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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-25
(45)【発行日】2024-07-03
(54)【発明の名称】抗癌剤及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/122 20060101AFI20240626BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240626BHJP
【ＦＩ】
A61K31/122
A61P35/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2019228526
(22)【出願日】2019-12-18
(65)【公開番号】P2021095375
(43)【公開日】2021-06-24
【審査請求日】2022-10-28
(73)【特許権者】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(74)【代理人】
【識別番号】100192773
【弁理士】
【氏名又は名称】土屋 亮
(72)【発明者】
【氏名】高橋 智聡
(72)【発明者】
【氏名】河野 晋
(72)【発明者】
【氏名】パイン リン
【審査官】梅田 隆志
(56)【参考文献】
【文献】MATILAINEN, S. et al.，European Journal of Human Genetics，2015年，Vol. 23，No. 3，pp.325-330.
【文献】TESSEM, M.B. et al.，PLOS ONE，2016年，Vol. 11，No. 4, Article:e0153727，pp.1-15.
【文献】KOKA, P.S., et al.，Experimental Biology and Medicine，2010年，Vol. 235，No. 6，pp.751-760.
【文献】リン パインほか，第78回日本癌学会学術総会抄録集，2019年09月28日，Article:E-3037，p.1496.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－ＣｏＡ Ｌｉｇａｓｅ ＡＤＰ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｅｔａ Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＳＵＣＬＡ２）遺伝子の欠失を伴う前立腺癌用抗癌剤。【化1】
【請求項2】
前記前立腺癌が、ＲＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ １（ＲＢ１）遺伝子を更に欠失している、請求項１に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗癌剤及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、抗癌剤、癌患者に抗癌剤の投与が有効か否かを判定するためのキット、及び、抗癌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌細胞のゲノムにおいて、癌抑制遺伝子のホモ接合性の欠失が典型的に認められる。そして、癌抑制遺伝子の欠失はしばしば隣接する遺伝子の欠失を伴うことが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【0003】
例えば、ＲＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ １（ＲＢ１）遺伝子は、第１３番染色体長腕（１３ｑ１４）に位置する癌抑制遺伝子であり、同じく第１３番染色体長腕（１３ｑ１４）に位置するＳｕｃｃｉｎａｔｅ－ＣｏＡ Ｌｉｇａｓｅ ＡＤＰ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｅｔａ Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＳＵＣＬＡ２）遺伝子の近傍に位置している。
【0004】
発明者らは、前立腺癌がＲＢ１遺伝子とＳＵＣＬＡ２遺伝子を高頻度に両欠失していることを見出した。前立腺癌は、治療抵抗性のクローンの出現頻度が高く、難治性であり、より効果的な治療法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Muller F. L., et al., Passenger deletions generate therapeutic vulnerabilities in cancer, Nature, 488 (7411), 337-342, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌を治療する新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－ＣｏＡ Ｌｉｇａｓｅ ＡＤＰ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｅｔａ Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＳＵＣＬＡ２）遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤。
［２］前記癌が、ＲＢ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ １（ＲＢ１）遺伝子を更に欠失している、［１］に記載の抗癌剤。
［３］前記癌が、前立腺癌、膀胱癌、浸潤性乳癌、漿液性卵巣嚢腫、膠芽腫、肉腫又は肺腺癌である、［１］又は［２］に記載の抗癌剤。
［４］ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質、を含む、癌患者に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定するためのキット。
［５］癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示すか、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示すか、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す、前記癌組織試料が由来する癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法。
［６］癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量する工程を含み、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高いことが、前記癌患者の癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す、前記癌患者の癌の治療に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法。
［７］被験物質の存在下で、癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子を欠失した細胞株を培養する工程と、前記細胞株の生存率を測定する工程と、を含み、前記生存率が、対照と比較して有意に低下することが、前記被験物質が、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤の候補であることを示す、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤のスクリーニング方法。
［８］前記細胞株が前記癌抑制遺伝子を更に欠失している、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］前記癌抑制遺伝子がＲＢ１遺伝子であり、前記代謝遺伝子がＳＵＣＬＡ２遺伝子である、［８］に記載のスクリーニング方法。
［１］下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－ＣｏＡ Ｌｉｇａｓｅ ＡＤＰ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｅｔａ Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＳＵＣＬＡ２）遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤。
【化1】
［３］前記癌が、前立腺癌、膀胱癌、浸潤性乳癌、漿液性卵巣嚢腫、膠芽腫、肉腫又は肺腺癌である、［１］又は［２］に記載の抗癌剤。
［４］ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質、を含む、癌患者に下記式（１）で表される化合物を有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定するためのキット。
【化2】
【化3】
【化4】
［８］前記細胞株が前記癌抑制遺伝子を更に欠失している、［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］前記癌抑制遺伝子がＲＢ１遺伝子であり、前記代謝遺伝子がＳＵＣＬＡ２遺伝子である、［８］に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌を治療する新たな技術を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。
【図2】実験例６におけるスクリーニングの結果を示すグラフである。
【図3】実験例７における細胞生存率の測定結果を示すグラフである。
【図4】（ａ）～（ｄ）は、実験例８におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図6】実験例９における腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。
【図7】（ａ）及び（ｂ）は、実験例９における、対照群及びチモキノン投与群の担癌モデルマウスの代表的な写真である。
【図8】実験例９において、対照群及びチモキノン投与群の担癌モデルマウスから摘出した腫瘍塊の写真である。
【図10】実験例１０において、切断カスパーゼ３陽性細胞の数を測定した結果を示すグラフである。
【図11】実験例１２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図12】実験例１３におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤を提供する。下記式（１）で表される化合物は、チモキノン（ＣＡＳ番号：４９０－９１－５）である。実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌細胞に対する細胞傷害性が高い。
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤を提供する。下記式（１）で表される化合物は、チモキノン（ＣＡＳ番号：４９０－９１－５）である。実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌細胞に対する細胞傷害性が高い。
【0011】
【化5】
【0012】
本実施形態の抗癌剤が有効な癌は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子と共にＲＢ１遺伝子を欠失している場合が多い。これは、癌悪性進展過程において癌抑制遺伝子を欠失する時に、近傍に位置する遺伝子を巻き込んで欠失するためであると考えられる。ＳＵＣＬＡ２遺伝子と共にＲＢ１遺伝子を欠失している癌としては、例えば、前立腺癌、膀胱癌、浸潤性乳癌、漿液性卵巣嚢腫、膠芽腫、肉腫、肺腺癌等が挙げられる。
【0013】
ＳＵＣＬＡ２タンパク質は、ＴＣＡ回路において、サクシニル－ＣｏＡをコハク酸に変換する酵素である、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－ＣｏＡ Ｌｉｇａｓｅヘテロダイマーのβサブユニットを構成するタンパク質である。ＳＵＣＬＡ２タンパク質が欠失するか又は変異により活性が低下した場合、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼが抑制される。この結果、血液中のメチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチンの濃度が増加することが知られている。また、尿中のメチルマロン酸、メチルクエン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸の濃度が増加することが知られている。
【0014】
本実施形態の抗癌剤は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の上記活性、すなわち、サクシニル－ＣｏＡをコハク酸に変換する活性が低下した癌に有効である。本明細書において、「ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌」とは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子座の一部又は全部をホモ接合性又はヘテロ接合性に欠失した癌、ＳＵＣＬＡ２遺伝子座に、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の発現を低下させる変異がホモ接合性又はヘテロ接合性に生じた癌、ＳＵＣＬＡ２遺伝子座に、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の上記活性を低下させる変異がホモ接合性又はヘテロ接合性に生じた癌等であってよい。
【0015】
本実施形態の抗癌剤は、薬学的に許容される担体と混合された医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
【0016】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【0017】
医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【0018】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【0019】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【0020】
本実施形態の抗癌剤の投与量は、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約３００～５０００ｍｇ、例えば約１０００～４０００ｍｇ、例えば約２００～２０００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【0021】
非経口的に投与する場合、その投与量は、患者の症状、対象臓器、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１～１０ｇ、例えば約１～５ｇ、例えば約１～２ｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約３００～１２００ｍｇ、例えば約３００～８００ｍｇ、例えば約１００～６００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【0022】
［キット］
１実施形態において、本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質、を含む、癌患者にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定するためのキットを提供する。本実施形態のキットにより、癌患者にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定することができる。
１実施形態において、本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質、を含む、癌患者にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定するためのキットを提供する。本実施形態のキットにより、癌患者にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効か否かを判定することができる。
【0023】
（ゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット）
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ゲノム上のＳＵＣＬＡ２遺伝子を増幅することができれば特に限定されない。
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ゲノム上のＳＵＣＬＡ２遺伝子を増幅することができれば特に限定されない。
【0024】
癌患者由来の癌組織試料中のゲノムＤＮＡを、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセットで増幅すると、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上にＳＵＣＬＡ２遺伝子を保持していた場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の増幅が認められる。
【0025】
一方、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性に欠失していた場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の増幅が認められない。また、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をヘテロ接合性に欠失していた場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の増幅の減少が認められる。
【0026】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性又はヘテロ接合性に欠失していた場合には、癌組織試料が由来する癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0027】
（ゲノムＤＮＡに対するプローブ）
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ゲノム上のＳＵＣＬＡ２遺伝子を検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ゲノム上のＳＵＣＬＡ２遺伝子を検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。
【0028】
癌患者由来の癌組織試料由来のゲノムＤＮＡにＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブをハイブリダイズさせると、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上にＳＵＣＬＡ２遺伝子を保持していた場合には、プローブがハイブリダイズし、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の存在を検出することができる。
【0029】
一方、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性に欠失していた場合には、プローブがハイブリダイズできず、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の存在が認められない。また、癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をヘテロ接合性に欠失していた場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子にハイブリダイズするプローブの量の減少が認められる。
【0030】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性又はヘテロ接合性に欠失していた場合には、癌組織試料が由来する癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0031】
（ｃＤＮＡ増幅用プライマーセット）
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができれば特に限定されない。
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセットを含んでいてもよい。プライマーセットの塩基配列は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができれば特に限定されない。
【0032】
癌患者由来の癌組織試料からＲＮＡを抽出し、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲにより増幅すると、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していた場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡの増幅が認められる。
【0033】
一方、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していない場合には、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡの増幅が認められない。癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していない場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現できなくなっている場合等が挙げられる。
【0034】
また、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を、対照細胞と比較して低下させている場合もある。このような場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をヘテロ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下している場合等が挙げられる。このような場合には、癌組織試料中の癌細胞由来のＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによるＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡの増幅量が対照細胞と比較して低下する。ここで、対照細胞としては、例えば、野生型の細胞が挙げられる。
【0035】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していないか、又は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を低下させている場合には、癌組織試料が由来する癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0036】
（ｍＲＮＡに対するプローブ）
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブを含んでいてもよい。プローブの塩基配列は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。
【0037】
癌患者由来の癌組織試料からＲＮＡを抽出し、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブをハイブリダイズさせると、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していた場合には、プローブがハイブリダイズし、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出することができる。
【0038】
一方、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していない場合には、プローブがハイブリダイズできず、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの存在が認められない。癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していない場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現できなくなっている場合等が挙げられる。
【0039】
また、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を、対照細胞と比較して低下させている場合もある。このような場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をヘテロ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等により、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下している場合等が挙げられる。このような場合には、癌組織試料中の癌細胞から抽出したＲＮＡに対するプローブのハイブリダイズ量が、対照細胞と比較して低下する。ここで、対照細胞としては、例えば、野生型の細胞が挙げられる。
【0040】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していないか、又は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を低下させている場合には、癌組織試料が由来する癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0041】
（特異的結合物質）
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質を含んでいてもよい。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質を検出することができれば特に限定されない。特異的結合物質は、固相に結合されて、例えば、フローストリップ、アレイ等を構成していてもよい。
本実施形態のキットは、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質を含んでいてもよい。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質を検出することができれば特に限定されない。特異的結合物質は、固相に結合されて、例えば、フローストリップ、アレイ等を構成していてもよい。
【0042】
癌患者由来の癌組織試料からタンパク質を抽出し、ＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質と接触させると、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質を発現していた場合には、特異的結合物質が結合し、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の存在を検出することができる。
【0043】
一方、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質を発現していない場合には、特異的結合物質が結合できず、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の存在が認められない。癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質を発現していない場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現できなくなっている場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡが翻訳できなくなっている場合等が挙げられる。
【0044】
また、癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を、対照細胞と比較して低下させている場合もある。このような場合としては、ゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をヘテロ接合性に欠失していた場合、遺伝子変異等により、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下している場合、遺伝子変異等によりＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの翻訳効率が低下している場合等が挙げられる。このような場合には、癌組織試料中の癌細胞から抽出したタンパク質に対する特異的結合物質の結合量が、対照細胞と比較して低下する。ここで、対照細胞としては、例えば、野生型の細胞が挙げられる。
【0045】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質を発現していないか、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現量を低下させている場合には、癌組織試料が由来する癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0046】
［判定方法］
（第１実施形態）
第１実施形態の判定方法は、癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法であって、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの方法である。
（ｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
（ｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
（ｉｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
（第１実施形態）
第１実施形態の判定方法は、癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法であって、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの方法である。
（ｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
（ｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
（ｉｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法。
【0047】
《ゲノムＤＮＡを検出する工程を含む方法》
本実施形態の判定方法は、（ｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
本実施形態の判定方法は、（ｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
【0048】
ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの検出は、上述したＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡに対するプローブ等を用いて、上述したようにして行うことができる。
【0049】
癌組織試料中の癌細胞がゲノムＤＮＡ上のＳＵＣＬＡ２遺伝子をホモ接合性又はヘテロ接合性に欠失していた場合には、癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。
【0050】
《遺伝子レベルでの発現を検出する工程を含む方法》
本実施形態の判定方法は、（ｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
本実施形態の判定方法は、（ｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
【0051】
ＳＵＣＬＡ２遺伝子の遺伝子レベルでの発現の検出は、上述したＳＵＣＬＡ２遺伝子のｃＤＮＡ増幅用プライマーセット、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡに対するプローブ等を用いて、上述したようにして行うことができる。
【0052】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡを発現していないか、又は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を対照細胞と比較して低下させている場合には、癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。ここで、対照細胞としては、例えば、野生型の細胞が挙げられる。
【0053】
《タンパク質レベルでの発現を検出する工程を含む方法》
本実施形態の判定方法は、（ｉｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
本実施形態の判定方法は、（ｉｉｉ）癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出されたことが、前記癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法であってもよい。
【0054】
ＳＵＣＬＡ２タンパク質の検出は、上述したＳＵＣＬＡ２タンパク質に対する特異的結合物質等を用いて、上述したようにして行うことができる。
【0055】
癌組織試料中の癌細胞がＳＵＣＬＡ２タンパク質を発現していないか、又は、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現量を対照細胞と比較して低下させている場合には、癌組織試料が由来する癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。ここで、対照細胞としては、例えば、野生型の細胞が挙げられる。
【0056】
（第２実施形態）
第２実施形態の判定方法は癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法であって、癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量する工程を含み、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高いことが、前記癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法である。
第２実施形態の判定方法は癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であるか否かを判定する方法であって、癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量する工程を含み、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高いことが、前記癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であることを示す方法である。
【0057】
第２実施形態の判定方法は、生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を指標とする点において第１実施形態の判定方法と主に異なる。上述したように、ＳＵＣＬＡ２タンパク質は、ＴＣＡ回路において、サクシニル－ＣｏＡをコハク酸に変換する酵素のサブユニットである。ＳＵＣＬＡ２タンパク質が欠失するか又は活性が低下した場合、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼが抑制される。この結果、血液中のメチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチンの濃度が増加することが知られている。また、尿中のメチルマロン酸、メチルクエン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸の濃度が増加することが知られている。
【0058】
第２実施形態の判定方法において、生体試料としては、尿、血液等を用いることができる。生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量の定量は、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－質量分析（ＭＳ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ等により行うことができる。
【0059】
癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高かった場合に、癌患者の癌の治療にチモキノンを有効成分とする抗癌剤の投与が有効であると判定することができる。ここで、対照としては、例えば、健常人由来の生体試料を用いることができる。
【0060】
［スクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子を欠失した細胞株を培養する工程と、前記細胞株の生存率を測定する工程と、を含み、前記生存率が、対照と比較して有意に低下することが、前記被験物質が、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤の候補であることを示す、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子を欠失した細胞株を培養する工程と、前記細胞株の生存率を測定する工程と、を含み、前記生存率が、対照と比較して有意に低下することが、前記被験物質が、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤の候補であることを示す、前記代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【0061】
本実施形態のスクリーニング方法により、代謝遺伝子の欠失を伴う癌に有効な抗癌剤をスクリーニングすることができる。被験物質としては、特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ等を用いることができる。
【0062】
本明細書において、代謝遺伝子とは、生体内のエネルギー恒常性において代謝経路を調節する酵素をコードする遺伝子を意味する。
【0063】
本明細書において、「癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子」とは、癌抑制遺伝子を欠失する場合に、当該癌抑制遺伝子と共に欠失する場合がある代謝遺伝子を意味する。より具体的には、癌抑制遺伝子と同じ染色体上に位置し、癌抑制遺伝子との間の距離が例えば５００ｋｂ以内、例えば３００ｋｂ以内、例えば２００ｋｂ以内である代謝遺伝子が挙げられる。
【0064】
癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子の具体例としては、例えば、癌抑制遺伝子であるＲＢ１遺伝子の近傍に位置するＳＵＣＬＡ２遺伝子、癌抑制遺伝子であるＣｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）遺伝子及びＣｙｃｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ｂ（ＣＤＫＮ２Ｂ）遺伝子の近傍に位置するＭｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＭＴＡＰ）遺伝子、癌抑制遺伝子であるＳＭＡＤ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ ４（ＳＭＡＤ４）遺伝子の近傍に位置するＭａｌｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ ２（ＭＥ２）遺伝子、癌抑制遺伝子であるＡＴＭ Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＡＴＭ）遺伝子の近傍に位置するＡｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（ＡＣＡＴ１）遺伝子、癌抑制遺伝子であるＲｈｏ Ｇｕａｎｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ １２（ＡＲＨＧＥＲ１２）遺伝子の近傍に位置するＳｔｅｒｏｌ－Ｃ５－Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＳＣ５Ｄ）遺伝子、癌抑制遺伝子であるＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｎｄ Ｔｅｎｓｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇ（ＰＴＥＮ）遺伝子の近傍に位置するＧｌｕｔａｍａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １（ＧＬＵＤ１）遺伝子等が挙げられる。
【0065】
本実施形態のスクリーニング方法において、スクリーニングに使用する細胞株（試験対象細胞）は、代謝遺伝子を欠失し、その近傍の癌抑制遺伝子を保持していてもよいし、代謝遺伝子及びその近傍の癌抑制遺伝子の双方を欠失していてもよい。癌抑制遺伝子の近傍に位置する代謝遺伝子を欠失した細胞株は、ゲノム編集等により人工的に作製した細胞であってもよいし、樹立された細胞株であってもよい。
【0066】
本実施形態のスクリーニング方法において、細胞株の生存率の測定方法は特に限定されず、通常用いられる方法を適宜用いることができる。例えば、トリパンブルー、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）等により死細胞を選択的に染色し、全細胞数に対する死細胞の割合を生存率として用いてもよいし、３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）等のテトラゾリウム化合物を用いた方法により生細胞数を測定し、生存率を算出してもよい。
【0067】
被験物質の存在下で試験対象細胞を培養した結果、試験対象細胞の生存率が、対照と比較して有意に低下した場合、当該被験物質が、代謝遺伝子の欠失を伴う癌用抗癌剤の候補であると判定することができる。ここで、対照としては、例えば、野生型の細胞、代謝遺伝子を欠失させた細胞に更に代謝遺伝子を再導入した細胞等を用いることができる。
【0068】
試験対象細胞の生存率が、対照細胞と比較して低下したか否かは、例えば、下記式（Ｆ１）により殺傷割合（Ｋｉｌｌｉｎｇ ｒａｔｉｏ）を算出して判定してもよい。
殺傷割合＝試験対象細胞の生存率／対照細胞の生存率 …（Ｆ１）
殺傷割合＝試験対象細胞の生存率／対照細胞の生存率 …（Ｆ１）
【0069】
試験対象細胞の生存率が、対照細胞の生存率と等しい場合、殺傷割合は１となる。殺傷割合の値が１より低いことは、試験対象細胞の生存率が、対照細胞の生存率よりも低いことを示す。そして、殺傷割合の値が低いほど、被験物質が試験対象細胞に特異的な細胞傷害性を有することを示す。
【0070】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、チモキノンの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌の治療方法を提供する。ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌については上述したものと同様である。
１実施形態において、本発明は、チモキノンの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌の治療方法を提供する。ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌については上述したものと同様である。
【0071】
１実施形態において、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの方法により、癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であるか否かを判定する工程と、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定された場合に、前記癌患者にチモキノンの有効量を投与する工程とを含む、癌の治療方法を提供する。
（ｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｉｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｖ）癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量する工程を含み、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高い場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２遺伝子のｍＲＮＡの発現の低下が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｉｉ）癌患者由来の癌組織試料において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検出する工程を含み、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の低下が検出された場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
（ｉｖ）癌患者由来の生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量する工程を含み、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量が対照と比較して有意に高い場合に、前記癌患者の癌の治療にチモキノンの投与が有効であると判定する方法。
【0072】
上記（ｉｖ）において、生体試料としては、上述したものと同様であり、尿、血液等を用いることができる。また、生体試料中の、メチルマロン酸、スクシニルカルニチン、メチルマロニルカルニチン、プロピオニルカルニチン、メチルクエン酸又は３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量の定量は、例えばＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ等により行うことができる。また、対照としては、例えば、健常人由来の生体試料を用いることができる。
【0073】
１実施形態において、本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌の治療のためのチモキノンを提供する。ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌については上述したものと同様である。
【0074】
１実施形態において、本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌の治療薬を製造するためのチモキノンの使用を提供する。ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌については上述したものと同様である。
【実施例】
【0075】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0076】
［実験例１］
（各種癌におけるＲＢ１遺伝子及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失１）
公共の癌のゲノム解析データベース（ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌ）を利用して、様々な癌種におけるＲＢ１遺伝子の欠失及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を検討した。
（各種癌におけるＲＢ１遺伝子及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失１）
公共の癌のゲノム解析データベース（ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌ）を利用して、様々な癌種におけるＲＢ１遺伝子の欠失及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を検討した。
【0077】
【0078】
その結果、前立腺癌、漿液性卵巣嚢腫、膀胱癌、肉腫、浸潤性乳癌等の様々な癌腫において、ＲＢ１遺伝子の欠失が生じていることが明らかとなった。更に、前立腺癌、膀胱癌、浸潤性乳癌、漿液性卵巣嚢腫、膠芽腫、肉腫、肺腺癌等の様々な癌腫において、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失が生じていることが明らかとなった。
【0079】
［実験例２］
（各種癌におけるＲＢ１遺伝子及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失２）
免疫染色により、前立腺癌患者由来の癌組織切片におけるＲＢ１タンパク質及びＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検討した。癌組織切片としては、市販の組織マイクロアレイ（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｔｕｍｏｒ， ｍａｔｃｈｅｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ （ＰＩＮ） ａｎｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ）」、カタログ番号「ＴＭ００１６」、ｐｒｏｖｉｔｒｏ社）を用いた。なお、この組織マイクロアレイでは、患者情報はブラインドとされていた。
（各種癌におけるＲＢ１遺伝子及びＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失２）
免疫染色により、前立腺癌患者由来の癌組織切片におけるＲＢ１タンパク質及びＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現を検討した。癌組織切片としては、市販の組織マイクロアレイ（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｔｕｍｏｒ， ｍａｔｃｈｅｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ （ＰＩＮ） ａｎｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅ）」、カタログ番号「ＴＭ００１６」、ｐｒｏｖｉｔｒｏ社）を用いた。なお、この組織マイクロアレイでは、患者情報はブラインドとされていた。
【0080】
下記表１に、前立腺癌患者由来の癌組織におけるＲＢ１タンパク質及びＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現の検討結果を示す。その結果、ＲＢ１タンパク質の発現が欠失した７例の前立腺癌のうち６例において、ＳＵＣＬＡ２タンパク質の発現が欠失していることが明らかとなった。この結果は、少なくとも前立腺癌では、ＲＢ１遺伝子とＳＵＣＬＡ２遺伝子が、高頻度に両欠失していることを示す。
【0081】
【表1】
【0082】
［実験例３］
（ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞株の樹立）
ゲノム編集により、ヒト前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５のＳＵＣＬＡ２遺伝子をノックアウトし、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を作製した。具体的には、まず、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の２０塩基の塩基配列（ＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡ、配列番号１）の相補鎖に制限酵素部位（ＢｐｉＩ）を付加したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｐｉＩ処理したＰＸ４５８ベクター（アドジーン社）に挿入し、ＰＸ４５８－ｓｇＳＵＣＬＡ２ベクターを得た。
（ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞株の樹立）
ゲノム編集により、ヒト前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５のＳＵＣＬＡ２遺伝子をノックアウトし、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を作製した。具体的には、まず、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の２０塩基の塩基配列（ＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡ、配列番号１）の相補鎖に制限酵素部位（ＢｐｉＩ）を付加したＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｐｉＩ処理したＰＸ４５８ベクター（アドジーン社）に挿入し、ＰＸ４５８－ｓｇＳＵＣＬＡ２ベクターを得た。
【0083】
続いて、濃度５×１０６個／ｍＬのＤＵ１４５細胞に、８μｇのＰＸ４５８－ｓｇＳＵＣＬＡ２ベクター及び２μｇのｐｃＤＮＡ３．１ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を同時に導入した。遺伝子導入はＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、プロトコルにしたがい、パルス電圧１，２５０（Ｖ）、パルス幅２（ｍｓ）、パルス数２、１００μＬチップの条件で行った。
【0084】
遺伝子導入後、７２時間、５％ＣＯ２、３７℃で培養した後、培地を４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含む培地に交換し、２週間培養することにより、ＰＸ４５８－ｓｇＳＵＣＬＡ２及びｐｃＤＮＡ３．１の双方が導入された細胞を選択した。
【0085】
続いて、薬剤選択後の細胞を０．３個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種して、１．５ヶ月培養し、クローンを得た。続いて、得られたクローンのうちウエスタンブロットによりＳＵＣＬＡ２発現が確認されず、サンガーシーケンスによりＳＵＣＬＡ２遺伝子の塩基配列にフレームシフトが認められたものをＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞として以下の実験に用いた。
【0086】
［実験例４］
（ＳＵＣＬＡ２遺伝子発現用組換えレンチウイルスベクター及びウイルス液の作製）
ＳＵＣＬＡ２遺伝子を発現させるための組換えレンチウイルスベクターを作製し、ウイルス液を調製した。まず、ＤＵ１４５細胞から全ＲＮＡを調整した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いてプロトコルにしたがって全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
（ＳＵＣＬＡ２遺伝子発現用組換えレンチウイルスベクター及びウイルス液の作製）
ＳＵＣＬＡ２遺伝子を発現させるための組換えレンチウイルスベクターを作製し、ウイルス液を調製した。まず、ＤＵ１４５細胞から全ＲＮＡを調整した。続いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （タカラバイオ）を用いてプロトコルにしたがって全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【0087】
続いて、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いたＰＣＲ反応により、５’末端にａｔｔＢ１配列を付加し、３’末端にａｔｔＢ２配列を付加し、ストップコドンを削除したＳＵＣＬＡ２遺伝子断片を増幅した。
【0088】
続いて、得られたＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｐＤＯＮＲ２２３ベクターにクローニングした。続いて、ＤＮＡシーケンサー３１３０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてベクターの塩基配列をシーケンスし、目的通りの遺伝子組換えができていることを確認した。
【0089】
続いて、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ｐＤＯＮＲ２２３ベクターにクローニングしたＳＵＣＬＡ２遺伝子断片を、ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＤＥＳＴベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にサブクローニングした。以下、このベクターを「ＳＵＣＬＡ２発現プラスミド」という場合がある。
【0090】
また、同様の方法により、ＬａｃＺ遺伝子断片をｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＤＥＳＴベクターにサブクローニングした。以下、このベクターを「ＬａｃＺ発現プラスミド」という場合がある。
【0091】
続いて、以下の方法により組換えレンチウイルスを作製した。まず、２９３ＦＴ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭに６×１０６個／１０ｃｍディッシュとなるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。
【0092】
続いて、２９３ＦＴ細胞に、パッケージングプラスミド及び１μｇのＳＵＣＬＡ２発現プラスミドを導入した。また、対照としてＬａｃＺ発現プラスミドを導入した。遺伝子導入は、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ １ｍＬにＤＮＡ３μｇ及び１ｍｇ／ｍＬポリエチレンイミン（分子量１５，０００）を９μＬ添加後、室温で１５分静置し、混合液を培地に滴下することで行った。
【0093】
遺伝子導入から１８時間後に培地を交換し、４８時間後に培地を回収した。回収した培地を０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（ザルトリウス社）で濾過した後、ポリエチレングリコールを用いて濃縮し、８μｇ／ｍＬ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（ナカライテスク社）を添加してウイルス液とした。
【0094】
［実験例５］
（ＳＵＣＬＡ２再構成細胞株の樹立）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞に、実験例４で作製したウイルス液を用いてＳＵＣＬＡ２遺伝子を導入し、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞株を作製した。
（ＳＵＣＬＡ２再構成細胞株の樹立）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞に、実験例４で作製したウイルス液を用いてＳＵＣＬＡ２遺伝子を導入し、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞株を作製した。
【0095】
具体的には、まず、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を６ウェルプレートに３×１０５個／ウェルとなるように播種した。続いて、培地に実験例４で作製したウイルス液を添加して、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞とウイルスを２４時間接触させ、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞にウイルスを感染させた。
【0096】
続いて、ウイルス感染後の細胞を、通常のＤＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社）で２４時間培養した。続いて、培地に２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（インビボジェン社）を添加し、４８時間培養することにより、ウイルス感染した細胞を選択した。得られた細胞株を、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞として以下の実験に用いた。
【0097】
また、ＬａｃＺ発現プラスミドを用いて調製したウイルス液を、上記と同様にしてＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞に感染させ、ウイルス感染した細胞を選択した。得られた細胞株を、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞（対照）として以下の実験に用いた。
【0098】
［実験例６］
（化合物ライブラリのスクリーニング）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を用いて、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞特異的に細胞傷害性を示す化合物をスクリーニングした。
（化合物ライブラリのスクリーニング）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を用いて、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞特異的に細胞傷害性を示す化合物をスクリーニングした。
【0099】
具体的には、化合物ライブラリ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれる各化合物を、終濃度５μｇ／ｍＬでＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞及びＳＵＣＬＡ２再構成細胞の培地に添加し、４８時間培養した。続いて、市販のキット（製品名「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ」、ナカライテスク社）を用いて各細胞の生存率を測定した。続いて、下記式（Ｆ２）にしたがって殺傷割合（Ｋｉｌｌｉｎｇ ｒａｔｉｏ）を算出した。
殺傷割合＝ＳＵＣＬＡ２再構成細胞の生存率／ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の生存率 …（Ｆ２）
殺傷割合＝ＳＵＣＬＡ２再構成細胞の生存率／ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の生存率 …（Ｆ２）
【0100】
図２は、スクリーニングの結果を示すグラフである。グラフの縦軸は殺傷割合を表し、横軸は化合物番号を示す。殺傷割合の値が高いほど、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞特異的な細胞傷害性を有することを示す。その結果、チモキノンがＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞特異的な細胞傷害性を有することが明らかとなった。
【0101】
［実験例７］
（チモキノンの細胞傷害性のＳＵＣＬＡ２欠失依存性の検証）
チモキノンの細胞傷害性が、ＳＵＣＬＡ２欠失依存性であるか否かを検討した。具体的には、まず、実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ３×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に培地に、０、５、１０、１５、２０、２５μｇ／ｍＬのチモキノンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。
（チモキノンの細胞傷害性のＳＵＣＬＡ２欠失依存性の検証）
チモキノンの細胞傷害性が、ＳＵＣＬＡ２欠失依存性であるか否かを検討した。具体的には、まず、実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ３×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に培地に、０、５、１０、１５、２０、２５μｇ／ｍＬのチモキノンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。
【0102】
続いて、培養上清及び残存している細胞を回収し、細胞懸濁液に等容量の０．５％トリパンブルー（ナカライテスク社）を添加して混和した。続いて、全細胞数及びトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数を、全自動セルカウンターＴＣ２０（バイオラッド社）を用いて測定した。続いて、全細胞数に対するトリパンブルー陰性細胞数の割合を細胞生存率として算出した。
【0103】
また、場合により、次の方法で細胞生存率を算出した。まず、実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ１×１０４個／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。播種と同時に培地に、０、５、１０、１５、２０、２５μｇ／ｍＬのチモキノンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。
【0104】
続いて、各細胞のウェルに１０μＬの生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社）を加えて２時間反応させた。続いて４６０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（製品名「ｉＭａｒｋ」、バイオラッド社）で測定した。続いて、チモキノンを添加しなかった細胞の吸光度からブランクの吸光度を引いた値を１００％として、細胞生存率を算出した。
【0105】
図３は、細胞生存率に基づいて作成した容量反応曲線のグラフである。図３中、「－Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞の結果であることを示し、「ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の結果であることを示す。図３の横軸はチモキノンの濃度を示し、縦軸は応答率（％）を示す。
【0106】
その結果、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞に対するチモキノンのＩＣ５０（５０％阻害濃度）は５．７７μｇ／ｍＬであり、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞に対するチモキノンのＩＣ５０は１８μｇ／ｍＬであった。この結果は、チモキノンの細胞傷害性が、ＳＵＣＬＡ２欠失依存性であることを示す。
【0107】
［実験例８］
（チモキノンによる細胞傷害性の検討）
チモキノンによる細胞傷害がアポトーシスを伴うか否かを検討した。具体的には、まず、実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に培地に、１０μｇ／ｍＬのチモキノンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。また、対照として、チモキノンの代わりに溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を添加した細胞も用意した。
（チモキノンによる細胞傷害性の検討）
チモキノンによる細胞傷害がアポトーシスを伴うか否かを検討した。具体的には、まず、実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に培地に、１０μｇ／ｍＬのチモキノンを加え、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。また、対照として、チモキノンの代わりに溶媒のみ（ＤＭＳＯ）を添加した細胞も用意した。
【0108】
続いて、培地中の浮遊細胞および接着している細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてアネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。
【0109】
続いて、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて各細胞を解析した。アネキシンＶ－ＦＩＴＣの蛍光値が高く、ＰＩの蛍光値が低い細胞は、アポトーシス初期の細胞であり、アネキシンＶ－ＦＩＴＣの蛍光値及びＰＩの蛍光値の双方が高い細胞は、アポトーシス後期の細胞である。
【0110】
図４（ａ）はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞にＤＭＳＯを添加した結果を示すグラフである。図４（ｂ）はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞にチモキノンを添加した結果を示すグラフである。図４（ｃ）はＳＵＣＬＡ２再構成細胞にＤＭＳＯを添加した結果を示すグラフである。図４（ｄ）はＳＵＣＬＡ２再構成細胞にチモキノンを添加した結果を示すグラフである。図４（ａ）～（ｄ）において、縦軸はＰＩの蛍光強度を示し、横軸はアネキシンＶ－ＦＩＴＣの蛍光強度を示す。
【0111】
また、図５（ａ）及び（ｂ）は、図４（ａ）～（ｄ）の結果に基づいて作成したグラフである。図５（ａ）はアポトーシスを生じた細胞の割合を示すグラフであり、図５（ｂ）は生細胞の割合を示すグラフである。図５（ａ）及び（ｂ）中、「ＬａｃＺ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の結果であることを示し、「Ａ２Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞の結果であることを示し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを添加した結果であることを示し、「ＴＱ」はチモキノンを示す。その結果、チモキノンによるＳＵＣＬＡ２欠失細胞に対する細胞傷害は、アポトーシスを伴うことが明らかとなった。
【0112】
［実験例９］
（チモキノンの頻回投与によるインビボでの薬効評価）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ５×１０６個／マウスの細胞数でＫＳＮ／ｓｌｃマウス（８週齢、雄）の背部皮下にマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）とともに移植し、担癌マウスモデルを作製した。担癌マウスモデルは、チモキノンを頻回投与するＴＱ投与群と、チモキノンの代わりに溶媒のみを投与する対照群とに各群５匹ずつに分けた。
（チモキノンの頻回投与によるインビボでの薬効評価）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ５×１０６個／マウスの細胞数でＫＳＮ／ｓｌｃマウス（８週齢、雄）の背部皮下にマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）とともに移植し、担癌マウスモデルを作製した。担癌マウスモデルは、チモキノンを頻回投与するＴＱ投与群と、チモキノンの代わりに溶媒のみを投与する対照群とに各群５匹ずつに分けた。
【0113】
各個体の平均腫瘍直径が７ｍｍに到達した後、ＴＱ投与群に対しては、４８時間毎にそれぞれチモキノンを２０ｍｇ／ｋｇ体重で計５回腹腔内投与した。一方、対照群に対しては、ＴＱ投与群と同じ投与タイミングで溶媒のみを計５回腹腔内投与した。溶媒としては生化学用コーン油（富士フイルム和光純薬社）を用いた。
【0114】
各群のマウスについて、チモキノンの投与開始から０、３、６、９、１１日後に、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積の測定は次の通りに行なった。デジタルノギスを用いて、背部皮下に形成された腫瘍の長径と短径を測定し、（長径ｍｍ×短径ｍｍ×短径ｍｍ）／２の値を腫瘍体積として算出した。
【0115】
また、最終投与から２４時間後に背部皮下に形成された腫瘍塊を摘出し、腫瘍重量及び個体体重を測定した。腫瘍重量及び腫瘍体積の群間比較には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いた。腫瘍重量及び各日の腫瘍体積の値について、各細胞におけるコントロール群とＴＱ投与群との間でＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔを実施し、両側検定にてＰ＜０．０１水準で有意差を判定した。
【0116】
図６は、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図６中、横軸はチモキノンの投与開始からの時間（日）を示し、縦軸は腫瘍体積の平均値（ｍｍ３）を示す。また、「ＫＯ Ｃｏｎｔ．」は、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍の対照群における結果であることを示し、「－Ｒ Ｃｏｎｔ．」は、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍の対照群における結果であることを示し、「ＫＯ＋ＴＱ」は、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍のＴＱ投与群における結果であることを示し、「－Ｒ＋ＴＱ」は、ＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍のＴＱ投与群における結果であることを示す。
【0117】
図７（ａ）及び（ｂ）は、チモキノンの投与開始から１１日後の対照群及びＴＱ投与群のマウスの代表的な写真である。図７（ａ）は対照群のマウスであり、図７（ｂ）はＴＱ投与群のマウスである。図７（ａ）及び（ｂ）中、「ＳＵＣＬＡ２ ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍を示し、「ＳＵＣＬＡ２ Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍を示す。
【0118】
図８は、チモキノンの投与開始から１１日後の対照群及びＴＱ投与群のマウスから摘出した腫瘍塊の写真である。図８中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照群のマウスから摘出した腫瘍塊の写真であることを示し、「ＴＱ」はＴＱ投与群のマウスから摘出した腫瘍塊の写真であることを示す。図８中、「ＳＵＣＬＡ２－ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍を示し、「ＳＵＣＬＡ２－Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍を示す。
【0119】
図９は、図８に示す腫瘍塊の腫瘍重量の測定結果を示すグラフである。図９中、グラフの縦軸は腫瘍重量を示し、「Ａ２ ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍を示し、「Ａ２ Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍を示し、「Ｃｏｎｔ」は対照群であることを示し、「ＴＱ」はＴＱ投与群であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ｎｓ」は有意差が存在しないことを示す。
【0120】
その結果、チモキノンの投与により、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍の体積が有意に減少したことが明らかとなった。この結果は、チモキノンが、インビボでＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌に対する高い細胞傷害性を有することを示す。
【0121】
［実験例１０］
（チモキノンを頻回投与した担癌マウスモデルの癌組織の免疫組織学的解析）
実験例１０でＴＱ投与群及び対照群から摘出した腫瘍塊を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定し、定法にしたがってパラフィン包埋した。続いて、パラフィン包埋した腫瘍サンプルから、４μｍ厚の薄切標本を作製した。続いて、Ｈｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（コスモバイオ社）を用いて脱パラフィンした後、エタノールでＨｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（コスモバイオ社）を除去した。続いて、水道水を用いた流水洗浄を１０分間行い、続いてＰＢＳを用いて５分間の洗浄を３回行った。続いて、標準的なプロトコルにしたがって、ヘマトキシリン・エオジン染色及び免疫組織学染色を行った。
（チモキノンを頻回投与した担癌マウスモデルの癌組織の免疫組織学的解析）
実験例１０でＴＱ投与群及び対照群から摘出した腫瘍塊を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定し、定法にしたがってパラフィン包埋した。続いて、パラフィン包埋した腫瘍サンプルから、４μｍ厚の薄切標本を作製した。続いて、Ｈｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（コスモバイオ社）を用いて脱パラフィンした後、エタノールでＨｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（コスモバイオ社）を除去した。続いて、水道水を用いた流水洗浄を１０分間行い、続いてＰＢＳを用いて５分間の洗浄を３回行った。続いて、標準的なプロトコルにしたがって、ヘマトキシリン・エオジン染色及び免疫組織学染色を行った。
【0122】
免疫組織学染色では、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて加熱による抗原賦活処理を１０分間行い、室温で冷却後、蒸留水を用いた５分間の洗浄を２回行った。続いて、３％Ｈ２Ｏ２を用いて内因性ペルオキシダーゼ賦活化処理を１０分間行い、流水洗浄及びＰＢＳを用いた洗浄を行った。
【0123】
続いて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％ヤギ正常血清及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含むＰＢＳを用いてブロッキング処理を行った。続いて、１次抗体を反応させた。１次抗体として、抗切断カスパーゼ３抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を使用した。それぞれ４００倍に希釈して４℃で一晩インキュベートした。
【0124】
続いて、２次抗体として、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ Ｌｉｎｋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ（マウス・ウサギ１次抗体両用タイプ、ダコ社）を切片に滴下し、ＨＲＰが接合したポリマーを反応させた。続いて、ＰＢＳによる５分間の洗浄を３回行い、Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ダコ社）を用いて発色反応を行った。
【0125】
発色反応時間は５分間とした。発色反応の後、ＰＢＳで５分間の洗浄を３回行い、ヘマトキシリン溶液（サクラファインテックジャパン）で対比染色し、脱水及び透徹した。その後、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ベクターラボラトリーズ社）を用いて封入した。
【0126】
続いて、顕微鏡観察を行い、切断カスパーゼ３陽性細胞の数を測定した。図１０は、一視野中の切断カスパーゼ３陽性細胞の数を測定した結果を示すグラフである。図１０中、「Ｃｏｎｔ．」は対照群から摘出した腫瘍塊の結果であることを示し、「ＴＱ」はＴＱ投与群から摘出した腫瘍塊の結果であることを示し、「ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍の結果であることを示し、「－Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞を移植して形成された腫瘍の結果であることを示す。
【0127】
その結果、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍にチモキノンを投与すると、切断カスパーゼ３陽性細胞の数が顕著に増加したことが明らかとなった。
【0128】
ところで、Ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質は、細胞周期Ｇ１期において特異的に発現が減少することが知られているタンパク質である。更に検討を行った結果、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞を移植して形成された腫瘍にチモキノンを投与すると、Ｇｅｍｉｎｉｎ陽性細胞の数が有意に減少したことも明らかとなった。
【0129】
［実験例１１］
（Ｃａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）シーケンス法による細胞死誘導遺伝子の発現解析）
実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を１．２×１０６個／１０ｃｍディッシュに播種した。続いて、２４時間培養後、終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにチモキノンを添加し、５％ＣＯ２、３７℃で６時間培養した。続いて、細胞から全ＲＮＡを回収し、精製した。ＲＮＡの精製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプロトコルにしたがって行った。
（Ｃａｐ ａｎａｌｙｓｉｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）シーケンス法による細胞死誘導遺伝子の発現解析）
実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を１．２×１０６個／１０ｃｍディッシュに播種した。続いて、２４時間培養後、終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにチモキノンを添加し、５％ＣＯ２、３７℃で６時間培養した。続いて、細胞から全ＲＮＡを回収し、精製した。ＲＮＡの精製はＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプロトコルにしたがって行った。
【0130】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（アジレント・テクノロジー社）を用いて測定した、ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒが７．０以上であり、吸光度比Ａ２６０／２８０及び２６０／２３０が１．７以上である純度のＲＮＡをＣＡＧＥライブラリ作成に用いた。
【0131】
まず、逆転写酵素を用いてＲＮＡの５’末端キャップよりｃＤＮＡを合成すると同時に任意のＣＡＧＥバーコードタグを付加した。続いて、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０（イルミナ社）を用いてＣＡＧＥタグ付加ｃＤＮＡのシーケンスを行い、得られた配列からリボソーム及びＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ以外の塩基を含むＲＮＡを除去した後、ヒトｈｇ１９ゲノムにＢｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ ソフトウェア（ｖ０．５．９）を用いてマッピングした。
【0132】
遺伝子発現は、マッピングされたタグをＲＥｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ＣＬＵＳｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄによりクラスタリングして解析した。ただし、最大ｉｒｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅが０．１及び最小ｔａｇｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎが０．１を満たさない遺伝子は排除した。
【0133】
発現変動遺伝子検出及びジーンオントロジー解析は、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ Ａｖｅｒａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ法を用いて行った。また、発現変動遺伝子のデータセット解析はＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓにより行った。下記表２に、ジーンオントロジー解析の結果を示す、表２中、「ＧＯ Ｔｅｒｍ」は生物学的プロセスを示し、「ＦＤＲ」は偽発見率を示す。その結果、チモキノン処理によりアポトーシス実行に関わる遺伝子の発現変動が起こることが明らかとなった。
【0134】
【表2】
【0135】
［実験例１２］
（チモキノンによるアポトーシス誘導効果の検討）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時にチモキノンを終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、６時間培養した。
（チモキノンによるアポトーシス誘導効果の検討）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時にチモキノンを終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、６時間培養した。
【0136】
続いて、ＲＩＰＡ改変細胞溶解バッファーを用いて、タンパク質を抽出後、ＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）にてタンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びＰＶＤＦ膜への転写を行った。続いて、ウエスタンブロッティングにより切断カスパーゼ３及び切断Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ－Ｒｉｂｏｓｅ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＰＡＲＰ）を検出し、アポトーシス誘導効果を評価した。
【0137】
図１１はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１１中、「ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の結果であることを示し、「－Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞の結果であることを示す。また、「ＤＭ」は対照としてＤＭＳＯを添加した結果であることを示し、「ＴＱ」はチモキノンを添加した結果であることを示す。また、「Ｃｏｎｔ．」は親細胞株の結果であることを示す。その結果、チモキノン処理群ではアポトーシスの実行分子である切断カスパーゼ３のタンパク量が増加することが明らかとなった。
【0138】
［実験例１３］
（チモキノンによるアポトーシス誘導効果のＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫによる阻害）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に、終濃度１０μｇ／ｍＬのチモキノンを単独で、又は、終濃度２０μＭの細胞透過性の全カスパーゼ阻害剤であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（プロメガ社）と共に培地に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。
（チモキノンによるアポトーシス誘導効果のＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫによる阻害）
実験例３で作製したＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞、及び、実験例５で作製したＳＵＣＬＡ２再構成細胞を、それぞれ６×１０５個／６ｃｍディッシュとなるように播種した。播種と同時に、終濃度１０μｇ／ｍＬのチモキノンを単独で、又は、終濃度２０μＭの細胞透過性の全カスパーゼ阻害剤であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（プロメガ社）と共に培地に添加し、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。
【0139】
続いて、培地中の浮遊細胞及び接着細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてアネキシンＶ陽性細胞を染色した。また、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で死細胞を染色した。続いて、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて各細胞を解析した。
【0140】
図１２は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１２中、縦軸は、アネキシンＶ陽性細胞（アポトーシスを起こした細胞）の割合（％）を示し、「ＳＵＣＬＡ２－ＫＯ」はＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞の結果であることを示し、「ＳＵＣＬＡ２－Ｒ」はＳＵＣＬＡ２再構成細胞の結果であることを示す。また、「ＤＭＳＯ」は対照としてＤＭＳＯを添加した結果であることを示し、「ＴＱ」はチモキノンを添加した結果であることを示し、「ＴＱ＋Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ」はチモキノン及びＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫを添加した結果であることを示す。また、「Ｎ．Ｓ」は有意差が認められなかったことを示す。
【0141】
その結果、ＳＵＣＬＡ２ノックアウト細胞では、チモキノンの投与によりアポトーシスが誘導され、チモキノンと共にＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫを添加すると、アポトーシスが抑制されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0142】
本発明は、ＳＵＣＬＡ２遺伝子の欠失を伴う癌を治療する新たな技術を提供することを目的とする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】