖ＝ｔ（Ａ１＋Ａ２＋Ａ３＋ ………＋Ａｎ）
ｔは、切片の厚さであり、Ａは梗塞面積である。
％Ｉ＝（ＶＣ－ＶＬ）／ＶＣ×１００％
％Ｉは、梗塞範囲の百分率であり、ＶＣは、対照側（左脳半球）の脳体積であり、ＶＬは、梗塞側（右脳半球）の非梗塞領域の体積である。
【0082】
（３）評価指標
脳梗塞範囲及び神経行動学的スコアを主な評価指標とし、同時に動物臨床症状を観察する。
脳梗塞範囲及び神経行動学的スコアを主な評価指標とし、同時に動物臨床症状を観察する。
【0083】
定量資料は、平均値±標準誤差で示し、各薬効指標は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（６．０１）ソフトウェアを用いて一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、分散検定が有意になった後に更にＦｉｓｈｅｒ’ｓ ＬＳＤ ｔｅｓｔを用いて群間の差異を検定する。Ｐ＜０．０５を有意差があるものと定義する。
４． 実験結果
（１）神経欠損症状に対するＡ５タンパク質の影響
一元配置分散分析により、各群の間に統計学的差異（Ｆ（４． ６９） ＝ ２．３０５、Ｐ ＝ ０．０６６９）が認められない。しかし、各群に対してそれぞれモデル群とＴ検定を行い、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０１）及びＡ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０５）は、虚血性動物の神経行動学的障害の症状を顕著に改善することができ、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ群及びＡ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ群は、虚血性動物の神経行動学的障害の症状を改善する傾向を有するが、統計学的差異が認められない。神経行動学的障害の症状に対するＡ５タンパク質の影響を表３及び図１に詳述する。
４． 実験結果
（１）神経欠損症状に対するＡ５タンパク質の影響
一元配置分散分析により、各群の間に統計学的差異（Ｆ（４． ６９） ＝ ２．３０５、Ｐ ＝ ０．０６６９）が認められない。しかし、各群に対してそれぞれモデル群とＴ検定を行い、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０１）及びＡ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０５）は、虚血性動物の神経行動学的障害の症状を顕著に改善することができ、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ群及びＡ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ群は、虚血性動物の神経行動学的障害の症状を改善する傾向を有するが、統計学的差異が認められない。神経行動学的障害の症状に対するＡ５タンパク質の影響を表３及び図１に詳述する。
【0084】
【表4】
【0085】
（２）脳梗塞範囲に対するＡ５タンパク質の影響
一元配置分散分析により、各群の間に統計学的差異（Ｆ（４． ６９） ＝ ２．２４０、Ｐ ＝ ０．０７３５）が認められない。しかし、各群に対してそれぞれモデル群とＴ検定を行い、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０５）は、モデル動物の脳梗塞面積を顕著に低減することができ、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ群、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ群は、モデル動物の脳梗塞面積を低減する傾向を有するが、統計学的差異が認められず、Ａ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ群は、モデル動物の脳梗塞面積を低減する作用を有さない。脳梗塞面積に対するＡ５タンパク質の影響を表３及び図２に詳述する。
一元配置分散分析により、各群の間に統計学的差異（Ｆ（４． ６９） ＝ ２．２４０、Ｐ ＝ ０．０７３５）が認められない。しかし、各群に対してそれぞれモデル群とＴ検定を行い、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群（Ｐ＜０．０５）は、モデル動物の脳梗塞面積を顕著に低減することができ、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ群、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ群は、モデル動物の脳梗塞面積を低減する傾向を有するが、統計学的差異が認められず、Ａ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇ群は、モデル動物の脳梗塞面積を低減する作用を有さない。脳梗塞面積に対するＡ５タンパク質の影響を表３及び図２に詳述する。
【0086】
今回の試験において、モデル群における動物の脳梗塞範囲の群内の差異は、実質的に平均値１／３以内（Ｍｅａｎ±ＳＤ、４２．５３±１２．６５）であり、モデル可用率は６９．８１％（偽手術群における動物を含まない）であり、当該実験系は、信頼性が高く、薬効評価に使用することができる。
【0087】
モデル群と比べ、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群は、モデルラットの脳梗塞面積（Ｐ＜０．０５）を顕著に低減することができ、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ １．０ ｍｇ／ｋｇ群は、モデルラットの脳梗塞面積を低減する傾向を有するが、統計学的差異が認められず、Ａ５ ０．１ ｍｇ／ｋｇは、モデル動物の脳梗塞面積を低減する作用を有さない。モデル群と比べ、エダラボン６．０ ｍｇ／ｋｇ及びＡ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群は、虚血性動物の神経行動学的障害の症状（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）を顕著に改善することができ、他の各群は、当該指標で顕著な改善作用を示さない。
【0088】
今回の実験において、Ａ５ １０．０ ｍｇ／ｋｇ群は、虚血性ラットの脳梗塞面積を顕著に低減すると共に、虚血性動物の神経行動学的障害の症状を改善することができる。アネキシンＡ５で治療される実験群にいずれも出血のリスクが認められない。
【0089】
実施例３
小膠細胞は、中枢神経系の炎症過程に重要な役割を果たす。小膠細胞の適度な活性化は、ニューロンに対して保護作用を有するが、過剰に活性化された小膠細胞は、一酸化炭素のような大量の神経毒性因子を放出し、これらの神経毒性因子は、神経変性疾患の発症を引き起こす。リポ多糖（ＬＰＳ）は、小膠細胞を活性化させるが、小膠細胞が過剰に活性化されると、ニューロンが損傷される。Ａ５を用いてＬＰＳ刺激による小膠細胞の過剰な活性化の影響を観察する。
小膠細胞は、中枢神経系の炎症過程に重要な役割を果たす。小膠細胞の適度な活性化は、ニューロンに対して保護作用を有するが、過剰に活性化された小膠細胞は、一酸化炭素のような大量の神経毒性因子を放出し、これらの神経毒性因子は、神経変性疾患の発症を引き起こす。リポ多糖（ＬＰＳ）は、小膠細胞を活性化させるが、小膠細胞が過剰に活性化されると、ニューロンが損傷される。Ａ５を用いてＬＰＳ刺激による小膠細胞の過剰な活性化の影響を観察する。
【0090】
実験中にＬＰＳ刺激による精製した初代小膠細胞を対照群として採用し、同時にＡ５タンパク質を実験群として追加する。上記処理に対して、それぞれＭＴＴ法によって細胞生存性を検出し、免疫細胞化学法によって細胞形態の変化を観察する。
【0091】
実験結果により、ＬＰＳは、初代小膠細胞を明らかに活性化させることができるが、細胞生存性に影響を与えないことを示す。Ａ５タンパク質は、ＬＰＳ刺激による小膠細胞の過剰な活性化に対して抑制作用を有する。よって、Ａ５タンパク質は、脳内免疫細胞の過剰な活性化を抑制し、例えば、小膠細胞の過剰な活性化を抑制するために使用することができる。
【0092】
実施例４
酸素グルコース欠乏（ｏｘｙｇｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ＯＧＤ）モデルは、細胞レベルで虚血／低酸素の刺激モデルをシミュレートし、細胞培養条件を変更し、例えば、細胞を低酸素チャンバに入れるか又は無糖の培地に交換することで、細胞が虚血／低酸素状態での損傷をシミュレートする。
酸素グルコース欠乏（ｏｘｙｇｅｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ＯＧＤ）モデルは、細胞レベルで虚血／低酸素の刺激モデルをシミュレートし、細胞培養条件を変更し、例えば、細胞を低酸素チャンバに入れるか又は無糖の培地に交換することで、細胞が虚血／低酸素状態での損傷をシミュレートする。
【0093】
ラット初代皮質ニューロンを選択してＯＧＤモデルを構築し、Ａ５タンパク質の検出濃度は、それぞれ０、４１．１５、１２３．５、３７０．４、１１１１、３３３３、１００００ ｎＭである。まず、ＰＢＳで培養プレート中の細胞を２回洗浄し、事前に９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２で３０ ｍｉｎ置換した無糖ＤＭＥＭを加え、３７ ℃、９４％Ｎ２＋１％Ｏ２＋５％ＣＯ２の低酸素インキュベータに迅速に入れる。８ ｈ低酸素培養した後、対応する薬物含有培地（即ち、Ａ５を含有するＤＭＥＭ培地）を加え、３７ ℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベータに再度入れて２４ ｈ再酸素化して培養する。正常条件に戻して２４ ｈ培養し続けた後に、倒立顕微鏡下で細胞の形態学的変化を観察し、ＣＣＫ－８比色法によって細胞生存率を検出し、フローサイトメトリーによって細胞アポトーシス率を検出する。同時に、正常酸素圧及び正常グルコースの処置群を対照群として設置する。細胞相対活性の計算式は、以下の通りである。
【0094】
細胞相対活性（％）＝（投与群－背景群）／（対照群－背景群）×１００％
モデル群と比べ、Ａ５タンパク質は、４１．１５～１１１１ ｎＭの濃度範囲内でＯＧＤによるニューロン損傷への保護作用（Ｐ＞０．０５）を示せず、且つ３３３３～１００００ ｎＭの濃度下でＯＧＤによるニューロン損傷後の活性（Ｐ＜０．０５、図３）を顕著に低下させる。
モデル群と比べ、Ａ５タンパク質は、４１．１５～１１１１ ｎＭの濃度範囲内でＯＧＤによるニューロン損傷への保護作用（Ｐ＞０．０５）を示せず、且つ３３３３～１００００ ｎＭの濃度下でＯＧＤによるニューロン損傷後の活性（Ｐ＜０．０５、図３）を顕著に低下させる。
【0095】
実験結果により、Ａ５タンパク質は、３３３３～１００００ ｎＭの濃度下で酸素グルコース欠乏によるニューロン細胞への損傷を軽減することができ、神経保護作用を有することを示した。
【0096】
実施例５
実施例５は、ＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン）誘発のラット皮質ニューロンの興奮毒性損傷に対するＡ５タンパク質の神経保護作用を研究した。ＮＭＤＡは、ＮＭＤＡ受容体を活性化して脳組織内のＣａ２＋含有量を増加させることができ、ＮＯＳが大量に活性化されると、大量のＮＯの合成などの一連の生理学的又は病理学的な変化を引き起こし、脳内ニューロンを損傷させる。実験は、Ａ５タンパク質を予め採用することでニューロンを前処理し、興奮毒性によるニューロンへの損傷に対するＡ５タンパク質の神経保護作用を観察する。
実施例５は、ＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン）誘発のラット皮質ニューロンの興奮毒性損傷に対するＡ５タンパク質の神経保護作用を研究した。ＮＭＤＡは、ＮＭＤＡ受容体を活性化して脳組織内のＣａ２＋含有量を増加させることができ、ＮＯＳが大量に活性化されると、大量のＮＯの合成などの一連の生理学的又は病理学的な変化を引き起こし、脳内ニューロンを損傷させる。実験は、Ａ５タンパク質を予め採用することでニューロンを前処理し、興奮毒性によるニューロンへの損傷に対するＡ５タンパク質の神経保護作用を観察する。
【0097】
実験は、胚が１７ｄのＳＤラットを選択して使用し、皮質ニューロンを接種して培養する。その後、ニューロンを対照群、ＮＭＤＡ中毒群及びＡ５前処置群に分け、そのうち、ＮＭＤＡ中毒群は、ニューロンをＮＭＤＡに加えて中毒化させ、対照群は、如何なる処理を行わず、Ａ５前処置群は、予めニューロンをＡ５タンパク質と共に一定時間インキュベートした後、ＮＭＤＡを加えて中毒化させる。異なる処置群に対して、トリパンブルー染色によって細胞生存性を評価し、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシス細胞を検出し、免疫蛍光細胞化学技術によってニューロン形態を測定する。細胞相対活性の計算式は、以下の通りである。
【0098】
細胞相対活性（％）＝（投与群－背景群）／（対照群－背景群）×１００％
図４に示すように、１００ μＭ濃度のＮＭＤＡは、ラット初代皮質ニューロンの細胞活性を低下させるように（Ｐ＜０．００１、正常ｃｏｎｔｒｏｌと比べる）誘発することができ、モデルの構築に成功したことを示した。Ａ５タンパク質は、検出濃度４１．１５～３３３３ ｎＭの範囲内で、ＮＭＤＡによる初代皮質ニューロン興奮性損傷への顕著な軽減作用（Ｐ＞０．０５、Ｍｏｄｅｌ群と比べる）が認められないが、検出濃度１００００ ｎＭでＮＭＤＡによる初代皮質ニューロン興奮性損傷への顕著な軽減作用（Ｐ＜０．０５、Ｍｏｄｅｌ群と比べる）を示す。
図４に示すように、１００ μＭ濃度のＮＭＤＡは、ラット初代皮質ニューロンの細胞活性を低下させるように（Ｐ＜０．００１、正常ｃｏｎｔｒｏｌと比べる）誘発することができ、モデルの構築に成功したことを示した。Ａ５タンパク質は、検出濃度４１．１５～３３３３ ｎＭの範囲内で、ＮＭＤＡによる初代皮質ニューロン興奮性損傷への顕著な軽減作用（Ｐ＞０．０５、Ｍｏｄｅｌ群と比べる）が認められないが、検出濃度１００００ ｎＭでＮＭＤＡによる初代皮質ニューロン興奮性損傷への顕著な軽減作用（Ｐ＜０．０５、Ｍｏｄｅｌ群と比べる）を示す。
【0099】
実験結果により、ＮＭＤＡ中毒群と比べ、Ａ５前処置群は、１００００ ｎＭの検出濃度で興奮毒性によるニューロンへの損害を軽減することができることを示した。
【0100】
実施例６
血液脳関門は、脳微小血管内皮細胞、星状膠細胞及び基底膜という３つの成分で構成される。血液脳関門の損傷は、卒中脳損傷の重要な病理の１つである。
血液脳関門は、脳微小血管内皮細胞、星状膠細胞及び基底膜という３つの成分で構成される。血液脳関門の損傷は、卒中脳損傷の重要な病理の１つである。
【0101】
実験中に自然に形質転換した内皮細胞系及び単離精製されたラット星状膠細胞を利用して共培養してインビトロ血液脳関門モデルを構築する。インビトロ血液脳関門モデルは、刺激処理後に損傷し、その後、Ａ５タンパク質で刺激処理後の血液脳関門モデルを処理する。頭蓋骨への打撃によるラット頭蓋骨損傷モデルを用いて血液脳関門の完全性を評価し、それぞれＡ５ １０ ｍｇ／ｋｇ、Ａ５ ３０ ｍｇ／ｋｇ、モデル群を設置する。Ａ５タンパク質の各用量群及びモデル群にモデル構築の１ｈ、２ｈ後にそれぞれ１回投与し、合計で２回投与し、投与形態は、尾静脈内注射投与である。モデル構築の２３ｈ後に、ラットを麻酔した後、尾静脈から４ ｍｌ／ｋｇの用量で２％のＥＢ（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）染料溶液を注射し、殺す前に染料をラット体内で１時間循環させる。無色の灌流が得られるまでラット左心室を通して食塩水で心臓に灌流する。殺す後、大脳を取り出し、秤量し、カルボキサミド（３ μｌ／ｍｇ）でホモジナイズし、室温で４８時間インキュベートする。遠心後、上清液を収集して６２５ ｎｍで光学密度を測定し、ＥＢ染料の相対量を決定するために使用し、結果を表４及び図５に示す。
【0102】
【表5】
【0103】
結果により、モデル群と比べ、Ａ５ １０ ｍｇ／ｋｇ群の脳組織中のＥＢ含有量には有意差（Ｐ＞０．０５）が認められず、Ａ５ ３０ ｍｇ／ｋｇ群の脳組織中のＥＢ含有量が顕著に減少する（Ｐ＜０．０５）ことを示した。今回の実験において、Ａ５ ３０ ｍｇ／ｋｇ群は、頭蓋骨への打撃によるラット血液脳関門の損傷に対して修復作用を有する。
【0104】
実験結果により、刺激により、既に構築された血液脳関門は、顕著に破壊され、Ａ５は、破壊された血液脳関門を修復することができることを示した。
【0105】
実施例７ 免疫毒性及び免疫原性の研究（ＳＤラット及びカニクイザルの反復投与毒性研究を伴う）
１、ＳＤラットの毒性実験研究
ＳＤラットに２８日間連続でＡ５タンパク質を静脉内注射し、４週間の回復期間を設置し、ラットから生じた毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官及び損害の可逆度を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、３０、１５０及び７５０ μｇ／ｋｇである。採血して免疫毒性（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）及び免疫原性の検出を行う。ここで、試験を４群に分け、１群当たり８匹のラットを設定し、サンプルの採取は合計で４つの時間点にし、即ち、各ラットに対して４つの時間点の血清サンプルを採取する。
１、ＳＤラットの毒性実験研究
ＳＤラットに２８日間連続でＡ５タンパク質を静脉内注射し、４週間の回復期間を設置し、ラットから生じた毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官及び損害の可逆度を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、３０、１５０及び７５０ μｇ／ｋｇである。採血して免疫毒性（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）及び免疫原性の検出を行う。ここで、試験を４群に分け、１群当たり８匹のラットを設定し、サンプルの採取は合計で４つの時間点にし、即ち、各ラットに対して４つの時間点の血清サンプルを採取する。
【0106】
ここで、免疫毒性結果から、対照群と比べて、試験期間における各用量の投与群の動物の末梢血中のＴリンパ球亜群の割合及び比率（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞測定値）には統計学的な有意差が認められないことが分かった。
【0107】
免疫原性結果を表４に示す。ここで、表４における各群のサンプル数は、１群当たり８匹のラットを示し、４つの時間点に分けて血清を採取し、各群は、合計で３２個のサンプル数であり、陽性個体数は、各群のサンプル数から陽性サンプルを検出した数である。
【0108】
【表6】
【0109】
表４の結果から明らかなように、ＳＤラットにＡ５タンパク質ブランクアジュバントを静脈内注射投与した後、抗薬物抗体（ＡＤＡ）が検出されなかった。異なる用量のＡ５タンパク質を静脈内注射した後、陽性サンプルの検出率は６５．６％でした。各用量群の間に有意差が認められず、陽性サンプルは、主に最終投与後及び回復期の最後に集中し、抗薬物抗体がインビボで産生されるプロセスに合致する。
【0110】
２、カニクイザルの毒性実験研究
研究において、カニクイザルを２８日間連続でＡ５タンパク質を静脈内注射し、４週間の回復期間を設置し、カニクイザルから生じた毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官及び損害の可逆度を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、１５、７５及び３７５ μｇ／ｋｇである。免疫原性の採血及び免疫毒性（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の検出を行う。
研究において、カニクイザルを２８日間連続でＡ５タンパク質を静脈内注射し、４週間の回復期間を設置し、カニクイザルから生じた毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官及び損害の可逆度を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、１５、７５及び３７５ μｇ／ｋｇである。免疫原性の採血及び免疫毒性（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の検出を行う。
【0111】
免疫毒性結果から、対照群と比べて、試験期間における各用量の投与群の動物の末梢血中のＴリンパ球亜群の割合及び比率（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞測定値）には統計学的な有意差が認められないことが分かった。
【0112】
免疫原性結果を表５に示す。上記ラットと同様の群分け及び処理形態を採用し、異なるのは、サンプリングする場合、各群のサンプル数が２つ多いことであり、即ち、各群のサンプル数が２つ多い。
【0113】
【表7】
【0114】
表５の結果から容易に分かるように、カニクイザルにＡ５タンパク質ブランクアジュバントを静脈内注射投与した後、ＡＤＡが検出されなかった。異なる用量のＡ５タンパク質を静脈内注射した後、陽性サンプルの検出率は２５．５％であり、陽性サンプルは、投与４週間後及び回復期の最後に集中し、抗薬物抗体がインビボで産生されるプロセスに合致する。
【0115】
実験結果により、ラット及びカニクイザルの両方において免疫毒性が認められないことを示した。免疫原性試験において、カニクイザルは、ラットと比べて、陽性発生率が有意に低下する。Ａ５タンパク質がヒト由来タンパク質に属することを考慮し、人体上に免疫原性の発生率が顕著に低下することが予想される。
【0116】
実施例８ ＳＤラット及びカニクイザルにＡ５タンパク質を静脈内注射する単回投与毒性研究
１、ＳＤラットにＡ５タンパク質を静脈内注射する単回投与毒性研究
研究において、ＳＤラットにＡ５タンパク質を単回静脈内注射し、動物から生じた急性毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、１０００、３０００及び９０００ μｇ／ｋｇである。静脈内注射し、投与後に動物の姿勢、歩行姿勢、反応状態、神経活動、食欲、被毛、眼、耳、口、鼻、四肢、呼吸、糞便などの臨床症状を連続的に観察する。その後、投与後１４日目まで観察し続け、動物の毒性反応の回復状況を考察する。投与１５日間後に動物を解剖して肉眼的病理学検査を行う。試験期間に全ての動物の臨床症状に異常が認められず、投与群における雌性及び雄性の動物の体重変化に異常が認められず、肉眼的病理学検査における各組織器官にいずれも異常が認められない。本試験条件下で、Ａ５タンパク質の単回静脈内注射の耐量（ＭＴＤ）は、９０００ μｇ／ｋｇ以上である。
１、ＳＤラットにＡ５タンパク質を静脈内注射する単回投与毒性研究
研究において、ＳＤラットにＡ５タンパク質を単回静脈内注射し、動物から生じた急性毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、１０００、３０００及び９０００ μｇ／ｋｇである。静脈内注射し、投与後に動物の姿勢、歩行姿勢、反応状態、神経活動、食欲、被毛、眼、耳、口、鼻、四肢、呼吸、糞便などの臨床症状を連続的に観察する。その後、投与後１４日目まで観察し続け、動物の毒性反応の回復状況を考察する。投与１５日間後に動物を解剖して肉眼的病理学検査を行う。試験期間に全ての動物の臨床症状に異常が認められず、投与群における雌性及び雄性の動物の体重変化に異常が認められず、肉眼的病理学検査における各組織器官にいずれも異常が認められない。本試験条件下で、Ａ５タンパク質の単回静脈内注射の耐量（ＭＴＤ）は、９０００ μｇ／ｋｇ以上である。
【0117】
２、カニクイザルにＡ５タンパク質を静脈内注射する単回投与毒性研究
研究において、カニクイザルにＡ５タンパク質を単回静脈内注射し、動物から生じた急性毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、５００、１５００及び４５００ μｇ／ｋｇである。単回静脈内注射して投与し、投与後１５日目まで投与後の動物の臨床症状（糞便、外観、呼吸、神経反応、活動状況などを含む）を観察する。投与後に摂餌量を１日に１回測定し、体重を週１回測定する。投与の当日にそれぞれ投与前後で動物の体温、血圧及び心電図を測定し、投与後１、７、１５日目に１回再測定する。投与後１、７、１５日目に全ての動物に血液学（血液凝固を含有する）及び血清生化学検査を行い、投与後１４日目に尿検査を行う。投与後１５日目に動物を解剖して肉眼的病理学検査を行い、必要に応じて組織病理学検査を行う。結果から分かるように、各群の動物の臨床症状及び注射部位の観察、体重、摂餌量、体温、血圧、心電図、尿検査、血清生化学及び病理学的検査には、いずれも被験物に関連する明らかな変化が認めらない。検疫期間の１３日目に、投与後１日目から投与後１５日目に各群の動物のプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）に明らかな変化が認められない。本試験条件で、カニクイザルの動物耐量（ＭＴＤ）は、４５００ μｇ／ｋｇ以上である。
研究において、カニクイザルにＡ５タンパク質を単回静脈内注射し、動物から生じた急性毒性反応及びその重症度、主な毒性の潜在的標的器官を観察する。投与用量は、それぞれ０（ブランクアジュバント）、５００、１５００及び４５００ μｇ／ｋｇである。単回静脈内注射して投与し、投与後１５日目まで投与後の動物の臨床症状（糞便、外観、呼吸、神経反応、活動状況などを含む）を観察する。投与後に摂餌量を１日に１回測定し、体重を週１回測定する。投与の当日にそれぞれ投与前後で動物の体温、血圧及び心電図を測定し、投与後１、７、１５日目に１回再測定する。投与後１、７、１５日目に全ての動物に血液学（血液凝固を含有する）及び血清生化学検査を行い、投与後１４日目に尿検査を行う。投与後１５日目に動物を解剖して肉眼的病理学検査を行い、必要に応じて組織病理学検査を行う。結果から分かるように、各群の動物の臨床症状及び注射部位の観察、体重、摂餌量、体温、血圧、心電図、尿検査、血清生化学及び病理学的検査には、いずれも被験物に関連する明らかな変化が認めらない。検疫期間の１３日目に、投与後１日目から投与後１５日目に各群の動物のプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びトロンビン時間（ＴＴ）に明らかな変化が認められない。本試験条件で、カニクイザルの動物耐量（ＭＴＤ）は、４５００ μｇ／ｋｇ以上である。
【0118】
以上の実験結果により、ＳＤラット及びカニクイザルの両方において、Ａ５タンパク質の耐量は、いずれも４５００ μｇ／ｋｇ以上であり、ＳＤラットにおいて、Ａ５タンパク質の耐量は、更には９０００ μｇ／ｋｇ以上であることを示した。結果により、Ａ５タンパク質が脳卒中の保護作用を発揮する等価用量で、ラット及びカニクイザルの明らかな毒性が認められない。これにより、Ａ５タンパク質が脳卒中の治療に使用される場合、安全性が良好であり、且つ高い用量で投与される場合でも、薬物使用のリスクを全く又はほとんどもたらさないことを示唆する。
【0119】
本明細書の説明において、「実施形態」、「実施例」、「例」などの用語の説明を参照することは、当該実施形態、実施例又は例に記載の具体的な特徴、構造、材料又は特性と組み合わせて本発明の少なくと１つの実施形態、実施例又は例に含まれることを意味する。本明細書において、上記用語の例示的な説明は、必ずしも同じ実施形態、実施例又は例を指すとは限らない。また、記載された具体的な特徴、構造、材料又は特性は、任意の１つ又は複数の実施形態、実施例又は例において適切な方法で組み合わせることができる。なお、当業者は、互いに矛盾しない限り、本明細書に記載されている異なる実施形態、実施例又は例及び異なる実施形態、実施例又は例の特徴を組み合わせることができる。
【0120】
以上、本発明の実施例を示して説明したが、上記実施例は、例示的なものであり、本発明の請求範囲を制限するものではないと理解すべきである。当業者は、本発明の範囲内で上記実施例に対して変更、修正、置換及び変形を行うことができ、これらの変更、修正、置換及び変形は、いずれも本発明の請求範囲に含まれるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】